DE2006446B2

DE2006446B2 - Verfahren zur herstellung von bleomycin-antibiotika sowie bleomycine mit strukturell abgewandelter seitenkette

Info

Publication number: DE2006446B2
Application number: DE19702006446
Authority: DE
Inventors: Hamao Maeda Kenji Tokio Takita Tomohisa Asaka Fujii Akio Shimada Nobuyoshi Chimura Hideo Tokio Nakayama Yuya Yono Umezawa, (Japan)
Original assignee: Zaidan Hojm Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai, Tokio
Priority date: 1969-02-15
Filing date: 1970-02-12
Publication date: 1977-09-29
Also published as: CS150904B2; RO54829A; FR2034552B1; NL147187B; NO132875C; CH545343A; PL80837B1; BG17632A3; FR2034552A1; CA923055A; DE2006446A1; YU36389B; IL33879A; YU35870A; NO132875B; DE2006446C3; NL7002104A; USRE30451E; ES376555A1; DK123605B

Description

NH ((H,), Ml (CIl,), N

NH ICH,I, Nil (CIU), N

Ik) NH (CII,), Nil (CH,), Nil

CU,

C II,

C, 11,

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bleomycin-Antibiotika sowie Blcomycine mit strukturell abgewandelter Seitenkette.

Die Bleomycine sind Antitumor-Antibiotika, die durch U m e ζ a w a et al. entdeckt wurden. Sie werden durch Züchten eines Bleomycin-erzcugendcn, zu den Actinomyces gehörenden Stammes von Streptomyces verticillus (z.B. ATCC 15003) unter aerobischen Bedingungen und unter Rühren in einem Nährmedium, das Hirse-Gallerte (Hauptkomponente Maltose), Glucose, Sojabohnenpulver, Korn-Einweichwasser, Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Zinksulfat, Kupfersulfat, etc., enthält und Isolieren des gebildeten Bleomycins aus der Kulturflüssigkeit in Form des Hydrochlorids oder des Sulfates mit Hilfe von Ionenaustausch-Harzen gewonnen. Man erhält so Produkte, die Ar. A₂-, A₂'-, A₃-, A₄-, A₅-, Ab , Β,-, B₂-, Bj-, B₄-, B₅-, B₆-Komponenten und dergleichen (nachstehend als Bleomycin-Komponenten bezeichnet) enthalten. Diese Bleomycin-Komponenten sind weiße Pulver, wenn man sie ferner noch zur Entfernung des Kupfers einer weiteren Behandlung unterzieht. Bleomycin ist als allgemeine Bezeichnung für

as Antibiotika, welche diese Komponenten enthalten, bekanntgeworden (GB-PS 10 38 242).

Wenn die Züchtung unter üblichen Bedingungen durchgeführt wird, werden diese Bleomycin-Komponenten gleichzeitig gebildet, jedoch ist das Verhältnis der einzelnen Komponenten zueinander unbestimmt. In den meisten Fällen werden hauptsächlich nur die Bleomycin-Komponenten A₂ und B₂ erzeugt.

Es wurden nun mit dem Ziel, ein Verfahrer aufzufinden, durch welches man erwünschte Bleomycin-

.vs Komponenten der obengenannten Art selektiv mii günstigen Ausbeuten erzeugen kann, Untersuchunger über die Strukturen der Bleomycine durchgeführt unc festgestellt, daß die Bleomycin-Komponenten eine Teilstruktur der nachstehenden allgemeinen Formel enthalten, und daß der Rest R in der Formel je nach dei Art der Bleomycin-Komponente variiert.

N—τ—CO —R

-NH-CH-CO-NH-(CH₂),-

CHOH

CH₃

Bleomycin A₂: R = -NH-(CH₂J₃-S

CH₃

Bleomycin A₂: R = -NH-(CH₂J₄-NH₂

Bleomycin A₅: R - —NH-(CH₂)₃ —NH-(CH₂J₄-NH₂

Bleomycin A₆: R = — NH—(CH₂)₃ —NH-(CH₂J₄-NH-(CH₂I₃-NH₂

Bleomycin B₂: R = -NH-(CH₂J₄-NH-C-NH₂

NH Bleomycin B₄: R = -NH-(CH₂J₄-NH-C-NH-(CH₂J₄-NH-C-

-NH,

NH

Basierend auf der vorerwähnten Erkenntnis wurde nun festgestellt, daß bei Zugabe von verschiedenartigen, der Seitenkette R in der erwähnten Formel 1 entsprechenden Aminoverbindungen, oder von solchen Aminoverbindungen, welche bei der Züchtung in der Seitenkette R entsprechende Amine umgewandelt werden, zu den Kulturmedien von Bleomycin-erzeugenden Stämmen, sowohl bekannte aus auch neue Bleomycin-Komponenten in ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden können.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Bleomycin-Antibiotika durch Beimpfen eines Nährmediums mit einem Bleomycin-erzeugenden Stamm von Streptomyces verticillus und Züchten dieses Stammes unter aeroben Bedingungen, bei welchem man 1 s dem Nährmedium ein Amin der allgemeinen Formel

X = — CH-

CH,

R¹ = R² = H

X = -CH₂-CH₂-CH,-R¹ = R² = H

X = -(CH₂J₂-NH-(CH,).,-R¹ = R² = CH,
R¹ = H, R² = C₄ H,. c-

H,N—CH,-X —N

R¹

R²

in der X, R¹. R² folgende Bedeutung haben:

■y CH

R¹ = R² = H, CH,. C₂H₅

R¹ = H. R² = -CH₂-CH-CH,

OH

X = _CH₂-CH₂—

R^! = R² = H. CH,. C₂U, R¹ = H. R² = CH.,. -CH₂-CH₂CH₂OH

-CH₂ CH₂-CH₂- OCH,

C₄Ii,. C-C₁₁H₁₁

CU {% CH.,

(CU₂), N ICH,), N (CH,), N O

CH,

R' I

(ClI,), . (CH,),

(CII,), O (CH,),

(CH,), Nil (CII,),

(CII,), N (ClI,),

(CII,), NII, X = -(CH₂I₂-N-(CH₂),-

R¹ = R- = H

X = -(CH₂I₂-NH-CH-(CH₁),

R¹ = R² = H

X = - (CHj)₂-NH--(CH,I₄-

R¹ = H. R² = H. -(CH₂).,-NH

X=-

R¹ = R² = H

X =

CH,

R¹

R² Il

oder

4-Λ minomet hy !piperidin,

4-(2-Aminoalhyl)-imidazol,

3-Aminopropyltrimcthylammoniimichlorid, N-(4-Aminobulyl)guaiiiclin,

3-Aminopropyl-dimcthylsiill'()niumbromid oder .j-AiiiiiH)-3-carb()xypropyl-

dimethylsiilfoniuniclilorid

zugibt und iius der Ktillurflüssigkeil ihis »us zugegebenen Aminoverbindung gebildete Uleoni durch Chromatogiaphieien im Kationciiiiustiuisc harz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid und vernetz Dextran und liluieren in an sich bekannter W isoliert.

Die in ticiii erfiiulungsgemäUen Verfahren verwet ten Aniinoverbiiulungen sind in der nachfolgen Tabelle I, zusammen mit den Schmelz- bzw. Siedepi ten, niedergelegt.

libelle

Ammovcrbindtini!

l-ornicl physikalische Eigenschaften

I 1,2-Diiiminoiillian

₁N (C! U), Nil,

Kp.:
116-117 "C

	Ν,Ν-Dimethyl- 1,2-diaminoäthan	1!,N(CI	I,),N " " \	\ C	\	"Κ,
				C	'2H₅
3	Ν,Ν-Diüthyl- 1.2-diaminoäthan	H₂N(C	H,),N

N-(2-I lydroxypropyl)-1,2-diaminoälhan

C₂H₅ OH

Kp.:
105—108" C

Kp.: 147—15I"C

Kp.:

123—126 C

12 mm Hg

5 N-(2-Aminoäthyi)-pipcrazin

6 1,3-Diaminopropan

7 Ν,Ν-Dimcthyl-1,3-diaminopropan

8 Ν,Ν-Dialhyl-1,3-diaminopropan

9 N-Methyl-1,3-diaminopropan

10 N-(3-l lydroxypropyl)-1,3-diaminopropan

11 N-(3-Mcthoxypropyl)-1.3-diaminopropan

12 N-IiLiIyI-l,3-ili;iminiinropan

H₂N (CH₂),- N NI! ^v—'

II,N--(CII,), --NH,

cn.,

H₂N -(CH,).,---N' \ CH,

C₂II₅

H₂N (CII₂)., N \
C₂II₅

H₂N (CW₂),, Nil CM.,

H₂N (ClI₂)., Nil (CII₂)., Oll

H₂N (CM,)., Nil (CIl₂)., OCII.,

Π., Ν (CiI₂), Nil C₁II,,

Kp.:
280-281 C

Kp.:

135 136 C

Kp.:

^- ' 35,5

Kp.:

I^;p.:

''¹^ 120'(

Fp.:
225 C

Kp.:

20 mm Πμ

13 N-Cyclohexyl-1,3-diamiiiopropan

I. N (CHj)., NII Kp.:

1-4 125 ( 21 mm I Ig

14 N-lk-n/yl-1,3-tliamiiiopi'opan II.. N (CIl..), Nil CH,

Kp.:

150 155 <

25 mm 1 Ij;

IS N-d-l'lu-iiyliitliyD-1,3-tliamiiiopi'opan II.. N (CII.,)., Nil CH

Kp.:

148 150 24 mm Ik

ίο

Fortsetzung

Nr. Aminovcrhiniliint!

l-'ormcl

Physikalische Kiueii schallen

N-(3-Pyrrolidinopropyl)-1,3-diaminopropan H₂N -(CH₂), --NH (CH₂), N

Kp.:

159 162 C

22 mm Hg

N-(3-Pipcridinopropyl)-1,3-diaminopropan H₂N-(C¹H,).,-NH (CH₂)., N

Kp.:

164 167 C

21 mm Hu

18 N-(3-Morpholinopropyl)- H₂N (CH₂), NH (CH₂), N O 1,3-diaminopropan ^x —

Kp.:

176 -180 C

20 mm Hg

N-(2-Furfuryl)-

1,3-diaminopropan H₂N- (C¹H₂), - NH - CH₂ -

Kp.:

105—109 C 3 mm Hg

N-(3-Aminopropyl)-pyrrolidin

H₂N -(CH₂), — N

Kp.:

185- 189 C

N-(3-Aminopropyl)-piperidin

H₂N- (CH₂), -N

Kp.: 100 C 20 mm Hg

N-(3-Aminopropyl)-morpholin

H₂N (CH₂), N O

Kp.: 219 C 733 mm Hi

N-(3-Aminopiopyl)-pipera/in

H₂N (CH₂), N NH

Kp.:

80 81 C

2 mm Hg

24 N.N'-Bis(3-aminopropyl)- H₂N (CIl₂), N N (ClI₂), NH₂ pipcia/in

,2-l)iamiin<propaii

.4-l)iainiiHibulaii H₂N CIl₂ ClI NJI₂

cn,

11,N (CIl,), NII,

27 N-l.l-hiim-tliylaiiiinn- ΙΙ,Ν (ClI.), Nil (CII,!, N

pi'npyl)· 1.3-dianiiiinpropan dl,

cn,

N Uuiyl-N'"|3-aminn- H,N (CH,I, NIl (( 11..I₁ Nil C₁II₁₁

pn'pyl)-1..1 iliamiin«|impan Kp.:

18>S 202 (

21 mm Hg

Kp.:

118 Il9 (

Kp.:

I5S IM) <

Kp.:

125 C

λΐ mm Hi;.

Kp.: 125

N-l.i-Cyi-lnlK-xylaniiiii)- ΙΙ,Ν K II.I, Nil (CH.I, Nil

pi'iipvl)-1.' iliaiiiinnpiiipaii Kp.:

iso c

11

Fortsetzung

12

Nr. Aminoveibiiulunu

lormel Physikalische lügcnschaften

N-(I-Phenylathyl)-N '-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropan H₂N (CH₂)., NH -(CH₂).,- NH-CH-

/ X

Kp.:

150 153" C/

mm Hg

31 N.N-Bis(3-aminopropyl)- H₂N -(CH₂)., - N - (CH₂)., -NH₂ methylamin

CH₁

32 N-(3-Amino-l-metliyl- H₂N (CH₂).,--NH -CH -(CH₂I₂-NH₂ propyl)-1.3-diaminopropan

Kp.:

97- 100 C/

2 mm Hg

Kp.: 123—125' C

N-(3-Aminopi"opyl)-1,4-diaminobutan (Spermidin)

N,N'-Bis(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutan (Spermin)

m-Xylylendiamin H₂N (CH₂), NH (CH₂J₄-NH₂

H₂N - (CH₂)., - NH (CH₂)₄ - NH-(CH₂).,-NH₂

H₁N-CH₁

CH₂-NH₂

Kp.: 115'C/ 3 mm Hg

Kp.:

150 -160X7

3 mm Hg

Kp.:

138 139 C/

9 mm Hg

p-Xylylcndiamin H₂N --CH₂-/ ">—CH₂-NH₂

Fp.: 35 C

4-Aminomethylpiperidin H₂N CH₂ NH

4-(2-Aminoäthyl)-imidazol-hydrochlorid

3-Amini)pri)pylli'imi.'tliylamnuitiiunichloriil

N-(4--Aininobiityl)" guanidin-suHal

.("Aniiiiupnipyl diimMliylsuH'.iuiimi bromid liydnihmiiiid

.1 ,Amino 3-faι bow pnipyl dinuMlivlsiilioiiiiim rliliuid / NII
II,N -(CIU)₁ < ■ hydiodilorid

N --

ClI.,

11,N (CIlJ, N ClI,
Cl (H,
II,N ICH, I Nil C NII, sulfat

Il

NH
CII,

II,N (CIlJ, S hydiobiomid
Hi CH,

CH,
II,N CH (CIlJ, S

COOIl Cl CH₁

Kp.:

78" C/ 5 mm Hg

Fp.:

247 250 C

Fp.:

200 201 C

Γρ.: 231 C

Γρ.:

S7 XX C

Γρ.: I .V)

(/.IMS.)

Wenn beispielsweise J-Ammopropyl-dimetliylsiiHu niumbromid oder J-Amino-J-carboxypropvl-dimethyT sulfoniumchlorid ;ils Aminoverbinciung zu einem Nährmedium zugegeben und ein Bieomycin-erzeugender Stamm, wie Streptomyces veriicillus, in dem erwähnten Medium gezüchtet wird, erhöhl sich der gebildete Anteil an Bleomycin A_> auf Kosten der gesamten anderen, in dem Kulturmedium vorhandenen Bleomycine. Desgleichen erhöht die Zugabe von Agmatinhydrochlorid den Prozenlgehalt an Bleomycin Bi, die Zugabe von 1,4 Diaminobutan den Prozentgehalt an Bleomycin A₂' und die Zugabe von Spermidin den Prozentgehalt an Bleomycin A₅. Jedoch führt die Zugabe von Spermin nicht nur zu einer Bildung von Bleomycin Ah mit der entsprechenden Seitenkette, sondern auch zu einer Produktion von Bleomycin A·-, mit dem Spermidinres! in der Seitenkette, der während der Züchtung aus dem Spermin entstand. Im Falle eines Stammes, der eine hohe Fähigkeit zur Umwandlung von Spermin in Spermidin besaß, führte die Zugabe von Spermin hauptsächlich nur zur Bildung von Bleomycin A₅. Ebenso führte die 2^ugabe von beispielsweise 1,2-Diaminoäthan oder 1,3-Diaminopropan zur Produktion von neuem 2-Aminoäthylamino-bleomycin oder 3-Aminopropylamino-bleomycin. Ferner lieferte eine Verbindung mit einer Polyamin-Kette, wie N,N-Bis(3-aminopropyl)-methylamin, hauptsächlich das neue 3-(N-Methyl-N-3-aminopropyl)-aminopropylamino-bleomycin, das die der zugegebenen Verbindung entsprechende Seitenkette besitzt. Außerdem entsteht jedoch aus einem Amin mit niedrigerem Molekulargewicht, welches sich aus dem erwähnten Additiv während der Züchtung gebildet hatte, 3-N-Methylaminopropylamino-bleomycin als Nebenprodukt.

Daß Mikroorganismen unter Umständen die Fähigkeiten der Esterspaltung, der Dealkylierung und der Decarboxylierung besitzen, ist bekannt. Es sind daher auch Aminoverbindungen, welche sich während des Kulturverfahrens in die Amine der Bleomycin-Seitenkette umwandeln, in die vorliegende Erfindung einbezogen, wie die Aminoverbindungen, in welchen Wasserstoff der Methylengruppe in der 2-Stellung von -NH₂ durch eine Carboxylgruppe oder eine Säureamidgruppe ersetzt worden ist, und welche im Stoffwechsel leicht zu Aminen umgesetzt werden.

Im allgemeinen werden die Aminoverbindungen als solche, oder in Form ihrer anorganischen Salze verwendet, jedoch variieren die Konzentrationen derselben in dem Kulturmedium in Abhängigkeit von ihrer Konstitution. Beispielsweise wird im Fall von 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid, Spermin und Spermidin eine Konzentration von zumindest 0,2 bis 9,4 mg/ml benötigt, wohingegen im Fall von 3-Amino-3-carboxypropyl-dimethylsulfoniumchlorid eine Konzentration in Höhe von zumindtst 40 mg/ml erforderlich ist. Ferner ist im Fall von N-(3-Aminopropyl)-morpholin und N-(3-MorphoIinopropy!)-l,3-diaminopropan eine Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 mg/ml ausreichend, wohingegen im Fall von N-(2-Aminoäthyl)-piperazin und N-(3-Methcxypropyl)-1,3-diaminopropan eine Konzentration von etwa 2 mg/ml notwendig ist. Im allgemeinen jedoch ist eine Konzentration von etwa mg/ml adäquat.

Bei der praktischen Ausführung des vorliegenden Verfahrens wird es bevorzugt, ein Medium zu verwenden, welches hauptsächlich aus Kohlenhydrate- und Stickstoff-enthaltenden organischen Substanzen, wie z. B. Hirse-Gallerte, Glucose, Stärke, Sojabohnen-

pulver, kurn-liinweiclnvasscr, besieht, um! das μιτιιιμι.· Mengen an anorganischen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphosphai. Kupiersulfat, Zinksiillat, Natriumchlorid, Nitrate, enthält. In diesem Medium wird Sireplomyces verticillus oder ein Blcomycm-er/eugeiider Stamm von im Wachstum abweichenden Tochter kolonien aerobisch gemäß den üblichen Arbeitsvertah rcn gezüchtet. Danach wird die Kulturfliissigkeit filtriert und das Filtrat an beispielsweise einem Kalionenausiau· schcr-Harz mit reaktiven Carboxylgruppen adsorbiert und anschließend mit wäßriger Salzsäure-Lösung eluiert. Nachfolgend wird das Eluat hintereinander den Stufen der Adsorption an Aktivkohle, Elution mit wäßriger Aceton/ChlorwasserstoffsäureLösung, Tonerde-Adsorption, Methanol-Elution, Adsorption (beispielsweise an im Handel befindliche, vernetzte Polysaccharide auf Dextran-Basis) und Elution mit destilliertem Wasser unterworfen, wodurch man ein Bleomycinhydrochlorid-Pulver erhält. Für eine weitere Reinigung des so erhaltenen Pulvers wird eine chromatographische Elution mit Ammoniumchloridoder wässeriger Ammoniumformiat-Lösung, unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppen als Träger bevorzugt angewandt. Schließlich wird das Eluat an Aktivkohle adsorbiert und den Stufen der Wasserwäsche und der Elution mit wässeriger Aceton/Chlorwasserstoffsäure-Lösung unterworfen, wodurch man eine reine Bleomycin-Komponente erhalten kann.

Wenn gemäß der vorliegenden Erfindung eine Bleomycin-Komponente in ausreichendem Maße selektiv in dem Kulturmedium erzeugt wurde, kann die Stufe der Abtrennung unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppen auch wegfallen.

Bleomycine haben die Eigenschaft, mit Kupfer Chelate zu bilden und werden aus der Kulturflüssigkeit als blaues Pulver erhalten, jedoch kann das Kupfer mittels Durchführung einer Behandlung zur Kupferentfernung in irgendeiner der Extraktions- oder Reinigungsstufen entfernt werden.

Von den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Bleomycinen haben sich diejenigen als besonders wirksam herausgestellt, die gekennzeichnet sind durch UV-Absorptionsmaxima bei 244 nm und bei 290 bis 295 nm und durch eine Partialstruktur gemäß folgender allgemeiner Formel

CO-R

-NH-CH-CO-NH-(CH₂J₂-_{Λ s}

CHOH

CH₃
in der R bedeutet:

(a) -NH-(CH₂J₃-NH-CH₃

(b) -NH-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH-Ch₃

OH

(C) — NH-(CH₂J₃-N^J

(d) -NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-OCH₁

15

IeI NIi K Ή.,)., Nil

IΠ Nil ICIU₁ Nil (Il

(Ή,

Ιμ) Nil (CIK)₁ N (CIUl, CH₁

NIl-

ihl NH ICIL)₁ NH ICH;,)., N

Ii) NH (('11,I₁ Nil {CW,), N

Ij) Nil- (CII₂), NH (CH_:|_,-- N

(Ή,

(k) NIl-- (CH₂), - Nil -(CH,).,-NlT thing erhaltenen Hleuinvvine werden in der Tabelle II ge/eigl. Alle in der Tabelle 11 aufgeführten Verfahren sproduk'.e (Bleomycine) wurden als Cu ('heiatc erhalten und weisen Ultraviolett Absorptionsmaxima b.'i 24i Ins > 244 und bei 24 J bis 244 mn auf.

Das lnfrarol-Absoiptionsspeklrum und das Uliravio lelt-Absorptionsspeklrum v.ni mehreren Verbindungen in Tabelle Il werden in den I·" i g. I bis I'ig. b wie folg! ge/eigl:

Spek- Name der \ 'crhiiulung ^

Hum Ni.

IK 3-|3-(N-Butyl)-aminopropyl|- 28 aminopropylamino-bleomyein

LIV 3-|3-(N-Butyl)-aminopmpyll- 2S aminopmpylaniino-bleoinyein

IR 3-( l-Methyl-3-aminopiOpyD- 32 am inop ropy la mino-bleom vein

L)V 3-(l-Methyl-3-aminopropyD- 32 aminopropylamino-blconiyein

IK 3-(3-CyelohexylaminopropyD- 2^l> aminopropylamino-blconiyein

UV 3-(3-Cyelohexylaminopropyl)- 2'' aminopropylamino-bleomycin

Die Verbindungen 1, 6, 24 bis 26 und 31 bis 36 der

Mehrere Eigenschaften sowie die Ergebnisse der _w Tabelle Il geben eine positive Ninhydrin-Reaktion, und Elementaranalyse der gemäß der vorliegenden Erfin- die Verbindung 40 eine positive Sakaguchi-Reaktion.

Tabelle!!

Zuge- Verlalirciispiodukl lvv\. Sti ukluilnimel des sct/lc cinuclülirlcn Restes R Λ mi π ο-vcrb.

1 NH (CH₂I, NlI₂

CII,

2 Nil -(CH,),N

■ ■ \

Vn.,

C₂H₅

3 -NH-(CH₂I₂N'

leine- Hiiienseliallen der Verfahrciisprodukle

slelll

nach Hlemciitaranalyse ('\,| Wirk- Chromiilo-

Hei- sam- graphic

keil**) (Ri-Wcrl)***)

Dünn- Papier C HN S (meg mg) schicht

43.12 6.15 16.Ml 4,21 1700 0.62 O.SO

43.20 6,25 16.48 4.13 S^l)7 0.46 0.86

45.01 6.35 16,14 3.91 1102 Ü.4X 0.S^l)

Nil (CH₂), - Nil CIl, -ClI -ClI., C)H

- Nil	-(C	'H₂):	-N	2	C	NH
Nil	(C	'H₂),	-NH
				^Xc	Ή.1
Nil	(C	II,),	N	C
					Ή,
				:H₅
NH	(C	Ή,),	- N

43.50 6,45 16.38 4.35 1020 0.65 0.84

44.38 6.30 16,78 3.95 799 0.36 0.85

43.15 6.20 16.51 4.18 1934 0.60 0.81

44.16 6.35 16.30 4.09 869 0.28 0.83

43.91 6.30 15.96 4.00 1036 0.40 0.87

C₁U,

\ nun.

17

\ ,1 !.,MU'Mn|1| ι ultlk I lv\\ M I 11 k I 111 I, .HI'Vllllll k Il lii--.li s K

πι,. Ι ,1.-

Nil K ll.l, Nil ( II,

Nil K ll.i. Nil |( 11,1: oil

Nil |i ll,|, Nil K 11,1, OUl,

Nil |( HjI, Nil C₁II.,

Nil IUl₂I, Nil

MJ ICJI₂), NH ((J₂

15 Nil KH₂I, Nil Ul

ClI,

16 Nil (CIIiI., Nil ((H₂I, N ~

17 Nil (CH₂I, Nil (UI₂I, N

IS Nil IUI₂I, Nil KII₂I, N

19 NH (Ul₂), NH CH, ^/'_o-

20 NH IUI₂), N j

21 Nil (UI₂I, N

22 Nil (UI₂I, N

23 NH (Ul₂), N Nil

24 Nil ((H₂), N N KII₂I, NII₂

25 Nil CHi (Il NII₂

I II,

26 Bleomycin A₂

NII (( H₂I, Nil [(W₁)?, N

CII,

ClI,

Nil (CII,), Nil (ClI,), Nil C₄II., Nil KII,), NH ((H₂I, NII

Nil K H₂I, Nil (CU,), Nil (Il

ClI, Nil K 11,1, N (( ll,|, NII₂

Ul₁ NII 1(11,1, Nil (Il ((H₂I₂ NII,

IS

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2 44.10 6.51 16.62 4.00 .15SO 0.14 O.SS

2 44.52 6.10 16.20 .1.S9 1201 (UX 0.S7

2 46..V) 6.." I6.4S 4.15 1450 0.67 0.X.1

2 44.90 6.22 16.20 4.12 1066 0.16 O.SS

2 44.71 6..1S 16.17 4.21 1257 0.14 0.S6

2 44..16 6,25 16,15 -1.0.1 592 0.65 0.S.1

2 44,91 6.21 16.50 .1.91 726 0.30 0.X4

2 44.01 6.14 17.52 190 11.10 (1.25 0.S6

2 41X0 6.04 16.60 4.31 2173 0.66 0.SI

3 43.93 6.02 I6.7S 4.25 1232 0.66 0.Xl 2 43.SO 6.35 16.91 4.05 1200 0,14 0.S3

2 43.00 6.62 16.40 3.7X 5S4O 0,23 0,X4

2 44.02 6.63 I6.4X 4.02 11215 0.24 0.Xl)

2 45.51 6,42 16.45 3.20 2500 0.46 0.75

2 43.20 6.20 17.00 4.09 1671 0.23 0,3.1

2 4.1.42 6.25 I6.X0 4.11 IS20 0.32 0.S4

20

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			N
V)	Ml (I	IK)₁	(I	ClI,
				cn,
411	Bleomycin	H:
41	Bleomycin	Λ,
42	Bleomvcin	Λ,

/1.4.1 16.21) 4.25 I.VJ4 0.41 0.72

43.S5 6.25 16.N0 4.2S S47 0.40 0.70

44.71 6.41 16.21 4.00 633 0.3S 0.N¹J

43.92 (Ul 17.41 3.34 3094 0.72 0.66

44.13 6.14 15,51 6.43 941 0.39 0,X5

44,13 6.14 15.51 6.43 941 0.39 0.S5

Anmerkungen /u Iabelle II:

*l Die De/iHerung entspricht derjenigen von Tabelle I.

♦*l Die Wirksamkeit winde gcmiil.i der biologischen Prüfung unter Verwendung von kupferfreiem IMeomycin Λ,-Ι lydrochlorid (Wirksamkeit 940 meg mg) als Slandaid-Siibslan/. und M. tuberculosis 607 als Tesl-Mikroornanismus ueme.ssen." Die Prül'melhodik ist in US-1'haimacopeia. 19. Ausgabe. Seiten 5¹Jh bis 600 (1¹J75) beschrieben. ♦♦·) Du'nnschicht-Chromatogruphie:
Adsorbierendes Mittel = Silicagel
Lösungsmillel = H): ¹J: I-Mischung von Melhanol-10%

/\mnii>niumacetat-l()"'o wässerige Ammoniaklosung. Papierchromatographie:
Lösungsmittel = IO"»ige wässerige AmmoniuiiKhlorid-L.ösung.

Wie aus der Tabelle Il klar hervorgeht, sind die neuen gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Bleomycine den bekannten Bleomycin-Komponemen im Aussehen und in der UV-Absorptionskurve ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich offensichtlich von diesen in der Wirksamkeit (mcg/mg) und den R[-Werten. Ferner muß noch erwähnt werden, daß man nach Hydrolyse der neuen Verbindungen mit starken Säuren die Amino-Verbindungen, welche als Additive für die Kultur verwendet wurden, oder die Aminoverbindungen, welche während des Kulturverfahrens gebildet wurden, bei der gaschromatographischen Untersuchung der Hydrolysate findet. Auch dies beweist, daß die neuen Bieomycine Seitenketten besitzen, welche den zugesetzten Aminoverbindungen oder den während des Kulturverfahrens gebildeten Verbindungen entsprechen.

Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde es erstmals möglich, diejenigen Bleomycin-Komso ponenten, welche für individuelle therapeutische Zwekke geeignet sind, selektiv in hohen Ausbeuten und in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise können die Bieomycine A2 und A₅, welche in ihren Antitumor-Eigenschaften von starker Wirkung sind und eine geringe Toxizität aufweisen, selektiv erhalten werden. Ferner wurde es möglich, als neues. Bleomycin 3-Aminopropylamino-bleomycin (Tabelle II, Verbindung Nr. 6) zu erhalten, das ausgezeichnet in seiner Wirkung ist und eine niedrige Toxizität aufweist.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. In den Beispielen 1 bis 4 wurde jeweils das in der nachstehenden Tabelle 111 beschriebene Nährmedium verwendet. Dem Nährmedium wurden, sofern anderslautende Angaben nicht

6s gemacht werden, die jeweiligen, dem Rest R entsprechenden Aminoverbindungen mit endständiger H2N-Gruppe zugegeben.

Tabelle III

Zusammensetzung des Nährmediums

Komponente	Beispiel !	15	-	0,5	-	ίο	-	2,0	6,	(%)	5	Beispiel 2	I	15	-	0,5	-	K)	-	10	6.	(%)	Beispiel 3	-	1,2	-	6,5	(%)	Beispiel 4
	(5 I)*)	5	0,5	6,4	(5 I)*)		5	0,5	6,4	(12 I)*)	24	6,4
		2,5	0,5	Gesamtmenge	2,5	0,5		2,4	0,5
		3,5	(B)	3,5		1,2	3,5	(%)
Ilirsc-Gallcrtc	Gesamtmenge	-	320	-	Gesamtmenge	24	-	-
Glucose	(B)	0,75	25	0,75	(g)	0,75	-
Sojabohnenpulvcr	320	-	175	-	768	-	4,0
Sojabohncnöl	25	0,3	-	0,3	60	0,3	1,0
Korn-liinwcichwasser	175	0,1	37,5	0,1	420	0,1	-
1 Icl'ccxtrukt	-	0,05	-	0,05	-	0,05	1,0
NaCl	37,5	-	-	90	-	0,3
K₂HPO₄	-	0,01	0,01	-	0,01	-
ZnSO₄ · 7H₂O	-	-	36	-	0,0002
FcSO₄ · 7 11,0	0,2	0,2	12	0,2	0,0001
CuSO₄ · 511,0	0,01	0,01	6	0,02	0,0007
MnCi₂ · 4H₂O	-	-	0,01	0,0008
NaNO₃	0,4 mg/ml	2 mg/ml	2 mg/ml	-
Oberflächenaktives Mittel			-
Silicon	-
Am in	0,5 mg/m
pll-Wcrt	7.0

*) Gesamtmenge des Nührmeiliums.

Beispiel 1

Zu einem Medium mit der oben ungegebenen Zusammensetzung wurde 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid-hydrobromid (Tabelle I, Aminoverbindung Nr. 41) in einer Menge von 0,4 mg/ml zugegeben und der pH-Wert des Mediums so auf ö,5 eingestellt, jeweils 100 ml des so behandelten Mediums wurden für sich in eine Sakaguchi-Flaschc eingefüllt und dann sterilisiert. Anschließend wurde Streptomyccs vcrticillus ATCC 15003 in das Medium geimpft und bei 27° C 8 Tage lang unter Rühren mit 130UpM gezüchtet. Danach wurden die Kulturflüssigkeiten (4,5 I) gesammelt und filtriert, wobei man 3,0 1 Filtrat (Wirksamkeit 138,8 mg/ml, Gesamtwirksamkeit 416,4 mg) erhielt. Dieses Kulturfiltrat wurde auf eine, mit 200 ml eines Ionenaustauscher-Harzes (Il-Typ) beschickte Säule aufgegeben und adsorbier!, mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n-ChlorwassLTstoffsüure eluicrt. 1,0 I des Fluates wurden neutralisiert, auf eine mit 100 ml Aktivkohle beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mil Wasser gewaschen und anschließend unter Verwendung einer 1 : I (Volum-Aiiteile)-Miselnmg von Acclon/0,02 n-wiisseriger Chlorwasserstoffsüure-Lösung eluicrt und die gegenüber Myeobaktenum tuberculosis 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in 5 ml einer K()"/oigen, wässerigen Methanol-Lösung gelöst und auf eine mit M) ml neutralem Aluminiumoxid beschickte Säule aufgegeben, ti ml anschließend mit einer H()%igen, wässerigen imMlianolischen Lösung eliiierl, Anschließend wurden die Uleomyciii-enlhaltenden Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt, wobei man 19^r> mg Bleomyeiii-hydiOehlond (Wirksamkeit 650,7 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 127 mg) erhielt. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 30,5%.

Das so erhaltene Produkt wurde mit wässerigei Ammoniumformiat-Lösung an einer Säule, die mi' einem vernetzten Polysaccharid mit Carboxymethyl gruppen beschickt war, in die einzelnen Bleomycin Komponenten aufgetrennt. Es wurde festgestellt, daf. das Produkt 72,2% Bleomycin A₂ enthielt. Diese: Trennverfahren wird in den folgenden Beispielen al: Polysaccharid-Verfahren bezeichnet.

•ts In der gleichen Weise wie oben wurden weiten Versuche durchgeführt, wobei die in der Tabelle IN genannten Aminoverbindungen verwendet wurden. Dii angewandten Bedingungen und die erhaltenen Resulta te sind ebenfalls aus Tabelle IV zu ersehen.

B e i s ρ i e I 2

Zu einem Medium mit der oben angegebene: Zusammensetzung wurde 1,2-Diaminopropan (Tabel lc I, Verbindung 25) in einer Menge von 2 mg/m ss zugegeben, und der pH-Wert des Mediums so auf 6, eingestellt. Jeweils 100 ml des so behandelten Medium wurden für sich in eine Sakaguchi-Flaschc eingefüllt uni anschließend sterilisiert. Danach wurde Strcplomycc veiticilliis ATCC 15003 in das Medium eingeimpft un bei 27"C 192 Stunden unter Rühren bei 130UpN kultiviert. Danach wurden die Kulturflüssigkciten (4,5 gesammelt und filtriert, wobei man 3,5b I eines Filtral (Wirksamkeit I¹K) mcg/ml, Gesamtwirksamke 676,4 mg) erhielt. Dieses Kulturfiltrat wurde auf eim mit 200 ml eines Ionenaustauscher-Harzes (Il-Forn beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wassi gewaschen und anschließend unter Verwendung cini I : !(Volum-Teile)-Misehimg von Accton/0,02 n-wässi

riger Chlorwasscrstoffsäure-Lösung cluicrt und die gegen Mycobakterium tuberculosis 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in 4 ml einer 80%igen wäßrigen Methanol-Lösung gelöst und auf eine mit 70 ml neutralem Aluminiumoxid beschickte Säule aufgegeben, gefolgt von einer Elution mit 80%iger wäßriger methanolischer Lösung. Anschließend wurden die Bleomycin-enlhaltenden Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 2 ml Wasser gelöst, auf eine mit 20 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids beschickte Säule aufgegeben und anschließend unter Verwendung von destilliertem Wasser eluiert.

Die erhaltene bläulichgrüne Bleomycin-enthaltende Fraktion wurde in einer 0,02 η-wäßrigen Ammoniumchlorid-Lösung suspendiert, auf eine mit 20 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppen beschickte Säule aufgegeben und anschließend mit einer 0,1 molaren wässerigen Ammoniumchlorid-Lösung eluiert.

Danach wurde die erhaltene Fraktion, welche die gewünschte Substanz enthielt, aufgenommen und auf eine mit 5 ml Aktivkohle beschickte Säule zur Adsorption der gewünschten Substanz aufgegeben, welche dann mit einer I : 1-Mischung von Accton/wässeriger 0,02 n-Chlorwasserstoff-Lösung eluiert wurde. Anschließend wurde das Eluat zur Trockene eingeengt und man erhielt 35 mg 2-Aininopropylamino-bleomycin (Wirksamkeit 2173meg/mg, Gesamtwirksamkeit 76,1 mg). Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 11,25%.

25 mg der so erhaltenen Substanz wurde in 1 ml Methanol gelöst und 10 Minuten lang Schwcfelwasscrstoffgas in die Lösung eingeleitet. Danach wurde die Lösung filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt, wobei man 20 mg eines kupferfreien 2-Aminopropylamino-bleomycin-hydroehlorids (Wirksamkeit

2000 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 40 mg) erhielt. Dieses kupferfreic Produkt wurde mit einer 6 n-wässcrigen Chlorwasserstoffsäure-Lösung hydrolysiert und anschließend bei einem pH-Wert von 1,9 und einer Spannung von 3000 Volt der Papicrclcktrophorcsc unterworfen, wobei 1,2-Diaminopropan gefunden wurde.

In der gleichen Weise wie oben wurden weitere Versuche durchgeführt, wobei die in der Tabelle IV aufgeführten Aminoverbindungen verwendet wurden. Die angewandten Bedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls aus Tabelle IV zu ersehen.

B e i s ρ i e 1 3

Zu einem Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurde 1,3-Diaminopropan (Tabelle I, Verbindung Nr. 6) in einer Menge von 2 mg/ml zugegeben und der pH-Wert des Mediums so auf 6,5 eingestellt. 12 1 des so behandelten Mediums wurden in einen 20-l-Glas-Fermcntor eingefüllt und sterilisiert. In dieses Medium wurden 800ml einer Kulturflüssigkeit von Streplomyces verticillus ATCX' ΙΓ>003 eingeimpft, welche 48 Stunden einer Schüttelkultiviemng in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie oben erwähn!, unterworfen gewesen war. Es wurde hei 27"C unter Rühren mit 350 bis 370 UpM 120 Stunden lang kultiviert, wobei pro Minute ein dem Volumen des Mediums gleiches Volumen l.ufl eingeführt wurde. 7,7 I der KulUiiTlüssigkcit wurden filtriert und das l'iltral (5,b I, Wirksamkeil 148,5 mcg/ml, Gcsamtwirksamkeil 831,6 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie ir Beispiel 1 gereinigt, wobei man 230 mg Bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 734,8 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 169 mg) erhielt. Die Ausbeute aus derr s Kulturfiltrat betrug 20,3%. Dieses Hydrochlorid wurde nach dem Polysaccharid-Verfahren analysiert unc gefunden, daß es 84,5% 3-Aminopropylamino-bleomyein enthielt. 200 mg des Hydrochlorids wurden in 10 m destilliertem Wasser gelöst, die Lösung auf eine mii

ίο einem vernetzten Polysaccharid mit Carboxymethylgruppen, suspendiert in 0,02 η-wässerigem Ammoniumformiat, beschickte Säule von 50 ml Volumen aufgegeben, entwickelt und mit 0,1 η-wässeriger Ammoniumformiat-Lösung eluiert, wobei man eine Fraktion erhielt

ι s welche 3-Amino-propylamino-bleomycin enthielt. Diese Fraktion wurde auf eine, mit 10 ml Aktivkohle beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wassci gewaschen und anschließend mittels Aceton/0,02 n-wässeriger Salzsäure-Lösung (1:1 im Volumen) eluiert Anschließend wurde die erhaltene aktive Eluat-Fraktior zur Trockene eingeengt und man erhielt 50 mg 3-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 1934 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 96,7 mg) Die Ausbeute aus dem vorerwähnten Hydrochloric

2s betrug 65,8%. Diese Substanz wurde mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert, zu einer 10%igen alkalischer Lösung umgesetzt und anschließend der Gaschromatographie unterworfen, wobei ein Maximum von 1,3-Diaminopropan gefunden wurde.

ίο 30 mg des so erhaltenen 3-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit 1934 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 58,02 mg) wurde in 5 ml Methano¹ gelöst und Schwefclwasserstoffgas 30 Minuten lang ir die Lösung eingeleitet, wobei ein Niederschlag vor

is Kupfersulfid ausfiel. Dieser Niederschlag wurde durcli Filtration abgetrennt und mit Methanol gewaschen Danach wurde die Waschflüssigkeit und das Filtral vereinigt und die Mischung zur Trockene eingeengt wobei man 25 mg eines kupferfreien 3-Aminopropyl-

^o amino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeil

1850 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 46,35 mg) erhielt Die Ausbeute aus der kupferenthaltenden Substan? betrug 79,7%.

20 mg dieses kupferfreien 3-Aminopropylamino-

4.S bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit 1850 mcg/mg CcLiMTitwirksamkcit 37 mg) wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst, auf eine mit 5 ml eines Anionenaustauscher-Harzcs beschickte Säule aufgegeben, anschließend mit destilliertem Wasser cluicrt und das Eluat zui

so Trockene eingeengt, wobei man 15,5 mg eines kupferfreien 3-Aminopropyliimin()-ble(>myein-siilfiits (Wirk samkeit 1850 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 28,68 mg] erhielt. Die Ausbeute aus dem kupferfreien I lydrochlorid betrug 77,5%.

ss In gleicher Weise wie vorstehend wurden weiten Versuche in einem Glas-Fermcntor unter Verwendung der in Tabelle IV angegebenen Aminoverbindungen durchgeführt. Die angewandten Bedingungen und dk erzielten Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle IV

(«ι niedergelegt.

B e i s ρ i e I 4

Ein Medium mil der oben angegebenen Ziisaiiimen-

<>s selzting wurde auf einen pll-Werl von 7,0 eingestellt leweils 120 ml dieses Mediums wurden getrennt in eine 500-mlSiikaguchi-Flasche eingefüllt und anschließend sterilisiert. In das Medium wurde ein MA 267-Ap

Stamm, isoliert im Jahre 1965 aus dem Boden von Musashino-cho, Saitama-ken, Japan, eingeimpft, welcher als eine Variante von Streptomyces verticillus ATCC 21678 identifiziert worden war und der spezifisch Bleomycin A5 erzeugt. Ferner wurde Spermidin (Tabelle I, Verbindung Nr. 33, als Phosphat), welches einer sterilisierenden Behandlung mit einem dünnen, hochporösen Membranfilter unterworfen worden war, in einer Menge von 0,5 mg/ml zugegeben, und der Stamm 7 Tage lang bei 27°C unter Rühren bei 130UpM kultiviert. 5,2 I der Kulturflüssigkeit wurden gesammelt, filtriert, das Filtrat (4,5 1, Wirksamkeit 196 mcg/ml, Gesamtwirksamkeit 253 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 137 mg eines rohen Pulvers von Bleomycin Anhydrochlorid (Wirksamkeit 1846mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 253 mg) erhielt. Die Ausbeute aus der Kulturflüssigkeit betrug 28,8%. Dieses rohe Pulver wurde der Chromatographie unter Verwendung einer mit 25 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids beschickten Säule unterworfen und mit destilliertem Wasser eluiert. Die erhaltenen, blaugefärbten, aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene eingeengt, wobei 53,5 mg eines blauen Pulvers (Wirksamkeit 2613mcg/nig, Gesamtwirksamkeit 140 mg] erhalten und nur Bleomycin A3 allein erzeugt wurde. Die Ausbeute aus dem rohen Pulver betrug 55,4%. Die Extinktion (E ]"."„, ) bei 293 ηm des so erhaltener Produktes betrug 116. Das Spermidin der Seitenkette wurde gefunden, wenn ein Hydrolysat des Produkte! mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure gaschromatographiscr untersucht wurde.

Tabelle	IV	Züch-	Filtrat-	Wirksam	Gesaml-	Gehall an	Ge	Wirksam	Gesamt	Ausbeute	Her
Zuge	Konzen	lungs-	menge	keit	wirksam-	isolierter	wicht	keil	wirksam	aus	gestellt
setzte	tration	/.eit			keit	Bleomydn-			keit	Kultur-	nach
Amino	an					llaupt-				tlltrat	Beispiel
verbin	Amino-					kompo-					Nr.
dung	vcrbin-					nente¹)
Nr.¹)	dung	(Std.)	(Liter)	(meg/ing)	(mg)	(%)	(mg)	(meg/mg)	(mg)	(%)
	(mg/ml)	192	3,0	150.0	450,0	80	28,7	1700	488	10,8	2
1	4,0	24Ü	2,98	154,0	458,9	91	!40	897	125,6	27,4	2
2	3,0	240	2,98	154,0	458,9	84	140	1102	154,3	33,6	2
3	2,0	240	3,00	140,0	420,0	95	88	1020	898,0	21,4	2
4	0,6	288	3,12	111,0	346,0	87	75,0	799	59,9	17,3	2
5	2,0	120	5,6	148,5	831,6	85	230	73	169	20,3	3
6	2,0	240	3,04	154,8	470,6	95	127,0	86	110,4	23,5	2
7	2,0	240	2,84	181,3	514,9	95	230	1036	238,3	46,3	2
8	2,0	264	3,10	129,8	402,4	81	119,0	860	102,3	25,4	2
9	1,5	264	3,02	227,4	186,7	85	166,1	1300	215,9	31,4	2
H)²)	0,7	288	3,10	282,5	875,8	88	336,0	1335	448,6	51,2	2
II·¹)	1,35	264	3,40	525,0	1785,0	85	214,7	1700	365,0	20,4	2
12	4,0	264	3,38	1354,0	4576,5	89	330,0	5355	1767,2	38,6	2
13	0,5	264	3,00	334,0	1182,0	70	40,0	1986	79,4	7,9	2
14	0,5	288	3,39	606,0	2054,3	89	96,3	2400	231	11,2	2
15	0,5	264	3,08	465,6	1434,0	76	105,0	2564	269,2	18,8	2
K)	1,0	264	3,10	543,5	1684,9	89	140,0	3580	501,2	29,7	2
17	0,5	264	2,94	139,0	408,7	79	70,0	1201	84,1	20,6	2
18	0,5	240	3,00	380,0	1 140	42	86	1450	124,7	10,9	_)
19	3,0	288	3,30	281,0	927,3	95	355,0	1066	378,4	40,8	2
20	1,0	288	3,00	317,0	931,0	98	320,0	1257	402,2	42,3	■>
21	1,0	240	2,94	145,8	428,7	KH)	175,0	5922	103,6	24,2	2
■))	0,1	240	2,98	123,1	366,8	81)	103	726	74,8	20,4	7
23	0,6	240	3,69	225,0	860,.!	95	210,6	1180	248,5	29,9	t
24	0,5	192	3,56	19()	676,4	90	35	2173	76,1	11,25	7
25	2,0	120	4,9	140,0	6X6,0	85	/1,8	1232	88,5	12,9	3
20	2,0	264	3,34	253,9	K48,O	85	162,5	1280	195	23,0	2
27	1,0	240	3,12	113,4	353,8	96	150	5840	8/6,0	24,8	)
2 X	2,0	264	3,10	1600J,)	496(1,0	90	178,01	1215	1996,3	40,3	1
2')	0,5	240	3,05	1020	3111	/.'	.'40	25110	600,0	19,3	2
30	3,0	264	3,54	133.7	473,3	/2')	32,(1	16/1	53,5	11,4	)
31	(1,5						24.(1	8(.()	20.6	4.4

l'ortset/unu	Konzen	Ziieh-	Fillral-	Wirksam	Gesamt·	Ciehalt an	Ge	Wirksam	Gesamt	Ausbeute	Her
Zuge	tration	tungs-	nienge	keit	Wirksam	isolierter	wicht	keit	wirksam	UUS	gestellt
setzte	■ iin	zc it			keit	Bleomyein-			keit	Kultur-	nach
Amino-	Ληιίηο-					lluupt-				Il I trat	Beispiel
verbin	verbin-					kompo-					Nr.
dung	dung					nente')
Nr.¹)	(mg/ml)	(Stil.)	(Liter)	(nicg/mg)	(mg)	(%)	(mg)	(mtg/mg)	(mg)	(%)
	1,0	264	3,20	331,0	1059,2	70	112,6	1820	205	19,4	2
η	0,4	163	5,0	122,2	611,0	>90	44,7	2543	113,7	18,6	3
33	0,5	168	4,5	196	253	>90	137	1846	253	28,8	4
33⁴)	0,2	264	1,1	150,0	165,0	90,8	62	1200	74,4	45,1	1
34	2,0	288	2,77	292,4	809,9	56	10,8	2546	27,5	3,4	2
35	2,0	264	3,05	320,4	977,2	68	33,3	2670	89,0	9,1	2
36	2,0	240	3,08	170,9	526,4	73	130	1394	181,2	34,4	2
37	1,0	240	2,88	189,6	493,0	93	74	847	62,7	12,7	2
38²)	1,0	288	3,20	118,0	377,6	95	124,0	633	78,5	20,8	2
39	2,0	240	2,0	200,0	400,0	76,2	164	800,0	131,2	32,8	1
40-')	0,4	192	3,0	138,8	416,4	72,2	195	650,7	127,0	30,5	I
41	40,0	192	1,65	100,0	165,0	87,2	140	300,0	42,0	25,5	1
42

AnmerKung zu Tabelle IV:

') Die Bezifferung entspricht derjenigen von Tabelle I und II. Hs werden die gleichen Verfahrensprodukte wie in Tabelle Il erhallen.

²) Als llydrochlorid zugegeben.

^!) Der Gehalt an hauptsächlich erhaltener Bleomycin-Komponente wurde in der Weise gemessen, daß das durch Züchtung und Reinigung, wie in jedem der Beispiele gezeigt, erhaltene Bleomycin (Gemisch der einzelnen Komponenten) vorher unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharide mit Car'aoxymethylgruppen getrennt und anschließend das UV-Absorptionsspektrum photometrisch bestimmt wurde.

\) Als Phosphat zugegeben.

^J) Hier wurde ferner noch B-N-Methylaminopropylamino-blcomycin gebildet.

Die folgenden Vergleichsversuche dienten zur Feststellung der Wirksamkeit sowohl der erfindungsgemäßen Bleomycine als auch von handelsüblichem Bleomycin, d. h. einem Komplex aus im wesentlichen Bleomycin A2 als Hauptkomponente und Bleomycin A2', A<-„ B2 usw. Für die Feststellung der Wirksamkeit der Bleomycine gegen Tuniore in bestimmten Organen des menschlichen Körpers wurde die Aktivität der Bleomycine unter Verwendung der Biotest-Methode (beschrieben in »The Journal of Antibiotics«, Ser. A, Vol. XX, Seiten 15 bis 24 [1967]) sowie die Bestimmung der Aniitumor-Wirksamkeit der einzelnen Bleomycine bei Mäusen und die Vcrteilungsspezifität in dem jeweiligen Rogan festgestellt. s<>

Bei der angewandten Versuchsmethode wurden b Wochen alten Mäusen (Stamm ICR) 100 mg/kg Bleomycin subkutan injiziert und die Tiere eine Stunde später durch Blutentnahme getötet. Die einzelnen Organe wurden entnommen und unter Verwendung ss einer bei einem pH-Wert von 7,2 gepufferten physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Unter Kühlung wurden von jedem Gewebe llomogenaie hergestellt, deren Volumen das dreifache des Gewebevoliimens betrug. Die einzelnen Homogenate wurden unter <>o Kühlung mit Hilfe einer Zentrifuge (10 000 U/Min.) während 10 Minuten bei 5"C zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit für den Biotest verwendet. Der Biotest von Bleomycin wurde unter Verwendung der Dünnschiclil-Seheibenmethode durchgeführt, bei <>s der als Testorganismus Bacillus suhtilis ΚΊ-2Ι¹) verwendet wird. Nach 2slündiger Vurkultu: wurde 18 Stunden lang bei 37"C kultiviert und die jeweils festgestellte Fläche der beobachteten Wachstumshemmung gemessen.

Die erhaltenen Versuchsergebnisse sind in dci nachfolgenden Tabelle V aufgeführt. In dieser Tabelle sind für die erfindungsgemäßen Bleomycinverbindun gen 4,9,11,13,15,16,20,27 bis 29 und 31 (vgl. Tabellen I und IV) die in mcg/g erhaltenen Konzentrationen in jeweiligen Organgewebe angegeben. Als Vergleich sine in der ersten Zeile die mit Bleomycin A₂ erhaltener Werte zu finden. Wie aus der Tabelle V entnommer werden kann, ist die Konzentration im Gewebe bei dei Verglcichsverbindung sehr niedrig. Dcmgcgcnübei zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen zum T'ei erheblich höhere Konzentrationen (die jeweiligei besseren Ergebnisse sind durch Unterstreichung her vorgehoben).

Die Verbindung 27 ist zwar nach diesem Versucl nicht als überlegen zu werten, jedoch hat dies« Verbindung andererseits einen hohen therapeutische! Index (1.DVF-IXo) gegenüber Khrlieh-Ascites-Card nomzellen, wie dies aus der US-Patentschrift 38 46 401 Spalte 25, Tabelle 2, zu entnehmen ist. Während nat I dieser Tabelle eier therapeutische Index von Bleouiycii Λ.. (Verbindung Nr. I der US-l'atenischrifl), welches 1I1 llauptkomponentc des käuflichen !Neomycins darstell den Wert 12 aufweist und Bleomycin U_f (Verbinduni Nr. 3 der US-Patentschrift) nur einen Wen von lh erreicht, hat die eiTindiingsgcniäUe Verbindung 27 (dii der Verbindung Nr. 21 in der US-Palenlsehnl entspricht) einen therapeutischen Index von 54, d. I einen ca. 5ni.il so hohen therapeutischen Index.

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	(al
4	lh)
20	(C)
I I	(el)
13	(C)
15	(O

Bleomycin Λ,

Nil (CH,!, Nil (II,

Nil [CU,)_{ Ν

K 611

.1 17

IO 0.3 0

4.2 O

Nil (CH,)., Nil (CH₂), OCH₁ 1335 6,4 111

NH (CH₂I, Nil CIl, (Il CII, 1020 14 113 15 6.3 (I

Oll

Nil {CW,), Nil Ν_χ
Nil [CW₂), Nil Cl

5355

2.6 0

(I

1.0

1(166 15 40 40 6.5 1.0 4.1

W) 7.0 2.0 0

24 I OS 3.1 10.4 0 3.S

5.0 0

1,2

31 (iO NH (CH₂I₁ N [CW,), Nil, 1671 14 25

CII₁

CII,

27 (h) - Nil (CH,), Nil (CH,), N 1200 035 03

\ CW,

16 (i) Nil (CH₂), Nil (CH₂), -N ] 2564 0,3 0,4 0.1 0.5 0

2K (j) -Nil-(CH₂), NII-(Cn,),-NII C₄II₁, 5840 0.1 24 8.4 0 03 0 0

29 (k) -NH-(CHj)₁-NH-(CH₂)J-NHK ^ 11215 5,6 30 9.6 3,2 1,7 1,0 0,9

Ausgehend von dem Erfahrungswissen, daß je höher lassen die Versuchsergebnisse erkennen, daß die mi

die Konzentration des aktiven Bleomycins in einem Hilfe des anmeldungsgemäßen Verfahrens erhaltene!

Organ ist, eine um so höhere therapeutische Wirksam- 45 Bleomycine im Vergleich zu_rhandelsüblichem Bleomy

keil gegen ein Tumorwachstuni in einem Organ vorliegt, ein eine überraschend verbesserte Wirksamkeit zeigen.

Hierzu 6 BUiH Zeichnungen

Claims

:0 06 446 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Hersteilung von Hleomycin-Aniibiotika durch Beimpfen eines Nahrmediums mit einem Bleomycin-erzeugenden Stamm von Streptoniyces verticillus und Züchten dieses Stammes unier aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium ein Amin der allgemeinen Formel

R¹

IUN CH, X N

in der X. R¹, R² folgende Bedeulunu haben:

X= CIU -■

R¹ = R² = ff, CH,, C₂H₅

R¹ = U, R² = -CU, ΠI C¹H,

OH
X = CH₂ CH,

R¹ , R- = - (ClU),- Nil (ClU)₂

R¹ = R² = H, CH.,, C₂H₅

R' = II. R- = CHv-CFU-CH₂- CH₂OFI

-CFU -CFU - C IU-OCFI., C₄H₉, C-C₁JI₁₁

CFI.,

-(CH₂J₃-N

-(CH₂J₃-N O

-CH₂-y
R' + R2 = -(CH₂J₄-, -(CH₂J₅-

-(CH₂J₂-O-(CH₂J₂-

-(CH₂J₂-NH-(CH₂J₂-

-(CH₂J₂-N-(CH₂J₂-

(CH₂J₃
NH₂

— ^, rl

CH₃
R¹ = R² = H

X (II, (IU (M,

R¹ R' Il

X ICH₂I₂ Nil K 11,I₁

R' R CII,

R¹ II. R-' C₄Il,,. C-C_nII₁₁

(Ή

CH,
X (CH₂I₂ N ICH₂),

CW,

R¹ -:- R-¹ Il
X ICH₂I₂ NH CW ICH₂I₂

CW,

R¹ = R-' - II
X ICH₂I₂ NH-(CFU)₄

R¹ - H. R^: = Ii. - (CFI₂), NII₂ CH₂

^{χ =} ~Ο"

R' = R² = FI

X = ~<f V CFU

R' = R² = FI

oder

4-Aminomethylpiperidin,

4-(2-Aminoäthyl)-imidazol, 3-A:ninopropyltrimethylammoniumchlorid, N-(4-Aminobutyl)-guanidin, 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromidoder S-Amino-S-carboxypropyldimethylsulfoniumchlorid

zugibt und aus der Kulturflüssigkeit das aus de zugegebenen Aminoverbindung gebildete Bleomy ein durch Chromatographieren an Kationenaustau scherharz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid um vernetzten! Dextran und Eluieren in an siel bekannter Weise isoliert.

2. Bleomycine, gekennzeichnet durch UV-Absorp tionsmaxima bei 244 nm und bei 290 bis 295 nm unc durch eine Partialstruktur gemäß folgender allge meiner Formel

NH-CFl - CO- NH - (CH₂), Λ ο /

CHOH
CH₃

in der R bedeutet:
(a) -NH-(CH₂J₃-NH-CH,

CO-R

9 ,

IbI Nil (CH,), M! CH; <ΙΙ CU

Oll

(Ο Nil KU,I₁ N j

ld) NH (CII,), NH (CH,), OCH₁
(el Nil ICII₂I, NH ■

(ΓΙ Nil ΚΊΙ,Ι, Nil CIl ■

cn,

(μ) Nil (CH,), N [CU,), Nil,
CIl,

lh) Nil (CH,], Nil K II,I₁ N