DE3008359A1 - N-methylbleomycin-antibiotika - Google Patents

Description

- 5 -Beschreibung

Die Erfindung betrifft N-Methylbleomycinderivate der folgenden allgemeinen Formel

NH2	H	NH I
O=C	I	,CH NH _
I	/N-( TT	/ \/ 2
H2Cx	"H0 C 2 Il

CH_ H

£ ^n I ³ I Il ο

O HO CH NC Il

■.„ , _w U GH C ^n NH

² ch_ I Il I H I I

Ji C CH O CH CH_

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H O

H j Ϊ ^on3 O ^n_{3 ürt2}

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H-

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HO /C C ■" ^N

CH₂ / O / H i

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OH

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H-C ' C C_x /C.

/ι ϋ ι

π I ι I

ⁿ OH ' H

O NH^

die nützliche Antitumormittel und Bakterizide sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Zwischenprodukte für ihre Herstellung.

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Die Erfindung betrifft neue Antibiotika der Bleomycingruppe.

Bleomycine sind Antibiotika mit Antitumorwirkung, die von Umezawa et al gefunden wurden und die von dem Actinomyzet Streptomyces verticillus gebildet werden [Umezawa et al, Journal of Antibiotics, 1_9A, Seite 200 (1966)] und die Struktur aufweisen, die durch die Formel (I) dargestellt wird:

NH,

NH,

O=C H CH NH_n

ι / \ / ²

" ~ N-CH_n C

NN

L ?

^NH2 Is, f

^J N

CH_ H

I ³ I

O HO ,CH N

C CH NH Il ι I

O CH
Il I

. _x /^C\ /^CH\ O /CH CH_n N H ^XCH N CH / \ \ I

I ι 3 CH₂ S

^H H

H-C H C
I

OH H

-CH₂OH „OH

OH

V" ΐ

0 NH.

Il

C-R

S H

[I]

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worin R den endständigen Aminmolekülteil der Bleomycine bedeutet.

Ein Gemisch, das Bleomycine A₂ und B₂ als Hauptbestandteile enthält, zeigt derzeit bei der Chemotherapie von Krebs eine sehr gute Wirkung, hauptsächlich bei squamösen ZeIlcarcinoma, insbesondere auf dem Gebiet des Kopf- und Halskrebses, Hautkrebses, Peniskrebses, Gebärmutterhalskrebses, Speiseröhrenkrebses, Lungenkrebses und maligner Lymphoma.

Die bekannten Bleomycine werden jedoch durch Hydrolyse eines Teils ihrer Moleküle, der durch die Partialstrukturformel

H
t

CONH₂ (II)

dargestellt wird, inaktiviert, wenn sie dem Einfluß von inaktivierendem Enzym unterliegen, wie es in dem folgenden Schema dargestellt wird:

H NH„ H NH_

i ι ² ι ι ²

N CH + K„O ν N CH + NE.

⁷ \ / \ Ina^ ' \ / \ ³ CH₂ CONH_{2 vi}^^ CH₂ COOH

enzym

Cn]

Diese Tatsache kann, wenn man Tierorgane, wie Mäuseleber, verwendet, gezeigt werden. Es wurde gefunden, daß Bleomycine gegenüber der Inaktivierung in der Haut und der Lunge, wo sie sehr aktiv sind, relativ resistent sind, daß sie jedoch im Magen und anderen Organen leicht inaktiviert werden, wo sie nicht wirken. Es wurde weiterhin gefunden, daß die Inaktivierungswirkung schwächer ist in den squamösen Zellcarcinoma bei Mäusen als in Sarcoma bei Mäusen, die

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jeweils durch 20-Methylcholanthren induziert werden [Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 25, Seite 409 (1972); Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 27, Seite 419 (1974)].

Es wurde weiterhin gefunden, daß die inaktivierende Wirkung von Bleomycin durch squamäse Zellcarcinoma im menschlichen Kopf und in Nackenbereichen bezeigt werden kann, was besonders bei solchen des niedrigen Differenzierungstyps ausgeprägt ist und von denen berichtet wird, daß sie durch Bleomycine relativ unwirksam behandelt werden [Mueller et al., Cancer, 40, Seite 2787 (1977)]. Dies ist einer der Gründe für eine erforderliche Verbesserung der Bleomycine.

Die Anmelderin hat die Antibiotika der Bleomycingruppe untersucht, die gegenüber inaktivierenden Enzymen hoch resistent sind, und gefunden, daß Antibiotika der Bleomycingruppe, die die Partialstrukturformel

CH₃

H NH

t t

N CH ^ (III)

^ ^ CH₂ CONH₂

besitzen, (im folgenden wird diese Gruppe von Bleomycinen als "N-Methylderivate" bezeichnet) gegenüber dem Einfluß inaktivierender Enzyme vollständig unempfindlich sind.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe zur Verfügung zu stellen, die gegenüber der oben erwähnten Wirkung der Inaktivierungsenzyme unempfindlich sind.

Gegenstand der Erfindung sind N-Methylbleomycine der allgemeinen Formel

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NH CH₃

NH

O=C H CH NH

CH O

CH HO O

I³I Ii Il

₀ HO CK N C ,C-R

_r- O CH ^XC CH NH

CH f Il I Il I ι

N. C. CH O .CH ^UM2 i\ / \ / \ / \ \

" "^TT N OH, O CH₀ C ι 3 ι 3

^H H

[IV]

worin R den endständigen Aminmolekulteil von Bleomycinen bedeutet,

ihre Kupfer-Chelatkomplexe und ihre nicht-toxischen Salze. Diese Substanzen werden auf folgende Arten hergestellt.

Erstes Verfahren: Antibiotika der Bleomycingruppe der allgemeinen Formel (I), die durch ein Fermentierungsverfahren erhalten wurden, werden der reduktiven Methylierung unter Bildung von N-Methylbleomycin der allgemeinen Formel (IV) oder ihres Kupfer-Chelatkomplexes oder eines nicht-toxischen Salzes unterworfen.

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Zweites Verfahren: Bleomycinsäure (oder ein Kupfer-Chelatkomplex von ihr) der allgemeinen Formel

NH₂

NH,

ii

0 ^H0

CH₀ H

.||_n ÜU btl IM U

/vV° ο ν ν ν^v

I Il >

K Λ /^c\

H CH N p_W

ι ι ^CH3

.CH. H

/Η L
CH₃ '

CH₂OH

0 Il C-OH

I \

[V]

wird der reduktiven Methylierung unterworfen, wobei die Amingruppe

NH₂

in der Partialstrukturformel

NH

I *

CH

CH.

in die Partialstrukturformel

CONH.

(H)

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(HD

H NK

I I

N CH

CH₂ CONH₂

überführt wird, und wobei das entstehende, methylierte Produkt mit einem Amin in an sich bekannter Weise für die Peptidbindungsbildung unter Bildung von N-Methy !bleomycin der Formel (IV) oder eines ihrer Kupfer-Chelatkomplexe oder eines ihrer nicht-toxischen Salze reagieren kann.

Die erfindungsgemäßen Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe sind nützliche Antitumormittel oder Bakterizide.

Die Ausdrücke "Bleomycine", "Bleomycinsäure", "N-Methylbleomycine" und "N-Methylbleomycinsäure" umfassen sowohl die kupferfreien als auch die Kupfer-Chelatformen, sofern sie nicht als kupferfreie Form oder als Kupfer-Chelatform expressis verbis bezeichnet sind.

In den beigefügten Zeichnungen 1 bis 6 sind die Restaktivitären der erfindungsgemäßen Verbindungen und entsprechender bekannter Bleomycine gegenüber einem inaktivierenden Enzym dargestellt, wobei die Ordinate die Restaktivität .(%) und die Abszisse die Reaktionszeit bedeuten. Fig. 1-(1) zeigt die Restaktivität von N-Methy!bleomycin A₂; Fig. 1-(2) die von Bleomycin A₂; Fig. 2-(i) die von N-Methylbleomycin B₂; Fig. 2-(2) die von Bleomycin B₂; Fig. 3-(i) die von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylamino-N-methylbleomycin; Fig. 3-(2) die von 3-[(S)-1^f-Phenyläthylaminoj-propylaminobleomycin; Fig. 4-(i) die von 3- (3-n-Buty laminopropylamino) -propylamino-N-methylbleomycin; Fig. 4-(2) die von 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylaminobleimycin; Fig. 5-(i) die von N-Methylbleo-

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mycin A₂'-b; Fig. 5-(2) die von Bleomycin A₂'-b; Fig. 6-(i) die von N-Methylbleomycinsäure; und Fig. 6-(2) die von Bleomycinsäure.

In den Fig. 7 bis 10 sind die Ultraviolettabsorptionsspektren der erfindungsgemäßen Verbindungen dargestellt, wobei Fig. 7 das von N-Methylbleomycinsäure (Kupfer-Chelatf οnn); Fig. 8 das von N-Methylbleomycin A₂(Kupfer-Chelatf orm)-hydro chlo rid; Fig. 9 das von N-Methylbleomycin(kupferfreie Form)-hydrochlorid; und Fig. 10 das von N-Methylbleomycin(kupferfreie Form)-hydrochlorid zeigen.

In den Fig. 11 bis 14 sind die Infrarotabsorptionsspektren der erfindungsgemäßen Verbindungen, bestimmt mit dem Kaliumbrömid-Tablettenverfahren, dargestellt, wobei Fig.11 dasjenige von N-Methylbleomycinsäure (Kupfer-Chelatform); Fig. 12 das von N-Methylbleomycin A₂(Kupfer-Chelatform)-hydrochlorid; Fig. 13 das von N-Methylbleomycin A₂(kupferfreie Form)-hydrochlorid; und Fig. 14 das von N-Methylbleomycin B₂(kupferfreie Form)-hydrochlorid zeigen.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird im folgenden näher erläutert.

Erstes Verfahren: Die Antibiotika der Bleomycingruppe, die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe der allgemeinen Formel (IV) bei dem ersten Verfahren als Ausgangsmaterialien verwendet werden, sind Bleomycine, die man aus der Züchtungsbrühe von Streptomyces verticillus nach einem an sich gut bekannten Verfahren gewinnt [Umezawa et al., Journal of Antibiotics, ^9, Seite 210 (1966)], Bleomycine, die nach einem Verfahren erzeugt werden, bei dem die Aminoverbindung als Vorstufe bei der Züchtung zugegeben wird (US-PS 3 846 400), Bleomycine gemäß der DE-OS 2 828 933t die

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N-Substitutionsderivate in den endständigen Amingruppen von Bleomycinen (US-PS 3 922 262), Zorbamycine B und C, gebildet durch Streptomyces bikiniensis var.zorbonensis [Argoudelis et al., Journal of Antibiotics, 24, S. 543 (1971)], Victomycin, gebildet durch Streptosporangium violaceochromogenes [Kawamoto et al., Journal of Antibiotics, 28, S. 358 (1975)], Platomycine A und B, gebildet durch Streptosporangium violaceochromogenes sub sp.globophilum [Takasawa et al., Journal of Antibiotics, 28, S. 366 (1975)] und Tallysomycine A und B, gebildet durch den Nr. E465-94-Stamm, der zu den Actinomyzeten gehört [Kawaguchi et al., Journal of Antibiotics, 3_O, S.779(1977)]

Die reduktive Methylierung der Antibiotika der Bleomycingruppe wird durchgeführt, indem man Formalydehyd mit den Antibiotika in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, bevorzugt in einem inerten Lösungsmittel, das solche Antibiotika löst, umsetzt. Als Reduktionsmittel kann man bei der reduktiven Methylierung Natriumborhydridverbindungen, wie Natriumcyanoborhydrid, und Derivate der Ameisensäure verwenden. Die reduktive Methylierung kann durch katalytische Reduktion in Anwesenheit eines Katalysators, wie Palladium-auf-Kohle, durchgeführt werden. Die Menge an Formaldehyd, die bei der reduktiven Methylierung verwendet wird, beträgt bevorzugt 1,0 bis 1,5 Mol/Mol Antibiotika der Bleomycingruppe. Das Reduktionsmittel wird bevorzugt in einer Menge von 0,6 bis 2 Mol/Mol Antibiotika der Bleomycingruppe eingesetzt. Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 50°C, bevorzugt etwa 15 bis etwa 35°C.

Wenn solche Antibiotika der Bleomycingruppe, wie 3-Aminopropylaminobleomycin [eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV), worin R eine 3-Aminopropylaminogruppe bedeutet], die eine freie primäre Amingruppe mit Ausnahme der aroma-

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N^NH₂ tischen primären Amingruppe -HC-// \\— CH^ zusätzlich

zu dem Molekülteil der Partialstrukturformel (II) enthalten, als Ausgangsmaterialen verwendet werden, wird die freie primäre Amingruppe ebenfalls methyliert, was manchmal eine Abnahme in der Ausbeute an gewünschtem N-Methylderivat ergibt. In einem solchen Fall wird das gewünschte N-Methylderivat in hoher Ausbeute erhalten, indem man zuerst die primäre Aminogruppe in dem Molekülteil mit der Partialstrukturformel (II) schützt, indem man mit Kupfer oder dergl. ein Chelat bildet, in an sich bekannter Weise eine Amino-Schutzgruppe, wie eine tert.-Butoxycarbonylgruppe, in die freie Amingruppe einführt, das Metallreagens entfernt, und dann die entstehende Verbindung der reduktiven Methylierung unterwirft und nach der Reaktion die Schutzgruppe nach einem geeigneten, bekannten Verfahren, wie durch Behandlung mit Trifluoressigsäure, entfernt.

Die inerten Lösungsmittel, die Antibiotika der Bleomycingruppe auflösen, werden auf geeignete Weise, abhängig von der besonderen Art der Bleomycine, unter polaren Lösungsmitteln, wie z.B. Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid und dergl., ausgewählt.

Zweites Verfahren: Die Herstellung der Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe der allgemeinen Formel (IV) nach dem zweiten Verfahren ist wie folgt.

Bleomycinsäure wird reduktiv durch Umsetzung mit Formaldehyd in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Reduk-

NH_p tionsmittels methyliert, wobei l„ des Molekülteils mit

der Partialstrukturformel (II) methyliert und in einen Molekülteil der Partialstrukturformel (III) überführt wird,

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wobei man N-Methylbleomycinsäure der allgemeinen Formel (VI) erhält:

f-2 NK

°"l f Α

H₉C N-CH^ C

² W ² II

CH. H

Γ I? I 3 I \\

L I ^J I Il ο

/⁵^A Ό. HO CH N C I

CH₀ Υ O CH C CH NH

i η

Il ' 'I I · J\^

C CH O CH CH₂ N if S

N⁷ CH, / \ \„Ä^„X^ ^H

[VI]

r-n I γ

^H ? H ? _T/\\_rt/< X^CH.OH

O H

\ I

C C

^Ά I η'Ί^ο^ \ ^Urt2^l

OH H I I \ /OH

C-^⁰V /I \ ^l

^H OH ° ^H

O NH₂

Diese Säure wird dann einer an sich bekannten Peptidbildungsbehandlung lonterworfen, indem man mit einem Amin der allgemeinen Formel

R-H (VII)

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worin R die oben gegebene Bedeutung besitzt, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels für die Peptidesynthese umsetzt. Alternativ kann N-Methylbleomycinsäure der allgemeinen Formel (VI) in einen aktiven Ester, wie er bei der üblichen Peptidsynthese verwendet wird, umgewandelt werden und dann mit einem Amin der allgemeinen Formel (VII) umgesetzt v/erden.

Die inerten Lösungsmittel, die bei der reduktiven Methylierung der ersten Stufe verwendet werden, sind bevorzugt solche, die Bleomycinsäure lösen, wie polare Lösungsmittel einschließlich Wasser, wäßrigem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dergl.. Als Reduktionsmittel verwendet man die gleichen wie bei dem ersten Verfahren, Borhydridverbindungen, wie Natriumcyanoborhydrid sind bevorzugt. Die als Ausgangsmaterial verwendete Bleomycinsäure ist eine bekannte Verbindung, die gemäß dem in der US-PS 3 843 448 beschriebenen Verfahren hergestellt wird, indem man Bleomycin B₂ der Einwirkung kultivierter Zellen eines Stammes von Fusarium-Genus, wie z.B. Fusarium roseum Link emend Snyder et Hansen, ATCC 20352 oder ATCC 20355, Fusarium anguioides Sherbakoff, ATCC 20351, oder eines Stammes vom Helminthosporium-Genus, wie Helminthosporium zonatum Ikata et Yoshida, ATCC 20353 oder ATCC 20354, unterwirft. Die Menge an Formaldehyd, die bei der reduktiven Methylierung verwendet wird, beträgt 0,5 bis 5 Mol und bevorzugt 1,0 bis 1,5 Mol/Mol Bleomycinsäure. Die Menge an Natriumcyanoborhydrid beträgt 0,3 bis 4 Mol und bevorzugt 0,6 bis 2 Mol/Mol Bleomycinsäure. Die reduktive Methylierung erfolgt bei einer Temperatur von 0 bis 50°C, bevorzugt 15 bis 35⁰C

Wenn die reduktive Methylierung ausreichend fortgeschritten ist, wird überschüssiges Reduktionsmittel, sofern vorhanden, zur Beendigung der Reaktion zersetzt. Verwendet man beispielsweise Natriumcyanoborhydrid als Reduktionsmittel, so wird die Reaktion beendigt, indem man den pH-Wert auf

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unter 3, bevorzugt auf etwa 1, mit Chlorwasserstoffsäure erniedrigt. Obgleich die Reaktionslösung in einigen Fällen bei der darauffolgenden Stufe der Umsetzung mit einem Amin verwendet werden kann, ist es normale Praxis, die N-Methylbleomycinsäure aus der Reaktionslösung zu isolieren, auf ähnliche Weise, wie die bekannten Bleomycine isoliert werden, indem man geeignete Adsorptionsharze, wie z.B. nicht-ionenaustauschbare, makroretikulare Harze oder dergl., verwendet und eine Sequenz von Adsorptionen, Entsalzen und.Eluieren auf folgenden Weise durchführt.

Der pH-Wert der Reaktionslösung wird auf etwa 6 mit einem Alkali, wie Natriumhydroxid o.a., eingestellt und dann wird durch Destillation vom Lösungsmittel befreit. Das Reaktionsgemisch wird auf eine mit destilliertem Wasser gefüllte Säule gegeben und ein Adsorbensharz, wie z.B. Amberlite XAD-2 (Warenzeichen für ein Adsorbens aus Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, hergestellt von Rohm & Haas Co.), wird zugesetzt. Dabei wird die gewünschte Substanz am Harz für die Entsalzung adsorbiert. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser zur Entfernung der Salze wird die adsorbierte Substanz in saurem, wäßrigem Methanol, wie z.B. einem N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol(1:4 Vol/Vol)-Gemisch, zur Sammlung einer Fraktion eluiert, die ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 290 m/U zeigt. Die Fraktion wird mit einem Anionenaustauscherharz Dowex 44 (Warenzeichen, OH""-Typ; eine schwach basische Anionenaustauscherharzverbindung aus einem Kondensationsprodukt zwischen Epichlorhydrin und Ammoniak; Dow Chemical Co.) neutralisiert, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man ein rohes Pulver aus N-Methylbleomycinsäure erhält. Erforderlichenfalls kann die Reinheit auf folgende Weise weiter erhöht werden.

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Das oben erhaltene Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst und mit basischem Kupfer(II)-carbonat unter Rühren vermischt. Dabei wird die N-Methylbleomycinsäure in einen Kupferkomplex überführt. Der Komplex wird an einer mit CM-Sephadex C-25 (Warenzeichen; Na -Tpy, ein saurer Ionenaustauscher aus dem Carboxymethylätherderivat eines Dextrangels; Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) gepackten Säule, die mit einer 1/2 M Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung auf einen pH von 4,5 äquilibriert worden ist, adsorbiert. Die adsorbierte Phase wird mittels des linearen Gradientenverfahrens unter Verwendung dieser Pufferlösung als Eluierungsmittel eluiert, zu der man kontinuierlich Natriumchlorid zugibt, um die Natriumchloridkonzentration allmählich auf 1,0 M zu erhöhen. Die N-Methylbleomycinsäure wird bei einer Natriumchloridkonzentration von etwa 0,35 M eluiert. Da sowohl das nichtumgesetzte Ausgangsmaterial als auch die Verunreinigungen zu einem frühen Zeitpunkt eluiert werden, können die diese Substanzen enthaltenden Fraktionen entfernt werden, indem man mit einem Ultraviolett-Absorptionsmonitor, wie z.B. Uvicord (Warenzeichen der LKB Co.), den entsprechenden Nachweis führt. Stellt man fest, daß die gewünschte Fraktion mit Verunreinigungen verunreinigt ist, können die letzteren vollständig entfernt werden, indem man die obige Chromatographie wiederholt. Die so erhaltene, gewünschte Fraktion wird nach dem oben erwähnten Verfahren, bei dem Amberlite XAD-2 verwendet wird, entsalzt, und dann lyophilisiert, wobei man N-Methylbleomycinsäure-Kupferkomplex in Form eines amorphen Pulvers, mit bläulichpurpurner Farbe erhält.

Die Stufe (zweite Stufe), bei der das obige Zwischenprodukt in N-Methy!bleomycin überführt wird, wird im folgenden beschrieben. Diese Stufe zeichnet sich dadurch aus, daß man die Carboxylgruppe mit einem Kondensationsmittel für die Peptidsynthese aktiviert und dann das aktivierte

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Zwischenprodukt mit einem Amin der allgemeinen Formel (VII) unter Bildung eines N-Methylbleomycins umsetzt. Das Verfahren wird im folgenden anhand eines Beispiels näher erläutert .

N-Methylbleomycinsäure wird in Wasser, einem organischen Lösungsmittel oder einem ihrer Gemische gelöst. Bevorzugte organische Lösungsmittel sind Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. In das Lösungsmittel gibt man unter Rühren bei einer bestimmten Temperatur zwischen O und 5O°C, bevorzugt zwischen O und 30⁰C, einen basischen Katalysator, wie z.B. N-Methylmorpholin, und ein Kondensationsreagens für die Peptidsynthese, wie z.B. 6-Chlor-1-p-chlorbenzolsulfonyloxybenzotriazol (im folgenden als CCBT bezeichnet). Anschließend wird ein Amin der allgemeinen Formel (VIl) zugegeben und man läßt 0,5 bis 24 Stunden, bevorzugt 1 bis 5 Stunden, reagieren, und gegebenenfalls wird die Reaktion beendet, indem man Essigsäure zusetzt, wobei man eine N-Methylbleomycin enthaltende Reaktionslösung erhält. Wenn das Ausgangsmaterial kupferfrei oder ein Kupferkomplex ist, erhält man ein N-Methylbleomycin in kupferfreier Form bzw. als Kupfer-Komplex. Bei der Isolierung des Produktes in der nachfolgenden Stufe ist der Kupferkomplex bevorzugt. Sowohl das Kondensationsreagens für die Peptidsynthese als auch das Amin der allgemeinen Formel (VII) werden in einer Menge von 0,5 bis 10 und bevorzugt 1 bis 5 Mol/1 Mol N-Methylbleomycinsäure verwendet.

Beispiele von Aminen der allgemeinen Formel (VII) sind solche, worin -R die Formel

-N

^Y2

besitzt, worin Y₁ steht für Alkyl(C_1-8-N ^ , worin R₁ und

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Rp jeweils die folgende Bedeutung haben: (a) ₁ das durch Hydroxyl oder AIkOXy(C₁ □) substituiert sein kann, (b) Phenylalkyl(C_1-2), das durch Methyl substituiert sein kann, (c)

(d) -CHp-IL_nJ , (e) -CHp-O-CH-, (f) -(CHJ_o-i

(g) -(CH_?)-N ) , (h) -(CH₉K-N N , (i) -(CH0₀-N~"o

oder (j) ein Wasserstoffatom; Alkyl(C_1-8)-N-alkyl(C_1-8)-

N , worin R für ein Wasserstoffatom -* oder Alkyl(C. _ß)

und Rr und R^ für ein Wasserstoffatom, Alkyl^_^ oder Benzyl stehen; AIlCyI(C₁ _₅)-NH-alkyl(C_1-6)-alkyl(C_1-5)-NH₂;

₇(_1-3)

-CH-Alkyl(C. «)-N^ ^ , worin Rf- für -COOH oder

^AIk₇I(C₁₃)

^R6
-CONH₂ steht; Phenyl, das substituiert sein kann durch

N; , -NO₂, -CN₃ -SO₃H₃ -£

-SO₂-I

das am Phenylring durch Aminomethyl substituiert sein kann; _-Zf)-R₇, worin R₇ steht für -NH-C-NH₂,

NH

, -N N oder-N O

worin N 1 = -N

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Alkyl(C_1-4)-N^N-R₈, worin R₈ für AIkYl(C₁ ^) oder Aminoalkyl (C₁ _^) steht;

CK₃ , worin X für ein Chlor- oder Brom-

X\ j Vy Xi. ^

/₃ atom steht; -CH-CH₂-CH₂-S , worin Y, für

ein Wasserstoffatom, -COOH oder -CONH₂ steht und X die oben gegebene Bedeutung hat; Biphenyl; Naphthyl oder Pyridyl; und Y₂ ein Wasserstoffatom, -CH,, -COCH^, -COC₂H₅ oder

bedeutet.

Beispiele individueller Amine sind Hydroxylamin, Hydrazin, Phenylhydrazin, Semicarbazid, Thiosemicarbazid, Dicyclohexylcarbodiimid, Methylamin, Äthylamin, n-Propylamin, Isopropylamin, n-Hexylamin, n-Laurylamin, Allylamin, Dimethylamin, Dipropylamin, Cyclohexylamin, Cyclopentylamin, Anilin, Aminopyridin, Aminopyrimidin, Aminothiazo1, Aminoimidazol, Aminopyrazol, Aminotriazol, Naphthylamin, Aminochinolin, Äthylenimin, Pyrolidin, Piperidin und Morpholin. Beispiele substituierter Amine sind Cyanomethylamin, ß-Hydroxyäthylamin, ß-Cyanoäthylamin, ß-Bromäthylamin, 1,3-Trimethylendiamin, 1,4-Diaminobutan, 4-Guanidinobutylamin, Di-ß-chloräthylamin, Aminosäureester (z.B. Glycinmethylester, Phenylglycinmethylester, Phenylalaninmethylester, Lysinmethylester, usw.)» Cyclohexylmethylamin, Chloranilin, Nitroanilin, Anisidin, Toluidin, Cyanoanilin, Aminoacetophenon, Aminoacetanilid, Biphenylamin, Benzylamin, Phenäthylamin, SuIfanilsäure, Sulfanylamid, Sulfadiazin, SuIfathiazol, Sulfadimethoxin, Homosulfamin, Furfurylamin, 4-(5-Nitro-2-furyl)-thiazolylamin, 1,2-Diaminoäthan, 1,3-Diaminopropan, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan, 1,6-Di-

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aminohexan, N-(2-Aminoäthyl)-1,2-diaminoäthan, N-(3-Aminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Aminopropyl)-1,4-diaminobutan, N-(3-Aminopropyl)-1,6-diaminohexan, N-(5-Aminopentyl)-1,5-diaminopentan, N,N'-Bis-(2-aminoäthyl)-diaminomethan, N,N¹-Bis-(2-aminoäthyl)-1,2-diaminoäthan, Ν,Ν'-Bis-(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutan, N,N^f-Bis-(3-aminopropyl)-1,6-diaminohexan, N,N'-Bis-(5-aminopentyl)-1,5-diaminopentan, 2,2,3-Trimethylpentamethylendiamin, 1,2-Diaminopropan, N-Methyl-1,3-diaminopropan, N-Butyl-1,3-diaminopropan, N,N-Dimethyl-1,2-diaminoäthan, N,N-Diäthyl-1,2-diaminoäthan , N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan, N,N-Diäthyl-1,3-diaminopropan, 3-Aminopropyl-trimethylammoniumbromid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Methylaminopropyl)-1,2-diaminoäthan, N-(3-Methylaminopropyl)-1,4-diaminobutan, N-(3-Methylaminopropyl)-1,5-diaminohexan, N-(3-Methylaminopropyl)-1,8-diaminooctan, N-Butyl-N¹^- aminopropyl-1,3-diaminopropan, N-(2-Dimethylaminoäthyl)-1,3-diaminopropan), N-(4-Dimethylaminobutyl)-1,3-diaminopropan, N-(6-Dimethylaminohexyl)-1,3-diaminopropan, N-(8-Dimethylaminooctyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Hydroxypropyl)-1,3-diaminopropan, N-(2-Hydroxypropyl)-1,2-diaminoäthan, N-(2-Hydroxyäthyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Methoxypropyl)-1,3-diaminopropan , N-(3-Octyloxypropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Amino-1-methylpropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Amino-1-äthylpropyl)-1,3-diaminopropan, N,N-Bis-(3-aminopropyl)-methylamin, N,N-Bis-(3-aminopropyl)-äthylamin, N,N-Bis-(3-aminopropyl) -n-butylamin, 3-Aminopropyldimethylsulfoniumbromid, 3-Aminopropyldimethylsulfoniumchlorid, 3-Acetamidopropyldimethylsulfoniumbromid, 3-Amino-3-carboxypΓopyldimethylsulfoniumchlorid, 3-Amino-3-carbamoylpropyldimethylsulfoniumchlorid, 4-(Aminobutyl)-guanidin, 3-Amidinopropylamin, N-(3-Aminopropyl)-pyrrolidin, N-(3-Aminopropyl)-piperidin, N-(2-Aminoäthyl)-piperazin, N-(3-Aminopropyl)-piperazin, N-(3-Aminopropyl)-morpholin, N-(3-Aminopropyl)-N'-methylpiperazin, N-(3-Aminopropyl)-N'-äthylpiperazin,

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N,N'-Bis-(3-aminopropyl)-piperazin, N-(3-Pyrrolidinopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Piperidinopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(3-Morpholinopropyl)-1,3-diaminopropan, N-Benzyl-1,3-diaminopropan, N,N-Dibenzyl-1,3-diaminopropan, N-(1-Phenylethyl)-1,3-diaminopropan, N-(p-Methylbenzyl)-1,3-diaminopropan, m-Xyloldiamin, p-Xyloldiamin, N-Cyclohexyl-1,3-diaminopropan, N-(3-Cyclohexylaminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(2-Hydroxycyclohexyl)-1,3-diaminopropan, N-(2-Phenyläthyl)-1,3-diaminopropan, N-(2-p-Tolyläthyl)-1,3-diaminopropan, N-Benzyl-N¹-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(1-Phenyläthyl)-N^f-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropan, N-(2-Furfuryl)-1,3-diaminopropan, N-(5-Methyl-2-furfuryl)-1,3-diaminopropan, N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan, 4-Piperidylmethylamin, 2-(4-Imidazolyl)-äthylamin, N,N-Dimethyl-N¹-acetyl-1,3-diaminopropan, N,N-Dimethyl-N^f-propionyl-1,3-diaminopropan, 1-Carboxy-4-dimethylaminobutylamin, 1-Carbamoyl-4-dimethylaminobutylami.n, N,N-Dimethyl-N'-benzoyl-1,3-diaminopropan, N-[2-(ß-Pyridyl)-äthyl]-1,3-diaminopropan, N-(2-Methoxyäthyl)-1,3-diaminopropan und N-(1-Methyl-3-methoxypropyl)-1,3-diaminopropan.

Die in der zweiten Reaktionsstufe verwendeten Kondensationsreagentien für die Peptidsynthese sind N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (NEPIS), N-tert.-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat, N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin, Di-p-nitrophenylsulfitester, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid zusätzlich zu dem zuvor erwähnten CCBT.

Die Isolierung der Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe aus der Reaktionslösung, die man bei dem ersten und zweiten Verfahren erhält, erfolgt durch Adsorption an einem geeigneten Adsorbensharz und anschließende Entsalzung und darauffolgende Eluierung auf ähnliche Weise wie bei der übli-

030038/0760

chen Isolierung von Bleomycinen. Eine genauere Beschreibung des Verfahrens wird im folgenden gegeben.

Der pH-Wert der Reaktionslösung wird mit Natriumhydroxid auf 6,0 eingestellt, dann wird die Reaktionslösung von Methanol durch Destillation unter vermindertem Druck befreit und in eine Säule, die mit einem Adsorbensharz gepackt ist, wie z.B. Amberlite XAD-2 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co.), zusammen mit destilliertem Wasser gegeben. Dabei wird die gewünschte Substanz an dem Harz für die Entsalzung adsorbiert. Nach dem Herauswaschen der Salze mit destilliertem Wasser wird die adsorbierte Substanz mit angesäuertem, wäßrigem Methanol, z.B. einer N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol(i:4 Vo1/Vol)-Mischung, eluiert und die Fraktion mit einem Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 290 m/U wird gesammelt. Die Fraktion wird mit einem Anionenaustauscherharz, wie z.B. Dowex 44 (OH~-Typ; Warenzeichen der Dow Chemical Co.),neutralisiert, dann bei vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert. Man erhält das rohe Pulver des Antibiotikums der N-Methylbleomycingruppe. Eine weitere Reinigung des rohen Pulvers kann wie im folgenden beschrieben erfolgen.

Das rohe Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst und mit einem Kupfer(II)-salz, wie basischem Kupfer(II)-carbonat, unter Rühren unter Bildung eines Kupferkomplexes des Antibiotikums der N-Methylbleomycingruppe gerührt. Der Kupferkomplex wird an einer Säule adsorbiert, die mit CM-Sephadex C-25 (Na -Typ; Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) gepackt ist und die mit einer M/20 Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung von pH 4,5 äquilibriert worden ist. Die adsorbierte Phase wird mittels des linearen Gradientenverfahrens unter Verwendung der gleichen Pufferlösung, zu der man kontinuierlich Natriumchlorid zur allmählichen Erhöhung der Natriumchloridkonzentration bis zu 1,0 M zugibt, als Eluierungsmittel eluiert. Der Kupfer-

03 0 038/0760

komplex des Antibiotikums der N-Methylbleomycingruppe wird in einer Bande zwischen 0,50 und 0,80 M entsprechend seiner Basizität eluiert. Da nichtumgesetztes Ausgangsmaterial und Nebenprodukte zu einem früheren Zeitpunkt eluiert werden, können die diese Substanzen enthaltenden Fraktionen entfernt werden, indem man mit einem Ultraviolett-Absorptionsmonitor, wie z.B. Uvicord (Warenzeichen der LKB Co.), den Verlauf der Eluierung verfolgt. Stellt man fest, daß die gewünschte Fraktion mit Verunreinigungen verunreinigt ist, können die letzteren vollständig entfernt werden, indem man die obige Chromatographie wiederholt. Die Fraktion, die das kupfer-chelatierte N-Methylbleomycin enthält, wird nach dem obigen Verfahren, bei dem Amberlite XAD-2 verwendet wird, entsalzt, wobei man den gereinigten N-Methylbleomycin-Kupferkomplex erhält. Das gewünschte N-Methylbleomycin wird erhalten, indem man das Kupfer aus dem Kupferkomplex nach einem an sich bekannten Verfahren, wie z.B. gemäß dem in der US-PS 3 929 993 beschriebenen Verfahren, bei dem EDTA verwendet wird, entfernt. Das Verfahren wird im folgenden anhand eines Beispiels beschrieben.

Der Kupferkomplex wird in destilliertem Wasser gelöst und zusammen mit destilliertem Wasser auf eine Säule gegeben, die mit Amberlite XAD-2 gepackt ist, wobei der Kupferkomplex von dem Harz adsorbiert wird. Die Säule wird mit einer wäßrigen Lösung gewaschen, die 2% Natriumchlorid und 5% Äthylendiamin-tetraessigsäure-dinatrium (im folgenden als EDTA.Na₂ bezeichnet) enthält, und dann wird überschüssiges EDTA.Na₂ mit einer 2?6igen wäßrigen Natriumchloridlösung entfernt. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wird die Säule mit angesäuertem, wäßrigem Methanol, z.B. einer N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1:4 Vol/Vol)-Mischung, eluiert, und die Fraktion, die ein Absorptionsmaximum bei Wellenlängen um 290 m/u hat, wird gesammelt. Der pH-Wert des abströmenden Materials wird mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf 6,0 eingestellt, dann wird bei verringertem

030038/0760

Druck konzentriert und lyophilisiert. Man erhält ein Pulver aus N-Methylbleomycin-hydrochlorid. Wird beispielsweise wäßrige Schwefelsäure anstelle von Chlorwasserstoffsäure verwendet, so wird das gewünschte Produkt in Form des Sulfats erhalten. Durch Auswahl der Art der bei der Eluierungsstufe verwendeten Säure ist es möglich, das nichttoxische Salz mit irgendeiner pharmakologisch annehmbaren Säure zu erhalten.

Die C NMR-Spektren (bestimmt gemäß dem Protonengeräusch-Entkupplungsverfahren in schwerem Wasser) der Antibiotika der N-Methylbleomycingruppe, die gemäß dem obigen Verfahren isoliert wurden, zeigen das Signal der Methylgruppe, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt wurde, was einer 32,7 ppm chemischen Verschiebung entspricht. Diese Struktur wird weiterhin bestätigt, wenn N-Methylbleomycin in 6N Chlorwasserstoffsäure bei 1O5°C während 24 h hydrolysiert wird, und jJ-Amino^-methylaminopropionsäure und Methylamin können in dem Hydrolysat nachgewiesen werden. In dem Hydrolysat werden auch andere Zersetzungsprodukte, die für die Bleomycine mit Ausnahme von 2,3-Diaminopropan charakteristisch sind, nachgewiesen. Die obigen Tatsachen zeigen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen die Partialstruktur aufweisen, wie sie durch die Partiaistrukturformel (III) dargestellt wird.

N-Methylbleomycinsäure, die als Zwischenprodukt bei dem

13 zweiten Verfahren erhalten wird, zeigt ein C NHR-Spektrum (bestimmt durch das Protonengeräusch-Entkupplungsverfahren in schwerem Wasser), bei dem das Signal der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.eingeführten Methylgruppe bei 32,7 ppm chemischer Verlagerung nachgewiesen werden kann. Es wurde weiterhin bestätigt, daß, wenn N-Methylbleomycinsäure in 6n Chlorwasserstoffsäure bei 1O5°C während

030038/0760

24 Stunden hydrolysiert wird, 3-Amino-2-methylaminopropionsäure und Methylamin in dem Hydrolysat nachgewiesen werden. Dementsprechend besitzt die N-Methylbleomycinsäure, die als Zwischenprodukt bei dem zweiten Verfahren erhalten wird, die Partialstruktur, die durch die Partialstrukturformel (III) dargestellt wird.

Beispiele von N-Methylbleomycinen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, umfassen die folgenden Verbindungen.

030038/0760

N-MethyTbleomycine

Ϊ f

CH H O

I³ I Il

O HO CH N C

ο yyyv

O CH₃ CHl^S-^H

CH H

H O V N

H C⁷ c C

OH H H I O \

worin R für -NH-(CH₂)₂-NH₂ oder -NH-

oder eine der folgenden Verbindungen steht:

030038/0760

/^H3

CH₃

C₂H₅

-NH-(CHg)₃-N'

/2^H5

C₂H₅

-NH-( CH₂) -NH-(CH₂ ) -

-NH-(CH₂)₂-NH-CH₂-CH-CH₃

OH

-NH-(CH,,) „-N NH NH-( CH₂ K-NH-C CH₂ ) -NH-C

CH₃

-NH-CH₉-CH-CH^ 2 , 3

NH₂

030038/0760

©/^CH3

-NH-(CH₂) -S^x

CH-

NH

-NH-(CH₂)--NH-CH₃ NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)3- -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)g-NH₂

.CH

-NH-(CH₂K-N;

-CH-

-NH-CCH_n)_-NH-C ι

NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃~N

-NH-(CH₂)₃-N-(CH₂)₃-NH₂ CH₃

-NH-CCH-),-NE-CH-CCH )_-N

<- D ι C-C.

,CH-

CH

-NH-(CH-)--N ^ ⁵ V

/—\

-NH-C CH₂ )₃-N >

030038/0760

-NH-(CH.,)--N O

-NH-(CH_n)--N NH

-NH-(CH₉)o-N N-(CH_)--NH-

<- J \ / d j CL

-NH-(CH₀)_o-NH-(

-NH-(CH₂) ₃-NH-( CH₂) o-l

-NH-(CH₂)--NH-(CH₂)₃~0H

-NH-(CH₂)--NH-(CH₂)3-

-NH-(CH_n)_-NH-CH-(CH₀

c- D I c-

-NH-(CH₂)o-NH-(

-NH-(CH₀)--NH-CH 2 3 ι

CH

-NHCH.

CH₂-NH₂

030038/0760

-NH-(CH₂)--NH-( H

-NH-(CH₂) -NH-( H OH'

-NH-(CH₂) -NH-(CH₂ )₃-NH-( H

-NH-CH₂-/ NH -NH-(CH₂J₂-Ip-N

CH-

-NH -Y O /~^N02

-NH-/oV^CN

-NH-ZoV(O

030038/0760

-co

-NH-

-NHCH

CO-OCH-

PHp-(O,

-NH-CH

ΝΠΩ-

CO-OCH-

-NH

-NH-/ÖV

CH-

-NH

CH₃

-NH-(CH₂)₂-OH -NHCH₂CN

-NH-/ H \

030038/0760

-HE-Q-,

OCH-

Die wesentlichsten physikalischen und chemischen Eigenschaften von N-Methylbleomycinsäure und N-Methylbleomycinen, bestimmt an typischen Beispielen, sind in . den Tabellen 1 bis 3 aufgeführt, wobei die Verbindungsnummern den folgenden Verbindungen entsprechen.

Verbindung (1) N-Methylbleomycinsäure (2) N-Methy!bleomycin Ap

(3)

R = -NH- (CH₂

N-iy^thy!bleomycin ] R = -NH-(CH₀)

@/^CH3

^CH-,

NH

030038/0760

Verbind. (²I) N-Methylbleomycin A₂'-b

R = -NH-(CH₂)₃-NH₂

(5) 3-C(S)-1'-Phenyläthylamino]propylamino-N-methy!bleomycin

(S)

R = -NH-(CH₂J₃-NH-CK

CH₃

(6) 3-(3-n-Butylaminopropylamino)propylamino-

N-methylbleomycin

R = -NH- (CH₂ )₃-NH- (CH₂) ^NH-n-

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Physikalische und chemische Eigenschaften

Tabelle 1 Verbindung

Verbindung (Ij , Cu-Komplex

Verbindung (2),
Cu-Komplex,
Hydrochlorid

VerDindung
Cu-Komplex,
Hydrochlorid

Löslichkeit	löslich in Wasser, DMF und DMSO	löslich in Wasser, DMF, DMSO und Methanol	gleich wie ke Spalte	lin-
Schmelzpunkt, °C(Zers.)	218 - 220	206 - 208	199 - 201
Molekularformel und Molekulargewicht	C51H72N16O22S2Cu 1388,89	C56H85N17°21S3Cl2Cu 1563,02	C56H86N20°21 1573,99	S2Cl

o Zirkulardichroismus, S £®3\ (Wellenlänge, m/u) ⁰⁰ in destilliertem Wasser

-4	900	234
+9	100	266
-6	700	312
+2	800	554
-1	400	659

- 4	900	234
+10	500	270
- 8	200	313
+ 3	000	558
	600	663

-2	700	234
+9	900	265
-8	000	313
+2	900	554
-1	500	660

UJ CTi

. TLC, Rf (1)

(a) 0,72; (b) 0,58

(a) 0,38;(b) 0,49 (a) 0,60;(b) 0,66

Elektrophorese, Rm (Rm von Alanin=1), (2)

0,70

0,93

0.83

(1) (a) Silicagel 6OF 254 (Warenzeichen der Merck Co.), Methanol-1096 Ammoniumacetat-

10% wäßriges Ammoniak (10:9:1 Vol/Vol)

(b) Avicel S (Warenzeichen der FMC Co.), n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12 Vol/Vol)

(2) Avicel SF (Warenzeichen), Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Vol/Vol), 800 v, 15 min

O CD CX) Ca)

Physikalische und
chemische Eigenschaften

Tabelle 2 Verbindung

Verbindung (IJ > Cu-frei Verbindung {2),
Cu-frei,
Hydrochlorid

Verbindung(3)» Cu-frei, Hydrochlorid

Löslichkeit

löslich in Wasser, DMF, DMSO löslich in Wasser, DMF, DMSO und Methanol

gleich wie linke Spalte

iQ : >7TM

(Zers.)

194 _ 183 - 185

186 - 188

Molekulargewicht-

₁₇₄₁₆ 1327,36 ^C56^H87^N17°21^S3^C12
1501,49

1512,46

j:· [«^"(Wellenlänge, m/u)

. ·* η 'iiif'"'! Ι·.⁷ η c c ο τ»

.wasser

-4 100 (248] +5 600 (286 -1 100 (316; -5 600
+6 500
- 500

25o;

286:
321

-5 800 (250; +6 500 (286 - 500 (322'

(a) 0,38;(b) 0,59

(a) 0,36;(b) 0,38

(a) 0,34;(b) 0,70

Ξ R= von" Alanin = 1) , (2)

0,82 1,04

1,01

Fuür.ccen (1) und (2) wie in Tabelle 1.

Tabelle 5 Verbindung

Verbindung Cu-frei, Hvdrochlorid Verbindung (57
Cu-frei,
Hydrochlorid

Verbindung (oj,
Cu-frei,
Hydrochlorid

löslich in Wasser, DMF, gleich wie linke DMSO und Methanol Spalte

gleich wie linke
Spalte

t, C(Zers.)

179 - 182 - 191

- 187

Molekularformel und
Molekulargewicht

1456,39 ^C62^H92^N18°21^S2^C12
1560,54

1606,05

Zirkulardichroismus
[ö]|⁵(Wellenlänge, m/u)

ir» destilliertem Wasser

-5 500 (247; +6 100 (284 - 400 (320; -6 700 (250;
+6 100 (287
- 300 (320;

-5 900 (247
+6 500 (286
- 400 (319

TLC₅ Rp (1)

(a) 0,28;(b) 0,62

(a) 0,35;(b) 0,80

(a) 0,09;(b) 0,73

Elektrophorese, Rm

(Rm von Alanin =1) (2)

1,03 1,04

1,25

Fußnoten (1) und (2) gleich wie in Tabelle

O O OO Ca)

Die biologischen Eigenschaften von N-Methylbleomycinsäure, eines Zwischenproduktes und der N-Methylbleoniycine, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, werden an Proben typischer Beispiele im folgenden erläutert.

(1) Test für die Beständigkeit gegenüber inaktivierendem Enzym

1. Extraktion des inaktivierenden Enzyms

Die Leber weiblicher Ratten des Donryu-Stamms wird in der zweifachen Gewichtsmenge an M/15 Phosphatpuffer (pH 7,2) unter Herstellung einer Gewebeemulsion zermahlen. Die Emulsion wird 60 min bei 105 000 χ G zentrifugiert und das überstehende Material wird mit dem obigen Puffer dialysiert. Die so erhaltene Fraktion mit hohem Molekulargewicht wird als Extraktlösung für das inaktivierende Enzym verwendet.

2. Prüfung der Inaktivierungsreaktion

Zu 1 ml der obigen Extraktlösung gibt man 1 ml(enthaltend 800/Ug N-Methylbleomycinsäure oder N-Methylbleomycin) der Substratlösung. Das entstehende Gemisch kann bei 37°C während 15, 30, 60 und 120 min reagieren. Ein 0,3 ml-Teil der Reaktionslösung wird von Protein befreit und auf die Restaktivität gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607 geprüft. Ähnliche Versuche werden mit Bleomycinsäure und Bleomycinen durchgeführt, die nicht N-methyliert wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 6 aufgeführt. In den Figuren bedeuten (1) und (2) die Ergebnisse, die man bei den erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. bei den Vergleichsverbindungen erhält.

Aus den Fig. 1 bis 6 folgt, daß die bekannte Bleomycinsäure und die bekannten Bleomycine gegenüber dem Einfluß des inaktivierenden Enzyms sehr empfindlich sind und im Verlauf der Zeit inaktiviert werden, wohingegen

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3008353

die erfindungsgemäße N-Methylbleomycinsäure und die erfindungsgemäßen N-MethyTbleomycine sehr resistent sind.

(2) Spaltungsaktivität für den DNA-Strang in zellfreiem System

Man nimmt an, daß der Mechanismus für die carcinostatische Wirkung der Bleomycine die Spaltung der DNA-Kette verursacht, die durch die gemeinsame Einwirkung der kupferfreien Bleomycine, von zweiwertigem Eisen und molekularem Sauerstoff hervorgerufen wird. Eine ähnliche Aktivität von N-Methylbleomycinen wurde ebenfalls bestätigt.

Testverfahren

Ein Gemisch aus zweiwertigem Eisen und einem kupferfreien N-Methylbleomycin wird zusammen mit mit Tritium markierter DNA in einem M/10 Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst. Die entstehende Lösung kann in Anwesenheit von Sauerstoff bei 37°C während 5 min reagieren. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 25%ige Trichloressigsäure. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, und das überstehende Material (säurelösliche Fraktion) wird auf seine Radioaktivität untersucht, wobei der Prozentgehalt an säurelöslicher DNA in Säure festgestellt wird. Dieser Prozentgehalt wird als Index für den Grad der DNA-Strang-Spaltung verwendet. Ein ähnlicher Versuch wird mit Bleomycinen A₂ und B₂ als Vergleich durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

(3) Wachstumshemmwirkung auf kultivierte HeLa-Zellen

HeLa S-^-Zellen werden in einem Medium (MEM unter Zugabe von 10% Kalbsserum) in Kunststoffpetrischalen inokuliert. 2 Tage nach der Inokulation wird N-Methylbleomycinsäure oder ein N-Methylbleomycin in die Schale gegeben und nach der Kultivierung während weiterer 3 Tage wird die Zahl der

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Zellen gezählt. Die Wachstumshemmung (%) wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

Wachstumshemmung (%) = (1 - ) x 100

worin A die Endzahl der Zellen am 3· Tag nach der Zugabe der Testprobe, B die Endzahl der Zellen in einer Kontrollkultur ohne Zugabe der Testprobe und C die Zahl der Zellen zum Zeitpunkt der Zugabe der Testprobe bedeuten. Der Wert von IDc₀ (Konzentration für eine 50%ige Inhibierung) wird aus einer graphischen Darstellung berechnet, die man erhält, indem man die Konzentration der Probe gegenüber der Wachstumshemmung aufträgt. Ein ähnlicher Versuch wird mit Bleomycinsäure und Bleomycinen, die als Vergleichsproben verwendet werden, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

(4) Antimikrobielle Aktivität gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607

Verfahren

Die antibakterielle Aktivität wird gemäß dem Zylinder-Agar-Plattenverfahren gegenüber dem obigen Bakterium bestimmt, indem man die Aktivität des kupferfreien Standard-Bleomycins Ao als 1000 /Ug Einheiten/mg annimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Aus der Tabelle folgt, daß die N-Methylbleomycine eine sehr gute antibakterielle Aktivität aufweisen.

Aus den obigen Versuchsergebnissen folgt, daß N-Methylbleimycinsäure und N-Methylbleomycine durch das Inaktivierungsenzym nicht inaktiviert werden. Weiterhin behalten die N-Methylbleomycine die DNA-Spaltungsaktivität ähnlich wie Bleomycine bei und zeigen eine höhere Wachstumshemmaktivität gegenüber HeLa S^-Zellen wie auch eine hohe antimikrobielle Aktivität. Diese Tatsachen zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen als Antitumormittel und Bakterizide nützlich sind.

030038/076G

Verbindung (kupferfrei)

Tabelle 4

Säurelösliche DNA
Probenkonzentration ( /

1275

64,6

Erfindungsgemäße Verb.: N-Methylbleomycin A₂ N-Methylbleomycin B₂ 87,6 N-Methylbleomycin A₂'-b 61,7 3-[(S)-I'-Phenyläthylamino J-propylamino-N-methylbleomycin

3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-N-methylbleomycin

70,1

59,5

90,7	99,9
95,5	102,1
94,1	99,4
92,6	100,5
94,0	100,4

Vergleich: Bleomycin A2 Bleomycin Bp	78 85	,6 90 ,6 95	,8 ,8	100 98	,9 ,2
		Tabelle 5
50%ige Wachstumshemmkonz ten HeLa S3~Zellen	•	(lD5o,/Ug/ml)	gegenüber	kultivier-

N-Methylderivate (Cu-frei)

N-Methylbleomycinsäure 4 N-Methylbleomycin A₂ 0 N-Methylbleomycin B₂ 0 N-Methylbleomycin A₂'-b 0 3-C(S)-I¹-Phenyläthyl- 0 amino J-propylamino-N-methylbleomycin

3-(3-n-Butylaminopropylamino )-propylamino-N-methylbleomycin 0 Bekanntes Bleomycin (Cu-frei), entsprechend der Verbindung in der linken Spalte

,8	Bleomycinsäure	18
,81	Bleomycin A2	0,73
,35	Bleomycin B2	0,80
,58	Bleomycin A2-b	1.5
,30	3-[(S)-1'-Phenyläthyl- amino J-propylamino- bleomycin	0,52
,37	3-(3-n-Butylaminopropyl- amino)-propylamino- bleomycin	0,43

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Tabelle 6

Verbindung	Antimikrobielle Aktivität /Ug Einheiten/mg	64
	Cu-frei Cu-Komplex	423
N-Methylbleomycinsäure	59	1755
N-Methylbleomycin A2	513	625
N-Methylbleomycin B2	1766	4266
N-Methylbleomycin A2'-b	595	3695
3-[(S)-I'-Phenyläthylami- no J-propylamino-N-methyl- bleomycin	4333
3-(3-n-Butylaminopropyl- amino)-propylamino-N- me thylbleomycin	3438

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Synthese von N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex)

In 48 ml 85%igem wäßrigem Methanol löst man 1,0 g Bleomycinsäure (kupferfrei). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 3O°C eine wäßrige Lösung, die 30 mg Formaldehyd enthält, und anschließend 33 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach 12stündiger Umsetzung wird das Reaktionssystem mit 1N Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 1,0 eingestellt.

Nach lOminütigem Stehenlassen ist die Umsetzung beendet. Die Reaktionsmischung wird mit 1N Natriumhydroxidlösung neutralisiert, durch Destillation bei vermindertem Druck von Methanol befreit und der Rückstand wird mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Zur Entsalzung wird die entstehende Lösung auf eine Säule gegeben, die mit 300 ml Amberlite XADr-2 mit destilliertem Wasser gepackt ist. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wird die Säule mit einem Gemisch aus N/50 Chlorwasserstoff säure-Methanol (1:4 Vol/Vol eluiert und eine Fraktion mit einem Absorptionsmaximum bei Wellenlängen um

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290 m/U wird gesammelt. Die Fraktion wird mit einem Anionenaustauscherharz (Dowex 44; OH~-Typ) neutralisiert, dann bei vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert.

Das lyophilisierte Produkt wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 113 mg basischem Kupfer(II)-carbonat vermischt und 2 h bei Zimmertemperatur gerührt. Überschüssiges basisches Kupfer(ll)-carbonat wird durch Filtration entfernt , und das bläulich-purpurne Filtrat wird auf eine Säule gegeben, die mit 200 ml CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Typ) gepackt ist, die zuvor mit M/20 Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) äquilibriert wurde, um das angestrebte Produkt zu adsorbieren. Die Säule wird mittels des linearen Gradientenverfahrens unter Verwendung von 2 1 der genannten Pufferlösung als Eluierungsmittel, zu der man kontinuierlich Natriumchlorid zur allmählichen Erhöhung der Natriumchloridkonzentration auf 1,0 M zugibt, eluiert. Eine abströmende Fraktion mit bläulich-purpurner Farbe wird bei einer Natriumchloridkonzentration von etwa 0,35 M gesammelt. Zur Verbesserung der Reinheit wird das obige Chromatographieverfahren wiederholt, und dann wird die gewünschte Fraktion auf gleiche Weise wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Amberlite XAD-2 entsalzt. Die so behandelte Fraktion wird mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf pH 6,0 eingestellt, bei vermindertem Druck konzentriert und dann lyophilisiert; man erhält 250 mg (2h% Ausbeute) N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex) in Form eines bläulichpurpurnen, amorphen Pulvers.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Pulvers, bestimmt in destilliertem Wasser, und das Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt mit dem Kaliumbromid-Pillenverfahren, sind in den Fig. 7 bzw. 11 dargestellt.

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Ultraviolettabsorptionsmaxima (E^^ , destilliertes Wasser): 292 (150), 246 (151) m/U. Andere physikalische und chemische Eigenschaften wurden zuvor in Tabelle 1 aufgeführt.

Beispiel 2 Synthese von N-Hethylbleomycinsäure (Kupferkomplex)

In 50 ml 90%igem wäßrigen Methanol löst man 1,0g Bleomycinsäure (kupferfrei). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei O⁰C eine 34 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 72 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach 24ständiger Umsetzung wird die Reaktionslösung wie in Beispiel 1 behandelt; man erhält 198 mg (Ausbeute 19%) N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex) in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulver. Dieses Pulver zeigt ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften wie die in Beispiel 1 erhaltene Probe.

Beispiel 3 Synthese von N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex)

In 40 ml 95%igem wäßrigen Methanol löst man 1,0 g Bleomycinsäure (kupferfrei). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 23°C eine 25 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 62 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach 6stündiger Umsetzung wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 1 behandelt; man erhält 235 mg (Ausbeute 22%) N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex) in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers, das ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften wie die in Beispiel 1 erhaltene Probe zeigt.

Beispiel 4

Synthese von N-Methylbleomycin Ao

Stufe A: In 20 ml Dimethylformaldehyd löst man 400 mg N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 23°C 116 mg N-Methylmorpholin und

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298 mg CCBT. Das Gemisch wird 5 min gerührt, mit 166 mg 3-Aminopropyldimethylsulfoniumchlorid (Hydrochlorid)vermischt \ind kann 3 h reagieren. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5,3 ml Eisessig beendigt. Die Reaktionsmischung wird mit 300 ml Aceton zur Ausfällung des gewünschten Produktes vermischt. Der Niederschlag wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und gemäß Beispiel 1 auf folgende Weise behandelt. Nach der Entsalzung unter Verwendung von Amberlite XAD-2 wird die Lösung einer Säulenchromatographie mit CM-Sephadex C-25 unterworfen, um die Eluatfraktion bei etwa 0,65 M zu sammeln. Die Fraktion wird entsalzt und lyophilisiert; man erhält 369 mg (Ausbeute 82%) N-Methylbleomycin A₂ (Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum, gemessen in destilliertem Wasser, und das Infrarotabsorptionsspektrum des Pulvers, bestimmt nach dem Kaliumbromid-Pillenverfahren, sind in Fig. 8 bzw. 12 gezeigt. Die Ultraviolettabsorptionsmaxima (^E1cm» ^destil^liertes Wasser) liegen bei 292 (I22)und 244 (148) m/U. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Stufe B: In 10 ml destilliertem Wasser löst man 300 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes. Zur Entfernung des Kupfers leitet man die entstehende Lösung in eine Amberlite XAD-2-Säule (200 ml), um die Adsorption zu bewirken. Die Säule wird nacheinander mit 600 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 2% Natriumchlorid und 5% EDTA-Na₂, 400 ml'einer 2%igen Natriumchloridlösung und 250 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die adsorbierte Phase wird mit einer N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1:4 Vol/Vol)-Mischung eluiert, um eine Fraktion mit einem Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 290 m/U zu sammeln. Die gesammelte Fraktion wird mit Dowex 44 (OH -Typ) auf einen pH von 6,0 eingestellt, bei vermindertem Druck kon-

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zentriert und lyophilisiert; man erhält 265 mg (Ausbeute 92%) N-Methylbleomycin A₂ (kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum und das Infrarotabsorptionsspektrum des Pulvers, bestimmt nach dem Kaliumbromid-Pillenverfahren, sind in den Fig. 9 bzw. 13 gezeigt. Das Ultra-

■Λ θ/

violettabsorptionsmaximum (E.^/0 , destilliertes Wasser) liegt bei 291 (93) m/u. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Beispiel 5

Synthese von N-Methylbleomycin B₂

Stufe A: In 20 ml Dimethylsulfoxid löst man 400 mg N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 23°C 116 mg N-Methylmorpholin und 298 mg CCBT. Die Mischung wird 5 min gerührt, mit 176 mg Agmatin (Hydrochlorid) vermischt und weitere 3 h reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wird auf ähnliche Weise wie in Stufe A von Beispiel 4 behandelt; man erhält 345 mg (Ausbeute 76%) N-Methylbleomycin B₂ (Kupferkomplex)

in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers.

190 Die Ultraviolettabsorptionsmaxima (E.;; , destilliertes

ι cm

Wasser) liegen bei 292 (123) und 244 (153) m/U. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Stufe B: Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 4 werden 335 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 280 mg (Ausbeute 86%) N-Methylbleomycin B₂(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum, bestimmt in destilliertem Wasser, und das Infrarotabsorptionsspektrum, bestimmt nach dem Kaliumbromid-Pillenverfahren, sind in Fig. 10 bzw. 14 gezeigt. Das Ultra-

19£ violettabsorptionsmaximum (Ej£ , destilliertes Wasser)

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liegt bei 290 (101) m/U. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Beispiel 6

Synthese von N-Methylbleomycin Ap'-b

Stufe A: In 20 ml Dimethylformamid löst man 400 mg N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei O⁰C 29 mg N-Methylmorpholin und 298 mg CCBT. Das Gemisch wird 5 min gerührt, mit 65 mg 1,3-Diaminopropan vermischt und kann weitere 5 h reagieren. Die Reaktionsmischung wird auf ähnliche Weise wie in Stufe A von Beispiel 4 behandelt; man erhält 402 mg (Ausbeute 92%) N-Methylbleomycin A^'-b (Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers. Die

190

Ultraviolettabsorptionsmaxima (E^ , destilliertes Was-

ι cm

ser) liegen bei 292 (122) und 244 (148) m/U. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Stufe B: Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 4 werden 390 mg Kupferkomplex vom Kupfer befreit; man erhält 333 mg (Ausbeute 89%) N-Methylbleomycin A^'-b(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsmaximuin (E./ , destilliertes Wasser) liegt bei 291 (101) m/u.

Beispiel 7

Synthese von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylamino-N-methy!bleomycin

Stufe A; In 20 ml Dimethylformamid löst man 400 mg N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 27⁰C 29 mg N-Methylmorpholin und 298 mg CCBT. Die Mischung wird 5 min gerührt, mit 154 mg N-](S)-1'-Phenyläthyl]-1,3-diaminopropan vermischt und kann weitere 3 h reagieren. Auf ähnliche Weise wie in Stu-

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fe A von Beispiel 4 wird die Reaktionsmischung behandelt; man erhält 304 mg (Ausbeute 65%) 3-[(S)-1·-Phenyläthylamino]-propylamino-N-methylbleomycin(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers. Die Ultraviolettabsorptionsmaxima des Pulvers (E^. destilliertes Wasser) liegen bei 292 (114) und (140) m/u.

Stufe B; Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 4 werden 290 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 257 mg (Ausbeute 92?£) 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylamino-N-methylbleomycin(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^_n. destilliertes Wasser) liegt bei 290 (101) m/U.

I CIQ /

Beispiel 8

Synthese von 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-N-methy!bleomycin

Stufe A; In 20 ml Dimethylformamid löst man 400 mg N-Methylbleomycinsäure (Kupferkomplex). Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei O⁰C 29 mg N-Methylmorpholin und 298 mg CCBT. Die Mischung wird 5 min gerührt, mit 162 mg N-3-Aminopropyl-N^l-n-butyl-1,3-diaminopropan vermischt und kann eine v/eitere Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wird auf ähnliche Weise wie in Stufe A von Beispiel 4 behandelt (wobei jedoch die Fraktion gesammelt wird, die aus der CM-Sephadex C-25-Säule bei einer Konzentration von etwa 0,80 M eluiert wurde); man erhält 246 mg (Ausbeute 51%) 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-N-methyl-bleomycin (Kupferkomplex) in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers. Die Ultra-

1 9ί violettabsorptionsmaxima (E₁ ⁷^ , destilliertes Wasser)

liegen bei 292 (102) und 243 (125) m/U.

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Stufe B; Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 4 werden 237 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 194 mg (Ausbeute 85%) 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino-N-methylbleomycin(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsmaximum

(E'^/0. destilliertes Wasser) liegt bei 290 (99) m/U. ι cm /

Beispiel 9

Synthese von N-Methy!bleomycin A_P

Stufe A: In 70 ml Methanol löst man 1,0g Bleomycin Ap (kupferfrei)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 25°C eine wäßrige Lösung, enthaltend 30 mg Formaldehyd, und anschließend 29 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach I6stündiger Umsetzung wird das Reaktionssystem mit 1N Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,0 eingestellt, und die Umsetzung ist nach lOminütigem Stehenlassen beendigt. Die Reaktionsmischung wird mit 1N Natriumhydroxidlösung neutralisiert, durch Destillation bei vermindertem Druck von Methanol befreit und der Rückstand wird mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Zur Entsalzung wird die erhaltene Lösung in eine Säule, die mit 300 ml AmberIite XAD-2 gepackt ist, mit destilliertem Wasser zur Adsorption des gewünschten Produktes eingeleitet. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wird die Säule mit einer Mischung aus N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1:4 Vol/Vol) eluiert und eine Fraktion mit einem Absorptionsmaximum bei Wellenlängen um 290 m/U gesammelt. Die Fraktion wird mit einem Anionenaustauscherharz (Dowex 44; OH""-Typ) neutralisiert, bei vermindertem Druck konzentriert und dann lyophilisiert; man erhält ein rohes Produkt in Form eines Pulvers.

Das rohe Produkt wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 113 mg basischem Kupfer(II)-carbonat vermischt und

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2 h bei Zimmertemperatur gerührt. Überschüssiges basisches Kupfer(II)-carbonat wird durch Filtration entfernt. Das erhaltene, bläulich-purpurne Filtrat wird in eine mit 200 ml CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Typ) gepackte Säule eingeleitet, die mit N/20 Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) äquilibriert worden war, um das gewünschte Po Produkt zu adsorbieren. Die Säule wird mittels der linearen Gradienten-Methode mit 2 1 der genannten Pufferlösung, zu der man kontinuierlich Natriumchlorid zur allmählichen Erhöhung der Natriumchloridkonzentration bis auf 1,0 ohne Änderung des pH-Wertes zugibt, als Eluierungsmittel eluiert. Eine abströmende, bläulich-purpurgefärbte Fraktion wird bei einer Natriumchloridkonzentration von etwa 0,65 M gesammelt. Zur Verbesserung der Reinheit wird das obige Säulenchromatographieverfahren wiederholt und dann wird die gewünschte Fraktion mittels eines Entsalzungsverfahrens unter "Verwendung von Amberlite XAD-2, wie oben erwähnt, entsalzt. Die so behandelte Fraktion wird bei vermindertem Druck konzentriert und dann lyophilisiert; man erhält 446 mg (Ausbeute 42%) N-HethyIbIeomycin Ap (Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulichpurpurnen, amorphen Pulvers.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum und die antimikrobieile Aktivität des Pulvers sind wie folgt:

A θ/

Altraviolettabsorptionsmaxima (^E-|c_m> destilliertes Wasser):

292 (122), 244 (I48)m/U Antimikrobielle Aktivität: 520 /Ug Einheiten/mg.

Bemerkungen: Die Antimiktrobielle Aktivität wird gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607 untersucht, wobei eine Aktivität von Bleomycin Ap (kupferfreie Form) von 1000/Ug Einheiten/mg angenommen wird. Das gleiche gilt für die folgenden Ausführungen.

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Stufe B: In 10 ml destilliertem Wasser löst man 430 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes. Zur Kupferentfernung wird die erhaltene Lösung in eine Amberlite XAD-2-Säule (200 ml Volumen) zur Herbeiführung der Adsorption gegeben. Die Säule wird nacheinander mit 600 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 2% Natriumchlorid und 5% EDTA.Na₂, 400 ml einer 2%igen wäßrigen Natriumchloridlösung und 250 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die adsorbierte Phase wird mit einer Mischung aus N/50 Chlorwasserstoffsäure-Methanol (1:4 Vol/Vol) eluiert, um eine Fraktion mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 290 m/U zu sammeln. Die gesammelte Fraktion wird mit Dowex 44 (OH~-Typ) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, bei vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert; man erhält 380 mg (Ausbeute 92%) N-Methylbleomycin A₂(kupferfrei )-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum und die antimikrobielle Aktivität dieses Produktes sind wie folgt:

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E,/⁰ , destilliertes Wasser):

291 (93) m/u
Antimikrobielle Aktivität: 418 /Ug Einheiten/mg.

Beispiel 10

Synthese von N-Methylbleomycin A₅

Stufe A: In 70 ml Methanol löst man 1,0g Bleomycin A₂(kup ferfrei )-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 0⁰C eine 25 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 29 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach 24stündiger Umsetzung wird das Reaktionssystem zur Beendigung der Reaktion auf einen pH von 1,0 eingestellt.

Die Reaktionsmischung wird auf ähnliche Weise wie in Stufe A von Beispiel 9 behandelt; man erhält 191 mg (Ausbeute 18%) N-Methylbleomycin A₂(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers.

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Das Ultraviolettabsorptionsspektrtim und die antimikrobieile Aktivität des Pulvers sind wie folgt: Ultraviolettabsorptionsmaxima (E,.⁷V, destilliertes Wasser):

292 (122), 244 (148 m/u Antimikrobieile Aktivität: 516/ug Einheiten/mg.

Stufe B: Auf ähnliche V/eise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 180 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 157 mg N-Methylbleomycin A₂ (kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers. Das Ultraviolettmaximum und die antimikrobielle Aktivität des Pulvers sind wie folgt: Ultraviolettabsorptionsmaximum (d]' _, destilliertes Wasser):

ι cm

291 (93) m/u

Antimikrobielle Aktivität: 427/ug Einheiten/mg.

Beispiel 11

Synthese von N-Methylbleomycin Ap

Stufe A: In 70 ml Methanol löst man 1,0 g Bleomycin A₂ (kupferfrei)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 30°C eine 25 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 29 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach lOständiger Umsetzung wird der pH des Reaktionssystems zur Beendigung der Reaktion auf 1,0 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Stufe A von Beispiel 9 behandelt; man erhält 209 mg (Ausbeute 20%) N-Methylbleomycin A₂(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers mit folgenden Werten:

-to/

Ultraviolettabsorptionsmaximum ( *^_m, destilliertes Wasser): 292 (122), 244 (148 mpx

Antimikrobielle Aktivität: 507/Ug Einheiten/mg

Stufe B: Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 200 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes

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vom Kupfer befreit; man erhält 173 mg (Ausbeute 90%) N-Methy!.bleomycin Ap (kupferfrei )-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers mit den folgenden Vierten:

1 ⁰D

Ultraviolettabsorptionsmaximum (^E-i_cm» destilliertes Wasser) 291 (93) m/u

Antimikrobielle Aktivität: 420/ug Einheiten/mg.

Beispiel 12

Synthese von N-Methylbleomycin Bp

Stufe A: In 60 ml Methanol löst man 1,0 g Bleomycin Bp(kupferfrei )-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 25°C eine 23 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 32 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach I6stündiger Umsetzung wird der pH des Reaktionssystems zur Beendigung der Reaktion auf 1,0 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird auf gleiche Weise wie in Stufe A von Beispiel 9 behandelt; man erhält 385 mg (Ausbeute 37%) N-Methylbleomycin Bp(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^^/0 , destilliertes Wasser);

ι cm

292 (123), 244 (153) nyu Antimikrobielle Aktivität: 1 758 /ug Einheiten/mg.

Stufe B: Auf gleiche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 375 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 335 mg (Ausbeute 93%) N-Methylbleomycin Bp(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers.mit den folgenden Werten:

A θ/

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^^ .destilliertes Wasser):

ι cm

290 (101) m/u Antimikrobielle Aktivität: 1 752 ,ug Einheiten/mg.

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_ 55 -

Beispiel 13

Synthese von N-Methy!bleomycin Bp

Stufe A; In 70 ml Methanol löst man 1,0g Bleomycin B₂ (kupferfrei)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 25°C eine 30 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 63 mg Iiatriumcyanoborhydrid. Nach 2stündiger Reaktion wird der pH des Reaktionssystems zur Beendigung der Reaktion auf 1,0 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird auf gleiche Weise wie in Stufe A von Beispiel 9 behandelt; man erhält 168 mg (Ausbeute 16%) N-Methylbleomycin Bp(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^ ,destilliertes Wasser):

292 (123), 244 (153) nyu Antimikrobielle Aktivität: 1 770/Ug Einheiten/mg.

Stufe B: Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 150 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 127 mg (Ausbeute 88%) N-Methylbleomycin Bp(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

1 ⁰A Ultraviolettabsorptionsmaximum (E₁^,destilliertes Wasser):

290 (101) m/u

Antimikrobielle Aktivität: 1 756 /Ug Einheiten/mg.

Beispiel 14

Synthese von 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylamino-N-methy!bleomycin

Stufe A: In 100 ml Methanol löst man 1,0g [3-(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin(kupferfrei)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 25°C eine 19 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 41 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach 6stündiger Ums etzung wird der pH des Reaktionssystems zur Beendigung

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der Reaktion auf 1,0 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird auf ähnliche Weise \iie in Stufe A von Beispiel 9 "behandelt; man erhält 86 mg (Ausbeute 8,2%) 3-[(S)-1 '-Phenyläthylamino ]-propylamino-N-methylbleomycin(Kupferkomplex)-hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

-in/

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E.^,destilliertes Wasser):

292 (114), 243 (14O) m/U Antimikrobielle Aktivität: 4 320 /Ug Einheiten/mg.

Stufe B: Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 80 mg .des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 74 mg (Ausbeute 96%) 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylamino-N-methylbleomycin(kupferfrei )-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^ ,destilliertes Wasser):

290 (101) m/u
Antimikrobielle Aktivität: 4 280/Ug Einheiten/mg.

Beispiel 15

Synthese von 3-(tert.-Butoxycarbonylamino)-propylamino-N-methy!bleomycin

Stufe A: In 75 ml Methanol löst man 1,0g 3-(tert.-Butoxycarbonylamino)-propylaminobleomycinikupferfrei)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man unter Rühren bei 27⁰C eine 20 mg Formaldehyd enthaltende, wäßrige Lösung und anschließend 55 mg Natriumcyanoborhydrid. Nach I4stündiger Reaktion wird der pH des Reaktionssystems zur Beendigung der Reaktion auf 1,0 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird auf ähnliche Weise wie in Stufe A von Beispiel 9 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß eine Fraktion bei etwa 0,50 M der CM-Sephadex-Chromatographie gesammelt wird. Man erhält 335 mg (Ausbeute 32%) des gewünschten

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Produktes (Kupferkomplex) als Hydrochlorid in Form eines bläulich-purpurnen, amorphen Pulvers mit Ultraviolettabsorptionsmaxima (E^_m» destilliertes Wasser) bei 292 (117) und 243 (147) m,u.

Stufe B; Auf ähnliche V/eise wie in Stufe B von Beispiel 9 werden 325 mg des in Stufe A erhaltenen Kupferkomplexes vom Kupfer befreit; man erhält 269 mg (Ausbeute 86%) des gewünschten Produktes (kupferfrei) als Hydrochlorid in

Form eines weißen, amorphen Pulver mit einem Ultravioletten/

absorptionsmaximum (E.;; , destilliertes Wasser) bei 291

ι cm

(iOO)m/U.

Vergleichsbeispiel 1 Tert.-Butoxycarbonisierung von 3-Aminopropylaminobleomycin

In 4 ml destilliertem Wasser löst man 750 mg 3-Aminopropylaminobleomycin(Kupferkomplex)-hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man bei 23°C unter Rühren 0,3 ml Triäthylamin und 134 mg 2-(tert.-Butoxycarbonylthio)-4,6-dimethylpyrimidin in Form einer Dioxanlösung. Nach 12stündiger Umsetzung gibt man 200 ml Aceton zur Ausfällung des Produktes zu der Reaktionsmischung zu. Der Niederschlag wird in 20 ml destilliertem V/asser gelöst und die Lösung wird mit 1N Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Anschließend wird das Produkt auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 vom Kupfer befreit; man erhält 558 mg (Ausbeute 78%) 3-(tert.-Butoxycarbonylamino)-propylaminobleomycin(kupferfrei) -hydro chlor id in Form eines weißen, amorphen Pulvers mit einem Ultraviolettabsorptionsmaximum (E₁ ⁷^ , destilliertes Wasser) bei 291 (101) m/u.

Vergleichsbeispiel 2

Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe aus 3-(tert.-

Butoxycarbonylamino)-propylamino-N-methy!bleomycin

In 3,6 ml destilliertem Wasser löst man 80 mg 3-(tert.-

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Butoxycarbonylamino)-propylamino-W-methylbleomyciniKupferkomplex) -hydrochlorid. Zu der Lösung gibt man 2,4 ml Trifluoressigsäure. Nach 1 stündiger Umsetzung bei 23°C wird Trifluoressigsäure bei vermindertem Druck durch Destillation entfernt. Der Rückstand wird mit 1N Natriumhydroxid neutralisiert. Auf ähnliche Weise wie in Stufe B von Beispiel 9 wird der Rückstand vom Kupfer befreit; man erhält 48 mg (Ausbeute 63?0 3-Aminopropylamino-N-methylbleomycin(kupferfrei)-hydrochlorid in Form eines weißen, amorphen Pulvers mit den folgenden Werten:

Ultraviolettabsorptionsmaximum (E^ , destilliertes Wasser):

291 (101 m/U Antimikrobielle Aktivität: 618/ug Einheiten/mg.

Ende der Beschreibung.

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Claims (8)

1. KRAUS & WEISERT

   PATENTANWÄLTE ^w

   DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON O89/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd

   TELEGRAMM KRAUSPATENT

   2485 AW/My

   NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA Tokyo, Japan

   N-Methy!bleomycin-Antibiotika

   Patentansprüche N-Methylbleomycine der allgemeinen Formel

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   f3

   >^IH2 NH

   ⁰⁼? ? CH NH,

   R- C N-CH₀ C

   2 \ / 2 j,

   pil H

   r¹¹ ο CH, η ο

   λ ι ι Il ο

   /"N _n HO CK N C II

   ^c ° CH C CH NK

   CH O CH CH₀ N

   CHo N_v C. CH

   Ch N

   worin R den endständigen Aminmolekülteil der Bleomycine bedeutet,

   ihre Kupferkomplexe und ihre nicht-toxischen Salze.
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R DialkylCC^-C^JsulfoniumalkylCCp-CcJamino, Guanidinoalkyl(C₂-Cc)amino, Aminoalkyl(C₂-Cc)amino, Phenyl-

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   alkyl(C₁-C_Zf)aminoalkyl(C₂-Cc)amino oder Alkyl(C₂-Cc)-aminoalkyl(Cp-C₁-)aminoalkyl(Cp-Cc)amino bedeutet.
3. 3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-[(S)-1-Phenyläthylamino]-propylamino bedeutet.
4. 4. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylamino bedeutet .
5. 5· Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

   ®^3 daß R -NH-(CHpU-S ^ .Cl" bedeutet.

   ^CH₃
6. 6. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R Guanidinobutylamino bedeutet.
7. 7. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R Aminopropylamino bedeutet.
8. 8. N-Methylbleomycinsäure der allgemeinen Formel

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   NH.

   NH

   O=C

   H₀C
   ²

   ι CH NH₀

   I / \ / N-CH₀ C

   il

   CH₀ H ι J ι

   N N

   NH₂ CH₃

   N. C

   ^ CH

   il

   HO CH N C

   O CH C CCH NH

   III Il I I

   CH O CH CH₀

   O CH_n C

   H
   i

   CH

   HO C C ^N'

   OH„ / O / H H

   CH

   N-

   Il

   C-OK H

   OH

   ^c\ i/\

   CK₂OH

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