DE2006446A1

DE2006446A1 -

Info

Publication number: DE2006446A1
Application number: DE19702006446
Authority: DE
Priority date: 1969-02-15
Filing date: 1970-02-12
Publication date: 1970-10-22
Also published as: BE745926A; RO54829A; GB1292081A; SE360677B; FI46178C; YU36389B; AT295743B; BG17632A3; USRE30451E; YU35870A; CH545343A; FR2034552B1; IL33879A; NO132875C; DE2006446C3; FR2034552A1; FI46178B; DE2006446B2; DK123605B; CS150904B2

Description

DR. BERG DIPL.-ING; STAPF

PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2, HILBLESTRASSE 2O

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stopf, 8 München 2, Hllblestraee 20

Unser Zeichen 1$ 30 4

Datum

12. Feb. 1970

Anwaltsakte-Nr. 19. 3'04

ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI Tokyo/ Japan

"Verfahren zur Hersteliurig von Bleomyöin-Äntibiofeika"

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von antibiotischen Bleomycinen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von antibiotiechen Bleomycinen durch Impfen und aerobisches Züchten eines Blöomycin-erzeugenden, zu den Actinomyces

009843/1946

gehörenden Stamm, in einem, eine Nährstoffquelle enthaltenden Medium, wobei die Züchtung in Anwesenheit einer

Aminoverbindung erfolgt, die zumindest eine -C-CH₂-NH₂- -Gruppe und zumindest eine basische Gruppe enthält, welche aus Amino-, Imino-, Guanidino-, Amidino- und Sulfonium-Gruppen und Stickstoff-enthaltenden, cyclischen Verbindungen ausgewählt ist, oder in Anwesenheit einer Verbindung, die in der Kulturflüssigkeit in eine derartige, wie oben erwähnte, Aminoverbindung umgewandelt wird, wobei selektiv eine bekannte oder neue Bleomycin-Komponente, entsprechend der oben erwähnten Aminoverbindung, oder einer Aminoverbindung, abgeleitet von der oben erwähnten Verbindung, erzeugt und dann das bekannte oder neue Bleomycin durch bekannte Mittel aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

Die Bleomycine sind anti-Tumor-Antibiotika, die durch Umezawa et al. entdeckt wurden und in der Weise erhalten werden, daß ein Bleomycin-erzeugender, zu den Actinpmyces gehörender Stamm Streptomyces verticillus (z.B. ATCC No. 15003) aerobisch unter Rühren in einem Nährmedium, enthaltend Hirse-Gallerte (Hauptkomponente; Maltose), Glucose, Sojabohnenpulver, Korn-EinweichflÜBsigkeit, Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Zinksulfat, Kupfersulfat, eto., gezüchtet und das erhaltene Bleomycin isoliert und in Form des Hydrochloride oder des Sulfates aus der Kulturflüssigkeit durch

- 3 009843/1946

Aufgreifen derartiger Mittel, wie die Verwendung von Ionenaustausch-Harzen, gewonnen wird. Sie enthalten A.-, A₂-, A«₂-, A₃-, A₄-, A₅-, A₆-, B₁-, B₃-, B₃-, B₄-, B₅-, B,-- und dergleichen -Komponenten (nachstehend als die Bleomycin-Komponenten bezeichnet) und diese Bleomycin-Komponenten werden als weiße Pulver erhalten, wenn sie ferner noch einer Behandlung zur Entfernung des Kupfers unterworfen werden. Bleomycin ist als allgemeiner Ausdruck für Antibiotika, welche diese Komponenten enthalten, bekannt geworden (Britische Patentschrift 1 O38 242).

Wenn die Züchtung unter gewöhnlichen Bedingungen vollzogen wird, werden diese Bleomycin-Komponenten gleichzeitig erzeugt, jedoch ist das Verhältnis der einzelnen Komponenten nicht bestimmt und in den meisten Fällen werden hauptsächlich die Bleomycine Ap und B_? erzeugt.

Es wurden nun mit dem Ziel, ein Verfahren aufzufinden, bei welchem gewünschte Bleomycin-Komponenten aus den vorstehend erwähnten selektiv mit günstigen Ausbeuten erzeugt werden können, Untersuchungen über die Strukturen der Bleomycine durchgeführt und gefunden, daß die Bleomycin-Komponenten eine derartige Teilstruktur aufweisen, wie sie durch die nachstehende Formel (I) dargelegt wird, und daß R in der Formel in Abhängigkeit der Art der Bleomycin-Komponenten variiert.

- H -009843/1948

COR

-KH-CH-CC—MH(CH₂)₂ -AgJ* (D

CHOH
ι

.CH₃
Bleomycin A₂; R= -ΜΪ-(CK₂K-S<

^J CH₃

Λο·: R= -HII-

A₅1 R=- Wd - (CH₂) 3- MI - (CH₂)4- KH₂ A₆: · R ζ= -Wd-(CH₂)3- Mi - (CH₂)4- KH - (CH₂) 3 - HH₂

BIeoar/ein B₂: R = - SH - (CH₂) 4 - KH - C - KH₂

(I

BH-B₄; R = - NH- (CH₂)₄- N- (CH₂^-₂

C=M HH

!
HH₂

iiasiorend auf die vorerwähnte Erkenntnis, wurden die Untersuchungen wiederholt, wobei festgestellt wurdo, daß bei Zugabe von verschiedenartigen Aminoverbindungen, entsprechend dem Seitenkettenteil R in der vorerwähnten Formel (I)j oder von Aminoverbindungen, welche der Züchtung in, dem Seitenkettenteil entsprechende, Amine umgewandelt werden, zu den Kulturflüssigkeiten von Bleomycin-erzeugenuori Stämmen, gewünschte Bleomycin-Komponenten in ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden können, und daß, falle gewisse Arten von Aminoverbindungen zugegeben werden

■5-009843/1946

BAD CRiQiMAL

η»'.¹..·- -ieorny cine ,verschieden von den vorerwähnten Bleq-mycin mycinen, erzeugt werden und daß₄ die .neuen Bieomycine, nachdem sie aus den Kulturflüssigkeiten abgetrennt und gereinigt worden sindj in hohen Ausbeuten erhalten werden können, Auf der Grundlage der vorstehenden Erkenntnisse wurde die vorliegende Erfindung ausgeführt,

DIg vorerwähnten, In der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminoverbindungen können durch die nachstehenden 5 allgemeinen Formeln dargestellt werden:

ti) HI₂ - CII₂-X-Κ-ζ , (2) HH₂-CH₂-X-Ν—

" XL -..""■. I \

(3) EH₂-CH₂- X-SC , .(4) MH₂-CS₂-X-ΪΓ

(5) worin %*

iß*

Ε - (CH₂k2 -.H-

00S843/1946

~(CH₂)_n-C-

^ ' - OR9

Jfc¹, R² = H, Alkylgruppe, -(CH₂)_n4-H, (CH₂)_n4'-OR⁹\

I ι

RS'

(CH₂)_n4"^^D-R¹⁰", -C-HH₂ Ro"' HH "

= Alkylgruppe

R^a

ρ -2 h hi htt ilrtl

worin η, η , n^J, η , η- , η , η a eine ganze Zahi

■'■·■■■ "-■■ '-'S . ~M - ■ ■ :

von 1 bis 8, n' » eine ganz· Zahl von O bis 8,

6 6¹ 6" 7 7' 8 8¹ _Ö8^B _n8^MI 9 9* RfR » R >H)R (RyR » R » R » R » R

- 7'-. 0098A3/194S

2OO6446

10 10* 1O"

R , R , R = H, Alkylgruppe ist. Die gepunktete Linie in der Formel (z.B. -(CHp),- etc.)

seiet, daß ein Wasserstoffatom in der Kohlenstoffkette an einer beliebigen Stelle der Alky!gruppe substituiert sein k£.n"»i. Typische Beispiele der Aminoverbindungen, dargestellt durch die oben gezeigten, allgemeinen Formeln (1) bis (5), und der Verbindungen, welche in die erwähnten Aminoverbindungen während des Kultur-Verfahrens umwandelbar sind, sind nachstehend angegeben:

1,2-Diaininoäthan MH₂- (CH₂ >2-ΜΗ2

1,3-Diainiiiupropan 1 -, 4-üiaiüinobutan l_f 5-Diamin.opentan 1,.6-Diaminohexan

N-(2-Aminoäthyl)-1,2-diamino äthan

N-(3-Aminopropyl)-1,3-diaminopropan

N-(Aiainopropyl)-l,4- " '

diaminobutan (Spermidin) Mi₂-(CH₂)J-NH-(CH₂)^NH₂

N- (5-Aminopentyl)-1,5-diaminopenian

Mi₂-(CH₂ ^-
MI₂-(CH₂) 5-

Mi₂- ( CH₂ ) 2-HH- (CH₂) ₂-Mi₂ Mi₂- (CH₂ ) 3-HH- (CH₂) J-

MI₂-(CH₂ ) 5-NH-(CH₂) 5-NH2 ITH₂- (CH₂ ) 2-NH-CH₂-Mi- (CH₂) 2~

N,Π'-Bis(2-aminoäthyl)-diaminomethan

IT, N · -Bis (2-amihOäthyl) 1,2- NH₂- (CH₂) ₂-HH- (CH₂) ₂-NH- (CH₂ ) ₂-®&2 diaminoäthan

009843/194

ORlQiNAL

fa:

N, N · -Bis (3-arainopr opyl) -1,4- ITH₂- (CH₂) ₃-NH- (CH₂) ₄-NH- (CH₂) -5-, diaminobutan (Spermin) ^J '

IT, IT · -Bis ( 3-aminopr opyl) -1,6- NH₂- (CH_?) ,-NH- (CH₂) ₆-NH- (CHp) *-NHp

(linm-iTinhQvcm c. J c- J C

diaminohexan

N,N·-Bis(5-aminopentyl)-1,5- MH₂"(^CH2)¹J-NH-(CH_P)ς-ΝΗ^(CHp)ndiaminopentan ^c ' ^J

2,4,4-Triinethylpentamethylen- NH₂-CH₂-C- CH-(CH₂)₂-diamin fag

1,2-Diaminopropan NH₂-CH₂-CH-CH₂

NH₂

IT-Me thyl-1,3-diaminopr opan ITH₂- (CH₂) yl

N-Butyl-1,3-diaminopropan NH₂-(CH₂)₅-NHC₄H₉

N-Octyl-1,3-diarainopropan NH₂-(CH₂ J₅-NH-(CH₂) 7-CH₅

.CH₅ N,N-Dimo thyl-1,2-diaminoäthan BHo(CHo)_PN f

^{6 d} ^XCH₅ . ·

^^C2^H5 · N, N-Di äthyl-1,2-diaminoäthan· NH_P (CH₂) pN Γ

^{d d} * ^C₂H₅

^CH₅ N, N-Dime thy 1-1,3-diaminopr opan NH₂-(CH₂J₅-N^

CH₅

N,N-Di äthyl-1,3-diaminopropan NH₂-(CH₂)₅-N:

3-Aminopropyl-trimethyl- NH₂-(CH₂)₅-NV CH₅ ammoniijm-chlorid . 'Θ" /-,ττ_

Cl ^0H5 Θ/^0Η3

3-Aininopropyl-trimethylain- KH₂- (CH₂ )₅-Nr CH₅

monium-bromid Jc^

- 9 009843/1946 '

, CH₃

N-(3-Mme thylaminopr opyl)- NH₂-(CH₂ J₅-I^ (CH₂ J₅-N ζ l,3--d!Laminopropan \ . CH₃

N-(3-Methylaminopropyl)-1,2-

diaminoäthan NH₂-(QS₂J₂-NH(CH₂J₅-NHOH₃

N-(3^toifet'hylaminopropyl)-l,4- '

diaminobutan ' \ NH₂-(CH₂)4-NH-.(CH₂)3-NHCH₅

N-(3~Methylaminopropyl)-l,5~ .

diaminohexan , NH₂-(CH₂Jg-NH-(CH₂J₅-NHCH₃

H-(3~MethylaminopropylJl,8- ■

diaminooetan NH₂-(Ch₂)Q-NH-(CH₂J₃-NHCH₃ -~

N-Butyl-H'—^-aminopropyl-l^- '

diaminopropan . NH₂- (CH₂ J₅-NH-^ (CH₂) 3-NH-C₄IIg

t^S^^r^^^^ NH₂-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₂-N< ^SpiSSr^in0W^^^ NH₂-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₄-N^

dlimlnoÄ NH₂-(CH₂J₅-NH-(CH₂J₆-N^ ^

N-(8-Dimethylaminooctyl J-1,3- .HH₉-(CH₉J^-NH-(CHp)₈-NC ⁵ diaminopropan ^d '^z 3 -° GH*

N-(3-Hydroxypropyl)-l,3- , ' . .

diaminopropan . NH₂-(CH₂J3-WH-(CH₂J₃-OH

N-(2-Hydroxypropyl)-l,2- NH₂-(CH₂J₂-NH-Ch₂-CH-CH₅ diaminoäthan ^: ; . qjj

N-(2-HydroxyathylO-l,3- , \ ■ / " .-

diaminopropan' ■■ NH₂-(CH₂J₅-NH-(CH₂J₂-OH

N-(3~Methoxypropyl)r.l,3- , -

diaminopropan ,,_V,Y _ NH₂-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-OCH₅

N-(3-Qctyloxypro$y§>-l,3- ' ' _v — ^

diaminopropan " "^{Ά m}2^^2lT^Z^^CEUT^0GQEl^

N-(3-Amino-l-methylpropyl) 1,3-diaminopropan

N-(3~Amino-l-äthylpropyl)-1,3-diaminopropan

N, U-Bis (3-aminopropyl) metiiylamin

IT, N~Bis (3-aminopropyl )-äthylarain

N, U-Bis (3-aminopropyl)-" n-butylamin

KH₂- (CH₂) ,j-UH-CH- (CH₂) ₂-NH₂

NH₂-NH₂-

NH₂

(CH₂)2-NH-CH- (CH2)2-NH₂ C₂H₅

(CH₂)3-N-(CH₂)3-CH3

(CH₂) 3-N-(CH₂)3-C₂H₅

NH₂-(CH₂)₅-N-(CH₂)3-C₄H₉

^X3

3-Aminopropyl-dimethylsulfonium NH₂-(CH₂)3-S' bromid iCfCH,

3-Aminopropyl-diciethylsiilfonium NH₂ chlorid

Br

.(GH₂)J-S_x, Cl

.CH,

3-Acetaminopropyldimethylsulfonium-bromid ■ Br

3-Amino~3-carboxypropyldime thylsulfonium-chlorid

3-Amino-3-carbamoylpropyl dime thyls ulfonium-chlorid NtI₂-CH-(CH₂J₂-S;

Cl

CH₃

M₂-CH- (CH₂) 2-

CONH Cl

4~(Aminobutyl)-guanidin (Agmatin)

)₄-NH-C-NH * Il NH

0098 4 3/1946

NH₂-(CH₂J₅-C-

NH

NH₂- (CH₂ )₂-N_wN

M₂-(ttI₂)₃-N> NH₂-(CH₂)₅-I

NH₂-(CH₂)3-N N-CH₃

3-Aiüid inopr opylamin

N-3 (Amiiiopropyl) -pyrrolidin N-(3-Aminoprdpyl)-piperidin N- (2-Amino ä thyl) -piperazin N-(3-Aminopropyl)-piperazin N- (3-Aiiiinopropyl) morpholin

N- (3-Aminopropyl)-N': - ' möthylpiperazin

N-(3-Aminopropyl)-N'-

äthylpiperazin

N,N'-Bis(3-aminopropyl)-piperazin

N- [3-(Pyrrolidino )-propylJ 1,3~diaminopropan

N- C3- (Piperidino) -propylj 1,3-diaminopropan

N- 3-(Piperazino)-propyl ■1,3-diaminopropan

N-(Morpholinopropyl)-l,3-diaminopropan

N-Benzyl-1,3-diaminopropan . NH₂-(CH₂)3-NH^

NH₂- (CH₂) 3-N_wN-C₂H₅ NH₂- (CH₂) 3-N^JT- (CH₂) 3-NH₂ NH₂-(CH₂) 3-NH-( CH₂) ₅-

NH₂- (CH₂) 3-NH- (CH₂) 3-1Q NH₂- (CH₂) 3-NH- (CH₂) 3"O

0 09843/1946

N, N-Dibenzyl-l,3-diaminopropan IiHp- (CH₂) «-ΙΓ

-CH₂'
CH₂.

N-(l~Phenylethyl)-1,3-diaminopropan

I
CH3

m-Xylylendiarnin p-Xy Iy le nd i amin

CH₂-NH₂

NH₂-CH₂--^^- CH₂-NH₂

N-Cyclohexyl-l^-diaminopropan

diaminopropan

»H₂-(CH₂)₃-_liH-(CH₂)3-NH.CH₂-

NH₂- (CH₂ ) 3-ΝΪΙ- (CH₂) 3-NH-CH-

CH,

0098Λ3/19Α6

N", F-Diraethyl-1,3-diaminopropan CHj-KH- (OT₂ J₃-NH-CH₃ 4-Piper idyline thy lamin . NH₂-CHg—\__,N

2-(4-Imidazolyl)-äthylamin. (Histamin)

-'·■■■■ CH*

N,F-Dimethyl~NL-acetyl- OTiO(HSE-(CHo J*-N< '*

1,3-diaminopropan -> . . ' ' ^XCH

N,N-Mmethyl~N'-propionyl- CoHc-CO-NH-(CHo h-N'

1,3-diaminopropan ^P - *> J ^Ν0Η·ζ

.CH₃

l-Carboxy-4-dimethylamino- HH₂-CH-(CH₂ )₃-N^ butylamin I CH₃

COOH

■■ -

l-Carbamoyl-4-aimethylamino- M₂-CH-(CH₂J₃-N

butylamin ' I · ₃

..■.:.■■."■ ^ CONH₂ . . ■- :

, CH*

Ν,Ν-Dimethyl-H'-benzoyl- /^\ CONH-(CHo)₁₅-NC/ '

1,3-diaminopropan ^t/" CH₃

Wenn -3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbrpmid oder 3-Amino-3-carboxypropyi-dimethylsulfoniumchlorid beispielsweise als Aminoverbindung zu einem Nährmedium zugegeben und ein Bleomycin-erzeugender Stamm wie Streptomyces vertlcillus in dem erwähnten Medium gezüchtet wird, wird die Produktivität von Bleomycin A₂ im Sinne einer Erhöhung des Gehaltes {%) 'von Bleomycin A_? unter den gesamten Bleomycinen, welche in der

Kulturflüssigkeit vorhanden sind, gesteigert. Desgleichen erhöht die Zugabe von Agmatin-hydrochlorid den Gehalt {%) an Bleomycin B-, die Zugabe von 1,4-Diaminobutan erhöht den Gehalt {%) von Bleomycin A' und die Zugabe von Spermidin erhöht den Gehalt von Bleomycin A₁-. Gleichwohl führt die Zugabe von Spermin nicht nur zu einer Produktion von Bleomycin Ag der entsprechenden Seitenkette, sondern auch zu einer Produktion von Bleomycin A₁-, welches in der Seitenkette Spermidin aufweist, welches sich während der Züchtung aus dem Spermin gebildet hatte. Im Falle eines Stammes, der eine hohe Fähigkeit zur Umwandlung von Spermin in Spermidin besaß, führte die Zugabe von Spermin hauptsächlich zur Produktion von Bleomycin A₁-. Ebenso führte die Zugabe von beispielsweise 1,2-Diaminoäthan oder l,3~Di~ aminopropan zur Produktion von neuem 2-Aminoäthylaminobleomycin oder 3~Aminopropylamino-bleomycin. Ferner bringt eine solche Verbindung mit einer Polyamin-Kette wie N,N-bis(3-Aminopropy1)-methylamin.hauptsächlich ein,solches neues Bleomycin wie 3~(N-Methyl-N-3~aminopropylamino)-propylamino-bleomycin hervor, welches die gleiche Seitenkette besitzt wie diejenige der zugegebenen Verbindung und außerdem verkuppelt es ein Amin mit niederem Molekulargewicht, welches sich aus dem erwähnten Additiv während: der Züchtung gebildet hatte, zu dem Nebenprodukt 3-NHVIe--.. thylaminopropylamino-bleomycin.

009843/1946

:J

Daß Mikroorganismen derartige Fähigkeiten wie die der Ester-, spaltung, der Dealkylierung und der Decarboxylierung besitzen, ist wohlbekannt und Aminoverbindungen, welche sich während des Kulturverfahrens in die Amine der Bleomycin-Seitenkette umwandeln, sind in der vorliegenden Erfindung einbezogen wie die Aminoverbindungen, welche durch die vorerwähnten allgemeinen Formeln (1) bis (5) dargestellt werden. Zum Beispiel können Verbindungen, in welchen NHp- in den vorerwähnten allgemeinen Formeln (.1) bis, (5) acyliert oder alkyliert ist, oder in welchen Wasserstoff der Methylen-Gruppe in der 2-Stellung von NHp- durch eine Carboxylgruppe oder eine Säureamidgruppe ersetzt worden ist, und welche im Stoffwechsel leicht zu Aminen umgesetzt werden, wie die Aminoverbindungen, dargestellt durch die vorerwähnten allge-r meinen Formeln (1) bis (5) verwendet werden.

Im allgemeinen werden die Aminoverbindungen, welche zuzugeben sind, entweder so wie sie sind oder in Form ihrer anorganischen Salze verwendet, jedoch variieren die Konzentrationen derselben in der Kulturflüssigkeit in Abhängigkeit von ihrer Art/Beispielsweise wird im Fall von 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid, Spermin und Spermidin eine Konzentration von zumindest 0,2 bis 9,k mg/ml benötigt, wohingegen im Fall von S-Amino^-carboxypropylTdimethyl-sulföniumchlorid eine Konzentration in Höhe von zumindest

: - 16 0098 43/1946

4O mg/ml erforderlich ist. Ferner ist im Fall von N-(3-Aminopropyl)-morpholin und N-[3-Morpholino-propyl]-l,3-diaminopropan eine Konzentration von etwa O₅I bis 0,5 mg/ml ausreichend, wohingegen im Fall von N-(2-Aminoäthyl)-piperazin und N-(3-Methoxypropyl)-l,3~diaminopropan eine Konzentration von etwa 2 mg/ml notwendig ist. Im allgemeinen jedoch ist eine Konzentration von etwa 4 mg/ml adäquat.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in folgender V/eise durchgeführt:

In der praktischen Ausführung des vorliegenden Verfahrens wird es bevorzugt, ein Medium zu verwenden, welches hauptsächlich aus Kohlenhydraten und Stickstoff-enthaltenden organischen Substanzen, wie z.B. Hirse-Gallerte, Glucose, Stärke, Sojabohnenpulver, Korn-Einweichwasser, etc., besteht und welches kleine Mengen an anorganischen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Natriumchlorid, Nitrate, etc., inkorporiert aufweist. In diesem Medium wird Streptomyces verticillus oder ein Bleomycin-erzeugender Stamm von im Wachstum abweichenden Tochter-Kolonien derselben aerobisch gemäf6 den üblichen Arbeitsverfahren gezüchtet. Danach wird die Kulturflüssigke^t filtriert und das Filtrat an beispielsweise einem Kation-Austauscher-Harz, welches eine reaktive Gruppe wie eine

- 17 009843/1946

Carboxylgruppe besitzt, adsorbiert und anschließend mit . wässeriger. Salzsäure-Lösung eluiert. Nachfolgend wird das Eluat hintereinander den Stufen der Adsorption an Aktivkohle^ Elution mit wässeriger Aceton/Chlorwassersto'ffsäure-Lösung, Tonerde-Adsorption, Methanol-Elution,Adsorption an Sephadex (Handelsname für ein trockenes,, unlösliches Pulver, zusammengesetzt aus mikroskopischen Perlen, welche synthetische, organische Verbindungen sind, abstammend von dem PoIysaccharid-Dextran; hergestellt und verkauft durch Pharmacia Pine Chemicals Inc.) und Elution mit destilliertem Wasser unterworfen, wodurch ein Bleomycin-hydrochlorid-Pulver erhalten wird. Für eine weitere Reinigung des so erhaltenen Pulvers wird es vorgezogen, eine chromatographische Elution mit Ammöniumchlorid- oder wässeriger Ammoniumformiat-Lösung, unter Verwendung von CM Sephadex als Träger anzuwenden. Schließlich wird das Eluat an Aktivkohle adsorbiert und den Stufen der Wasserwäsche und der Elution mit wässeriger · · Aceton/Chlorwasserstoffsäure-Lösung unterworfen, wodurch eine reine Bleomycin-Komponente erhalten werden kann. .

Wenn in .Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eine Bleomycin-Komponente in ausreichfndein; Maße selektiv in dem Kulturmedium erzeugt wurde'--, kann die Stufe der Abtrennung unter Verwendung von CM Sephadex weggelassen werden.

.OTOGlNAl, INSPECTED

Bleomycine haben die Eigenschaft, mit Kupfer Chelate zu bilden und werden aus der Kulturflüssigkeit als blaues Pulver erhalten, jedoch kann das Kupfer mittels Durchführung einer Behandlung zur Kupferentfernung in irgendeiner der Extraktions- oder Reinigungsstufen entfernt werden.

Mehrere Eigenschaften der gemäß der vorliegenden Erfindung f erhaltenen Bleomycine werden in Tabelle I gezeigt.

009343/1946

	1	T	Name und physikalische Eigen schaften des Additives	a b e 1 1 e I (linkei	* Teil)
	2	3-Aninopr opyl-diinethylsulf oniun bromid - hycLrobromid pp. 87 - SS⁰C.	Gehalt an neuer,, (^' (Kaupt-) Komponente in den gesamten, durch Extraktion er haltenen Bieoinyolnen *(%) ·*	Name und Seitenlcettenstruktur des■-.' neuen (Haupt-): 'Bicir.ycins ' ~\ : , *
C	3	J-Amino-^-carbpxypropyl- ' . dimethylsulfonium-chlorid Pp. 139 - 14O⁰C. (Zers.)	72	Bleomycin &2
C cc OO *"· OJ	4	Agraatinsulf at Pp; 231⁰C.	87	Bleomycin A2
9 V 61	5	1,2-Diaminoäthan Kp. 116 - 117⁰C.	76	Bleomycin B2
	6	1,3-Diaminopropan Kp. 135 - 136⁰C	80	2-Aminoäthyl-bleomycin HH₂(CH₂ )₂M-
	7	1,4-Μβπι1ηοϊ)α.ΐαΐι Kp.. 158 - 16O°C.	⁸5	3-AminoproOyl-bleomycin HH₂I CH₂) ₃HH-
	SOerniidin Kp. 115°C/3 am Hg	85	Bleomycin A'₂ t ,
	^> 90	Bleomycin A5

Tabelle I (linker Teil; Portsetzung)

	s	Spermin Kp. 150 - l6O°C/3 mn Hg	91	Bleomycin A5
C C cc cc -P-	9	IT, 17-Dime thyl-1,2-diamino äthan Kp. 105 - 108⁰C.	91	3~N, ΕΓ-Dime thylaminoäthylamino- iDleomycin O U(CH₂) 2¹^- CH₅-
3/1946	10	IT, IT-Di äthyl-1,2-diaminoäthan Kp. 147 - 151⁰C	84	3-1T, F-Diäthylamino äthylamino- bleomycin C₂H₅. ⁵ ^1T(CHp )?m- C₂H₅
	11	IT, IT-Di äthyl-1,3-diaminoTDropan KP- 166 - 172⁰C.	95	3-N, H-Diäthylaminopropylamino- bleoinycin CpHtr^ ^ U(CHp), MH- C₂H₅ ⁵
		IT-Sutyl-F' - (3-aiainopropyl )~1,3- dianinoOroOan Kp. 125 - 126°C/3 ma Hg	96	3- ^3- (H-Butyl) -aminopropyl] -amino- propylamino-bleomycin C₄H₉ITH (CH₂) ₅ΣΤΗ (CH₂) ^HH-

Tab e lie I (linker Teil j Fortsetzung)

CO 00

ω >

tu

15	2T-(2-üydroxypropyl)-l,2- · ■ diasänoätliari Kp. 123 - 126°C/12 mn Eg	95	2-(2-Hydrosypropyl)-aminoäthylamino- bleoavci?.! CH₅CHCH₂IiH (CE₂) 2^i- ■ oh ' ' .: ' ':
14	N-(3-Aminopr 0T>yl )-piperazin KP· 80 - 81^öC/2 mm Hg	80	3-Piperazinopropyla2nino-bleomycin iTjJ-(CH₂) 3KH-
1 15	IT-(1-Phenyl äthyl)-H' - (3-aminopr opyl)- 1,3-diamin.oOropan KpV 150 - 153°C/Äm Hg	72	3- (3- (ϊΤ-1-Phenyläthyl) -aiainopropyl·} - äminopropylamino.-bleomyein .. ^)-CH-IiH(CH₂)3-IiH(CHa)3KH- , ■■■;. ' ^3 ■:.■ ■■■. \ ■■■■■ :
16	1,2-Diaminopropan Kp. 118 - 119⁰C.	90	2-Aminopr opylamino-ble omy ein CH₅-CH-CH₂-HH- SH₂
17	IT-Me thyl-1,3-diann η opropan Kp. 138 - 142⁰C. ■	81	3-N-Methylamin'opropylämino-bleoiiiycin CH₅T-HH-(CH₂)^-SIH-
is	Ef-Bu±yl-1,3-dianinoT)roT3ane Kp. 114 - il6OC/20 min Hg		3-H-Butylaminopr opylamino-ble oisycin • , CH₅- (CH₂ )₅-HH-( CH₂ ).₅-HH-

ro ο

CD

Tabelle I (linker Teil; Portsetzung)

σ co αο

19	N,N-Diriethyl--1, 3-diaminoprot>an 132 - 135.5⁰C	95	3-(N,U-Dime thyl)-am inopropylamino- "bleomycin CH₃ ■ ^2T-(CH₂)₃-1S- CL₃
i 20	3-Aminopropyl-trime thylamraonium chlorid Fp. 200 - 201⁰C.	95	3~ (IT, N, N-Tr ine thyl) -aminopropy !amino bleomycin CH3_X© CH^ -N- (CH₂) 3-NH- CH^i
21	N- (3- (JT, N-Dime thyl) -aminopropyl) - 1,3-diaiainoOropan Kp. 125°C/23 mm Hg	85	3- (3-(l?,N-Mmethyl)-aminopropyl}- aminopropylamino-bleomycin CH,, ^y ^N- ( CHo) ,-FH- (CH₂) I₅-HH- CH₅ ^ ^
22	N, N-Bis (3-&minopropyl)-methylamin Kp. 97 - 100°C/2 mm Hg	72	3-(N-Methy1-N-aminopropyl)-amino- propylamino-bleomycin ITH₂-(CH₂) 3-N-(CH₂) ₅-NH- CH3
ZZ	ΪΤ-(3~Amino-l-me thylpr opyl)-1,3- dianinoOrosarL " Kp. 123,- 125°C/21 mm Hg	70	3-(1-Methyl-3-aminopropyl)-amino- propylaaino-bleomycin BH2-(CH₂)2-CH-HH-(CH₂)₅-NH- CH₅ »

a b e lie I (linker Teil; Fortsetzung)

OO •Tv

2<i	!T-3-AsiinoT>ropyl-Oyrrolidin Kp. 185*-· 189⁰C	95	3- (Pyrrolidino) -propylaraino- bleomyoih ' \JB- (CH₂) 3-2H-
I 25	IT-3-AninoproT)ylpiperidin Kp. 100°C/20 mm Hg	98	3- (Piperidino J-propylamino-bleoiny c in Qt- (CH₂ )₃-be- .
26	N-3-Aminopropylmorpholin Kp. 219°C/733 mm Hg	100	3- (Morpholino) -propylamino-bleomycir iQsr-(GH₂·) 3-NH-
27'	IT- 2-Aminö athy lpiper a zin Kp. 280 - 281⁰C. ■	87	2-(Piperazino)-ätnylamino-bleomycin ϊΓ\- (CH₂)2-ϊίΗ-
28	N_fN-Bis-3-aniinopropylpiperazin Kp. 188 - 202⁰C/21 mm Hg	95	3-(l-{4- (3-Aminopropyl) J--piperazino^· propyiamino-lDleomyciii ^ KH₂- ( CH₂ )₃-ϊΓ~\- ( CH₂) 3-HH^-
29	N- (3-(Pyrrolidino )-propyrJ -ti, 3- diaminopronan Kp. 159 - l62°C/22 mm Hg •	76	3- (3- (Pyrrolidino) -propyl] -amino- propylamino-bleomycin Qt- (CH₂) 3-EH- (CH₂) 3-HH-'

	30	N-(3-(Piperidino)-propyl}-1,3- dianinoprοpan	: s. b e 1 1 e I (linker Teil; Portsetzung)	3- (3-(Piperidino)-propyl]-amino- propylamino-bleoniycin
		Kp. 164 - 167°C/21 inn Eg	89	Qff" ^ ^CH2 ^ 3^-ΕΗ" (^2) 3~^M~
	31	3Si- (3- (Morpholino) -propyl) -1, 3- dianinopropan		3- (3- (Korpholino) -pr opyl j -arnino- pr opylaraino-"b le oay ein
		176 - 180°C/20 mm Hg	79	0~\- (CH₂) ₅-3SH- (CH₂) 3-EH-
O ο	32	H- ( 3-Hydr oxypr opyl) -1,3-diamino- propane (hydrochloride)		3-(3-Hydroxypropyl)-aminopropylamino- bleomycin
ta OO -Ρ» co		Fp. 119 - 12O⁰C	85	HO- ( CH₂) 3-ΙΪΗ- (CH2) 3-BH-
co	33	H-(3-Methoxypropyl)-1,3-diaminopropan (hydrochlorid )		3- (3-Me thoxypropyl) -aininopropylaminc bleomycin
O)		Em.p. 225°C	88	CH3O-(CH₂)3-KH-(CH₂)3-KH-
		F-Benzyl-1,3-diaminopropan		3-Benzylaminopropylamino-"bleomycin
	jr*	Kp. 150 - 155°C/25 mm Hg		(j{3)- CH₂-HH- ( CH₂) 3-HH -
			(W	3-(1-Phenylethyl)-aminopropyl-
	35	2T- (1-Phenyläthyl) -1,3-diaciinoüroT)ane		anino-ble omycin
	JJ	Kp. 148 - 15O°C/24 cm Hg	PQ	<^>- CH-HH- (CH₂) 3-IIH- CH3
fo KS J

ro ο ο

Tab e I 1 e I (linker, Seil; Fortsetzung)·

la-Xyiylendiamin

Kp. 138 - 139°C/9 mc· Hg

37

p-Xylylendiamin Fp. 35⁰C

ο ο co 00

CD

m-AminomethyHDensylamino-bleomycin

p-Aminone t hy

iiizylarnino - ble ony c in CH₂-HH-

IT-Cycloliesyl-l, 3-diaminopropan

Kp, 124 - 125^OC/21 mm Hg

39

N- ( 3-Oyclöhexylaiainopr opyl) -1,3-diaminöpropan

Kp. 180⁰C/ 21 mm Hg

S-Cyclpliesylaminoprppylaminobleomycin '

3- (3-Cy clohexylaminopr opyl) -aiaino propylamino-blePmyeln

Έ\ -HH (CH₂) 3-HH- (CH₂) 3"

40

ΪΓ- (2-Purf uryl) -1,3-diamlnopr opan Kp. 105 - 109°C/3 mm

3- (h- (2-i¹urf uryl)] -aminopr opylamino-"bleOmyein

JIq]I-CH₂-HH- (CH₂ ) 3-KH-

41

4-:

lamin

Kp. 78^&C/5 mm Hg

4-Piperi dylme thylamino-bleomycin

/^V-CH₂-HH- .... ,

\ r

42

2- (4-Imida ζ olyl) -äthylamin hydrochlorid

Fp. 247 - 25O⁰C

2-(4-Imidazolyl)-ä thylamino-b leomycin m

§ JL(CH₂) 2-HH-

Tabelle I (rechter Teil)

Nr.	Eigenschaften der neuen (Haupt-) Bleomycin-Eydrochloride	H	15.51	S	Wirk- (2) sänkeit (dcg/ng)	Chronatograpiiie (Hf) (3)	Papier	Reaktion (4)	S	Aussehen	Ultraviolett absorption s- maximan (el//.)
1	Elementar -Analys.e ($)	6.14	15.51	6.43	941	Dünn schicht	0.85	.ir	—	Blaues Pulver	293 243
2	C	6.14	17.41	6.43	941	0.39	0.85	-	-	H	293 243
3	44.13	6.31	16.60	3.34	3094	0.39	0.66	-	+	Il	293 244 '
4	44.13	6.15	16.51	4.21	1700	0.72	0.80	—	. -	Il	293 244
VJl	43.92	6.20	16.78	4.18	1934	0.62	0.81	+	—	It	293 244
6	43.12	6.02	16.39	4.25	1232	0.60	0.81	+	-	Il	293 244
7·	43.15	6.34	4.05	2700	0.66	0.88 .	+	-	Il	293 • 244
43.93		0.16	+
43.81

T ab ell e .l· (rechter Teil: Fortsetzung)

	43.81	6.34	16.39	4.05	2700	0.16 ■	0.83	+	■M	Il	. ———i-i ι —■ ".mi ii.agav* .293
8
											.244
	43.20	6.25	16.48	4.13	897	0.46	0.86				294
9								•		It*	244
	45.01	6.35	16.14	3.91	1102	0.48	0.89	—	—■		294
10										Il
	43.91	6.30	15.96	4.00	1036	0.40	0.87				■ 244
11										Il	294
	43.00	6.62	16.40	3.78	5840	0.23	0.84				244
12										Il	294
										244

CVJ CVJ

I

ί

■ς!

O> Nj"

I
;

ω

O

3 K

cn Nj-

2006446

Nj- Nj-

ί

OD

Oj cvj

O
I

O

OJ OJ

Nj- Nj-

cn Nj-

-

O

I

cn Nj-

CVJ CVJ

OJ OJ

I

VD

VD
•
ο

OJ

to

C-

α

N

O

H

•Ρ

ν»/
CVJ

cn
. ·

ω

ο

C

H

in

b

ιη

VO

H

to

I

H

I

•Η

on

H
CVJ

I

(U

to

VO

I

VD

H

QJ

H

I

cn

I

+

•Ρ

in

Nj-

I

.α
O

•

Nj-

I

OJ

Nj-

in

H

U

in

H

C-

OD

to

H

•

d

to

ω

Ni

00

d

OJ

VD

d

. I

H

O

VD
d

O

H

C-
d

φ

in
d

O

to

oä

O

C-

O

Ln

H

O

OJ

vo

C-

O

H

co

H

OJ
•

to
*

OJ

in

O

00

to

VD

H

O

VD

VO

OJ

cvj

H

Nj-

VD

OJ

O

VO

H

VD

H

H
to

H

O

CVJ

VO

in

ω

VD

O

in

to

C-

to

Nj"

°?

to

in

VO

to

H

Nj-

00

C-

H

009843/1946

- 29 -

	44.	16	6.	35	16	.30	4	869	T	a b e	1 1	e	I (rechter	+	Teil;	Fortsetzung)	■294. , .
19										0.	28	0	.83				■ ,244,
	44.	71	6.	41	16	.21	4	633						+		■' ■ ■...■■	294
20										0.	38	0	.89			1!	244
	43.	80	6.	35	16	.91	4	1200								294
Γ 21										0.	14	0	.83		■ ¹II	244
	43.	20	6.	20	17	.00	4	1671								294
22										o.	23	o	.33		η	244
	ΐ\ U₁ \ 43.	42	6.	25	16	.80	4	1820								294 '
23										0.	32	0	.84		Il	• 244

	.09

.00

.05

;09

.11

α>

Tabelle I (rechter Teil; Fortsetzung)

	24	44.90	6.22	16.20	4.12	1066	0.36	0.88	—	-	Il	294 244
O O	25	44.71	6.38	16.17	4.21	1257	0.14	0.86	-		If	294 244
(O										-
CD	26	44.36	6.25	16.15	4.03	592	0.65	0.83	-		It	294
3/1										-		244
CO CT5	27	44.38	6.30	16.78	3.95	799	0.36	0.85	-	-	ti	294 244
	28	44.01	6.14	17.52	3.90	1130	0.25	0.86	+	-	It	294 244
	29	44.20	6.41	16.80	3.98	2564	0.1	0.88	-	Il	294 244

T a b ell e I (rechter Teil: Fortsetzung)

30	44.30	6.51	16.62	4.00	3580	0.14	0.88	■ '	.-	■ ■ —	Il	294
31	44.52	6.30	16.20	3.89	1201	0.38	0.87	-	-	Il	294 , 244
32	43.76	6.40	16.38	4.22	1300	0.63	0.86	-	-	tt	294 · 244
33	43.91	6.35	16.21	4.10	1335	0.54	0.87		- .	Il	294 -244
34	45.40	6.41	15.30 V	4.00	1986	. 0.53	0,70	-	-	Il	294 244
35	45.39	6.42	15.13	4.13	2400	0.62	0.85	-	294 244 .

ro ο σ

	44.89	6.28	15.98	4.19	1	2546	a b e 1	1 e X (ι	"•echtei	* Teil;	Fortsetzung)	Il	II	294 244
36	44.80	6.30	15.70	4.18	2350	0.61	0.66	. +	—	fl	ti	294 244
37	44.91	6.60	15.27	4.03	5355	0.58	0.64	+	—	t)	Il	294 244
38	44.02	6.63	16.48	4.02	11215	0.57	0.79	-	-	η	294 244
39	46.39	6.37	16.48	4.35	1450	0.24	0.80	-	-		294 244
40	44.60	6.43	16.20	4.25	1394	0.67	0.83	-	-	294 244
41	43.85	6.25	16.80	4.28	847	0.41	0.72	-	-	294 244
42				0.40	0.70	-	-

2 DO 6 4 46

Das Infrarot-Absorptionsspektrum und das Ultraviolett-■ Absorptionsspektrum von mehreren Verbindungen in Tabelle I werden in den anliegenden Fig.l bis Fig.β wie folgt gezeigt : ' ■

Fig. Spektrum

Name der Verbindung

Verbdg. Nr.

IR

UV IR

3~t3-(N-Buty1)-aminopropy1] aminopropylamino-bleomycin

3-(1-Methy1-3~aminopropy1) aminopropylamino-bleomyein

3-(3~Cyclohexylaminopropy1) · aminopropyiamino-bleomyein

It

Il

39

It

Anmerkungen:

(1) Der Gehalt an neuem (ioder hauptsächlich erhaltenem Blöon^cin wurde so gemessen, daß das Bleomycin (Mischung der einzelnen Komponenten), erhalten durch j. Züchtung und Reinigung, vjie in -jedem der Beispiele

gezeigt, vorher unter Veitwöndung von GM-Sephadex ab-. getrennt und anschließend das ÜV-Abaorptionsspektrum photometrisch bestimmt wurde.

009843/1946

(2) Die Wirksamkeit wurde gemäß der biologischen Prüfung unter Verwendung von Kupfer-freiem Bleomycin Ap-Hydrochlorid (Wirksamkeit 940 mcg/mg) als Standard-Substanz und M. tuberculosis 607 als Test-Mikroorganismus gemessen.

(3) Dünnschicht-Chromatographie:

Adsorbierendes Mittel = Silicagel

Lösungsmittel = 10:9:1-Mischung von Methanol-lO^

k" Ammoniumacetat-10#

W wässerige Ammoniaklösung.

Papierchromatographie:

Lösungsmittel = 10$-ige wässerige Ammoniumchlorid-Lösung

N= Ninhydrin-Reaktion, S = Sakaguchi-Reaktion.

Wie aus der Tabelle I klar hervorgeht, sind die neuen Bleomycine, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung, den bekannten Bleomycin-Komponenten im Aussehen und in der UV-Absorptionskurve ähnlich, jedoch sind sie offensichtlich von diesen in der Wirksamkeit (mcg/mg) und den Rf-Werten verschieden. Ferner ist noch erwähnenswert, daß im Falle der Hydrolyse der neuen Verbindungen mit starken Säuren die Amino-Verbindungen, welche als Additive für die Kultur verwendet wurden, oder die Amino-Verbindungen, welche während des Kulturverfahrens gebildet wurden, bei der gasohromatographischen Untersuchung der Hydrolysate gefunden

- 35 009843/1946

wurden und es hat sich bestätigt, daß sie Seitenketten-be- .· sitzen, entsprechend den zugesetzten Amino-Verbindungen oder' den während des Kulturverfahrens gebildeten Verbindungen.

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde es zum ersten Mal möglich, daß man unter den Bleomycin-Komponenten diejenigen, welche für individuelle therapeutische Zwecke geeignet sind, selektiv in hohen Ausbeuten und in reiner Form gewinnen kann. Beispielsweise können die Bleomycine A„ und A^₃ welche in ihren Anti-Tumor-Eigenschaften von starker Wirkung sind und eine geringe Toxizität aufweisen, selektiv erhalten werden. Ferner wurde es möglich, ein derartiges neues Bleomycin wie 3-Äminopropylaminobleomycin zu erhalten, welches ausgezeichnet in Wirkung und gering hinsichtlich seiner Toxizität ist.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Beispiele in detaillierter Form erläut.ert.

¹ B e i s ρ i e 1 1

Zu einem Medium mit der Zusammensetzung von 6,4$ Hirse-Gallerte, 0,5 % Glucose, 3,5 % Sojabohenpulver, 0,75 % Korn-Einweichwasser, 0,3" % Natriumchlorid, 0,1 % sekundäres Kaliumphosphat, 0,05 % Zinksulfat, 0,01 % Kupfersulfat,

- 36 - ^v 009843/1946

ΐ'" - 36 -

0,2 % Natriumnitrit und 0,01 % Toho Nr.1 (Handelsmarke für ein oberflächenaktives Mittel) wurde 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid-hydrobromat in einem Anteil von 0,4 mg/ml zugegeben, um den p_H~Wert des Mediums auf 6,5 einzustellen. Jeweils 100 ml des so behandelten Mediums wurden getrennt in eine Sakaguchi-Plasche eingefüllt und anschließend sterilisiert. Anschließend wurde Streptomyces verticillus (ATCC No. I5OO3) in das Medium geimpft und bei 27°C 8 Tage lang unter Rühren mit 130 Upm gezüchtet. Danach wurden die Kulturflüssigkeiten (4,5 1) gesammelt und filtriert, wobei man 3,0 1 Filtrat (Wirksamkeit 38,8 mg/ml, Gesamtwirksamkeit 4l6,4 mg) erhielt. Dieses Kulturfiltrat wurde aufgegeben und adsorbiert auf eine Säule, beschickt mit 200 ml Amberlite IRC-50 (Handelsmarke für ein Ionenaustauscher-Harz; Η-Typ), mit Wasser gewaschen und mit 0,5n-Chlorwasserstoffsäure eluiert. 1,0 1 des Eluates wurden neutralisiert, aufgegeben und adsorbiert an einer Säule, beschickt mit 100 ml Aktivkohle, mit V/asser gewaschen und anschließend unter Verwendung einer l:l(Volum-Anteile)-Mischung von Aceton/ 0,02n-wässeriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung eluiert und die gegenüber Mykobakterium 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in 5 ml einer 80#-igen, wässerigen Methanol-Lösung gelöst und auf eine Säule, beschickt mit 30 ml neutralem Alurainiumoxyd, aufgegeben, gefolgt von einer Elution mit einer 80£-igen,

- 37 009843/1946

- 37 - 200B446

wässerigen methanolischen Lösung. Anschließend wurden die Bleornycin-enthalt enden Fraktionen gesammelt und zur Trockne eingeengt, wobei man 195 mg Bleomycin-hydrochlorid' (Wirksamkeit 650,7 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 172 mg) erhielt. Die Ausbeute aus dem KulturfiItrat betrug 30,5$.

Das so erhaltene Produkt wurde mit wässeriger Ammoniumformiat-Lösung an einer CM-Sephadex-Säule auf die einzelnen Bleornycin-Komponenten aufgetrennt und gefunden, daß es 72,2$ an Bleomycin A_? enthielt. Dieses Trennverfahren wird in den folgenden Beispielen als CM-Sephadex-Verfahren bezeichnet.

In der gleichen Weise wie oben x^urden Versuche durchgeführt, wobei als Additive solche Amino-Verbindungen wie in Tabelle II gezeigt, verwendet wurden-. Die angewandten Bedingungen und die erhaltenen Resultate sind aus Tabelle II zu ersehen.

- 38 .0098A3/194S

Tabelle II (linker Teil)

Nr.	Name des Additivs	Konzen tration ' (mg/ml)	Züch tungs- zeit (Std.)	Filtrat- menge (Liter)	Wirksam keit (mcg/rnl)
1	3-Aminopropyl-di- me thylsulfonium bromid -hydrobromat	0.4	192	3.0	138.8
2	3-Amino-3-carboxy- propyl-dimethyl- sulfonium Chlorid	40.0	192	1.65	100.0
3	Agmatin hydrochlorid	2.0	240	2.0	200.0
4	Spermin	0.2	264	1.1	150.0

ro ο ο

label 1 e II (rechter Teil)

ο co co

CO

Nr.	Gesamt- wirksam keit (mg)	Harne des neuen,, mit -CM-Sephadex isolier- .ten Bleomycins	Gevricht (mg)	Wirksam keit (mcg/ir.¹=:)	Gesamt wirksam keit (mg)	Ausbeute aus dem Kulturfil traf (%)
	416.4	Bleomycin (A₂ content 72.2 %)	195	650.7	127.0	30.5
2	165.0	Bleomycin (A2 content 87.2 fo)	140	300.0	42.0	25.5
3	400.0	Bleomycin (B₂ content 76.2 ?o)	164	800,0	131.2	32.8
Ά	165.0	Bleomycin (A5 content 90.8 fo)	62	1200	74.4	, 45.1

VjJ

CD

CO

Beispiel 2

Zu einem Medium mit der Zusammensetzung von 6,4 % Hirse-Gallerte, 0,5 % Glucose, 3,5 % Sojabohenpulver, 0,75 % Korn-Einweichwasser, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % sekundäres Kaliumphosphat, 0,05 % Zinksulfat, 0,01 % Kupfersulfat, 0,2 % Natriumnitrat und 0,01 % Toho Nr.1 (Handelsname für ein oberflächenaktives Mittel) wurde 1,2-Diaminopropan in einem Anteil von 2 mg/ml zugegeben, um den p„-Wert des Mediums auf 6,5 einzustellen. Jeweils 100 ml des so behandelten Mediums wurden getrennt in eine Sakaguchi-Flasche eingefüllt und anschließend sterilisiert. Danach wurde Streptomyces verticillus (ATCC No. 15003) in das Medium eingeimpft und bei 27°C 192 Stunden unter Rühren bei 130 Upm kultiviert. Danach wurden die Kulturflüssigkeiten (4j5 1 ) gesammelt und filtriert, wobei 3»56 1 eines Filtrates (Wirksamkeit 190 mcg/ml, Gesamtwirksamkeit 676,4 mg) erhielt. Dieses Kulturfiltrat wurde aufgegeben und adsorbiert an einer Säule, beschickt mit 200 ml Amberlite IRC-50 (Handelsmarke für ein synthetisches Harz; Η-Form), mit Wasser gewaschen und anschließend unter Verwendung einer l:l(Volum-Teile)-Mischung von Aceton/0,02n-wässeriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung eluiert und die gegen Mykobakterium 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in H ml einer 80!Ü-igen wässeri-

- 41 00 9 8 4.3/19 A 6

iifrhii iil 11

gen Methanol^Lösung gelöst und auf eine Säule, beschickt mit 70 ml neutralem Aluminiumoxyd, aufgegeben, gefolgt von einer Elution mit 80$-iger wässeriger metharioliseher Lösung. Anschließend wurden die Bleomycin-enthaltenden Fraktionen, gesammelt und zur Trockne eingeengt,, der Rückstand in 2 ml Wasser gelöst, auf eine Säule, beschickt mit 20 ml Sephadex G-25 aufgegeben und anschließend unter Verwendung von destilliertem Wasser eluiert.

Die erhaltene bläulich¹-grüne Bleomycin-enthaltende Fraktion wurde in einer 0,02n-wässerigen Ammoniumchlorld-LÖsung sus- · pendie^t, auf.eine Säule, beschickt mit 20 CM-Sephadex aufgegeben und anschließend mit einer O,lM~wässerigen Ammoniumchlorid'-Lösung eluiert.

Danach wurde die erhaltene Fraktion, welche die gewünschte Substanz enthielt, aufgenommen und auf eine Säule, beschickt mit 5 ml Aktivkohle, zur Adsorption der gewünschten Substanz aufgegeben,.welche dann mit einer l:l-Mischung von Aceton/wässeriger 0,02n-ChlorWasserstoffsäure-Lösung eluiert wurde. Anschließend wurde das Eluat zur Trockne eingeengt und man erhielt 35 mg 2-Aminopropylamino-b'leo- _; mycin (Wirksamkeit 2173 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 76,1 mg). Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 11,25 %.

25 mg der so erhaltenen Substanz!wurde in 1 ml Methanol gelöst und Schwefelwasserstoffgas 10 Minuten lang in die

0098Λ3/1946

Lösung eingeleitet. Danach wurde die Lösung filtriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt, wobei man 20 mg eines Kupfer-freien 2-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorid .(Wirksamkeit 2000 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit kO mg), feststellte. Dieses Kupfer-freie Produkt wurde mit einer 6n-wässerigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung hydrolysiert und anschließend der Papier-Elektrophorese bei einem p„-Wert von 1,9 und einer Spannung von 3000 Volt unterworfen, " wobei 1,2-Diaminopropan gefunden wurde.

In der gleichen Weise wie oben wurden Versuche unter Verwendung der Amino-Verbindungen, wie sie als Additive in Tabelle III angeführt sind, bewerkstelligt. Die in diesen Versuchen verwendeten Bedingungen und die Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt.

- Ü3 9843/1946

T a b e 1 l.e III (linker Teil)

Vera Nr.	Name des Addi tives	• Additiv-l konz. (mg/ml)	Züch tungs- zeit (Std) (Schüttler)	Filtrat- menge -(Liter)	Wirksam keit (mcg/ml)	Sesamt- wi r k- samkeit (mg)
1	1,2-Diamino- äthan	4.0	192	3.0	150.0	450.0
2	N,N-Dimethyl-1,2- diamino äthan	3.0	240	2.98	154.0	. 458.9
3	N,N-Diäthyl-1,2- diamino äthan	2.0	240	2.98	154.0	458.9
4	N,N-Diäthyl-1,3- diaminopropan	2.0	240	2.84	181.3	514.9
VJl	N-Butyl-N'-(3- aminopropyl)-1,3- d iaminopropan	2.0	240	3.12	113.4	353.8
6	N- (2-Hydroxy- propyl)-l,2- diaminoäthan	0.6	240	3.00	140.0	420.0
7	N-(3-Aminopropyl] piperazin	" 0.6	240	2.98	123.1	366.8
8	N-d-Hienylfthyl] N' - (3-aminopr opy: 1,3-diaminopropar	I- L)- 3.0 1.	240	3.05	1020	3111

00984 3/1946

Tabelle III (linker Teil; Portsetzung)

9	N- (2-Furfuryl)- 1,5-diaminopropan	5.0	240	5.00	380.0	1140
10	4-Piperidyl- methylamin	2.0	240	5.08	170.9	526.4
11	2-(4-Imidazolyl)- äthylaniine hydrochlorid	1.0	240	2.88	189.6	493.0
12	N-Methyl-l,3-di- aminopropan	1.5	264	3.10	129.8	402.4
13	N-Butyl-1,3- diaminopropan	4.0	264	3.40	525.0	1785.0
14	N,N-Dimethyl-1,3- diaminopropan	2.0	240	3.04	154.8	470.6
15	3-Aminopropyl- trimethylamraonium Chlorid	1.0	268	3.20	118.0	577.6
16	N-(3-(N,N-Dimethyl)- aminopropyl] -1,5- diaminopropan	1.0	264	3.34	253.9	848.0

Tabelle III (linker Teil; Portsetzung)

17	N,N-Bis-(3-amino- pr opyl)-me thylainin	0.5	264	3.54	133.7	473.3
18	N- (3-Amino-l- methylpropyl)-1,3- diaminopropan	1.0	264	3.20	331.0	1059.2
19	N-3-Aminopropyl- pyrrolidin	1.0	288	3.30	281.0	927.3
20	N-3-Aminopropyl- piperidin	1.0	288	3.00	317.0	931.0
21	N-3-Aminopropyl- morpholin	0.1	240	2.94	145.8	428.7
22	N-2-Aminoäthyl- piperazin	2.0	288	3.12	111.0	346.0
23	N,N-Bis-3-amino- propylpiperazin	0.5	240	3.69	225.0	860.3
24	N- f3-(Pyrrolidino)- propyl>l,3- diaminopropan	L.O	264	3.08	465.6	1434.0

009843/1946

T a belle III (linker Teil; Fortsetzung)

25	N-(3-(Piperidino)- propyl>l,3- ,diaminopropan	0.5	264	3.	10	543.	O	1684.	9
26	N-(3-(Morpholino)- propyl]-l,3- diaminopropan	0.5	264	2.	94	139.	4	408.	7
27	N- (3-Hydroxypro- pyl)-l,3-diamino propan -(hydro- chlorid )	,0.7	264	3.	02	227.	5	186.	7
28	N-(3-Methoxypropyl) 1,3-diaminopropan (hydrochlorid )	,1.35	288	3.	10	282.	.0	875.	8
29	N-Benzyl-1,3-di aminopropan	0.5	264	3	.00	334	.0	1182	.0
30	N-(l-Phenyläthyl)- 1,3-diaminopropan	0.5	288	3	.39	606	.4	2054	.3
31	m-Xylylendiamin	2.0	288	2	.77	292	.4	809	.9
32	p-Xyiylendiamin	2.0	264	3	.05	320	.0	977	.2
33	N-Cyclohexyl-1,3- diaminopropan	0.5	264	3	.38	1354	.0	4576	.5
34	N- (3-Cyclohexyl- aminopropyl)-1,3- diaminopropan	0.5	264	3	.10	1600	4960	.0

009843/1946

•ι¹ a b e 1 1 e III (rechter Teil)

; Name des neuen, Vera ^m^ CH-Sephadex isolierten Bleo- ¹^** my c ins	3-i3-(N-Butyl)- aminopropylj- aminopropylamino- bleomycin	Gew. (mg)	Wirksam keit (meg/mg)	Gesamt- wirksaDl·- keit (mg)	Ausbeute aus KuI- turfiltrat
^ 2-Aminoäthylamino~ "bleoraycin	2-(2-Hydroxy- propyl)-amino- .'ithylamino- bleomycin	28.7	1700	488 .	10.8
3-N,N-Dimethyl- 2 amino athylamino- bleomycin	3-Piperazinopropyl- 7 amino-bleomycin	140	897	125.6	27.4
■3-N,N-Dii'thyl- j5 'aminoäthylamino- bleomycin	3-(3-(N-l-Phenyl- ätnyl)-amino- 8 ' propyl^I-amino- propylamino- bleomycin	140.	1102	154.3 .	33.6
3-N,N-DiSthyl- i\ aminopropylamino- bleonycin	230	1036	238.3	46.3
5	150	5840	876.0	24.8
6	88	1020	898.0	21.4
103	726	74.8	20.4
240	2500	600.0	19.3

009843/1946

T a belle III (rechter Teil; Fortsetzung)

3-(N-(2-Furfuryl)J- 9 aminopropylamino- bleomycin	4-Piperidylmethyl- amino-bleomycin	3-(N,N,N-Triinethyl)- aminopropylaraino- bleomycin	86	1450	124.7	10.9
10	2-(4-Imidazolyl)- äthylamino- Dleomycin	3-(3-(N,N-Dimethyl). aminopropyl) -amino- propylamino-ble o- mycin	130	1394	181.2	34.4
11	3-N-Methylamino- propylamino- bleomycin	74	847	62.7	12.7
12	3-N-Butylamino- propylamino- bleomycin	119.0	860	102.3	25.4
13	3~(N,F-Dimethyl)- 14 aminopropylamino- bleomycin	214.7	1700	365.0	20.4
15	127.0	869	110.4	23.5
16 ·	124.0	633	78.5	20.8
162.5	1280	195	23.0

009843/1946

- H 9 -

ΐ a b e 1 1 e III (rechter Teil; Portseti'.ung)

17	; 3-(lT-Hethyl-N-3- j aminopropyl)-amino- propylaniino- bleomycin 3-N-Me thylpropyl- aiaino-ble omy c in	32.0 24.0	1671 860	53.5 20.6	11.4 4.4.
18	3-(l-Methyl-3- aminopropyl)- aminopropylamino- bleomycin	112.6	1820	205	19.4
19	3-(Pyrrolidino)-pro- pylamino-bleomyein	355.0	1066	378.4	'40.8
20	I 3-(Piperidino)- , propylamino- j bleomycin	320.0	1257	402.2	42.3
21	3-(Morpholino)- propylamino- bleomycin	175.0	5922	103.6	24.2
22	2-(Piperazino)-äthy3 amino-bleomycin	·" 75.0	799	59.9	17.3
23	3-(l-{4_r(3-Amino- propyl)[-piperazinq] propylamino- bleomycin	"210.6	1180	248.5	29.9
24	3-(3-(Pyrrolidino)- propyl]-aminopropyl- amino-bleomycin	105.0	2564	269.2	18.8

- 5o -

009843/1946

Tabelle III (rechter Teil; Fortsetzung)

25	3-(3-(Piperidino)- propyl'j- amino propy lamino-b Ie 0- mycin	140.0	3580	501.2	29.7
26	3- [3- (Morpholino)- propyl)-amino- propylamino- bleomycin	70.0	1201	84.1	20.6
27	3-(3-Hydroxy- propyl)-aminopro- pylamino-bleomycin	166.1 ι .	1300	215.9	31.4
28	3-(3-Methoxypropyl) ■ aminopropylamino- bleomycin	•336.0	1335	448.6	51.2
29	3-Benzylamino- propylamino- bleomycin	40.0	1986	79.4	7.9
30	3-(l-Phenyl&thyl)- aminopropylamino- ¹ bleomycin	96.3	2400	231	11.2
31	m-Aminome thyl- benzylamino- bleomycin	10.8	2546	27.5	3.4
32	p-Aminome thy1- benzylamino- blQomycin	33.3	2670	89.0	9.1
33	3-Cyclohexylamino- propylamino- bleomycin t	330.0	5355	1767.2	38.6
34	3-*(3-Cyclohexyl~ aminopropyl)-amino- propylamino- bleomyoin	,178.0	11215	1996.3	40.3

- 5.1 -

009843/1946

Beispiel 3

Zu einem Medium mit der Zusammensetzung von 6,4 % Hirse-

n/

Gallerte, 0,5 % Glucose, 3,5 % Sojabohenpulver, 0,75 %

Korn-Einweichflüssigkeit, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % sekundäres Kaliumphosphat, 0,05 % Zinksulfat, 0,01 % Kupfersulfat, 0,2 Ü Natriumnitrat, 0,01 % Silicon und 0,01 % Toho No.1 (Handelsmarke für ein oberflächenaktives Mittel, hergestellt bei Toho Chemical Industry Co., Ltd.) wurde 1,3-Diaminopropan in einem Anteil von 2 mg/ml zugegeben, um den p^-Wert des Mediums auf 6,5 einzustellen. 12 1 des so behandelten Mediums wurden in einen 20 1-Glas-Fermentor eingefüllt und sterilisiert. In dieses Medium wurden 800 ml einer Kulturflüssigkeit von Streptomyces verticillus (ATCC Ho. I5OO3) eingeimpft, welche 48 Stunden einer Schüttelkultivierung in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie oben erwähnt, unterworfen war und es wurde bei 27°C unter Rühren mit 350 bis 370 Upm 120 Stunden lang kultiviert, wobei pro Minute 1 Volumanteil Luft eingeführt wurde, der dem Volumteil des Mediums gleich war. 7,7 1 der Kulturflüssigkeit wurden filtriert und das Filtrat (5,6 1, Wirksamkeit 148,5 mcg/ml, Gesamtwirksamkeit 831,6 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 230 mg Bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 734,8 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit I69 mg) erhielt. Die Ausbeute aus

- 52 009843/1946

dem Kulturfiltrat betrug 20,3 %* Dieses Hydrochlorid wurde nach dem CM-Sephadex-Verfahren analysiert und gefunden, daß es 84,5$ 3-Aminopropylamino-bleomycin enthielt. 200 mg des Hydrochlorids wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, die Lösung auf eine Säule von 50 ml Volumen, beschickt mit CM-Sephadex, suspendiert in 0,02n-wässerigem Ammoniumformiat, aufgegeben und dann entwickelt und mit 0,ln-wässeriger Ammoniumformiat-Lösung eluiert, wobei man eine Fraktion er-

f hielt, welche 3-Aminopropylamino-bleomycin enthielt. Diese Fraktion wurde aufgegeben und adsorbiert an einer Säule, beschickt mit 10 ml Aktivkohle, mit Wasser gewaschen und anschließend mittels Aceton/0,02n-wässeriger Salzsäure-Lösung (1:1 im Volumen) eluiert. Anschließend wurde die erhaltene aktive Eluat-Praktion zur Trockne eingeengt und man erhielt 50 mg 3~Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 193** mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 96,7 mg). Die Ausbeute aus dem vorerwähnten Hydrochlorid betrug 65,8 %, Diese Substanz wurde mit on-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert, zu einer 10#-igen alkalischen Lösung umgesetzt und anschließend der Gaschromatographie unterworfen, wobei eine Säule, beschickt mit Fluoropack 80 (Handelsmarke), überzogen mit Silicone SF 96 (Handelsmarke) verwendet wurde, wobei ein Maximum von 1,3-Diaminopropan gefunden wurde. 30 mg des so erhaltenen 3-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 193^ mcg/mg, Oesamtwirksamkeit 58,02 mg) wurde in 5 ml Methanol gelöst und Schwefelwasserstoff-

- 53 009843/1946

gas 30 Minuten lang in die Lösung eingeleitet, wobei ein Niederschlag von Kupfersulfid ausfiel. Dieser Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und mit Methanol gewaschen. Danach wurde die Waschflüssigkeit und das Piltrat vereinigt und die Mischung zur Trockne eingeengt, wobei man 25 mg eines Kupfer-freien 3-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit I85O mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 46,35 mg) erhielt. Die Ausbeute aus der Kupfer-enthaltenden Substanz betrug 79,7 %.

20 mg dieses Kupfer-freien 3-Aminopropylamino-bleomycinhydrochlorids (Wirksamkeit I85O mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 37 mg) wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst, auf eine Säule, beschickt mit 5 ml des Anionaustauscher-Harzes Amberlite IRA-400 (Handelsmarke; für Schwefelsäure-Typ-Ionenaustauscher-Harz, hergestellt von Rohm and Haas Co,) aufgegeben, anschließend mit destilliertem Wasser eluiert und das Eluat zur Trockne eingeengt, wobei man 15,5 mg eines Kupfer-freien 3-Aminopropylamino-bleomycin-sulfates (Wirksamkeit I85O mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 28,68 mg) erhielt. Die Ausbeute aus dem Kupfer-freien Hydrochlorid betrug 77,5 %.

In der gleichen Weise wie oben wurden Versuche in einem Olae-Ferraentor unter Verwendung von solchen Aminoverbindungen als Additive, wie sie in Tabelle JV aufgeführt sind, bewerkstelligt. Die angewandten Bedingungen und die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle IV niedergelegt.

- 54 009843/1946

T a b e 1 1 e IV (linke Seite)

	Additiv- konz. (mg/ral)	Züch tungs- dauer (Std.)	Filtrat- menge (Liter)	Wirksam keit (mcg/ml)	Gesaint- wirksam- keit (nip;)
Name des Additivs	2.0 0.4	120 • 163	4.9 5.0	140.0 122.2	686.0 611.0
1,4-Diamino- butan Spermidin

Tabelle IV (rechte Seite)

Harne dos Additivs	Name des isolierten Bleomycins	Gewicht (mg)	Wirk samkeit (mcg/mg)	Gesamt wirksam (idnd)	Ausbeute .aus KuI- turfiltr. *(Z)*
1 ,'I-Diamino- butan Spermidin	Bleomycin A2¹ Bleomycin A5	71.8 44.7	1,232 2,543	88.5 113.7	12.9 18.6

009843/1946

Beispiel 4

Ein Medium mit einem Gehalt an 4,0 % Sojabohnenpulver, 1,0 % Hefeextrakt, 0,3 % Natriumchlorid, 1,0 % Sojabohnenöl, 0,0007 % Kupfersulfat.5H„0, 0,0001 % Eisensulfat.7H₉O,

£— Cm»

0,0008 % Manganchlorid.4H₂O und 0,0002 % Zinksulfat.7HpO wurde auf einen p^-Wert von 7,0 eingestellt. Jeweils 120 ml dieses Mediums wurden getrennt in eine 500 ml-Sakaguchi-Flasche eingefüllt und anschließend sterilisiert. In das Medium wurde ein MA 267-A₁-Stamm, isoliert im Jahre I965 aus dem Boden von Musashino-cho, Saitama-ken, Japan, eingeimpft, welcher als eine Variante von Streptomyces verticillus identifiziert worden war und welcher spezifisch Bleomycin A₅ erzeugt. Ferner wurde Spermidinphosphat, welches einer sterilisierenden Behandlung mit Millipore-Filter (Handelsmarke) unterworfen worden war, zugegeben, so daß die Menge desselben 0,5 mg/ml betrug, und der Stamm wurde bei 27°C 7 Tage lang unter Rühren bei 130 Upm kultiviert, 5,2 1 der Kulturflüssigkeit wurden gesammelt und filtriert, und das Filtrat (4,5 1, Wirksamkeit 196 meg/ml, Gesamtwirksamkeit 253 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man I37 mg eines rohen Pulvers von Bleomycin A^-hydrochlorid (Wirksamkeit 1846 meg/ mg, Gesaratwirksamkeit 253 mg) erhielt. Die Ausbeute aus der Kulturflüssigkeit betrug 28,8 %. Dieses rohe Pulver wurde

- 56 0098Λ3/19/4 6

der Chromatographie unter Verwendung einer Säule, beschickt mit 25 ml Sephadex G-50, unterworfen und mit destilliertem Wasser eluiert. Die erhaltenen, blaugefärbten, aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockne eingeengt, wobei 53,5 nig eines blauen Pulvers (Wirksamkeit 2613 nicg/mg, Gesamtwirksamkeit 1*10 mg) erhalten und nur Bleomycin A„ allein erzeugt wurde. Die Ausbeute aus dem rohen Pulver betrug 55,4 %. Die Extinktion (E* * ) bei 293 πιμ des so

J. Olli

erhaltenen Produktes war II6, und das Spermidin der Seitenkette desselben wurde gefunden, wenn ein Hydrolysat des Produktes mit 6n-Chlorwasserstoffsäure gaschromatographisch untersucht wurde.

0098 A 3 / 1SU 6

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von antibiotischen Bleomycinen durch Impfen und aerobisches Züchten eines Bleomycinerzeugenden, zu den Actinomyces gehörenden Stammes in einem, eine Nährstoffquelle enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in Anwesenheit einer Amino-Verbindung erfolgt, die zumindest eine -C-CH₂-NH -Gruppe

I und zumindest eine basische Gruppe enthält, welche aus

Amino-, Imino-, Guanidino-, Amidino- und Sulfonium-Gruppen und Stickstoff-enthaltenden, cyclischen Verbindungen ausgewählt ist, oder in Anwesenheit einer Verbindung, die in der Kulturflüssigkeit in eine derartige, wie oben erwähnte, Amino-Verbindung umgewandelt wird, wobei selektiv eine bekannte oder neue Bleomycin-Komponente, entsprechend der oben erwähnten Amino-Verbindung, oder einer Amino-Verbindung, abgeleitet von der oben erwähnten Verbindung, erzeugt und dann das bekannte oder neue- Bleomycin durch bekannte Mittel aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Amino-Verbindung durch irgendeine der allgemeinen Formeln

c, η

- 58 - 200644G

Ri

(1) NH₂-CH₂-X-N^ , (2) NH₂-CH₂-X-

(3) NH₂-CH₂-X-Sf , (4)

I n_r4

(5) NH₂-CH₂-XOn

worin X=-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n·-<§)-(CH₂)_n2-r6 _r6 r6·

-(CH₂)_n-N-(CH₂)_n2- , -(CH₂)n-N-(CH₂)_n2-.N-(CH₂)_n3-' I ' ' I ' I

r6 r7 r6· r6 r7 r6· r7'r6»

-(CH₂)_n-C-

« » NH

0r9

R¹, R² = H, Alkylgruppe, -(ΟΗ₂)_η4-Η, -(CH₂)n4'-OR9',

RS

R8"

R¹⁰", -C-NH₂ _R8'" NH

= Alkylgruppe,

- 59 009843/ 1946

_R7

R⁶ R⁶

2 3 4 4¹ 4'' 4¹ '■' . „ . viorxn η,η,η,η,η ,η ,η = eine ganze Aua

von 1 bis 8,

n¹ = eine Ganze Zahl von O bis 8 ist, G 6' 6'' 7 7¹ 3 8¹ 8^i! Π¹'¹ °

ιι , ti j Xv _s Λ j η. j U , η »^ j " > ^J1 j

ir , R₅ ΙΓ , R = H, Alkylgruppen sind und die punktierte Linie in der Formel (z.B. -(CHp) - etc.)

tfi

anzeigt, daß ein V/asserstoffatom an einer Kohlenstoffkette an irgendeiner Stellung der Alkylgruppe ersetzt sein kann, dargestellt v/ird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß HIl₅-CiI₀-X-M^ „ 1,2-Diaminoäthan, 1,2-Diaminopropan,

1,3-Diaminopropan, 1,4-Diaminobutan, Aginatin, Spermidin, Spermin, Ii-ilethyl-l,3-diaminopropan, N-Butyl-l,3~diaminopropan, Njir-Dimethyl-l^-diaiuinoäthan, N,N-Diäthyl-1,2-diaminoäthan, Il,N-Dimethyl-l,3-diaminopropan, N,N-Diüthyl-

0098A3/1946

- 6ο -

1,3~diaminopropan, N-[3~(N,N-Dimethyl)-3-aminopropy1]-1,3-diaminopropan, N,N-bis-(3-Aminopropyl)-methylamin, N- (3-Amino- 1-methy 1-propy 1 f-1,3-diaminopropan, N- (2-Hydroxy■ propyl)-l,2-diaminoäthan, N-(3-Hydroxypropyl)-l,3-diaminopropan, N-(3-Methoxypropyl)-l,3-diaminopropan, N-Benzyl-1,3-diaminopropan, N-(l-Phenetyl)-l,3-diaminopropan, N-(1-PhenyläthyI)-N'-(3-aminopropyI)-I,3-diaminopropan, N-Cyclohexyl-1,3-diaminopropan, N-(3-Cyclohexylaminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-Buty1-N'-3-aminopropy1-1,3-diaminopropan, m-Xylylendiamin oder p-Xylylendiamin ist.

H. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

^^X ti

daß ΝΗ,,-CH -X-N—R 3-Aminopropyl-trimethylammonium-

² |V

chlorid oder 3-Aminopropyl-trimethylammonium-bromid ist,

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß NH₂-CHp-X-SCT ,- 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid,

3-Acetaminopropy1-dimethylsulfonium-bromid, 3-Amino-3-carboxypropyl-dimethylBulfonium-chlorid oder 3-Amino- 3-carbamoylpropyl-dimethylsulfoniumchlorid ist.

Γ ^6l '" 009843/194 6

- 6l -

β. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß HH₂-CH -X-NC^;N-3-Aminopropylpyyrolidin, N-3-Aminopropylpiperidin, N-3-Aminopropylmorpholin, N-2-Aminoäthylpiperazin, N-3-Aminopropylpiperazin, Ν,Ν-bis-Aminopropylpiperazin, i'J- (3-Pyrrolidinopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Piperidinopropy1)-1,3~diaminopropan, N-(3-Morpholinopropyl)-l,3-cliariiinopropan ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß HH₀-CH₀-X' ijl N-(2-i?urfuryl)-l_i3-diaminopropan₃ il-Piperidyl-methylamin oder 2-(ⁱl-lmidazolyl)-äthylamin ist.

/8.y Neue Bleomycine, welche im Ultraviolett-Absorptionsbereich ein Absorptionsmaximum bei 244 my und ein Absorptions maximum bei 290 bis 295 mu besitzen, die Anti-Tumor- und mikrobicide Aktivitäten aufweisen und eine Teil-Struktur haben, dargestellt durch die' allgemeine Formel

CO-R

NH-CH-CO-HH-(CH₂ )₂O[_g Jl CHOH

I CH

-NH-(CH₂)2-

0098 43/ 19 46 ^Γ ·^;'

copy

-nh-(ch₂)₂-n:

.CH₅ "CH,

-nh-(ch₂)₂-n;

-nh-(ch₂)₃-n;

-nh-(ch₂)₅-n:

.C₂H₅

"C₂H₅

CH,

,C₂H₅

C₂H₅ -NH- (CH₂) 3-NH- (CH₂) ₃-lI:

.C₄H₉ Ή

MH- (CII₂) 2-MH-CH₂-CH-CPI,

1 ^J OH

NH- (CH₂) 3-NH- (CH₂) 3-NH-CH

CH

-NH-CH₂-CH-CH₅

-Nil-(CH₂) 3-NH-CH₃

-NH-(CH₂)3-NH-(CH₂)3-CH3 -NH-(CH₂)3-NH-(CH₂)3-N \

-NH-(CH₂)3-N-(CH₂)3-NH₂

.CH, CH,

CH3

NH-(CH₂)₅-NH-CH-(CH₂)₂-NH₂ CH,

-NH-

-NH-(CH₂) 3-

-NH-(CH₂J₅-NJD

-NH-(CH₂ J₂-N
-NH- (CH₂) 3-N_JI- (CH₂) 3-NII₂ -ΝΪΙ- (CH₂) 3-NH- (CH₂) y\\ -Nil- (CH₂) 3-NH- (CH₂) 3-Ν^Λ -NH- (CH₂) 3-NH- (CH₂) 3-1Q) -NH-(CH₂)3-NH-(CH₂)3-OH -NH-(CH₂)3-NH-(CH₂)3-OCH3 -NH-(CH₂)₅-NH-CH₂-<f)\

CH -NH- (CH₂) 3-NH-CH -<C j ■ , v_

CH

009843/1946

-KH-(CH₂)₅-KH-(CH₂)₅-HH -KH-(CH₂)3-KH-( -KH-CH.

-KH-(CH₂)2

009843/1946