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DE69223516T2 - Auftrennung von arylalkansäuren - Google Patents

Auftrennung von arylalkansäuren

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DE69223516T2
DE69223516T2 DE69223516T DE69223516T DE69223516T2 DE 69223516 T2 DE69223516 T2 DE 69223516T2 DE 69223516 T DE69223516 T DE 69223516T DE 69223516 T DE69223516 T DE 69223516T DE 69223516 T2 DE69223516 T2 DE 69223516T2
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DE
Germany
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ketoprofen
biotransformation
enantiomer
acid
ester
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DE69223516T
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Germano Carganico
Christopher Evans
Peter Stabler
Richard Wisdom
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Laboratorios Menarini SA
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Laboratorios Menarini SA
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Publication date
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf eine Aufspaltung einer Arylalkanoinsäure.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Viele pharmazeutisch aktive Verbindungen, die durch eine chemische Synthese hergestellt sind, werden als Gemische von Stereoisomeren erhalten und verkauft. Es ergibt sich jedoch oft der Fall, daß nur eines dieser Stereoisomere pharmazeutisch aktiv ist. Das verunreinigende Enantiomer hat oft eine sehr schwache, wenn überhaupt eine Aktivität oder ergibt in einigen Fällen unerwünschte physiologische Seitenwirkungen und zeigt eine Giftigkeit.
  • Die Arbeiten einer Anzahl von Forschern hat ergeben, daß die antientflammbare Aktivität der 2-Arylpropionsäuren Naproxen und Ibuprofen bei dem (S) Enantiomer zu finden ist. Das gleiche trifft zu für Ketoprofen, welches gegenwärtig als ein Racemat hergestellt und verkauft wird. Arylalkanoinsäuren können durch eine Biotransformation gemäß dem folgenden Reaktionsschema aufgespaltet werden:
  • worin R' eine Alkylgruppe ist, Ar ein aromatischer Rest ist und R bspw. ein aliphatischer Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
  • Beispiele von verschiedenen verwendeten Biokatalysatoren bei den Aufspaltungsprozessen sind in der EP-A-0 407 033 und EP-A-0 227 078, EP-A-0 289 804, EP-A-0 197 474 und in "Agricultural and Biol. Chem.", Band 45, No. 6, 1981, Seiten 1389-1392 beschrieben.
  • Eine besondere Aufgabe bei der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer ökonomischen Verfahrensweise der Herstellung von optisch reinem (S)-Ketoprofen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ergibt gleichfalls ein Verfahren für die Aufspaltung von (S)-Ketoprofen aus einem racemischen Gemisch. Dieses Verfahren umfaßt die biokatalytische Hydrolyse eines Esters von racemischem Ketoprofen, um eine Biotransformation-Kulturlösung zu ergeben, welche Ketoprofensäure enthält, die im wesentlichen in einem Enantiomer angereichert ist, sowie Ketoprofenester, der im wesentlichen in einem anderen Enantiomer angereichert ist. Vorausgesetzt, daß das Säureprodukt der Biotransformation genügend mit dem gewünschten Enantiomer angereichert ist, kann eine weitere Verbesserung der optischen Reinheit unmittelbar und ökonomisch erreicht werden unter Verwendung von chemischen Standardverfahren durch die Bildung eines Salzes mit einem chiralen Amin einer hohen optischen Reinheit, gefolgt von einer Kristallisation aus der Lösung. Der Ketoprofenester- Rest aus der Biotransformation kann unmittelbar gereinigt werden, chemisch racemisiert und rezirkuliert, um bei weiteren Biotransformationen verwendet zu werden und die Kosten des Rohmaterials zu minimieren.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf der Entdeckung eines Biokatalysators, der zur Verwendung bei der vorbeschriebenen Biotransformation geeignet ist: Eine Mikrobe (ENZA-I3) wurde identifiziert, die zur Durchführung der erforderlichen Aufspaltung extrem nützlich ist. Dieser Organismus war ursprünglich durch ein Siebkiassieren von Proben von Abwasser- oder Kläranlagen für ein Wachstum an Ethanol als einer einzigen Quelle von Kohlenstoff isoliert worden. Ein nachfolgendes Siebklassieren des Organismus auf Platten, die Ethylketoprofen enthielten, zeigte, daß sich bei dem folgenden Wachstum ein extensiver Freiraum von wasserunlöslichem Ethylketoprofen um ENZA-I3 Kolonien herum ergab (was ein Anzeichen für eine potentielle Esterhydrolyse ist). Ein nachfolgendes Siebklassieren in flüssigen Medien zeigte, daß ENZA-I3 beträchtlich stärker aktiv ist bei der Hydrolyse von Ethylketoprofen als andere Isoliermedien während des flüssigen Siebklassierens.
  • Dieser Stamm hat sich für eine Anzahl von Eigenschaften für die Aufspaltung von (S)-Ketoprofen aus dem racemischen Ketoprofenester als vorteilhaft erwiesen, nämlich:
  • (a) Er hydrolisiert Ketoprofenester mit kurzer Kette sehr rasch.
  • (b) Er erzeugt (S)-Ketoprofensäure von racemischem Ethylketoprofen mit einer sehr hohen Enantioselektivität, sodaß bei niedrigen Umwandlungen ein (S)-Ketoprofen mit einer Reinheit von mehr als 95 % erhalten werden kann. Bei Umwandlungen von angenähert 50 % (40 - 50 %) ergibt sich eine Verringerung der Reinheit auf 90 %. Diese Selektivität wird ohne das Erfordernis für ein Reinigen oder Säubern von verschmutzenden Aktivitäten erhalten (was teuer sein kann) oder für eine Überbetonung der interessierenden Aktivität durch ein Klonen.
  • (c) Durch ein Verwandeln des Substrats aus einem Ethyl- zu einem Methylketoprofen ist es möglich, die Selektivität des Biokatalysators so zu andern, daß (R)-Ketoprofensaure anstelle des (S) Enantiomers vorzugsweise angesammelt wird. Wenn so die Biotransformation mit mehr als 50 % durchgeführt wird, dann kann (S)-Ketoprofen als der Methylester hergestellt werden.
  • (d) Der Organismus wächst rasch bei Umgebungstemperaturen mit einer Verdopplungszeit von 1.5 bis 2 Stunden, was eine einfache und ökonomische Herstellung des Biokatalysators ermöglicht.
  • Der isolierte Stamm wurde durch das Centralbureau Voor Schimmelcultures (CBS) in Holland als Trichosporon laibacchii (Windisch) identifiziert, welcher auch als Endomyces laibacchii klassifiziert wird. Einige alternative Stämme oder Rassen dieser Spezies sind von der CBS öffentlich zu erhalten. Diese Stämme wie bspw. CBS 5791, 5790, 5381 und 2495 wurden beschafft und gleichzeitig getestet zusammen mit dem Isolierstoff ENZA-I3. Diese Versuche zeigten, daß einige dieser Stämme nahezu gleich gut sind wie der Isolierstoff ENZA-I3 bei der Durchführung der Biotransformation. In dem CBS 1990 Katalog (32. Ausgabe) werden diese Stämme klassifiziert als Trichosporon beigelii, sie wurden jedoch nachfolgend umbenannt durch die CBS als Endomyces laibacchii. Die Stämme der T. beigelii wurden getestet und es wurde dabei gefunden, daß sie eine ähnliche Selektivität zu ENZA-I3 haben, obwohl sie nicht aktiv sind.
  • ENZA-I3 wurde niedergelegt bei dem International Mycological Institute, Kew, UK am 20. August 1991 unter den Bedingungen des Vertrages von Budapest, wo er die Zulassungsnummer 348917 erhalten hat.
  • Weitere Eigenschaften der niedergelegten Mikrobe ENZA-I3 sind nachfolgend angegeben:
  • Fermentatives Wachstum: Glukose -ve
  • Aerobisches Wachstum: D-Glukose +ve
  • D-Galaktose +ve
  • L-Sorbose +ve
  • D-Glukosamin +ve
  • D-Ribose +ve
  • D-Xylose +ve
  • L-Arabinose +ve
  • D-Arabinose -ve
  • L-Rhamnose +ve
  • Sukrose +ve
  • Maltose +ve
  • αα-Trehalose +ve
  • Methyl α-Glucosid +ve
  • Cellobiose +ve
  • Salicin +ve
  • Arbutin +ve
  • Melibiose +ve
  • Laktose +ve
  • Raffinose +ve
  • Melezitose +ve
  • Inulin -ve
  • lösliche Stärke +ve
  • Glycerol +ve
  • Mesoerythritol -ve
  • Ribitol -ve
  • Xylitol -ve
  • L-Arabinitol +ve
  • D-Glucitol +ve
  • D-Mannitol -ve
  • Galaktitol +ve
  • Myoinositol +ve
  • Glukonolacton -ve
  • D-Glukonat +ve
  • D-Glukuronat +ve
  • D-Galakturonat -ve
  • Di-Lactat +ve
  • Succinat +ve
  • Citrat +ve
  • Methanol -ve
  • Ethanol +ve
  • Verwendung einer Stickstoffguelle: Nitrat -ve an Nitrat
  • Nitrit -ve
  • Ethylamin +ve
  • L-Lysin +ve
  • Cadaverin +ve
  • Creatin -ve
  • Creatinin +ve
  • Wachstum: +ve bei 25ºC, 30ºC
  • -ve bei 35ºC, 37ºC
  • Erscheinungsform: Kolonien - dickbreiig, membranförmig
  • Filamente - gut entwickelt, Pseudohyphae/Septaehyphae arthrocandida
  • Asci - keine
  • Teliosporen/basidia - keine
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die folgenden Medien wurden in den Beispielen 1 bis 5 verwendet (in welchen (S)-Ketoprofen hergestellt wurde):
  • * Ivanhoe Chemical Company, IL, USA
  • Alle Medien wurden vor ihrer Autoklavierung auf pH 6.5 mit Natriumhydroxid eingestellt. Alle Medien waren für 20 bis 40 Minuten vor ihrer Impfung bei 121ºC wärmesterilisiert worden. Die Glukose wurde als eine 50 % Lösung getrennt von dem Rest des Mediums sterilisiert.
  • Das Gemisch der Biotransformation war wie folgt:
  • Natriumphosphat 100 mM, pH 6.5
  • Hefeextrakt 10 g/l
  • Tween 80 5 g/l
  • Antischäumer (XFO 371) 1 ml/l
  • Ketoprofenethylester wurde dem Gemisch der Biotransformation hinzugefügt, um eine abschließende Konzentration von 50 g/l nach der Hinzufügung des Impfstoffes zu ergeben. Das Medium der Biotransformation wurde bei 121ºC für 20 bis 40 Minuten wärmesterilisiert; der Ketoprofenethylester wurde getrennt wärmesterilisiert.
  • Die verwendete Lösung der Spurenelemente war wie folgt:
  • CaCl&sub2; 3.57 g/l
  • ZnO 2.0 g/l
  • CuCl&sub2; 2H&sub2;O 0.85 g/l
  • Na&sub2;MoO&sub4; 2H&sub2;O 4.8 g/l
  • MnCl&sub2; 4H&sub2;O 2.0 g/l
  • FeCl&sub2; 6H&sub2;O 5.4 g/l
  • H&sub3;BO&sub3; 0.3 g/l
  • CoCl&sub2; 6H&sub2;O 2.4 g/l
  • HCl 250 ml/l
    • Beispiel 1
  • Zellen (ENZA-I3) wurden auf YM (Difco ) Agarplatten geimpft und bei 23ºC für 2 Tage inkubiert. Eine einzige Kolonie wurde in ein 75 ml Saatmedium in einer 500 ml Schüttelflasche überführt. Dieses wurde dann bei 23ºC für 24 Stunden aerob gewachsen. Die Kultur wurde dann in einen 2.8 l Fermentator überführt, der 1.5 1 des Wachstumsmediums bei 23ºC enthielt. Das Wachstum wurde für 10 Stunden mit einer genügenden Belüftung und einem Umrühren fortgesetzt, um die aeroben Bedingungen beizubehalten. 150 ml dieser Kultur wurden dann einem 1.35 l Biotransformation-Medium in einem 2.8 l Gefäß zugesetzt. Während der Biotransformation wurde ein Umrühren bei 1200 U/min und eine Belüftung von 0.5 vvm beibehalten. Die Temperatur wurde auf 23ºC geregelt. Die nach 20 Stunden nach dem Start entnommene Probe zeigte eine Ketoprofen-Konzentration von 7 g/l mit einer Reinheit von 98 % (S)-Ketoprofen. Eine nach 73 Stunden nach dem Start der Biotransformation entnommene Probe zeigte eine Ketoprofen-Konzentration von 23.3 g/l mit einer Reinheit von 94 % (S)-Ketoprofen.
    • Beispiel 2
  • Eine gleichartige Methodik wie beschrieben im Beispiel 1 wurde in einem größeren Maßstab durchgeführt. Es wurde Zellen auf YM (Difco ) Agarplatten geimpft und für 2 Tage inkubiert. Einzelne Kolonien wurden dann in jede von vier 11 konische Flaschen übernommen, die 250 ml Saatmedium enthielten. Nach einem Wachstum von 1 Tag wurden die Inhalte aller Flaschen in einen 15 l Fermentator übernommen, der 9 l Wachstumsmedium enthielt. Nach einem aeroben Wachstum von 10 Stunden wurde eine 5 l Zellkulturlösung in einen 75 l Kessel übernommen, der 45 l Biotransformation-Medium enthielt, um die Biotransformation zu starten. Es wurde eine Luftströmrate von 0.2 vvm und eine Umrührrate von 500 U/min benutzt, um aerobe Bedingungen beizubehalten und ein gutes Vermischen zu versichern. Die Analyse einer 71 Stunden nach dem Start der Biotransformation entnommenen Probe zeigte, daß sich 17 g/l Ketoprofen angesammelt hatte mit einer Reinheit von 93 % zugunsten des (S) Enantiomers.
    • Beispiel 3
  • Kulturen verschiedener Stämme, die von dem CBS erhältlich und in der folgenden Tabelle angegeben sind, wurden von frischen YM Agarplatten in 250 ml Flaschen übernommen, die 25 ml des Wachstumsmedium ohne Glukose enthielten. Nach einem Wachstum von 24 Stunden wurde 5.0 ml jeder Kultur in 250 ml Flaschen übernommen, die 20 ml Biotransformation- Medien enthielten. Es wurden Proben nach einem Schütteln bei 23ºC für 72 Stunden entnommen. Die Ergebnisse sind nachfolgend tabellisiert:
  • * Schwierig für eine genaue Angabe der Menge als Folge von niedrigen Konzentrationen, jedoch wurde eine Selektivität für das (S) Enantiomer (zu einem größeren oder geringeren Ausmaß) für die Stämme beobachtet.
    • Beispiel 4 Wirkung der Temperatur
  • Untersuchungen zeigen, daß das Verhalten des Biokatalysators während der Biotransformation bei 23ºC und 26ºC ähnlich ist. Bei 20ºC ist die Rate der Biotransformation ähnlich zu derjenigen bei 23ºC, jedoch fällt die Enantioselektivität des Biokatalysators so weit ab, daß bei einer Standard- Biotransformation (Beispiel 1) die Einheit des Säureprodukts nur 88 % (S)-Ketoprofen nach 70 Stunden ist, anstelle von 93 - 95 %. Bei 30ºC erniedrigt sich die Rate der Katalyse um etwa 40 - 50 % und ist auch die Enantioseselektivität nicht gut.
    • Beispiel 5 Wirkung des pH
  • Die Aktivität ergibt sich bei einem pH Wert zwischen 4.5 und 7.5 (und nahezu sicher auch bei einem höheren Wert, obwohl nicht getestet). Die Selektivität des Biokatalysators erniedrigt sich beträchtlich bei einem pH-Wert von weniger als 4.5. Der optimale pH-Wert wird zwischen 6.5 und 7.5 angenommen.
  • Wenn so ein Standardverfahren (Beispiel 1) mit einem pH-Wert durchgeführt wird, der auf 4.5 geregelt wurde, dann ergaben sich für eine Probe nach 66 Stunden 8 g/l (Reinheit 91 % (S)-Ketoprofen); bei einem pH-Wert von 6.5 ergaben sich für die Probe nach 66 Stunden 24 g/l (Reinheit 94 % (S)-Ketoprofen); bei einem pH-Wert von 7.5 ergaben sich für die Probe nach 66 Stunden 23 g/l (Reinheit 80 % (S)-Ketoprofen).
    • Beispiel 6 Wirkung der Kettenlänge
  • Es wurden Zellen in einem Medium gewachsen, das 25 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0.5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Ammoniumsulphat und 1 ml/l Spurenelementlösung enthielt. (CaCl&sub2; 2H&sub2;O - 53 g/l, FESO&sub4; 7H&sub2;O - 2 g/l, MnSO&sub4; H&sub2;O - 100 mg/l, ZNSO&sub4; 7H&sub2;O - 200 mg/l, CUSO&sub4; - 40 mg/l, CoCl&sub2; 6H&sub2;O - 60 mg/l, NaMoO&sub4; - 40 mg/l, H&sub3;BO&sub3; - 30 mg/l), mit einer Einstellung des pH-Wertes auf 6.5 mit Natriumhydroxid. Nach einem Wachstum über Nacht wurden die Kulturen bei 20 % in 250 ml Flaschen übernommen, die 25 ml desselben Mediums enthielten, jedoch wurden verschiedene Ketoprofenester hinzugefügt für eine abschließende Konzentration von 10 g/l. Die Rate der Biotransformation und die Enantiomerreinheit des Ketoprofenprodukts wurden gemessen. Die Ergebnisse waren:

Claims (5)

1. Verfahren zum Herstellen überwiegend eines Enantiomers einer chiralen 2-Arylalkanomsäure von einem Gemisch von Enantiomeren eines Alkylesters der 2--Arylalkanomsäure mit der folgenden Formel:
worin R' eine Alkylgruppe ist, Ar ein aromatischer Rest ist und R eine aliphatische Gruppe von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist;
welches die Verwendung des Mikroorganismus Trichosporon ENZA 1-3, IMI 348917, bei einer Temperatur von 20 bis 30ºC als ein Biokatalysator umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die chirale 2-Arylalkanomsäure die 2- (3-Benzoylphenyl) propionsäure ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem der Alkylester ein Methylester und das überwiegend gebildete Enantiomer die (R)-2-(3-Benzoylphenyl) propionsäure ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem der Alkylester ein Ethylester und das überwiegend gebildete Enantiomer die (S)-2-(3-Benzoylphenyl)propionsäure ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches bei einem pH von 4.5 bis 7.5 durchgeführt wird.
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