ES2202363T3 - Proteinas recombinantes de la hemaglutinina filamentosa de bortedella, principalmente bordetella pertussis, procedimiento para su obtencion y aplicaciones para la produccion de proteinas extrañas o principios activos vacunales. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ADN RECOMBINANTE QUE CONTIENE UNA SECUENCIA (1) QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO HETEROLOGO RESPECTO A UNA HEMAGLUTININA FILAMENTOSA DE BORTELLA (FHA) FUSIONADA EN EL MISMO MARCO DE LECTURA CON UNA SECUENCIA (2) COLOCADA CORRIENTE ARRIBA DE LA PRIMERA, CODIFICANDO ESTA SECUENCIA (2) UNA PARTE AL MENOS DEL PRECURSOR DE LA FHA, LLEVANDO ESTA PARTE AL MENOS LA REGION N-TERMINAL DE UNA PROTEINA MADURA TRUNCADA DE FHA QUE CONTIENE EL SITIO DE INTERACCION DE LA FHA CON LA HERAPINA, POR UNA PARTE, Y QUE, CUANDO ESTA ESTA ELLA MISMA COLOCADA, SOLA, BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR RECONOCIDO POR LAS POLIMERASAS CELULARES B. PERTUSSIS E INTRODUCIDA EN UN CULTIVO DE CELULAS DE B. PERTUSSIS, SE EXPRESA EN ESTE CULTIVO BAJO EL CONTROL DE ESTE PROMOTOR EN EL MEDIO DE CULTIVO DE ESTAS CELULAS, POR OTRA PARTE. LA INVENCION UTILIZA TANTO LAS CAPACIDADES DE LAS BORDETELLA, Y MAS EN PARTICULAR DE B. PERTUSSIS QUE NO PARECE PRODUCIR PROTEASAS EXTRACELULARES, COMO LA FACILIDAD CON LA QUEPUEDEN AISLARSE LAS HEMAGLUTININAS FILAMENTOSAS DE LAS DE LAS BORDETELLA QUE LAS SINTETIZAN.

Description

Proteínas recombinantes de la hemaglutinina filamentosa de Bordetella, principalmente Bordetella Pertussis procedimiento para su obtención y aplicaciones para la producción de proteínas extrañas o principios activos vacunales.

Objetos de la invención

Gracias a la tecnología de la ingeniería genética, hoy día es posible expresar, en principio, cualquier gen en un organismo heterólogo con el fin de disponer de una cantidad ilimitada de una determinada proteína, con fines industriales o de investigación. Con mucha frecuencia se utilizan los microorganismos como huéspedes para la expresión genética.

Paradójicamente, a pesar de los considerables progresos observados durante los últimos veinte años, uno de los problemas que frena la explotación industrial de las proteínas recombinantes está en relación con las dificultades para la purificación de estas moléculas que generalmente se concentran en el organismo que las sintetiza. La purificación de las proteínas recombinantes podría ser considerablemente simplificada si fueran segregadas al medio de cultivo. La manipulación genética de un microorganismo para que segregue una proteína recombinante requiere el conocimiento de los mecanismos moleculares que rigen las vías metabólicas de la secreción. Estos mecanismos son particularmente complejos en las bacterias gramnegativas en las que todas las proteínas segregadas deben atravesar dos membranas lipídicas antes de alcanzar el medio extracelular. En consecuencia, las bacterias gramnegativas no segregan más que una pequeña proporción de las proteínas.

La secreción de proteínas es más simple en las bacterias grampositivas debido a que no poseen más que una sola membrana lipídica. Por desgracia, estos microorganismos generalmente producen también proteasas extracelulares que son nefastas para las proteínas recombinantes. La construcción de bacterias grampositivas deficientes en proteasas ha sido, por lo tanto, un importante campo de investigación. Sin embargo, esta tarea se ha revelado difícil porque con frecuencia estos microorganismos segregan múltiples proteasas y la eliminación de los genes que codifican dichas proteasas disminuye la viabilidad de las cepas y, en consecuencia, su utilidad para la expresión de genes heterólogos. De manera ideal, sería necesario, por lo tanto, utilizar bacterias gramnegativas que no produzcan proteasas extracelulares y que posean un mecanismo de secreción muy eficaz.

La invención saca partido de dos ventajas; por una parte, las características de las Bordetella, y más particularmente de B. Pertussis, que no parece producir proteasas extracelulares y, por otra parte, la facilidad con la que pueden ser aisladas las hemaglutininas filamentosas de las Bordetella que las sintetizan para, entre otras ventajas, soslayar las dificultades mencionadas.

Bordetella Pertussis, el agente etiológico de la tos ferina, es una bacteria gramnegativa que produce y segrega muchas proteínas de tamaño importante, entre las cuales están la toxina tosferínica (alrededor de 107 kDa) y la hemaglutinina filamentosa (Fha, alrededor de 220 kDa). La Fha es el principal producto de secreción y se puede detectar fácilmente mediante la coloración con azul de Coomassie tras la electroforesis del sobrenadante del cultivo.

La Fha es una proteína de 220 kDa producida y segregada por B. Pertussis. Es la principal adhesina y el mayor producto de secreción de este microorganismo (para una revisión, véase Locht, C., Bertin, P., Menozzi, F.D., et Renauld, G. (1993) Mol Microbiol. 9, 653-660). El gen estructural de la Fha ha sido clonado en muchos laboratorios (Brown, D.R., et Parker, C.D. (1987) Infect. Immun., 55, 154-161; Relman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R., et Falkowo, S., (1989) Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2637-2641; Delisse-Gathoye, A.M., Locht, C., Jacob, F., Raaschou-Nielsen, M., Heron, I., Ruelle, J.-L., DeWilde, M., et Cabezón, T., (1990) Infect. Immun 58, 2895-2905) y codifica un precursor de unos 367 kDa (Delisse-Gathoye et al., 1990; Domenighini, M., Relman, D., Capiau, C., Falkow, S., Prugnola, A., Scarlato, V., et Rappuoli, R., (1990) Mol Microbiol. 4, 787-800). El segmento N-terminal de este precursor corresponde a la parte madura de la Fha y el segmento C-terminal se pierde durante la maduración y/o la secreción del producto.

Tras el gen FhaB existe un operón policistrónico responsable a la vez de la biogénesis de la Fha y de las fimbrias, también denominadas aglutinógenos (Locht, C., Geoffroy, M.C., et Renauld, G. (1992) EMBO J. 11, 3175-3183). Este operón contiene cuatro cistrones de los cuales los productos de los tres primeros son homólogos de las proteínas accesorias y la adhesina del pili de muchas bacterias gramnegativas (Locht et al., 1992) y están implicados en la biogénesis de las fimbrias de B. Pertussis y el producto del último es homólogo de Sh1B y HpmB y está implicado en la biogénesis de la Fha (Willems, R.J.L., Geuijen, C., van der Heide, H.G.J., Renauld, G., Bertin, P., van der Akker, W.M.R., Locht, C., et Mooi, F.R. (1994) Mol Microbiol. 11, 337-347).

Por otra parte, la región N-terminal de la Fha es homóloga de las regiones N-terminales de las hemolisinas ShIA y HpmA de Serratia marcescens y Proteus mirabilis, respectivamente (Delisse-Gathoye et al., 1990). Estas hemolisinas son segregadas por estos dos microorganismos y la secreción implica la interactuación del producto del gen shIB o hpmB con la región N-terminal de ShIA y HpmA, respectivamente (Braun, V., Ondraczed, R., et Hobbie, S. (1993) Zbl. Bakt. 278, 306-315). Experimentos de mutagénesis del gen FhaB han mostrado que la región N-terminal de la Fha, homóloga de ShIA y HpmA, es igualmente importante para la biogénesis de la Fha (Willems et al., 1994), sugiriendo, por lo tanto, por analogía con los sistemas de secreción de las hemolisinas, que el producto del gen FhaC interactúa con la región N-terminal y que esta interactuación es importante en el proceso de biogénesis de la Fha. Las proteínas HpmB, ShIB y FhaC son verosímilmente proteínas de la membrana externa (Braun et al., 1993; Willems et al., 1994) y juegan un papel en la secreción de las hemolisinas y de la Fha, respectivamente, a través de la membrana externa. En B. Pertussis, el bloqueo de la secreción a través de la membrana externa conduce a la rápida degradación de la proteína.

La Fha es una adhesina importante de B. Pertussis y expresa al menos tres tipos de actividades de unión (véase Locht et al., 1993). Relman et al. (Relman, D., Tuomanen, E., Falkow, S., Golenbock, D., Saukkonen, K., et Wright, S. (1990) Cell 61, 1375-1382) han mostrado que una secuencia RGD de la Fha madura es responsable de la interactuación de esta molécula con la integrina CR3 (A_{M}\beta_{2}, CD11b/CD18) de los macrófagos. Esta interactuación induce la internación de B. Pertussis en los macrófagos en los que el microorganismo puede sobrevivir.

La Fha puede igualmente interactuar con glucoconjugados, habiendo sido identificado el dominio del reconocimiento de los hidratos de carbono por Prasad et al. (Prasad, S.M., Yin, Y., Rodzinski, E., Tuomanen, E.I., et Masure, R. (1993) Infect. Immun. 61, 2780-2785) en la región 1141 a 1279 de la Fha, un poco más adelante del sitio RGD. Menozzi et al. (Menozzi, F.D., Gantiez, C., et Locht, C. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 78, 59-64) han mostrado que la Fha expresa afinidad por la heparina y puede ser purificada por cromatografía en heparina-sepharosa a partir del sobrenadante del cultivo de B. Pertussis. Esta interactuación con los glucosaminogucanos sulfatados parece tener un papel en la interactuación de los microorganismos con las células epiteliales (Menozzi, F.D., Mutombo, R., Renauld, G., Gantiez, C., Hannah, J.H., Leininger, E., Brennan, M.J., et Locht, C. (1994) Infect. Immun. 62, 769-778).

La Fha es un buen inmunógeno para la inducción de IgA en las vías respiratorias de los pacientes infectados por B. Pertussis (Zackrisson, G., Lagergard, T., Trollfors, B., et Krants, I. (1990) J. Clin. Microbiol. 28, 1502-1505), siendo posible detectar la presencia de IgA incluso mucho tiempo después de la infección (Zackrisson, G., Arminjon, F., Krantz, I., Lagergard, T., Sigurs, N., Taranger, J. et Trollfors, B. (1988) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7, 764-770). Una respuesta inmunitaria de larga duración contra la Fha puede igualmente observarse en el ratón experimentalmente infectado con B. Pertussis por vía nasal (Amsbaugh, D.F., Li, Z.-M., et Shahin, R.D. (1993) Infect. Immun. 61, 1447-1452). También se puede obtener una buena respuesta inmunitaria (a la vez IgA e IgG) contra la Fha en las vías respiratorias del ratón tras la vacunación intranasal con Fha purificada (Shahin, R.D., Amsbaugh, D.F., et Leef, M.F. (1992) Infect. Immun. 60, 1482-1488; Cahill, E.S., O'Hagan, D.T., Illum, L., et Redhead, K. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 107, 211-216). Es posible que una o varias de las actividades de unión expresadas por la Fha sean responsables de la inmunogenicidad mucosa de esta molécula.

La invención aprovecha el mecanismo molecular de la secreción de Fha de Bordetella, principalmente B. Pertussis, para la producción de proteínas o péptidos recombinantes heterólogos por estos microorganismos.

En una de las primeras aplicaciones, la invención permite, principalmente en las condiciones que se describirán más adelante, la secreción de estos péptidos recombinantes heterólogos al medio heterólogo de cultivo y, eventualmente, la recuperación de la parte heteróloga de este péptido recombinante cuando éste es el producto finalmente investigado. Pero otra variante de la invención tiene como objetivo la exposición del péptido recombinante en la superficie de las células procariotas, principalmente con fines de vacunación.

La fusión de proteínas o péptidos heterólogos con la Fha puede, realmente, tener una aplicación particularmente interesante en el campo de la vacunación. De hecho, la Fha tiene la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria mucosa importante y de larga duración tras la infección natural en el hombre o por inmunización intranasal. Esta propiedad probablemente sea debida a las actividades específicas de adhesión de la Fha a las mucosas. Una fusión traduccional de la Fha con un antígeno podría, por lo tanto, facilitar la presentación de este antígeno al nivel de la mucosa nasal cuyo objetivo sería la producción de inmunoglobulinas secretoras (IgA). Tal estrategia es particularmente interesante para la vacunación contra ciertas enfermedades respiratorias y, como el sistema inmunitario de las mucosas respiratorias comunica con el de otras mucosas o, más en general, con otras células epiteliales, macrófagos etc., este principio puede ampliarse a otras muchas enfermedades infecciosas contra las que es importante desarrollar inmunidad de las mucosas. Un tipo así de vacuna, poco costosa, podría administrase fácilmente por vaporización intranasal. Esta vía de vacunación eliminaría el traumatismo causado por la inyección así como el riesgo de destrucción de las vacunas orales en el ambiente ácido del estómago.

Se hace referencia a continuación de los diseños cuyas leyendas se indican al final de esta descripción.

La invención concierne, en primer lugar, al ADN recombinante que contiene una secuencia (1) que codifica un polipéptido heterólogo vis-a-vis de una Fha de B. Pertussis fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia (2) situada anteriormente con respecto a la primera; esta secuencia (2) codifica al menos la región N-terminal de la proteína madura de Fha que, cuando está bajo el control de un promotor reconocido por las polimerasas celulares de B. Pertussis e introducida en un cultivo de B. Pertussis, se expresa en este cultivo bajo el control de este promotor y es excretada al medio de cultivo.

En uno de los casos extremos, la secuencia (2) del ADN recombinante mencionado codifica la totalidad del precursor de la Fha, por ejemplo, de B. Pertussis (a veces designado con la abreviatura FhaB). La incorporación de este ADN recombinante bajo la forma de plásmido principalmente y bajo el control del promotor adecuado en una célula de B. Pertussis conduce a la expresión de la proteína recombinante correspondiente, de la cual una parte es excretada totalmente al medio de cultivo y la otra atraviesa igualmente la membrana de B. Pertussis pero queda adherida a la misma. En este último caso, veremos a continuación que la proteína recombinante, incluida la secuencia de aminoácidos correspondientes a los polipéptidos heterólogos, se encuentra en la superficie de estas células.

La proteína excretada al medio de cultivo puede ser purificada de forma ventajosa principalmente por un procedimiento que consiste en poner en contacto el medio de cultivo con heparina inmovilizada sobre un soporte insoluble para formar un complejo de heparina y Fha, del cual la proteína recombinante puede ser recuperada por disociación del complejo.

A continuación, se verá en esta exposición que los primeros ensayos han sido realizados en una cepa de B. Pertussis BGR4 en la que la parte más importante de la fase de lectura del gen FhaB y su promotor han sido eliminados del cromosoma por dos elementos sucesivos de recombinación homólogos. El ADN recombinante contenía un fragmento EcoRI de unas 10 kb aislado a partir de un clon enteramente secuenciado, principalmente por Delisse-Gathoye et al., 1990. Es en relación la secuencia descrita por estos autores por lo que se precisan en el presente texto, las posiciones relativas de ciertos nucleótidos en el cromosoma de B. Pertussis, correspondiendo el primer sitio de EcoRI E^{a} a la posición 1 y ocupando, por lo tanto, el segundo sitio E^{b} la posición 10035.

El ATG de iniciación de la traducción se encuentra situado anteriormente con respecto al sitio E^{a} (los tres ATG en las posiciones 253, 298, 427, respectivamente) estando el promotor intercalado entre el sitio E^{a} y el ATG de iniciación pertinente. El precursor se extiende hasta más allá de la posición del sitio E^{b} (posición 11025).

Como se describirá de forma más detallada en los ejemplos, se han producido muchos ADN recombinantes que contienen principalmente secuencias que se extienden, respectivamente, entre los nucleótidos 1 y 10035 (BPGR41), 6292 (BPGR413), 5215 (BRGR48), 2841 (BPGR44), 1575 (BPGR412) y, finalmente 907 (BPGR415). Los sitios de restricción correspondientes se indican en la figura 2 B.

Las observaciones realizadas sobre la expresión de estos fragmentos de tamaño decreciente, antes de que hayan sido recombinados con una secuencia codificadora de un polipéptido heterólogo han sido las que siguen. Como resulta de las figuras 2 A y 2 B, se obtuvo una excreción importante del péptido codificado por el péptido BPGR41, excreción que se reducía para los fragmentos contenidos en los plásmidos BPGR413 y BPGR48, que no contenían más que la secuencia codificadora de la casi totalidad de la proteína madura (BPGR413) y una secuencia truncada codificadora de un polipéptido igualmente truncado (BPGR48). Estas observaciones se encuentran reflejadas en los ensayos ilustrados en la figura 2 B donde los productos de expresión han sido detectados con anticuerpos policlonales de rata anti-Fha. Pero en este ensayo se constata la ausencia de expresión detectable de los plásmidos que contienen secuencias más cortas. Se constata, por el contrario, en otro sistema de medida (coloración con azul de Comassie: figura 2 A) una recrudescencia de la expresión con el plásmido BPGR44. Sin que sea necesario ver una relación de correspondencia, se observa que la parte reconocida por la mayoría de los anticuerpos policlonales de la secuencia Fha no es necesaria para la existencia de excreción en el sistema utilizado. Cuando se acorta más la secuencia truncada de Fha se observa de nuevo una reducción de la excreción. Así, el fragmento contenido en el plásmido BPGR412 se expresa en un grado menor, incluso si no se observa ninguna banda en la figura 2 en la calle de la electroforesis en gel correspondiente al plásmido BPGR412. Pero al poner en contacto un cultivo correspondiente con heparina inmovilizada se puede aislar una fracción excretada reconocida por anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la región N-terminal de la Fha.

Resulta que las secuencias (2) que entran en los ADN recombinantes según la invención deben, en todo caso, comprender las señales de excreción de la secuencia codificadora de la Fha y de la región N-terminal homóloga de las regiones N-terminales de las hemolisinas Sh1A y HpmA de Serratia marcescens y Proteus mirabilis.

Para la realización de una de las aplicaciones preferidas de la invención, a saber, la producción de un péptido heterólogo y su recuperación del medio de cultivo, resulta, por consiguiente, que la extensión de la secuencia (2) a partir del extremo N-terminal de la Fha hacia su extremo C-terminal será la escogida, para no ir más allá de la longitud que haría que la transformación de B. Pertussis con este ADN recombinante, entonces situado bajo el control de un promotor susceptible de ser reconocido por B. Pertussis, no permitiera la excreción directa de la proteína recombinante formada al medio de cultivo de este B. Pertussis.

En el marco de esta aplicación, un ADN recombinante preferido se caracteriza porque la secuencia (2) se extiende entre el ATG correspondiente al codón de iniciación de la traducción de la Fha a un nucleótido C-terminal, más allá del nucleótido 907, en la dirección de la traducción y, preferentemente, más allá de la posición 6292.

Sin que esto sea decisivo, se puede todavía afirmar que un ADN recombinante preferido será aquel que se caracterice por no reaccionar más que débilmente con los anticuerpos anti Fha más particularmente dirigidos contra los epitopos de la parte C-terminal de la Fha madura, situados más allá del sitio nucleotídico 2841, en el sentido de la traducción.

No es necesario decir que la secuencia recombinante que comprenda las secuencias (1) y (2) puede realizarse de una forma conocida en función del objetivo final que se le va a dar. Eventualmente, la secuencia (1) codificadora del péptido heterólogo se encontrará enmarcada por regiones cortas codificadoras de péptidos previamente definidos formando los sitios de escisión específicos de enzimas proteolíticas, ellas mismas específicas, gracias a que la parte heteróloga del polipéptido recombinante puede ser fácilmente separada a partir de éste.

En otra aplicación ventajosa de la invención, el péptido recombinante es susceptible de ser utilizado como principio vacunal, estando dotada la secuencia peptídica heteróloga de propiedades inmonogénicas elegidas previamente y, preferentemente, la parte derivada de la proteína madura de Fha que contiene al menos sitios específicos de unión de la Fha a las mucosas o, de forma más general, a otras células eucariotas, principalmente células epiteliales o macrófagos.

La utilización de ADN recombinante para la producción de polipéptidos heterólogos puede ser considerada en células procariotas distintas de Bordetella Pertussis o incluso de las Bordetella en general. En efecto, hay que recordar que Stibitz, Weiss y Falkow han referido ADN de Bordetella que contienen la secuencia codificadora del precursor de la Fha y el conjunto de los genes de regulación, incluyendo el gen FhaC, es decir, el gen auxiliar cuyo producto de expresión es igualmente necesario para la expresión de la Fha, pudiendo, cuando son transportados en E. coli, ser expresados y expuestos en la superficie de bacterias E. coli transformadas (J. of Bacteriology (1988) 170, 2904-2913).

No es necesario decir que la invención concierne, por lo tanto, a todos los cultivos celulares en los que puede expresarse la Fha. Por lo tanto, la invención concierne particularmente a los cultivos celulares de una especie de Bordetella, principalmente B. Pertussis, cuyas células son igualmente portadoras del gen FhaC susceptible de expresarse en estas células.

La invención concierne también a los cultivos celulares transformados de especies distintas de Bordetella cuando contienen igualmente una secuencia codificadora al menos de la parte de la FhaC necesaria para la expresión de la secuencia (2) bajo una forma igualmente susceptible de expresarse en el seno de las células de este cultivo.

Esto es lo que ocurre en el caso de E. coli y, llegado el caso, con la reserva de adaptaciones menores que autoricen la expresión de los ADN recombinantes de la invención en otras bacterias gramnegativas, por ejemplo, el tipo salmonella, vibrio, etc

Hay que recordar que Willems et al. (1994) Mol. Microbiol. 11, 337-347, han secuenciado enteramente una secuencia codificadora de la proteína FhaC.

Tampoco hay que insistir en que la invención no se limita a los ADN recombinantes que contienen una secuencia codificadora de la Fha de B. Pertussis. Ésta puede ser reemplazada por cualquier secuencia correspondiente que pueda ser aislada a partir de otras Bordetella, sean Bordetella patógenas para el hombre, principalmente B. Parapertussis o B. Bronchiseptica o incluso Bordetella patógenas para animales, principalmente Bordetella Bronchiseptica, patógena para el perro o el cerdo.

La invención no se limita sólo a los ADN recombinantes cuyas secuencias (2) se limitan a secuencias truncadas del ADN codificador de una Fha de Bordetella. Como se ha visto previamente, la invención concierne igualmente a los ADN recombinantes que contienen secuencias (2) más largas cuando, por el contrario, se investigue la producción de células procariotas, principalmente bacterias portadoras del producto de expresión del ADN recombinante definido expuesto en su superficie. La secuencia heteróloga (1) puede ser incorporada al interior de la secuencia codificadora de Fha, incluso al propio FhaB, o fusionada a la Fha madura, o al precursor, con conservación del código de lectura correspondiente.

En el caso en que la célula huésped, eventualmente tras atenuación o inactivación, pueda ser utilizada como soporte de vacuna, se aprecia que la invención aporta nuevas variedades vacunales, incluyendo células procariotas del tipo que porta en su superficie el producto de la expresión del ADN recombinante. Ventajosamente se expondrán a la vez en la superficie de las bacterias en cuestión, por una parte, la secuencia de aminoácidos correspondiente a los sitios antigénicos del péptido heterólogo, y uno de los sitios de adherencia de la proteína Fha a las mucosas, o incluso a otras células eucariotas como las células epiteliales o los macrófagos, por la otra parte.

A título de ejemplos de técnica, que pueden ser utilizados para obtener esta orientación conveniente, hay que hacer referencia a la patente europea No. 0242243, patentada en 06/03/87.

Mientras en el caso de la producción in vitro de una proteína o de un polipéptido recombinante se puede disponer de células procariotas transformadas por un plásmido, para la construcción de bacterias portadoras del producto de expresión del ADN recombinante en su superficie, es preferible que éste haya sido incorporado bajo el control del promotor apropiado al ADN cromosómico de dichas células. Se pueden utilizar todas las técnicas conocidas para este fin, como las técnicas de recombinación homóloga.

No es necesario señalar que la secuencia (1) puede codificar todas las secuencias antigénicas deseadas, se trate de antígenos de Bordetella, de Shigella, de Neisseria, de Borrellia etc. de toxinas o toxoides diftéricos o coléricos, antígenos víricos, principalmente de la hepatitis B, hepatitis C, poliovirus o VIH, antígenos parasitarios como plasmodium, Schistozoma, toxoplasma etc.. Se trata evidentemente de ejemplos que no tienen ningún carácter limitador.

Igualmente, los huéspedes celulares pueden estar constituidos por cualquier bacteria atenuada o inactivada, como shigellas atenuadas, E. coli atenuado o salmonellas atenuadas.

Pero, como se ha visto, cualquier Fha de Bordetella puede ser construida. Partiendo de una secuencia codificadora de una de ellas, se sabe que se pueden detectar secuencias correspondientes contenidas en el ADN cromosómico de otras Bordetella, por ejemplo, usando las sondas apropiadas.

La invención presenta un interés muy particular para la constitución de composiciones inmunógenas y vacunales destinadas a la administración por contacto con las mucosas, principalmente por vía nasal. La invención tiene, por lo tanto, un interés particular para la prevención de las infecciones de las vías respiratorias o de los tejidos susceptibles de ser afectados por esta vía. Las composiciones del género en cuestión pueden presentarse en forma de aerosol, administrable principalmente por vía nasal. La invención interesa tanto a la vacunación humana como animal.

Otras características de la invención aparecen a lo largo de la descripción que sigue, construcciones de ensayos biológicos que son realizados en el marco de la invención y que aportan la base experimental necesaria.

Figuras Figura 1

Análisis mediante SDS-PAGE y coloración con azul de Coomassie de los sobrenadantes del cultivo de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR4 y BPGR41. Los marcadores del tamaño y los sobrenadantes del cultivo no concentrado de tres cepas de B. Pertussis han sido depositados en SDS-poliacrilamida. Tras la electroforesis, se ha coloreado el gel con azul de Coomassie según lo descrito por Sambrook et al (1989). Los pesos moleculares de los marcadores del tamaño se muestran en el margen.

Figuras 2 A y 2 B

Electroforesis (A) y Western blot (B) de los sobrenadantes del cultivo de cepas de B. Pertussis BPGR41, BPGR413, BPGR48, BPGR44, BPGR412, BPGR415, BPGR4 y BPSM. Tras la electroforesis, se ha coloreado el gel con azul de Coomassie, como se ha descrito en la figura 1 (A), o transferido sobre membrana de nitrocelulosa y analizado mediante Western blot, según lo descrito por Delisse-Gathoye et al. (1990), usando un anticuerpo policlonal anti Fha de rata, en una dilución 1/1000. Se muestra el mapa de las construcciones que son la base de las diferentes cepas. E^{a} y E^{b} representan, respectivamente, el primero y segundo sitios EcoRI del gen FhaB (Delisse-Gathoye et al. 1990).

Figuras 3 A y 3 B

Análisis mediante electroforesis (A) y Western blot (B) de los sobrenadantes del cultivo de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR4, BPMC, BPGR44, BPGM47, BPMC4, BPSM4 y B. Parapertussis PEP4. Tras la electroforesis se ha coloreado el gel con azul de Coomassie, como se ha descrito en la figura 1 (A), o analizado mediante Western blot, utilizando antisuero anti FHA de rata en una dilución 1/500 (B), como se ha descrito en la figura 2.

Figura 4

Mapa de restricción de los diferentes fragmentos de ADN expresado en fusión con el gen codificador de Ma1E. La línea negra de arriba muestra la longitud de la porción de FhaB que codifica la FHA madura. N y C designan respectivamente las regiones amino y carboxilo terminales. La línea negra del centro muestra la longitud de la fase abierta de lectura de FhaB. E, EcoRI; Sp, SphI; S, SalI; B, BamHI. Las flechas indican la longitud de los fragmentos expresados y la dirección de la expresión.

Figuras 5 A y 5 B

Western blot de los sobrenadantes del cultivo de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR44, BPGR4, BPJN1. Tras la electroforesis, se han analizado los geles mediante Western blot, como se ha descrito en la figura 2, utilizando un antisuero anti FHA de rata en una dilución 1/500 (A) o un anticuerpo anti péptido 190-211 de Sm28GST de rata, en una dilución 1/250 (B). La calle de la izquierda del gel (B) contiene la Sm28GST recombinante purificada.

Figura 6

Western blot de los sobrenadantes y de las proteínas asociadas a las células de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR4, BPGR5 y BPGR6. El análisis mediante Western blot de las proteínas extraídas de los sobrenadantes de los cultivos (calles 5 a 8) o de las fracciones proteicas asociadas a las células (calles 1 a 4) de diferentes cepas de B. Pertussis BPSM (calles 1 a 5), BPGR4 (calles 2 y 6), BPGR5 (calles 3 y 7) y BPGR6 (calles 4 y 8) ha sido realizado como se describe en la figura 2, utilizando el anticuerpo monoclonal anti FHA 12.1.9 (Delisse Gathoye et al. 1990).

Figura 7

Análisis mediante Western blot de los sobrenadantes y de las proteínas asociadas a las células de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR5 y BPGR6. El análisis mediante Western blot de las proteínas extraídas de los sobrenadantes de los cultivos y purificadas sobre matriz de heparina-sepharosa (calles 4 a 6) o de fracciones proteicas asociadas a las células (calles 1 a 3), de diferentes cepas de B. Pertussis BPSM (calles 1 y 4), BPGR5 (calles 2 y 5) y BPGR6 (calles 3 y 6) ha sido realizado como se describe en la figura 2, utilizando un antisuero anti Sm28GST de conejo diluido 200 veces.

Figura 8

Análisis mediante Western blot de los sobrenadantes del cultivo purificados en columna de heparina-sepharosa de las cepas de B. Pertussis BPSM, BPGR5 y BPGR6. El análisis mediante Western blot de las proteínas de los sobrenadantes de los cultivos purificadas sobre matriz de heparina-sepharosa de las cepas de B. Pertussis BPSM (calle 1), BPGR5 (calle 2) y MPGR6 (calle 3) ha sido realizado como se describe en la figura 2, utilizando el anticuerpo monoclonal anti FHA 12.1.9 (Delisse Gathoye et al. 1990).

Figura 9

Análisis mediante Western blot de los sobrenadantes del cultivo y de las proteínas asociadas a las células de las cepas de B. Pertussis BPSM y BPGR60. El análisis mediante Western blot de las proteínas de los sobrenadantes de los cultivos (calles 1 y 3) o de las fracciones proteicas asociadas a las células (calles 2 y 4) de las cepas de B. Pertussis BPSM (calles 3 y 4) y BPGR60 (calles 1 y 2) ha sido realizado como se describe en la figura 2, utilizando el anticuerpo monoclonal anti FHA 12.1.9 (Delisse Gathoye et al. 1990).

Figura 10

Análisis mediante Western blot de los sobrenadantes del cultivo y de las proteínas asociadas a las células de las cepas de B. Pertussis BPSM y BPGR60. El análisis mediante Western blot de las proteínas de los sobrenadantes de los cultivos (calles 1 y 3) o de las fracciones proteicas asociadas a las células (calles 2 y 4) de las cepas de B. Pertussis BPSM (calles 1 y 3) y BPGR60 (calles 3 y 4) ha sido realizado como se describe en la figura 2, utilizando un antisuero anti Sm28GST de conejo. La calle 5 contiene la Sm28GST recombinante purificada.

Figuras 11 A y 11 B

Colonización del ratón OF1 por B. Pertussis BPGR60 y Tohama I. Los ratones OF1 han sido infectados por vía nasal con las cepas de B. Pertussis Tohama I (cuadrados blancos), BPGR60 (círculos negros), BPGR60 y luego con Tohama I (triángulos negros de A) o Tohama I y luego BPGR60 (triángulos negros de B). Tres horas después de la infección, se ha sacrificado a una serie de ratones y se ha realizado una estimación del número de B. Pertussis viables en cada pulmón. Los otros grupos de ratones han sido analizados una o varias semanas después de la infección, como se muestra en la figura.

Figuras 12 A y 12 B

Determinación de TNF e IL-6 en los ratones infectados por B. Pertussis BPGR60. Se ha medido el TNF (A) y la IL-6 (B) en los ratones no infectados (sanos) e infectados por B. Pertussis BPGR60, a las 3 horas, 6, horas, 1 día, 3 días o 7 días de la infección.

Figuras 13 A y 13 B

Determinación de IgA anti Sm28GST y anti Fha en los lavados broncoalveolares de los ratones OF1 infectados por B. Pertussis BPGR60. Los ratones OF1 han sido infectados con B. Pertussis BPGR60 por vía nasal. Tras la infección, en los días indicados en la figura, se han sacrificado grupos de ratones y se ha medido la IgA anti Sm28GST (A) y anti Fha (B) del líquido del lavado broncoalveolar. En los días 56 (en A) o 63 (en B), se ha administrado por vía nasal 20 \mug de Sm28GST (triángulos negros) o una nueva dosis de B. Pertussis BPGR60 (cuadrados negros).

Figura 14

Determinación de complejos IgA-Sm28GST en los lavados broncoalveolares de los ratones tratados como se ha descrito previamente en la leyenda de la figura 13. Se representa la cantidad de complejos (columnas rayadas) en comparación con la IgA anti Sm28GST libre (columnas negras) y la IgA total (columnas grises).

Figuras 15 A y 15 B

Carga parasitaria observada tras la infestación por S. mansoni de ratones OF1 previamente inmunizados con BPGR60 y con "refuerzo" con Sm28GST libre. Las dosis administradas son idénticas a las utilizadas en los experimentos de inmunización (Fig 13). Tras 42 días se sacrifican los ratones y se perfunde el hígado para la evaluación de la carga parasitaria (A). Se solubilizan químicamente el hígado y el intestino y se cuentan los huevos (B). La columna negra corresponde a los ratones no tratados, la columna rayada a los ratones que han recibido la Sm28GST libre, el día 63 y la columna gris corresponde a los ratones tratados con BPGR60 (día 0) y Sm28GST libre (día 63).

Ejemplos I. Complementación de la cepa de B. Pertussis BPGR4 con un plásmido derivado de pBBR1 que contiene el gen FhaB

Con el fin de saber si es posible complementar una mutación cromosómica del gen FhaB por un plásmido autorreplicativo, hemos utilizado la cepa de B. Pertussis BPGR4 (Locht et al., 1992), una cepa derivada de la cepa salvaje de B. Pertussis Tohama I en la que el fragmento EcoRI de 10 kb, que contiene la mayor parte de la fase de lectura del gen FhaB y su promotor, ha sido eliminado del cromosoma por dos eventos sucesivos de recombinación homóloga. Esta cepa no produce FHA. Por otra parte, el fragmento EcoRI de 10 kb aislado de pRIT13202 (Delisse-Gathoye et al., 1990) que contiene la mayor parte del gen FhaB ha sido clonado en el sitio EcoRI del plásmido pBBR122. Este plásmido es un derivado del pBBR1 aislado de Bordetella Bronchiseptica, descrito por Antoine et Locht (Antoine, R., et Locht, C., (1992) Mol. Microbiol. 6, 1785-1799). Contiene un fragmento HhaI, de 1364 pb, proveniente del pBR328 (Soberon, X., Covarrubias, L., et Bolívar, F. (1980) Gene 9, 287-305) que confiere resistencia al cloranfenicol, insertado en el sitio PvuI así como el gen comercial (Pharmacia), que confiere resistencia a la canamicina, insertado en el sitio AvaI en posición 1388.

La digestión del pBBR122 por EcoRI y la inserción del gen FhaB bajo la forma de fragmento EcoRI de 10 kb inactiva el gen de resistencia al cloranfenicol pero mantiene la resistencia a la canamicina. El plásmido recombinante, denominado pBG1, ha sido introducido en B. Pertussis BPGR41 por electroporación. Esta nueva cepa de B. Pertussis es denominada B. Pertussis BPGR41. El análisis del sobrenadante del cultivo de B. Pertussis BPSM, un derivado Sm^{R} de la cepa Tohama I (Menozzi et al., 1994), de B. Pertussis BPGR4 y de B. Pertussis BPGR41 mediante electroforesis en SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y coloración con azul de Coomassie (Fig 1) así como mediante Western blot, utilizando anticuerpos policlonales de rata específicos para la FHA, muestra que el pBG1 puede complementar eficazmente la mutación FhaB de B. Pertussis BPGR4.

II. Eliminaciones progresivas de la región C-terminal de FhaB

El producto primario del gen FhaB, es decir, el precursor de la FHA, se denomina FhaB. Como la región N-terminal homóloga de las hemolisinas Sh1A y HpmA es importante para la biogénesis de la FHA (Willems et al., 1994), es necesario investigar el papel de la región C-terminal de FhaB en la biogénesis de la FHA. Se han obtenido muchas eliminaciones de la región C-terminal: pBG13 es el resultado del cambio del fragmento SphI/BamHI, de 2,5 kb, de pBG4 por el fragmento SphI/BglII, de 6 kb, de pRIT13202 (Delisse-Gathoye et al., 1990); pBG8 es el resultado de la inserción del fragmento BamHI, de 4,7 kb, en pBG4 digerido por BamHI; pBG4 es el resultado de la digestión de pBG1 por BamHI y de su religamiento, habiendo perdido este plásmido los dos fragmentos BamHI, de 4,7 kb y 2,37 kb; pBG12 es el resultado del intercambio del fragmento SphI/BamHI, de 2,5 kb, de pBG4 por el fragmento SphI/BamHI, de 1,27 kb, de pUC18-3, habiendo sido generado pUC18-3 por cambio del fragmento SphI/SalI de 15 pb de pUC18 por el fragmento SphI/SalI de 1,27 kb de pRIT13197 (Delisse-Gathoye et al., 1990); pBG15 es el resultado del religamiento de dos fragmentos PvuI, de 3,65 kb y 2,76 kb, tras la digestión de pBG4 por PvuI, generándose así la eliminación del fragmento PvuI de 1,9 kb. Los plásmidos pBG13, pBG8, pBG4, pBG12 y pBG15 han sido introducidos en B. Pertussis BPGR4 por electroporación con lo que se generan las cepas de B. Pertussis BPGR413, BPGR48, BPGR44, BPGR412 y BPGR415, respectivamente.

Los sobrenadantes del cultivo de estas distintas cepas han sido analizados mediante SDS-PAGE y coloreados con azul de Coomassie así como mediante Western blot, utilizando anticuerpos policlonales de rata anti FHA. Los resultados se muestran en la figura 2 e indican que, en comparación con la cepa de B. Pertussis BPSM y la cepa B. Pertussis BPGR41, las cepas BPGR413 y BPGR48, producen mucho menos FHA en el sobrenadante del cultivo. Por el contrario, la cepa BPGR44 produce más FHA truncada y segregada que las cepas BPSM o BPGR41. Las cepas BPGR412 y BPGR415 producen de nuevo menos FHA truncada que la cepa BPGR44 aunque la FHA truncada producida por BPGR412 es claramente visible en el sobrenadante del cultivo. Estos experimentos muestran la importancia de la región C-terminal de FhaB en la biogénesis y/o secreción de la FHA madura y también que una FHA truncada (por ejemplo, en la cepa BPGR44) puede ser muy eficazmente segregada en ausencia de la región C-terminal de FhaB.

III. Importancia de FhaC en la biogénesis de la FHA truncada codificada por pBG4 y secreción por Bordetella Parapertussis

Como B. Pertussis BPGR44 segrega de forma muy eficaz la FHA truncada, resultaba importante saber si esta secreción es siempre dependiente del producto del gen FhaC. Para ello, se ha introducido pBG4 en la cepa de B. Pertussis BPMC (Locht et al., 1992). Esta cepa se caracteriza por una eliminación cromosómica del gen FhaB total y de la región intergénica entre FhaB y los genes auxiliares posteriores, incluido el FhaC. No expresa, por lo tanto, ni FhaB, ni FhaC ni los genes fimBCD (también denominados FhaDAE). Los análisis mediante SDS-PAGE y coloración con azul de Coomassie de los sobrenadantes del cultivo de la cepa de B. Pertussis BPMC (pBG4), denominada BPMC4, muestran que esta cepa no produce FHA truncada extracelular. Por lo tanto, estos resultados (Fig. 3) indican que para la producción extracelular de la región N-terminal de la FHA, es necesaria la expresión del gen FhaC. La importancia de la región N-terminal de la FHA homóloga a las hemolisinas Sh1A y HpmA (Delisse-Gathoye et al., 1990) para la secreción de la FHA truncada ha sido estudiada generando la cepa de B. Pertussis BPGR47. Esta cepa deriva de BPGR4 transformada con pBG7. Este plásmido es el resultado del cambio del fragmento SphI/BamHI, de 2,5 kb, de pBG4 por el fragmento SphI/BamHI de pUC18-5, que es a su vez, el resultado de la inserción del fragmento SalI/BamHI, de alrededor de 1,27 kb, del pRIT13120 (Delisse-Gathoye, et al., 1990) en pUC18-4 digerido por SalI y BamHI. El plásmido pUC18-4 es el fruto de la digestión de pUC18-3 por PstI, y del religamiento sobre sí mismo. Esta construcción elimina en fase un fragmento PstI de alrededor de 460 pb que codifica la región FHA homóloga a las hemolisinas Sh1A y HpmA. El análisis de la cepa BPGR47 por electroforesis y Western blot (Fig 3) muestra que la región homóloga es también necesaria para la secreción de la FHA truncada como para la de la FHA completa.

Con el fin de saber si la FHA truncada puede ser producida y segregada por otras especies del género Bordetella, se ha introducido pBG4 en Bordetella Parapertussis PEP (Nordmann, P., François, B., Menozzi, F.D., Commare, M.C. et Barois, A. (1992) Ped. Infect. Dis. J. 11, 248). El sobrenadante del cultivo de la cepa transformada ha sido analizado mediante SDS-PAGE y el resultado (Fig. 3) indica que B. Parapertussis puede igualmente segregar la región N-terminal de la FHA de B. Pertussis, lo que sugiere que B. Parapertussis expresa igualmente un gen auxiliar que corresponde a FhaC.

Finalmente, pBG4 ha sido introducido en la cepa de B. Pertussis BPSM y el análisis del sobrenadante del cultivo de la cepa de B. Pertussis BPSM (pBG4), denominado B. Pertussis BPSM4, muestra que la producción y la secreción de la FHA truncada no afecta a la producción y secreción de la FHA natural y viceversa (Fig. 3). El sistema de secreción no parece resultar saturado por la expresión del gen FhaB.

IV. Identificación del sitio de fijación a la heparina y purificación de la FHA truncada en heparina-sepharosa

La FHA de B. Pertussis puede interactuar con la heparina y ser purificada en heparina-sepharosa (Menozzi et al., 1991). Para saber si esta interactuación implica un sitio diferente del responsable de la adhesión de la FHA a las integrinas CR3 (Relman et al., 1990) o del responsable de la adhesión a otros glucoconjugados (Prasad et al., 1993), diferentes fragmentos de ADN que comprenden la totalidad de la región del gen FhaB que codifica la FHA madura han sido expresados en fusión con Ma1E (una "maltose binding protein" = proteína que une maltosa) utilizando el sistema de expresión comercializado por New England Biolabs (Beverly, MA, EE.UU.). En la figura 4 se muestran los diferentes fragmentos expresados en fusión con el gen codificador de Ma1E. Todas las proteínas de fusión han sido purificadas por cromatografía en resina de amilosa partiendo de un lisado total obtenido tras sonicación de unos 600 ml de cultivo de Escherichia coli TG1 transformado por los diferentes plásmidos recombinantes.

Las proteínas recombinantes purificadas en amilosa así como Ma1E y la FHA purificada han sido cromatografiadas en 3 ml de heparina-sepharosa equilibrada con 100 ml de PBS ("phosphate buffered saline" = solución salina tamponada con fosfato). Previamente se han ajustado 40 ml de diferentes muestras a una concentración de 5 \mug/ml en PBS + maltosa 5 mM, depositado sobre la columna de heparina-sepharosa y lavado con PBS + maltosa 5 mM. Las proteínas fijadas son posteriormente eluídas con PBS + NaCl 0,5 M. La cantidad de proteínas no retenidas se ha comparado con las proteínas totales depositadas en la columna. El análisis de las diferentes fracciones mediante SDS-PAGE se ha utilizado para confirmar que las proteínas corresponden a los polipéptidos de fusión esperados. Los resultados indican que sólo el fragmento 2 (Fig. 4) codifica un polipéptido que es retenido significativamente en la heparina-sepharosa. El hecho de que el fragmento 1 (Fig. 4) no codifique un polipéptido retenido en la heparina-sepharosa y que este fragmento recubra parcialmente al fragmento 2, sugiere que la región de la FHA que interactúa con la heparina se localiza entre los residuos 441 y 863 si se considera la numerotación propuesta por Delisse-Gathoye et al., (1990). Esta región contiene la mayor parte de los "A repeats" (repeticiones A) y dos " B repeats" (repeticiones B) (Locht et al., 1993) lo que sugiere que uno o varios de estos "repeats" podrían ser responsables de la unión entre la FHA y la heparina.

La FHA truncada producida y segregada por la cepa de B. Pertussis BPGR44 contiene la totalidad de la región codificada por el fragmento 2 (Fig. 4) y, por consiguiente, debería unirse a la heparina. El sobrenadante del cultivo de esta cepa ha sido, por lo tanto, cromatografíado en heparina-sepharosa y eluído con PBS + NaCl 0,5 M. El análisis mediante SDS-PAGE y coloración con azul de Coomassie de las diferentes fracciones proteicas muestra que la totalidad de la FHA truncada producida y segregada por la cepa BPGR44 es retenida en la heparina y puede ser purificada en heparina-sepharosa mediante un procedimiento idéntico al utilizado para la purificación de la FHA natural (Menozzi et al., 1991).

V. Producción y secreción de péptidos heterólogos en fusión con la FHA truncada por B. Pertussis y purificación en heparina-sepharosa

A continuación se ha utilizado el eficaz sistema de secreción de la FHA por B. Pertussis con el fin de obtener la secreción péptidos heterólogos por este microorganismo. El péptido modelo utilizado en este experimento es el que corresponde a la región 190-211 de la glutation-S-transferasa, de 28 kDa (Sm28GST) de Schistosoma mansoni (Xu, C.-B., Verwaerde, C., Gras-Masse, H., Fontaine, J., Bossus, M., Trottein, F., Wolowczuk, I., Tartar, A., et Capron, A. (1993) J. Immun. 150, 940.949). Dos oligonucleótidos con la secuencia siguiente: 5' TAGGATCCGGGCCGGGGCC-
CGAAAATCTGTTAGCC 3', y 5' TAAGATCTCCCGGGCCCCGGGAAGGGAGTTGCAGG 3' han sido fosforilados mediante los métodos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E. F., et Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ième édition. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY) y utilizados para amplificar, mediante PCR, la región codificadora del péptido 190-211. Tras la amplificación, el fragmento ha sido digerido por BamHI y BglII e insertado en el sitio BamHI del pBG4. Se ha analizado la restricción de los péptidos recombinantes con el fin de conocer la orientación del inserto oligonucleotídico. A continuación se ha purificado un plásmido conteniendo el inserto oligonucleotídico en el sentido de la expresión de la FHA, denominado pNJ1 e introducido en B. Pertussis BPGR4 por electroporación. Esta cepa recombinante es denominada BPNJ1 y el sobrenadante de su cultivo ha sido analizado mediante SDS-PAGE y coloración con azul de Coomassie y con Western blot, utilizando anticuerpos dirigidos contra el péptido 190/211 de Sm28GST. Los resultados mostrados en la figura 5 indican que la cepa BPNJ1 segrega eficazmente el péptido 190/211 de Sm28GST en fusión con la FHA truncada y que este péptido conserva su antigenicidad.

El sobrenadante del cultivo de la cepa BPNJ1 ha sido a continuación cromatografiado en heparina-sepharosa en presencia de PBS. La elución se ha realizado con PBS + NaCl 0,5 M. El análisis mediante SDS-PAGE y coloración con azul de Coomassie muestra que la totalidad de la proteína de fusión es retenida en la columna y puede ser eluída con PBS + NaCl 0,5M.

VI. Estabilidad del pNJ1 en B. Pertussis BPNJ1

Con el fin de conocer la estabilidad del pNJ1 en B. Pertussis BPNJ1, se ha incubado la cepa en medio sólido, en ausencia de antibióticos. Tras 4 días de incubación a 37ºC, se han inoculado 20 colonias en medio líquido con y sin canamicina. A los 4 días de incubación a 37º C, el recuento de colonias resistentes a la canamicina, en comparación con las no resistentes, indica que las colonias conservaban la resistencia, demostrando que el pNJ1 es estable en B. Pertussis BPNJ1 en ausencia de presión selectiva. El contenido de plásmido de 6 colonias resistentes ha sido analizado con un método de análisis rápido (Baulard, A., Bertin, P., Dartois, V., et Locht, C. (1994) Meth. Mol. Cell. Biol. 4, en prensa) y el resultado muestra que las 6 colonias contenían el plásmido pNJ1.

A continuación, cinco ratones OF1 han sido infectados por vía nasal con B. Pertussis BPNJ1. Se han instilado por vía nasal aproximadamente 10^{6} ufc (unidades formadoras de colonias) en cada ratón. Al cabo de 7 días, se extrajeron los pulmones de los ratones y los B. Pertussis contenidos en los mismos se extendieron sobre medio sólido, con o sin canamicina. A los 4 días de cultivo a 37ºC, se comparó el número de bacterias hemolíticas resistentes a la canamicina con el número de bacterias hemolíticas no resistentes a la canamicina. El resultado muestra que alrededor del 95% de las bacterias habían perdido la resistencia a la canamicina.

En conjunto, estos resultados muestran que el pNJ1 es muy estable en B. Pertussis in vitro pero relativamente inestable in vivo.

VII. Construcción de la cepa Bordetella Pertussis BPGR5 productora de Sm28GST de S. mansoni en fusión con la FHA

Para saber si una proteína heteróloga puede ser producida en fusión con la FHA entera, se ha fusionado al marco de lectura del gen FhaB un fragmento que contiene el ADN completo de la Sm28GST provisto de su codón de fin de la traducción de forma que este marco queda interrumpido justo detrás de la inserción del gen codificador de la Sm28GST. Un fragmento Bg/II, de 0,68 kb, conteniendo el ADNc de la Sm28GST ha sido amplificado mediante PCR a partir del clon TG10, un derivado del fago lambda gt10 (Pierce, R., Khalife, J., Williams, D., Kanno, R., Trottein, F., Lepresle, T., Sabatier, J., Achtetter, T., et Capron, A. Remitido para publicación) utilizando los oligonucleótidos siguientes: 5'TAAGATCTCCATGGCTGGCGAGCAT 3' y 5'TAAGATCTCCGAGCTTTCTGTTG 3'. Tras la digestión del fragmento amplificado por la enzima Bg/II, dicho fragmento ha sido clonado en el plásmido pRIT13202 (Delisse-Gathoye et al., 1990), previamente digerido por Bg/II, y desfosforilado. El plásmido recombinante ha sido denominado pUC8-A. Tras la digestión de pUC8-A por EcoRI, el fragmento de 10,68 kb es insertado en el sitio EcoRI del plásmido movilizable pGR5, un derivado del plásmido pSS1129 que contiene las regiones flanco 5' y 3' del gen FhaB (Locht et al., 1992). El plásmido resultante, (denominado pGR53), es transferido a la cepa movilizante E. coli S17-1 para la conjugación con B. Pertussis (Simon, R., Priefer, U., et Puhler, A. (1983) Bio/Technology 1, 784-791).

Para introducir la construcción genética de una forma dirigida al locus cromosómico FhaB, la cepa de E. coli S17-1(pGR53) es cruzada con B. Pertussis BPGR4. Al estar desprovista esta cepa de la mayoría de los genes de estructura FhaB, los eventos de doble recombinación homóloga son forzados en las regiones flanco de este gen. Tras la conjugación, se seleccionan sucesivamente en medios selectivos los dos eventos de recombinación, como se ha descrito previamente (Antoine, R., Locht, C., (1990) Infect. Immun. 58, 1518-1526).

Brevemente, E coli S17-1(pGR53) (Sm^{S}, Gen^{R}, Nal^{S}) es cruzado en medio sólido de Bordet-Gengou (BG) con B. Pertussis BPGR4 (Sm^{R}, Gen^{S}, Nal^{R}). A las 6 horas de la conjugación, se seleccionan los transconjugados en un medio selectivo (BG + gentamicina + ácido nalidíxico). La resistencia a la gentamicina es proporcionada por el plásmido pGR53 y la resistencia al ácido nalidíxico está localizada en el cromosoma de la cepa de B. Pertussis BPGR4. A continuación, alrededor de 50 colonias aisladas son purificadas en medio de BG + estreptomicina. Con el objetivo de determinar qué clon Gen^{R} ha integrado bien el plásmido pGR53, los transconjugados son colocados en duplicado en el medio selectivo de BG + estreptomicina y luego en BG + gentamicina + ácido nalidíxico. Las colonias que hayan integrado el plásmido pGR53 son sensibles a la estreptomicina (el carácter de la sensibilidad a la estreptomicina es dominante sobre la resistencia a la misma). Los transconjugados Gen^{R}Sm^{S} son entonces extendidos en el medio selectivo BG + estreptomicina para seleccionar el segundo evento de recombinación, correspondiente a la escisión del plásmido integrado. Si este "crossing-over" se realiza en el mismo lugar que la primera vez, se obtiene la construcción inicial correspondiente a la cepa BPGR4. Si el segundo "crossing over" tiene lugar en la otra región recombinatoria, la construcción está integrada en el genoma de B. Pertussis. La escisión del plásmido que ha proporcionado la construcción se controla por la aparición del fenotipo Sm^{R}Gen^{S}.

\newpage

Los clones candidatos resistentes a la estreptomicina y portadores del cambio alélico deseado son identificados por hibridación de las colonias con una sonda correspondiente al fragmento Bg/II, de 0,68 kb, descrita más arriba. La integridad cromosómica en la unión de las regiones flanco se confirma tras el análisis del ADN genómico mediante Southern blot.

La antigenicidad de la proteína de fusión heteróloga se ha demostrado mediante análisis de Western blot, tras la separación por SDS-PAGE, utilizando un gel al 10%. Se han analizado la fracción proteica del sobrenadante del cultivo y la asociada a las células tras el crecimiento de las bacterias recombinantes en cultivo líquido en medio de Stainer-Scholtes. La proteína de fusión se identifica en las fracciones proteicas mediante anticuerpos policlonales dirigidos contra la FHA, anticuerpos monoclonales anti FHA (Delisse-Gathoye et al., 1990), anticuerpos policlonales de rata dirigidos contra la FHA truncada, anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra la Sm28GST y anticuerpos policlonales de rata dirigidos contra el péptido 190-211 de la Sm28GST. Los anticuerpos anti FHA han sido previamente purificados frente a un lisado total de la cepa de B. Pertussis BPGR4 en tanto que los anticuerpos anti Sm28GST han sido purificados frente a un lisado total de la cepa de B. Pertussis BPSM.

La proteína de fusión se demuestra en la fracción proteica asociada a las células de la cepa BPGR5 en la que una banda proteica (doblete) de un tamaño ligeramente superior a la FHA reacciona a la vez con los anticuerpos anti FHA (Fig. 6) y con los anticuerpos anti Sm28GST (Fig. 7). La fusión genética está, por lo tanto, bien expresada en este nuevo sistema de expresión heteróloga. En la fracción proteica asociada a las células se observan también productos de degradación (característicos de la FHA). Sin embargo, no se ha detectado inmunológicamente ningún polipéptido en el sobrenadante bruto del cultivo, lo que indica que la proteína de fusión no se produce de forma eficaz en forma segregada.

Cuando la cepa de B. Pertussis BPGR5 se cultiva durante más de 48 horas y el sobrenadante de dicho cultivo en fase estacionaria se concentra en una columna de heparina-sepharosa, se detecta un producto de secreción (Fig. 8). Este producto corresponde a un producto escindido de la proteína de fusión ya que no reacciona más que contra los anticuerpos anti FHA y no con los anti Sm28GST. Por lo tanto, parece verosímil que en esta construcción la porción de la molécula Sm28GST insertada en la extremidad de la FHA madura incompleta quede unida a la superficie interna de la membrana externa de la bacteria porque no es posible excretar la proteína de fusión completa al sobrenadante del cultivo.

VIII. Construcción de la cepa B. Pertussis BPGR6 productora de una Sm28GST truncada de S. mansoni en fusión con la FHA

Para exponer mejor el antígeno heterólogo nos pareció más razonable conservar la región de la FHA por debajo de la inserción de la molécula Sm28GST para así expresar la totalidad del precursor y favorecer la exportación de la proteína de fusión a través de las dos membranas de B. Pertussis. Por esta razón, en las construcciones siguientes se conserva tras la inserción del antígeno o péptido heterólogo el marco de lectura del gen FhaB.

Para la construcción de la cepa de B. Pertussis BPGR6 hemos utilizado un fragmento que contiene las tres cuartas partes del ADNc de Sm28GST de tal forma que el marco de lectura de FhaB se mantenga tras la inserción del gen codificador de una Sm28GST truncada por eliminación del extremo C-terminal del gen. El gen codificador de la Sm28GST truncada corresponde al fragmento Bg/II-Bc/I, de 0,5 kb. Este fragmento ha sido aislado a partir del fragmento BglII, de 0,68 kb, y digestión por Bg/II y Bc/II. El fragmento de 0,5 kb es insertado a continuación en el plásmido pRTTI13202 (Delisse-Gathoye et al., 1990) digerido por Bg/II y Bc/I, eliminando así 0,1 kb del marco de lectura de FhaB. El plásmido así obtenido se denomina pUC8-F. El fragmento EcoRI de 10,4 kb ha sido a continuación aislado de pUC8-F e insertado en pGR5 (Locht et al., 1992) previa digestión por EcoRI. El plásmido pGR54 resultante se introduce después en la cepa E. coli S17-1.

La cepa E. coli S17-1(pGR54) se cruza entonces con B. Pertussis BPGR4 con el fin de integrar la construcción en el locus FhaB cromosómico, como se ha descrito en el ejemplo VII. Tras selección de dos eventos de recombinación y análisis mediante Southern blot, la cepa de B. Pertussis BPGR6 es retenida. Esta cepa es, por lo tanto, un derivado de B. Pertussis BPSM con una eliminación de 0,1 kb en el gen FhaB e inserción cromosómica en este lugar del gen codificador de la Sm28GST truncada.

La proteína de fusión se demuestra en la fracción proteica asociada a las células de la cepa BPGR6 donde una banda proteica de un tamaño ligeramente superior a la FHA reacciona a la vez con los anticuerpos anti FHA (Fig. 6) y con los anticuerpos anti Sm28GST (Fig. 7) aunque en menor cuantía en comparación con la cepa BPGR5. Por el contrario, cuando el sobrenadante de un cultivo en fase estacionaria de la cepa BPGR6 se concentra en heparina-sepharosa, un producto de secreción reacciona a la vez con los anticuerpos anti FHA y anti Sm28GST (Figs. 7 y 8) demostrando, por lo tanto, que la proteína de fusión es segregada por BPGR6 y/o presentada en la superficie externa de la bacteria. La secreción de la proteína de fusión completa sigue siendo poco eficaz ya que el producto segregado está mayoritariamente escindido, como se ha observado ya con la cepa BPGR5.

\newpage

IX. Construcción de la cepa de B. Pertussis BPGR60, productora de una Sm28GST modificada de S. mansoni en fusión con la FHA

La Sm28GST contiene una cisteína eventualmente capaz de formar un puente disulfuro. Ahora bien, la presencia de puentes disulfuro puede ser un factor limitador para la exportación eficaz de las proteínas al sobrenadante del cultivo de las bacterias gramnegativas (Klauser, T., Pohlner, J., y Meyer, T.F. (1990) EMBO J. 9, 1991-1999; Klauser, T., Pohlner, J., y Meyer, T.F. (1992) EMBO J. 11, 2327-2335). Por lo tanto, hemos intentado producir una proteína de fusión entre la FHA y una Sm28GST en la que el codón TGC codificador de la cisteína (en posición 140 en la proteína) ha sido sustituido por el codón AGC, codificador de una serina y en la que el codón de terminación de la traducción ha sido eliminado.

Por lo tanto, la construcción resultante es tal que el marco de lectura de FhaB se mantiene tras la inserción del gen Sm28GST.

El fragmento Bg/II-Sa/I del gen codificador de la Sm28GST modificado al nivel del codón cisteína ha sido amplificado por PCR (polymerase chain reaction = reacción en cadena de la polimerasa), usando cebadores complementarios específicos de estas dos regiones del gen. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores de amplificación se presentan a continuación: son oligo 5': 5' TAAGGATCCCCATGGCTGGCGAGCATATCAAG 3' y oligo 3': 5' CCTGTCGACCCTTTCAGAGATTCGCTGATCATATTGAG 3'. El producto de 0,44 kb de la PCR ha sido digerido por PstI y Sa/I, el fragmento de 0,28 kb ha sido clonado en el plásmido pUC7-28 digerido preleablemente por PstI-SalI lo que genera pUC7-28*. El plásmido pUC7-28 es un derivado de pUC7 digerido por BamHI (eliminación de los sitios PstI y Sa/I internos en pUC7) y ligado con el fragmento BamHI de 0,64 kb procedente de la amplificación por PCR del ADNc entero codificador de la Sm28GST. Esta amplificación por PCR ha sido realizada con los siguientes oligonucleótidos: oligo 5': 5' TAAGGATCCCCATGGCTGGCGAGCATATCAAG 3'; oligo 3': 5' TAAGGATCCCGAAGGGAGTTGCAGGCCTGTT 3'. Las secuencias de las uniones (linkers) BamHI han sido elegidas de tal forma que estos sitios de restricción son compatibles a cada lado con la fase de lectura comenzando en el sitio Bg/II del gen FhaB. El fragmento BamHI del plásmido pUC7-28* es, por lo tanto, aislado y clonado en el sitio Bg/II del plásmido pRIT13202, lo que genera el plásmido pUC8-928*. Este plásmido es a continuación digerido por EcoRI y el fragmento EcoRI es introducido en el plásmido pGR5 digerido previamente por EcoRI. El plásmido pGR540 resultante se introduce a continuación en la cepa de E. coli S17-1.

La cepa de E. coli S17-1(pGR540) se cruza entonces con B. Pertussis BPGR4 con el fin de integrar la construcción en el locus FhaB cromosómico, como se ha descrito en el ejemplo VII. Tras la selección de dos eventos de recombinación y análisis mediante Southern blot, la cepa de B. Pertussis BPGR 60 es retenida. Esta cepa es, por lo tanto, un derivado de B. Pertussis BPSM que contiene al nivel del sitio Bg/II del gen FhaB la inserción cromosómica del gen codificador de la Sm28GST modificada.

En la cepa de B. Pertussis BPGR60, la proteína de fusión se visualiza bien en la fracción proteica asociada a las células donde una banda proteica reacciona a la vez con los anticuerpos anti FHA (Fig. 9) y los anticuerpos anti Sm28GST (Fig. 10). En el sobrenadante bruto, sólo se observan polipéptidos que reaccionan únicamente con los anticuerpos anti FHA (Fig. 9). Cuando el sobrenadante de un cultivo en fase estacionaria de esta cepa BPGR60 es concentrado en heparina-sepharosa, se demuestra un producto que reacciona a la vez con los anticuerpos anti FHA y anti Sm28GST. Este reconocimiento es muy similar al de la cepa BPGR6. La proteína de fusión es, por lo tanto, segregada y/o presentada en la superficie externa de la bacteria. De todas formas, la secreción de la proteína de fusión completa sigue siendo poco eficaz y además, el producto segregado está mayoritariamente escindido.

X. Estudio de la colonización de la cepa recombinante de B. Pertussis BPGR60 en el ratón tras la administración por vía nasal

Con el fin de estudiar la colonización de la cepa recombinante BPGR60 en el ratón OF1 (cepa no pura, ratones hembras de 4 semanas de edad) se instilaron por vía nasal 5 x 10^{6} bacterias en suspensión en PBS (células raspadas de un cultivo en medio sólido de Bordet Gengou con sangre de carnero desfibrinada (BG) , Bordet, J., et Gengou, O., (1906) Ann. Inst. Pasteur (Paris) 20, 731-741), a razón de 25 \mul por orificio, bajo anestesia con pentobarbital. Tres horas después de la inyección, y posteriormente a los 7, 14, 21 y 28 días, se extrajeron los pulmones de 4 a 7 ratones. Se homogenizaron en 5 ml de PBS y se contaron las bacterias tras realizar una extensión del homogenado en medio sólido de BG con 100 \mug/ml de estreptomicina y 25 \mug/ml de ácido nalidíxico (BGS_{100}N_{25}).

Como indica la figura 11 A (círculos negros) se observa colonización pulmonar en el séptimo día, seguida de una caída en el día 28 en que la casi totalidad de las bacterias ha sido eliminada. La cinética de la colonización de BPGR60 es similar a la observada con la cepa salvaje BPSM (cuadrados vacíos) con la excepción de que esta última no había sido totalmente eliminada 28 días después de la instilación.

Cuando los ratones habían recibido previamente la cepa BPGR60 y a continuación la cepa virulenta BPSM, la cepa salvaje no presenta fase de crecimiento y su eliminación resulta entonces acelerada (triángulos negros).

La colonización por la cepa BPGR60 ha sido estudiada también en el ratón infectado previamente por la cepa salvaje Tohama I. Así, 28 días después de la instilación de la cepa Tohama I, los ratones recibieron una dosis de BPGR60 y se contó el número de bacterias contenidas en el pulmón. En este caso, no se observó ninguna fase de crecimiento de la cepa BPGR60 en los 7 días siguientes a la administración (Fig. 11 B, triángulos negros). Por el contrario, la disminución del número de bacterias a lo largo del tiempo era más rápida que la observada 7 días después de la administración de BPGR60 en el ratón no tratado previamente.

Estos resultados indican, por lo tanto, que la cepa recombinante se comporta in vivo como la cepa salvaje y que la primoinfección con una de las dos cepas impide la colonización eficaz de las mucosas respiratorias por la otra cepa.

XI. Estudio de la producción de citocinas inflamatorias tras la administración intranasal de la cepa recombinante de B. Pertussis BPGR60 en el ratón OF1

La presencia de ciertos microorganismos, o incluso de micropartículas, en las mucosas respiratorias, puede provocar reacciones inflamatorias relacionadas con presencia de células capaces de producir, tras estimulación, factores como el "tumor necrosis factor" (TNF alfa) o la interleucina-6 (IL-6). Estas dos citocinas generalmente son producidas localmente y pueden ser cuantificadas en los lavados broncoalveolares. En ciertos casos graves estos factores pueden detectarse en el suero.

De la misma forma que anteriormente, se instiló por vía nasal 5 x 10^{6} bacterias de la cepa recombinante BPGR60 en suspensión en PBS a ratones OF1, a razón de 25 \mul/ml por orificio nasal, bajo anestesia con pentobarbital (células raspadas de un cultivo en medio sólido (BGS_{100}N_{25}). Se utilizaron como controles ratones a los que se administraron partículas de sílice o PBS. Después de 3, 6, 24 horas, tras 3 y 7 días, se procedió al sangrado o al lavado broncoalveolar (5 ratones por punto).

Mientras no se detectó traza alguna de TNF-alfa o IL-6 en la sangre circulante, incluso después de 7 días, se encontraron cantidades significativas de ambas citocinas en los lavados broncoalveolares (Fig. 12).

La producción de TNF parecía ser inmediata ya que la tasa máxima de secreción se obtenía a las tres horas de la inyección. La cantidad de TNF alfa, estable hasta 6 horas al menos después de la inyección, era prácticamente nula 24 horas después y permanecía siendo despreciable hasta el día 7.

La producción de IL-6, muy débil en los tres primeros días, aumentaba fuertemente el día 3 y volvía a una concentración normal el día séptimo.

Parece, por lo tanto, que la administración de BPGR60 induce una reacción inflamatoria localizada que se demuestra por el aumento de TNF e IL-6. Este aumento de la secreción de citocinas inflamatorias es pasajero ya que 7 días después de la instilación se volvían a detectar concentraciones pulmonares normales.

XII. Respuesta inmunitaria tras la administración de la cepa recombinante de B. Pertussis BPGR60 por vía intranasal a ratones OF1

Los ratones hembras OF1 de 4 semanas de edad recibieron 5 x 10^{6} bacterias en suspensión en PBS (células raspadas de un cultivo en medio sólido (BGS_{100}N_{25}), a razón de 25 \mul por orificio nasal, bajo anestesia con pentobarbital. La respuesta inmunitaria fue evaluada en la sangre y en los líquidos broncoalveolares a los 28, 35, 42, 49 y 56 días de la administración. En el día 56 se estimuló a una parte de los ratones mediante una nueva inyección de la cepa BPGR60 (en las mismas condiciones) o mediante la administración de 20 \mug de antígeno recombinante purificado (Sm28GST producido en E. coli) por vía nasal. La respuesta inmunitaria se analizó en los días 70 y 77. Esta respuesta ha sido comparada con la de los ratones sanos mantenidos en las mismas condiciones y con la de los ratones que recibieron sólo el antígeno recombinante.

Los resultados obtenidos en este ejemplo nos indican que sólo se obtiene una respuesta sérica de tipo IgA específica del antígeno Sm28GST. Esta respuesta anti Sm28GST, que no presenta ningún anticuerpo de la clase IgG, se observa 56 días después de la primera inyección. La nueva inyección (día 63) no indujo más que la persistencia de esta respuesta sérica específica IgA. Por el contrario, se detectó una fuerte respuesta anti Fha. Esta respuesta, observable a partir de los 28 días después de la administración era máxima después de 42 días y presentaba un "plateau" en el momento de la inyección de recuerdo. El recuerdo con la cepa BPGR60 (el día 63) no tenía efecto sobre esta respuesta anti Fha, que ya estaba en su máximo.

El refuerzo con la proteína libre Sm28GST por vía nasal provoca al cabo de 8 días una intensa producción de IgG2a e IgG2b. Quince días después de este refuerzo se obtiene una fuerte respuesta de anticuerpos séricos anti Sm28GST con los isotipos siguientes: IgG1, IgG2a, IgG2b e IgA.

El refuerzo con la cepa BPGR60 o con la proteína recombinante Sm28GST no provoca cambios significativos de la cantidad de IgA secretora anti Fha 7 días después de la segunda administración a pesar de un ligero aumento. En el día 77 (14 días después del refuerzo), la tasa de anti Fha disminuía en ambos grupos.

Por el contrario, el refuerzo con BPGR60 inducía 7 días después un aumento de la cantidad de anticuerpos secretores específicos de la Sm28GST, que disminuía 14 días después. El refuerzo con la proteína recombinante provocaba un fuerte aumento de la tasa de IgA secretora específica, más importante que la obtenida con la cepa BPGR60 pero bastante heterogénea. Este aumento de IgA anti Sm28GST no era duradero ya que a los 14 días esta tasa disminuía y llegaba a los valores obtenidos antes del refuerzo.

Se ha realizado una investigación de los complejos antígeno - anticuerpo de tipo IgA - Sm28GST en los lavados broncoalveolares, antes y después del refuerzo con la cepa BPGR60. Los resultados obtenidos y presentados en la figura 14 muestran que una gran proporción de la IgA anti Sm28GST se presenta en forma de complejos. Este ejemplo nos indica que la utilización de BPGR60 como formulación de refuerzo está perfectamente adaptada para la obtención de un efecto de re-estimulación de la respuesta inmunitaria frente a un antígeno extraño.

No se detectó producción de anticuerpos IgA anti Sm28GST o anti Fha en las secreciones broncoalveolares de los ratones que no recibieron más que la Sm28GST en el momento del refuerzo.

La administración por vía nasal de la cepa BPGR60 que expresa la Sm28GST es, por lo tanto, capaz de inducir una respuesta inmunitaria secretora frente a este antígeno. Esta respuesta de anticuerpos puede ser amplificada por el refuerzo, sea con la cepa recombinante, o con la Sm28GST sólo. Sin duda, este modo de vacunación podría ser mejorado difiriendo el tiempo entre la inmunización y el refuerzo (por ejemplo, 90 días en lugar de 56). Las cantidades de bacterias y la dosis de las proteínas pueden considerarse óptimas).

XIII. Estudio del efecto protector de la inmunización mediante BPGR60 sobre la carga parasitaria de los ratones infectados por S. mansoni

Previamente a la infección, se inmunizaron ratones hembra OF1 conforme al protocolo indicado en el ejemplo precedente y se realizó el refuerzo con la proteína libre (día 63). Quince días después del refuerzo los ratones fueron infestados con 80 cercarias (vía transcutánea, en el abdomen). Posteriormente se evaluó la carga parasitaria a los 42 días de la infestación, en función de la carga de parásitos y de huevos hepáticos e intestinales. Los resultados obtenidos se han comparado con los obtenidos en el mismo experimento en los ratones no tratados o que no recibieron la inyección de Sm28GST en el momento del refuerzo.

Mientras la inyección única de Sm28GST no provoca efectos significativos sobre la carga parasitaria, la inmunización con la cepa BPGR60 induce una protección significativa contra la infección por S. mansoni, tanto con respecto a la carga parasitaria (Fig. 15 A) como para la de huevos (Fig. 15 B). Este resultado indica que una cepa recombinante de B. Pertussis que exprese una proteína extraña en fusión con la Fha presenta cualidades vacunales.

XIV. Producción y secreción de la FHA truncada en Escherichia coli

Dada la secreción de la FHA truncada en E. coli, los genes codificadores de la proteína accesoria FhaC y de la proteína FHA44 (codificada inicialmente por pBG4) han sido puestos bajo el control del promotor tac con el fin de sacar partido a una expresión regulable y de escapar al sistema de regulación de la expresión de FHA en B. Pertussis. El fragmento Bc/1 de 2,3 kpb de pRIT12990 (Delisse-Gathoye et al., 1990) conteniendo la extremidad 3' del gen fimD y la totalidad del gen FhaC ha sido clonado en pQE32 (Qiagen, Hilden, Alemania) previamente digerido por BamH1, para generar una fusión traduccional entre la secuencia del vector codificador de un motivo polihistidina y la extremidad 3' de fimD. Gracias a esta disposición, la transcripción de este gen híbrido y de FhaC se encuentra bajo el control del promotor tac inductible por el IPTG. Por otra parte, la traducción de 2 genes, en los que la extremidad 3' del primero cabalga sobre la extremidad 5' del segundo, puede desarrollarse de forma acoplada. Este plásmido se denomina pFJD6. Se trata con IPTG 1 M durante, dos horas, un cultivo líquido de E. coli XL1 blue transformado por este plásmido, tras haber alcanzado una absorbencia de 0,8 a 600 nm. A continuación se colectan las células, se lisan mediante sonicación y se separan las membranas celulares por ultracentrifugación (15ºC, 60 minutos a 100,000 g) del sonicado clarificado. Una extracción con sarcosil (1%) solubiliza selectivamente la membrana citoplásmica y una segunda ultracentrifugación (15ºC, 60 minutos a 100,000 g) permite obtener una fracción enriquecida en proteínas de la membrana externa. Su análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS e inmunotransferencia con un suero policlonal dirigido contra FhaC muestra que en estos extractos existe una proteína del mismo tamaño que la FhaC de B. Pertussis en tanto que la cepa no transformada no la posee. Estas observaciones indican que E. coli es capaz de producir y localizar correctamente la FhaC en la célula.

El fragmento EcoRI-BamHI, que codifica la FHA truncada (denominada FHA44) de pBG4 ha sido clonado en los mismos sitios del vector pMMB91 (P. J. Fürste, W. Pansegrau, R. Frank, H. Blöcker, P. Scholz, M. Bagdasarian y E. Lanka. Gene 48, 119-131, 1986) bajo el control del promotor tac. El plásmido resultante, pFJD9, ha sido introducido por transformación en las cepas de E. coli XL1 blue y UT5600 (esta última no produce la proteasa de la membrana externa OmpT), sólo o en trans con pFJD6. Estos dos plásmidos poseen orígenes de replicación compatibles y marcadores de resistencia diferentes. Una inmunotransferencia realizada con las colonias que poseen los dos plásmidos trasplantados a un medio sólido conteniendo 50 \mug de IPTG muestra que la superficie de las células es reconocida por un antisuero dirigido contra la FHA truncada en tanto que no se demuestra ninguna reactividad en la superficie de las células que poseen sólo uno de los dos plásmidos. Por el contrario, el fraccionamiento de las células y análisis de las proteínas mediante inmunotransferencia con el mismo antisuero no permite detectar ninguna banda proteica correspondiente a FHA44, lo que sugiere que la proteína es producida débilmente o es fuertemente degradada. En el cultivo líquido no se obtienen más que cantidades detectables de FHA truncada, del sobrenadante del cultivo o asociada a las células.

El extremo amino terminal de la FHA no posee apenas características de un péptido señal clásico y podría dificultar la secreción eficaz de FHA en E. coli. Se han realizado diferentes construcciones con el fin de añadir la secuencia previa codificadora del péptido señal de la pre-proteína preOmpA de E. coli. Esta pre-secuencia ha sido injertada en tres localizaciones diferentes de la región 5' del gen fha truncado. La región 5' del gen ha sido amplificada mediante PCR a partir del plásmido pRIT13130 (Delisse-Gathoye et al., 1990) utilizando el oligonucleótido (5'-3') TTTAACCGATGCGGCCGCCGTTG que contiene un sitio Not1 (señalado) y uno de los tres oligonucleótidos (5'-3') TATAAGCTTCGAACCTGTACAGGCTGGTC, TCAAAGCTTCGCGTGGTCAAGCGCGAAG y ATTAAGCTTCCCAGGGCTTGGTTCCTCAG, cerrando sitios Hind3 (señalados). El fragmento de 100 pb Xba1-BamH1 de pIN-OmpAIII-Hind (F. Rentier-Delrue, D. Swennen et J. Martial. Nucleic Acids Res. 16, 8726, 1988) que contiene la pre-secuencia de PreOmA ha sido clonado en pACYC184, dando el plásmido pEC1. Los tres productos PCR, de 615 pb, 520 pb y 410 pb, han sido a continuación purificados y digeridos por Not1 y Hind3 y cada uno de ellos utilizado en un ligamiento de tres partes con pEC1 restringido por Hind3 y BamH1 y el fragmento Not1-BamH1 de 2 kb de pRIT13197 codificador de la región 5' de FHA44 (Delisse-Gathoye et al., 1990). Los tres plásmidos resultantes pEC11, pEC12 y pEC13 han sido digeridos por Xba1, el sitio se ha llenado con Klenow y los plásmidos han sido digeridos por BamH1. Los fragmentos de ADN que contienen los genes quimera preOmpA-fha44 han sido clonados en los sitios EcoRI (llenos con fragmento Klenow) y BamH1 de pMMB91. Los plásmidos resultantes, pFJD11, pFJD12 y pFJD13, codifican genes quimera cuyos productos son, respectivamente, proteínas de fusión en las que los 2, 33 o 71 primeros aminoácidos de FHA44 han sido sustituidos por los 18 aminoácidos del péptido señal de preOmpA. Los plásmidos han sido introducidos en la cepa UT5600, solos o en trans con pFJD6 y la expresión de FhaC y de genes quimera ha sido inducida por la adición de IPTG a los cultivos líquidos que presentan una absorbencia de 1 a 600 nm. Los cultivos son incubados durante tres horas en presencia de IPTG (1 mM final). La FHA44 se detecta por inmunotransferencia tras electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS en los sobrenadantes de los cultivos procedentes de cepas que expresan FhaC. La producción de FHA44 es bastante débil en las cepas UT5600(pFJD6, pFJD11) y UT5600(pFJD13 y pFJD6) pero claramente más elevada en la cepa UT5600(pFJD12, pFJD6), que contiene el gen quimérico de longitud intermedia. La producción de FHA44 en el sobrenadante de esta cepa ha sido estimada, con ELISA e inmunotransferencia, en alrededor del 20% de la producción de FHA truncada en B. Pertussis (BPGR44). Por el contrario, las otras dos cepas segregan de 8 a 10 veces más FHA44 que la cepa UT5600(pFJD12, pFJD6). En ausencia de FhaC, la secreción es despreciable en UT5600(pFJD11) y UT5600(pFJD13) y muy débil en UT5600(pFJD12), lo que indica que la FHA truncada es segregada por E. coli por su proteína accesoria y no es segregada de forma no específica. La FHA segregada por E. coli tiene el mismo tamaño que la de B. Pertussis y puede ser purificada en las mismas condiciones por cromatografía de afinidad en heparina-sepharosa. La secuencia amino terminal de las dos proteínas muestra que experimentan la misma maduración amino terminal.

Este ejemplo muestra que es posible hacer segregar eficazmente FHA truncada, indistinguible de la producida por B. Pertussis, en otros microorganismos gramnegativos, patógenos o no patógenos, mediante la transferencia del aparato de secreción - FhaC suficiente - y la remodelación de la región amino terminal de la FHA. Por lo tanto, es probable que pueden utilizarse construcciones similares para expresar y segregar la FHA entera o truncada siempre que las secuencias de secreción estén funcionalmente presentes. Esta tecnología es susceptible de extenderse igualmente a otras bacterias gramnegativas, como Salmonella, Vibrio y otras.

Claims (29)

1. ADN recombinante que contiene una secuencia (1) codificadora de un polipéptido heterólogo respecto de una hemaglutinina filamentosa de Bordetella (Fha) fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia (2) situada por delante de la primera; codificando esta secuencia al menos una parte del precursor de la Fha, comprendiendo dicha parte al menos la región N-terminal de una proteína madura truncada de Fha que contiene el sitio de interactuación de la Fha con la heparina, por una parte, y que colocada, sola o bajo el control de un promotor reconocido por las polimerasas celulares de B. Pertussis, e introducida en un cultivo de células de B. Pertussis, se expresa en este cultivo bajo el control de este promotor y es excretada al medio de cultivo de dichas células, por otra parte.

2. ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque la Fha es una Fha de B. Pertussis.

3. ADN recombinante según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia (2) codifica la proteína madura Fha.

4. ADN recombinante según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia (2) resulta del truncamiento de la secuencia codificadora de la proteína madura Fha en su extremidad C-terminal.

5. ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende además otra secuencia (3) por debajo de la secuencia (1), correspondiente esencialmente a la parte truncada de la proteína madura, preferentemente completada con la secuencia señal del precursor.

6. ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia (2) comprende las señales de excreción de la secuencia codificadora de la Fha y la región N-terminal homóloga a las regiones N-terminales de las hemolisinas ShIA y HpmA de Serratia marcescens y Proteus mirabilis.

7. ADN recombinante según las reivindicaciones 4 ó 6, caracterizado porque la extensión de la secuencia (2) por el extremo C-terminal no va más allá de la longitud que haría que la transformación de B. Pertussis con este ADN recombinante, entonces situado bajo el control de un promotor susceptible de ser reconocido por B. Pertussis, no permite la excreción directa de la proteína recombinante así formada al medio de cultivo de este B. Pertussis.

8. ADN recombinante según las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque la secuencia (2) se extiende entre el ATG correspondiente al codón de iniciación de la traducción de la Fha a un nucleótido C-terminal más allá del nucleótido 907 en la dirección de la traducción y preferentemente no después de la posición 6922.

9. ADN recombinante según la reivindicación 8, caracterizado porque ya no reacciona con anticuerpos anti Fha más particularmente dirigidos contra los epítopos del extremo C-terminal de la Fha madura, situados más allá del sitio nucleotídico 2841, en el sentido de la traducción.

10. ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el polipéptido codificado por la secuencia (2) contiene al menos un sitio específico de unión de la Fha a las mucosas.

11. ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la secuencia (1) codifica un polipéptido con propiedades vacunales frente a un patógeno dado.

12. ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende además un promotor reconocido por las polimerasas de un vector que contiene el ADN recombinante en cuestión y autoriza la expresión de las secuencias (1) y (2) ya que en esta célula se expresa igualmente un gen auxiliar del tipo FhaC.

13. ADN recombinante según la reivindicación 12, caracterizado porque el promotor es un promotor reconocido por las polimerasas de una bacteria de la especie Bordetella, principalmente B. Pertussis, que en el producto natural regula la expresión de la proteína Fha.

14. Cultivo de células procariotas, principalmente bacterias transformadas con un ADN recombinante según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el promotor del ADN recombinante es reconocido por las polimerasas de dicha célula procariota.

15. Cultivo según la reivindicación 14, caracterizado porque las células pertenecen a una especie Bordetella, principalmente B. Pertussis que son también portadoras de un gen FhaC que puede expresarse en dichas células.

16. Cultivo según la reivindicación 14, caracterizado porque las células pertenecen a una especie bacteriana distinta de Bordetella y contienen además una secuencia codificadora de al menos la parte de FhaC necesaria para la expresión de la secuencia (2), bajo una forma expresable en el seno de las células de este cultivo.

17. Cultivo celular según la reivindicación 16, caracterizado porque las células pertenecen a la especie E. coli.

\newpage

18. Cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque el ADN recombinante es incorporado al ADN de las células mencionadas.

19. Cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizado por la exposición del producto de expresión de la secuencia (1) en su superficie.

20. Cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado porque la secuencia (2) contiene al menos un sitio de adhesión de la Fha a las mucosas o a células eucariotas, principalmente macrófagos o células epiteliales.

21. Cultivo según la reivindicación 20, caracterizado por estar destoxificado o atenuado.

22. Composición inmunógena dirigida contra un agente patógeno determinado y caracterizada porque contiene, como principio activo, unas células del cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en las que la secuencia (1) codifica un antígeno característico de este agente patógeno.

23. Proteína recombinante constituida por el producto de la expresión del ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

24. Proteína recombinante según la reivindicación 23, caracterizada porque comprende al menos uno de los sitios de adhesión a las mucosas de la proteína Fha.

25. Proteína recombinante según la reivindicación 24, caracterizada porque el producto de la expresión de la secuencia (1) codifica un polipéptido con propiedades vacunales frente a un agente patógeno dado y porque el producto de la expresión de la secuencia (2) contiene un sitio de adhesión de la Fha a las mucosas o a las células eucariotas, principalmente macrófagos o células epiteliales.

26. Composición vacunal que contiene el cultivo celular de la reivindicación 22 o la proteína recombinante de la reivindicación 25, caracterizada porque la Fha presenta inmunogenicidad para las mucosas principalmente para la administración por vía nasal.

27. Procedimiento para la producción de una proteína heteróloga recombinante que contiene una secuencia polipeptídica determinada caracterizada por la transformación de un cultivo de células procariotas con un vector que contiene un ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 13; contiendo además dichas células procariotas una secuencia nucleotídica codificadora de FhaC bajo una forma susceptible de expresión o habiendo sido transformadas para este fin y a continuación el cultivo de estas células, y la recuperación del producto excretado por las células de este cultivo en su medio.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque dichas células procariotas son Bordetella del tipo B. Pertussis.

29. Procedimiento según las reivindicaciones 27 y 28, caracterizado por la purificación suplementaria del producto de excreción por medio de la puesta en contacto del medio de cultivo con heparina inmovilizada en un soporte insoluble y por medio de la recuperación de la proteína recombinante purificada por disociación del complejo que formaba con la heparina.