DE69129924T2

DE69129924T2 - Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE69129924T2
Application number: DE69129924T
Authority: DE
Inventors: Masao C/O Meiji Seika Kaisha Ltd. Yokohama-Shi Kanagawa Koyama; Toru C/O Meiji Seika Kaisha Ltd. Yokohama-Shi Kanagawa Sasaki; Akira C/O Meiji Seika Kaisha Ltd. Yokohama-Shi Kanagawa Shimizu; Hiroomi C/O Meiji Seika Kaisha Ltd. Yokohama-Shi Kanagawa Watabe; Junko C/O Meiji Seika Kaisha Ltd. Yokohama-Shi Kanagawa Yoshida
Original assignee: Meji Seika K K
Current assignee: Meji Seika K K
Priority date: 1990-05-21
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2011-05-22
Also published as: EP0458259A3; DE69129924D1; EP0458259A2; JP2594167B2; US5164507A; EP0458259B1; JPH0426674A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Antibiotikum, von dem erwartet wird, daß es als Behandlungsmittel von Mykosen nützlich ist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bisher wurden eine Anzahl von Antibiotika, die von Mikroorganismen produziert werden, entwickelt; unter ihnen befindet sich jedoch keine Verbindung, die hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften mit der antibiotischen Substanz der vorliegenden Erfindung (im folgenden als "Substanz SF 2698" bezeichnet) übereinstimmt.
Während verschiedene Antibiotika bekannt sind und in den Bereichen der Arzneimittel, Veterinärmedikamente und landwirtschaftlichen Chemikalien praktische Anwendung finden, besteht ein Bedarf an einem neuen Antibiotikum, welches höherer Sicherheit und Wirksamkeit, im besonderen im Bereich der Antipilzmittel, aufweist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein neues Antibiotikum mit antifungaler Wirkung zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Antibiotikums zur Verfügung zu stellen.
Um den oben erwähnten Bedarf zu decken, suchten die Erfinder nach einer Substanz mit antifungaler Wirksamkeit; im Ergebnis stellte sich heraus, daß eine Kultur eines bestimmten Stammes der Gattung Streptomyces eine Substanz produziert, welche in einem synthetischen Medium antifungale Wirksamkeit aufweist. Sie isolierten die wirksame Substanz und bestimmten ihre physikochemischen Eigenschaften.
Die oben beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch eine neue antibiotische Substanz SF 2698 gemäß folgender Formel:
und deren Salze und ein Verfahren zur Herstellung der Substanz SF 2698, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, welcher die Substanz SF2698 produzieren kann, in einem Medium zur Anreicherung der Substanz SF 2698 und das Gewinnen der angereicherten Substanz SF 2698 umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Tablette) eines Hydrochlorids der Substanz SF 2698.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein Hydrochlorid der Substanz SF 2698 gemäß Formel
besitzt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
1) Farbe und Form: farbloses Kristall
2) Schmelzpunkt: unklar; Zerfall bei 250ºC oder höher
3) Molekularformel: C&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub2;
4) Massenspektrum (HR-MS):
berechnet: m/z 140, 0585 (C&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub2;)
gefunden: m/z 140,0587 (M+)
5) Spezifische Drehung: [α]25D -50º (c = 1,0, H&sub2;O)
6) Ultraviolette und sichtbare Absorptionsspektren:
λmax nm ( ) [MeOH]: 218 (9000), 255 (Schulter)
7) Infrarotabsorptionsspektrum:
wie in Fig. 1 dargestellt
8) ¹H NMR-Spektrum (400 MHz, D&sub2;O)
δ(ppm): 7,02(1H, dt), 6,23 (1H, dt), 4,18 (1H, t), 2, 92 (1H, m), 2, 78 (1H, m)
9) ¹³C NMR-Spektrum (100 MHz, D&sub2;O)
δppm): 177,8 s, 159,1 s, 146,9d, 117,3d, 53,4d, 27,8 t
10) Löslichkeit: löslich in Wasser oder Methanol; unlöslich in organischen Lösungsmitteln, z. B. Ethylacetat.
11) Farbreaktion: positiv mit einem Greig-Leaback (GL)-Reagenz und einem Pentacyanoaquoferroat-Reagenz, entwickelt eine gelbe Farbe mit einem Ninhydrin-Reagenz.
12) Dünnschichtchromatographie (TLC):
Rf = 0,29; Kieselgelglasplatte (5715, hergestellt von Merck Co.); Butanol-Methanol-Wasser (2 : 1 : 1 Volumen) als Entwicklungslösungsmittel.
Aufgrund der oben beschriebenen physikochemischen Eigenschaften in Verbindung mit den Ergebnissen der instrumentalen Analysen, wird die Substanz SF 2698 als bisher noch nicht beschriebene, neue Substanz betrachtet, welche folgen der Formel entspricht:
Die Substanz SF 2698 kann in Abhängigkeit der Bedingungen folgende alternative Struktur aufweisen:
Die Substanz SF 2698 ist eine amphotere Substanz und kann in das Salz einer anorganischen oder organischen Säure, beispielsweise ein Hydrochlorid, ein Sulfat und ein Trifluoracetat, oder in Salze mit anorganischen oder organischen Basen, beispielsweise ein Natriumsalz, ein Kaliumsalz und ein Ethanolaminsalz, überführt werden.
Der die Substanz SF 2698 produzierende Mikroorganismus, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfaßt einen Stamm SF 2698, der aus dem Boden von Shizuoka, Japan, isoliert wurde.
Der Stamm SF 2698 besitzt die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.

I. Morphologische Eigenschaften:

Die vegetativen Hyphen breiten sich lang aus und verzweigen sich gut; sie werden unter gewöhnlichen Bedingungen nicht unterbrochen. Die aerialen Hyphen wachsen reichlich auf einem Stärkeagarmedium, einem Glucose-Asparagin-Agarmedium usw. mit befriedigender Sporulation. Die Verzweigung der aerialen Hyphen ist relativ gering, es tritt keine Wirbelverzweigung auf. Die Sporenketten an der Spitze der aerialen Hyphen verlaufen linear. Bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop besitzen die Sporen eine elyptische bis zylindrische Gestalt mit einer Größe von 0,6-1,0 · 0,9-1,4 um und mit einer weichen Oberfläche. Gewöhnlich sind etwa 30 bis 50 Sporen verbunden. Es werden kein Sporangium, keine beweglichen Sporen und kein Sclerotium beobachtet.

II. Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien:

Die Wachstumsbedingungen des Stammes SF 2698 auf verschiedenen Medien sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Die Farbstandards in Klammern stimmen mit dem Color Harmony Manual der Container Corporation aus Amerika überein. Die Beobachtungen wurden nach der Kultivierung bei 28ºC für 14 bis 21 Tage durchgeführt.

III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Bereich der Wachstumstemperaturbedingung:
von 15 bis 33ºC, im besonderen von 25 bis 30ºC, auf einem Hefeextrakt-Stärke-Agarmedium.
(2) Gelatineverflüssigung: negativ
(3) Stärkehydrolyse: negativ
(4) Reduktion von Nitrat: positiv
(5) Peptonisierung auf Magermilch: negativ Koagulation auf Magermilch: negativ
(6) Salzresistenz: fähig zum Wachstum in einem 5%-igen NaCl-haltigen Medium, jedoch im wesentlichen unfähig zum Wachstum in einem 7%-igen oder höher konzentrierten NaCl-haltigen Medium
(7) Melaninähnliche Pigmentproduktion: positiv (auf Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium)

IV. Verwendung der Kohlenstoffquellen (auf ISP-9-Medium):

(1) Verwertbar: D-Glucose, D-Fructose, Glycerol, D- Mannitol, Raffinose
(2) Nicht verwertbar: L-Arabinose, L-Rhamnose, Sucrose
(3) Verwertbarkeit zweifelhaft: D-Xylose, Myo-Inositol

V. Analyse der mikrobiellen Zellen:

Eine Analyse durch das Verfahren von Becker (Appl. Microbiol. 13 : 236 (1965) zeigte, daß die Diaminopimelinsäure in dem Hydrolysat der gesamten mikrobiellen Zellen vom LL- Typ war.
Anhand dieser taxonomischen Eigenschaften wurde der Stamm SF 2698 als zu der Gattung Stroptomyces der Actinomyceten zugehörig erkannt, wobei die aerialen Hyphen der gelbfarbigen Serie angehören, die Spitze der aerialen Hyphen linear ist, eine weiche Sporenoberfläche vorliegt und die Rückseitenfarbe blaßgelb bis gelblich-braun ist, und er kein nennenswertes lösliches Pigment produziert. Die Erfinder bezeichneten den Stamm als Streptomyces sp. SF 2698. Der Stamm wurde am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305 JAPAN) unter der Nummer FERM BP-3336 in Übereinstimmung mit dem Budapester Abkommen hinterlegt.
Die Eigenschaften des Stammes SF 2698 unterliegen Variationen, wie sie gewöhnlich mit anderen Actinomyceten beobachtet werden. All diese Mutanten (entweder spontane oder induzierte), Zygoten oder Rekombinanten oder aus dem Stamm SF 2698 hervorgegangene Varianten könnten in der vorliegen den Erfindung verwendet werden, wenn sie die Substanz SF 2698 produzieren können.
Der oben beschriebene Stamm wird in einem Medium kultiviert, welches die Nährstoffe, die gewöhnlich bei Mikroorganismen verwendet werden, enthält. Es können jegliche der bekannten Nährstoffquellen, die konventionell zur Kultivierung von Actinomyceten verwendet werden, verwendet werden. Zu Beispielen für verwendbare Kohlenstoffquellen zählen Glucose, Glucose- oder Maltosesirup, Dextrin, Stärke, Molasse und tierische und pflanzliche Öle. Zu Beispielen für verwendbare Stickstoffquellen zählen Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Kornlaugenflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Amoniumsulfat, Natriumnitrat und Harnstoff. Wenn notwendig, werden Salze anorganischer Säuren, welche ein Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Kobalt-, Chlorid-, Phosphat- oder Sulfation oder andere Ionen produzieren können, dem Medium zugegeben. Zu Beispielen für die Salze anorganischer Säuren zählen Natriumsulfat und Calciumcarbonat. Organische oder anorganische Substanzen, welche das Wachstum des Stammes unterstützen, um die Produktion des Antibiotikums SF 2698 zu beschleunigen, werden in angemessener Weise dem Medium zugegeben. Zu spezifischen Beispielen hierfür zählen Vitamin A, B&sub1;, B&sub2; und B&sub1;&sub2;.
Die Kultivierung wird geeigneterweise unter aeroben Bedingungen, und im besonderen in einer Eintauchkultur bei pH 7,5 und einer Temperatur von 25 bis 30ºC, meist um 28 ºC, durchgeführt. Die Anreicherung der Substanz SF 2698 erreicht ihr Maximum gewöhnlich an Tag 2 bis 7 der Kultur, entweder in einer Schüttelkultur oder ruhenden Kultur, in Abhängigkeit vom Medium und den Kulturbedingungen. Wenn die Menge der angereicherten Substanz SF 2698 das Maximum erreicht, wird die Kultivierung beendet und die gewünschte Substanz aus dem Kulturüberstand isoliert und gereinigt.
Die Mittel zur Isolierung und Reinigung der Substanz SF 2698 aus der Kultur werden unter denen ausgewählt, die im allgemeinen verwendet werden und sich die Eigenschaften der Substanz zunutze machen, wie Ionenaustauscherharz-Verfahren, Adsorptions- oder Verteilungs-Säulenchromatographie, Gelfiltration, Dialyse, Sedimentation und ähnliches, entweder einzeln oder in einer geeigneten Kombination. Beispielsweise wird die in der Kultur produzierte und angereicherte Substanz SF 2698 auf stark sauren Ionenaustauscherharzen, z. B. Diaion PK-208 (hergestellt von Mitsubishi Kasei Corporation) adsorbiert. Sie wird effektiv durch Chromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, z. B. aktivierter Kohlenstoff, gereinigt. Zur weiteren Reinigung der Substanz SF 2698 wird Chromatographie unter Verwendung eines Adsorptionsmittels, z. B. Kieselsäuregel (Wako Gel C-200, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Aluminiumoxid usw. oder Sephadex G-10 (hergestellt von Pharmacia Co.), angewendet. Wenn gewünscht, können die obigen chromatographischen Verfahren in Kombination in angemessener Reihenfolge verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Substanz SF 2698 weist antifungale Wirksamkeit, wie im nachfolgend beschriebenen Testbeispiel gezeigt, auf und ist bei der Therapie von Mycosen in Menschen und Tieren anwendbar, wobei ihre Brauchbarkeit als Antipilzmittel erwartet wird. Zur therapeutischen Verwendung kann die Substanz SF 2698 in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verschiedener Dosierungsformen entsprechend bekannter Präparationstechniken formuliert werden. Die Substanz SF 2698 kann außerdem als Zwischenprodukt zur Synthese von Arzneimitteln verwendet werden.

TESTBEISPIEL

Die minimalen wachstumsinhibierenden Konzentrationen (MIC) eines Hydrochlorids der Substanz SF 2698 auf verschie dene Testmikroorganismen sind in folgender Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Testmikroorganismus MIC (ug/ml)
Candida glabrata IFO-0005 0,2
Candida glabrata IFO-0622 0,78
Candida utilis M9007 12,5
Candida albincans M9001 > 100
Cyptococcus neoformans M9010 > 100
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, übt ein Hydrochlorid der Substanz SF 2698 antimikrobielle Wirkung gegen verschiedene Arten von Eumyceten aus.
Des weiteren wurde die Toxizität eines Hydrochlorids der Substanz SF 2698 durch Verabreichung der Testverbindung an Mäuse durch intravenöse Injektion untersucht. Im Ergebnis trat kein Todesfall bei einer Dosis von 100 mg/kg auf.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detaillierter mit Bezug auf ein Beispiel beschrieben. Nun, da die Eigenschaften der Substanz SF 2698 aufgeklärt wurden, können verschiedene Ansätze zur Herstellung der Substanz SF 2698 entsprechend ihrer Eigenschaften unternommen werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem Verfahren der Herstellung, Konzentrierung, Extraktion, Reinigung der Substanz SF 2698 entsprechend ihrer Eigenschaften unter Verwendung bekannter Verfahren sowie Modifikationen der Verfahren, wie sie in dem Beispiel beschrieben sind.

BEISPIEL

Ein Medium, welches 1,0% Stärke, 1,0% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Sojabohnenmehl und 0,2% Fleischextrakt (pH = 7,0 vor der Sterilisation) enthielt, wurde als Aussaatmedium verwendet.
Ein Medium, welches 5,0% Glucose (separat sterilisiert), 2,5% Sojabohnenmehl, 0,2% Fleischextrakt, 0,2% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 0,2% Natriumsulfat (wasserfrei) und 0,5% Calciumcarbonat (pH = 6,0 vor der Sterilisation) enthielt, wurde als Produktionsmedium verwendet.
Ein 100 ml-Erlenmeyerkolben, welcher 20 ml des Aussaatmediums enthielt, wurde bei 121ºC 20 Minuten sterilisiert und mit 2 bis 3 Platinimpfösen einer Schrägagarkultur von Streptomyces sp. SF 2698 (FERM BP-3336) angeimpft und bei 28 ºC 24 Stunden unter Schütteln inkubiert, um eine erste Subkultur herzustellen.
Ein 500 ml-Erlenmeyerkolben, welcher 80 ml des Aussaatmediums enthielt, wurde bei 121ºC 30 Minuten sterilisiert und mit 4 ml der ersten Subkultur angeimpft und bei 28ºC 24 Stunden unter Schütteln inkubiert, um eine zweite Subkultur herzustellen.
Ein 2l-Erlenmeyerkolben, welcher 700 ml des Aussaatmediums enthielt, wurde bei 121ºC 30 Minuten sterilisiert und mit 35 ml der zweiten Subkultur angeimpft und bei 28ºC 24 Stunden inkubiert, um eine dritte Subkultur herzustellen.
700 ml der dritten Subkultur wurden in einen 50 l-Rüttelfermenter, welcher 35 l des Produktionsmediums enthielt, welches bei 121ºC 30 Minuten sterilisiert worden war, geimpft und bei 28ºC 5 Tage unter Belüftung (17,5 l/Min.) und Rühren (250 rpm im Anfangsstadium; 400 rpm ab 24 Stunden) kultiviert.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde Diatomeenerde der Kultur als Filtrierhilfe zugegeben und die Kultur filtriert. Das Filtrat der Kultur (60 l) wurde durch eine Säule mit aktiviertem Kohlenstoff zur Chromatographie (6 l) geschickt und die Säule mit Wasser (40 l) gewaschen. Das Waschwasser wurde unter reduziertem Druck konzentriert und das Konzentrat (4 l) durch eine Diaion PK-208-Säule (H&spplus;-Typ, 800 ml; hergestellt von Mitsubishi Kasei Corporation) geschickt. Nach Waschen der Säule mit Wasser wurde unter Verwendung von 0,1 N wäßrigem Ammoniak (13 l) eluiert. Das Eluat, welches die aktive Komponente enthielt, wurde durch einen Bioassay unter Verwendung von Candida glabrata als Indikatormikroorganismus bestimmt und mit 0,5 N Salzsäure neutralisiert und durch eine Säule mit aktiviertem Kohlenstoff zur Chromatographie (1 l) geschickt. Nach Waschen der Säule mit Wasser wurde die aktive Komponente mit 30%-igem wäßrigem Methanol (2 l) eluiert. Das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und das Konzentrat unter Verwendung einer Sephadex G-10-Säule (1,8 l; hergestellt von Pharmacia Co.) und Wasser als Entwicklungslösungsmittel Chromatographie unterworfen. Die aktive Fraktion wurde unter reduziertem Druck bei 40ºC oder weniger konzentriert, wodurch 103 mg eines Hydrochlorids der Substanz SF 2698 als farbloses Kristall erhalten wurden.
Die Substanz SF 2698 kann per se aus der obigen aktiven Fraktion folgendermaßen erhalten werden. Die Fraktion wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch Chromatographie mit aktiviertem Kohlenstoff entsalzt. Das resultierende Eluat wird unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, was die Substanz SF 2698 ergibt.

Claims

1. Substanz gemäß folgender Formel:

und deren Salz.

2. Substanz gemäß Anspruch 1, deren Hydrochlorid gemäß folgender Formel

folgende physikochemische Eigenschaften besitzt:

1) Farbe und Form: farbloses Kristall

2) Schmelzpunkt: unklar; Zerfall bei 250ºC oder höher

3) Molekularformel: C&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub2; · 1/2HCl

4) Massenspektrum (HR-MS):

berechnet: m/z 140,0585 (C&sub6;H&sub8;N&sub2;O&sub2;)

gefunden: m/z 140, 0587 (M&spplus;)

5) Ultraviolette und sichtbare Absorptionsspektren: λmax(e) [MeOH]: 218 (9000), 255 (Schulter)

6) ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, D&sub2;O)

δ(ppm): 177,8 s, 159,1 s, 146, 9d, 117, 3d, 53, 4d, 27, 8 t

3. Verfahren zur Herstellung einer Substanz gemäß Anspruch 1, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus des Stammes Streptomvces, welcher die Substanz herstellen kann, und das Gewinnen der Substanz aus der Kultur umfaßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um FERM BP-3336 handelt.