ES2076160T5 - Analogos de las subunidades de la toxina de bordetella obtenidos a partir de adn recombinante. - Google Patents

Abstract

EL DESARROLLO DE SUBUNIDADES Y ANALOGOS DE SUBUNIDADES DE LA EXOTOXINA DE BORDETELLA POR MEDIO DE TECNICAS DE RECOMBINACION DE DNA PROPORCIONA PRODUCTOS ADECUADOS PARA LA FABRICACION DE VACUNAS QUE RETIENEN SU ACTIVIDAD BIOLOGICA, SON ALTAMENTE INMUNOGENICOS Y PUEDEN PROPORCIONAR PROTECCION ANTE EL RIESGO DE ENFERMEDAD. MODIFICACIONES EN LAS SUBUNIDADES PRODUCIDAS A TRAVES DE INGENIERIA GENETICA PUEDEN DAR COMO RESULTADO PRODUCTOS QUE RETIENEN SU CAPACIDAD INMUNOGENICA, PERO QUE CARECEN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ASOCIADA CON LA TOXINA.

Description

Análogos de las subunidades de la toxina de Bordetella obtenidos a partir de ADN recombinante.

Antecedentes de la invención

La presente invención proporciona un alto nivel de expresión directa de análogos recombinantes a las subunidades S1, S2, S3, S4 y S5 de la exotoxina de Bordetella en E. coli, sin recurrir a fusiones con porciones de proteínas heterólogas. Más particularmente, las modificaciones de las subunidades, realizadas mediante ingeniería genética, proporcionan una clase de análogos a la toxina de Bordetella que tienen la capacidad de producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina, y de estar sustancialmente libres de componentes reactogénicos. Las subunidades obtenidas por ingeniería genética pueden utilizarse para producir vacuna(s) de subunidades que tienen eficacia inmunogénica y están sustancialmente libres de componentes reactogénicos.

La expresión "exotoxina de Bordetella" designa a un grupo de toxinas codificadas por los genomas de diversas especies de Bordetella, tales como B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica. Otras expresiones normalmente utilizadas para designar a la exotoxina de Bordetella son las de toxina pertussis ("PTX"), factor promotor de la linfocitosis ("LPF") y proteína activadora de islotes ("IAP").

La tosferina sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad infantil en muchas partes del mundo. Las vacunas a base de células enteras de Bordetella pertussis han proporcionado un medio eficaz para controlar esta enfermedad. Sin embargo, el uso de estas vacunas se ha correlacionado directamente con efectos secundarios leves y, transitoriamente, con sucesos neurológicos más graves y, en ocasiones, mortales.

Se han dedicado amplios esfuerzos en el empeño de eliminar los efectos secundarios perjudiciales que se sabe que están asociados a las vacunas actuales. Esto ha dado como resultados la producción y el ensayo de vacunas acelulares y, en el ámbito de la investigación básica, un intento de desarrollar productos recombinantes más seguros. Una primera etapa crítica para la clonación y el desarrollo de una vacuna obtenida a partir de ADN recombinante fue la secuenciación del operón de la toxina pertussis y la subsiguiente deducción de las secuencias de aminoácidos de las subunidaades individuales (Locht, C. Keith, J. M., 1986, Science 232: 1258-1264; Locht et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 3251-3261; y Nicosia et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4631-4635).

Nicosia et al., (1987, Infect. Immun., 55: 963-967) demostraron que el ARNm que codifica cada una de las subunidades S1, S2, S3, S4 y S5 de Bordetella pertussis podría transcribirse eficazmente en E. coli a partir de los genes clonados. Aunque ellos dieron a entender que se manifestaban niveles elevados de transcripción del mensaje policistrónico de la toxina pertussis nativa, la cantidad de proteínas producida mediante expresión directa era muy baja o indetectable. Además, las proteínas de fusión que se sintetizaron a continuación no fueron capaces de producir ninguna respuesta inmunológica neutralizante o protectora.

Barbieri et al., (1987, Infect. Immun., 55: 1321-1323) demostraron la expresión de la subunidad S1 como una proteína de fusión en E. coli. Esta proteína de fusión contiene los seis primeros aminoácidos de la beta-galactosidasa, cinco aminoácidos codificados por el poliengarzador de pUC18, seguidos por los aminoácidos 2 a 235 de la subunidad S1. La proteína de fusión S1, producida en pequeñas cantidades, sólo tenía alrededor del 25% de la actividad de ADP-ribosiltransferasa de la toxina pertussis auténtica o nativa.

Locht et al., (Resumen, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 9-14 de septiembre de 1986) pudieron expresar una proteína de fusión que contenía los aminoácidos 2 a 187 de la subunidad S1. Predijeron que la construcción pudiera no tener actividad tóxica porque creían que carecía del sitio de unión al NAD, asociado con la ADP-ribosiltransferasa, la actividad enzimática que se cree que es responsable de la reactogenicidad de la toxina. Experimentos posteriores con esta molécula indicaron que esta especie truncada tenía una actividad enzimática esencialmente no disminuida. Ninguna de las subunidades ni ninguno de los análogos a subunidades que se conocen en la técnica anterior tienen la capacidad de producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina ni están prácticamente libres de la actividad enzimática asociada con la reactogenicidad.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del orden cistrónico del operón PTX (Técnica anterior de Locht y Keith, supra). Las regiones marcadas como S1, S2, S4, S5, y S3 indican las fases de lectura abierta propuestas para cada una de estas subunidades de PTX. El área rellena situada justamente antes de cada cistrón, designa la secuencia de señal putativa. El sitio de restricción enzimática situado inmediatamente después de cada elemento cistrónico indica el sitio de restricción aguas abajo utilizado en la subclonación de ese cistrón en el vector de expresión. El sitio de restricción enzimática localizado justamente dentro de cada región de secuencia de señal, se utilizó como el sitio de restricción aguas arriba para la subclonación del cistrón de longitud completa en el vector de expresión con un engarzador oligodesoxinucleotídico adecuado, para producir la subunidad de PTX inmadura con su secuencia de señal intacta. El sitio de restricción enzimática situado justamente dentro de la fase de lectura abierta de cada una de las subunidades de PTX maduras se utilizó, con un engarzador oligodesoxinucleotídico adecuado, como el sitio de restricción aguas arriba para la subclonación del cistrón sin la secuencia de señal codificada por él mismo, para producir una subunidad de PTX madura unida a metionilo.

La Figura 2 representa un gel de poliacrilamida-SDS y una transferencia Western de las subunidades de PTX recombinantes. La parte izquierda del panel A muestra un gel de las subunidades de PTX recombinantes producidas en cantidades medibles, teñido con Azul Brillante de Coomassie; la parte derecha del panel A es una transferencia Western de un gel realizado en paralelo, llevada a cabo utilizando un suero policlonal hiperinmune de conejo anti-PTX. El término PTX indica las calles que contienen toxina pertussis de calidad comercial. Estos resultados demuestran que todas las subunidades S1, S2, S3 y S5 recombinantes (r) se produjeron en cantidades significativas. La transferencia Western muestra que la S1r se procesa completamente a partir de su especie preproteínica, la S2r y la S5r se procesan parcialmente y la S3r no se procesa sustancialmente bajo las condiciones de fermentación; la S4r no se produjo en cantidad suficiente como para ser visualizada. El panel B muestra los productos de la expresión como subunidades recombinantes maduras (rm) unidas a metionilo. Estas subunidades se obtienen en cantidades significativas, con la excepción de la S1rm (no se muestra).

La Figura 3 es una transferencia Western que demuestra el efecto de las secuencias no codificantes, localizadas aguas arriba, en la expresión de S2r. Los detalles de la figura se exponen en el texto.

La Figura 4 es una autorradiografía de un gel de poliacrilamida-SDS que demuestra la actividad de ADP-ribosiltransferasa de la S1 recombinante. Se hicieron reaccionar individualmente, S1 recombinante (500 ng), toxina pertussis nativa purificada (1 \mug) y tampón de reacción, con transducina bovina en presencia de [P^{32}]NAD, esencialmente como está descrito por Manning et al., 1984, J. Biol. Chem., 259: 749-756; West et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:14.428-14.430. Las muestras se hicieron precipitar con ácido tricloroacético frío al 10%, los precipitados se sometieron a PAGE-SDS y a una posterior autorradiografía. La banda radiactiva situada a 39 kd es la subunidad transducina que se ha ribosilado. Calle A, testigo de tampón de reacción; calle B, PTX nativa; calle C, S1r.

La Figura 5 es un gráfico de radioinmunoensayos que muestra la inmunogenicidad de las subunidades S1r y S4r en ratones. Se hiperinmunizaron ratones con S1 recombinante, metionil-S4r, toxina pertussis nativa (PTX), vacuna comercial de pertussis, o excipiente (NMS); algunas preparaciones contenían adyuvante completo de Freund (CFA). Se recogieron los sueros y se examinaron diluciones de ellos en un radioinmunoensayo en fase sólida para determinar su título anti-PTX.

La Figura 6 es un gráfico que demuestra el potencial inmunoprotector de S1r y S4r en ratones, contra el desafío i.c. (intracerebral) con B. pertussis. Los detalles de la figura se exponen en el texto.

La Figura 7 es la secuencia de aminoácidos deducida del mutante S1r obtenido a partir de la expresión de pPTXS1 (6A-3/4-1).

Las Figuras 8A y 8B son gráficos de las actividades de ADP-ribosiltransferasa y de NAD-glucohidrolasa del análogo recombinante S1.

La Figura 9 es una autorradiografía de un gel de poliacrilamida-SDS de las proteínas de la subunidad S1 purificadas.

La Figura 10 es una autorradiografía de un gel no reductor y no desnaturalizante de poliacrilamida de holotoxinas nativas procedentes de la combinación del oligómero B nativo, bien con la S1/1 recombinante o con la S1/1-4 recombinante.

La Figura 11 es una fotografía de monocapas de células examinadas mediante microscopía óptica, para determinar la presencia de agrupamientos de células.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende, por lo menos, una porción que codifica la subunidad S1 de laexotoxina de Bordetella, o un fragmento o un derivado de dicha porción, en la que dicha porción, o fragmento, o derivado, codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica que puede (a) producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y (b) está sustancialmente libre de componentes reactogénicos. La subunidad polipeptídica S1, o los análogos a la subunidad, comprenden un epítopo principal que se sabe que es importante para proporcionar inmunoprotección contra la toxicidad de pertussis. Los niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina proporcionan inmunoprotección contra la toxicidad de pertussis. La mutagénesis específica de un sitio da como resultado un análogo a la subunidad S1 que es sustancialmente inactivo desde el punto de vista enzimático.

En particular, la presente invención proporciona una molécula de DNA que codifica un análogo polipeptídico de una subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, teniendo el análogo polipeptídico una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la subunidad S1 que aparece de forma natural, en uno o más restos de aminoácidos localizados en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, donde la arginina 9 se ha sustituido por lisina, molécula que codifica un análogo que (a) puede producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y (b) está libre de la actividad enzimática asociada con la reactogenicidad de la toxina.

La subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, obtenida mediante ingeniería genética, y los análogos a esta subunidad, proporcionan materiales para vacunas a base de subunidades, obtenidos a partir de ADN recombinante para uso en la prevención de la enfermedad causada por la pertussis. La subunidad S1 y sus análogos pueden proporcionar productos vacunales, bien individualmente o en combinación con las subunidades S2, S3, S4 y S5, y sus mezclas. Las subunidades S2, S3, S4 y S5 se pueden purificar a partir de B. pertussis, o pueden obtenerse por recombinación como productos de fusión o de ausencia de fusión. También se han alcanzado altos niveles de expresión en E. coli, de las subunidades recombinantes S2, S3, S4 y S5 de la exotoxina de Bordetella, mediante métodos directos que no son de fusión. Para la expresión de estos análogos a subunidades pueden utilizarse hospedadores alternativos de los recombiantes, que incluyen levaduras como, por ejemplo, S. cerevisiae, y organismos bacterianos como, por ejemplo, Salmonella typhimurium o typhi, Bacillus sp., y virus como, por ejemplo, el virus de la vacuna.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un alto nivel de expresión directa de todas las subunidades recombinantes de PTX necesarias para la producción de vacunas. Además, los análogos a la subunidad S1 proporcionan una actividad biológica que es muy inmunogénica y están sustancialmente libres de componentes reactogénicos, teniendo dichos componentes actividades enzimáticas de la molécula de toxina relacionadas con su toxicidad y reactogenicidad, y de componentes externos a B. pertussis (p. ej., endotoxina) que pudieran encontrarse con los materiales vacunales extraídos de células de B. pertussis y que se sabe que son reactogénicos. Los análogos a S1 utilizados individualmente, o en combinación con otras subunidades de PTX, pueden proporcionar productos vacunales que son eficaces y que reducen mucho la posibilidad de efectos secundarios producidos por los componentes reactogénicos existentes en subunidades nativas, u obtenidas a partir de recombinantes, no modificadas.

Cada una de las subunidades individuales S1, S2, S3, S4 y S5 de la toxina de Bordetella pertussis se subclonó y se expresó directamente, de forma individual, en E. coli. La secuencia de señal manifiesta jugar un papel importante en la expresión de la S1 recombinante (S1r). En ausencia de un péptido de señal, se expresaron cantidades insignificantes de S1r en E. coli. Si en la preproteína está presente bien el líder nativo de la subunidad S1, o un líder sintético, se obtienen altos niveles de expresión, en el intervalo del 10-30% de la proteína celular total. Como se muestra en la Figura 2, la fermentación de células que expresan S1r, a escala de producción, en un fermentador de 10 litros de capacidad con alimentación por tandas (a un nivel de expresión no optimizado de 8 mg de S1/DO-l), da como resultado un procesamiento proteolítico casi completo de S1r para dar sus especies maduras. La fermentación de células expresadoras, a escala de laboratorio, da lugar a una S1 procesada de forma incompleta; tanto la preproteína como la proteína madura se hallaron siguiendo el crecimiento celular logarítmico. La incapacidad de una secuencia líder sintética rompible en E. coli para mejorar el procesamiento de la señal, sugirió que una rotura incompleta no es el resultado de un reconocimiento incompatible de los sitios de rotura proteolítica de B. pertussis por las peptidasas del líder de E. coli. La incapacidad para superar el bloqueo en el procesamiento, bien mediante aumento de la síntesis de peptidasas de la señal utilizando células cotransformadas con un plásmido que exprese la peptidasa del líder de E. coli a niveles elevados, o bien mediante reducción de los niveles de expresión de S1 con el uso de un vector de bajo número de copias, indicó que el problema no consiste en la saturación de la vía de rotura. Estos resultados demuestran que un procesamiento postraduccional de proteínas extrañas en E. coli puede estar controlado por mecanismos poco entendidos, relacionados con el estado fisiológico de la célula en crecimiento.

Como se muestra en la Figura 2, las subunidades S2, S3, S4 y S5 de PTX se expresaron de forma similar en E. coli. Resultó que, al igual que la S1 recombinante, las subunidades S2r, S3r y S5r mostraron un procesamiento incompleto en la fermentación a escala de laboratorio. Puesto que la S1r podría procesarse por completo a escala de producción, pueden utilizarse unas condiciones de fermentación similares para producir las otras subunidades en las formas completamente procesadas. Al contrario que S1r, la subunidad S4r podría expresarse en elevados niveles como un polipéptido maduro unido a metionilo, pero no era detectable cuando se expresaba con su secuencia peptídica líder natural. Ahora, todas las subunidades S2, S3, S4 y S5 han sido expresadas como polipéptidos maduros unidos a metionilo. El análisis de los aminoácidos de estas moléculas demuestra que el resto metionilo heterólogo (no nativo) es eliminado sustancialmente de cada una de las especies (con la excepción de la S4) mediante una metionil-aminopeptidasa celular, para proporcionar proteínas completamente maduras de secuencia nativa. El resto metionilo no es sustancialmente eliminado de la S4 recombinante debido a la incompatibilidad de la secuencia de reconocimiento del amino terminal con la enzima celular. Todas las proteínas recombinantes se recuperaron como cuerpos de inclusión a partir de células lisadas. Se halló que las subunidades presentaban perfiles de migración en PAGE-SDS esencialmente idénticos a los de las subunidades nativas auténticas, o que reaccionaban en ensayos de transferencia Western con sueros policlonales o con monoclonales anti-toxina. Como se muestra en la Figura 2, se alcanza un alto nivel de expresión de las subunidades S1, S2, S3, S4 y S5 recombinantes en E. coli por medios directos, con ausencia de fusión.

Aunque podrían utilizarse métodos y materiales alternativos en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las referencias citadas a continuación se incorporan con fines de consulta.

Materiales y métodos para la expresión de las subunidades S1, S2, S3, S4 Y S5 recombinantes

Materiales. Las enzimas modificadoras de ADN se adquirieron de New England Biolabs (Beverly, MA), Bethesda Research Laboratories, (Gaithersburg, MD), Boehringer Mannheim Biochemicals, (Indianapolis, IN), e International Biotechnologies, Inc., (New Haven, CT); las enzimas se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Todos los productos químicos y bioquímicos eran de calidad de reactivos analíticos. La toxina pertussis PTX purificada se adquirió de List Biological Laboratories, Inc., (Campbell, CA). Los oligonucleótidos sintéticos se sintetizaron de acuerdo con Caruthers (1982, en H. G. Gussen y A. Lang (coordinadores de edición), Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments, Verlag Chemie, Weinheim, RFA, págs. 71-79). Los antisueros de conejo anti-PTX completa fueron producidos en Antibodies Inc., (Davies, CA) y en el NIAID Rocky Mountain Laboratory. Los anticuerpos monoclonales contra las subunidades procedentes de PTX nativa se produjeron mediante métodos habituales (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Nowinski et al., 1979, Virology 93:111-126). La proteína A marcada con yodo radiactivo y los sueros de conejo anti-IgG de ratón se adquirieron de New England Nuclear (Wilmington, DEL). El anticuerpo monoclonal IB7 anti-S1 (como se ha descrito en Sato et al., 1987, Infect. Immun. 55:909-915) fue un obsequio de H. Sato, NIH, to Keyo, Japón.

Plásmidos y cepas bacterianas. El plásmido pPTX42 que contiene el operón de PTX, ya se ha descrito (véase Locht y Keith, supra y Locht, et al., supra). Los plásmidos de expresión pCFM1036, pCFM1146, pCFM1152 y pCFM1156 se obtuvieron de Amgen.

Una descripción detallada del sistema del vector de expresión de Amgen se describe en la Solicitud de Patente Europea publicada nº 136.490, y se incorpora aquí por su referencia. Dichos plásmidos pueden contener un promotor inducible, un sitio sintético de unión al ribosoma, un agrupamiento de clonación, un origen de replicación del plásmido, un codón de terminación de la transcripción, genes reguladores del número de copias del plásmido y un gen de resistencia a la kanamicina. Los plásmidos obtenidos difieren entre sí en diversos aspectos. El plásmido pCFM1036 puede obtenerse a partir del pCFM836 (Solicitud de Patente Europea nº 136.490) por sustitución de la secuencia de ADN localizada entre los sitios únicos de restricción con AatII y EcoRI, que contiene el promotor sintético P_{L}, por el siguiente oligonucleótido:

1

El plásmido no contiene un promotor inducible precediendo al agrupamiento de restricción. El plásmido
pCFM1146 puede obtenerse a partir de pCFM836 por sustitución de la pequeña secuencia de ADN localizada entre los sitios únicos de restricción con ClaI y XbaI, por el siguiente oligonucleótido:

2

y por destrucción de los dos sitios endógenos de restricción con NdeI rellenando los extremos con la enzima polimerasa de T4 y, a continuación, ligando los extremos romos. El plásmido no contiene un sitio sintético de unión al ribosoma inmediatamente antes del agrupamiento de restricción. El plásmido pCFM1156 puede obtenerse a partir del pCFM1146 por sustitución de la pequeña secuencia de ADN localizada entre los sitios únicos de restricción con XbaI y KpnI, por el siguiente oligonucleótido:

3

El plásmido pCFM1152 puede obtenerse a partir del pCFM1156 por sustitución del fragmento de ADN que va desde BglII hasta BglII (248 pares de bases), que contiene el promotor copB y que codifica una porción del gen copB, por el fragmento correspondiente de ADN procedente del plásmido pCFM512 (Solicitud de Patente Europea nº 136.490). Este plásmido tiene un menor número de copias que el pCFM1156.

Los plásmidos pBR322, pUC18, pUC19, y el ADN de los fagos M13mp18 y M13mp19 se adquirieron de Bethesda Research Laboratories. El plásmido pTD125 que contiene el gen de la peptidasa del líder de E. coli (Dale, T. 1983, J. Bacteriol., 143:76-83) fue un obsequio de W. Wickner (UCLA). Las células de E. coli FM5 se obtuvieron en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, a partir de la cepa K-12 de E. coli de C. F. Morris (Bachmann et al., 1976, Bacteriol. Rev. 40: 116-167) y contienen el gen represor CI_{857} del fago lambda integrado (Sussman et al., 1962, C.R. Acad. Sci. 254:1517-1579). La construcción de los plásmidos de expresión de las subunidades individuales se describe aquí. La producción del vector, la transformación celular y la selección de colonias se llevaron a cabo por métodos habituales (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Procedimientos analíticos. La secuenciación del ADN se realizó por el método de terminación de la cadena por extensión desde un cebador (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467; Heidecker et al., 1980, Gene, 10:69-73). Los análisis de las secuencias de proteínas se llevaron a cabo mediante degradación de Edman automatizada, en un microsecuenciador de fase gaseosa ABI 470A (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem., 256:7990-7997; Hunkapillar et al., 1983, Meth. Enzymol., 91:399-413). La electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) se llevó a cabo como está descrito por Laemmli (1970, Nature 227, 680-685), la elución de polipéptidos a partir de los geles de poliacrilamida se realizó por el método de Hunkapiller et al., (1983, Meth. Enzymol. 91:227-236), y las transferencias Western se llevaron a cabo según lo descrito por Burnette (1981, Analyt. Biochem., 112:195-203). La relación de proteína recombinante a proteína celular total, o a proteína total de los cuerpos de inclusión, se determinó mediante PAGE-SDS de lisados de células completas o de preparaciones de cuerpos de inclusión, seguida de tinción con Azul Brillante de Coomassie R250 y posterior exploración del gel mediante densitometría de integración. Los ensayos de NAD-glucohidrolasa y ADP-ribosiltransferasa se hicieron como se ha descrito previamente (Katada et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3129-3133; Lim et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2585-2588). La reducción en la respuesta morfológica de células CHO a PTX (Hewlett et al., 1983, Infect. Immun. 40:1198-1203) con antisueros contra diversas preparaciones de subunidades recombinantes, se realizó mediante el procedimiento de Gillenius et al. (1985, J. Biol. Stand., 13:61-66).

Construcción de los plásmidos de expresión. Todos los plásmidos se construyeron a partir de una serie de vectores de expresión generalizada en E. coli, que se diferencian como se ha descrito anteriormente. Los segmentos génicos de las subunidades individuales de la toxina pertussis se aislaron utilizando los sitios de restricción mostrados en la Figura 1 de la técnica anterior; el sitio de restricción aguas arriba estaba justamente dentro del codón de iniciación para la expresión de la forma de la subunidad que contenía el péptido de señal, o justamente dentro del codón para el resto amino terminal de la forma procesada y madura de la subunidad para la expresión de la forma madura unida a metionilo del análogo a la subunidad. En la coexpresión del oligómero B entero se utilizaba, en un caso, el fragmento que contenía la región no codificante de S2 situada aguas arriba hasta el final de S3 y se omitía el sitio sintético de unión al ribosoma del vector de expresión de E. coli; en el otro caso, se omitió por deleción la región no codificante de S2 situada aguas arriba y se insertó el sitio sintético de unión al ribosoma de E. coli. Se emplearon engarzadores oligonucleotídicos sintéticos para efectuar la inserción de los segmentos génicos en los plásmidos de expresión a una distancia óptima aguas abajo del promotor sintético y del sitio de unión al ribosoma. Los engarzadores localizados aguas arriba restauraron la fase de lectura de cada gen haciéndola volver a coincidir, bien con el auténtico codón de iniciación, en el caso de construcciones de presubunidades, o con el primer codón del extremo amino maduro; los últimos oligonucleótidos incluyen un codón de iniciación para metionilo. En algunos casos, se modificó el codón habitual para reducir las posibilidades de una estructura secundaria cerca del extremo 5' de los ARNm resultantes. Por ejemplo, el codón correspondiente a cisteína localizado en la posición 3 de la región señal de la subunidad S1 (Locht y Keith, supra) se sustituyó por el codón correspondiente a serina para eliminar la posibilidad de interacciones disulfuro perjudiciales.

A continuación de la transformación de células de E. coli FM5 con las diversas construcciones de plásmidos y de su cultivo sobre placas de agar que contenían kanamicina, se seleccionó un número adecuado de colonias, se hicieron réplicas en placas, se hicieron crecer en pequeños cultivos líquidos ("minipreparaciones"), y se indujeron a 42ºC durante 4 h. Después, las minipreparaciones se escrutaron mediante microscopía óptica para determinar la presencia de cuerpos de inclusión en las células bacterianas. Se identificaron las preparaciones que mostraban presuntas inclusiones, y las colonias coincidentes de las placas de réplica se sometieron a fermentación a escala de laboratorio en matraces (de un litro), a la temperatura de inducción; posteriormente, algunas preparaciones se sometieron a fermentación en fermentadores industriales de 10 litros de capacidad, con alimentación por tandas (discontinua). Durante la fermentación se retiraron muestras en distintos momentos después de la inducción y se examinaron para determinar la aparición de la subunidad de PTX apropiada, mediante PAGE-SDS, seguida tanto por tinción con Azul Brillante de Coomassie como por ensayos de transferencia Western; las transferencias se hicieron reaccionar, en primer lugar, con un anticuerpo monoclonal apropiado, se examinaron mediante autorradiografía y, después, se hicieron reaccionar con un suero policlonal anti-PTX y se siguió con otro examen por autorradiografía. La estructura del plásmido procedente de cada clon de expresión se confirmó mediante cartografía por restricción del plásmido aislado y se verificó mediante secuenciación del ADN de las regiones de unión.

Expresión de la S1 recombinante. Cuando las células de E. coli que contenían el plásmido de expresión de S1 (pPTXS1/1) se indujeron a 42ºC en un fermentador de 10 litros de capacidad con alimentación por tandas (discontinua), a escala de producción, produjeron una proteína intracelular mayoritaria de, aproximadamente, 26.000 daltons (Figura 2A, izquierda, calle S1r) que migraba hasta la misma posición que la S1 de PTX auténtica en PAGE-SDS. El análisis parcial (5 ciclos) de la secuencia de aminoácidos estableció que este polipéptido tenía la secuencia del extremo amino prevista para la subunidad S1 madura (Locht y Keith, supra). La proteína se identificó inmunoquímicamente como S1 por su reactividad con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-S1 en una transferencia Western (Figura 2A, derecha, calle S1r).

Debe señalarse que la fermentación en laboratorio de las células que expresan S1, a la escala de un matraz de un litro de capacidad, dio como resultado una rotura incompleta del péptido de señal de S1r, fenómeno que también se ha observado en la expresión de las otras subunidades de PTX en E. coli (véase a continuación). Se intentó identificar el bloqueo molecular al procesamiento de la señal, observado a escala de matraz, mediante una serie de experimentos pensados para aumentar el alcance de la rotura de la preproteína: inserción del gen S1 en un vector de expresión de bajo número de copias, sustitución del péptido de señal S1 auténtico por una secuencia de señal sintética rompible en E. coli (Picker et al., 1983, Infect. Immun., 42:269-275), y cotransformación de las células que expresaban la subunidad con un plásmido de expresión que contenía el gen de la peptidasa del líder de E. coli (Date, supra), para aumentar el nivel constitutivo de esta enzima. Ninguno de estos enfoques dio lugar a alteraciones significativas en la rotura de la señal. Sin embargo, la modificación de las condiciones de fermentación hasta llegar a un procedimiento con alimentación por tandas, dio lugar a un procesamiento de la pre-S1 en su forma madura, que fue sustancialmente completo.

El éxito en la expresión de la subunidad S4 como un polipéptido maduro unido a metionilo (ver a continuación) estimuló el empleo de la misma estrategia con la S1r. Sin embargo, al contrario que la expresión de la S4r en E. coli, la expresión de la S1 madura unida a metionilo fue tan baja que se tuvo que realizar una transferencia Western para su detección. Por el contrario, la expresión de la S1r utilizando su secuencia de señal auténtica, produjo el polipéptido completamente procesado a niveles del 10-30% de la proteína celular total. Como se describe más adelante, el truncamiento del extremo amino de la S1r madura por medios recombinantes, puede producir niveles muy elevados de expresión. De hecho, la sustitución de tan solo los dos primeros restos de la secuencia de la S1 madura (AspAsp) por MetVal produce una expresión significativa en relación a la de la forma madura unida a
metionilo.

Expresión de S2, S3, S4 y S5 . Como ensayo de factibilidad, la subunidad S4 de PTX se expresó, en primer lugar, como una proteína madura unida a metionilo sin su péptido líder nativo y, como se ha descrito anteriormente, se produjo en altos niveles, en E. coli (Figura 2B, parte izquierda, calle S4rm). Aunque su migración en PAGE-SDS estaba ligeramente retardada con respecto a la de la S4 procedente de las preparaciones de toxina completa, tenía la secuencia de aminoácidos prevista para S4. La S4 procedente de B. pertussis, purificada mediante HPLC, mostraba el mismo retardo en electroforesis en gel (Locht et al., supra). La S4 recombinante reacciona bien con antisueros policlonales en transferencias Western (Figura 2B, parte derecha, calle S4rm), pero presenta menor reactividad con un anticuerpo monoclonal anti-S4.

En contraposición a los resultados obtenidos con la S1, la expresión de la S4 con la secuencia de su péptido líder nativo (Locht y Keith, supra) produjo niveles indetectables de proteína (no se muestra). Sin embargo, debe señalarse que Nicosia et al. (supra) predijeron un sitio diferente de iniciación de la tradución situado más aguas arriba; es posible que el uso de esta secuencia adicional en el péptido líder de la S4 pudiera producir niveles de expresión mucho más altos. Las subunidades recombinantes S2, S3 y S5 fueron, cada una de ellas, expresadas con sus secuencias líderes nativas (Figura 2A, calles S2r, S3r y S5r, respectivamente); ninguna de estas subunidades fue procesada completamente durante la fermentación a escala de laboratorio, aunque experimentos preliminares de fermentación a escala de producción, utilizando el procedimiento de alimentación por tandas, dieron lugar a una marcada mejora en el procesamiento de S2 y S5. Las subunidades S2, S3 y S5 también fueron, cada una de ellas, expresadas en E. coli en una forma madura unida a metionilo, a niveles comparables a los obtenidos con sus péptidos líderes nativos (Figura 2B, calles S2rm, S3rm y S5rm, respectivamente). Como se ha señalado anteriormente, los restos heterólogos de metionina de las subunidades S2, S3 y S5 son procesados mediante metionil-aminopeptidasa celular para producir polipéptidos completamente maduros de secuencia nativa.

El segmento policistrónico entero que representa a las subunidades del oligómero B (S2-S4-S5-S3), se expresó bajo el control del promotor P_{L}. La Figura 3 ilustra los efectos de la región no codificante localizada aguas arriba, en la producción de la subunidad S2. En un caso, el plásmido de expresión retuvo la porción intercistrónica entera, localizada entre el codón de terminación de la S1 y el codón de iniciación de la S2 (Locht y Keith, supra), pero sin el sitio sintético de unión al ribosoma utilizado en todos los demás plásmidos de expresión. Esto produjo la síntesis de la S2 recombinante, que resultó que estaba completamente procesada cuando se examinó en una transferencia Western con un anticuerpo monoclonal anti-S2 (Figura 3, calles D y E); aunque nno se muestra, el análisis con anticuerpos policlonales sugiere que las otras subunidades del oligómero B también eran completamente procesadas en sus formas maduras. La sustitución del segmento intercistrónico no codificante con la secuencia sintética de Shine-Delgarno produjo un nivel mucho más alto de síntesis de S2r (Figura 3, calles B y C); sin embargo, este material es procesado de manera incompleta. La eficacia de la síntesis de cada cistrón resultó estar directamente relacionada con su proximidad al extremo 5' del mensajero, es decir, S2>S4>S5>S3. Un experimento preliminar, en el que la parte que queda del operón se sitúa aguas abajo de la construcción que expresa S1 a altos niveles (véase arriba) dio por resultado muy bajos niveles de síntesis y un procesamiento incompleto de cada una de las subunidades, incluyendo la S1).

Propiedades de las subunidades de PTX recombinantes. Se manifiesta que muy pocas de las subunidades de PTX procesadas, si es que existe alguna, son secretadas desde las células de E. coli, aunque hay alguna indicación de que se pueden encontrar cantidades limitadas de la S1r completamente procesada en el espacio periplasmático. La mayor parte de cada subunidad se encontró en forma de cuerpos de inclusión y constituía del 10 al 30% de la proteína celular total. La lísis celular mediante una prensa de French y la centrifugación a baja velocidad produjeron fracciones de sedimentos que contenían hasta un 65% de sus proteínas como subunidades individuales.

Todas las subunidades de PTX podían detectarse en transferencias Western con un suero policlonal de conejo antitoxina (Figura 2). Como se ha señalado anteriormente, las subunidades S1r y S2r reaccionaban bien con anticuerpos monoclonales específicos en transferencias Western. La S4 recombinante, producida como un polipéptido unido a metionilo, presentaba una reactividad reducida con un anticuerpo monoclonal anti-S4. No se disponía de anticuerpos monoclonales contra las subunidades S3 y S5, aunque se pudo detectar la S3r por transferencia Western con un anticuerpo monoclonal anti-S2, gracias a la gran homología de su secuencia con la de la S2 (Locht y Keith, supra).

Cuando se incubaron preparaciones crudas de S1r recombinante con membranas aisladas a partir de células CHO, en presencia de [P^{32}]NAD, se ribosiló a partir de ADP una proteína de aproximadamente 41.000 daltons, idéntica a la ribosilada por la PTX entera nativa; se cree que esta molécula es la proteína reguladora de membrana N_{i} del complejo de adenilatociclasa (Bokoch et al., 1983, J. Biol. Chem., 258: 2072-2075; y Hsia et al., 1983, J. Biol. Chem., 259: 1086-1090). Con miras a un ensayo rutinario, puede utilizarse la transducina bovina como sustrato de la ribosilasa (Fig. 4), una molécula que se ha demostrado que es un aceptor para la transferencia de la ADP-ribosa catalizada por la toxina pertussis desde el NAD (Manning et al., supra; West et al., supra). Estos resultados confirman la localización de la actividad de ADP-ribosiltransferasa en el promotor A (subunidad S1) de la toxina y sugieren que la proteína de B. pertussis recombinante se pliega, en E. coli, en una forma parecida a la de su estructura tridimensional nativa. Además, la S1 recombinante presentaba una actividad de NAD-glucohidrolasa que también se identifica con el promotor A. Se inmunizaron y reestimularon ratones mediante inyección intraperitoneal de una preparación cruda de cuerpos de inclusión de S1r, o con la S4 recombinante unida a metionilo purificada. El material de la subunidad S1r utilizado estaba constituido tanto por el polipéptido completamente procesado como por la preproteína sin procesar, en una relación aproximada de 1:2; no se conoce la inmunogenicidad relativa de las dos especies de S1r. Se sometieron muestras de suero a un ensayo RIA en fase sólida, para determinar la presencia de anticuerpos antitoxina (Figura 5). Los animales que recibieron la S1 recombinante mostraron una respuesta antitoxina significativa, independientemente de que las dosis de inmunización hubieran sido formuladas con adyuvante completo de Freund, o no lo hubieran sido. La S4 recombinante, que sólo se administró con adyuvante, también fue muy inmunogénica en relación con la toxina completa administrada con adyuvante y con la vacuna comercial de pertussis.

El tratamiento de células CHO cultivadas, con toxina pertussis completa produjo una morfología "de agrupamiento" (Hewlett et al., supra) que puede ser abolida con sueros antitoxina (Gellenius et al., supra). En experimentos preliminares, los sueros de ratón contra S1r o contra S4r, preparados como se ha descrito anteriormente y que poseían títulos relativamente altos de anticuerpos antitoxina, no fueron capaces de neutralizar, rutinariamente, la respuesta de las células CHO a la toxina nativa.

Inmunoprotección de ratones con S1 recombinante. Los ratones inmunizados con las subunidades S1 recombinante cruda, S4 recombinante purificada, y con materiales de testigo apropiados (véase arriba), se sometieron a desafío intracerebral (i.c.) con la cepa 18.323 de B. pertussis, virulenta para ratones, y se calificaron los datos de mortalidad hasta un total de 45 días después del desafío (Figura 6). Los ratones fueron inmunizados con 50 \mug del artículo a ensayar (100 \mul de una dilución 1:35 de vacuna comercial de pertussis), mediante inyección intraperitoneal; se les reestimuló con una cantidad idéntica 21 días después de la inoculación y se les desafió, 7 días más tarde, mediante desafío intracerebral con la cepa viable 18.323 de B. pertussis (3 x 10^{4} organismos por animal). Aunque no se esperaba protección debido a la falta de holotoxina activa en las preparaciones recombinantes, fue sorprendente observar un aumento del periodo de supervivencia de los animales inmunizados con S1r en relación con los animales de testigo que no habían sido inmunizados. Además, algunos de los animales que recibieron S1r con adyuvante estuvieron completamente protegidos contra el desafío; los ratones inmunizados con S4r administrada con adyuvante, aunque presentaron una buena respuesta de anticuerpos (véase Figura 5), no estuvieron mejor protegidos que los ratones sin inmunizar. En otro experimento preliminar, se manifestó que la S1r con adyuvante producía una protección contra el desafío que dependía de la dosis recibida. La protección incompleta en el ensayo de desafío i.c., puede estar basada en una ausencia de holotoxina activa en el material de inmunización; a pesar de eso, la protección conseguida en este estudio preliminar demuestra que la proteína S1 recombinante tiene posibilidades como material vacunal de subunidades. Estudios posteriores no han confirmado una inmunoprotección contra el desafío intracerebral con la cepa 18.323 de B. pertussis, virulenta para ratones.

Análogos de S1

Utilizando técnicas de ingeniería de proteínas y de mutagénesis específica de un sitio, se hicieron análogos a S1 truncados. Se encontró que la región limitada por la valina 7 y la prolina 14 era una región necesaria para la actividad de ADP-ribosiltransferasa de la molécula de S1. Un epítopo antigénico que se une a un anticuerpo monoclonal que protege pasivamente contra la actividad de la toxina en ratones (es decir, un epítopo que está implicado en la producción de una respuesta protectora) está situado, al menos parcialmente, en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive. La mutagénesis de la molécula de S1 en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, produce moléculas de análogos a la S1 que carecen de actividad enzimática, aunque mantienen el epítopo protector. El epítopo protector es importante para proporcionar inmunoprotección contra la toxicidad de pertussis. Las modificaciones de la región comprendida entre la valina 7 y la prolina 14, incluyendo la sustitución de uno a más aminoácidos, da como resultado productos análogos a la S1 que pueden producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y que están sustancialmente libres de componentes reactogénicos.

Subclonación del gen de la S1 de PTX en pUC18

El plásmido pPTX42, que contenía el operón entero de la toxina de Bordetella pertussis (PTX), se obtuvo de J. Keith (NIAID, Rocky Mountain Laboratory) como células JM109 transformadas. Las bacterias se hicieron crecer en caldo L que contenía ampicilina, y el plásmido se recuperó y purificó por métodos habituales (Maniatis et al., supra). Un fragmento de ADN de 792 pp. bb., que contenía una porción del gen (cistrón) de la S1 de PTX (Locht y Keith, supra), se aisló del pPTX42 mediante digestión del plásmido con las enzimas de restricción AvaI y XbaI, seguida de electroforesis en gel de acrilamida y posterior elución del fragmento de ADN del gel. Este fragmento de ADN comienza en el sitio AvaI localizado justamente dentro de la fase de lectura abierta de la proteína pre-S1, y termina en un sitio XbaI localizado en el codón de terminación de S1. El vector habitual de clonación pUC18 también se digirió con AvaI y XbaI, y el producto digerido se trató con fosfatasa. Se llevó a cabo una reacción de ligamiento con el vector pUC18 digerido, el fragmento de ADN de 792 pp.bb. (AvaI-XbaI) de pPTX42, y ADN ligasa de T4 utilizando las condiciones habituales. Con la mezcla de ligamiento se transformaron células DH52\alpha competentes de nueva aportación, y se seleccionaron transformantes sobre placas de agar con caldo L que contenía ampicilina y "Blue-gal" (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Se seleccionaron 12 colonias blancas, se hicieron réplicas en placas, y se hicieron crecer como cultivos líquidos de 2 ml. Se trataron las minipreparaciones de las células mediante un procedimiento habitual de lísis alcalina, se digirió el ADN con AvaI y XbaI, y los productos de digestión se sometieron a electroforesis en gel de acrilamida.

Construcción del plásmido de expresión de rPTXS1 pPTXS1/1. A partir del plásmido pPTX42, se aisló un fragmento AvaI-XbaI de 792 pp.bb., como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos de expresión de E. coli, pCFM1156 y pCFM1036, se obtuvieron de Charles F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. El plásmido pCFM1156 se digirió con las enzimas de restricción SstI y NdeI, y se aisló un fragmento de ADN de 1,8 kb a partir de un gel de agarosa mediante electroelución sobre papel NA45 (Schleicher y Schuell, Keene, N.H.). El plásmido pCFM1036 se digirió con SstI y XbaI y, asimismo, se aisló un fragmento de ADN de 2,8 kb. Mediante el tratamiento químico con aminofosfina de Caruthers et al., (supra), se sintetizaron dos cadenas complementarias de un engarzador oligodesoxinucleotídico, que reconstituían la porción omitida por deleción de la fase de lectura abierta de la S1. La secuencia del fragmento sintético, aún manteniendo la secuencia de aminoácidos auténtica, se modificó en lo concerniente al uso de sus codones para reducir la posibilidad de formación de una estructura secundaria en el ARN mensajero; una excepción a esto fue la sustitución del codón de cisteína por un codón de serina en el aminoácido situado en la posición 2 de la secuencia de señal de la preproteína, para eliminar cualquier interacción disulfuro entre la señal de la preproteína y los dos restos de cisteína de las posiciones 41 y 199 de la proteína madura. Este engarzador oligodesoxinucleotídico tiene un sitio NdeI cohesivo para el que hay en el pCFM1156, y un extremo cohesivo AvaI para el ligamiento al sitio AvaI del fragmento de ADN de 792 pp.bb. del gen de la S1. La secuencia de este oligodesoxinucleótido era:

5' TATGCGTTCTAC 3'

\hskip0.4cm

3'ACGCAAGATGAGCC 5'

Se preparó una reacción de ligamiento con el fragmento de ADN de 2,8 kb del pCFM1036, el fragmento de ADN de 1,8 kb del pCFM1156, el fragmento de ADN de 792 pp.bb., que contenía el segmento del gen de S1, el engarzador oligodesoxinucleotídico, y la ADN ligasa de T4. Después del ligamiento, se transformaron células FM6 (obtenidas de C. F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA.) con la mezcla de ligamiento y se hicieron crecer en placas de agar con caldo L con kanamicina. Se seleccionaron colonias y se hicieron réplicas en placas, así como minipreparaciones que se trataron mediante el método alcalino (Maniatis et al., supra). Las muestras de ADN de las minipreparaciones se sometieron a una cartografía mediante enzimas de restricción y se encontró que poseían los fragmentos de restricción de ADN esperados. La región que iba desde el comienzo del engarzador sintético hasta el interior de la fase de lectura abierta del gen de S1 auténtico, se evaluó mediante análisis de la secuencia de ADN. La posterior inducción de este plásmido condujo a un alto nivel de expresión de la proteína S1 recombinante.

Construcción del plásmido de expresión de rPTXS1 pPTXS1/2. Un fragmento de ADN de 181 pp.bb., se aisló a partir del plásmido pPTXS1/1 mediante digestión con AccI y SphI; la posterior purificación del fragmento de ADN se realizó en un gel de poliacrilamida. Este fragmento de ADN es una porción interna del lado izquierdo del gen de S1. Utilizando los mismos procedimientos, se aisló un fragmento de ADN de 564 pp.bb., que representaba la porción del lado derecho del gen, a partir del PTXS1 que fue clonado en pUC18. Esto se llevó a cabo por digestión del plásmido con SphI y BamHI, cortando esta última enzima aguas abajo del sitio (XbaI) de clonación de S1, en el sitio BamHI localizado dentro del agrupamiento de clonación del pUC18. A partir del vector de expresión pCFM1156, se aislaron fragmentos de ADN de 1,8 kb y 2,8 kb mediante digestión con las enzimas de restricción NdeI, SstI y BamHI, seguida de aislamiento por electroforesis en gel de agarosa y electroelución de los fragmentos de ADN. Se sintetizó un engarzador oligodesoxinu- cleotídico; este engarzador de doble cadena tenía los extremos cohesivos NdeI y AccI y la secuencia siguiente:

5' TATGGACGATCCACCTGCTACCGT 3'

\hskip0.4cm

3' ACCTGCTAGGTGGACGATGGCATA 5'

Se llevó a cabo un ligamiento mediante métodos habituales (Maniatis et al., supra), utilizando los fragmentos de ADN de 181 pp.bb., (AccI-SphI) y de 564 pp.bb., (SphI-BamHI) procedentes del pPTXS1/1, los fragmentos de ADN de 1,8 kb (NdeI-SstI) y de 2,8 kb (SstI-BamHI) procedentes del pCFM1156, el engarzador oligodesoxinucleotídico y ADN ligasa de T4. Después del ligamiento, la mezcla se utilizó para transformar células FM5 competentes, de nueva aportación. Se obtuvieron transformantes resistentes a la kanamicina, se realizaron análisis con enzimas de restricción del ADN del plásmido de las minipreparaciones, y se confirmó la estructura mediante análisis de las secuencias de ADN de las zonas de unión.

Digestión del pPTXS1/2 con Bal31 y construcción de vectores con genes de S1 truncados. Para confirmar la presencia de epítopos antigénicos y de sitios con actividad enzimática importantes cercanos al extremo amino de la molécula de S1 madura, se hicieron versiones truncadas de esta proteína. Se digirió el plásmido de expresión pPTXS1/2 con NdeI, se trató con la exonucleasa Bal31 (IBI) bajo las condiciones habituales, y se recogieron alícuotas a diversos tiempos hasta alcanzar los 110 min. Tras la inactivación de Bal31 durante 15 min a 65ºC, se analizaron las muestras mediante electroforesis en geles de agarosa para determinar si había aumentos en la migración electroforética. Se reunieron las muestras de las alícuotas tomadas a los 100 min y 110 min (fracción A), y las restantes muestras se reunieron y se digirieron con Bal31 adicional; se recogieron alícuotas en diversos momentos hasta alcanzar los 180 min. Después de extinguir la reacción, se volvieron a examinar las alícuotas para determinar si había aumentos en la migración electroforética, y se retuvieron cuatro fracciones adicionales (B, C, D y E). Cada una de las cinco fracciones se digirieron individualmente con SstI, y se aislaron fragmentos de ADN de 3-3,5 kb a partir de geles de agarosa, mediante electroelución.

El vector de expresión pCFM1156 se digirió con SstI y HpaI, y, asimismo, se aisló un fragmento de ADN de 1,8 kb. Cada uno de los fragmentos individuales de ADN de 3-3,5 kb (Bal31 romo-SstI) procedentes del pPTXS1/2, se ligaron con el fragmento de ADN de 1,8 kb (SstI-HpaI) utilizando ADN ligasa de T4 bajo las condiciones habituales. Se transformaron células competentes FM5, de nueva aportación, con cada una de las mezclas de ligamiento individuales y se aislaron transformantes resistentes a kanamicina. Se recogieron transformantes de cada uno de los truncamientos de las fracciones A y B, se indujeron minipreparaciones a 42ºC, y se examinaron las preparaciones mediante microscopía óptica para determinar la presencia de cuerpos de inclusión. Se hicieron minipreparaciones con las preparaciones que resultaron positivas en cuanto a la presencia de inclusiones, se digirieron con XbaI, y se examinaron los insertos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, para determinar su tamaño. Se seleccionaron las muestras cuyo tamaño oscilaba en el intervalo de 600-650 pp.bb., para la secuenciación de su ADN, con vistas a confirmar la estructura de los truncamientos. Posteriores análisis de las proteínas recombinantes expresadas, indicaron que una región necesaria para la actividad de ADP-ribosiltransferasa de la mólecula de S1 y un epítopo implicado en la producción de una respuesta protectora (es decir, un epítopo antigénico que se une a un anticuerpo monoclonal, el cual protege pasivamente a los ratones de la actividad de la toxina) se encuentran dentro de una región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, de la molécula madura (para la secuencia completa de aminoácidos, véase Locht y Keith, supra). Todas estas versiones truncadas de la molécula de S1, debido a la construcción del vector, comienzan en su extremo N con un metionilvalilo seguido de la secuencia truncada.

Mutagénesis de S1. El gen de la S1 recombinante se sometió a mutagénesis para realizar un mapa detallado de la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, y para producir moléculas de análogos a S1 que careciesen de actividad enzimática, pero que retuviesen el epítopo protector en esta región. La retención del epítopo protector se define mediante reactividad con el anticuerpo monoclonal 1B7. Esto se consiguió sustituyendo la región auténtica que codifica los restos de aminoácidos que van desde la valina 7 hasta la prolina 14, por segmentos de oligodesoxinucleótidos sintéticos. Estos segmentos contenían sustituciones únicas o dobles en codones, para modificar la secuencia de aminoácidos auténtica. La modificación se puede conseguir por deleción y/o por sustitución. Entra dentro del alcance de la presente invención el modificar una única base para obtener las características deseadas de los análogos a S1. Para modificar la secuencia de aminoácidos se puede modificar una única base. No obstante, está reconocido por los expertos en esta técnica que, estadísticamente, es mayor la posibilidad de una reversión del genotipo al del de la cepa salvaje cuando se modifica una única base que cuando se modifican, por lo menos, dos bases. Por tanto, en una realización preferida, cada uno de estos cambios de codón implica la sustitución de, por lo menos, dos bases en cada uno de los codones, para reducir la eficacia de reversiones. Los engarzadores oligodesoxinucleotídicos se sintetizaron con los extremos cohesivos AccI y BspMII y contenían la secuencia auténtica de la S1, salvo por los cambios de codones señalados en las descripciones de los engarzadores de la Tabla I:

TABLA I

4

Para la construcción de los plásmidos de expresión, se aislaron por electroelución a partir de geles de agarosa, los siguientes fragmentos de ADN:

1)

un fragmento de ADN de 1824 pp.bb. (desde AccI a SstI) procedente de pPTXS1(6A), un plásmido construido como se ha descrito previamente, que expresaba una molécula de análogo a S1 recombinante que había sufrido una deleción del aspartato 1 y del aspartato 2 y la había sustituido con metionil valilo;

2)

un fragmento de ADN de 3,56 kb (desde SstI a BspMII) procedente de pPTXS1(33B), un plásmido construido como se ha descrito previamente, que expresaba un análogo a S1 recombinante que había sufrido una deleción de los primeros catorce restos de aminoácidos y la había sustituido con metionil valilo. En esta particular construcción génica, el ligamiento de extremos romos que produjo esta molécula de longitud reducida creó un nuevo sitio BspMII. Este sitio de restricción, que no estaba presente en el elemento cistrónico de la S1 nativa, permitió la utilización de engarzadores oligonu cleotídicos relativamente cortos, con extremos cohesivos AccI y BspMII para llevar a cabo la mutagénesis.

Estos dos fragmentos de ADN se ligaron con los fragmentos oligodesoxinucleotídicos individuales, descritos anteriormente, bajo condiciones habituales de ligamiento. Estos ligamientos produjeron genes de S1 de nueva construcción: una porción de pPTXS1(6A) que proporcionaba los codones situados aguas arriba hasta alcanzar el sitio de restricción con AccI, los fragmentos sintéticos que proporcionaban las diversas mutaciones en los codones localizados entre el sitio AccI y el sitio BspMII, y una porción de pPTXS1(33B), que proporcionaba lo que quedaba de la región que codificaba la S1 localizada aguas abajo del nuevo sitio de reatricción BspMII. Después del ligamiento, cada una de las mezclas se utilizó para transformar distintas preparaciones de células FM5 competentes, de nueva aportación. Se recogieron los transformantes, se les hizo crecer en minipreparaciones, se indujeron para producir proteína recombinante, y se identificaron mediante microscopía óptica las muestras que resultaron ser positivas por contener cuerpos de inclusión. Estas muestras se fermentaron a gran escala (1-6 litros) a la temperatura de inducción, con el fin de preparar cantidades mayores de cada una de las proteínas de análogos recombinantes. Las pastas celulares aisladas se lisaron en una prensa de French después de resuspenderlas en H_{2}O destilada con DDT 1 mM. Se aislaron los cuerpos de inclusión de estos productos de lisis mediante una simple centrifugación a baja velocidad. Las preparaciones de proteínas de los cuerpos de inclusión contenían, como poco, un 30% y, como mucho un 80% de proteínas recombinantes. Cada preparación se analizó para determinar su capacidad para unirse, en una transferencia Western (Burnette, supra), al anticuerpo monoclonal B2F8 dirigido contra un epítopo dominante identificado en nuestros estudios con los análogos a S1 truncados, y para unirse al anticuerpo monoclonal 1B7, del que se sabe que protege pasivamente a los ratones contra el desafío intracerebral con B. pertussis virulenta (Sato et al., supra). También se evaluaron las muestras para determinar la actividad de ADP-ribosiltransferasa. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla II.

TABLA II

5

\newpage

El análogo 4-1 a la S1 (arg9 \rightarrow Lys) mostró poca, o ninguna, actividad de transferasa aunque mantenía la reactividad con el AcM neutralizante 1B7. Sólo podían observarse cantidades extremadamente pequeñas de actividad enzimática incrementando la cantidad de proteína de 4-1 en el ensayo (Figura 8A); repetidas determinaciones indicaron que la actividad de ADP-ribosiltransferasa específica del análogo a la S1 se reducía en un factor de, por lo menos, 5.000. La medida de la actividad de glucohidrolasa asociada con los mutantes obtenidos por sustitución de un único resto (Figura 8B) reveló un perfil similar al obtenido de la evaluación de la actividad de ADP-ribosiltransferasa. El análogo 4-1 a la S1 mostró una actividad de glucohidrolasa poco detectable, o indetectable, que indicaba una reducción de la magnitud de su actividad en un factor de, por lo menos, entre 50 y 100.

Debido a su aptitud para mantener la capacidad de unión a un anticuerpo monoclonal que protege pasivamente (es decir, para retener un epítopo protector mayoritario) y por carecer de un marcador principal de actividad tóxica (ADP-ribosiltransferasa), la molécula de análogo a la S1 recombinante, producida por el clon pPTXS1(6A-3/4-1), como la que se muestra en la Fig. 7 y sus modificaciones, tiene aplicación, tanto sola como en combinación con otras subunidades de PTX, como vacuna a base de subunidades, económica y segura. Los análogos a la S1 producidos mediante el clon pPTXS1(6A-3/4-1), en los que la arginina 9 se ha sustituido por lisina, son ilustrativos de los análogos a la S1r que tienen la propiedades deseadas, necesarias para ser utilizados como vacunas de subunidades seguras. Otros análogos a 6A-3/4-1 podían incluir, por ejemplo, restos de aspartilo-aspartilo en las posiciones 1 y 2, restos metionilo-aspartilo-aspartilo en las posiciones 0, 1 y 2, y restos metionilo-valilo-aspartilo en las posiciones 0, 1 y 2.

Las vacunas acelulares actuales contienen las subunidades S1, S2, S3, S4 y S5. Se ha hallado recientemente que la modificación morfológica producida por la toxina pertussis en células de mamífero cultivadas, es una propiedad de la subunidad S1 (Burns et al., 1987, Infect. Immun., 55:24-28), aunque este efecto sólo se ha demostrado en presencia del oligómero B. Los estudios preliminares descritos aquí, demuestran la posibilidad de hacer una vacuna de una única subunidad, utilizando análogos a la S1r que retienen un epítopo protector mayoritario pero carecen de actividad tóxica. Los análogos a la S1 también tienen aplicación en combinación con las subunidades S2, S3, S4 y S5. Estas subunidades pueden aumentar la respuesta inmunológica a la S1 y, ellas mismas, pueden presentar epítopos protectores. Entra dentro del alcance de esta invención que, además, las vacunas que comprenden análogos a la subunidad S1 puedan incluir, por lo menos, una de las citadas subunidades S2, S3, S4 y S5 de la exotoxina de Bordetella, y sus mezclas. Las subunidades S2, S3, S4 y S5 pueden ser subunidades obtenidas de B. pertussis, o ser subunidades, y sus análogos, que se han obtenido por ingeniería genética. Los productos de subunidades, obtenidos por ingeniería genética pueden incluir proteínas de fusión y proteínas que no son de fusión.

Para los fines de los experimentos descritos en la sección siguiente, se modificó el sistema de expresión para producir un análogo a la subunidad S1 (S1/1-4) que poseía la sustitución de la arginina 9 por una lisina, pero que también poseía los restos aspartilo-aspartato nativos en su extremo amino.

Evaluación de la actividad biológica de los análogos S1/1-4 y de S1/1

La proteína recombinante de S1 de secuencia nativa (S1/1) y la del análogo S1/1-4 (como se ha descrito anteriormente, contiene la sustitución Arg 9 \rightarrow Lys y los restos aspartil-aspartato del extremo amino de la secuencia nativa), se aislaron individualmente a partir de las células de E. coli productoras, mediante un procedimiento que incluía rotura celular, centrifugación, solubilización con urea, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por filtración en gel. Las pastas celulares se suspendieron en tampón Tris 25 mM, pH 8,5, y se sometieron a lisis mediante rotura a presión elevada (prensa de French). Los productos de lisis se centrifugaron y los sedimentos insolubles, que contenían las proteínas S1 recombinantes, se solubilizaron con urea 8 M y Tris 25 mM, pH 8,5. Después de añadir CuSO_{4} hasta una concentración 50 \muM, las mezclas se agitaron durante toda la noche para permitir la formación de puentes de disulfuro en las proteínas S1 recombinantes. Las mezclas se diluyeron en un volumen igual de urea 8 M y citrato sódico 25 mM, pH 3,8, y se introdujeron en columnas de S-Sepharose ("flujo rápido") equilibradas a pH 3,8 con urea 8 M. Las columnas se eluyeron con gradientes lineales de NaCl (0-0,5 M) con urea 8 M y citrato sódico 12,5 mM, pH 3,8. Se recogieron los picos anchos de cada columna y se valoraron a pH 7,5. Estos grupos de fracciones cromatográficas se introdujeron por separado en columnas de Sephacryl S-200, equilibradas con urea 2 M y fosfato potásico 10 mM, pH 7,5, y se recogieron grupos de materiales de elución que representaban las proteínas de S1 recombinantes monoméricas, oxidadas, de cada una de las especies (S1/1 y S1/1-4). Las proteínas de la subunidad S1 purificadas se analizaron por PAGE-SDS, seguida de tinción con plata de las proteínas en los geles (Figura 9). Las electroforesis de los geles (acrilamida al 12,5%) se realizaron bajo condiciones reductoras. Calle 1, patrones de peso molecular (Pharmacia). Calle 2, 2 \mug de holotoxina de B. pertussis (List Biological Laboratories). Calle 3, 0,2 \mu de proteína de la subunidad S1 de B. pertussis (List Biological Laboratories). Calle 4, 0,2 \mug de S1/1 recombinante. Calle 5, 0,2 \mug de S1/1-4 recombinante. Calle 6, vacía, Calle 7, 0,4 \mug de proteína de la subunidad S1 (List). Calle 8, 0,4 \mug de S1/1 recombinante. Calle 9, 0,4 \mug de S2/1-4 recombinante. En esta etapa de preparación, las especies de S1 recombinantes tenían una pureza superior al 90%.

Para evaluar la actividad biológica de la mutación Arg 9 \rightarrow Lys de la S1, fue necesario conseguir la asociación del análogo mutante y de la proteína de S1 recombinante de secuencia nativa, en las especies de holotoxina pertussis. El oligómero B de la toxina pertussis altamente purificado (una estructura pentamérica de las subunidades S2, S3, S4 y S5 de la toxina) se obtuvo de D. Burns, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration. Se dejó que las dos especies diferentes de subunidad S1 se asociaran individualmente con el oligómero B para formar moléculas de holotoxina (que contenían bien S1/1 o S1/1-4), mediante el procedimiento siguiente. Se combinaron cantidades equimolares de las especies de S1 recombinantes y de oligómero B, en soluciones de urea 2 M y fosfato potásico 10 mM, pH 7,5, y se incubaron durante 30 min a 37ºC. Se evaluó la formación de holotoxina mediante electroforesis en geles de acrilamida nativos (Figura 10). Gel 1, S1/1 recombinante y oligómero nativo. Gel 2, S1/1-4 recombinante y oligómero B nativo. Gel 3, oligómero B nativo. Gel 4, holotoxina de B. pertussis nativa. Gel 5, S1/1 recombinante. Los geles indicaron que las especies de holotoxina se ensamblaban a partir de la combinación del oligómero B nativo, bien con la S1/1 recombinante o con la S1/1-4 recombinante.

Después, las holotoxinas semirrecombinantes (oligómero B más, bien la S1/1 o el análogo S1/1-4) se examinaron para determinar su capacidad para producir una respuesta de agrupamiento en células de ovario de hamster chino (CHO) in vitro; se ha demostrado que esta respuesta es una medida de la citopaticidad de la toxina pertussis. Se diluyeron las muestras experimentales y las muestras de testigo apropiadas en medio de cultivo celular de CHO (medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10%), se esterilizaron por ultrafiltración, y se volvieron a diluir por transferencia en serie a placas de cultivo de plástico de 96 pocillos. Sobre cada pocillo se añadieron, aproximadamente, de 5-7 x 10^{3} células CHO (American Type Culture Collection, CCL 61, células CHO-K1) recién tratadas con tripsina, y las placas se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5%, durante 48-72 horas. Las monocapas celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se tiñeron con cristal violeta, y se examinaron por microscopía óptica para determinar la presencia de agrupamientos celulares.

La Figura 11 ilustra los resultados de tales análisis; son de particular interés los resultados de los Paneles G, H y J, relativos al análogo S1/1-4. El análogo S1/1-4 solo y la dilución 1/1600 de la holotoxina formada a partir de análogo S1/1-4 y oligómero B, mostraron una carencia de agrupamiento celular, mientras que la dilución 1/200 mostraba una cantidad despreciable de agrupamiento. El Panel A muestra células tratadas con una dilución 1/200 de tampón solo. En el Panel B el tratamiento ha sido con oligómero B solo, a una dilución 1/200; a esta dilución se puede ver alguna pequeña cantidad de agrupamiento y es atribuible a los restos contaminantes de subunidad S1 nativa que quedan después de la purificación. El Panel B puede compararse con otro de los campos de este mismo pocillo (Panel I), que muestra claramente la actividad de agrupamiento de la preparación de oligómero B, a una dilución 1/200. El Panel C representa células tratadas con subunidad S1 nativa de calidad comercial (List Biologicals), a una dilución 1/2000. El Panel D se obtiene con holotoxina pertussis nativa de calidad comercial (List Biologicals), a una dilución 1/2000, que demuestra el espectacular efecto citopático de la toxina pertussis sobre las células CHO en cultivo. El Panel E representa el efecto de la subunidad S1 recombinante de secuencia nativa (S1/1), a una dilución de 1/2000. El Panel F muestra el efecto de la S1/1 combinada con oligómero B y diluida hasta 1/2000; el efecto de agrupamiento de las células CHO se manifiesta tan espectacular como el producido por la holotoxina nativa, y apoya los resultados físicos sobre geles (arriba) que muestran la asociación de holotoxina con el oligómero B y la proteína de S1 recombinante. El Panel G ilustra que el mutante Arg 9 \rightarrow Lys, S1/1-4, por sí solo, no causa efectos sobre las células CHO. El Panel H muestra la ausencia de agrupamiento de células CHO a una dilución 1/1600 de la holotoxina formada a partir del análogo S1/1-4 y el oligómero B. A una dilución de 1/200 (Panel J), puede verse algún agrupamiento producido por la holotoxina que contiene S1/1-4; no obstante, la contribución al efecto de agrupamiento de las especies de análogos a la S1 resulta despreciable en comparación con la del oligómero B, por sí solo, a la misma dilución (Panel I).

Se han hecho experimentos iniciales para cuantificar la concentración efectiva de las diversas especies de toxina pertussis, necesaria para producir el fenómeno de agrupamiento de células CHO. Los resultados preliminares indican que, tanto la toxina pertussis comercial como la holotoxina que contiene la S1/1 recombinante, pueden producir agrupamiento de células a concentraciones tan bajas como las comprendidas entre 0,25-0,30 ng/ml; por el contrario, es necesario que la concentración de holotoxina que contiene el análogo S1/1-4 sea de, por lo menos, 10-25 ng/ml, para inducir el efecto de agrupamiento.

Estos resultados confirman que el efecto citotóxico de la toxina pertussis reside en el radical de su subunidad S1, y que está directamente relacionado con sus actividades enzimáticas. Aun más importante es que estos experimentos demuestran que puede formarse una molécula de toxina pertussis relativamente atóxica a partir de subunidades de toxina recombinantes específicas, obtenidas por mutagénesis dirigida a un sitio.

Una finalidad de la presente invención es incluir todas estas modificaciones y mejoras, tal y como están contenidas en el alcance de la presente invención, como reivindicadas.

Las características expuestas en la descripción anterior, en las reivindicaciones siguientes y/o en los dibujos adjuntos pueden ser, tanto por separado como en su conjunto, esenciales para entender la invención en sus distintas formas.

Claims (19)

1. Un método para producir una molécula de ADN, método que comprende la producción de una molécula de ADN que codifica un análogo polipeptídico a la subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, teniendo el análogo polipeptídico una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la subunidad S1 que aparece de forma natural, en uno o más restos de aminoácidos localizados en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, donde la arginina 9 se ha sustituido por lisina, molécula que codifica un análogo que (a) puede producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y (b) está libre de la actividad enzimática asociada con la reactogenicidad de la toxina.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ADN se prepara mediante mutagénesis específica de un sitio.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido citado comprende un epítopo mayoritario, importante para proporcionar inmunoprotección contra la toxicidad de Bordetella.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha exotoxina de Bordetella se selecciona del grupo que consiste en las exotoxinas de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica.

5. Un método para producir un análogo polipeptídico a la subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, método que comprende la expresión de una molécula del ADN que codifica un análogo polipeptídico a la subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, cuyo análogo polipeptídico tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la subunidad S1 que aparece de forma natural en uno o más restos de aminoácidos localizados en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, donde la arginina 9 se ha sustituido por lisina, análogo polipeptídico que (a) puede producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y (b) está libre de las actividades enzimáticas asociadas con la reactogenicidad de la toxina.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho análogo incluye un epítopo mayoritario, importante para proporcionar inmunoprotección contra la toxicidad de Bordetella.

7. El método de la reivindicación 5, en el que dichos niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina proporcionan inmunoprotección contra la toxicidad de Bordetella.

8. El método de la reivindicación 5, en el que dicha exotoxina de Bordetella se selecciona del grupo que consiste en las exotoxinas de B. pertussis, B. parapertussis, y B. bronchiseptica.

9. El análogo de la reivindicación 5, en el que el extremo amino del análogo citado incluye una secuencia con metionilvalilo.

10. Un método para producir un análogo a la subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, método que comprende la producción de un análogo que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 7.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha molécula de ADN se prepara mediante mutagénesis específica de un sitio.

12. Un método para producir una vacuna mejorada para la inmunización contra Bordetella pertussis, que comprende la producción de una vacuna que comprende un análogo polipeptídico a la subunidad S1 de la exotoxina de Bordetella, teniendo el análogo polipeptídico una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la subunidad S1 que aparece de forma natural, en uno o más restos de aminoácidos localizados en la región limitada por la valina 7 y la prolina 14, ambas inclusive, donde la arginina 9 se ha sustituido por lisina, análogo polipeptídico que (a) puede producir niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina y (b) está libre de la actividad enzimática asociada con la reactogenicidad de la toxina.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho análogo incluye, por lo menos, un epítopo mayoritario para proporcionar inmunoprotección contra la toxicidad de Bordetella.

14. El método de la reivindicación 12, en el que dichos niveles de anticuerpos suficientes para neutralizar la toxina, proporcionan inmunoprotección contra la toxicidad de Bordetella.

15. El método de la reivindicación 12, en el que dicha exotoxina de Bordetella se selecciona del grupo que consiste en las exotoxinas de B. pertussis, B. parapertussis, y B. bronchiseptica.

16. El método de la reivindicación 12, en el que la vacuna además incluye, por lo menos, una de dichas subunidades S2, S3, S4 y S5 de la exotoxina de Bordetella, y sus mezclas.

17. El método de la reivindicación 16, en el que al menos una de dichas subunidades S2, S3, S4 y S5 de la exotoxina de Bordetella, y sus mezclas, se ha obtenido por ingeniería genética.

18. El método de la reivindicación 17, en el que dichas subunidades S2, S3, S4 y S5 obtenidas por ingeniería genética, son expresadas como proteínas que no son de fusión, en hospedadores recombinantes seleccionados de los grupos que consisten en E. coli, S. cerevisiae, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Bacillus sp. y vaccinia.

19. El método de la reivindicación 12, en el que dicho análogo polipeptídico de la subunidad S1 se prepara mediante mutagénesis específica de un sitio de una molécula de ADN que codifica la subunidad S1.