<p>настоящее изобретение демонстрирует, что антитела к СО38 находят применение в диагностике и/или лечении воспаления и/или иммунологических нарушений, ассоциированных с активированными лимфоцитами, в частности включая аутоиммунные заболевания. Как показано в настоящем документе, СЭ38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, ингибируется в зрелых клетках и повторно экспрессируется на высоких уровнях в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия СЭ38 наблюдается на активированных В-клетках, плазматических клетках, активированных СЭ4' Т-клетках, активированных СЭ8' Т-клетках, ΝΚ-клетках ΝΚΤклетках, зрелых дендритных клетках (ДК) и активированных моноцитах.</p>
<p>Данные настоящего документа являются удивительными в силу того, что присутствие антител к СЭ38 было связано с диабетом, хроническим аутоиммунным тиреоидитом и болезнью Грейвса (см. Ап1оиеШ е1 а1., Сйп. Ехр. 1ттипо1. 2001 126:426-431; Ма11опе е1 а1., Э1аЬе1е5 50:752 (2001) и АпФпеШ е1 а1., 1. Епйосйпок ИкеЛ. 27:695-707 (2004), все включены посредством ссылки.</p>
<p>В этой связи, антитела согласно настоящему изобретению находят применение в диагностике и/или лечении ряда заболеваний, включающих, но не ограничивающихся этим, аутоиммунные заболевания, рассмотренные ниже, включая, но не ограничиваясь этим, системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и язвенный колит.</p>
<p>Таким образом, например, могут быть отобраны пациенты с высоким содержанием плазматических клеток, например пациенты с СКВ, которые демонстрируют высокий уровень плазматических клеток, а также пациенты с РА, ареактивные к лечению на основе СЭ20.</p>
<p>- 3 029303</p>
<p>Терапевтические антитела к СО38 согласно настоящему изобретению связываются с СО38положительными клетками, что приводит к истощению клеток, таких как активированные лимфоциты, через многочисленные механизмы действия, включая, но не ограничиваясь этим, СОС АОСС и пути апоптоза, приведенные в настоящем документе, ведущие к лечению и/или устранению аутоиммунных заболеваний.</p>
<p>Одним из преимуществ, не очевидным в некоторых клинических испытаниях антител к СО38 в онкологии, является способность связываться с СО38 яванского макака, так как эти приматы используются в доклинических испытаниях, и, следовательно, могут привести к ранней оценке дозировки, токсичности, эффективности и т.д.</p>
<p>СО38 белки.</p>
<p>В этой связи настоящее изобретение предлагает выделенные антитела к СО38, специфически связывающиеся с СО38 белком человека (и, как описано ниже, дополнительно и предпочтительно специфически связываются с СО38 белком приматов). Как известно в данной области, СО38 белки можно обнаружить в ряде видов. Конкретно, в настоящем изобретении используются антитела, связывающиеся как с СО38 белками человека, так и приматов, особенно приматов, используемых в клиническом испытании, таких, как яванские (Масаса Еа8С1Си1аг18, макак-крабоед, иногда называемый в настоящем документе как "супо") макаки. "СО38 человека" или "СО38 антиген человека" относится к белку ЛЕО ГО N0: 1 или его функциональной фракции, такой как эпитоп, указанный в настоящем документе. В общем, СО38 имеет короткий интрацитоплазматический хвост, трансмембранный домен и внеклеточный домен, в конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению связываются с внеклеточной частью СО38 белка. Под "СО38 яванского макака" в настоящем документе подразумевается ЛЕО ГО N0: 2, которая на 92% идентична СО38 человека.</p>
<p>Синонимы СО38 включают ДЦФ-рибозилциклазу 1, цАДФР-гидролазу 1, СО38-Г81, гидролазу 1 циклической АДФ-рибозы, 1-19 и ΝΙΜ-Κ5 антиген.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения АЬ79 антитела к СО38 согласно настоящему изобретению взаимодействуют с СО38 с некоторым количеством аминокислотных остатков, включающих К121, Р135, 0139, 0141, М142, 0202, У203, Н205, 0236, Е239, №241, §274, С275, К276, Р284, С287, У288, К289, N290, Р291, Е292, 0293. Как приведено в настоящем документе, другие антитела, взаимодействующие с этими остатками, также находят применение в терапевтических и диагностических использованиях.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела к СО38 согласно настоящему изобретению необязательно (а в некоторых случаях предпочтительно) не связываются с другими членами семейства СО38, такими как СО157. Например, предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения не связываются с СО157 человека с ЛЕО ГО N0: 23 (идентификационный номер по СепВапк N1’ 004325).</p>
<p>Антитела.</p>
<p>Настоящее изобретение предлагает антитела к СО38, как правило, терапевтические и/или диагностические антитела, описанные в настоящем документе. Антитела, которые находят применение в настоящем изобретении, могут принимать различные форматы, описанные в настоящем документе, в том числе традиционные антитела, а также производные, фрагменты и миметики антител, описанные ниже. По существу, изобретение предлагает структуры антител, содержащие набор 6 СОК, указанный в настоящем документе (включая небольшое количество аминокислотных замен, описанных ниже).</p>
<p>Традиционные структурные части антител обычно содержат тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну "легкую" (как правило, имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (как правило, имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как Ι§Μ, Ι§0, 1§С, 1дА и 1дЕ соответственно. 1дС имеет несколько подклассов, включая, но не ограничиваясь 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. 1§М имеет подклассы, включая, но не ограничиваясь 1дМ1 и 1дМ2. Таким образом, "изотип" в контексте настоящего описания означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определенный химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известными изотипами иммуноглобулина человека являются 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1, 1дА2, 1дМ1, 1дМ2, Ι§0 и 1§Е. Следует понимать, что терапевтические антитела могут также содержать гибриды изотипов и/или подклассов.</p>
<p>Амино-концевой участок каждой цепи включает вариабельную область примерно от 100 до 110 или более аминокислот, несущую основную ответственность за распознавание антигена. В вариабельной области три петли собраны для каждого из У-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего центра антитела. Каждая из петель называется "гипервариабельный участок" (далее по тексту "СОК"), в котором вариация в аминокислотной последовательности является наиболее значимой. "Вариабельный" относится к тому факту, что среди антител определенные сегменты вариабельной области различаются по последовательности. Вариативность в вариабельной области распределена неравномерно. Вместо этого, У-области состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркас- 4 029303</p>
<p>ными участками (РК) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями со значительной изменчивостью, называемых "гипервариабельные области", каждая из которых имеет длину 9-15 аминокислот или длиннее.</p>
<p>Каждая УН и УЪ состоит из трех гипервариабельных областей ("гипервариабельные участки", "СОК") и четырех РК, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: РК1СЭК1-РК2-СОК2-РК3-СОК3 -РК4.</p>
<p>Гипервариабельная область, как правило, охватывает аминокислотные остатки от приблизительно аминокислотных остатков 24-34 (ЬСПК1, "Ь" обозначает легкую цепь), 50-56 (ЬСПК2) и 89-97 (ЬСОКЗ) в вариабельной области легкой цепи, и примерно приблизительно 31-35В (НСЭК1; "Н" обозначает тяжелую цепь), 50-65 (НСЭК2) и 95-102 (НСЭК3) в вариабельной области тяжелой цепи; КаЬа! е! а1., 8Е0иЕЖ.’Е8 ОР РКОТЕШ8 ОР 1ММШОЬОО1САЬ ЮТЕКЕ8Т, 5" Еб. РиЬНс НеаНЬ 8етуюе, \аПопа1 Ιηβΐΐ1и1е8 оГ НеаИЬ, ВеШекба, Мб. (1991) и/или остатки, формирующие гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (ЬСПК1), 50-52 (ЬСПК2) и 91-96 (ЬСПК3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (НСЭК1), 53-55 (НСОК2) и 96-101 (НСЭК3) в вариабельной области тяжелой цепи; СНо!Ыа апб Ьекк (1987) 1. Мо1. Вю1. 196:901-917. Конкретные СОК согласно настоящему изобретению описаны ниже.</p>
<p>В настоящем описании система нумерации по КаЬа!, как правило, используется, когда речь идет об остатке в вариабельном домене (примерно, остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1113 вариабельной области тяжелой цепи) (например, КаЬа! е! а1., 8ирта (1991)), с системой нумерации ЕС, используемой для Рс-области.</p>
<p>СОК способствуют образованию антиген-связывающего, или, более конкретно, эпитопсвязывающего сайта антитела. "Эпитоп" относится к детерминанте, взаимодействующей со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Эпитопы являются группами молекул, такими как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют конкретные структурные характеристики, а также конкретные характеристики заряда. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Например, как показано в настоящем документе, два различных антитела, называемые в настоящем документе "АЬ19" и "АЬ79", связываются с различными эпитопами на СЭ38 молекуле.</p>
<p>Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантный компонент эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не вовлечены в связывание, например, аминокислотные остатки, которые эффективно заблокированы специфическим антиген-связывающим пептидом; другими словами, аминокислотный остаток входит в участок конкретного антиген-связывающего пептида.</p>
<p>Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп формируется аминокислотами, пространственно размещенными рядом, из различных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп формируется соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационный и неконформационный эпитопы могут быть различены тем, что связывание с первым, но не с последним, нивелируется в присутствии денатурирующих растворителей.</p>
<p>Как правило, эпитоп содержит по меньшей мере 3 и обычно более по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть верифицированы простым иммунологическим анализом, демонстрирующим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, например "связывание", как приведено в примерах исследования при помощи рентгеноструктурной кристаллографии, приведенных в примерах, идентифицировали аминокислотные остатки, связывающиеся как с антителами согласно настоящему изобретению (включая АЬ19 и АЬ79), так и с антителами согласно известному уровню техники (тест 1 и тест 2), как продемонстрировано на фиг. 4.</p>
<p>В настоящем изобретении АЬ79, как приведено в примерах, взаимодействует с некоторым количеством аминокислотных остатков СО38, включая К121, Р135, Ц139, Ό141, М142, Е239, \У241, 8274, С275, К276, Р284, У288, К289, N290, Р291, Е292 и Ό293. Следует отметить, что эти остатки одинаковы как у человека, так и у яванских макаков, с тем исключением, что 8274 является Р274 у яванского макака. Эти остатки могут представлять иммунодоминантный эпитоп и/или остатки, входящие в участок конкретного антиген-связывающего пептида.</p>
<p>В настоящем изобретении АЬ19 связывается с другим эпитопом, включая 091, Е103, Е1034, Ό105, Ц107, М110, К111, Т114, Ц115, Т148, У192, К194, К195, Р196, А199, Н228, N229, Ц231, Е233 и К234. Следует отметить, что эти остатки одинаковы как у человека, так и у яванских макаков, с тем исключением, что М110 является У110 у яванского макака и А199 является Т199 у яванского макака.</p>
<p>Таким образом, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела, конкурирующие с АЬ79 и АЬ19 путем связывания с любым из этих эпитопов, могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний. Следует отметить, что АЬ79 и ВМ1 имеют некоторое перекрытие, таким образом антитела, конкурирующие с АЬ79 и не являющиеся ВМ1, находят применение в настоящем изобретении.</p>
<p>Таким образом, настоящее изобретение предлагает антитела, связывающиеся как с СЭ38 человека, так и СЭ38 яванского макака и взаимодействуют по меньшей мере с 80, 90, 95 или 98% этих остатков.</p>
<p>- 5 029303</p>
<p>Другими словами, площадь поверхности зоны взаимодействия не превышает площади этих остатков.</p>
<p>Карбокси-концевой участок каждой цепи определяет константную область, несущую основную ответственность за эффекторную функцию. КаЬа! е! а1. собрали многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. В зависимости от степени сохранения последовательности, они классифицировали отдельные первичные последовательности в СОК и каркасном участке и создали их список (см. δΕρυΕΝίΈδ ΘΡ 1ММиМОЬОС1САЬ ΙΝΤΕΚΕδΤ, 5'<sup>1</sup>' ебйюп, ΝΙΗ риЬЬсабоп, Νο.91-3242, Е.А. КаЬа! е! а1., работа включена во всей своей полноте посредством ссылки).</p>
<p>В подклассе иммуноглобулинов 1д0 существует несколько доменов иммуноглобулина в тяжелой цепи. Под "доменом иммуноглобулина (1д)" в настоящем документе подразумевается область иммуноглобулина, имеющая четкую третичную структуру. Доменами тяжелых цепей, представляющими интерес для настоящего изобретения, являются включающие константные тяжелые домены (СН) и домены шарнира. В контексте 1д0 антител, каждый из 1д0 изотипов имеет три СН-области. Соответственно, "СН" доменами в контексте 1д0 являются следующие: "СН1" относится к позиции 118-220 в соответствии с индексом ЕС согласно КаЬа!. "СН2" относится к позиции 237-340 в соответствии с индексом ЕС согласно КаЬа! и "СН3" относится к положениям 341-447 в соответствии с индексом ЕС согласно КаЬа!.</p>
<p>Другим типом 1д-домена тяжелой цепи является шарнирная область. Под "шарниром" или "шарнирной областью" или "шарнирной областью антитела" или "шарнирной областью иммуноглобулина" в настоящем документе подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно СН1-домен 1д0 заканчивается в позиции по ЕС 220 и СН2-домен 1д0 начинается с остатка в позиции по ЕС 237. Таким образом, для 1д0 шарнир антитела в настоящем документе определен как включающий позиции 221 (Ώ221 в 1дО1) до 236 (0236 в 1дО1), в котором нумерация осуществляется в соответствии с индексом ЕС согласно КаЬа!. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения, например, в контексте Рс-области, включен нижний шарнир, с "нижним шарниром", как правило относящимся к позициям 226 или 230.</p>
<p>Особый интерес для настоящего изобретения представляют Рс-области. Под "Рс" или "Рсобластью" или "Рс-доменом" в контексте настоящего описания подразумевается полипептид, содержащий константную область антитела за исключением первой константной области домена иммуноглобулина и в некоторых случаях части шарнира. Таким образом, Рс относится к двум последним константным областям доменов иммуноглобулина 1дА, 1§О, и 1д0, последним трем константным областям доменов иммуноглобулина 1дЕ и 1дМ и гибкого шарнира Ν-конца этих доменов. Для 1дА и 1дМ Рс может включать I цепь. Для 1д0 Рс-область иммуноглобулина состоит из доменов Су 2 и Су3 (Су2 и Су3) и нижней шарнирной области между Су1 (Су 1) и Су2 (Су2). Хотя границы Рс-области могут варьировать, тяжелая цепь Рс-области 1д0 человека, как правило, определяется, как включающая остатки С226 или Р230 к его карбоксильному концу, в котором нумерация осуществляется в соответствии с индексом ЕС согласно КаЬа!. В некоторых вариантах воплощения изобретения, как это более подробно описано ниже, в Рс-область внесенные аминокислотные модификации, например, для изменения связывания с одним или более РсуК-рецепторами или с РсКп-рецептором.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела являются полноразмерными антителами. Под "полноразмерным антителом" в настоящем документе подразумевается структура, которая представляет собой естественные биологические формы антител, включая вариабельные и константные области, включая одну или несколько модификаций, приведенных в настоящем документе.</p>
<p>Кроме того, антитела могут быть различными по структуре, включая, но не ограничиваясь фрагментами антител, моноклональными антителами, биспецифическими антителами, миниантителами, доменными антителами, синтетическими антителами (иногда называемыми в настоящем документе "миметики антител"), химерными антителами, гуманизированными антителами, слитыми антителами (иногда называемыми "конъюгаты антител"), а также фрагментами каждого из них соответственно. Структуры, которые по-прежнему полагаются.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело является фрагментом антитела. Специфические фрагменты антител включают, но не ограничиваются, (ί) РаЬ-фрагмент, состоящий из УЬ, УН, СЬ и СН1-доменов; (ΐΐ) Рб-фрагмент, состоящий из УН и СН1-доменов; (ίίί) Ру-фрагмент, состоящий из УЬ и УН-доменов одного антитела; (ίν) бАЬ-фрагмент (ГСагб е! а1., 1989, №йиге 341:544-546, работа включена во всей своей полноте посредством ссылки), состоящий из одной вариабельной области; (ν) изолированные СОК-области; (νί) Р(аЬ')<sub>2</sub>-фрагменты, бивалентные фрагментам, содержащим два связанных РаЬ-фрагмента; (νΐΐ) одноцепочечные Рν-молекулы (8сРν), в которых УН-домен и УЪ-домен соединены пептидным линкером, позволяющим двум доменам ассоциироваться с образованием антигенсвязывающего сайта (Βίτ6 е! а1., 1988, §шепсе 242:423-426, Ни§!оп е! а1., 1988, Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И.8.А. 85:5879-5883, работы включены во всей своей полноте посредством ссылки); (νΐΐΐ) биспецифические одноцепочечные Рν (ГСО 03/11161, включенный в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки) и (ΐχ) "диатела" или "тритела", мультивалентные или мультиспецифические фрагментам, сконструированным посредством слияния генов (ТотЪпкоп е!. а1., 2000, Ме!Ьобк Еп/уто1. 326:461-479; ГСО 94/13804; НоШдег е! а1., 1993, Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И.8.А. 90:6444-6448, работы включены во всей своей</p>
<p>- 6 029303</p>
<p>полноте посредством ссылки).</p>
<p>Химерные и гуманизированные антитела.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитело может быть комбинацией различных видов, например химерное антитело и/или гуманизированное антитело. Т.е. в настоящем изобретении наборы СЭР могут быть использованы с каркасными участками и константными областями, отличными от конкретно описанных последовательностью в настоящем документе.</p>
<p>В целом, как "химерные антитела", так и "гуманизированные антитела" относятся к антителам, сочетающим области более, чем одного вида. Например, традиционно "химерные антитела" содержат вариабельную область(ти) мыши (или крысы в некоторых случаях) и константную область(ти) человека. "Гуманизированные антитела" в целом относятся к нечеловеческим антителам, которые имели вариабельные домены каркасных участков, замещенные последовательностями, обнаруженными в антителах человека. Как правило, в гуманизированном антителе все антитело, за исключением СОК, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или идентично этому антителу, за исключением его СОК. СОК, некоторые или все, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из организмов, не являющихся человеком, пересаживают в бета-складчатый каркасный участок вариабельного участка антитела человека для создания антитела, специфичность которого определяется пересаженными СОК. Создание таких антител описано, например, в УО 92/11018, Шпек, 1986, №Цигс 321:522-525, УегЬоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе 239:1534-1536, все работы включены во всей своей полноте посредством ссылки. Для восстановления аффинности, которая теряется в исходной конструкции при пересадке, часто требуется "обратная мутация" избранных аминокислотных остатков акцепторного каркасного участка на соответствующие донорные аминокислотные остатки (И8 5530101; И8 5585089; И8 5693761; И8 5693762; И8 6180370; и8 5859205; И8 5821337; И8 6054297; И8 6407213, все включены во всей своей полноте посредством ссылки). Оптимально гуманизированное антитело также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека, и, следовательно, будет типично содержать Рс-область человека. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием мышей с генетически сконструированной иммунной системой. Вос|ие е! а1., 2004, Βίο1ес1то1. Ргод. 20:639-654, включен во всей своей полноте посредством ссылки. В данной области хорошо известны различные методики и способы гуманизации и реконструирования антител, не принадлежащих человеку (см. ТщгиЧШа&Уаксще/. 2004, Ниташ/аОоп о£ Мопос1опа1 ЛпОЬоШеБ Мо1еси1аг Вю1оду о£ В Се11к, 533-545, Е1кеу1ег 8аепсе (и8А), и приведенные в этом документе ссылки, все включены во всей своей полноте посредством ссылки). Способы гуманизации включают, но не ограничиваются способами, описанными в работах Шпек е! а1., 1986, №-11иге 321:522-525; ЮесЬтапп е! а1., 1988; Ха!иге 332:323-329; УегЬоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе, 239:1534-1536; Онееп е! а1., 1989, Ргос. №!1. АсаД. 8ск, И8А 86:10029-33; Не е! а1., 1998, 1. 1ттипо1. 160: 1029-1035; Сайег е! а1., 1992, Ргос. Ыа!1. АсаД. 8с1. И8А 89:4285-9, Ргек!а е! а1., 1997, Сапсег Кек. 57(20):4593-9; Ооттап е! а1., 1991, Ргос. Ыа!1. АсаД. 8οΐ. И8А 88:4181-4185; О'Соппог е! а1., 1998, Рто!ет Епд. 11:321-8, все работы включены во всей своей полноте посредством ссылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей антител, не являющихся человеческими, могут включать способы восстановления поверхности, как описано, например, в работе Кодикка е! а1., 1994, Ргос. Ыа!1. АсаД. 8ск И8А 91:969-973, включенной во всей своей полноте посредством ссылки. В одном варианте воплощения настоящего изобретения исходное антитело является аффинно созревшим, как это известно в данной области техники. Для гуманизации и аффинного созревания возможно применять структурные способы, как, например, описано в υ88Ν 11/004590. Для гуманизации и/или аффинного созревания вариабельных областей антител возможно применять селекционные способы, которые включают, но не ограничиваются способами, описанными в работах Уи е! а1., 1999, 1. Мо1. Вю1. 294:151-162; Васа е! а1., 1997, 1. Вю1. СЬет. 272 (16):10678-10684; Кокок е! а1., 1996, 1. Вю1. СЬет. 271(37): 22611-22618; КаДег е! а1., 1998, Ргос. №!1. АсаД. 8ск и8А 95: 8910-8915; Кгаикк е! а1., 2003, Рго!еш Епдтеейпд 16(10):753-759, все включены во всей своей полноте посредством ссылки. Другие способы гуманизации могут включать пересадку только частей СОК, эти способы включают, но не ограничиваются способами, описанными в работах υ88Ν 09/810510; Тап е! а1., 2002, 1. 1ттипо1. 169:1119-1125; Эе РаксаЬк е! а1., 2002, 1. 1ттипо1. 169:3076-3084, все включены во всей своей полноте посредством ссылки.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению могут быть мультиспецифическими антителами и, особенно биспецифическими антителами, также иногда называемыми "диатела". Они являются антителами, связывающимися с двумя (или более) различными антигенами или различными эпитопами одного антигена. Диатела возможно изготовить различными способами, известными в данной области техники (НоШдет апД Ут!ет, 1993, Ситтеп! Ортюп Вю!есЬпо1. 4:446-449, включен во всей своей полноте посредством ссылки), например, получив химическим путем или из гибридных гибридом.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело является миниантителом. Миниантитела являются доведенными до минимума антителоподобными белками, включающими ксРу, присоединенными к СН3-домену. Ни е! а1., 1996, Сапсег Кек. 56:3055-3061, включен во всей своей полноте посредством ссылки. В некоторых случаях ксРу может быть присоединен к Рс-области, и может вклю- 7 029303</p>
<p>чать некоторую часть или всю шарнирную область.</p>
<p>Антитела согласно настоящему изобретению обычно являются выделенными или рекомбинантными. Термин "выделенный", используемый для описания различных полипептидов, описанных в настоящем документе, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен из клеток или клеточной культуры, в которой экспрессировался. Как правило, выделенный полипептид будет подготовлен, по меньшей мере, одной стадией очистки. "Выделенное антитело" означает антитело, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные антигенные свойства. Например, выделенное антитело, специфически связывающееся с ί'.Ό38, по существу, не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от ί'.Ό38.</p>
<p>Выделенное антитело, специфически связывающееся с эпитопом, изоформа или вариант СО38 человека или С.ГО38 яванского макака может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, других видов, таких как видовые гомологи ί'.Ό38. Более того, выделенное антитело может быть, по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.</p>
<p>Выделенные моноклональные антитела, имеющие различные свойства, могут быть объединены в хорошо определенной композиции. Так, например, АЬ79 и АЫ9 могут быть объединены в одной лекарственной форме, если это необходимо.</p>
<p>Антитела к СО38, согласно настоящему изобретению, специфически связывают СО38-лиганды (например, СГО38 белки 8ЕО ГО N0: 1 и 2 человека и яванского макака). "Специфическое связывание" или "специфически связывается с" или "специфичное для" конкретного антигена или эпитопа означает связывание, заметно отличающееся от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, посредством определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно является молекулой аналогичной структуры, которая не имеет связывающей активности. Например, специфическое связывание может быть определено путем конкуренции с контрольной молекулой, схожей с мишенью.</p>
<p>Специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может демонстрироваться, например, антителом, имеющим КО для антигена или эпитопа по меньшей мере приблизительно 10<sup>-4</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-5</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-6</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-7</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-8</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-9</sup> М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10<sup>-10</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-11</sup> М, по меньшей мере приблизительно 10<sup>-12</sup> М, или более, где КО относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, специфически связывающее антиген, будет иметь КО в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- и в более раз выше для контрольной молекулы по отношению к антигену или эпитопу.</p>
<p>Кроме того, специфическое связывание с конкретным антигеном или эпитопом может демонстрироваться, например, антителом, имеющим КА или Ка для антигена или эпитопа по меньшей мере в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- или более раз больше для эпитопа по сравнению с контролем, где КА или Ка относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.</p>
<p>Модификации антител.</p>
<p>Настоящее изобретение дополнительно предлагает вариант антител. Т.е. существует ряд модификаций для антител согласно настоящему изобретению, которые могут быть проведены, включающие, но не ограничивающиеся модификациями аминокислот в СОК (аффинное созревание), модификациями аминокислот в Ре-области, вариантами гликозилирования, ковалентными модификациями других типов и т.д.</p>
<p>Под "вариантной" в настоящем документе подразумевается полипептидная последовательность, отличающаяся от исходного полипептида посредством, по меньшей мере, модификации одной аминокислоты. Аминокислотные модификации могут включать замены, инсерции и делеции, причем первая модификация является предпочтительной во многих случаях.</p>
<p>Как правило, варианты могут включать любое количество модификаций до момента сохранения функции белка, описанной в настоящем документе. Т.е. в случае аминокислотных вариантов, проделанных с СОК либо АЬ79, либо АЬ19, например, антитело должно по-прежнему специфически связываться как с СО38 человека, так и СО38 яванского макака. Аналогично, если аминокислотные варианты проделываются с Рс-областью, например, вариантные антитела должны поддерживать необходимые функции связывания рецептора для конкретного применения или показания для антитела.</p>
<p>Однако, как правило, используются 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из используемых аминокислотных замен, и часто целевой результат преследует изменение функции с минимальным количеством модификаций. В некоторых случаях, проводится от 1 до 5 модификаций, с от 1-2, 1-3 и 1-4 также находящими применение во многих вариантах воплощения настоящего изобретения.</p>
<p>Следует отметить, что количество аминокислотных модификаций может быть в пределах функциональных доменов: например, желательными могут быть от 1-5 модификации в Рс-области дикого типа или генно-инженерных белков, а также от 1 до 5 модификаций в Ρν-области, например. Вариантная последовательность полипептида предпочтительно будет иметь по меньшей мере приблизительно 80, 85,</p>
<p>- 8 029303</p>
<p>90, 95 или до 98 или 99% идентичности исходной последовательности (например, вариабельные области, константные области и/или тяжелые и легкие цепи последовательностей для ЛЬ79 и/или ЛЫ9). Следует отметить, что в зависимости от размера последовательности, процент идентичности будет зависеть от количества аминокислот.</p>
<p>Под "аминокислотной заменой" или "заменой" в настоящем документе подразумевается замена аминокислоты в определенной позиции в исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена 8100Л относится к вариантному полипептиду, в котором серин в положении 100 заменен на аланин. Под "инсерцией аминокислоты" или "инсерцией" в контексте настоящего описания подразумевается добавление аминокислоты в конкретное положение в исходной полипептидной последовательности. Под "делецией аминокислоты" или "делецией" в контексте настоящего описания подразумевается удаление аминокислоты в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности.</p>
<p>Под "исходным полипептидом", "исходным белком", "полипептидом-предшественником" или "белком-предшественником" в контексте настоящего описания подразумевается немодифицированный полипептид, который последовательно модифицируется для создания варианта. В общем, исходными полипептидами в настоящем документе являются АЬ79 и АЬ19. Исходный полипептид может относиться к непосредственно полипептиду, композициям, содержащим исходный полипептид, или аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Соответственно, "исходный Рс-полипептид" в контексте настоящего описания подразумевает Рс-полипептид, модифицированный для создания варианта, а "исходное антитело" в контексте настоящего описания подразумевает антитело, модифицируемое для создания вариантного антитела.</p>
<p>Под "диким типом" или "Д(Г" или "нативным" в настоящем документе подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, встречающаяся в природе, включая аллельные варианты. ДГ белок, полипептид, антитело, иммуноглобулин, 1§О и т.д. имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.</p>
<p>Под "вариантной Рс-областью" в настоящем документе подразумевается Рс-последовательность, отличающаяся от Рс-последовательности дикого типа посредством, по меньшей мере, модификации одной аминокислоты. Вариантный Рс может относиться к непосредственно Рс-полипептиду, композициям, содержащим вариантный Рс-полипептид или аминокислотную последовательность.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения одна или более аминокислотных модификаций выполнены в одном или более СОК антитела (либо АЬ79, либо АЬ19). Как правило, только 1 или 2 или 3 аминокислоты замещаются в любом единичном СОК и, как правило, не более, чем от 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 изменений вносятся в пределах набора СОК. Гем не менее, следует понимать, что любая комбинация отсутствия замен, 1, 2 или 3 замен в любом СОК могут независимо и необязательно сочетаться с любой другой заменой.</p>
<p>В некоторых случаях аминокислотные модификации в СОК называются "аффинным созреванием". "Аффинно созревшим" антителом является антитело, имеющее одну или более альтераций в одном или более СОК, что приводит к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, не имеющем тех альтераций. В некоторых случаях, хотя и редко, желательным может быть уменьшение аффинности антитела к его антигену, но это, как правило, не является предпочтительным.</p>
<p>Аффинное созревание может быть осуществлено для увеличения аффинности связывания антитела с антигеном по меньшей мере приблизительно с 10 до 50-100-150% или более, или от 1 до 5 раз по сравнению с "исходным" антителом. Предпочтительные аффинно зрелые антитела будут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают при помощи известных процедур. См., например, работу Магкз е! а1., 1992, Вю!есЬпо1о§у 10:779-783, в которой описано аффинное созревание путем перестановки доменов вариабельной области тяжелой цепи (УН) и вариабельной области легкой цепи (УЬ). Случайный мутагенез СОК и/или аминокислотных остатков каркасных участков описан в работах ВагЬаз, е! а1. 1994, Ргос. Ν;·ιΙ. Асай. δει, И8А 91:3809-3813; 8Ыег е! а1., 1995, Оеие 169:147-155; УеПои е! а1., 1995, 1. 1ттипо1. 155:1994-2004; 1аскзоп е! а1., 1995, 1. 1ттипо1. 154(7):3310-9; и Нщуктз е! а1, 1992, 1. Мо1. Вю1. 226:889-896, например.</p>
<p>Кроме того, аминокислотные модификации могут быть проведены в одном или нескольких СОК антитела согласно настоящему изобретению, которые являются "молчащими", например, которые существенно не изменяют аффинности антитела к антигену. Это может быть осуществлено по ряду причин, в том числе для оптимизации экспрессии (что может быть проведено для нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению).</p>
<p>Таким образом, включенными в определение СЭР и антител согласно настоящему изобретению являются вариантные СЭК и антитела, т.е. антитела согласно настоящему изобретению могут включать аминокислотные модификации в одном или нескольких СОК АЬ79 и АЬ19. В дополнение к этому, как приведено ниже, аминокислотные модификации также могут независимо и необязательно проводится в любой области вне СОК, включая каркасные участки и константные области.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения описаны вариантные антитела АЬ79 и</p>
<p>- 9 029303</p>
<p>ЛЫ9, специфичные для СЭ38 человека (ЗЕО ГО N0: 1) и СГО38 яванского макака (ЗЕО ГО N0: 2). Данное антитело состоит из шести СОК, отличающееся тем, что каждый СОК данного антитела может отличаться от ЗЕр ГО N0: 3, ЗЕр ГО N0: 4, ЗЕр ГО N0: 5, ЗЕр ГО N0: 6, ЗЕр ГО N0: 7 и ЗЕр ГО N0: 8 на 0, 1 или 2 аминокислотные замены.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела к СГО38 согласно настоящему изобретению состоят из вариантного Рс-домена. Как известно в данной области техники, Рс-область антитела взаимодействует с рядом Рс-рецепторов и лигандов, передавая массив важных функциональных возможностей, называемых эффекторные функции. Данные Рс-рецепторы, включают, но не ограничиваются (у человека) РсуК1 (СГО64). включая изоформы РсуК1а, РсуК1Ь и РсуК1с; РсуКН (СГО32), включая изоформы РсуКПа (включая аллотипы Н131 и К131), РсуКНЬ (включая РсуК11Ь-1 и РсуК11Ь-2), и РсуКПс; и РсуКШ (СГО16), включая изоформы РсуКШа (включая аллотипы У158 и Р158, коррелирующие с антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (АЭСС)) и РсуКШЬ (включая аллотипы РсуКШЬ-НЛ1 и РсуКШЬ-НЛ2), РсКп (неонатальный рецептор), С1с| (комплементарный белок, вовлеченный в комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС)) и РсКп (неонатальный рецептор, вовлеченный в сывороточный полураспад). Подходящие модификации могут быть проведены в одном или более положениях, в общем приведенных, например, в заявке на патент ИЗ 11/841654 и ссылки в них, ИЗ 2004/013210, ИЗ 2005/0054832, ИЗ 2006/0024298, ИЗ 2006/0121032, ИЗ 2006/0235208, ИЗ 2007/0148170, υЗЗN 12/341769, патенте ИЗ №6737056, патенте ИЗ №7670600, патенте ИЗ №6086875, все включены во всей своей полноте посредством ссылки, и, в частности, для конкретных аминокислотных замен, увеличивающих связывание с Рс-рецепторами.</p>
<p>В дополнение к модификациям, приведенным выше, могут быть выполнены другие модификации. Например, молекулы могут быть стабилизированы путем введения дисульфидных мостиков, связывающих УН и УЬ домены (Кейет с1 а1., 1996, №йигс Вю1сс1т 14:1239-1245, работа включена во всей своей полноте посредством ссылки). В дополнение к этому, существуют различные ковалентные модификации антител, которые могут быть проведены, приведены ниже.</p>
<p>Ковалентные модификации антител включены в объем настоящего изобретения, и, как правило, но не всегда, проведены посттрансляционно. Например, несколько типов ковалентных модификаций антитела вводятся в молекулу путем реакции специфических аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, способным реагировать с избранными боковыми цепями или или С-концевыми остатками.</p>
<p>Остатки цистеинила наиболее часто вступают в реакцию с α-галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид для создания карбоксиметил- или карбоксиамидометил-производных. Остатки цистеинила также могут быть дериватизированы реакцией с бромтрифторацетоном, а-бром-в-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлоруксусным фосфатом, К-алкилмалеинимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-оксо-1,3-оксадиазолом и т.п.</p>
<p>Остатки гистидила дериватизируются реакцией с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, так как этот агент относительно специфичен для боковой цепи гистидила. Также используется парабромфенацилбромид, реакцию предпочтительно проводят в 0,1М натрия какодилата при рН 6,0.</p>
<p>Лизинил и терминальные аминокислотные остатки вступают в реакцию с янтарным или другими ангидридами карбоновых кислот. Дериватизация с этими агентами имеет эффект изменения заряда остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-амино-содержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксаль фосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; 0-метилизомочевину, 2,4-пентандион и реакцию с глиоксилатом, катализируемую трансаминазой.</p>
<p>Остатки аргинила модифицируют путем реакции с одним или несколькими общепринятыми реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует проведения реакции в щелочных условиях из-за высокой рК<sub>а</sub> функциональной группы гуанидина. Кроме того, эти реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.</p>
<p>Специфическая модификация остатков тирозина может быть проведена, особый интерес представляет введение спектральных меток в остатки тирозина путем реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. Чаще всего используются ^ацетилимидазол и тетранитрометан для образования соединений О-ацетилтирозила и 3-нитропроизводных соответственно. Остатки тирозила йодируются с использованием 1251 или 1311 для создания меченых белков для использования в радиоиммунном анализе, описанный выше способ с использованием хлорамина Т является подходящим.</p>
<p>Боковые карбоксильные группы (аспартил или глутамил) избирательно модифицируют путем реакции с карбодиимидами (^-^=0=^-^), где К и К' необязательно являются различными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила преобразуются в остатки аспарагинила и глутаминила путем взаимодействия с ионами аммония.</p>
<p>- 10 029303</p>
<p>Дериватизация при помощи бифункциональных агентов полезна для перекрестного сшивания антител с водонерастворимой поддерживающей матрицей или поверхностью для использования в различных способах, в дополнение к способам, описанным ниже. Обычно используемые агенты для перекрестного сшивания включают, например, 1,1-бис-(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, например эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидильные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат) и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Ы-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(параазидофенил)дитио]пропиоимидат, позволяют получить фотоактивируемые промежуточные продукты, способные к образованию поперечных сшивок в присутствии света. Альтернативно, высокореактивные водонерастворимые матрицы, такие как "супото1ди8одеи" бромид-активированные углеводы и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах υ.δ. №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, все включены во всей своей полноте посредством ссылки, используемые для иммобилизации белков.</p>
<p>Остатки глутаминила и аспарагинила часто деамидируют для получения соответствующих остатков глутамила и аспартила соответственно. Альтернативно, эти остатки деамидируют в мягких кислых условиях. Оба способа образования этих остатков входят в объем настоящего изобретения.</p>
<p>Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование α-аминогрупп лизиновых, аргининовых и гистидиновых боковых цепей (Т.Е. СтещЙои, Рто!еш8: 8!гис!иге аиб Мо1еси1аг РторетИек, А.Н. Ргеетаи&Со., 8аи Ртаишксо, рр. 79-86 [1983], работа включена во всей своей полноте посредством ссылки), ацетилирование Ν-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.</p>
<p>В дополнение к этому, что будет понятно специалистам в данной области техники, метки (включая флуоресцентные, ферментные, магнитные, радиоактивные и т.д. все могут быть добавлены к антителам (а также другие композиции согласно настоящему изобретению).</p>
<p>Г ликозилирование.</p>
<p>Другим типом ковалентной модификации являются изменения в гликозилировании. В другом варианте воплощения настоящего изобретения антитела, описанные в настоящем документе, могут быть модифицированы для включения одной или более сконструированных гликоформ. Под "сконструированной гликоформой" в контексте настоящего описания подразумевается углеводная композиция, ковалентно присоединенная к антителу, в котором указанная углеводная композиция химически отличается от углеводной композиции исходного антитела. Сконструированные гликоформы могут быть полезны для различных целей, включая, но не ограничиваясь, усилением или снижением эффекторной функции. Предпочтительным способом образования сконструированной гликоформы является афукозилирование, которое, как было показано, коррелирует с увеличением АЭСС функции, предположительно за счет тесной связи с рецептором РсуКШа. В контексте настоящего описания "афукозилирование" означает, что большая часть антитела, продуцируемого в клетках-хозяевах, по существу, свободна от фукозы, например, 90-95-98% образуемых антител не содержат фукозу в качестве существенного компонента углеводного остатка антитела (обычно прикрепленного к Ν297 в Рс-области). Определено функционально, что афукозилированные антитела обычно имеют по меньшей мере 50%-ную или большую аффинность к рецептору РсуКШа.</p>
<p>Сконструированные гликоформы могут быть созданы с использованием различных способов, известных в данной области техники (итаиа е! а1., 1999, Ыа!. Вю1есЬио1. 17:176-180; Пау1е8 е! а1., 2001, Вю!есЬио1. Вюеид. 74:288-294; §Пе1б8 е! а1., 2002, I. Вю1. СЬет. 277:26733-26740; 8Ьшка\уа е! а1., 2003, I. Вю1. СЬет. 278:3466-3473; υδ 6602684; υδδΝ 10/277370; υδδΝ 10/113929; РСТ АО 00/61739А1; РСТ АО 01/29246А1; РСТ АО 02/31140А1; РСТ АО 02/30954А1, все работы включены во всей своей полноте посредством ссылки; (Ро!е1Ь§еи!® !есЬио1оду |Вю\\а. 1ис., Принстон, Нью-Джерси]; О1усоМАЬ® д1усо8у1абои еидшеетшд !есЬио1оду [О1усаг! Вю!есЬио1о§у АО, Цюрих, Швейцария]). Многие из этих методик основаны на регулировании уровня фукозилированных и/или разветвленнных олигосахаридов, ковалентно присоединенных к Рс-области, например, путем экспрессии 1дО в различных организмах или клеточных линиях, сконструированных или созданных иным способом (например, клетки Ьес-13 СНО или клетки гибридомы крысы УВ2/0, путем регулирования ферментов, вовлеченных в путь гликозилирования (например, РиТ8 [α1, 6-фукозилтрансферазы] и/или β 1-4-Ы-ацетиглюкозаминтрансферазы III [ОиТ111]), либо путем модификации углевода(ов) после экспрессии 1дО. Например, "сахар сконструированное антитело" или "8ЕА технология" §еай1е Оеиебск функционирует путем добавления модифицированных сахаров, ингибирующих фукозилирование в процессе производства; см., например, 20090317869, включенная в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки. Сконструированная гликоформа как правило относится к различному углеводу или олигосахариду; таким образом, антитело может включать сконструированную гликоформу.</p>
<p>Альтернативно сконструированная гликоформа может относиться к вариантному 1дО, содержащему различный углевод или олигосахарид. Как известно в данной области техники, гликозилирование может зависеть как от последовательности белка (например, наличия или отсутствия конкретных амино- 11 029303</p>
<p>кислотных остатков, пригодных для гликозилирования, рассмотрены ниже), так и от клетки-хозяина или организма, в котором продуцируется белок. Отдельные экспрессионные системы рассмотрены ниже.</p>
<p>Гликозилирование полипептидов обычно происходит либо через Ν-связь, либо через О-связь. Νгликозилирование относится к присоединению углеводного остатка к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X - любая аминокислота, кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводного остатка к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Огликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.</p>
<p>Включение сайтов гликозилирования в антитело удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов Ν-гликозилирования). Изменение также может быть проделано путем добавления или замещения одного или нескольких остатков серина или треонина для начала последовательности (для сайтов О-гликозилирования). Для удобства аминокислотная последовательность антитела предпочтительно модифицируется в результате изменений на уровне ДНК, в частности, путем мутирования ДНК, кодирующей полипептид-мишень в заранее выбранных основаниях, так, чтобы образовывались кодоны, которые будут транслироваться в желаемые аминокислоты.</p>
<p>Другими способами увеличения числа углеводных остатков на антителе является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к белку. Эти процедуры имеют преимущество, поскольку они не требуют продуцирования белка в клетке-хозяине, имеющей гликозилирующие способности к Ν- и О-гликозилированию. В зависимости от используемого способа присоединения, сахар(а) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидину, (б) свободным карбоксильным группам, (в) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (г) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (д) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (е) амидной группе глутамина. Данные способы описаны в АО 87/05330 и в Άρΐίη апб АпЧоп. 1981, СРС Сгй. Кеу. Вюсйет., рр. 259-306, работы включены во всей своей полноте посредством ссылки.</p>
<p>Удаление углеводных остатков, присутствующих в исходном антителе (например, посттрансляционно), может быть реализовано химически или ферментативно. Для химического дегликозилирования необходимо воздействие на белок трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного соединения. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связанного сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), оставляя полипептид интактным. Химическое дегликозилирование описано в работах Накшиййш е! а1., 1987, Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 259:52 и Ебде е! а1., 1981, Апа1. Вюсйет. 118:131, которые включены во всей своей полноте посредством ссылки. Ферментативное отщепление углеводных остатков полипептидов может быть достигнуто путем использования различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в работе Тйо1акига е! а1., 1987, Ме!й. Еп/уто1. 138:350, включенной во всей своей полноте посредством ссылки. Гликозилирование в потенциальных сайтах гликозилирования возможно предотвратить путем использования соединения туникамицина, как описано в работе Эщкт е! а1., 1982, 1. Βίοί. Сйет. 257:3105, включенной во всей своей полноте посредством ссылки. Туникамицин блокирует образование белок-Ы-гликозидных связей.</p>
<p>Другой тип ковалентной модификации антитела включает присоединение антитела к различным небелковым полимерам, включающим, но не ограниченным, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, способом, описанным в, например, 2005-2006 РЕО Са!а1од £гот Ыек!аг Тйегареийск (доступен на веб-сайте Ыек!аг) патенты И8 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337, все работы включены во всей своей полноте посредством ссылки. В дополнение к этому, как известно в данной области техники, аминокислотные замены могут быть реализованы в различных позициях в антителе для облегчения присоединения полимеров, таких как ПЭГ. См., например, публикацию И.8. №2005/0114037А1, включенную во всей своей полноте посредством ссылки.</p>
<p>Варианты воплощения конкретных СЭР и вариативных областей.</p>
<p>Настоящее изобретение предлагает некоторое количество антител, каждое из которых имеет конкретный набор СЭР (включая, как приведено выше, некоторые аминокислотные замены). Как приведено выше, эти антитела могут характеризоваться набором 6 СЭР, вариабельными областями или полноразмерными тяжелыми и легкими цепями, включая константные области. В дополнение к этому, как приведено выше, могут быть осуществлены аминокислотные замены. В общем, в контексте изменений в структуре СЭР, в связи с относительно короткой длиной СЭР, аминокислотные модификации, как правило, характеризуются количеством аминокислотных модификаций, которые могут быть проведены. Хотя это также применимо к обсуждению количества аминокислотных модификаций, которые могут быть осуществлены в вариабельных, константных или полноразмерных последовательностях, в дополнение к ряду изменений, следует определить эти изменения в "% идентичности". Таким образом, как опи- 12 029303</p>
<p>сано в настоящем документе, антитела, включенные в объем настоящего изобретения, идентичны на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% последовательностям 8ЕО ГО N0:, перечисленным в настоящем документе.</p>
<p>В контексте ЛЬ79 антитела, набор СЭВ является следующим: три СЭВ тяжелой цепи охватывают ПССВ1 8ЕО ΙΌ N0: 3 (НСОКТ), 8ЕО ΙΌ N0: 4 (11С1Ж2) и 8ЕО ΙΌ N0: 5 (ПСОВ.® и три СОВ легкой цепи охватывают 8ЕО ГО N0: 6 (ЬСПК1), 8ЕО ГО N0: 7 (ЕС12В2) и 8ЕО ГО N0: 8 (ЕС0В3).</p>
<p>В частности, исключенными из настоящего изобретения являются антитела с 8Е0 ГО N0: 24 и 25 (тяжелые и легкие цепи теста 1) и с ЗЕЦ ГО N0: 26 и 27 (тяжелые и легкие цепи теста 2). Следует отметить, что эти антитела не являются перекрестнореактивными с СГО38 яванского макака, рассмотренного ниже.</p>
<p>Антитела согласно настоящему изобретению являются перекрестнореактивными с СГО38 человека и СГО38 яванского макака и, таким образом, являются межвидовыми перекрестнореактивными антителами. "Межвидовое перекрестнореактивное антитело" является антителом, обладающим аффинностью связывания с антигеном, характерной для первого вида млекопитающего, которая является практически идентичной аффинности связывания гомолога этого антигена вторым видом млекопитающего. Межвидовая перекрестная реактивность может быть выражена, например, как соотношение ΚΌ антитела для антигена первого вида млекопитающего к ΚΌ того же антитела для гомолога того же антигена второго вида млекопитающего, где соотношение составляет 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15 до 20. Альтернативно или дополнительно, антитело обладает "межвидовой перекрестной реактивностью", если оно демонстрирует терапевтическую или диагностическую эффективность при введении второму виду. Таким образом, в данном случае, антитела согласно настоящему изобретению являются перекрестнореактивными с СГО38 яванского макака, демонстрирующими доклиническую эффективность при введении яванским макакам и, таким образом, считаются перекрестнореактивными.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения предлагаются антитела, конкурирующие с антителами согласно настоящему изобретению (например, с АЬ79 и/или АЬ19) за связывание с СГО38 человека и/или СГО38 яванского макака, но не включены ни ВМ1, ни ВМ2. Конкуренция за связывание с СГО38 или частью СГО38 двумя или более антителами к СГО38 может быть определена любой подходящей методикой, как известно в данной области техники.</p>
<p>Конкуренция в контексте настоящего изобретения относится к любому обнаруживаемому значительному снижению способности антитела согласно настоящему изобретению (например, АЬ79 или АЬ19) связывать своего конкретного партнера по связыванию, например, СГО38. в присутствии исследуемого соединения. Как правило, конкуренция подразумевает по меньшей мере приблизительно 10-100%ное снижение связывание антитела согласно настоящему изобретению с СГО38 в присутствии конкурента, что измерено стандартными методиками, такими как ЕЬ13А или анализы В1асоте®. Так, например, возможно установить критерии конкурентоспособности, при которых определяется по меньшей мере приблизительно 10%-ное относительное ингибирование связывания, определяется по меньшей мере приблизительно 15%-ное относительное ингибирование связывания или определяется по меньшей мере приблизительно 20%-ное относительное ингибирование связывания до того, как антитело рассматривается как достаточно конкурентное. В случаях, когда эпитопы, принадлежащие конкурирующим антителам, в антигене расположены близко, конкуренция может быть отмечена более чем приблизительно 40%-ным ингибированием связывания СГО38 (например, по меньшей мере приблизительно 45%-ным ингибированием, например по меньшей мере приблизительно 50%-ным ингибированием, например по меньшей мере приблизительно 55%-ным ингибированием, например по меньшей мере приблизительно 60%-ным ингибированием, например по меньшей мере приблизительно 65%-ным ингибированием, например, по меньшей мере примерно 70%-ное ингибирование, например, по меньшей мере приблизительно 75%-ным ингибированием, например, по меньшей мере приблизительно 80%-ным ингибированием, например, по меньшей мере приблизительно 85%-ным ингибированием, например, по меньшей мере приблизительно 90%-ным ингибированием, например по меньшей мере приблизительно 95%-ным ингибированием или более высоким уровнем относительного ингибирования).</p>
<p>В некоторых случаях метятся один или более компонентов анализов конкурентного связывания, рассматриваемых ниже в контексте диагностических применений.</p>
<p>Также возможна конкуренция между антителами к СГО38 в отношении более чем одного из эпитопов СГО38 и/или части СО38, например, в контексте, когда антитело-связывающие свойства конкретного региона СГО38 удерживаются в его фрагментах, например, в случае хорошо представленного линейного эпитопа, расположенного в различных исследуемых фрагментах или конформационного эпитопа, представленного в достаточно больших фрагментах СО38, а также в СГО38.</p>
<p>Оценка конкуренции, как правило, включает оценку относительного ингибирующего связывания с использованием антитела согласно настоящему изобретению, СГО38 (либо человека, либо яванского макака, либо обоих), и исследуемой молекулы. Исследуемые молекулы могут включать любую молекулу, в том числе другие антитела, малые молекулы, пептиды и т.д. Соединения смешивают в количествах, достаточных для проведения сравнения, несущего информацию о селективности и/или специфичности молекул в продукте относительно других присутствующих молекул.</p>
<p>Количества исследуемого соединения, СГО38 и антител согласно настоящему изобретению могут</p>
<p>- 13 029303</p>
<p>варьировать. Например, для оценки наличия конкуренции методом ЕЫ§Л требуется приблизительно 550 мкг (например, приблизительно 10-50 мкг, приблизительно 20-50 мкг, приблизительно 5-20 мкг, приблизительно 10-20 мкг и т.д.) антитела к СЭ38 и/или СО38-мишений. Условия также должны быть пригодны для связывания. Как правило, физиологические или близкие к физиологическим условиям (например, температура приблизительно 20-40°С, рН приблизительно 7-8 и т.д.) являются подходящими для антитела к ί'.Ό38:ί'.Ό38 связывания.</p>
<p>Часто конкуренция отмечена значительно большим относительным ингибированием, чем приблизительно 5% по данным ЕЬ1§Л и/или РЛС8 анализа. Желательным может быть установление более высокого предела относительного ингибирования как критерия/детерминанты того, что является подходящим уровнем конкуренции в конкретном контексте (например, где анализ конкуренции используется для отбора или скрининга новых антител, созданных с предполагаемой функцией блокирования связывания другого пептида или молекулы, связывающихся с СЭ38 (например, природными партнерами по связыванию СЭ38. такими как СО31, также называемый СЭ31 антиген, ЕийоСАМ, ОРПЛ, РЕСАМ-1, эндотелиальная молекула клеточной адгезии тромбоцитов или природным антителом к СЭ38).</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 согласно настоящему изобретению специфически связывается с одним или более остатками или областями в СО38, но также не вступает в перекрестную реакцию с другими белками с гомологией к СО38, например, ΒδΤ-1 (антиген-1 стромы костного мозга) и Мо5, также называемый СЭ157.</p>
<p>Как правило, отсутствие перекрестной реактивности подразумевает менее, чем приблизительно 5%ное относительное конкурентное ингибирование между молекулами при оценке методом ЕЬ1§А и/или РАС8 анализа с использованием достаточного количества молекул при подходящих условиях анализа.</p>
<p>Ингибирование активности СИ38.</p>
<p>Описанные в настоящем изобретении антитела могут найти применение в блокировании взаимодействия лиганд-рецептор или ингибировании взаимодействия рецептор-компонент. Антитела к СИ38 согласно настоящему изобретению могут быть "блокирующими" или "нейтрализующими". "Нейтрализующее антитело" предназначено для обозначения антитела, связывание которого с СИ38 приводит к ингибированию биологической активности СИ38, например, его способности взаимодействовать с лигандами, ферментативную активность, сигнальную активность и, в частности, его способность активировать лимфоциты. Ингибирование биологической активности СИ38 возможно оценить при помощи одного или более стандартных анализов ίη νίίτο или ίη νίνο, известных в данной области техники (см. примеры ниже).</p>
<p>"Ингибирует связывание" или "блокирует связывание" (например, когда речь идет о торможении/блокировании связывания СИ38-партнера по связыванию с СИ38) охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование.</p>
<p>Ингибирование/блокирование связывания СИ38-партнера по связыванию с СИ38 может снизить или изменить нормальный уровень или тип клеточного сигналинга, возникающего при связывании СИ38-партнера по связыванию с СИ38 без ингибирования или блокирования. Ингибирование и блокирование также включают любое измеряемое снижение аффинности связывания СИ38-партнера по связыванию к СИ38 при контакте с антителом к СИ38 по сравнению с лигандом, не контактирующим с антителом к СИ38, например, блокирования связывания СИ38-партнера по связыванию с СИ38 по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.</p>
<p>Описанные антитела к СИ3 могут также ингибировать рост клеток. "Ингибирует рост" включает любое измеряемое снижение роста клеток при контакте с антителом к СИ38 по сравнению с ростом тех же клеток, не конкурирующих с антителом к СИ38, например, ингибирование роста культуры клеток по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения описанные антитела к СИ38 способны истощать активированные лимфоциты и плазматические клетки. "Истощение" в контексте настоящего описания подразумевает измеряемое снижения сывороточных уровней (например, как исследовано на яванских макаках) активированных лимфоцитов и/или плазматических клеток по сравнению с нелеченными животными. В общем, наблюдается истощение по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%. Как показано ниже в примерах, в дополнение к этому, особым преимуществом, характерным для антител согласно настоящему изобретению, является восстановление этих клеток после введения дозы, то есть, как известно для некоторых процедур (например, с антителами к СИ20), истощение клеток может продолжаться в течение длительного периода времени, что приводит к нежелательным побочным эффектам. Как показано в настоящем документе, функции активированных лимфоцитов и/или плазматических клеток являются восстанавливаемыми.</p>
<p>Способы получения антител согласно настоящему изобретению.</p>
<p>Настоящее изобретение дополнительно предлагает способы получения описываемых антител к СЭ38. Данные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую антитела согласно настоящему изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области техники, это может быть осуществлено различными способами, в зависимости от природы антитела. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения, в случае, когда анти- 14 029303</p>
<p>тела согласно настоящему изобретению являются общепринятыми полноразмерными антителами, например, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи в условиях, при которых продуцируется антитело, и оно может быть выделено.</p>
<p>В общем, предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению. Такие полинуклеотиды кодируют как вариабельные, так и константные области каждой из тяжелых и легких цепей, хотя другие комбинации также рассматриваются в настоящем изобретении в соответствии с композициями, описанными в настоящем документе. Настоящее изобретение также рассматривает фрагменты олигонуклеотидов, полученных из описанных полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот, комплементарных этим полинуклеотидам.</p>
<p>Полинуклеотиды могут быть в виде РНК или ДНК. В пределах объема настоящего изобретения находятся полинуклеотиды в виде ДНК, кДНК, геномной ДНК, аналогов нуклеиновых кислот и синтетические ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае одноцепочечной может быть кодирующей (смысловой) цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует полипептид, может быть идентична кодирующей последовательности, описанной в настоящем документе, или может быть отличной кодирующей последовательностью, чья последовательность в результате избыточности или вырожденности генетического кода кодирует те же полипептиды, как и ДНК, описанная в настоящем документе.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нуклеиновую кислоту(ты), кодирующую антитела согласно настоящему изобретению, вводят в экспрессионные векторы, которые могут быть внехромосомными или созданными для интеграции в геном клетки-хозяина, в которую он вводится. Экспрессионные векторы могут содержать любое количество соответствующих регуляторных последовательностей (включая, но не ограничиваясь, последовательности контроля транскрипции и трансляции, промоторы, сайты связывания рибосом, энхансеры, сайты инициации репликации и т.д.) или других компонентов (выбор генов и т.д.) все из которых функционально связаны, как хорошо известно в данной области техники. В некоторых случаях используются две нуклеиновые кислоты, и каждая вводится в различный экспрессионный вектор (например, тяжелая цепь является первым экспрессионным вектором, легкая цепь является вторым экспрессионным вектором), или, альтернативно, они могут быть введены в один экспрессионный вектор. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что разработка экспрессионного вектора(ов), включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д.</p>
<p>Как правило, нуклеиновые кислоты и/или экспрессия могут быть введены в подходящую клеткухозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина с использованием любого способа, подходящего для избранной клетки-хозяина (например, трансформация, трансфекция, электропорация, инфекция), таким образом, что молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана с одним или несколькими контролирующими экспрессию элементами (например, в векторе, в конструкции, созданной при помощи процессов в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученная рекомбинантная клеткахозяин может содержаться в условиях, пригодных для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, кроме человека, в подходящей культуральной среде с добавлением соответствующих солей, факторов роста, антибиотиков, пищевых добавок и т.п.), в результате чего продуцируется кодируемый полипептид(ы). В некоторых случаях тяжелые цепи продуцируются в одной клетке, а легкая цепь в другой.</p>
<p>Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области техники и включают многие бессмертные клеточные линии, доступные из Атспсап Туре СиЬиге Со11есйои (АТСС), Манассас, Вирджиния, включают, но не ограничиваются клетками яичника китайского хомяка (СНО), НЕК 293 клетками, N80 клетками, НеЬа клетками, клетками почки детеныша хомяка (ВНК), клетками почки обезьяны (С08), клетками гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер 02) и рядом других клеточных линий. Клетки, не являющиеся клетками млекопитающих, включают, но не ограничиваются бактерии, дрожжи, насекомых, растения также могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных антител. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела могут быть получены в трансгенных животных, таких как коровы или куры.</p>
<p>Общие способы молекулярной биологии антитела, экспресии, очистки и скрининга описаны, например, в работах АийЬойу Еидшееттд, еййей Ьу Коп1еттапп&ОиЬе1, 8рг1пдег, Не1йе1Ьег§, 2001и 2010 НауЬиг81&Оеог§юи, 2001, Сигг. Ορίη. СЬет. Бю1. 5:683-689; Маупатй&Оеогдюи, 2000, Аппи Ке\'. Вютей. Епд. 2:339-76; и Моткоп 8. (1985) 8аепсе 229:1202.</p>
<p>Использование и показания.</p>
<p>Созданные антитела согласно настоящему изобретению находят применение в различных областях, включая диагностику СГО38-опосредованны.\ заболеваний и их лечение.</p>
<p>СГО38-опосредованные состояния.</p>
<p>В одном из аспектов настоящее изобретение предлагает способы диагностики и лечения состояния, ассоциированного с воспалением и иммунными заболеваниями, в частности заболеваниями, ассоциированными с активированными лимфоцитами. Как показано в настоящем документе, ΟΌ38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, ингибируется в зрелых клетках и повторно экспрессируется на</p>
<p>- 15 029303</p>
<p>высоких уровнях в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия С 038 наблюдается на активированных В-клетках, плазматических клетках, активированных СЭ4' Тклетках, активированных СЭ8' Т-клетках, NК-клетках, NКΤ-клетках, зрелых дендритных клетках (ДК) и активированных моноцитах.</p>
<p>Терапевтические антитела к С.О38 согласно настоящему изобретению связываются с СЭ38положительными клетками, что приводит к истощению этих клеток, таких как активированные лимфоциты, через многочисленные механизмы действия, включая как СОС, так и АОСС пути.</p>
<p>Таким образом, любое аутоиммунное заболевание, демонстрирующее либо повышенную экспрессию СО38, либо повышенное число клеток, экспрессирующих СО38, как компонент заболевания, возможно лечить с использованием антител согласно настоящему изобретению. Эти заболевания включают, но не ограничиваются этим, аллогенное отторжение островкового трансплантата, очаговую алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунное заболевание Аддисона, антинейтрофильные цитоплазматические аутоантитела (АNСА), аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунную гемолитическую анемиею, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный миокардит, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунную крапивницу, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, синдром Кастельмана, целиакию-спру-дерматит, синдр иммунной дисфункции хронической усталости, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Черджа-Стросса, рубцовый пемфигоид, СКЕЛТ синдром, болезнь Холодовых агглютининов, болезнь Крона, дерматомиозит, дискоидную красную волчанку, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, недостаточность фактора УШ, фибромиалгию-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, синдром Гудпасчера, реакцию трансплантат-против-хозяина (РТПХ), тиреоидит Хашимото, гемофилию А, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), 1§А-нейропатию, 1дМполинейропатию, иммунноопосредованную тромбоцитопению, ювенильный артрит, болезнь Кавасаки, плоский лишай, красную волчанку, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа, миастению гравис, вульгарный пемфигус, пернициозную анемию, узелковый полиартрит, полихондрит, полигландулярный синдром, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз печени, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, отторжение трансплантатов паренхиматозных органов, синдром скованного человека, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, язвенный колит, увеит, васкулиты, такие как дерматит, герпетиформный васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.</p>
<p>Конкретное использование в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела нашли в диагностике и/или лечении ряда заболеваний, включая, но не ограничиваясь аутоиммунные заболевания, включающие, но не ограничивающиеся, системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит и реакцию трансплантатпротив-хозяина.</p>
<p>Например, могут быть отобраны пациенты с высоким содержанием плазматических клеток, например, пациенты с СКВ, имеющие высокий уровень плазматических клеток, а также пациенты с РА, которые выявились ареактивны к СО20 лекарственным препаратам.</p>
<p>В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы лечения состояния, ассоциированного с пролиферацией клеток, экспрессирующих СО38, включающие введение пациенту фармацевтически эффективного количества описанного антитела. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения состоянием является рак и в конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения рак является гематологическим раком. В других конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения состоянием является множественная миелома, хронический лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, плазмоклеточный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, Вклеточная лимфома или лимфома Беркитта.</p>
<p>Как известно в данной области техники, некоторые состояния ассоциированы с клетками, экспрессирующими СО38, и некоторые состояния ассоциированы с гиперэкспрессией, экспрессией высокой плотности или активированной экспрессией СО38 на поверхности клеток. Экспрессирует ли популяция клеток СО38 или нет, возможно определить способами, известными в данной области техники, например, определение методом проточной цитометрии процента клеток в данной популяции, меченных антителом, специфически связывающимся с СО38 или иммуногистохимическими анализами, которые в общем описаны ниже для диагностического использования. Например, популяцию клеток, в которой экспрессия СО38 обнаруживается в 10-30% клеток, возможно рассматривать как имеющую слабую СО38 позитивность, а популяцию клеток, в которой экспрессия СО38 обнаруживается в более чем примерно 30% клеток, возможно рассматривать как определенную СО38 положительную (например, в работе 1аск5оп е1 а1. (1988), С1ш. Ехр. 1ттипо1. 72: 351-356), хотя могут быть использованы другие критерии для определения того, экспрессирует ли популяция клеток СО38. Плотность экспрессии на поверхностях клеток может быть определена с использованием способов, известных в данной области техники, таких</p>
<p>- 16 029303</p>
<p>как, например, измерение проточной цитометрией средней интенсивности флуоресценции клеток, которые были флуоресцентно мечены с использованием антител, специфически связывающихся с СЭ38.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения композиции и способы согласно настоящему изобретению используются при раке, таком как "гематологический рак", термин, относящийся к злокачественным новообразованиям кроветворных тканей и включающий в себя лейкоз, лимфому и множественную миелому. Неограничивающие примеры состояний, ассоциированных с экспрессией СЭ38. включают, но не ограничиваются множественной миеломой Цасккоп е! а1. (1988), СЬп. Ехр. 1ттипо1. 72: 351-356), В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) Όϋή§ е! а1. (2002), Бенкепна 16: 30-5; МогаЬЬо е! а1. (2001), Ьеикетга КекеагсЬ 25: 927-32; Магтоу е! а1. (1993), №ор1акта 40(6): 355-8; и 1еЬпек е! а1. (2001), Вг. 1. Наета!о1. 115: 854-61), острым лимфобластным лейкозом (КеуЬаш е! а1. (1999), Ьеикетга КекеагсЬ 24: 153-9; и Магтоу е! а1. (1993), №ор1акта 40(6): 355-8), хроническим миелоидным лейкозом (Магтоу е! а1. (1993), №ор1акта 40(6): 355-8), острым миелоидным лейкозом (КеуЬаш е! а1. (1999), Ьеикетга КекеагсЬ 24: 153-9), хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), хроническим миелобластным лейкозом или хроническим миелолейкозом (ХМЛ), острым миелобластным лейкозом или острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), волосатоклеточным лейкозом (НСЬ), миелодиспластическими синдромами (МДС) или хроническим миелолейкозом (ХМЛ-БП) в бластном и всех подтипах этих лейкозов, которые определяются морфологическими, гистохимическими и иммунологическими методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники.</p>
<p>"Неоплазия" или "неопластическое состояние" относится к состоянию, ассоциированному с пролиферацией клеток, характеризующемуся потерей нормальных контролей, что приводит к одному или более симптомам, в том числе, нерегулируемому росту, отсутствию дифференциации, локальной тканевой инвазии и метастазам.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения гематологический рак выбран из группы хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), хронического миелолейкоза (ХМЛ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) и острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ).</p>
<p>Кроме того, в данной области техники известно, что экспрессия СЭ38 является прогностическим показателем для пациентов с состояниями, такими как, например, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (Όϋή§ е! а1. (2002), Ьеикетга 16: 30-5; и МогаЬЬо е! а1. (2001), Ьеикетга КекеагсЬ 25: 92732) и острый миелобластный лейкоз (КеуЬаш е! а1. (1999), Ьеикетга КекеагсЬ 24: 153-9).</p>
<p>ХЛЛ является наиболее распространенным лейкозом среди взрослого населения в западном мире. ХЛЛ вовлекает клональную экспансию псевдозрелых лимфоцитов с вовлечением лимфатических узлов и других лимфоидных тканей с прогрессирующей инфильтрацией костного мозга и присутствием в периферической крови. В-клеточная форма (В-ХЛЛ) присутствует практически во всех случаях.</p>
<p>В-ХЛЛ.</p>
<p>В-ХЛЛ является неизлечимым заболеванием, характеризующимся постепенным увеличением энергичных моноклональных клеток В-линии, накапливающихся в костном мозге и периферической крови продолжительным образом на протяжении многих лет. Экспрессия СЭ38 рассматривается как независимый неблагоприятный прогностический фактор для В-ХЛЛ. НатЬЬп е! а1., В1ооЬ 99:1023-9 (2002).</p>
<p>Современная стандартная терапия В-ХЛЛ носит паллиативный характер и в основном осуществляется цитостатическими препаратами хлорамбуцилом или флударабином. При возникновении рецидивов часто проводится сочетанная терапия с использованием флударабина, циклофосфамида в комбинации с ритуксимабом (моноклональное антитело к СЭ20) или кэмпасом (моноклональное антитело к СЭ52). Таким образом, существует критическая неудовлетворенная медицинская потребность в лечении В-ХЛЛ. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения предлагаются способы лечения В-ХЛЛ с применением описанных антител к СЭ38 (и, как проведено ниже, это может быть реализовано при помощи комбинации лекарственных препаратов, включающих необязательно и независимо любое из вышеуказанных лекарственных средств).</p>
<p>В-ХЛЛ характеризуется двумя подтипами, хроническим и агрессивным. Эти клинические фенотипы коррелируют с наличием или отсутствием соматических мутаций в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (1дУН). В контексте настоящего описания хронический В-ХЛЛ относится к нарушению у субъекта, имеющего мутировавший ген 1§УН и/или репрезентирующего один или более клинических фенотипов, связанных с хроническим В-ХЛЛ. В контексте настоящего описания словосочетание агрессивный В-ХЛЛ относится к нарушению у субъекта, имеющего немутировавший 1§УН и/или репрезентирующего один или более клинических фенотипов, ассоциированных с агрессивным В-ХЛЛ.</p>
<p>Множественная миелома.</p>
<p>Множественная миелома является злокачественным нарушением клеток В-линии, характеризующимся опухолевой пролиферацией плазматических клеток в костном мозге. Современные схемы лечения демонстрируют умеренные частоты ответа. Однако наблюдаются лишь незначительные изменения в общей выживаемости, и средняя выживаемость составляет около 3 лет. Таким образом, существует критическая неудовлетворенная медицинская потребность в лечении множественной миеломы. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения предлагаются способы лечения множественной миеломы, используя антитела, раскрытые в настоящем изобретении.</p>
<p>- 17 029303</p>
<p>СО38 экспрессируется на высоком уровне на плазматических клетках, которые являются терминально дифференцированными В-клетками.</p>
<p>Пролиферация миеломных клеток вызывает различные эффекты, в том числе литические поражения (дыры) в кости, сниженное количество эритроцитов, продуцирование аномальных белков (с сопутствующим повреждением почек, нервов и других органов), сниженную функцию иммунной системы и повышенные уровни кальция в крови (гиперкальциемия).</p>
<p>Современные варианты лечения включают химиотерапию, предпочтительно ассоциированную, когда это возможно, с аутологичной трансплантацией стволовых клеток (АТСК).</p>
<p>Моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии и вялотекущая множественная миелома.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения предлагаются способы лечения моноклональной гаммапатии с использованием описанных антител. В других вариантах воплощения настоящего изобретения предлагаются способы лечения вялотекущей множественной миеломы с использованием описанных антител.</p>
<p>Моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МГНЭ) и вялотекущая множественная миелома (ЗММ) являются бессимптомными, предраковыми нарушениями, характеризующимися пролиферацией моноклональных плазматических клеток в костном мозге и отсутствием поражения органовмишеней.</p>
<p>Вялотекущая множественная миелома (ЗММ) является бессимптомным нарушением пролиферации плазматических клеток с высоким риском прогрессирования в симптоматическую или активную множественную миелому (Ν. Еи§1. 1. Мей. 356(25): 2582-2590 (2007)).</p>
<p>Международные единые критерии, определяющие ЗММ, были приняты в 2003 году и предусматривают уровень М-белка у пациента >30 г/л и/или клональных плазматических клеток костного мозга >10% (Вг. 1. Наета1о1. 121. 749-57 (2003)). У пациента не должны наблюдаться органная или тканевая недостаточность, включая костные поражения или симптомы (Вг. 1. Наета1о1. 121: 749-57 (2003)).</p>
<p>Последние исследования выявили два подкласса ЗММ: ί) пациенты с прогрессирующим заболеванием и ίί) пациенты с непрогрессирующим заболеванием (Вг. 1. Наета1о1. 121: 631-636 (2003)). Международные единые критерии, определяющие МГНЭ, предусматривают уровень М-белка у пациента >30 г/л, плазматических клеток костного мозга <10% и отсутствие органной или тканевой недостаточности, включая костные поражения или симптомы (Вг. 1. Наета1о1. 121: 749-57 (2003)).</p>
<p>ЗММ напоминает моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (МГНЭ) при отсутствии поражения органов-мишеней (Ν. Еи§1 ί. Мей. 356 (25): 2582-2590 (2007)). Клинически, однако, ЗММ намного более вероятно прогрессирует в активную множественную миелому или амилоидоз через 20 лет (78% вероятности для ЗММ против 21% для МГНЭ) (Ν. Еи§1. 1. Мей. 356 (25): 2582-2590 (2007)).</p>
<p>Композиции антител для введения ίη утуо.</p>
<p>Лекарственные формы антител, используемые в соответствии с настоящим изобретением, изготавливают для хранения путем смешиванием антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Кетшд1оп'к РНагтасен11са1 Зиепсек 16ΐ1ι ейШоп, Око1, А. Ей. [1980]) в виде лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (приблизительно менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζη-белок) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Т\УЕЕ№<sup>Л1</sup>, РЬИКОМСЗ™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).</p>
<p>Лекарственная форма, описанная в настоящем документе, может также содержать более чем одно активное соединение, что является необходимым для конкретного показания, нуждающегося в лечении, предпочтительно с комплементарными активностями, которые не оказывают отрицательного воздействия друг друга. Например, желательным может быть предложить антитела с другими свойствами. Альтернативно или дополнительно, композиция может содержать цитотоксическое средство, цитокин, ингибирующее рост средство и/или низкомолекулярный антагонист. Соответственно такие молекулы присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предназначенной цели.</p>
<p>Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, методиками коацервации или путем межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микро- 18 029303</p>
<p>эмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в КепипдЮп'з РЬагтасеи!юа1 δ^ι^5 161Н ейШоп, Озо1, А. Ей. (1980).</p>
<p>Лекарственные формы, используемые для введения ш У1уо, должны быть стерильными или практически стерильными. Это легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.</p>
<p>Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, чьи матрицы находятся в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент υ.δ. № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма. этил-Ь-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как ЬиРКОХ ΌΕРОТ™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как такие полимеры, как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота способны высвобождать молекулы в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.</p>
<p>Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если механизм агрегации обусловлен межмолекулярным образованием δ-δ-связи через тиодисульфидный обмен, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, регулированием содержания влаги, использованием соответствующих добавок и разработкой специфических полимерных матричных композиций.</p>
<p>Способы введения.</p>
<p>Антитела и химиотерапевтические агенты согласно настоящему изобретению вводят субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течении времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным путями. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введения антитела.</p>
<p>Способы лечения.</p>
<p>В способах согласно настоящему изобретению терапия используется для обеспечения положительного терапевтического ответа в отношении заболевания или состояния. Под "положительным терапевтическим ответом" подразумевается улучшение заболевания или состояния и/или улучшение симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием. Например, положительный терапевтический ответ будет относиться к одному или более из следующих улучшений заболевания: (1) снижение количества опухолевых клеток, (2) увеличение смерти опухолевых клеток, (3) ингибирование выживаемости опухолевых клеток, (5) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно прекращение) роста опухоли; (6) увеличенная частота выживаемости пациентов и (7) некоторое облегчение одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием.</p>
<p>Положительные терапевтические ответы при любом заболевания или состоянии могут быть определены путем стандартизованных критериев ответа, специфических для данного заболевания или состояния. Опухолевый ответ может быть оценен изменениями в морфологии опухоли (т.е. общая опухолевая масса, размер опухоли и тому подобное) с использованием скрининговых методик, таких как магнитно-резонансная томография (МРГ), рентгеновская рентгенография, компьютерная томография (КГ), визуализация остеосцинтиграфии, эндоскопия и биопсия образца опухоли, включая аспирацию костного мозга (ВМА) и подсчет опухолевых клеток в кровотоке.</p>
<p>В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам субъект, получающий терапию, может наблюдать положительный эффект улучшения симптомов, ассоциированных с заболеванием.</p>
<p>Гаким образом, при В-клеточных опухолях субъект может испытывать снижение так называемых В-симптомов, т.е. ночной потливости, лихорадки, потери веса и/или крапивницы. Для предраковых состояний терапия лекарственным средством с антителом к СП38 может блокировать и/или пролонгировать время развития злокачественного состояния, например развитие множественной миеломы у субъектов, страдающих моноклональной гаммапатией неустановленной этиологии (МГНЭ).</p>
<p>Улучшение заболевания возможно охарактеризовать как полный ответ. Под "полным ответом" подразумевается отсутствие клинически обнаруживаемого заболевания с нормализацией любых ранее анормальных рентгенографических исследований, костного мозга и спинномозговой жидкости (СМЖ) или анормального моноклонального белка в случае миеломы.</p>
<p>Гакой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере от 4 до 8 недель, а иногда от 6 до 8 недель после лечения в соответствии со способами настоящего изобретения. Кроме того, улучшение заболевания может быть классифицировано как частичный ответ. Под "частичным ответом" подразумевается, по меньшей мере, примерно 50%-ное снижение всей измеримой опухолевой массы (т.е. количества злокачественных клеток, присутствующих у субъекта, или измеренной суммарной массы опухоли или</p>
<p>- 19 029303</p>
<p>количества аномального моноклонального белка) при отсутствии новых повреждений, которые могут сохраняться в течение от 4 до 8 недель, или от 6 до 8 недель.</p>
<p>Лечение в соответствии с настоящим изобретением включает "терапевтически эффективное количество" используемых лекарственных средств. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата.</p>
<p>Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума и способности лекарственных средств вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество является также таким, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами.</p>
<p>"Терапевтически эффективное количество" для лечения опухоли возможно также измерить его способностью стабилизировать прогрессирование болезни. Способность соединения ингибировать рак может быть оценена в системе животной модели, прогностичной для эффективности при опухолях человека.</p>
<p>Альтернативно, данное свойство композиции может быть оценено путем исследования способности соединения ингибировать рост клеток или индуцировать апоптоз в анализах ш уПго, известных специалисту в данной области техники. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом устранять симптомы у субъекта. Специалист в данной области техники сможет определить эти количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов субъекта и конкретная композиция или избранный путь введения.</p>
<p>Схемы приема лекарственных средств корректируются для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введен один болюс, несколько раздельных доз могут быть введены в течение периода времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что диктуется потребностями терапевтической ситуации. Парентеральные композиции могут быть изготовлены в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма в контексте настоящего описания относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению, и каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.</p>
<p>Особенности лекарственных форм согласно настоящему изобретению продиктованы и непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который необходимо достичь, и (б) ограничений, присущих в области приготовления такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.</p>
<p>Эффективные дозы и схемы приема антител к СЭ38, используемые в настоящем изобретении, зависят от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистами в данной области техники.</p>
<p>Неограничивающий пример диапазона терапевтически эффективного количества антитела к СЭ38, используемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 0,1-100 мг/кг, например приблизительно 0,1-50 мг/кг, например приблизительно 0,1-20 мг/кг, например приблизительно 0,1-10 мг/кг, например приблизительно 0,5, приблизительно 0,3, приблизительно 1 или 3 мг/кг. В другом варианте воплощения настоящего изобретения антитело вводят в дозе 1 мг/кг или более, например в дозе от 1 до 20 мг/кг, например доза от 5 до 20 мг/кг, например доза 8 мг/кг.</p>
<p>Средний медицинский специалист в данной области техники может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз лекарственного средства, используемых в фармацевтической композиции в количестве меньшем, чем это требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желаемого эффекта.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят путем инфузии в еженедельной дозе от 10 до 500 мг/кг, например от 200 до 400 мг/кг. Такое введение может быть повторено, например, от 1 до 8 раз, например от 3 до 5 раз. Введение может быть осуществлено путем непрерывной инфузии в течение от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят медленной непрерывной инфузией в течение длительного времени, например более 24 ч, если это необходимо для уменьшения побочных эффектов, включая токсичность.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят в еженедельной дозе от 250 до 2000 мг, например, 300, 500, 700, 1000, 1500 или 2000 мг до 8 раз, например от 4 до 6 раз. Введение может быть осуществлено путем непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч. Такая схема может быть повторена один или более раз по мере необходимости, например, после 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировка может быть определена или скорректирована путем измерения количества соединения согласно настоящему изобретению в крови после введения, например путем отбора биологического образца и использованием антиидиотипических антител, которые</p>
<p>- 20 029303</p>
<p>воздействуют на область связывания антигена антителом к СЭ38.</p>
<p>В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят один раз в неделю в течение от 2 до 12 недель, например от 3 до 10 недель, например от 4 до 8 недель.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят в виде поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение 6 месяцев или более.</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело к СЭ38 вводят согласно схеме, включающей одну инфузию антитела к СЭ38 антитела с последующим введением антитела к СЭ38, конъюгированным с радиоактивным изотопом. Схема может быть повторена, например, через 7-9 дней.</p>
<p>В качестве неограничивающих примеров лечение в соответствии с настоящим изобретением может проводиться в виде суточной дозы антитела в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг, например 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 45; 50; 60; 70; 80; 90 или 100 мг/кг в день, по меньшей мере, на один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или альтернативно по меньшей мере на одной из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения, или любой их комбинации, используя одну или разделенные дозы каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч или любую их комбинацию.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения молекула антитела к СЭ38 согласно настоящему изобретению используется в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например химиотерапевтическим средством. Неограничивающие примеры ДНК-повреждающих химиотерапевтических средств включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан, камптотецин и аналоги или их метаболиты и доксорубицин), ингибиторы топоизомеразы ΙΙ (например, этопозид, тенипозид и даунорубицин), алкилирующие агенты (например, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, ифосфамид, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, декарбазин, метотрексат, митомицин С и циклофосфамид); интеркаляторы ДНК (например, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин); интеркаляторы ДНК и генераторы свободных радикалов, такие как блеомицин и миметики нуклеозидов (например, 5-фторурацил, капецитабин, гемцитабин, флударабин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и гидроксимочевина).</p>
<p>Химиотерапевтические средства, которые нарушают репликацию клеток, включают паклитаксел, доцетаксел и аналоги; винкристин, винбластин и аналоги; талидомид, леналидомид и родственные аналоги (например, СС-5013 и СС-4047); ингибиторы протеинтирозинкиназы (например, иматиниб мезилат и гефитиниб), ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), NР-κВ-ингибиторы, включая ингибиторы ΙκΒ-киназы; антитела, связывающиеся с белками, сверхэкспрессируемыми при раке и тем самым подавляющие репликацию клеток (например, трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб и бевацизумаб), а также другие ингибиторы белков или ферментов, которые активируются, сверхэкспрессируются или активированы при раке, ингибирование которых подавляет репликацию клеток.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению могут быть использованы до, одновременно с или после лечения Уе1сабе® (бортезомиб).</p>
<p>Использование в диагностических целях.</p>
<p>Предлагаемые антитела к СИ38 также находят применение ш уйго или ш νί\Ό визуализации опухолей или аутоиммунных заболеваний, ассоциированных с СИ38. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антитела, описанные в настоящем документе, используются как для диагностики и для лечения, или только для диагностики. Когда антитела к СИ38 используются как для диагностики, так и для лечения, некоторые варианты воплощения настоящего изобретения основываются на двух различных антителах к СИ38 с двумя различными эпитопами, таким образом, что диагностическое антитело не конкурирует за связывание с терапевтическим антителом, хотя в некоторых случаях одно антитело может быть использовано для обеих целей. Например, в некоторых случаях, АЬ19 антитело используется диагностически (как правило, меченное, как рассматривается ниже), а АЬ79 используется терапевтически или наоборот. Таким образом, включенными в изобретение являются композиции, содержащие диагностическое антитело и терапевтическое антитело, а в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения диагностическое антитело мечено, как описано в настоящем документе. В дополнение к этому композиция терапевтических и диагностических антител также может быть совместно введена с другими лекарственными средствами, приведенными в настоящем документе.</p>
<p>Во многих вариантах воплощения настоящего изобретения диагностическое антитело мечено. Под "меченым" в настоящем документе подразумевается то, что антитела, описанные в настоящем документе, имеют один или более элементов, изотопов или химических соединений, присоединенных для возможности выявления во время скрининга или диагностической процедуры. Как правило, метки делятся на несколько классов: а) иммунные метки, которые могут быть эпитопом, включенным как сливающиеся клетки, которые распознаются антителом, б) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами, в) низкомолекулярные метки, которые могут включать люминесцентные и колориметрические красители, или молекулы, такие как биотин, который дает возможность осуществлять другие способы мечения, и г) метки, такие как частицы (включая пузырьки для ультразвукового мече- 21 029303</p>
<p>ния) или парамагнитные метки, которые позволяют визуализацию тела. Метки могут быть введены в антитело в любом положении и могут быть введены ίη νίίτο или ίη νίνο во время экспрессии белка, как известно в данной области техники.</p>
<p>Диагноз может быть поставлен либо ίη νίνο, путем введения диагностического антитела, которое позволяет визуализацию всего тела, как описано ниже, либо ίη νίίτο на образцах, отобранных у пациента. "Образец" в контексте настоящего описания включает любое количество материалов, включая, но не ограничиваясь этим, жидкости тела (включая, но не ограничиваясь, кровь, мочу, сыворотку, лимфу, слюну, анальные и вагинальные выделения, пот и сперму), а также образцы тканей, полученные биопсией соответствующих тканей.</p>
<p>В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения проводится ίη νίνο визуализация, включая, но не ограничиваясь, ультразвуком, КТ-сканированием, рентгеновским исследованием, МРТ- и ПЭТ-сканированием, а также оптическими методиками, например, с использованием оптических меток для опухолей у поверхности тела.</p>
<p>Ιη νίνο визуализация заболеваний, ассоциированных с СЭ38, может быть проведена любым подходящим способом. Например, для мечения антител к СЭ38 может быть использовано <sup>99</sup>Тс-мечение или мечение с другим β-излучающим изотопом. Варианты данной методики могут включать использование магнитно-резонансной томографии (МРТ) для улучшения визуализации на основе методики гаммакамеры. Подобные способы и принципы иммуносцинтиграфии описаны, например, в работах 8пуа51ауа (еб.), Кабю1аЬе1еб ΜοηοΟοηαΙ Ληΐίόο6ίθ5 Рог Юадшд Ап6 Тйегару (Р1ешт Ргевв 1988), СЬаве, "Меб1са1 АррШа^^ ο£ Κаб^ο^δοίοреδ," в Кетт^^'в РЬагтасеи11са1 8^ι^5, 18ΐΗ Е6Ьюп, Сегтаго еί а1., (ебв.), рр. 624-652 (Маск РиЬЬвЬтд Οο., 1990), и Вгсчуп, "СЬтса1 Иве ο£ Мοηοс1οηа1 Аηί^Ьοб^е8," в Βίο^1ιηο1ο8\· Ап6 РЬагтасу 227-49, Ре/ζιιΙο еί а1., (ебв.) (СЬартаи&Ηа11 1993).</p>
<p>В одном варианте воплощения настоящее изобретение предлагает способ ίη νίνο визуализации, в котором антитело к СЭ38 конъюгируют с агентом, промотирующим детектирование, конъюгированное антитело вводится хозяину, например, путем инъекции в кровоток и анализируется присутствие и локализация меченого антитела в хозяине. При помощи данного метода и любого другого диагностического способа, предложенного в настоящем документе, настоящее изобретение предлагает способ скрининга присутствия клеток, связанных с заболеванием, у пациента-человека или биологического образца, взятого у пациента-человека.</p>
<p>Для диагностической визуализации радиоизотопы могут быть связаны с антителом к СЭ38, либо непосредственно, либо опосредованно при помощи промежуточной функциональной группы. Полезные промежуточные функциональные группы включают хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота и диэтилентриаминпентауксусная кислота (см., например, патент и.8. № 5057313). В таких диагностических тестах с участием антител к ί.Ό38, коньюгированных с радиоизотопом, доза конъюгированного антитела к СО38, доставленная пациенту, как правило, поддерживается на более возможном низком уровне за счет выбора изотопа с лучшим сочетанием минимального периода полураспада, минимальной задержки в организме и минимального количества изотопа, которое позволит обнаружение и точное измерение.</p>
<p>В дополнение к радиоизотопам и рентгеноконтрастным веществам диагностические способы могут быть выполнены с использованием антител к СЭ38, конъюгированных с красителями (например, с комплексом биотин-стрептавидин), контрастными средствами, флуоресцентными соединениями или молекулами и усиливающими агентами (например, парамагнитные ионы) для магнитно-резонансной томографии (МРТ) (см., например, патент и.8. № 6331175, в котором описаны методики МРТ и подготовка антител, конъюгированных с МРТ-усиливающим агентом). Такие диагностические/детектирующие средства могут быть выбраны из средств для использования в магнитно-резонансной томографии и флуоресцентных соединений.</p>
<p>Для введения в антитело к СЭ38 радиоактивных металлов или парамагнитных ионов необходимой может быть его реакция с реагентом, имеющим длинный хвост, к которому прикреплены множество хелатирующих групп для связывания ионов. Таким хвостом может быть полимер, такой как полилизин, полисахарид или другие производные или цепь, способная к дериватизации, имеющая боковые группы, к которым могут быть присоединены хелатирующие группы, такие как, например, порфирины, полиамины, краун-эфиры, бистиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы, полезные для данной цели.</p>
<p>Хелаты могут быть соединены с антителами к СЭ38 с использованием стандартных химических способов. Хелат, как правило, связывается с антителом к СЭ38 группой, позволяющей образование связи с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренним перекрестным сшиванием.</p>
<p>Примеры потенциально полезных металл-хелатных комбинаций включают 2-бензил-ДТПА и ее монометиловый и циклогексиловый аналоги, используемые с диагностическими изотопами в общем энергетическом диапазоне от 60 до 4000 кэВ, например, <sup>125</sup>Ι, <sup>123</sup>Ι, <sup>124</sup>Ι, <sup>62</sup>Си, <sup>64</sup>Си, <sup>18</sup>Р, '"Ιη, <sup>67</sup>Са, <sup>99</sup>Тс, <sup>94</sup>Тс, <sup>П</sup>С, Ά <sup>15</sup>0 и <sup>76</sup>Вг для радиовизуализации.</p>
<p>Метки включают радионуклид, радиологическое контрастное вещество, парамагнитный ион, металл, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, ультразвуковое контрастное вещество и све- 22 029303</p>
<p>точувствительное вещество. Такие диагностические вещества хорошо известны и любые такие известные диагностические средства могут быть использованы. Неограничивающие примеры диагностических средств включают радионуклиды, такие как <sup>110</sup>Ιη, '"Ιη, <sup>177</sup>Ьи, <sup>18</sup>Р, <sup>52</sup>Ре, <sup>62</sup>Си, <sup>64</sup>Си, <sup>67</sup>Си, <sup>67</sup>0а, <sup>68</sup>0а, <sup>86</sup>Υ, <sup>90</sup>Υ, <sup>89</sup>Ζγ, <sup>94</sup>тТс, <sup>94</sup>Тс, <sup>99</sup>тТс, <sup>120</sup>Ι, <sup>123</sup>Ι, <sup>124</sup>Ι, <sup>125</sup>Ι, <sup>131</sup>Ι, <sup>154-158</sup>0б, <sup>32</sup>Р, <sup>П</sup>С, <sup>13</sup>Ν, <sup>15</sup>О, <sup>186</sup>Ке, <sup>188</sup>Ке, <sup>51</sup>Мп, <sup>52</sup>тМп, <sup>55</sup>Со,</p>
<p>Аб, Вг, <sup>6</sup>Вг, тКЬ, 8г или другие γ-, β- или позитрон-излучатели.</p>
<p>Используемые парамагнитные ионы могут включать хром(Ш), марганец(П), железо(Ш), железо(П), кобальт(П), никель(П), медь(П), неодим(Ш), самарий(Ш), иттербий(Ш), гадолиний(Ш), ванадий(П), тербий(Ш), диспрозий(Ш), гольмий(Ш) или эрбий(Ш). Металлконтрастные средства могут включать лантан(Ш), золото(Ш), свинец(П) или висмут(Ш).</p>
<p>Ультразвуковые контрастные вещества могут содержать липосомы, такие как липосомы, заполненные газом.</p>
<p>Рентгеноконтрастные диагностические вещества могут быть избраны из соединений, соединений бария, соединений галлия и соединений таллия.</p>
<p>Эти и подобные хелаты при образовании комплекса с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, могут быть использованы для диагностических способов при помощи МРТ в связи с антителами к СЭ38. Макроциклические хелаты, такие как NОΤА, ЭОТА и ТЕТА, пригодны для использования с различными металлами и радиоактивными металлами, в частности с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие металл-хелатные комплексы могут быть созданы весьма стабильными путем адаптации размера кольца с металлом, представляющим интерес. Другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические полиэфиры, представляющие интерес для стабильного связывания радионуклидов, таких как <sup>223</sup>Ка, также могут быть пригодными в диагностических способах.</p>
<p>Таким образом, настоящее изобретение предлагает диагностические коньюгаты антитела к СЭ38, в котором коньюгат антитела к СЭ38 конъюгирован с контрастным веществом (например, для магнитнорезонансной томографии, компьютерной томографии или с усиливающим ультразвук контрастным веществом) или радионуклидом, который может быть, например, γ-, β-, α-, Оже-электрон- или позитронизлучающим изотопом.</p>
<p>Антитела к СЭ38 также могут быть полезны, например, в обнаружении экспрессии антигена, представляющего интерес, в специфических клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических целей антитело обычно мечется детектируемым остатком молекулы для анализов ίη уйго. Как будет понятно специалистам в данной области техники, существует множество подходящих меток для использования в тестировании ίη уйго. Подходящие красители для использования в данном аспекте настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, флуоресцентные лантанидные комплексы, в том числе европия и тербия, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метил-кумарин, квантовые точки (также называемые "нанокристаллы", см. и.8. сер. № 09/315584, включенная в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки), пирен, малахитовый зеленый, стильбен, люцифер желтый, Саксабе В1ие. ТМ., техасский красный, цианиновые красители (Су3, Су5 и т.д.), красители А1еха (включая А1еха, фикоэритрин, ВО^IРΥ и другие, описанные в 6!" ЕбНюи оГ !"е Мо1еси1аг РгоЬек НаибЬоок Ьу КюЬатб Р. Наидкшб, работа включена в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки).</p>
<p>Окрашенные ткани могут быть оценены измерением радиоактивности в качестве показателя количества СО38-пептидов, ассоциированных с опухолью. Изображения, полученные с использованием таких методик, могут быть использованы для оценки биораспределения СЭ38 у пациента, млекопитающего или ткани, например, в контексте использования СЭ38 в качестве биомаркера присутствия инвазивных раковых клеток.</p>
<p>Изделия.</p>
<p>В других вариантах воплощения настоящего изобретения предлагается изделие, содержащее материалы, используемые для лечения нарушений, описанных выше. Изделие содержит контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Активным агентом композиции является антитело. Этикетка на или связанная с контейнером, указывает, что композиция используется для лечения избранного состояния. Изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие вещества, предпочтительные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по применению.</p>
<p>Примеры</p>
<p>Следующие примеры приводятся для иллюстрации, но не ограничивают настоящее изобретение.</p>
<p>- 23 029303</p>
<p>Пример 1. Создание экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотиды, кодирующие СБ38 человека, яванского макака и мыши.</p>
<p>Для создания вектора, экспрессирующего СБ38 человека (йиСБ38) из кДНК, полученной от Олдеме ТесЬио1од1е5 Тгиес1оие® человека, был выделен полинуклеотид, кодирующий 1шС'Б38. Выделенный 1шСБ38 был клонирован в стабильный экспрессионный вектор (ХОМА, 1ис.), содержащий ген устойчивости к неомицину (иео<sup>К</sup>), который позволил отобрать 0418 (генетицин)-устойчивые трансфектанты. НиСБ38 ген, присутствующий в отобранных трансфектантах, секвенировали для идентификации любых ошибок последовательности. Ошибки в последовательности, отклонявшиеся от идентификационного номера по ОеиВаик, ΝΜ_001775, были исправлены при помощи сайт-направленного мутагенеза с использованием ПЦР. Конечная векторная ДНК была подтверждена 5'-секвенированием.</p>
<p>Для создания вектора, экспрессирующего СБ38 яванского макака (суСБ38) из ДНК, полученной из кДНК здоровой ткани селезенки яванского макака, полученной из Вюсйаш ЪШйШе, был выделен полинуклеотид, кодирующий суСБ38.</p>
<p>Выделенный суСБ38 был клонирован в стабильный экспрессионный вектор (ХОМА, 1ис.), содержащий ген иео<sup>К</sup>, который позволил отобрать 0418 (генетицин)-устойчивые трансфектанты. суСБ38 ген, присутствующий в отобранных трансфектантах, секвенировали для идентификации любых ошибок последовательности. Ошибки в последовательности, отклонявшиеся от идентификационного номера по ОеиВаик, ΑΥ555148, были исправлены при помощи направленного мутагенеза с использованием ПЦР. Конечная векторная ДНК была подтверждена секвенированием.</p>
<p>Для создания вектора, экспрессирующего СБ38 мыши (тоСБ38) из ДНК, полученной из Опдеие'к ТгиеОКР сойесйои, был выделен полинуклеотид, кодирующий тоСБ38. Выделенный тоСБ38 был клонирован в стабильный экспрессионный вектор (ХОМА, 1ис), содержащий ген иео<sup>К</sup>, который позволил отобрать 0418 (генетицин)-устойчивые трансфектанты. тоСБ38 ген, присутствующий в отобранных трансфектантах, секвенировали для идентификации любых ошибок последовательности. Ошибки в последовательности, отклонявшиеся от идентификационного номера по ОеиВаик, ΝΜ_007646, были исправлены при помощи направленного мутагенеза с использованием ПЦР. Конечная векторная ДНК была подтверждена секвенированием.</p>
<p>Пример 2. Создание СБ38-экспрессирующих клеток яичника китайского хомяка (СНО).</p>
<p>Для создания СНО клеток, экспрессирующих йиСБ38, тиСБ38 и суСБ38, СНО клетки трансфицировали линеаризованной ДНК. После селекции в течение одной недели клетки сортировали при помощи проточной цитометрии и клетки, экспрессирующие наибольшее количество йиСБ38, тиСБ38 или суСБ38 (наивысшее значение 15%), вносили в 96-луночные планшеты для получения отдельных колоний. Остальные клетки также высевались при селекции для формирования резервных колоний. Приблизительно через 12-14 дней после посева были идентифицированы отдельные колонии и перенесены в 96луночные планшеты с глубокими лунками. После второго пассажа проводили скининг клонов при помощи РАС8 анализа. Клоны с наибольшим уровнем продуцирования пересевались и выращивались во встряхиваемых колбах. Наилучшие 2 клона были заморожены и/или культивировались для микоплазменного АУА тестирования и для увеличения размера.</p>
<p>Для создания репортера люциферазы для моделей диссеминированного ксенотрансплантата коммерческий вектор, содержащий промотор СМУ/ген люциферазы/неомицин селектируемый маркер (Рготеда, МаШкои, VI), использовали для получения стабильной трансфицированной линии в БанШ клетках лимфомы Беркитта.</p>
<p>Пример 3. Библиотеки фагового дисплея и скрининг агентов, связывающих СБ38.</p>
<p>Выбор специфических антител-мишеней из библиотеки фагового дисплея был проведен в соответствии со способами, описанными в работе Магкк е! а1. (2004, МеШойк Мо1. Вю1. 248:161-76). Вкратце, библиотеку фагового дисплея инкубировали с 100 пмоль биотинилированного СБ38 при комнатной температуре в течение 1 ч, и полученный комплекс был поглощен 100 мкл суспензией гранул стрептавидина (^ΥNΑВЕΑ^δ® М-280 81гер1ау1Й1и, Шуйгодеи). Неспецифические фаги были удалены промывкой гранул промывочным буфером (5% молока в РВ8). Связанные фаги элюировали 0,5 мл 100 нМ триэтиламина (ТЕА) и немедленно нейтрализовали добавлением равного объема 1М ТК18-С1, рН 7,4. Элюированный пул фагов был использован для инфицирования ТО1 клеток Е.сой, растущих в логарифмической фазе и фагимид был высвобожден, как описано в Магкк е! а1., И. Отбор был повторен в общей сложности в три цикла.</p>
<p>Альтернативно, библиотеки фагового дисплея были отсортированы по отношению к иммобилизованному СБ38 (К&Б 8ук1етк) для определения панели фрагментов антител, способных связывать СБ38. Сортировка проводилась с использованием стандартных протоколов (см., например, МеШойк ш Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 178: АийЪойу Рйаде Б1кр1ау: МеШойк аий РгоЮсой Еййей Ъу: Р.М. О'Впеи аий К. Айкеи, Нитаиа Ргекк; "Раиитд о£ АийЪойу РЪаде-Б1кр1ау иЬгапек," СоотЪег, β.ν.Ι, рр. 133-145, и "Зексйои о£ АийЪоШек Адате! Вю1ту1а1ей АиБдеик," СЪатек е! а1., рр. 147-157). Вкратце, три лунки планшета Νϋ^® Мах18огр покрывали 50 мкл рекомбинантного СБ38 (К&Б 8ук1етк) в концентрации 10 мкг/мл в РВ8. После инкубации в течение ночи при 4°С, свободные сайты связывания были блокированы 5% мо- 24 029303</p>
<p>локом в РВ8 в течение одного часа при комнатной температуре. Приблизительно 200 мкл фаговой библиотеки в 5% молоке/РВ8 затем было добавлено в блокированные лунки и инкубировано при комнатной температуре в течение примерно одного-двух часов. Лунки промывали и связанный фаг элюировали с использованием стандартных способов (см., например, 8атЬгоок апД Кикке11, Мо1еси1е С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 3<sup>гД</sup> ЕДЬюп, Со1Д 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 2001). Элюированный фаг был амплифицирован путем заражения ТО1 клеток-хозяев Е.соП в логарифмической фазе роста. Инфицированные ТО1 клетки были восстановлены центрифугированием при 2500 РКМ в течение пяти минут, высеяны на 15 см 2УТ-ампициллин-2% глюкоза агаровые планшеты и инкубированы при 30°С в течение ночи. Процесс сортировки затем был повторен с использованием амплифицированного фага. Цикл сортировки, элюирования и амплификации был повторен трижды.</p>
<p>После завершения сортировки, для инокуляции среды в 96-луночных планшетах использовали отдельные колонии высеянных ТО1 клеток. Микрокультуры выращивали до ОИ600=0,6, после чего экспрессию растворимого ксРу индуцировали добавлением 1 мМ 1РТО и инкубацией в течение ночи во встряхивателе при 30°С. Бактерии осаждали центрифугированием и периплазматический экстракт был использован для тестирования связывания ксРу с иммобилизованным СИ38 при помощи стандартного анализа ЕЫ8А и РАС8 анализа связывания.</p>
<p>В РАС8-скрининге связывания использовались СНО клетки, стабильно экспрессирующие СИ38 для скрининга ксРук в периплазматическом экстракте (РРЕ) на способность связывать нативный, мембранносвязанный СИ38. Исходные и СНО трансфектанты (клеточные линии, экспрессирующие СИ38 человека или СИ38 яванского макака, или СИ38 мыши) ресуспендировали по отдельности при концентрации 2х10<sup>6</sup> клеток/мл в РВ8 (ЬДе ТесЬпо1од1ек), 0,5% В8А (81дта А1ДпсЬ) и 0,1% Ν;·ιΝ<sub>3</sub>, (81дта-А1Дт1сЬ) (РАС8 буфер). Исходные СНО клетки, которые не экспрессировали СИ38, были использованы как отрицательный контроль. Аликвоты по двадцать пять мкл клеток высевали в 96-луночные планшеты с У-образным дном (Сок!аг Са! # 3897) и к клеткам было добавлено 25 мкл перипластического экстракта, содержащего Мус-меченый ксРу-фрагмент антитела, затем смесь инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки промывали дважды, после чего осадок ресуспендировали в 25 мкл мышиного антитела к с-тус (1/1000 в РАС8 буфере) (КосЬе) и снова инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 25 мкл разведенного 1/200 антитела мыши к 1дО-РЕ в РАС8 буфере Цасккоп ЬаЬк), и снова инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали для удаления избытка несвязанного антитела и ресуспендировали в 70 мкл РАС8 буфера и анализировали на приборе ВИ РАС8сап®. Полученные данные оценивали с использованием программного обеспечения Р1о\\1о (Тгее8!аг, 1пс.) Положительные образцы были определены путем сравнения средней интенсивности флуоресценции СП38-трансфицированных СНО клеток по отношению к средней интенсивности флуоресценции исходной СНО линии клеток.</p>
<p>(СИ38<sup>-</sup>).</p>
<p>Клоны антитела, связывающие СИ38 человека, секвенировали для идентификации уникальных клонов. Уникальные клоны ксРу были классифицированы на основе скоростей диссоциации, определенных анализом В1асоте®. От 200Ки до 500Ки рекомбинантного СИ38 человека (К&И 8ук!етк са! # 2404АС или эквивалент) были иммобилизированы стандартной реакцией аминного сочетания (В1асоте®) на СМ5 или эквивалентном чипе. Также была получена референтная точка, которую активировали и затем блокировали без иммобилизации белка. Это было осуществлено путем разбавления антигена с 1-3 мкг/мл в ацетатном буфере, рН 5,0 и введением на активированную поверхность до достижения иммобилизации требуемого уровня (3-5) мин. Поверхность затем блокировали этаноламином. Периплазматические экстракты разбавляли один-к-одному аналитическим подвижным буфером 10 мМ НЕРЕ8, 150 мМ №С1, 3 мМ ЕИТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 0,05% полисорбата 20 при рН 7,4, с 2 мг/мл В8А (бычий сывороточный альбумин)). Разбавленный периплазматический экстракт вносили на поверхности поверхностного плазмонного резонанса (8РК) на 30 мин в течение 300 с с дополнительными 900 с контролируемого времени диссоциации. Регенерация была проведена единичной 8-секундной инъекцией 100 мМ НС1. Данные эталонные точки вычитали из данных активной поверхности, затем кривые диссоциации были построены с использованием модели диссоциации 1:1 в программном обеспечении В1асоте® Т100.</p>
<p>Наивысшие по ранжированию ксРу клоны были преобразованы в 1дО1 антитела. РАС8-скрининг связывания был повторен на реформатированных клонах 1дО1 с использованием исходных СНО клеток и СНО клеток, экспрессирующих СИ38 человека, мыши и яванского макака, чтобы удостоверится в сохранении связывающих свойств, а также для оценки видовой перекрестной реактивности. РАС8 характеристика 1дО-реформатированных клонов была проведена, как описано выше, но шаги, состоящие из добавления антитела к с-тус и антитела мыши к 1дО-РЕ, были заменены на один шаг, в котором связывание полноразмерного 1дО человека было обнаружено путем добавления фикоэритрин-конъюгированного антитела к 1дО человека Цасккоп ЬаЬк).</p>
<p>Пример 4. 1п уЬто клеточные анализы переформатированных клонов 1дО.</p>
<p>Около 150 клонов были переформатированы как 1дО1 антитела человека и пять (АЬ19, АЬ43, АЬ72,</p>
<p>- 25 029303</p>
<p>АЬ79 и АЬ110) были всесторонне исследованы с использованием панели анализов, как описано ниже. Свойства реформатированных 1§О-клонов как ίη νίίτο, так и ίη νίνο тестах сравнивали с двумя антителами, ВМТК4-1 (также называемый тест-1, ВМ-1, или ВМТК-1) (ЗЕр ГО N0: 24 и 25; вариабельные области тяжелой и легкой цепи) и ВМТК4-2 (также называемый тест-2, ВМ-2 или ВМТК-2) (ЗЕр ГО N0: 26 и 27; вариабельные области тяжелой и легкой цепи), аминокислотные последовательности которых были получены из последовательностей известных антител к СИ38 даратумумаб (также называемых НиМахСИ38, описанные в международной публикации №Υ0 06/099875) и ЗАК650984 (описанный в международной публикации №Υ0 08/047242) соответственно. Паливизумаб (ЗУИАОШ®) (МеЛштипе), клинически утвержденное антитело, распознающее респираторно-синцитиальный вирус, служило отрицательным контролем для связывания СИ38.</p>
<p>Пример 5. Обнаружение связывания АЬ79 иммунофлюоресценцией.</p>
<p>АЬ79, меченное красителем А1еха Р1иот®-488, наносили на замороженные срезы нормальной ткани толстой кишки человека, предстательной железы и лимфатических узлов. Паливизумаб (Зупад18®), меченный красителем А1еха Р1иог®-488, служил отрицательным контролем окрашивания. Полученные иммунофлуоресцентные изображения приведены на фиг. 4. Окрашивание, наблюдаемое для АЬ79, было идентично окрашиванию, наблюдаемому для коммерчески доступного поликлонального антитела к СИ38 на здоровой ткани толстой кишки человека, предстательной железы и лимфатических узлов (данные не приведены).</p>
<p>АЬ79, меченное красителем А1еха Р1иог®-488, также наносили на образцы здорового костного мозга и костного мозга с множественной миеломой (данные не приведены). В то время как АЬ79 связывает ~10% клеток здорового костного мозга, >90% клеток костного мозга с множественной миеломой, в 4 из 4 исследованных образцов, продемонстрировали связывание АЬ79.</p>
<p>Также была исследована способность АЬ79 связываться с некоторым количеством клеточных линий (М0ЬР-8, ИАИИ1, КРМ1 и МСР7). М0ЬР-8 (множественная миелома человека), ΌΛυΟΙ (лимфобласты, полученные от пациента с лимфомой Беркитта) и КРМ1 (клеточная линия, полученная от пациента с хроническим миелогенным лейкозом) все клетки продемонстрировали связывание АЬ79. Линия рака молочной железы, МСР7, оказалась отрицательной в связывании АЬ79 (данные не приведены).</p>
<p>Антитела, конъюгированные с А1еха Р1иог®-488, окрашивали в виде срезов толщиной 8 мкм, замороженных в криостате, которые были фиксированы в смеси этанол/ацетон в течение 5 мин с последующей инкубацией с антителами в течение 1 ч при комнатной температуре в камере с регулируемой влажностью. Затем срезы промывали, добавляли ИАРЕ содержащий гистологическую среду (Уес1от ЬаЬотаШпе5, са1 #Н1500), и использовали покровное стекло.</p>
<p>Пример 6. Оценка экспрессии АЬ79 при множественной миеломе (ММ) и хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ).</p>
<p>Связывание АЬ79 с образцами костного мозга пациентов с множественной миеломой анализировали при помощи проточной цитометрии либо после обогащения для СГО138' клеток, либо стробированием на СИ138<sup>+</sup>СИ45<sup>-/Ь</sup> клетках (фиг. 7А). Было обнаружено, что АЬ79 экспрессируется на >95% клеток четырех из шести образцов множественной миеломы. Связывающая часть АЬ79 оказалась в значительной степени похожей на связывающую часть антитела к СГО38, используемого в клинических лабораториях. Кроме того, АЬ79 связывал клетки пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (фиг. 7В).</p>
<p>Для измерения связывания АЬ79 с ММ и ХЛЛ РАСЗ анализом, образцы, отобранные у пациентов, были обработаны в течение 24 ч. Мононуклеарные клетки периферической крови были выделены Нсо11Расще™ (ОЕ НеаННсаге) в соответствии с инструкциями производителя. Анализ экспрессии проводили с использованием следующих панелей антител с клонами в круглых скобках. ММ панель: АЬ79-А1еха Р1иог®-488, СИ45-РетСР (2И1), СИ138-АРС (ΜΙ15). ХЛЛ панель: АЬ79-А1еха Р1иог®-488; СИ5-РЕ (ИСНТ2), СИ45-РегСР (2И1), СИ19-АРС (З125С1). 5 мкл РЕ, РегСР или АРС меченого антитела или 10 мкл антитела, меченного А1еха Р1иог®-488, или изотипа контрольной группы было добавлено в каждую лунку или пробирку, содержащую либо 100 мкл МКПК в концентрации 0,2х10<sup>6</sup> или СИ138 обогащенных клеток из аспирата костного мозга. Образцы инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего эритроциты лизировали с использованием раствора ВИ РЬатт1у8е в соответствии с инструкциями производителя. Все образцы промывали три раза в РАСЗ буфере. Образцы фиксировали в 1% параформальдегиде и анализировали на приборах ВИ РАСЗСапЮ™ II или ВИ РАСЗСаЛЬет™.</p>
<p>Пример 7. Исследования СИС, индуцированные антителом к СИ38.</p>
<p>Перекрестно-реактивные клоны яванского макака были протестированы на способность индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность (СИС). М0ЬР-8 клетки высевали при плотности 10000 клеток на лунку в черные 96-луночные плоскодонные планшеты для тканевых культур в 50 мкл полной среды (КРМ1, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки). 50 мкл 2х антитела к СИ38, контрольного 1дО антитела или только среду добавляли в каждую лунку и оставляли для инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин. В зависимости от клеточной линии, в каждую лунку, за исключением контрольных лунок, были добавлены различные количества (2-15 мкл) очищенного комплемента кролика (са1 #СЬ 3441 Сейаг1апе ЬаЬогаЮпек, Канада). После инкубации в течение одного часа при 37°С план- 26 029303</p>
<p>шеты были доведены до комнатной температуры, на лунку было добавлено 100 мкл реагента Су!оТох С1о™ для клеточной титрации (Рготеда С7571/С7573), планшет встряхивали в течение 5-7 мин и считывали люминесценцию на люминесцентном Епу1люп® (Регкт Е1тег) планшет-ридере. Условия анализа: только клетки, клетки + комплемент, клетки + контрольный 1дС + комплемент, клетки + антитело + комплемент. % СБС рассчитывали по следующему уравнению:</p>
<p>100- (кьи<sub>т</sub>/ньи<sub>с</sub>) χίοο.</p>
<p>где КШ<sub>Т</sub> - это относительные единицы люминесценции исследуемого образца и КЬИ<sub>С</sub> - это относительные единицы люминесценции образца только с комплементом. Статистический анализ проводили при помощи программного обеспечения РК1ЛМ. Значения ЕС<sub>50</sub>, определенные согласно графиков % СОС по отношению к концентрации антитела, приведены в табл. 1.</p>
<p>Пример 8. Исследования АОСС, индуцированные антителом к С1138.</p>
<p>Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АОСС) была оценена при помощи ВаиШ, М0ЕР-8 и КРМ1-8226 клеточных линий в качестве клеток-мишеней. РВМС выделяли как эффекторные клетки сепарацией Р1со11-Р1адие™ из лейкоцитарной пленки или ЕКЛ, которые были получены из Л!ап!огб В1ооб Сеп1ег (Ра1о А1!о, Калифорния). Образцы разводили 1:3 2% РВЛ в РВЛ. 15 мл Рюо11Р1адие™ (СЕ НеаЕРсаге) осторожно наслаивали на 35 мл разбавленного образца и центрифугировали при 1800 грт (разбежка) в течение 25 мин. Отбиралась мутная промежуточная фаза, содержащая МКПК, промывалась 3 раза 2% РВЛ в РВЛ и замораживали аликвоты с концентрацией 50х10<sup>6</sup> клеток/мл на аликвоту в 10% ОМЛ0/РВЛ. Замороженные аликвоты МКПК оттаивали и культивировали в течение ночи в 10% РВЛ/КРМ1 + 5 нг/мл рекомбинантного ИЛ-2 человека (Κ&Ό лул!етл #202-1Ъ) в концентрации 2х10<sup>6 </sup>на мл, при необходимости.</p>
<p>Для исследования АОСС все шаги были выполнены в полной среде. 5000 клеток-мишеней высевали на лунку в 96-луночный планшет в 50 мкл 3х антитела к СО38, контрольного 1дС или только среды с последующим добавлением 50 мкл эффекторных МКПК человека в соотношении клетки-мишени : эффекторные (М:Э) клетки между 1:25 до 1:50. Планшеты быстро центрифугировали в течение ~30 с при 800 грт, чтобы расположить все клетки в непосредственной близости. После 4 ч при 37°С планшеты центрифугировали при 1100 грт в течение 5 мин и 100 мкл супернатанта переносили в белый планшет. 100 мкл реагента Су1оТох С1о™ (Рготеда са! # С9292) добавляли к супернатанту и планшеты оставляли для встряхивания в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Люминесценцию считывали на люминесцентном Епу1люп® (Регкт Е1тег) планшет-ридере и процент специфического лизиса рассчитывали по следующей формуле:</p>
<p>(кьи<sub>т</sub>/кьи<sub>Е/т</sub>) / (нъи<sub>ь</sub>/кьи<sub>Е</sub>/<sub>т</sub>) χίοο</p>
<p>где КЕИ<sub>Т</sub> - это относительные единицы люминесценции исследуемого образца и КЕИ<sub>е/т</sub> - это относительные единицы люминесценции образца, содержащего клетки-мишени и только эффекторные клетки, и КОЕ- - это относительные единицы люминесценции клеток, лизированных Тп!оп Х-100. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения РК1ЛМ. Значения ЕС<sub>50</sub>, определенные согласно графиков % специфического лизиса в зависимости от концентрации антитела, приведены в табл. 1.</p>
<p>Таблица 1. СОС, АОСС и агонистичная активность 1дС-реформатированных антител</p>
<table border="1">
<tr><td>
</td><td>
СОС ЕС50</td><td>
АОСС ЕС50</td><td>
АОСС ЕС50</td><td>
АОСС ЕС50</td><td>
Апоптоз</td></tr>
<tr><td>
Антитело</td><td>
нМ</td><td>
нМ</td><td>
нМ</td><td>
нМ (ΗΡΜΙ-</td><td>
ЕС50 нМ</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
(МОЬР-8)</td><td>
(ΟΑυϋΙ)</td><td>
(МОЬР-8)</td><td>
8226)</td><td>
(ΟΑυΟΙ)</td></tr>
<tr><td>
ВМ-1</td><td>
0,48+0,16</td><td>
0, 03+0,02</td><td>
0,036+0,013</td><td>
0,13+0,03</td><td>
0, 057</td></tr>
<tr><td>
ВМ-2</td><td>
0,65+0,18</td><td>
0,04+0,02</td><td>
0,024+0,005</td><td>
0,15+0,04</td><td>
0, 062</td></tr>
<tr><td>
АЫ9</td><td>
0,98+0,26</td><td>
0,08+0,03</td><td>
0,038+0,008</td><td>
0,46+0,15</td><td>
0, 032</td></tr>
<tr><td>
АЬ43</td><td>
2,2</td><td>
0,12+0,09</td><td>
0,027+0,018</td><td>
3,84+1,34</td><td>
1,56</td></tr>
<tr><td>
АЬ72</td><td>
0,66+0,49</td><td>
0,14+0,12</td><td>
0,193+0,037</td><td>
2,35+0,99</td><td>
0,35</td></tr>
<tr><td>
АЬ79</td><td>
1,1+0,39</td><td>
0, 03+0,02</td><td>
0,047+0,012</td><td>
0,4 6+0,19</td><td>
0, 048</td></tr>
<tr><td>
АЫ10</td><td>
1,99+0,71</td><td>
0,24+0,17</td><td>
0,874+0,804</td><td>
2,98+0,91</td><td>
0,40</td></tr>
<tr><td>
АЫ64</td><td>
2,00+0,83</td><td>
Нет
данных</td><td>
0,165+0,154</td><td>
1,2+0,24</td><td>
0,31</td></tr>
</table>
<p>Пример 9. Определение аффинности РАСЛ анализом.</p>
<p>М0ЕР-8 клетки, экспрессирующие СО38, суспендировали в 1% РВЛ буфере при концентрации жизнеспособных клеток приблизительно 2 млн клеток/мл. Тестируемые тАЬ серийно разводили (в 2 раза) через лунки в двух 96-луночных планшетах в 1 х РВЛ. Последняя лунка каждой титрации содержала только буфер. Дополнительные РВЛ и клеточные суспензии были добавлены в каждую лунку таким образом, чтобы конечный объем составил 300~л/лунку, и каждая лунка содержала приблизительно 100000</p>
<p>- 27 029303</p>
<p>клеток. Ниже перечислены тАЬ с соответствующим окончательным диапазоном концентрации сайта связывания тАЬ (2Х молекулярная концентрация), используемых для титрации</p>
<p>[тАЬ] сайт связывания = 50,8 нмоль -49,7 пмоль</p>
<p>е = 49,5 нмоль -48,3 пмоль 49,3 нмоль -48,2 пмоль</p>
<p>Тест-1, Тест-2,</p>
<p>[тАЬ] сайт связывания,</p>
<table border="1">
<tr><td>
АЬ</td><td>
43,</td><td>
[тАЬ]</td><td>
сайт связывания =</td></tr>
<tr><td>
АЬ</td><td>
110,</td><td>
[тАЬ]</td><td>
сайт связывания =</td></tr>
<tr><td>
АЬ</td><td>
79,</td><td>
[тАЬ]</td><td>
сайт связывания</td></tr>
<tr><td>
АЬ</td><td>
72,</td><td>
[тАЬ]</td><td>
сайт связывания</td></tr>
<tr><td>
АЬ</td><td>
19,</td><td>
[тАЬ]</td><td>
сайт связывания</td></tr>
</table>
<p>Планшеты помещали в планшетный шейкер на 5 ч при 4°С, после чего планшеты промывали 3 раза при 4°С 1хРВЗ. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл 99 нмоль Су5 Рс-специфического поликлонального антитела козы к 1дО человека Даскзоп 1ттипоРе5еагсй РаЬога!опе5, #109-175-008) и планшеты встряхивали в течение 30 мин при 4°С. Планшеты вновь промывали дважды при 4°С 1Х РВЗ, затем был использован проточный цитометр РАСЗСап!о™ II НТЗ для записи средней интенсивности флуоресценции (МР1) 5000 событий для каждой лунки, содержащей концентрацию уникального сайта связывания тАЬ. График средней интенсивности флуоресценции как функция концентрации антитела связывающего сайта антитела была нелинейно подобрана программным обеспечением ЗаепОЧ 3.0 при помощи приведенного ниже уравнения для оценки ΚΌ:</p>
<p>Г=р[ (КЬ+ЬТ+п(М) ) -{ (КЬ+ЬТ+п(М) ) 2-4п(М) (ЬТ) }1/2] /2 + В где Р (средняя интенсивность флуоресценции), ЬТ (общая концентрация сайта связывания тАЬ), Р</p>
<p>(коэффициент пропорциональности, который соотносит произвольные единицы флуоресценции со связанным мАт), М (молярная клеточная концентрация; 0,553 фМ, основанная на 100000 клеток в 300 мкл), п (число рецепторов на клетку), В (фоновый сигнал) и ΚΌ - константа равновесной диссоциации.</p>
<p>Для каждой кривой титрации антител оценка ΚΌ производилась при свободном размещении Р, п, В и ΚΌ при нелинейном анализе. Для подробного выведения данного уравнения см. работу Эгаке апб К1акатр (2007), "А пдогоиз тиШр1е тберепбеп! Ьтбтд ч!е тобе1 Юг бе!егтттд се11-Ьазеб едшНЬпит б155ос1а1юп сопЧапЬ," I. 1ттипо1. Ме!йобз 318: 157-62, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. В табл. 3 перечислены полученные ΚΌ для всех антител в порядке убывания аффинности вместе с 95% доверительным интервалом для каждого, внесенном в скобки. Концентрация сайта связывания антитела (2Х молекулярная концентрация) была использована для нелинейного проведения кривых по точкам.</p>
<p>Пример 10. Определение аффинности с использованием В1асоге®.</p>
<p>Аффинности антител 1дО к растворимому эктодомену СЮ38 (ЕСЭ) определяли при помощи анализа поверхностного плазмонного резонанса (ЗРР) на приборе В1асоге™ А100 при 22°С. Поликлональное антитело козы к 1дО человека (Са1!ад Н10500) иммобилизовали на СМ5 биосенсорном чипе с использованием стандартного аминного связывания с точками 1, 2, 4 и 5 во всех четырех проточных кюветах в чипе. Уровни иммобилизация в каждой точке варьировали от 5865 Ри до 6899 Ри. СЮ38 человека был получен от Р&Э ЗуЧетз (Са! # 2404-АС, Ро! # РЕН020812А). Исходная концентрация СЭ38 была определена при помощи способов, подробно описанных в Расе е! а1. (1995) "Ноа !о теазиге апб ргебю! то1аг аЬзогрбоп сое£йс1еп! о£ а рго!ет" Рго!ет Зс1епсе 4(11):2411-23 и Расе апб ОптЧеу (2004) "Зрес!горйо!оте!пс бе!егтта!юп о£ рго!ет сопсеп!га!юп," т Сиггеп! Рго!осо1з ш Рго!ет Зс1епсе, Сйар!ег 3: ит! 3.1, содержание которых включено в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки.</p>
<p>Подвижный буфер получали путем дегазации забуференного НЕРЕЗ физиологического раствора, 0,005% полисорбата 20 и добавление фильтруемого ВЗА до конечной концентрации 100 мкг/мл. Все восемь очищенных тАЬ разводили подвижным буфером до концентрации приблизительно 2 мкг/мл. Предварительные эксперименты оценили количество каждого захватываемого тАЬ для поддерживания поверхностной емкости (Р<sub>тах</sub>) не более чем ~100 Ри. Для каждого цикла захвата тАЬ/инъекции антигена тАЬ был захвачен в точках 1 и 5 в каждой проточной кювете с расположенными рядом точками 2 и 4, служившими в качестве соответствующих эталонных поверхностей. Каждое разбавленное тАЬ было захвачено течение 1 мин при скорости потока 10 мкл/мин, с последующим трехминутным потоком подвижного буфера для стабилизации поверхности. НиСЭ38 вводили во все четыре проточные кюветы в течение 120 с при 30 мкл/мин в диапазоне концентраций от 193,7-3,0 нМоль (2х серийное разведение) с последующей 15-минутной фазой диссоциации. Все образцы были подготовлены в подвижном буфере и были случайно введены трижды семью инъекциями буфера, рассеянных для двойного сравнения. Поверхности были регенерированы двумя 20-секундными пульсами 10 ммоль глицина, рН 1,7.</p>
<p>Все данные сенсограммы были обработаны программным обеспечением ЗсгиЬЬег 2.0с и в общем соответствовали модели взаимодействия 1:1 в ЗсгиЬЬег 2.0с. Полученные константы связывания приведены в табл. 2.</p>
<p>- 28 029303</p>
<p>Таблица 2</p>
<table border="1">
<tr><td>
Антитело</td><td colspan="2">
ВАС5 Κϋ
(нМ)
МОЬР-8</td><td>
ВАСЗ Κϋ
(пМ)
ΚΡΜΙ-8226</td><td>
Вьасоге
Ка
(М-1с-1)</td><td>
Вьасоге
Κά (с-1)</td><td>
Вьасоге
Κϋ (нМ)</td></tr>
<tr><td>
ВМ-1</td><td>
1,1 (</td><td>
0, 9)</td><td>
802</td><td>
4,49х10<sup>4</sup></td><td>
2,46х10~<sup>3</sup></td><td>
54,8</td></tr>
<tr><td>
ВМ-2</td><td>
1,6 (</td><td>
0, 6)</td><td>
428</td><td>
4,24х10<sup>5</sup></td><td>
2,27х10~<sup>3</sup></td><td>
5,4</td></tr>
<tr><td>
АЫ9</td><td>
0,4 (</td><td>
0,3)</td><td>
-</td><td>
1,54х10<sup>5</sup></td><td>
8,10х10<sup>ч</sup></td><td>
5, 3</td></tr>
<tr><td>
АЬ79</td><td>
1,2 (</td><td>
1,1)</td><td>
508</td><td>
1,22х10<sup>5</sup></td><td>
6, 75х10~<sup>4</sup></td><td>
5, 5</td></tr>
<tr><td>
АЬ72</td><td>
0, 6 (</td><td>
0,4)</td><td>
-</td><td>
1,44х10<sup>4</sup></td><td>
1, 82х10~<sup>3</sup></td><td>
126</td></tr>
<tr><td>
АЫ10</td><td>
1,0 (</td><td>
0,1)</td><td>
-</td><td>
1,22х10<sup>5</sup></td><td>
1,71Х10<sup>-1</sup></td><td>
1400</td></tr>
<tr><td>
АЬ43</td><td>
1,1 (</td><td>
0,3)</td><td>
-</td><td>
2,72х10<sup>5</sup></td><td>
1,46x1ο-<sup>1</sup></td><td>
537</td></tr>
<tr><td>
АЫ64</td><td>
1,4 (</td><td>
0,7)</td><td>
-</td><td>
1,99х10<sup>5</sup></td><td>
7, 15х10~<sup>2</sup></td><td>
359</td></tr>
</table>
<p>Пример 11. Иммунофлюоресцентные исследования интернализации.</p>
<p>Иммунофлюоресцентные методики были использованы для оценки интернализации антитела к СЭ38 в М0ЬР-8 клетки. Были отобраны М0ЬР-8 клетки и концентрация клеток, равная 5х10<sup>6</sup>, была окрашена в течение 10 мин при 4°С в среде КРМ1-1640, содержащей 1 мкг каждого антитела к СЭ38, непосредственно конъюгированного с А1еха Р1иог® 488. Клетки промывали в РВ8, содержащем 1% В8А, и клетки в концентрации 1 х 10<sup>6</sup> инкубировали в течение 3 или 6 ч при 4 или 37°С. Поверхностное окрашивание гасили в течение 30 мин при 4°С с использованием 2 мкг А1еха Р1иог®-488 антитела кролика (1пу11го§еп). Клетки промывали и фиксировали в РВ8 с 1% РРА, перенесенные в 96-луночный планшет М1сго1ез! (ВЭ Вюзшепсез), и исследовали либо при помощи проточной цитометрии с использованием проточного цитометра РАС8Сап1о™ II (ВЭ Вюзшепсез), либо визуализировали с использованием 1та§еХрге88® М1сго (Мо1еси1аг ^еν^сеδ) при 20-кратном увеличении.</p>
<p>Пример 12. Связывание эпитопа при помощи В1асоге®.</p>
<p>Оборудование В1асоге® А100 было использовано для би~ двух тестовых антител, а также АЬ19 и АЬ79. Сперва антитела были иммобилизованы при высокой и низкой плотностях на СМ5 чипах с использованием N118ЕГ)С связывающих реакций. Для каждого цикла эксперимента связывания эпитопа на эти поверхности вначале вносили СЭ38. Аналогично сэндвич-анализу в формате ЕЬ18А, уникальное антитело (избранное из множества иммобилизованных антител) затем вносили на поверхности, содержащие комплексы СЭ38/антитело. Поверхности регенерировали с использованием пульсов фосфорной кислоты в конце каждого цикла. Данные были собраны при 22°С с использованием НВ8-Р (10 мМ НЕРЕ810, рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,005%) Р-20) с добавлением В8А. Полученные сенсограммы обрабатывали с использованием модуля "Ерйоре Марршд" пакета программного обеспечения В1асоге® А100 Еνа1иаί^оη, а также пробной версии 8сгиЬЬег для А100 для наборов данных. Для генерации двоичной 4х4 матрицы для вышеуказанных 4 моноклональных антител из двух отдельных экспериментов были использованы дублирующие данные, как показано в табл. 3.</p>
<p>Таблица 3</p>
<p>Пример 13. 1п νινί) анализ в онкологии.</p>
<p>Эффективность АЬ19 и АЬ79 была испытана ш νίν() на модели дессиминированной Г)аи<Елюциферазной лимфомы человека. 6-8-недельным самкам 8СГО СВ.17 мышей из Тасошс ЬаЬогаЩпек внутривенно вводили концентрацию ПаийЕЕис клеток опухоли, равную 1 х 10<sup>6</sup>. На 7 сутки исследования мышам внутрибрюшинно вводили: паливизумаб, АЬ79, АЬ19, тест 1 и тест 2. Начиная с 21-го дня еженедельно, проводили биолюминесцентную визуализацию с использованием системы 1У18 Хеподеп (Сайрег I аГе 8с1епсез) для контроля опухолевой массы. Для визуализации животным внутрибрюшинно вводили субстрат люциферазы (150 мг/кг) за 10 мин до визуализации, затем животных анестезировали изофлураном и получали изображение. Результаты продемонстрированы на фиг. 8 и 9.</p>
<p>Пример 14. Корреляция воспалительного/иммунологического заболевания.</p>
<p>Было продемонстрировано, что СЭ38 значительно активируется в МКПК клетках после активации. Среди покоящихся МКПК нормальных доноров менее чем 20% покоящихся клеток экспрессируют СГ)38 с количеством рецепторов примерно 10000-20000 на клетку. Активированные МКПК, также нормальных</p>
<p>- 29 029303</p>
<p>доноров, продемонстрировали 60-75% клеток, экспрессирующих ί'.Ό38. с количеством рецепторов 110000 до 160000 на клетку.</p>
<p>В дополнение к этому, как показано на фиг. 5, МКПК пациентов с СКВ характеризовались повышенной экспрессией С.И38.</p>
<p>Образцы исследовали иммуногистологически на предмет избыточной экспрессии СЭ38. 19 образцов от пациентов с СКВ были проанализированы, повышенная экспрессия С.И38 наблюдалась на В- и Тклетках памяти и плазмоцитоидных ДК. Были исследованы 3 пациента с РА, продемонстрировавшие инфильтрацию СИ38-плазматическими клетками синовиальной ткани у всех трех пациентов, а также повышенное окрашивание синовиальной ткани с АЬ79. Были исследованы 7 пациентов с болезнью Крона и 6 пациентов с язвенным колитом, и продемонстрировали инфильтрацию СИ38-экспрессирующими плазматическими клетками гладкой мускулатуры толстой кишки (проверено на двух первичных образцах клеток пациентов). Следует отметить, что было исследовано такое же количество здоровых пациентов, которые не продемонстрировали этих результатов.</p>
<p>Пример 15. Истощение с использованием антител к СИ38.</p>
<p>Яванские макаки, которым была введена доза АЬ79, демонстрируют значительное снижение лимфоцитов, В- и Т-клеток и ΝΚ-клеток. Антитело вводили путем 30-минутной внутривенной инфузии в дозах, продемонстрированных на фиг. 6 с данными, собранными в течение 24 ч. Аналогичные данные были продемонстрированы на день 4, 7, 11 и 18.</p>
<p>Тем не менее, данные рК/рИ демонстрируют выздоровление животных после введения дозы. Как показано на фиг. 7, количество лимфоцитов становится аналогичным количеству контрольной группы после периода от нескольких дней после однократной внутривенной 30-минутной инфузионной дозы, даже после наивысшей дозы, что указывает на отсутствие проблем с лимфоидными клеткамипредшественницами.</p>
<p>Пример 16. Модели аутоиммунных заболеваний.</p>
<p>Используются три различные модели.</p>
<p>Мышиная модель Ни8с1б служила как модель псевдореакции трансплантат-против-хозяина, а также как модель для противостолбнячного ответа, истощения 1дО и общей выживаемости. СВ17/Ни8СГО мышам вводили А8ОМ1 для истощения ΝΚ-клеток, а затем на другой день вводили МКПК человека. Период приживления составлял 7-10 дней, сыворотку отбирали для рандомизации 1д человека. На другой день мышам вводили восемь АЬ79 в дозе 10 мг/кг с последующим введением ТТб, со второй дозы через 4 дня, третьей дозой через три дня после этого, сыворотку собирали для подсчета 1д человека и обнаружения противостолбнячного иммуноглобулина через 3 дня после этого (всего 10 дней от первой дозы). На фиг. 8 продемонстрированы результаты одной мыши-донора, которые указывают на значительное снижение всех 1д изотипов при лечении. На фиг. 9 продемонстрированы результаты средних уровней 1д для каждой группы реципиентов, при этом каждая точка данных представляет среднее значение в каждой группе (и=5 до и=10). На фиг. 10 продемонстрировано значительное снижение противостолбнячного ответа при лечении АЬ79. Наконец, на фиг. 11 продемонстрировано общее существенное выживания с использованием лечения АЬ79.</p>
<p>Эксперименты на суррогатных мышах.</p>
<p>Поскольку АЬ79 перекрестно не реагирует с СИ38 грызунов, было создано суррогатное антитело. Предварительно с использованием коммерческого антитела к СИ38 человека и коммерческого антитела к СИ38 мыши, продемонстрированы значительные различия уровней экспрессии СИ38 клеточными типами между человеком и мышью (см. фиг. 12), демонстрирующие, что биология заболевания различна. Таким образом, использование антител, перекрестно реагирующих с СИ38 обезьяны, в моделях на обезьянах может дать значительно лучшие результаты.</p>
<p>Было создано суррогатное антитело, демонстрирующее сходное истощение СИ38+ клеток, полученных из селезенки, крови и костного мозга (данные не показаны), а также из периферической крови (см. фиг. 13). В дополнение к этому на фиг. 14 продемонстрирована кинетика истощения в селезенке, крови и костном мозге, полученных на 1, 2 или 3 день после одной дозы 10 мг/кг суррогатной мыши. Быстрое истощение В-клеток в крови было продемонстрировано в течение 24 ч с более медленным истощением, продемонстрированном в селезенке и костном мозге.</p>
<p>Мышиная модель СКВ.</p>
<p>Суррогатное антитело мыши к СИ38 исследуют на МКЬ/1рг модели, используя следующие промежуточные считывания (например, каждые две недели), в крови: аутоантитела к двухцепочечной ДНК, СВС, РАС8 для Т/В лимфоцитов, белок альбумина мочи и воспаление кожи. Конечное считывание в крови включает, но не ограничивается: аутоантителами к двухцепочечной ДНК, СВС, РАС8 для Т/В лимфоцитов, из селезенки, лимфатических узлов и костного мозга: весом органов, количеством иммунных клеток, РАС8 для Т/В лимфоцитов, в почках: весом органов, гистопатологией (Н&Е и РА§), внутриклеточным расположением, клетками воспаления и воспалением кожи (гистопатологией).</p>
<p>Модель коллаген-индуцированного артрита (С1А).</p>
<p>Была использована мышиная модель с использованием суррогатного антитела мыши с 7 группами мышей для оценки как про-профилактической, профилактической и терапевтической эффективности.</p>
<p>- 30 029303</p>
<p>Всех мышей иммунизировали С11/СРА на 0 день, бустер-инъекцией СП/СРА на 21 день, как правило приводящие к прогрессированию заболевания с 21 по 42 день (окончание исследования). Группе 1 (10 мышей) интраперитонеально вводили 10 мг/кг суррогатного антитела два раза в неделю, начиная с 0 дня (про-профилактически). Группе 2 (п=10) вводили то же самое количество, но начиная с 21 дня. Группе 3 (п=10) вводили то же самое количество с момента начала заболевания (25-28 день). Группе 4 (п=10) вводили те же дозы, но с И1уС1 (например, изотип) на 0 день. Группе 5 (п=10) вводили ту же дозу ЫуО1, но начиная с 21 дня. Группе 6 (п=10) вводили на 21 день 0,5 мг/л дексаметазон в воде и группе 7 (п=5) ничего не вводили.</p>
<p>Исследование С1А на яванском макаке проводится с использованием п=3 в каждой группе, группа 1 - наивные животные, только носитель. Группе 2 вводят разовую дозу АЬ79 в дозе 3 или 10 мг/кг, ί]1\ν (профилактическое лечение начинается на 7 день после иммунизации коллагеном). Группе 3 вводят АЬ79 в дозе 3 или 10 мг/кг ς1ν, для терапевтического лечения, начиная с начала заболевания, 21 день или 28 день. Группе 4 вводят 0,1 мг/кг ς1ά с дексаметазоном также в начале заболевания.</p>
<p>Список последовательностей 5Е<2 Ю N0:1 (Οϋ38 Ното зараепз; ΝΡ_001766.2)</p>
<p>ΜΑΝΟΕ Е5 РУ5 СОКРССНЬЗННАОЬСЬСУЗIЬУЬIЫЛЛ1ЬАУУУРНИН00И5 СРСТ ТКН</p>
<p>ΕΡΕΤνΕΑΚΟνΚΥΤΕΙΗΡΕΜΚΗνϋΟΟΕνίΛΓΟΑΕΚΟΑΕΙΕΚΗΡΟΝΙΤΕΕΟΥΟΡΕΜΚΕΟΤΟΤνΡΟΝΚ</p>
<p>1ЬЬИ5Н1КОЬАН0ЕТ0У0НОМЕТЬЕОТЬЬСУЬАООЬТИССЕЕЫТ5К1ЫУ05СРОИНКОС5ЫЫР</p>
<p>У5УЕИКТУ5ККЕАЕААСО1тЛ/МЬЫС5К5К1ЕОКЫ5ТЕС5УЕУНЫЬ0РЕКУ0ТЬЕАИУ1НССК</p>
<p>Εϋ5ΗϋΕΟ0ϋΡΤΙΚΕΕΕ5ΙΙ5ΚΗΝΙ0Ε5ΟΚΝΙΥΗΡϋΚΕΕ0θνΚΝΡΕΌ55ΟΤ5ΕΙ</p>
<p>5Е0 Ю N0:2 (Οϋ38 Масаса £азс1си1аг1з; ААТ36330.1)</p>
<p>МАЖЕЕЗРУЗСОКРССРЪЗРРА0УСЪСУСЪЪУЪЫ1ЛЛЛЛ/АУУЪРРИР00ИЗСЗСТТЗ</p>
<p>ΚΕΡΕΤνΕΑΚΟνΚΥΤΕνΗΡΕΜΚΗνϋΟΟδνΝΟΑΕΚΟΑΕΙδΚΥΡΟΝΙΤΕΕΟΥΟΡΕνΚΕΟΤΟΤνΡΟΝ</p>
<p>ΚΤΕΕΝ3ΚΙΚΟΕΑΗ0ΕΤ0ν0ΚΟΜΕΤΕΕΟΜΕΕΟΥΕΑΟΟΕΤΝΟΟΕΕΝΤΕΕΙΝΥ03ΟΡΟΝΚΚϋΟ3ΝΝ</p>
<p>Ρν5νΕΝΚΤν5ΗΗΕΑΕΤΑΟθννΗνΜΕΝΟ5Η5ΚΙΕΟΚΝ5ΤΕΟ5νΕνΗΝΕ0ΡΕΚν0ΑΕΕΑΝνΐΗΟΟ</p>
<p>КЕО5КОЬС0ОРТ1КЕЬЕ5115ККШКЕЕСКШУКРОКЕЬ0СУ1ШРЕО55СЬ5С1</p>
<p>5Е0 Ю N0:3 (ΗΟϋΚΙ АЪ79)</p>
<p>- 31 029303</p>
<p>ΘΓΤΡϋϋΥΟ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:4 (НСОК2 АЬ7 9)</p>
<p>Ι3ΜΝΟΟΚΤ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:5 (НСОКЗ АЬ79)</p>
<p>АКСЗЬРНОЗЗОРУРСН</p>
<p>ЗЕО Ю N0:6 (ЬСОК1 АЬ7 9)</p>
<p>33ΝΙΟΌΝΥ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:7 (ЬСОК2 АЬ7 9)</p>
<p>КОЗ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:8 (ЬСОКЗ АЬ79)</p>
<p>ОЗУОЗЗЬЗОЗ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:9 (тяжелая цепь АЬ79)</p>
<p>ЕУ0ЬЬЕЗСССЬУ0РСОЗЬКЬЗСАА5СРТР0ОУСМЗЮУК0АРСКСЬЕЮУ5О15ТОгаСКТ</p>
<p>ΗΥνθ3νΚΟ0ΕΤΙ3ΚΟΝ3ΚΝΤΟΥΟ0ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚσ3:ΕΡΗΟ33ΟΡΥΕΟΗΝ60ΟΤθντν</p>
<p>ЗЗАЗТКСРЗУРРЬА</p>
<p>ЗЕО Ю N0:10 (легкая цепь АЬ79)</p>
<p>03νθΤ0ΡΡ3Α3ΟΤΡΟ0ΚνΤΙ303Ο333ΝΙΟΟΝΥν3ΝΥ00ΟΡΟΤΑΡΚΟΟΙΥΚΌ30ΚΡ3Ο</p>
<p>УРОКР8СЗКЗОТЗАЗЬА13СЬКЗЕОЕАОУУСОЗУОЗЗЬЗСЗУРдССЗТКЬТУЬСОРКАНРТУТЬ</p>
<p>РРРЗЗЕЕЬ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:11 (тяжелая цепь АЫ9)</p>
<p>ЕУ0ЬЬЕЗСССЬУ0РСОЗЬКЬЗСААЗСРТРЫНУОМТИУК0АРСКСЬЕМУАУ15УОО5ОК</p>
<p>ΟΥΑΟ8νκσΚΡΤΙ5ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ0ΑΚνΥΥΥσΡ5ΟΡ3Μθν№30<3Τθντν3</p>
<p>ЗАЗТКСРЗУРРЬА</p>
<p>ЗЕО Ю N0:12 (легкая цепь АЫ9)</p>
<p>03νΕΤ0ΡΡ3Α3ΟΤΡΟ0ΚνΤΙ3σ3Ο3Ν3ΝΙΟ3ΝΤνΝΝΥ00ΕΡΟΤΑΡΚΟΟΙΥ3Ο3ΝΚΡ3σ</p>
<p>УРОКГЗСЗК80ТЗАЗЬА13СЬКЗЕОЕАОУУСОЗУОЗЗЬЗСЗКУРСССТКЬТУЬСОРКАЯРТУТ</p>
<p>ЬРРРЗЗЕЕЬ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:13 (НС0К1 АЫ9)</p>
<p>ΟΡΤΡΝΝΥϋ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:14 (НС0К2 АЫ9)</p>
<p>Ι8ΥΟΟ3ΟΚ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:15 (НСОКЗ АЫ9)</p>
<p>ΑΚνΥΥΥΟΡ5ΟΡ5Μθν</p>
<p>ЗЕО Ιϋ N0:16 (ЬС0К1 АЫ9)</p>
<p>Ν3ΝΙ03ΝΤ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:17 (ЬС0К2 АЫ9)</p>
<p>- 32 029303</p>
<p>3ϋ3</p>
<p>5Ε0 Ю N0:18 (ЬСОКЗ АЫ9)</p>
<p>ОЗУОЗЗЬЗСЗК</p>
<p>ЗЕО Ю N0:19 (тяжелая цепь АЫ9) с константой</p>
<p>ЕУОЬЬЕЗСССЬУОРССЗЬКЬЗСААЗСЕТЕННУОМТИУКОАРСКСЬЕИУАУРЗУОСЗОК</p>
<p>ΟΥΑΟ3νΚΟΚΕΤΙ3ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΒΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚνΥΥΥΟΕ3ΟΡ3ΜθνΝΟ0ΟΤΕντν3</p>
<p>ЗАЗТКСРЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЕУКОУЕРЕРУТУЗИПЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬ</p>
<p>УЗЬЗЗУУТУРЗЗЗЬСТОТУЮПУПНКРЗПТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЬЕССРЗУЕЬ</p>
<p>ΕΡΡΚΡΚϋΤΕΜΙ3ΚΤΡΕνΤθνννθν3ΗΕΟΡΕνΚΕΝΝΥνθθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ3ΤΥΚνν3ν</p>
<p>ЬТУЬН0ОИЬПСКЕ¥КСКУЗПКАЬРАР1ЕКТ13КАКС0РНЕР0У¥ТЬРРЗНЕЕМТКП0УЗЬТСЬ</p>
<p>νΚΟΕΥΡ3ΟΙΑνΕΝΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ3ΟΟ3ΕΕΕΥ3ΚΕΤνϋΚ3ΗΝ00ΟΝνΕ3Ο3νΜΗΕΑ</p>
<p>ЬНПНУТОКЗЬЗЬЗРСК</p>
<p>ЗЕО Ю N0:20 (легкая цепь АЫ9) с константой</p>
<p>03νΕΤ0ΡΡ3Α5ΟΤΡΟ0ΚνΤΙ3Ο3Ο3Ν3ΝΙΟ3ΝΤνΝΝΥ00ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΙΥ3ϋ3ΝΚΡ3Ο УРОКЕЗСЗКЗСТЗАЗЫИЗСЬКЗЕОЕАОУУСОЗУОЗЗЬЗСЗКУЕСССТКЬТУЬСОРКАНРТУТ Ь Е Ρ Ρ 3 3 Е Е Ь 01ШКАТ Ь УС Ы 3 ϋ Е Υ Р САУТ νΑΝΚΑϋ С 3 Р УКАС УЕ Т Т К Ρ 3 КО 3 ΝΝΚ ΥΑΑ3 3 Υ Ь 3 ЬТРЕОИКЗНКЗУЗСОУТНЕСЗТУЕКТУАРТЕСЗ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:21 (тяжелая цепь АЪ79)</p>
<p>ЕУ0ЬЬЕЗСССЬУ0РССЗЬКЬЗСААЗСЕТЕОО¥СМЗИУК0АРСКСЬЕИУЗО13ИЖ1СКТ</p>
<p>ΗΥνϋ3νΚΟ0ΕΤΙ3ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΒΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΟ3ΕΕΗΟ33ΟΕΥΕΟΗΝΟ0ΟΤΕντν</p>
<p>ЗЗАЗТКСРЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКОУЕРЕРУТУЗИНЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗС</p>
<p>ЬУЗЬЗЗУУТУРЗЗЗЬСТОТУЮПУПНКРЗПТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЕЬССРЗУЕ</p>
<p>ΕΕΡΡΚΡΚϋΤΕΜΙ3ΚΤΡΕνΤθνννθν3ΗΕΟΡΕνΚΕΝΝΥνθθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝ3ΤΥΚνν3</p>
<p>УЬТУЬН0ОИЬПСКЕ¥КСКУЗПКАЬРАР1ЕКТ13КАКС0РКЕР0У¥ТЬРРЗКЕЕМТКП0УЗЬТС</p>
<p>ΕνΚΟΕΥΡ3ΟΙΑνΕΝΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ3ΟΟ3ΕΕΕΥ3ΚΕΤνϋΚ3ΚΝ00ΟΝνΕ3Ο3νΜΗΕ</p>
<p>АЬНПНУТОКЗЬЗЬЗРСК</p>
<p>ЗЕО Ю N0:22 (легкая цепь АЬ79)</p>
<p>ОЗУЬТОРРЗАЗСТРСОКУИЗСЗСЗЗЗШСОПУУЗИУООЬРСТАРКЬЫУКОЗОКРЗС УРОКЕЗбЗКЗбТЗАЗГАНЗбЬКЗЕОЕАОУУСОЗУОЗЗЬЗбЗУЕбббТКЬТУЬбОРКАНРТУТЬ Е Ρ Р 3 3 Е Е Ь 07ШКАТ Ь УС Ы 3 ϋ Е Υ Р САУТ νΑΝΚΑϋ С 3 Р УКАС УЕ Т Т К Р 3 КО 3 ΝΝΚ ΥΑΑ3 3 Υ Ь 3 Ь ΤΡΕ0ΚΚ3ΗΚ3Υ3Ο0νΤΗΕΟ3ΤνΕΚΤνΑΡΤΕΟ3</p>
<p>ЗЕО Ю N0:23 (ΟΏ157 Ното зар1епз; ΝΡ_004325)</p>
<p>МАА0ССААЗКЬЬ0ЬЬЬ0ЬЬЬЬЬЬЕЬААССАКАКИКСЕСТЗАНЬКО1ЕЬСКСАЕУКАЬЬ 3ΡΕ0ΚΝΚΝΟΤΑΙΝΕΑΕΚνΑΕΟΚΟΡΟ3νΕΡ3ϋΥΟΕΕΙΝΕ3ΚΗ3ΙΡΚΟΚ3ΕΕΝΕΝ3ΗΕΕνΝ3ΕΑΟ ΝΤΚΚ™ΡΗ3ϋνΗΥΟΚνΑϋΕΗ3ΝΟΚ0ΚΝϋ3ΟΕϋΥ03ΟΡΤ3</p>
<p>ΕΟ0ΕΝΝΡνϋ3ΕΝΚΚΑ3Ι0Υ3ΚΟ33θνΐΗνΜΕΝΟ3ΕΡΤΟΑΥΡΙΚΟΕΕΑΟΥΕΙΡΝΕ0ΚΕΚΙΤΚΙΕ</p>
<p>- 33 029303</p>
<p>1ЖЖНЕ1ССРЫУЕ5ССЕС5МКУЪЕККЪКОМСГ<2¥5С1ЫО¥КРУКЪЪ<2СУОН5ТНРОСАЪК5АА ААТОККАРЗТАТЕОКАСЫ1РЬЕЬУЕАЗКТ0Ь</p>
<p>ЗЕО Ю N0:24 ( Тест 1; вариабельная область тяжелой цепи)</p>
<p>ЕУ0ЬЬЕ5ССС1ЛЛ2РСС5ЬКЬ5САУ5СЕТЕЫ5ЕАМ5ИУК0АРСКСЬЕИУ5А15С5СССТ</p>
<p>ΥΥΑΟ5νΚΟΗΕΤΙ5ΗΟΝ5ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ5ΕΗΑΕΟΤΑνΥΕΟΑΚΟΚΙΕΜΕΟΕΡνΕΟΥΜΟ0ΟΤΕντν5</p>
<p>5</p>
<p>ЗЕО Ю N0:25 (Тест 1; вариабельная область легкой цепи) ЕТУЬТОЗРАТЬЗЬЗРСЕВАТЕЗСВАЗОЗУЗЗУЬАИУООКРСОАРКЬЫУОАЗЕВАТСТ</p>
<p>ΡΑΚΕ5Ο5Ο5ΟΤϋΕΤΕΤΙ55ΕΕΡΕΟΕΑνΥΥΟ00Κ5ΝΝΡΡΤΕΟ0ΟΤΚνΕΙΚΚ</p>
<p>ЗЕО Ю N0:26 (Тест 2; вариабельная область тяжелой цепи) 0У0ЬУ05САЕУАКРСТ5УКЬ5СКА5С¥ТЕТО¥ИМ0ИУК0НРС0СЬЕИ1СТ1¥РСОСОТ</p>
<p>ΟΥΑ0ΚΕ0ΟΚΑΤΕΤΑΟΚ55ΚΤνΥΜΗΕ55ΕΑ5ΕΟ5ΑνΥΥΟΑΗΟϋΥΥΟ5Ν5ΕΟΥΝΟ0ΟΤ5ντν55 ЗЕО Ю N0:27 (Тест 2; вариабельная область легкой цепи) ΟΐνΜΤ05ΗΕ5Μ5Τ5ΕΟΟΡν5ΙΤΟΚΑ50ϋν5ΤννΑΝΥ00ΚΡΟ05ΡΚΚΕΙΥ5Α5ΥΚΥΙθν</p>
<p>ΡϋΗΕΤΟΟΟΑΟΤΟΕΤΕΤΙΟΟνΟΑΕΟΕΑνΥΥΟΟΟΗΥΟΡΡΥΤΕΟΟΟΤΚΕΕΙΚΗ ЗЕО Ю N0:28 (тяжелая цепь АЬ43)</p>
<p>ЕУ0ЬЬЕ5ССС1ЛЛ2РСС5ЬКЬ5САА5СЕТЕ55¥СМНИУК0АРСКСЬЕИУ5К1ЖОС55Т</p>
<p>ЗУАОЗМКСОЕТТЗКОЖКЖТАЬОМЖЬВАЕОТАУУУСАКССУУУУАМОУИСОСТЬУТУЗЗАЗ</p>
<p>ТКСРЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЕУКОУЕРЕРУТУЗИЕЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСТАЗЬ</p>
<p>55νντνΡ555ΕΟΤ0ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ5ΝΤΚνϋΚΚνΕΡΚ5ΟΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕΕΕΟΟΡ5νΕΕΕΡΡ</p>
<p>ΚΡΚΟΤΕΜΙ5ΚΤΡΕνΤθνννθν5ΗΕΟΡΕνΚΕΝΝΥνθθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ5ΤΥΚνν5νΕΤν</p>
<p>ΕΗΟϋΝΕΝΟΚΕΥΚΟΚνΟΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙΟΚΑΚΟΟΡΗΕΡΟνΥΤΕΡΡΟΗΕΕΜΤΚΝΟνΟΕΤΟΕνΚΟ</p>
<p>ΕΥΡ5ϋΙΑνΕΝΕ5ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ5ΟΟ5ΕΕΕΥ5ΚΕΤνθΚ5ΗΝ00ΟΝνΕ5Ο5λ/ΜΗΕΑΕΗΝ</p>
<p>НУТОКЗЬЗЬЗРСК</p>
<p>ЗЕО Ю N0:29 (легкая цепь АЬ43)</p>
<p>03νΕΤ0ΡΡ3Α3ΟΤΡΟ0ΡνΤΙ3Ο3ΟΟ33ΝΙΟΥΚΤνΝΝΥ00ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΙΥΌΝΝΚΡΡ3Ο</p>
<p>УРОКЕЗСЗКЗСТЗАЗЬАТЗСЬКЗЕОЕАОУУСААИООЗЬЖЗЬУЕСССТКЬТУЬСОРКАдаТУТЬ ΕΡР33ΕЕЬ0ΑΝΚΑΤЬУСЫ3ϋΕΥРСАУТνΑΝΚΑϋ03РУКАСУЕΤТКР3КО3ΝΝΚΥΑΑ33ΥЬ3Ь ΤΡΕ0ΝΚ3ΗΚ3Υ3Ο0νΤΗΕΟ3ΤνΕΚΤνΑΡΤΕΟ3</p>
<p>ЗЕО Ю N0:30 (тяжелая цепь АЬ72)</p>
<p>ЕУОЬЬЕЗСССЬУОРССЗЬКЬЗСААЗСЕТЕЗЗУСМЕИУКОАРСКСЬЕИУЗСТЗСЗССЗТ</p>
<p>ΥΥΑΟ3νΚΟΚΕΤΙ3ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΟ3ΝΥΟΕΝ3ΟΥΥΥΟΜθνΝΟ0ΟΤΕν</p>
<p>ТУЗЗАЗТКСРЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКОУЕРЕРУТУЗШГЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗ</p>
<p>3ΟΕΥ3Ε33νντνΡ333ΕΟΤ0ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ3ΝΤΚνϋΚΚνΕΡΚ3ΟΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕΕΕΟΟΡ3</p>
<p>νΕΕΕΡΡΚΡΚϋΤΕΜΙ3ΚΤΡΕνΤθνννθν3ΗΕΟΡΕνΚΕΝΝΥνθθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝ3ΤΥΚν</p>
<p>УЗУЬТУЬНООИЬЖЖЕУКСКУЗШСАЕРАРТЕКТТЗКАКСОРКЕРОУУТЬРРЗКЕЕМТ^ОУЗЬ</p>
<p>- 34 029303</p>
<p>ТСЪУКСЕУРЗО1АУЕИЕЗЕС0РЕЕЕУКТТРРУЪОЗОСЗЕЕЪУЗКЪТУОКЗНИ00СЕУЕЗСЗУМ</p>
<p>НЕАЫШНУТОКЗЪЗЪЗРСК</p>
<p>5Е<2 Ю N0:31 (легкая цепь АЪ72)</p>
<p>ОЗУЪТОРРЗАЗСТРСОНУТТЗСЗСЗЗЗЫЮЗКТУЗИУООЪРСТАРКЪЫУОЫЫКНРЗС УРОКЕЗСЗКЗСТЗАЗЪА13СЪКЗЕОЕАОУУСЗЗУААКЗТШ1ЕСССТКЪТУЪС<2РКАиРТУТЪ Е Ρ Р 3 3 Е Е Ъ 0ΑΝΚΑΤ Ъ УС Ъ13 ϋ Е У Р САУТ νΑΜΚΑϋ С 3 Р УКАС УЕ Τ Т К Р 3 К<2 3 ΝΝΚ ΥΑΑ3 3 У Ъ 3 Ъ ТРЕ<2ИКЗНКЗУЗС<2УТНЕСЗТУЕКТУАРТЕСЗ</p>
<p>ЗЕ<2 Ю N0:32 (тяжелая цепь АЫ10)</p>
<p>ЕУ0ЪЪЕЗСССЪУ0РССЗЪКЪЗСААЗСЕТЕЗЗУСМНИУК<2АРСКСЪЕИУЗ 11УЗССЗТУ УАОЗУК6КЕТ13КОЕЗКЕТЪУИ2МЕЗЪКАЕОТАУУУСАККАТИ66АТНОУИ6(26ТЪУТУЗЗАЗ ТКСРЗУЕРЪАРЗЗКЗТЗССТААЪССЪУКОУЕРЕРУТУЗИЕЗСАЪТЗСУНТЕРАУЪОЗЗСЪУЗЪ ЗЗУУТУРЗЗЗЪСТ<2ТУ1СЕУЕНКРЗЕТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЪЪССРЗУЕЪЕРР ΚΡΚϋΤΕΜΙ3ΚΤΡΕνΤ0ννν0ν3ΗΕ0ΡΕνΚΕΝΝΥν00νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ<2ΥΝ3ΤΥΚνν3νΕΤν ЪН0ОИЪЕСКЕУКСКУЗЕКАЪРАР1ЕКТ13КАКС0РКЕР<2УУТЪРРЗКЕЕМТКЕ<2УЗЪТСЪУКС ЕУРЗО1АУЕИЕЗЖЗ<2РЕЕЕУКТТРРУЪОЗОСЗЕЕЪУЗКЪТУОКЗКИ<2<2СЕУЕЗСЗУМНЕАЪНЕ НУТОКЗЪЗЪЗРСК</p>
<p>ЗЕ<2 Ю N0:33 (легкая цепь АЫ10)</p>
<p><23νΕΤ<2ΡΡ3Α3ΟΤΡΟ<2ΚνΤΙ3Ο3Ο333ΝΙΟ3ΝΤνΝΝΥ<2<2ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΙΥΚΝΝ<2ΚΡ3Ο УРОКЕЗСЗК36ТЗАЗЪА136ЪКЗЕОЕАОУУСАТ№ООЗ]Ш6УЪЕ666ТКЪТУЪ6(2РКЕШРТУТЪ Е Ρ Р 3 3 Е Е Ъ 0ΑΝΚΑΤ Ъ УС Ъ13 ϋ Е Υ Р САУТ УАИКАО С 3 РУКАС УЕ Τ Т К Р 3 К<2 3 ΝΝΚ ΥΑΑ3 3 Υ Ъ 3 Ъ ТРЕ<2ИКЗНКЗУЗС<2УТНЕСЗТУЕКТУАРТЕСЗ</p>
<p>ЗЕ<2 Ю N0:34 (тяжелая цепь АЫ9) с константой</p>
<p>ЕУ<2ЪЪЕЗСССЪУ<2РССЗЪКЪЗСААЗСЕТЕЕЕУОМТИУК<2АРСКСЪЕИУАУ13УОСЗОК</p>
<p>ОУАОЗУКСКЕТ13КОЕЗКЕТЪУЪ0МЕЗЪКАЕОТАУУУСАКУУУУСЕЗСРЗМОУИС<2СТЪУТУЗ</p>
<p>ЗАЗТКСРЗУЕРЪАРЗЗКЗТЗССТААЪССЪУКОУЕРЕРУТУЗИЕЗСАЪТЗСУНТЕРАУЪОЗЗСЪ</p>
<p>УЗЪЗЗУУТУРЗЗЗЪСТ<2ТУ1СЕУЕНКРЗЕТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЪЪССРЗУЕЪ</p>
<p>ΕΡΡΚΡΚϋΤΕΜΙ3ΚΤΡΕνΤ0ννν0ν3ΗΕ0ΡΕνΚΕΝΝΥν00νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ<2ΥΝ3ΤΥΚνν3ν</p>
<p>ЪТУЪН0ОИЪЖЖЕУКСКУЗЕКАЪРАР1ЕКТ13КАКС<2РКЕР<2УУТЪРРЗКЕЕМТКЕ<2УЗЪТСЪ</p>
<p>УКСЕУРЗО1АУЕИЕЗЕС<2РЕЕЕУКТТРРУЪОЗОСЗЕЕЪУЗКЪТУОКЗКИ<2<2СЕУЕЗСЗУМНЕА</p>
<p>ЪНЕНУТОКЗЪЗЪЗРСК</p>
<p>ЗЕ<2 Ю N0:35 (легкая цепь АЫ9) с константой</p>
<p><23νΕΤ<2ΡΡ3Α3ΟΤΡΟ<2ΚνΤΙ3Ο3Ο3Ν3ΝΙΟ3ΝΤνΝΝΥ<2<2ΕΡΟΤΑΡΚΙΑΙΥ3Ο3ΝΚΡ3Ο УРОКЕЗСЗКЗСТЗАЗЪА13СЪКЗЕОЕАОУУС<23УОЗЗЪЗСЗКУЕСССТКЪТУЪС<2РКАиРТУТ Ъ Е Ρ Р 3 3 Е Е Ъ 0ΑΝΚΑΤ Ъ УС Ъ13 ϋ Е Υ Р САУТ УАИКАР С 3 РУКАС УЕ Τ Т К Р 3 К<2 3 ΝΝΚ ΥΑΑ3 3 Υ Ъ 3 ЪТРЕ<2ИКЗНКЗУЗС<2УТНЕСЗТУЕКТУАРТЕСЗ</p>
<p>Данное описание изобретения подробно и имеет ссылки на конкретные варианты его воплощения, должно быть понятным, что возможны модификации и изменения, не выходящие за объем настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. В частности, хотя некоторые аспекты изобретения определены здесь как особенно предпочтительные, предполагается, что настоящее изобретение не ограничивается этими конкретными аспектами изобретения.</p>
<p>- 35 029303</p>
<p>Список последовательностей</p>
<p><110> ТакеНа РНагтасеиЫса1 Сотрапу ЫтаЬеН ЕНаз, КаЬН1ееп А.</p>
<p>ЬапНез, Сгедогу ЗапдН, ЗНиеЬа Когуег, ИоиЬег Огаке, АпНгеи И.</p>
<p>Наак-ЕгепНзсНо, Магу Зпе11, Суогду Р.</p>
<p>ВНазкаг, Уапау</p>
<p><120> АНТИТЕЛА К СО38</p>
<p><130> 101588-5005-ΝΟ</p>
<p><140> Заявка на изобретение РСТ Νο. будет назначен <141> 2011-12-30</p>
<p><150> 61/428,699</p>
<p><151> 2010-12-30</p>
<p><150> 61/470,382</p>
<p><151> 2011-03-31</p>
<p><150> 61/470,406</p>
<p><151> 2011-03-31</p>
<p><150> 61/485,104</p>
<p><151> 2011-05-11</p>
<p><160> 35</p>
<p><170> Патентная версия 3.5</p>
<p><210> 1</p>
<p><211></p>
<p><212></p>
<p>300</p>
<p>БЕЛОК</p>
<p><213> Ното зараепз</p>
<p><400> 1</p>
<p>Мер А1а Азп Суз С1и РНе Зег Рго Уа1 Зег С1у Азр Ьуз Рго Суз Суз</p>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Агд Ьеи Зег Агд Агд А1а С1п Ьеи Суз Ьеи С1у Уа1 Зег Не Ьеи Уа1 20 25 30</p>
<p>Ьеи 11е Ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи А1а Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд Тгр Агд С1п 35 40 45</p>
<p>С1п Тгр Зег С1у Рго С1у ТНг ТНг Ьуз Агд РНе Рго С1и ТНг Уа1 Ьеи 50 55 60</p>
<p>А1а Агд Суз Уа1 Ьуз Туг ТНг С1и 11е Низ Рго С1и МеЬ Агд Низ Уа1 65 70 75 80</p>
<p>- 36 029303</p>
<p>Азр Суз С1п Зег Уа1 Тгр Азр А1а РНе Ьуз С1у А1а РНе 11е Зег Ьуз 85 90 95</p>
<p>Наз Рго Суз Азп 11е ТНг С1и С1и Азр Туг С1п Рго Ьеи МеЬ Ьуз Ьеи 100 105 110</p>
<p>С1у ТНг С1п ТНг Уа1 Рго Суз Азп Ьуз 11е Ьеи Ьеи Тгр Зег Агд 11е 115 120 125</p>
<p>Ьуз Азр Ьеи А1а Н1з С1п РНе ТНг С1п Уа1 С1п Агд Азр МеЬ РНе ТНг 130 135 140</p>
<p>Ьеи С1и Азр ТНг Ьеи Ьеи С1у Туг Ьеи А1а Азр Азр Ьеи ТНг Тгр Суз 145 150 155 160</p>
<p>С1у С1и РНе Азп ТНг Зег Ьуз Не Азп Туг С1п Зег Суз Рго Азр Тгр 165 170 175</p>
<p>Агд Ьуз Азр Суз Зег Азп Азп Рго Уа1 Зег Уа1 РНе Тгр Ьуз ТНг Уа1 180 185 190</p>
<p>Зег Агд Агд РНе А1а С1и А1а А1а Суз Азр Уа1 Уа1 Шз Уа1 МеЬ Ьеи 195 200 205</p>
<p>Азп С1у Зег Агд Зег Ьуз 11е РНе Азр Ьуз Азп Зег ТНг РНе С1у Зег 210 215 220</p>
<p>Уа1 С1и Уа1 Шз Азп Ьеи С1п Рго С1и Ьуз Уа1 Е1п ТНг Ьеи С1и А1а 225 230 235 240</p>
<p>Тгр Уа1 11е Шз С1у С1у Агд С1и Азр Зег Агд Азр Ьеи Суз С1п Азр 245 250 255</p>
<p>Рго ТНг 11е Ьуз С1и Ьеи С1и Зег 11е 11е Зег Ьуз Агд Азп 11е С1п 260 265 270</p>
<p>РНе Зег Суз Ьуз Азп 11е Туг Агд Рго Азр Ьуз РНе Ьеи С1п Суз Уа1 275 280 285</p>
<p>Ьуз Азп Рго С1и Азр Зег Зег Суз ТНг Зег С1и 11е 290 295 300</p>
<p><210> 2</p>
<p><211> 301</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Масаса Ьазс1си1аг1з</p>
<p>- 37 029303</p>
<p><400> 2</p>
<p>Меб А1а Азп Суз С1и РНе Зег Рго Уа1 Зег С1у Азр Ьуз Рго Суз Суз 15 10 15</p>
<p>Агд Ьеи Зег Агд Агд А1а С1п Уа1 Суз Ьеи С1у Уа1 Суз Ьеи Ьеи Уа1 20 25 30</p>
<p>Ьеи Ьеи Не Ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 А1а Уа1 Уа1 Ьеи Рго Агд Тгр Агд 35 40 45</p>
<p>С1п С1п Тгр Зег С1у Зег С1у ТНг ТНг Зег Агд РНе Рго С1и ТНг Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьеи А1а Агд Суз Уа1 Ьуз Туг ТНг С1и Уа1 Шз Рго С1и МеЬ Агд Шз 65 70 75 80</p>
<p>Уа1 Азр Суз С1п Зег Уа1 Тгр Азр А1а РНе Ьуз С1у А1а РНе 11е Зег 85 90 95</p>
<p>Ьуз Туг Рго Суз Азп 11е ТНг С1и С1и Азр Туг С1п Рго Ьеи Уа1 Ьуз 100 105 110</p>
<p>Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Уа1 Рго Суз Азп Ьуз ТНг Ьеи Ьеи Тгр Зег Агд 115 120 125</p>
<p>11е Ьуз Азр Ьеи А1а Шз С1п РНе ТНг С1п Уа1 С1п Агд Азр МеЬ РНе 130 135 140</p>
<p>ТНг Ьеи С1и Азр МеЬ Ьеи Ьеи С1у Туг Ьеи А1а Азр Азр Ьеи ТНг Тгр 145 150 155 160</p>
<p>Суз С1у С1и РНе Азп ТНг РНе С1и 11е Азп Туг С1п Зег Суз Рго Азр 165 170 175</p>
<p>Тгр Агд Ьуз Азр Суз Зег Азп Азп Рго Уа1 Зег Уа1 РНе Тгр Ьуз ТНг 180 185 190</p>
<p>Уа1 Зег Агд Агд РНе А1а С1и ТНг А1а Суз С1у Уа1 Уа1 Шз Уа1 МеЬ 195 200 205</p>
<p>Ьеи Азп С1у Зег Агд Зег Ьуз 11е РНе Азр Ьуз Азп Зег ТНг РНе С1у 210 215 220</p>
<p>Зег Уа1 С1и Уа1 Шз Азп Ьеи С1п Рго С1и Ьуз Уа1 С1п А1а Ьеи С1и 225 230 235 240</p>
<p>- 38 029303</p>
<p>А1а Тгр Уа1 11е Низ С1у С1у Агд С1и Азр Зег Агд Азр Ьеи Суз С1п 245 250 255</p>
<p>Азр Рго ТЬг 11е Ьуз С1и Ьеи С1и Зег 11е Ые Зег Ьуз Агд Азп 11е 260 265 270</p>
<p>Агд РЬе РЬе Суз Ьуз Азп 11е Туг Агд Рго Азр Ьуз РЬе Ьеи С1п Суз 275 280 285</p>
<p>Уа1 Ьуз Азп Рго С1и Азр Зег Зег Суз Ьеи Зег С1у 11е 290 295 300</p>
<p><210> 3</p>
<p><211> 8</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Тяжелая Цепь СЬК1</p>
<p><400> 3</p>
<p>С1у РЬе ТЬг РЬе Азр Азр Туг С1у 1 5</p>
<p><210> 4</p>
<p><211> 8</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Тяжелая Цепь СЬК2</p>
<p><400> 4</p>
<p>11е Зег Тгр Азп С1у С1у Ьуз ТЬг 1 5</p>
<p><210> 5</p>
<p><211> 16</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Тяжелая Цепь СЬКЗ</p>
<p><400> 5</p>
<p>А1а Агд С1у Зег Ьеи РЬе Низ Азр Зег Зег С1у РЬе Туг РЬе С1у Низ 15 10 15</p>
<p><210> 6</p>
<p>- 39 029303</p>
<p><211> 8</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Легкая Цепь СЬК1</p>
<p><400> 6</p>
<p>Зег Зег Азп 11е С1у Азр Азп Туг 1 5</p>
<p><210> 7</p>
<p><211> 3</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Легкая Цепь ΟϋΚ2</p>
<p><400> 7</p>
<p>Агд Азр Зег</p>
<p>1</p>
<p><210> 8</p>
<p><211> 10</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Легкая Цепь СЬКЗ</p>
<p><400> 8</p>
<p>Е1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи Зег С1у Зег 15 10</p>
<p>- 40 029303</p>
<p>Зег Азр 11е Зег Тгр Азп С1у С1у Ьуз ТНг Нтз Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у С1п РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд С1у Зег Ьеи РНе Нтз Азр Зег Зег С1у РНе Туг РНе С1у Нтз ТОО 105 110</p>
<p>Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у 115 120 125</p>
<p>Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а 130 135</p>
<p><210> 10</p>
<p><211> 129</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Легкая Цепь Вариабельного Участка</p>
<p><400> 10</p>
<p>С1п Зег Уа1 Беи ТНг С1п Рго Рго Зег АТа Зег С1у ТНг Рго С1у С1п</p>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Агд Уа1 ТНг 11е Зег Суз Зег С1у Зег Зег Зег Азп 11е С1у Азр Азп 20 25 30</p>
<p>Туг Уа1 Зег Тгр Туг С1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>11е Туг Агд Азр Зег С1п Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи 85 90 95</p>
<p>Зег С1у Зег Уа1 РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи С1у СТп</p>
<p>- 41 029303</p>
<p>НО</p>
<p>100</p>
<p>105</p>
<p>Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег С1и С1и 115 120 125</p>
<p>Ьеи</p>
<p><210> 11</p>
<p><211> 134</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ9 Тяжелая Цепь</p>
<p><400> 11</p>
<p>С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у О1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Азп Азп Туг 20 25 30</p>
<p>Азр МеН ТНг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>А1а Уа1 11е Зег Туг Азр С1у Зег Азр Ьуз Азр Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд Уа1 Туг Туг Туг С1у РНе Зег С1у Рго Зег МеН Азр Уа1 Тгр 100 105 110</p>
<p>С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго 115 120 125</p>
<p>Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а 130</p>
<p><210> 12</p>
<p><211> 130</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p>- 42 029303</p>
<p><220></p>
<p><223> АН19 Легкая Цепь</p>
<p><400> 12</p>
<p>С1п Зег Ла1 Ьеи ТНг С1п Рго Рго Зег А1а Зег С1у ТНг Рго О1у Θΐη 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТНг Не Зег Суз Зег б1у Зег Азп Зег Азп 11е С1у Зег Азп 20 25 30</p>
<p>ТНг Уа1 Азп Тгр Туг С1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>Не Туг Зег Азр Зег Азп Агд Рго Зег О1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег О1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а Не Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр О1и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи 85 90 95</p>
<p>Зег С1у Зег Агд Уа1 РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи С1у 100 105 110</p>
<p>С1п Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег С1и 115 120 125</p>
<p>С1и Ьеи 130</p>
<p><210> 13</p>
<p><211> 8</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ9 Тяжелая Цепь СЦК1</p>
<p><400> 13</p>
<p>С1у РНе ТНг РНе Азп Азп Туг Азр</p>
<p><210></p>
<p><211></p>
<p><212></p>
<p><213></p>
<p>14</p>
<p>8</p>
<p>БЕЛОК</p>
<p>Искусственная последовательность</p>
<p>- 43 029303</p>
<table border="1">
<tr><td>
<220>
<223></td><td>
АЫ9 Тяжелая Цепь СЬК2</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
14</td></tr>
</table>
<p>11е Зег Туг Азр С1у Зег Азр Ьуз</p>
<table border="1">
<tr><td>
1</td><td>
5</td></tr>
<tr><td>
<210>
<211>
<212>
<213></td><td>
15
15
БЕЛОК
Искусственная последовательность</td></tr>
</table>
<table border="1">
<tr><td>
<220>
<223></td><td>
АЫ9 Тяжелая Цепь СЬКЗ</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
15</td></tr>
</table>
<p>А1а Агд Уа1 Туг Туг Туг С1у РЬе Зег С1у Рго Зег МеЬ Азр Уа1 15 10 15</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210>
<211>
<212>
<213></td><td>
16
8
БЕЛОК
Искусственная последовательность</td></tr>
</table>
<table border="1">
<tr><td>
<220>
<223></td><td>
АЫ9 Легкая Цепь ΟϋΚΐ</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
16</td></tr>
</table>
<p>Азп Зег Азп 11е С1у Зег Азп ТЬг</p>
<table border="1">
<tr><td>
1</td><td>
5</td></tr>
<tr><td>
<210>
<211>
<212>
<213></td><td>
17
3
БЕЛОК
Искусственная последовательность</td></tr>
</table>
<table border="1">
<tr><td>
<220>
<223></td><td>
АЫ9 Легкая Цепь ΟϋΚ2</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
17</td></tr>
</table>
<p>Зег Азр Зег 1</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210>
<211>
<212>
<213></td><td>
18
11
БЕЛОК
Искусственная последовательность</td></tr>
</table>
<table border="1">
<tr><td>
<220>
<223></td><td>
АЫ9 Легкая Цепь ΟϋΚ3</td></tr>
<tr><td>
<40 0></td><td>
18</td></tr>
</table>
<p>- 44 029303</p>
<p>Е1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи Зег Е1у Зег Агд 15 10</p>
<p><210> 19</p>
<p><211> 452</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ9 Тяжелая Цепь</p>
<p><400> 19</p>
<p>С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у 1 5</p>
<p>Е1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 10 15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а 20</p>
<p>Зег С1у РНе ТНг РНе Азп Азп Туг 25 30</p>
<p>Азр МеЬ ТЬг Тгр Уа1 Агд С1п А1а 35 40</p>
<p>Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 45</p>
<p>А1а Уа1 11е Зег Туг Азр С1у Зег 50 55</p>
<p>Азр Ьуз Азр Туг А1а Азр Зег Уа1 60</p>
<p>Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд 65 70</p>
<p>Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 85</p>
<p>Е1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 90 95</p>
<p>А1а Агд Уа1 Туг Туг Туг С1у РЬе 100</p>
<p>Зег С1у Рго Зег МеЬ Азр Уа1 Тгр 105 110</p>
<p>С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 115 120</p>
<p>Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго 125</p>
<p>Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег 130 135</p>
<p>Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у С1у ТЬг 140</p>
<p>А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз 145 150</p>
<p>Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг 155 160</p>
<p>Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи 165</p>
<p>ТЬг Зег С1у Уа1 Нтз ТЬг РЬе Рго 170 175</p>
<p>А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи 180</p>
<p>Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг 185 190</p>
<p>- 45 029303</p>
<p>- 46 029303</p>
<p>МеЕ Ηΐ5 С1и А1а Ьеи Н15 Азп Н13 Туг Тпг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи 435 440 445</p>
<p>Зег Рго С1у Ьуз 450</p>
<p><210> 20</p>
<p><211> 217</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ9 Легкая Цепь</p>
<p><400> 20</p>
<p>С1п Зег Уа1 Ьеи ТЬг С1п Рго Рго Зег А1а Зег С1у ТЬг Рго С1у С1п 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Зег С1у 20</p>
<p>Зег Азп Зег Азп 11е С1у Зег Азп 25 30</p>
<p>ТЬг Уа1 Азп Тгр Туг С1п С1п Ьеи 35 40</p>
<p>Рго С1у ТЬг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 45</p>
<p>11е Туг Зег Азр Зег Азп Агд Рго 50 55</p>
<p>Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТЬг Зег А1а 65 70</p>
<p>Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг 85</p>
<p>Суз С1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи 90 95</p>
<p>Зег С1у Зег Агд Уа1 РЬе С1у С1у 100</p>
<p>С1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи С1у 105 110</p>
<p>С1п Рго Ьуз А1а Азп Рго ТЬг Уа1 115 120</p>
<p>ТЬг Ьеи РЬе Рго Рго Зег Зег С1и 125</p>
<p>С1и Ьеи С1п А1а Азп Ьуз А1а ТЬг 130 135</p>
<p>Ьеи Уа1 Суз Ьеи 11е Зег Азр РЬе 140</p>
<p>Туг Рго С1у А1а Уа1 ТЬг Уа1 А1а 145 150</p>
<p>Тгр Ьуз А1а Азр С1у Зег Рго Уа1 155 160</p>
<p>Ьуз А1а С1у Уа1 С1и ТЬг ТЬг Ьуз 165</p>
<p>Рго Зег Ьуз С1п Зег Азп Азп Ьуз 170 175</p>
<p>- 47 029303</p>
<p>Туг А1а А1а Зег Зег Туг Ьеи Зег Ьеи ТНг Рго С1и С1п Тгр Ьуз Зег 180 185 190</p>
<p>Низ Агд Зег Туг Зег Суз С1п Уа1 ТНг Низ С1и С1у Зег ТНг Уа1 С1и 195 200 205</p>
<p>Ьуз ТНг Уа1 А1а Рго ТНг С1и Суз Зег 210 215</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210></td><td>
21</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<211></td><td>
453</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<212></td><td>
БЕЛОК</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<213></td><td>
Искусственная</td><td>
последовательность</td></tr>
<tr><td>
<220></td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<223></td><td>
АЬ79 Тяжелая</td><td>
Цепь</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
21</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1и Уа1</td><td>
С1п Ьеи Ьеи</td><td>
С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у</td></tr>
</table>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Азр Азр Туг 20 25 30</p>
<p>С1у МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>Зег Азр 11е Зег Тгр Азп С1у С1у Ьуз ТНг Низ Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у С1п РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд С1у Зег Ьеи РНе Низ Азр Зег Зег С1у РНе Туг РНе С1у Низ 100 105 110</p>
<p>Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у 115 120 125</p>
<p>Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у 130 135 140</p>
<p>ТНг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 145 150 155 160</p>
<p>- 48 029303</p>
<p>ТНг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 Низ ТНг РНе 165 170 175</p>
<p>Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 180 185 190</p>
<p>ТНг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг Не Суз Азп Уа1 195 200 205</p>
<p>Азп Низ Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз 210 215 220</p>
<p>Зег Суз Азр Ьуз ТНг Низ ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи 225 230 235 240</p>
<p>Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг 245 250 255</p>
<p>Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 260 265 270</p>
<p>Зег Низ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 275 280 285</p>
<p>С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег 290 295 300</p>
<p>ТНг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи 305 310 315 320</p>
<p>Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а 325 330 335</p>
<p>Рго 11е С1и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго 340 345 350</p>
<p>С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеЬ ТНг Ьуз Азп С1п 355 360 365</p>
<p>Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а 370 375 380</p>
<p>Уа1 С1и Тгр С1и Зег 385</p>
<p>Азп</p>
<p>390</p>
<p>С1у</p>
<p>С1п Рго</p>
<p>С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг 395</p>
<p>ТНг</p>
<p>400</p>
<p>- 49 029303</p>
<p>Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр Е1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи 405 410 415</p>
<p>ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр Е1п Е1п Е1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег 420 425 430</p>
<p>Уа1 МеЬ Нгз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег 435 440 445</p>
<p>Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 450</p>
<p><210> 22</p>
<p><211> 216</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ79 Легкая Цепь</p>
<p><400> 22</p>
<p>С1п Зег Уа1 Ьеи ТНг Е1п Рго Рго Зег А1а Зег С1у ТНг Рго С1у С1п 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТНг Не Зег Суз Зег С1у Зег Зег Зег Азп 11е С1у Азр Азп 20 25 30</p>
<p>Туг Уа1 Зег Тгр Туг Е1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>11е Туг Агд Азр Зег С1п Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Е1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи 85 90 95</p>
<p>Зег Е1у Зег Уа1 РНе Е1у Е1у Е1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Е1у Е1п 100 105 110</p>
<p>Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег Е1и Е1и 115 120 125</p>
<p>Ьеи Е1п А1а Азп Ьуз А1а ТНг Ьеи Уа1 Суз Ьеи 11е Зег Азр РНе Туг 130 135 140</p>
<p>- 50 029303</p>
<table border="1">
<tr><td>
Рго
145</td><td>
С1у</td><td>
А1а</td><td>
Уа1</td><td>
ТЪг</td><td>
Уа1
150</td><td>
А1а</td><td>
Тгр</td><td>
Ьуз</td><td>
А1а</td><td>
Азр
155</td><td>
С1у</td><td>
Зег</td><td>
Рго</td><td>
Уа1</td><td>
Ьуз
160</td></tr>
<tr><td>
А1а</td><td>
С1у</td><td>
Уа1</td><td>
С1и</td><td>
ТЪг</td><td>
ТЪг</td><td>
Ьуз</td><td>
Рго</td><td>
Зег</td><td>
Ьуз</td><td>
С1п</td><td>
Зег</td><td>
Азп</td><td>
Азп</td><td>
Ьуз</td><td>
Туг</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
165</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
170</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
175</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
Зег</td><td>
Зег</td><td>
Туг</td><td>
Ьеи</td><td>
Зег</td><td>
Ьеи</td><td>
ТЪг</td><td>
Рго</td><td>
С1и</td><td>
С1п</td><td>
Тгр</td><td>
Ьуз</td><td>
Зег</td><td>
Наз</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
180</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
185</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
190</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Агд</td><td>
Зег</td><td>
Туг</td><td>
Зег</td><td>
Суз</td><td>
С1п</td><td>
Уа1</td><td>
ТЪг</td><td>
Наз</td><td>
С1и</td><td>
С1у</td><td>
Зег</td><td>
ТЪг</td><td>
Уа1</td><td>
С1и</td><td>
Ьуз</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
195</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
200</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
205</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
ТЪг</td><td>
Уа1</td><td>
А1а</td><td>
Рго</td><td>
ТЪг</td><td>
С1и</td><td>
Суз</td><td>
Зег</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
210</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
215</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td colspan="2">
<210></td><td>
23</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td colspan="2">
<211></td><td>
318</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td colspan="2">
<212></td><td colspan="2">
БЕЛОК</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td colspan="2">
<213></td><td>
Ното</td><td colspan="2">
зартепз</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td colspan="2">
<400></td><td>
23</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
МеЪ</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
С1п</td><td>
С1у</td><td>
Суз</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
Зег</td><td>
Агд</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
С1п</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td></tr>
<tr><td>
1</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
5</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
10</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
15</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1п</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
С1у</td><td>
С1у</td><td>
А1а</td><td>
Агд</td><td>
А1а</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
20</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
25</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
30</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Агд</td><td>
Тгр</td><td>
Агд</td><td>
С1у</td><td>
С1и</td><td>
С1у</td><td>
ТЪг</td><td>
Зег</td><td>
А1а</td><td>
Наз</td><td>
Ьеи</td><td>
Агд</td><td>
Азр</td><td>
11е</td><td>
РЪе</td><td>
Ьеи</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
35</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
40</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
45</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1у</td><td>
Агд</td><td>
Суз</td><td>
А1а</td><td>
С1и</td><td>
Туг</td><td>
Агд</td><td>
А1а</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Зег</td><td>
Рго</td><td>
С1и</td><td>
С1п</td><td>
Агд</td><td>
Азп</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
50</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
55</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
60</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Ьуз</td><td>
Азп</td><td>
Суз</td><td>
ТЪг</td><td>
А1а</td><td>
11е</td><td>
Тгр</td><td>
С1и</td><td>
А1а</td><td>
РЪе</td><td>
Ьуз</td><td>
Уа1</td><td>
А1а</td><td>
Ьеи</td><td>
Азр</td><td>
Ьуз</td></tr>
<tr><td>
65</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
70</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
75</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
80</td></tr>
<tr><td>
Азр</td><td>
Рго</td><td>
Суз</td><td>
Зег</td><td>
Уа1</td><td>
Ьеи</td><td>
Рго</td><td>
Зег</td><td>
Азр</td><td>
Туг</td><td>
Азр</td><td>
Ьеи</td><td>
РЪе</td><td>
11е</td><td>
Азп</td><td>
Ьеи</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
85</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
90</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
95</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Зег</td><td>
Агд</td><td>
Наз</td><td>
Зег</td><td>
11е</td><td>
Рго</td><td>
Агд</td><td>
Азр</td><td>
Ьуз</td><td>
Зег</td><td>
Ьеи</td><td>
РЪе</td><td>
Тгр</td><td>
С1и</td><td>
Азп</td><td>
Зег</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
100</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
105</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
110</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Наз</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
Уа1</td><td>
Азп</td><td>
Зег</td><td>
РЪе</td><td>
А1а</td><td>
Азр</td><td>
Азп</td><td>
ТЪг</td><td>
Агд</td><td>
Агд</td><td>
РЪе</td><td>
МеЪ</td><td>
Рго</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
115</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
120</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
125</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
</table>
<p>- 51 029303</p>
<table border="1">
<tr><td>
Ьеи</td><td>
Зег
130</td><td>
Азр</td><td>
Уа1</td><td>
Ьеи</td><td>
Туг</td><td>
С1у
135</td><td>
Агд</td><td>
Уа1</td><td>
А1а</td><td>
Азр</td><td>
РНе
140</td><td>
Ьеи</td><td>
Зег</td><td>
Тгр</td><td>
Суз</td></tr>
<tr><td>
Агд</td><td>
С1п</td><td>
Ьуз</td><td>
Азп</td><td>
Азр</td><td>
Зег</td><td>
С1у</td><td>
Ьеи</td><td>
Азр</td><td>
Туг</td><td>
С1п</td><td>
Зег</td><td>
Суз</td><td>
Рго</td><td>
ТНг</td><td>
Зег</td></tr>
<tr><td>
145</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
150</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
155</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
160</td></tr>
<tr><td>
С1и</td><td>
Азр</td><td>
Суз</td><td>
С1и</td><td>
Азп</td><td>
Азп</td><td>
Рго</td><td>
Уа1</td><td>
Азр</td><td>
Зег</td><td>
РНе</td><td>
Тгр</td><td>
Ьуз</td><td>
Агд</td><td>
А1а</td><td>
Зег</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
165</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
170</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
175</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Ые</td><td>
С1п</td><td>
Туг</td><td>
Зег</td><td>
Ьуз</td><td>
Азр</td><td>
Зег</td><td>
Зег</td><td>
С1у</td><td>
Уа1</td><td>
Ые</td><td>
Низ</td><td>
Уа1</td><td>
МеЬ</td><td>
Ьеи</td><td>
Азп</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
180</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
185</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
190</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1у</td><td>
Зег</td><td>
С1и</td><td>
Рго</td><td>
ТНг</td><td>
С1у</td><td>
А1а</td><td>
Туг</td><td>
Рго</td><td>
Ые</td><td>
Ьуз</td><td>
С1у</td><td>
РНе</td><td>
РНе</td><td>
А1а</td><td>
Азр</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
195</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
200</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
205</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Туг</td><td>
С1и</td><td>
Ые</td><td>
Рго</td><td>
Азп</td><td>
Ьеи</td><td>
С1п</td><td>
Ьуз</td><td>
С1и</td><td>
Ьуз</td><td>
Ые</td><td>
ТНг</td><td>
Агд</td><td>
Ые</td><td>
С1и</td><td>
Ые</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
210</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
215</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
220</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Тгр</td><td>
Уа1</td><td>
МеЬ</td><td>
Низ</td><td>
С1и</td><td>
Ые</td><td>
С1у</td><td>
С1у</td><td>
Рго</td><td>
Азп</td><td>
Уа1</td><td>
С1и</td><td>
Зег</td><td>
Суз</td><td>
С1у</td><td>
С1и</td></tr>
<tr><td>
225</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
230</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
235</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
240</td></tr>
<tr><td>
С1у</td><td>
Зег</td><td>
МеЬ</td><td>
Ьуз</td><td>
Уа1</td><td>
Ьеи</td><td>
С1и</td><td>
Ьуз</td><td>
Агд</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьуз</td><td>
Азр</td><td>
МеЬ</td><td>
С1у</td><td>
РНе</td><td>
С1п</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
245</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
250</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
255</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Туг</td><td>
Зег</td><td>
Суз</td><td>
Ые</td><td>
Азп</td><td>
Азр</td><td>
Туг</td><td>
Агд</td><td>
Рго</td><td>
Уа1</td><td>
Ьуз</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьеи</td><td>
С1п</td><td>
Суз</td><td>
Уа1</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
260</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
265</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
270</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Азр</td><td>
Низ</td><td>
Зег</td><td>
ТНг</td><td>
Низ</td><td>
Рго</td><td>
Азр</td><td>
Суз</td><td>
А1а</td><td>
Ьеи</td><td>
Ьуз</td><td>
Зег</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td><td>
А1а</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
</td><td>
275</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
280</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
285</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
ТНг</td><td>
С1п</td><td>
Агд</td><td>
Ьуз</td><td>
А1а</td><td>
Рго</td><td>
Зег</td><td>
Ьеи</td><td>
Туг</td><td>
ТНг</td><td>
С1и</td><td>
С1п</td><td>
Агд</td><td>
А1а</td><td>
СТу</td><td>
Ьеи</td></tr>
<tr><td>
</td><td>
290</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
295</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
300</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Ые</td><td>
Ые</td><td>
Рго</td><td>
Ьеи</td><td>
РНе</td><td>
Ьеи</td><td>
Уа1</td><td>
Ьеи</td><td>
АТа</td><td>
Зег</td><td>
Агд</td><td>
ТНг</td><td>
СТп</td><td>
Ьеи</td><td>
</td><td>
</td></tr>
</table>
<p>305 310 315</p>
<p><210> 24</p>
<p><211> 122</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<table border="1">
<tr><td>
<223></td><td>
Тест</td><td>
1 Тяжелая Цепь</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
24</td><td>
</td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1и Уа1</td><td>
СТп</td><td>
Ьеи Ьеи С1и Зег</td><td>
С1у С1у С1у</td><td>
Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у</td></tr>
<tr><td>
1</td><td>
</td><td>
5</td><td>
10</td><td>
15</td></tr>
</table>
<p>- 52 029303</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а Уа1 Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Азп Зег РЬе 20 25 30</p>
<p>А1а МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>Зег А1а Не Зег С1у Зег С1у С1у С1у ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Ьуз Азр Ьуз 11е Ьеи Тгр РЬе С1у С1и Рго Уа1 РЬе Азр Туг Тгр 100 105 110</p>
<p>С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210></td><td>
25</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<211></td><td>
108</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<212></td><td>
БЕЛОК</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<213></td><td>
Искусственная</td><td>
последовательность</td></tr>
<tr><td>
<220></td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<223></td><td>
Тест 1 Легкая</td><td>
Цепь</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
25</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
СНи Т1е</td><td>
Уа1 Ьеи ТЬг</td><td>
С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у</td></tr>
</table>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг 20 25 30</p>
<p>Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е 35 40 45</p>
<p>Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у 50 55 60</p>
<p>Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго 65 70 75 80</p>
<p>С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго 85 90 95</p>
<p>- 53 029303</p>
<p>ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105</p>
<p><210> 26</p>
<p><211> 120</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> Тест 2 Тяжелая Цепь</p>
<p><400> 26</p>
<p>С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 А1а Ьуз Рго С1у ТНг 15 10 15</p>
<p>Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азр Туг 20 25 30</p>
<p>Тгр МеН С1п Тгр Уа1 Ьуз С1п Агд Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр 11е 35 40 45</p>
<p>С1у ТНг 11е Туг Рго С1у Азр С1у Азр ТНг С1у Туг А1а С1п Ьуз РНе 50 55 60</p>
<p>С1п С1у Ьуз А1а ТНг Ьеи ТНг А1а Азр Ьуз Зег Зег Ьуз ТНг Уа1 Туг 65 70 75 80</p>
<p>МеН Низ Ьеи Зег Зег Ьеи А1а Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд С1у Азр Туг Туг С1у Зег Азп Зег Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п 100 105 110</p>
<p>С1у ТНг Зег Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 120</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210>
<211>
<212>
<213></td><td>
27
108
БЕЛОК
Искусственная</td><td>
последовательность</td></tr>
<tr><td>
<220></td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<223></td><td>
Тест 2 Легкая</td><td>
Цепь</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
27</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
Азр 11е</td><td>
/ Уа1 МеН ТНг</td><td>
С1п Зег Низ Ьеи Зег МеН Зег ТНг Зег Ьеи С1у</td></tr>
<tr><td>
1</td><td>
5</td><td>
10 15</td></tr>
</table>
<p>- 54 029303</p>
<p>Азр Рго Уа1 Зег 11е ТНг Суз Ьуз А1а Зег С1п Азр Уа1 Зег ТНг Уа1 20 25 30</p>
<p>Уа1 А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п Зег Рго Агд Агд Ьеи 11е 35 40 45</p>
<p>Туг Зег А1а Зег Туг Агд Туг 11е С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе ТНг С1у 50 55 60</p>
<p>Зег С1у А1а С1у ТНг Азр РНе ТНг РНе ТНг 11е Зег Зег Уа1 С1п А1а 65 70 75 80</p>
<p>С1и Азр Ьеи А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Шз Туг Зег Рго Рго Туг 85 90 95</p>
<p>ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз Агд 100 105</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210></td><td>
28</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<211></td><td>
449</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<212></td><td>
БЕЛОК</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<213></td><td>
Искусственная</td><td>
последовательность</td></tr>
<tr><td>
<220></td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<223></td><td>
АЬ43 Тяжелая</td><td>
Цепь</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
28</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1и Уа1</td><td>
СТп Ьеи Ьеи</td><td>
С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у</td></tr>
</table>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг 20 25 30</p>
<p>С1у МеЬ Шз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>Зег Агд 11е Азп Зег Азр С1у Зег Зег ТНг Зег Туг А1а Азр Зег МеЬ 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у С1п РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд С1у С1у Туг Туг Туг Туг А1а МеЬ Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у 100 105 110</p>
<p>- 55 029303</p>
<p>ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе 115 120 125</p>
<p>Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг А1а А1а Ьеи 130 135 140</p>
<p>С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр 145 150 155 160</p>
<p>Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 Низ ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи 165 170 175</p>
<p>С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго Зег 180 185 190</p>
<p>Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Низ Ьуз Рго 195 200 205</p>
<p>Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз 210 215 220</p>
<p>ТНг Низ ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго 225 230 235 240</p>
<p>Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеН 11е Зег 245 250 255</p>
<p>Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр 260 265 270</p>
<p>Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп 275 280 285</p>
<p>А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 290 295 300</p>
<p>Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и 305 310 315 320</p>
<p>Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз 325 330 335</p>
<p>ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг 340 345 350</p>
<p>- 56 029303</p>
<p>Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеЬ ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг 355 360 365</p>
<p>Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и 370 375 380</p>
<p>Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи 385 390 395 400</p>
<p>Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз 405 410 415</p>
<p>Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Наз С1и 420 425 430</p>
<p>А1а Ьеи Шз Азп Шз Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 435 440 445</p>
<p>Ьуз</p>
<p><210> 29</p>
<p><211> 216</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ43 Легкая Цепь</p>
<p><400> 29</p>
<p>С1п Зег Уа1 Ьеи ТНг С1п Рго Рго Зег А1а Зег С1у ТНг Рго С1у С1п 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТНг 11е Зег Суз Зег С1у С1у Зег Зег Азп 11е С1у Туг Ьуз 20 25 30</p>
<p>ТНг Уа1 Азп Тгр Туг С1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>11е Туг Азр Азп Азп Ьуз Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз А1а А1а Тгр Азр Азр Зег Ьеи 85 90 95</p>
<p>- 57 029303</p>
<p>Азп С1у Ьеи Уа1 РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи С1у С1п 100 105 110</p>
<p>Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег С1и С1и 115 120 125</p>
<p>Ьеи С1п А1а Азп Ьуз А1а ТНг Ьеи Уа1 Суз Ьеи Не Зег Азр РНе Туг 130 135 140</p>
<p>Рго С1у А1а Уа1 ТНг Уа1 А1а Тгр Ьуз А1а Азр С1у Зег Рго Уа1 Ьуз 145 150 155 160</p>
<p>А1а С1у Уа1 С1и ТНг ТНг Ьуз Рго Зег Ьуз С1п Зег Азп Азп Ьуз Туг 165 170 175</p>
<p>А1а А1а Зег Зег Туг Ьеи Зег Ьеи ТНг Рго С1и С1п Тгр Ьуз Зег Нтз 180 185 190</p>
<p>Агд Зег Туг Зег Суз С1п Уа1 ТНг Нтз С1и С1у Зег ТНг Уа1 С1и Ьуз 195 200 205</p>
<p>ТНг Уа1 А1а Рго ТНг С1и Суз Зег 210 215</p>
<table border="1">
<tr><td>
<210></td><td>
30</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<211></td><td>
455</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<212></td><td>
БЕЛОК</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<213></td><td>
Искусственная</td><td>
последовательность</td></tr>
<tr><td>
<220></td><td>
</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
<223></td><td>
АЬ72 Тяжелая</td><td>
Цепь</td></tr>
<tr><td>
<400></td><td>
30</td><td>
</td></tr>
<tr><td>
С1и Уа1</td><td>
С1п Ьеи Ьеи</td><td>
С1и Зег СТу СТу СТу Ьеи Уа1 С1п Рго СТу СТу</td></tr>
</table>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг 20 25 30</p>
<p>С1у МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>Зег С1у 11е Зег С1у Зег С1у С1у Зег ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>- 58 029303</p>
<p>- 59 029303</p>
<p>Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи 325 330 335</p>
<p>Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у Е1п Рго Агд 340 345 350</p>
<p>С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеЬ ТНг Ьуз 355 360 365</p>
<p>Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 370 375 380</p>
<p>11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз 385 390 395 400</p>
<p>ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег 405 410 415</p>
<p>Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп \/а1 РНе Зег 420 425 430</p>
<p>Суз Зег Уа1 МеЬ Нгз С1и А1а Ьеи Нгз Азп Нгз Туг ТНг Е1п Ьуз Зег 435 440 445</p>
<p>Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 450 455</p>
<p><210> 31</p>
<p><211> 216</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЬ72 Легкая Цепь</p>
<p><400> 31</p>
<p>С1п Зег Уа1 Ьеи ТНг С1п Рго Рго Зег А1а Зег С1у ТНг Рго С1у С1п 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТНг 11е Зег Суз Зег С1у Зег Зег Зег Азп 11е Е1у Зег Ьуз 20 25 30</p>
<p>ТНг Уа1 Зег Тгр Туг С1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>11е Туг Азр Азп Азп Ьуз Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>- 60 029303</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Зег Зег Туг А1а А1а Агд Зег 85 90 95</p>
<p>ТНг Азп 11е 11е РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи С1у С1п 100 105 110</p>
<p>Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег С1и С1и 115 120 125</p>
<p>Ьеи С1п А1а Азп Ьуз А1а ТНг Ьеи Уа1 Суз Ьеи 11е Зег Азр РНе Туг 130 135 140</p>
<p>Рго С1у А1а Уа1 ТНг Уа1 А1а Тгр Ьуз А1а Азр С1у Зег Рго Уа1 Ьуз 145 150 155 160</p>
<p>А1а С1у Уа1 С1и ТНг ТНг Ьуз Рго Зег Ьуз С1п Зег Азп Азп Ьуз Туг 165 170 175</p>
<p>А1а А1а Зег Зег Туг Ьеи Зег Ьеи ТНг Рго С1и С1п Тгр Ьуз Зег Ыз 180 185 190</p>
<p>Агд Зег Туг Зег Суз С1п Уа1 ТНг Ыз С1и С1у Зег ТНг Уа1 С1и Ьуз 195 200 205</p>
<p>ТНг Уа1 А1а Рго ТНг С1и Суз Зег 210 215</p>
<p><210> 32</p>
<p><211> 449</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ10 Тяжелая Цепь</p>
<p><400> 32</p>
<p>С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у</p>
<p>10</p>
<p>15</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг 20 25 30</p>
<p>С1у МеЬ Ыз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>- 61 029303</p>
<p>Зег 11е 11е Туг Зег С1у С1у Зег ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 50 55 60</p>
<p>С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг Ьеи 65 70 75 80</p>
<p>С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а Е1и Азр ТНг А1а 1/а1 Туг Туг Суз А1а 85 90 95</p>
<p>Агд Агд А1а ТНг Тгр С1у С1у А1а ТНг Низ Азр Туг Тгр С1у С1п С1у 100 105 110</p>
<p>ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе 115 120 125</p>
<p>Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг А1а А1а Ьеи 130 135 140</p>
<p>С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр 145 150 155 160</p>
<p>Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 Низ ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи 165 170 175</p>
<p>С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго Зег 180 185 190</p>
<p>Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Низ Ьуз Рго 195 200 205</p>
<p>Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз 210 215 220</p>
<p>ТНг Шз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго 225 230 235 240</p>
<p>Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЬ Не Зег 245 250 255</p>
<p>Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр 260 265 270</p>
<p>Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп 275 280 285</p>
<p>- 62 029303</p>
<p>А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд Е1и Е1и Е1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 290 295 300</p>
<p>Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Низ Е1п Азр Тгр Ьеи Азп Е1у Ьуз Е1и 305 310 315 320</p>
<p>Туг Ьуз Суз Ьуз 1/а1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е Е1и Ьуз 325 330 335</p>
<p>ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз Е1у Е1п Рго Агд Е1и Рго Е1п Уа1 Туг ТЬг 340 345 350</p>
<p>Ьеи Рго Рго Зег Агд Е1и Е1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп Е1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг 355 360 365</p>
<p>Суз Ьеи Уа1 Ьуз Е1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 Е1и Тгр Е1и 370 375 380</p>
<p>Зег Азп Е1у Е1п Рго Е1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи 385 390 395 400</p>
<p>Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 405 410 415</p>
<p>Зег Агд Тгр С1п Е1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Наз Е1и 420 425 430</p>
<p>А1а Ьеи Шз Азп Шз Туг ТЬг Е1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго Е1у 435 440 445</p>
<p>Ьуз</p>
<p><210> 33</p>
<p><211> 216</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ10 Легкая Цепь</p>
<p><400> 33</p>
<p>Е1п Зег Уа1 Ьеи ТЬг Е1п Рго Рго Зег А1а Зег Е1у ТЬг Рго Е1у Е1п 15 10 15</p>
<p>Агд Уа1 ТЬг Не Зег Суз Зег Е1у Зег Зег Зег Азп 11е Е1у Зег Азп 20 25 30</p>
<p>- 63 029303</p>
<p>ТНг Уа1 Азп Тгр Туг С1п С1п Ьеи Рго С1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45</p>
<p>11е Туг Агд Азп Азп С1п Агд Рго Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РНе Зег 50 55 60</p>
<p>С1у Зег Ьуз Зег С1у ТНг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е Зег С1у Ьеи Агд 65 70 75 80</p>
<p>Зег С1и Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз А1а ТНг Тгр Азр Азр Зег Ьеи 85 90 95</p>
<p>Азп С1у Уа1 Ьеи РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи С1у С1п 100 105 110</p>
<p>Рго Ьуз А1а Азп Рго ТНг Уа1 ТНг Ьеи РНе Рго Рго Зег Зег С1и С1и 115 120 125</p>
<p>Ьеи С1п А1а Азп Ьуз А1а ТНг Ьеи Уа1 Суз Ьеи 11е Зег Азр РНе Туг 130 135 140</p>
<p>Рго С1у А1а Уа1 ТНг Уа1 А1а Тгр Ьуз А1а Азр С1у Зег Рго Уа1 Ьуз 145 150 155 160</p>
<p>ТНг Уа1 А1а Рго ТНг С1и Суз Зег 210 215</p>
<p><210> 34</p>
<p><211> 452</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ19 Тяжелая Цепь</p>
<p><400> 34</p>
<p>С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15</p>
<p>- 64 029303</p>
<p>Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Азп Азп Туг 20 25 30</p>
<p>Азр МеЬ ТНг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45</p>
<p>А1а Уа1 Не Зег Туг Азр С1у Зег Азр Ьуз Азр Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60</p>
<p>Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80</p>
<p>Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95</p>
<p>А1а Агд Уа1 Туг Туг Туг С1у РНе Зег С1у Рго Зег МеЬ Азр Уа1 Тгр 100 105 110</p>
<p>С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго 115 120 125</p>
<p>Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг 130 135 140</p>
<p>А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг 145 150 155 160</p>
<p>Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 Низ ТНг РНе Рго 165 170 175</p>
<p>А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг 180 185 190</p>
<p>Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТНг С1п ТНг Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп 195 200 205</p>
<p>Низ Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз Зег 210 215 220</p>
<p>Суз Азр Ьуз ТНг Низ ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 225 230 235 240</p>
<p>С1у С1у Рго Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи 245 250 255</p>
<p>- 65 029303</p>
<p>МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 260 265 270</p>
<p>НЬз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и 275 280 285</p>
<p>Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг 290 295 300</p>
<p>Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп 305 310 315 320</p>
<p>С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 325 330 335</p>
<p>11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п 340 345 350</p>
<p>Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 355 360 365</p>
<p>Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 370 375 380</p>
<p>С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго 385 390 395 400</p>
<p>Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг 405 410 415</p>
<p>Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 420 425 430</p>
<p>МеЬ Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи 435 440 445</p>
<p>Зег Рго С1у Ьуз 450</p>
<p><210> 35</p>
<p><211> 217</p>
<p><212> БЕЛОК</p>
<p><213> Искусственная последовательность</p>
<p><220></p>
<p><223> АЫ9 Легкая Цепь</p>
<p>- 66 029303</p>
<p><400> 35</p>
<table border="1">
<tr><td>
<p>С1п</p>
<p>1</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>ТЬг</p>
<p>5</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>А1а</p>
<p>10</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>С1у</p>
<p>15</p></td><td>
<p>С1п</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Агд</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>11е</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Суз</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>11е</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азп</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>20</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>25</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>30</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>ТНг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Тгр</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>35</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>40</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>45</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Не</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Агд</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>Агд</p></td><td>
<p>РЬе</p></td><td>
<p>Зег</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p>50</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>55</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>60</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>11е</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>Агд</p></td></tr>
<tr><td>
<p>65</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>70</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>75</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>80</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Суз</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>85</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>90</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>95</p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Агд</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>РЬе</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>С1у</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>100</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>105</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>110</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>РЬе</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>С1и</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>115</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>120</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>125</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>Суз</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>11е</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>РЬе</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p>130</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>135</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>140</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Тгр</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Азр</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Уа1</p></td></tr>
<tr><td>
<p>145</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>150</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>155</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>160</p></td></tr>
<tr><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>С1у</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Азп</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>165</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>170</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>175</p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>А1а</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Ьеи</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Тгр</p></td><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>Зег</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>180</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>185</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>190</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Низ</p></td><td>
<p>Агд</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Туг</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>Суз</p></td><td>
<p>С1п</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Низ</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>СТу</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>С1и</p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>195</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>200</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>205</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p>Ьуз</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>Уа1</p></td><td>
<p>АТа</p></td><td>
<p>Рго</p></td><td>
<p>ТЬг</p></td><td>
<p>С1и</p></td><td>
<p>Суз</p></td><td>
<p>Зег</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p>210</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p>215</p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td></tr>
<tr><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td>
<p></p></td><td colspan="7">