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CN107667118A - 包含针对密封蛋白18.2之抗体的药物缀合物 - Google Patents

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CN107667118A
CN107667118A CN201680021997.6A CN201680021997A CN107667118A CN 107667118 A CN107667118 A CN 107667118A CN 201680021997 A CN201680021997 A CN 201680021997A CN 107667118 A CN107667118 A CN 107667118A
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厄兹莱姆·图雷奇
科登·沃尔特
玛丽亚·克罗伊茨贝格
里塔·米特纳赫特-克劳斯
法布里斯·莱加尔
斯特凡·雅各布斯
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Translationale Onkologie An Der Universitatsmedizin Der Johannes Gutenberg-Univers
Ganymed Pharmaceuticals GmbH
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Abstract

本发明提供了抗CLDN18.2抗体‑药物缀合物，其有效用于治疗和/或预防与表达CLDN18.2之细胞相关的癌症疾病，所述癌症疾病包括胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，及其转移。

Description

包含针对密封蛋白18.2之抗体的药物缀合物
单克隆抗体(monoclonal antibodiy，mAB)已经在过去的二十年间变革了癌症的治疗(Sliwkowski，M.X.等(2013)Science 341(6151)，1192-1198)。mAB的关键特征是其高特异性及其靶向肿瘤细胞的能力，使其用于免疫效应子介导的细胞杀伤(补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC))和/或导致增殖降低和凋亡(Kubota，T.等(2009)Cancer Sci.100(9)，1566-1572)。与细胞毒性药物缀合可以扩展mAB的功用并改善其效力和有效性(Goldmacher，V.S.等(2011)Ther.Deliv.2(3)，397-416；Sievers，E.L.(2013)Annu.Rev.Med.64，15-29)。
历史上，使用细胞毒性药物治疗癌症集中在靶向正分裂的癌细胞的化学治疗。这些化合物不仅靶向癌细胞而且还靶向体内其他正分裂的健康细胞，并且接受治疗的患者经历严重的副作用，这限制了剂量。这些药物的治疗指数(最大耐受剂量/最小有效剂量)低，导致狭窄的治疗窗(Ismael，G.F.V.等(2008)Cancer Treat Rev.34(1)，81-91)。为了在药物开发中规避这一障碍并提高治疗指数，可使用抗体将细胞毒性药物特异性递送至肿瘤。通过将抗体的独特靶向能力与细胞毒性药物的癌症杀伤能力组合，与传统化学治疗剂相比，抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，ADC)表现出更低的副作用并且提供更宽的治疗窗(Gerber，H.-P.等(2013)Nat.Prod.Rep.30(5)，625-639)。
ADC设计成以靶标依赖性方式杀伤癌细胞。该过程的第一步是抗体与其抗原的结合。在ADC结合后，整个抗原-ADC复合物被内化，并且细胞毒性有效载荷(payload)被释放到肿瘤细胞中，导致细胞死亡。影响ADC治疗指数的因素包括抗体、肿瘤靶抗原、细胞毒性药物和接头(Panowksi，S.等(2014)MAbs 6(1)，34-45)。
作为开发ADC的基本先决条件，肿瘤靶抗原必须定位在细胞表面上并可被循环抗体接近。此外，肿瘤选择性和靶抗原表达水平是设计安全且有效的ADC的关键参数。目前，多种肿瘤相关细胞表面抗原正作为用于癌症治疗的ADC靶标进行评价(Trail，P.A.(2013)Antibodies 2(1)，113-129；Teicher，B.A.(2009)Curr.Cancer Drug Targets 9 (8)，982-1004)。
ADC的效率也取决于细胞毒性药物。由于与施用剂量相比，定位于肿瘤的抗体的量非常小，因此需要具有亚纳摩效力的毒性化合物。奥瑞他汀类(auristatin)和美登木素生物碱(maytansinoid)是目前在ADC开发中使用的两类高度有效的细胞毒素(Trail，P.A.(2013)Antibodies 2(1)，113-129)。二者都是阻断微管蛋白聚合的抗有丝分裂剂，其通过G2/M期细胞周期停滞引起细胞死亡(Lopus，M.等(2010)Mol.Cancer Ther.9(10)，2689-2699；Francisco，J.A等(2003)Blood 102(4)，1458-1465)。除mAB的特异性和药物的效力之外，接头也是ADC开发的重要要素。接头应是稳定的以利用mAB的药代动力学半衰期，并且不应在抗原介导的内化之前释放细胞毒性药物。接头可通过其药物释放机制来分类：可切割接头通过抗原特异性内化后的水解或酶切割来释放药物，而不可切割接头通过在内化后mAB在溶酶体中降解来释放药物(Dosio，F.等(2011)Toxins(Basel)3(7)，S.848-883)。
根据接头设计，释放在靶标阳性细胞内的膜可渗透性(亲脂性)毒素可通过细胞膜并杀伤紧邻的其他细胞，包括缺乏抗原表达的邻近癌细胞(旁观者效应(bystandereffect))(Kovtun，Y.V.等(2006)Cancer Res.66(6)，3214-3221)。这些细胞毒性药物介导局部旁观者杀伤的能力是针对在肿瘤中异质表达的抗原的那些ADC的重要选择标准。
紧密连接分子密封蛋白18同种型2(claudin 18isotype 2，CLDN18.2)是密封蛋白18的癌症相关剪接变体。CLDN18.2是包含四个跨膜结构域和两个小细胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围；环2被疏水区3和4包围)的27.8kDa跨膜蛋白。CLDN18.2是高度选择性胃谱系抗原，仅在短寿命的分化胃上皮细胞上表达，并且无法在任何其他正常人组织中检出。该抗原在包括胃食管癌和胰腺癌的多种人癌症中以显著水平异位表达(Sahin，U.，等，ClinCancer Res，2008.14(23)：第7624-34页)。CLDN18.2蛋白在胃癌的淋巴结转移和远处转移中也被频繁检出。由于通过siRNA技术的靶标下调导致抑制胃癌细胞的增殖，因此CLDN18.2看来参与CLDN18.2阳性肿瘤细胞的增殖。
IMAB362是针对CLDN18.2的IgG1亚型的嵌合单克隆抗体。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一细胞外结构域，并且不与包括密切相关的密封蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)的任何其他密封蛋白家族成员结合。在表达CLDN18.2的人异种移植物中，已经在施用IMAB362之后在小鼠中观察到存活效益和肿瘤消退。当在相关动物物种中静脉内施用后，由于靶表位不可及而未观察到胃组织中的毒性。然而，肿瘤靶标在恶性转化期间变得对IMAB362可及。IMAB362具有四种独立的高度有效的作用机制：(i)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)；(ii)补体依赖性细胞毒性(CDC)；(iii)由靶标在肿瘤表面交联而诱导的凋亡诱导；以及(iv)直接抑制增殖。先前的I期试验已经将IMAB362作为单一治疗以单剂量在患有晚期胃食管癌的患者中进行评价。该研究表明这种抗体的单一施用在高至1000mg/m2的剂量下是安全的并且耐受良好，因为没有观察到剂量组之间AE分布和其他安全性参数的相关差异(AE＝不良事件)。300mg/m2组和600mg/m2组获得关于抗肿瘤活性的最佳结果。进行IIa期临床试验以确定重复剂量的IMAB362在患有通过组织学证明的晚期胃或下食管腺癌的转移性、顽固性或复发性疾病的患者中的安全性、耐受性和抗肿瘤活性。
如上所述，CLDN18.2在正常细胞中具有限制性表达模式，并且因此显示是表达CLDN18.2之癌症的抗体定向治疗的理想靶标。因此，需要针对表达CLDN18.2之癌细胞的治疗，其能够对表达CLDN18.2之细胞施加临床上可用的细胞毒性或细胞抑制性作用，特别是不对非CLDN18.2表达细胞施加不期望的作用。优选地，治疗不应与通常与已经用于提高抗体治疗效力的方法(例如放射性标记和与化学治疗组合)相关的缺点和不期望副作用相关。例如，同位素治疗与骨髓抑制相关，且与抗体和化学治疗剂的组合治疗与免疫抑制相关。此外，同位素标记的物质难以产生，并且患者在经同位素标记的物质初始治疗之后经常经历复发。
本发明证明存在这样的抗CLDN18.2单克隆抗体，其可在表达CLND18.2的细胞上在CLDN18.2结合后高度有效地内化，并且因此适合用于ADC开发。此外，公开了分别使用可切割SPDB或Val-Cit(vc)接头使这样的抗体成功地与药物DM4和MMAE缀合。在体外，抗体缀合物降低表达CLDN18.2之胃和胰腺癌细胞的生存力。IMAB362-vcMMAE和IMAB362-DM4不与CLDN18.2阴性细胞结合或影响其生存力。DM4和vcMMAE缀合物二者在体外均对与CLDN18.2阳性癌细胞共培养的CLDN18.2阴性癌细胞施加旁观者杀伤作用。此外，在体内，在具有CLDN18.2阳性胃或胰腺异种移植肿瘤的裸鼠中静脉内施用抗体缀合物导致剂量依赖性肿瘤生长抑制、存活效益以及甚至早期和晚期肿瘤的完全消退。在约4至8mg/kg的单剂量静脉内施用下观察到显著的治疗效果；最佳治疗效果在15至16mg/kg下获得。无法确定两种缀合物的最大耐受单剂量，因为15.2和16mg/kg的最高可能测试剂量不导致肝毒性或其他毒性作用。
从本文中提供的数据可以得出结论，抗CLDN18.2抗体-药物缀合物(例如本文中所述的那些)是用于治疗CLDN18.2阳性人癌(例如胃癌和胰腺癌)的高度有效药物。
发明概述
本发明一般地提供了用于有效地治疗和/或预防与表达CLDN18.2之细胞相关的癌症的治疗，所述癌症例如胃癌、食管癌、胰腺癌、例如非小细胞肺癌(non small cell lungcancer，NSCLC)的肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，及其转移，特别是胃癌转移(例如克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor))、腹膜转移和淋巴结转移。特别优选的癌症疾病是胃、食管、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。
在一个方面，本发明提供了治疗或预防表达CLDN18.2之癌症的方法，其包括向癌症患者施用抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与至少一种毒素药物部分共价连接的具有与CLDN18.2结合之能力的抗体。
在一个实施方案中，抗体-药物缀合物在与由细胞表达的CLDN18.2结合后被内化到细胞中。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2特异性结合。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物与CLDN18.2特异性结合。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体、或抗体片段。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的细胞外结构域结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的第一细胞外环结合。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以如下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSM ACC2737、DSM ACC2738、DSMACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSMACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSM ACC2809或DSM ACC2810；(ii)为(i)中抗体之嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体之特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点(特别是可变区)，并且优选地具有(i)中抗体之特异性的抗体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。与第二抗体竞争与靶标结合的抗体优选对所述第二抗体是拮抗性的。
在一个实施方案中，毒素药物部分是细胞膜可渗透性的(cell membrane-permeable)。在一个实施方案中，毒素药物部分是细胞毒性剂或细胞抑制剂。在一个实施方案中，毒素药物部分是美登木素生物碱或奥瑞他汀类。在一个实施方案中，美登木素生物碱选自DM1和DM4。在一个实施方案中，奥瑞他汀类选自单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体通过接头与毒素药物部分共价连接。在一个实施方案中，接头是可切割接头。在一个实施方案中，接头在细胞内条件下可被切割。在一个实施方案中，接头在小于5.5的pH下可水解。在一个实施方案中，接头可被细胞内蛋白酶切割。在一个实施方案中，接头是组织蛋白酶可切割接头(cathepsin-cleavable linker)。在一个实施方案中，接头包含二肽。在一个实施方案中，二肽是val-cit或phe-lys。在一个实施方案中，抗体通过所述抗体的半胱氨酸巯基与接头连接。在一个实施方案中，抗体通过所述抗体的胺基团(特别是赖氨酸残基的胺基团)与接头连接。
在一个实施方案中，抗体-药物缀合物以有效用于治疗或预防表达CLDN18.2之癌症的量施用。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物以3至30mg/kg体重(例如4至25、5至20、10至18、或15至16mg/kg体重)的剂量施用。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物以8至150、9至100、或9至90mg/m2人患者体表(例如12至75、15至60、30至54、或45至48mg/m2人患者体表)的剂量施用。在一个实施方案中，施用单剂的抗体-药物缀合物或者两个或更多个剂的抗体-药物缀合物。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物通过静脉内注射来施用。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括施用外科手术、化学治疗和/或放射治疗。
在一个实施方案中，CLDN18.2的表达是在癌细胞的细胞表面。在一个实施方案中，癌症是腺癌，特别是晚期腺癌。在一个实施方案中，癌症选自：胃癌、食管癌、胰腺癌、例如非小细胞肺癌(NSCLC)的肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌，及其转移，克鲁肯贝格瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。在一个实施方案中，癌症选自：胃癌；食管癌，特别是下食管癌；食管-胃接合部(eso-gastric junction)的癌症；以及胃食管癌。在一个实施方案中，患者是HER2/neu阴性患者或具有HER2/neu阳性状态但不适于曲妥珠单抗治疗的患者。
在一个实施方案中，CLDN18.2具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了抗体-药物缀合物，其包含与至少一种毒素药物部分共价连接的具有与CLDN18.2结合之能力的抗体。
在一个实施方案中，抗体-药物缀合物在与由细胞表达的CLDN18.2结合后被内化到细胞中。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2特异性结合。在一个实施方案中，抗体-药物缀合物与CLDN18.2特异性结合。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体、或抗体片段。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的细胞外结构域结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的第一细胞外环结合。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以如下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSM ACC2737、DSM ACC2738、DSMACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSMACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSM ACC2809或DSM ACC2810；(ii)作为(i)中抗体之嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体之特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点(特别是可变区)，并且优选地具有(i)中抗体之特异性的抗体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。与第二抗体竞争结合靶标的抗体优选对所述第二抗体是拮抗性的。
在一个实施方案中，毒素药物部分是细胞膜可渗透性的。在一个实施方案中，毒素药物部分是细胞毒性剂或细胞抑制剂。在一个实施方案中，毒素药物部分是美登木素生物碱或奥瑞他汀类。在一个实施方案中，美登木素生物碱选自DM1和DM4。在一个实施方案中，奥瑞他汀类选自单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体通过接头与毒素药物部分共价连接。在一个实施方案中，接头是可切割接头。在一个实施方案中，接头在细胞内条件下可被切割。在一个实施方案中，接头在小于5.5的pH下可水解。在一个实施方案中，接头可被细胞内蛋白酶切割。在一个实施方案中，接头是组织蛋白酶可切割接头。在一个实施方案中，接头包含二肽。在一个实施方案中，二肽是val-cit或phe-lys。在一个实施方案中，抗体通过所述抗体的半胱氨酸巯基与接头连接。在一个实施方案中，抗体通过所述抗体的胺基团(特别是赖氨酸残基的胺基团)与接头连接。
在一个实施方案中，CLDN18.2具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了药物制剂，其包含本发明的抗体-药物缀合物，以及可药用稀释剂、载体或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了医用制品(medical preparation)，其包含本发明的抗体-药物缀合物。在一个实施方案中，医用制品以药盒的形式存在，所述药盒包含含有抗体-药物缀合物的容器。在一个实施方案中，医用制品还包含用于在治疗或预防癌症(特别是表达CLDN18.2之癌症)的方法中使用所述制品的打印说明书(printed instructions)。
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗体-药物缀合物、本发明的药物组合物或本发明的医用制品，其用于治疗，特别是用于治疗或预防癌症(特别是表达CLDN18.2之癌症)的方法。在一个实施方案中，治疗或预防癌症的方法为本发明的治疗或预防表达CLDN18.2之癌症的方法。
本发明的另一些特征和优点将通过以下详细描述和权利要求书而显而易见。
附图简述
图1：抗体药物缀合
图2：HEK293～CLDN18.2细胞与嵌合抗CLDN18.2mAb和Fab-ZAP共孵育之后生存力的降低(内化的间接评价)。
将HEK293～CLDN18.2细胞与抗CLDN18.2特异性抗体和皂草毒蛋白(saporin)缀合的抗人IgG Fab片段(Fab-ZAP人)孵育72小时。通过测量细胞生存力来间接确定IMAB362、chim mAB294、chim mAB308和chim mAB359的胞吞。数据点(n＝3个重复)表示为平均值±SD。
图3：HEK293～CLDN18.2细胞与鼠抗CLDN18.2抗体和Fab-ZAP共孵育之后生存力的降低(内化的间接评价)。
将HEK293～CLDN18.2细胞与抗CLDN18.2反应性鼠抗体和皂草毒蛋白缀合的抗小鼠IgG Fab片段(Fab-ZAP鼠)孵育72小时。通过测量细胞生存力来间接确定不同抗CLDN18.2反应性鼠抗体的胞吞。
图4：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对CLDN18.2阳性细胞的相对结合亲和力。
在高至20μg/ml的抗体浓度下通过流式细胞术对内源性表达CLDN18.2的(A)NUGC-4 10cF7-5sort3a和(B)DAN-G 1C5F2细胞、异位过表达CLDN18.2的(C)NCI-N87～CLDN18.2和(D)BxPC-3～CLDN18.2细胞确定IMAB362-毒素缀合物与未缀合IMAB362相比的相对结合亲和力。数据点(n＝2个重复)表示为平均值±SD。
图5：CLDN18.2介导的IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE结合。
在高至20μg/ml的抗体浓度下通过流式细胞术对(A)异位过表达CLDN18.2的NCI-N87～CLDN18.2细胞和(B)对应的CLDN18.2阴性人肿瘤细胞系分析CLDN18.2介导的IMAB362-毒素缀合物结合。数据点(n＝2个重复)表示为平均值±SD。
图6：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的结合特异性。
对(A)HEK293～CLDN18.2、(B)HEK293～CLDN18.1或(C)作为阴性对照的HEK293～模拟细胞确定IMAB362-毒素缀合物的结合特异性。在高至20ug/ml的抗体浓度下通过流式细胞术分析结合。数据点(n＝2个重复)表示为平均值±SD。
图7：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对表达CLDN18.2之人癌细胞系的生存力的作用。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE介导的(A)NUGC-4 10cF7-5sort 3a、(B)NCI-N87～CLDN18.2和(C)BxPC-3～CLDN18.2细胞生存力降低的剂量响应曲线。使用IMAB362作为阴性对照(在这些条件下在生存力测定中没有作用)。将细胞在浓度高至16875ng/ml的抗体存在下孵育72小时。使用基于XTT的生存力测定来测量细胞生存力的降低。数据点(n＝3个重复)表示为平均值±SD。
图8：IMAB362-vcMMAE介导的肿瘤细胞生存力降低的CLDN18.2依赖性。
对NCI-N87细胞(CLDN18.2阴性)和异位表达靶标的NCI-N87～CLDN18.2细胞确定IMAB362-vcMMAE介导的细胞生存力降低的靶标依赖性。将细胞与浓度高至16875ng/ml的IMAB362-vcMMAE或未缀合IMAB362孵育72小时。已知IMAB362在此处使用的实验条件下没有活性。使用基于XTT的生存力测定来测量细胞生存力的降低。数据点(n＝3个重复)表示为平均值±SD。
图9：IMAB362-vcMMAE介导的细胞生存力降低的特异性。
用稳定转染的HEK293～CLDN18.2、HEK293～CLDN18.1和HEK293～模拟细胞测试IMAB362-vcMMAE介导的细胞生存力降低的靶标特异性。将细胞在浓度高至16875ng/ml的IMAB362-vcMMAE存在下孵育72小时。使用基于XTT的生存力测定来测量细胞生存力的降低。数据点(n＝3个重复)表示为平均值±SD。
图10：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的旁观者活性。
在使用PA-1(Luc)细胞(CLDN18.2阴性/萤光素酶阳性)和NUGC-410cE8细胞(CLDN18.2阳性/萤光素酶阴性)的共培养实验中确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE介导的旁观者效应诱导。作为背景对照，将PA-1(Luc)细胞与IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE孵育。对于处理，将细胞在200ng/ml IMAB362-DM4、800ng/ml IMAB362-vcMMAE或800ng/mlIMAB362存在下培养4天。测量萤光素酶活性。
图11：IMAB362-DM4对晚期BxPC-3～CLDN18.2异种移植肿瘤的肿瘤生长抑制。
将CLDN18.2阳性BxPC-3～CLDN18.2细胞皮下植入雌性无胸腺裸鼠的胁部。在第14天，将小鼠组织为4组，并静脉内注射单剂量的载剂，7.5mg/kg、15mg/kg IMAB362-DM4，或重复剂量的15mg/kg IMAB362-DM4(笫14和21天)。每周两次测量皮下肿瘤的大小(平均值+SEM)。组大小n＝5。SD：单剂量，RD：重复剂量。
图12：经IMAB362-DM4处理的小鼠的平均体重。
每周两次地监测用单剂量的载剂对照，7.5mg/kg或15mg/kg或者重复剂量的15mg/kg IMAB362-DM4分别处理的BxPC-3～CLDN18.2荷瘤裸鼠的体重。4组的体重表示为平均值。组大小n＝5。
图13：来自在异种移植裸鼠中单剂量和重复剂量施用IMAB362-DM4的临床化学参数。
在植入后第49天分析用单剂量载剂，7.5mg/kg、15mg/kg IMAB362-DM4或重复剂量的15mg/kg IMAB362-DM4静脉内处理的BxPC-3～CLDN18.2荷瘤雌性裸鼠的临床化学。A)丙氨酸转氨酶(GPT)；B)天冬氨酸转氨酶(GOT)；C)谷氨酸脱氢酶；D)碱性磷酸酶；E)α-淀粉酶；F)胆碱酯酶；G)肌酸激酶(creatine kinase，CK)；H)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)；I)脂肪酶；J)尿素；K)葡萄糖；L)总蛋白；和M)白蛋白。
图14：来自经IMAB362-DM4和载剂处理的小鼠的胃切片的组织学分析。
用IMAB362-DM4处理荷有BxPC-3～CLDN18.2异种移植肿瘤的小鼠。在移植后第49天，处死小鼠，并将所选的器官解剖并福尔马林固定。将这些FFPE组织的切片用苏木精-伊红染色，并用显微镜检查形态学改变。(A，C)来自具有最高IMAB362-DM4暴露(15mg/kgIMAB362-DM4，在移植后第14天和笫21天)的处理组的代表性小鼠的胃组织。(B，D)只用载剂处理的对照组小鼠的胃组织。放大率：见比例尺。
图15：IMAB362-vcMMAE对晚期BxPC-3～CLDN18.2异种移植肿瘤的肿瘤生长抑制。
将CLDN18.2阳性BxPC-3～CLDN18.2细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在笫14天，将小鼠组织为4组，并静脉内注射单剂量的载剂，8mg/kg、16mg/kg IMAB362-vcMMAE或重复剂量的16mg/kg IMAB362-vcMMAE(第14和21天)。每周两次测量皮下肿瘤的大小(平均值+SEM)。组大小n＝5。
图16：经IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的平均体重。
每周两次监测用单剂量载剂对照，8mg/kg或16mg/kg或者重复剂量的16mg/kgIMAB362-vcMMAE处理的荷瘤雌性裸鼠的体重。4组的体重表示为平均值。组大小n＝5。
图17：来自在异种移植裸鼠中单剂量和重复剂量施用IMAB362-vcMMAE的临床化学参数。
在植入后第37天分析用单剂量的载剂，8mg/kg、16mg/kg IMAB362-vcMMAE或重复剂量的16mg/kg IMAB362-vcMMAE静脉内处理的BxPC-3～CLDN18.2荷瘤雌性裸鼠的临床化学。A)丙氨酸转氨酶(GPT)；B)天冬氨酸转氨酶(GOT)；C)谷氨酸脱氢酶；D)碱性磷酸酶；E)α-淀粉酶；F)胆碱酯酶；G)肌酸激酶(CK)；H)乳酸脱氢酶(LDH)；I)脂肪酶；J)尿素；K)葡萄糖；L)总蛋白；和M)白蛋白。
图18：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在晚期人NCI-N87～CLDN18.2胃异种移植肿瘤模型中的剂量依赖性抗肿瘤效力。
将异位表达人CLDN18.2的NCI-N87～CLDN18.2细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在植入后第10天，将小鼠组织成组，并在第13天静脉内注射单剂量的载剂，3.8mg/kg、7.6mg/kg或15.2mg/kg IMAB362-DM4或者4mg/kg、8mg/kg或16mg/kg IMAB362-vcMMAE。使另一个对照组通过交替IV和i.p.注射每周两次接受重复剂量的约8mg/kg IMAB362。每周测量两次肿瘤体积。当肿瘤体积超过1400mm3时或当肿瘤溃烂时，处死动物。使用Kruskal-Wallis和事后Dunn检验进行肿瘤生长的统计学分析。使用Mantel Cox检验分别比较载剂对照组与IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE来分析存活。用载剂对照、IMAB362或IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的(A-H)肿瘤生长曲线、(I，K)平均肿瘤生长(±SEM)和(J，L)存活图。组大小：n＝11；＊：p＜0.05；＊＊＊p＜0.001。箭头表示开始处理。
图19：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在早期人NUGC-410cF7-5sort3a胃异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤效力。
将内源性表达CLDN18.2的NUGC-4 10cF7-5sort3a细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在第3天，通过单次IV注射使小鼠接受载剂、15.2mg/kg IMAB362-DM4或16mg/kg IMAB362-vcMMAE。每周测量两次肿瘤体积。当肿瘤体积超过1400mm3时或当肿瘤溃烂时或在预定观察期120天后，处死动物。使用Kruskal-Wallis和事后Dunn检验进行肿瘤生长的统计学分析。使用Mantel Cox检验分析存活。用载剂对照、IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的(A-C)肿瘤生长曲线、(D)平均肿瘤生长(±SEM)和(E，F)存活图。组大小：n＝10；＊＊＊：p＜0.001；＊＊＊＊：p＜0.0001。箭头表示处理的时间点。
图20：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在晚期人BxPC-3～CLDN18.2胰腺异种移植肿瘤模型中的剂量依赖性抗肿瘤效力。
将异位表达人CLDN18.2的BxPC-3～CLDN18.2细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在第13天，将小鼠组织成组，并在笫14天静脉内注射单剂量的载剂，3.8mg/kg、7.6mg/kg或15.2mg/kg IMAB362-DM4或者4mg/kg、8mg/kg或16mg/kg IMAB362-vcMMAE。使来自抗体对照组的小鼠通过交替IV和i.p.注射每周两次接受约8mg/kg未缀合IMAB362。肿瘤大小每周测量两次。当肿瘤体积超过1400mm3时或当肿瘤溃烂时，处死动物。使用Kruskal-Wallis和事后Dunn检验进行肿瘤生长的统计学分析。使用Mantel Cox检验分别比较载剂对照组与IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE来分析存活。用载剂对照、IMAB362、IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的(A-H)肿瘤生长曲线、(I，K)平均肿瘤生长(±SEM)和(J，L)存活图。组大小：n＝11；p＜0.05；＊＊：p＜0.01；＊＊＊：p＜0.001；＊＊＊＊：p＜0.0001。箭头表示处理的时间点。
图21：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在早期人DAN-G1C5F2胰腺异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤效力。
将内源性表达CLDN18.2的DAN-G 1C5F2细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在植入后笫3天，用单次IV注射载剂对照，15.2mg/kg IMAB362-DM4或16mg/kg IMAB362-vcMMAE处理小鼠。每周测量两次肿瘤体积。当小鼠由于癌症恶病质而减轻超过10％体重时、当肿瘤溃烂时或在120天的预定观察期后，处死动物。使用Kruskal-Wallis和事后Dunn检验进行肿瘤生长的统计学分析。使用Mantel Cox检验分析存活。用载剂对照、IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的(A-C)肿瘤生长曲线、(D)平均肿瘤生长(±SEM)和(E，F)存活图。组大小：n＝10；＊＊：p＜0.01；＊＊＊：p＜0.001。箭头表示处理的时间点。
图22：来自经IMAB362-vcMMAE和载剂处理的小鼠的胃切片的组织学分析。
用IMAB362-vcMMAE处理携带BxPC-3～CLDN18.2异种移植肿瘤的小鼠。在移植后第37天，处死小鼠，解剖所选择的器官并进行福尔马林固定。将这些FFPE组织的切片用苏木精-伊红染色，并用显微镜检查形态学改变。(A，C)来自具有最高IMAB362-vcMMAE暴露(16mg/kg IMAB362-vcMMAE，在移植后第14天和第21天)的处理组的代表性小鼠的胃组织。(B，D)只用载剂处理的对照组小鼠的胃组织。放大率：见比例尺。
图23：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的凋亡诱导。
使用靶标阳性NUGC-4 10cE8细胞通过测量胱天蛋白酶3/7活性并用膜联蛋白V染色来确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE介导的凋亡诱导。A)在将细胞在2.5μg/mlIMAB362抗体存在下孵育3天后分析胱天蛋白酶3/7活性(n＝3个重复，平均值±SD).B)在用2.5μg/ml IMAB362抗体处理后4天进行经膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)共染色的细胞的流式细胞术分析(n＝3个重复)。未处理的细胞用作对照。
图24：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在晚期人NUGC-410cF7-5sort3a胃异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤效力。
将内源性表达CLDN18.2的NUGC-4 10cF7-5sort3a细胞皮下植入雌性裸鼠的胁部。在第10天，通过单次IV注射使小鼠接受载剂、15.2mg/kg IMAB362-DM4或16mg/kg IMAB362-vcMMAE。每周测量两次肿瘤体积。当肿瘤体积超过1400mm3时、当肿瘤溃烂时或在预定观察期120天后，处死动物。使用Kruskal-Wallis和事后Dunn检验进行肿瘤生长的统计学分析。使用Mantel Cox检验分析存活。用载剂对照、IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的小鼠的(A-C)肿瘤生长曲线、(D)平均肿瘤生长(±SEM)和(E，F)存活图。组大小：n＝10；＊：p＜0.05；＊＊＊：p＜0.001。箭头表示处理的时间点。
图25：表达CLDN18.2的人癌细胞上IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE介导的ADCC。
A)内源性表达CLDN18.2的NUGC-4 10cF7_5sort3a p3151#10人胃癌细胞上IMAB362-DM4(实心黑色圆圈)、IMAB362-vcMMAE(实心黑色三角形)和IMAB362(空心黑色方块)介导的ADCC的剂量响应曲线。使用约40∶1的效应物与靶标比例进行实验。数据点(n＝4个重复)表示为平均值±SD。B)NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10细胞上的CLDN18.2表达的流式细胞术分析。灰色填充直方图：抗CLDN18.2(IMAB362，50μg/ml)。黑色虚线：同种型对照。
图26：表达CLDN18.2的人癌细胞上IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE介导的CDC。A)内源性表达CLDN18.2的KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25(左)和NUGC-4 10cF7_5sort3a p3151#10人胃癌细胞(右)上IMAB362-DM4(实心黑色圆圈)、IMAB362-vcMMAE(实心黑色三角形)和IMAB362(空心黑色方块)介导的CDC的剂量响应曲线。将表达萤光素酶的靶细胞与20％人血清(来自健康人供体的汇集物(pool))和指定浓度的各抗体孵育90分钟。数据点(n＝3个重复)表示为平均值±SD.B)KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25(左)和NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10细胞(右)上的CLDN18.2表达的流式细胞术分析。灰色填充直方图：抗CLDN18.2(IMAB362，50μg/ml)。黑色虚线：同种型对照。
发明详述
尽管下文详细描述了本发明，但是应理解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
下文中，将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案列出，然而，应理解，可以以任何方式和任意数量对其进行组合以产生另外的实施方案。不同地描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限制于明确描述的实施方案。本说明书应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外说明，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应视为被本申请的说明书公开。
优选地，本文中使用的术语如″A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)″，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel；以及H.编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)中所述进行定义。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用在本领域的文献中阐明的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文中另外要求，否则词语“包括/包含”及变化形式应理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可排除，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中值范围的描述仅旨在用作单独地提及落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。除非本文中另外说明或另外明显与上下文相矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任意合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如/如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围造成限制。本说明书中的语言不应解释为表示对本发明的实施至关重要的任何非要求保护的要素。
在本说明书的整个文本中引用了数篇文献。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论在上文中还是在下文中都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明无权由于在前的发明而早于这样的公开内容。
密封蛋白是作为紧密连接中最重要组分的蛋白质家族，在紧密连接中其建立控制分子在上皮的细胞之间的细胞间隙中流动的细胞旁屏障。密封蛋白是跨膜4次的跨膜蛋白，具有均位于细胞质中的N端和C端。第一细胞外环或结构域平均由53个氨基酸组成，且第二细胞外环或结构域由约24个氨基酸组成。密封蛋白家族的细胞表面蛋白(例如CLDN18.2)在不同来源的肿瘤中表达，并且由于其选择性表达(在毒性相关正常组织中没有表达)和定位到质膜而特别适合作为与抗体介导的癌症免疫治疗相关的靶结构。
本文中使用的术语“CLDN”意指密封蛋白并且包括CLDN18.2。优选地，密封蛋白是人密封蛋白。
术语“CLDN18”涉及密封蛋白18并且包括任何变体，所述变体包括密封蛋白18剪接变体1(密封蛋白18.1(CLDN18.1))和密封蛋白18剪接变体2(密封蛋白18.2(CLDN18.2))。
术语“CLDN18.2”优选地涉及人CLDN18.2，且特别是涉及包含根据序列表的SEQ IDNO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。CLDN18.2的第一细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的第27至81位氨基酸，更优选第29至78位氨基酸。CLDN18.2的第二细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的第140至180位氨基酸。所述第一和第二细胞外环或结构域优选形成CLDN18.2的细胞外部分或结构域。
CLDN18.2在胃黏膜的分化上皮细胞的正常组织中选择性表达。CLDN18.2在不同来源的癌症中表达，例如胰腺癌、食管癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤。CLDN18.2是用于预防和/或治疗原发性肿瘤(例如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌)及其转移(特别是胃癌转移(例如克鲁肯贝格瘤)、腹膜转移和淋巴结转移)的有价值的靶标。
术语“CLDN18.1”优选涉及人CLDN18.1，且特别是涉及包含根据序列表的SEQ IDNO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。
根据本发明的术语“变体”特别是指突变体、剪接变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体(species variant)和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义常常是不清楚的。全基因测序通常鉴定出给定基因的多种等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何翻译后修饰的变体和构象变体。
根据本发明，术语“表达CLDN18.2之癌症”或“CLDN18.2阳性癌症”意指涉及(优选在所述癌细胞的表面上)表达CLDN18.2之癌细胞的癌症。
“细胞表面”根据其在本领域的正常含义使用，并因此包括可被蛋白质和其他分子接近以结合的细胞外部。
如果CLDN18.2位于细胞的表面并且可被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体接近以结合，则其在所述细胞的表面上表达。
在本发明的上下文中，术语“细胞外部分”或“细胞外结构域”是指分子(例如蛋白质)的一部分，其朝向细胞的细胞外空间，并且优选地可从所述细胞的外部接近，例如被位于所述细胞外部的抗原结合分子(例如抗体)接近。优选地，该术语是指一个或更多个细胞外环或结构域或者其片段。
根据本发明，如果与胃细胞或胃组织中的表达相比，表达水平较低，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。优选地，表达水平是胃细胞或胃组织中表达的小于10％，优选小于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％或者甚至更低。优选地，如果表达水平超过除胃以外的非癌组织中的表达水平不超过2倍、优选1.5倍，并且优选地不超过所述非癌组织中的表达水平，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在细胞中基本上不表达。
根据本发明，如果表达水平超过除胃以外的非癌组织中的表达水平优选多于2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则细胞中表达CLDN18.2。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN18.2表达或暴露在所述细胞的表面上。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。通常来说，疾病解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可由源自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者其可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。对于人，“疾病”通常更广泛地用于指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社交问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何状况。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、不正常行为、以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于另一些目的，这些可认为是可区别的类别。疾病通常不仅在身体上而且还在情感上影响个体，因为对许多疾病的染病和与其共存可以改变个体对生命的看法和个体的性格。根据本发明，术语“疾病”包括癌症，特别是本文中所述的那些癌症形式。本文中对癌症或具体癌症形式的任何提及还包括其癌症转移。在一个优选实施方案中，待根据本申请治疗的疾病涉及表达CLDN18.2的细胞。
根据本发明，“涉及表达CLDN18.2之细胞的疾病”或“与表达CLDN18.2之细胞相关的疾病”或类似表述意指CLDN18.2在患病组织或器官的细胞中表达。在一个实施方案中，与对应健康组织或器官中的状态相比，CLDN18.2在患病组织或器官的细胞中的表达提高。提高是指提高至少10％，特别地至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅见于患病组织，而相应健康组织中的表达被抑制。根据本发明，与表达CLDN18.2之细胞相关的疾病包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选为其中癌细胞表达CLDN18.2的那些。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。优选地，“癌症疾病”的特征在于表达CLDN18.2的细胞，以及癌细胞表达CLDN18.2。表达CLDN18.2的细胞优选是癌细胞，优选本文中所述的癌症的癌细胞。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病变。“肿瘤细胞”意指通过迅速的不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，并且通常形成独特的组织团块，其可以是良性的、恶化前的或恶性的。根据本发明，“癌症疾病”优选为“肿瘤疾病”。然而，通常术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，根据本发明的癌症涉及表达CLDN18.2的癌细胞。在一个实施方案中，癌症是CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，CLDN18.2的表达是位于细胞的表面。在一个实施方案中，至少50％，优选60％、70％、80％或90％的癌细胞是CLDN18.2阳性的，和/或至少40％，优选至少50％的癌细胞对CLDN18.2的表面表达呈阳性。在一个实施方案中，至少95％或至少98％的癌细胞是CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的癌细胞对于CLDN18.2的表面表达是阳性的。
在一个实施方案中，表达CLDN18.2之癌症、涉及表达CLDN18.2之癌细胞的癌症或CLDN18.2阳性癌症选自：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，及其转移，特别是胃癌转移(例如克鲁肯贝格瘤)、腹膜转移和淋巴结转移。在一个实施方案中，癌症是腺癌，特别是晚期腺癌。特别优选的癌症疾病是胃、食管、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。在一个实施方案中，癌症选自胃癌、食管癌(特别是下食管癌)、食管-胃接合部的癌症和胃食管癌。在一个特别优选的实施方案中，癌症是胃食管癌，例如转移性、顽固性或复发性晚期胃食管癌。
根据本发明，“癌”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是源于腺组织的癌症。这种组织也是称为上皮组织的较大组织类别的一部分。上皮组织包括皮肤、腺和内衬于身体的腔和器官的多种其他组织。上皮在胚胎学上来自于外胚层、内胚层和中胚层。要分类为腺癌，细胞不一定需要是腺的一部分，只要其具有分泌特性即可。这种形式的癌可以发生在一些高级哺乳动物，包括人中。良好分化的腺癌倾向于类似于其所来源的腺组织，而分化较差的腺癌则可以不是这样。通过对来自活检物的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是腺癌还是某种其他类型的癌症。由于体内腺的普遍存在性，腺癌可在身体的许多组织中出现。虽然每种腺可以不是分泌相同的物质，但是只要细胞有外分泌功能，其就被认为是腺性的，并且因此其恶性形式被称为腺癌。恶性腺癌侵袭其他组织并且经常转移(如果时间足够这样做的话)。卵巢腺癌是卵巢癌最常见的类型。其包括浆液性和黏液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的其他部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离、侵袭细胞外基质、穿透内皮基底膜以进入体腔和血管、以及随后在通过血液转运后浸润靶器官。最后，在靶部位处新肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并产生转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和局部淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。使用本发明治疗可治疗的一种特定形式的转移是源自作为原发性部位的胃癌的转移。在一些优选实施方案中，这样的胃癌转移是克鲁肯贝格瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。
克鲁肯贝格瘤是卵巢的不常见转移性肿瘤，占所有卵巢肿瘤的1％至2％。克鲁肯贝格瘤的预后仍然很差，并且尚未建立克鲁肯贝格瘤的治疗。克鲁肯贝格瘤是卵巢的转移性印戒细胞腺癌。胃是大多数克鲁肯贝格瘤病例(70％)的原发性部位。结肠癌、阑尾癌和乳腺癌(主要是侵袭性小叶癌)是紧随其后最常见的原发性部位。已报道源自胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、小肠癌、法特壶腹(ampulla of Vater)癌、宫颈癌和膀胱/脐尿管癌的罕见克鲁肯贝格瘤病例。原发性癌的诊断与随后发现卵巢受累之间的时间间隔通常为6个月或更短，但较长的时间也已报道过。在许多情况下，原发性肿瘤非常小，并且可逃避检测。在只有20％至30％的病例中可获得胃或其他器官的先前癌病史。
患有克鲁肯贝格瘤的患者的总体死亡率显著较高。大多数患者在2年内死亡(中位存活，14个月)。一些研究表明，当在发现转移到卵巢后鉴定原发性肿瘤时，预后不良，并且如果原发性肿瘤保持隐蔽，预后就会变得更差。
文献中没有明确建立克鲁肯贝格瘤的最佳治疗策略。是否应进行外科手术切除尚未得到充分解决。化学治疗或放射治疗对克鲁肯贝格瘤患者的预后无显著作用。
特别地与本文中针对癌症治疗使用的术语“(治疗性)治疗”涉及旨在改善患者的健康状况和/或延长(提高)患者寿命的任何治疗。所述治疗可消除癌症、减小患者中肿瘤的大小或数量、阻止或减缓患者中癌症的发生、抑制或减缓患者中新癌症的发生、降低患者中症状的频率或严重程度、和/或降低当前患有或先前曾患有癌症的患者中的复发。癌症的(治疗性)治疗可选自外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。
本文中使用的术语“外科手术”包括在手术中移除肿瘤。外科手术是癌症的常见治疗。外科医生可以使用局部切除来移除肿瘤。
本文中使用的术语“化学治疗”是指使用化学治疗剂或化学治疗剂组合，优选地通过杀伤细胞或通过停止细胞分裂来停止癌细胞生长。当经口或者通过注射到静脉或肌肉中来接受化学治疗时，药物进入血流并且可到达遍及整个身体的癌细胞(全身性化学治疗)。当将化学治疗直接置于脑脊液、器官或体腔(例如腹)中时，药物主要影响那些区域的癌细胞(区域性化学治疗)。
根据本发明的化学治疗剂包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化合物。传统的化学治疗剂通过杀伤迅速分裂(大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞发挥作用。这意味着化学治疗也伤害在正常情况下迅速分裂的细胞，例如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化学治疗最常见的副作用。根据本发明，术语“化学治疗”优选不包括靶向在癌细胞中异常表达的蛋白质(肿瘤抗原，例如CLDN18.2)并且通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体。然而，靶向在癌细胞中异常表达的蛋白质(肿瘤抗原，例如CLDN18.2)并通过与其缀合的治疗部分或治疗剂发挥作用的抗体可以被视为化学治疗的一种形式。然而，在最严格意义上，根据本发明的术语“化学治疗”不包括靶向治疗。
根据本发明，术语“靶向治疗”涉及可用于优先地靶向患病细胞(例如癌细胞)而不靶向或在较小程度上靶向非患病细胞的任何治疗。患病细胞的靶向优选地导致杀伤患病细胞和/或损害其增殖或生存力。这样的治疗包括：i)靶向患病细胞上的某些细胞表面靶标(例如，肿瘤抗原，例如CLDN18.2)的裸露的或与治疗部分缀合的抗体、抗体片段和蛋白质(例如，本文中所述的针对CLDN18.2的抗体或抗体缀合物)；或者ii)损害患病细胞的增殖或生存力的小分子。在一个具体实施方案中，该药剂结合于与正常干细胞上相比在患病干细胞上以更高水平表达的抗原。在一个具体实施方案中，该药剂特异性结合于肿瘤抗原。传统的化学治疗或放射治疗不被认为是“靶向治疗”，尽管其经常针对肿瘤。此外，根据本发明的术语“抗体治疗”优选不包括用与治疗部分缀合的抗体、其片段或衍生物治疗，而仅涉及用通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞而发挥作用的抗体、其片段或衍生物治疗。
在本发明的上下文中，例如“保护”、“预防”或“预防性”的术语涉及防止对象中疾病的发生和/或播散，且特别是使对象将发生疾病的机会最小化或延缓疾病的发生。例如，处于癌症风险之中的对象将成为预防癌症的治疗的候选者。
“处于风险之中”意指鉴定为与一般群体相比发生疾病(特别是癌症)的机会高于正常的对象。此外，曾患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象是发生疾病的风险提高的对象，因为对象可继续发生疾病。目前患有或曾患有癌症的对象的癌症转移风险也提高。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。其是指人、非人灵长类或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)，其可以受疾病或病症(例如癌症)影响或者易患疾病或病症(例如癌症)，但可以患有或可以未患所述疾病或病症。在许多实施方案中，个体是人。除非另外说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成人、老年人、儿童和新生儿。在本发明的一些优选实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。术语“患者”根据本发明意指治疗对象，特别是患病对象。
术语“抗原”涉及包含免疫应答所针对的和/或待针对之表位的物质，例如蛋白质或肽。在一个优选实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原例如CLDN18.2，即可来自细胞质、细胞表面和细胞核的癌细胞成分，特别是在细胞内或作为癌细胞上的表面抗原产生、优选大量产生的那些抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”优选涉及在正常条件下特异性表达于有限数量的组织和/或器官或特定发育阶段并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达的蛋白质。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原优选与癌细胞的细胞表面相缔合，并且优选在正常组织中不表达或仅很少表达。
术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，即分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分。例如，表位是抗原上的离散的三维位点，其被免疫系统识别。表位通常由例如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组群组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失而与后者的结合不丧失。蛋白质(例如CLDN18.2)的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，以及包含这样的糖蛋白的抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、包含抗体的结合片段或衍生物的分子(包括但不限于单链抗体(例如scFv)和抗原结合抗体片段(例如Fab和Fab′片段))，并且还包括所有重组形式的抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体、以及本文中所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，其散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体显示出单一的结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的从非人动物(例如小鼠)获得的B细胞。
本文中使用的术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因而言转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)从转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体；(c)从重组的组合抗体文库分离的抗体；以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完全可变结构域，或仅包含可变结构域中接枝到合适框架区上的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或者通过一个或更多个氨基酸替换修饰，例如被修饰以更接近类似于人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留所有的CDR序列(例如包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。另一些形式具有相对于原始抗体改变的一个或更多个CDR。
术语“嵌合抗体”是指以下这些抗体，其中重链和轻链的氨基酸序列各自的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余区段与另一个中的相应序列同源。通常来说，轻链和重链二者的可变区模拟来源于一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种的抗体的序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点在于：与来源于例如人细胞制备物的恒定区组合，使用来自非人宿主生物的容易获得的B细胞或杂交瘤可以方便地从目前已知的来源获得可变区。尽管可变区具有易于制备的优点并且特异性不受来源的影响，但是与来自非人来源的恒定区相比，当注射抗体时，恒定区是人的，较不可能引发来自人对象的免疫应答。然而，该定义不限于该特定实例。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称“结合片段”)或者类似术语是指抗体的保留与抗原特异性结合能力的一个或更多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补性决定区(CDR)；以及(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过单独的基因编码，但其可以通过合成接头使用重组方法连接，使得其能够被制成单个的蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。另外的实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步公开在US 2003/0118592和US2003/0133939中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且所述片段以与完整抗体相同的方式根据用途进行筛选。
天然存在的抗体通常是单特异性的，即其与单一抗原结合。本发明包括与靶细胞(通过接合肿瘤抗原)和第二实体如细胞毒性细胞(例如通过接合CD3受体)结合的抗体。本发明的抗体可以是双特异性或多特异性的，例如三特异性的、四特异性的等。
术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的物质。例如，所述分子可以与(a)细胞表面抗原(例如CLDN18.2)和(b)效应细胞表面上的受体(例如Fc受体)结合或相互作用。术语“多特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的物质。例如，所述分子可与(a)细胞表面抗原(例如CLDN18.2)、(b)效应细胞表面上的受体(例如Fc受体)和(c)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，术语“抗体”包括但不限于针对肿瘤抗原以及其他靶标(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括双链抗体(diabody)。双链抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短以致不允许同一链上两个结构域之间配对，从而迫使结构域与其他链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点的接头(参见例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。
抗体可来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
本文中使用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别改变为其他Ig类别之一的现象。
本文中所述的抗体包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在多个实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别地IgG1κ或IgG1λ同种型(即IgG1，κ、λ)；IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)；IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)；IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)；或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。
本文中使用的“异源抗体”相对于产生这样的抗体的转基因生物定义。该术语是指具有对应于见于以下生物体中的那些的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，所述生物体不由转基因生物组成并且通常来源于除转基因生物以外的物种。
本文中使用的“异杂交抗体(heterohybrid antibody)”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异杂交抗体。
本文中所述的抗体优选地是分离的。本文中使用的“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与肿瘤抗原特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合不同于肿瘤抗原的抗原的抗体)。然而，与人肿瘤抗原的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原(例如来自其他物种的其他相关抗原(例如，肿瘤抗原物种同源物))具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不合其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合涉及具有不同特异性并且以明确确定的组合物或混合物组合的抗体。
在本发明的上下文中，抗体能够通过募集患者的免疫系统以破坏肿瘤细胞来发挥作用，如果抗体特别是当与其靶标(例如患病细胞上的肿瘤抗原)结合时，引发免疫效应功能，如本文所述。优选地，所述免疫效应功能针对细胞，例如在其表面上携带肿瘤抗原(例如CLDN18.2)的癌细胞。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发生，包括抑制肿瘤播散和转移。优选地，免疫效应功能导致杀伤癌细胞。这样的功能包括补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬(antibody-dependent cell-mediatedphagocytosis，ADCP)、在携带肿瘤抗原的细胞中诱导凋亡、携带肿瘤抗原的细胞的细胞裂解、和/或抑制携带肿瘤抗原的细胞的增殖。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
ADCC描述了优选地需要靶细胞被抗体标记的效应细胞(特别是淋巴细胞)的细胞杀伤能力。
当抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并且抗体Fc结构域与免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)接合时，优选发生ADCC。已经鉴定了数个Fc受体家族，并且特定细胞群特征性地表达限定的Fc受体。ADCC可被视为直接诱导导致抗原呈递和诱导肿瘤导向的T细胞应答的可变程度的立即肿瘤破坏的机制。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤导向的T细胞应答和宿主源性抗体应答。
补体依赖性细胞毒性
CDC是可由抗体指导的另一种细胞杀伤方法。IgM是补体激活最有效的同种型。IgG1和IgG3二者在通过经典补体激活途径指导CDC方面也非常有效。优选地，在该级联反应中，抗原-抗体复合物的形成导致参与抗体分子(例如IgG分子)的CH2结构域上紧密接近的多个C1q结合位点暴露(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转化为高亲合力相互作用，其触发涉及一系列其他补体蛋白的级联事件并导致效应细胞趋化/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，补体级联以形成膜攻击复合物结束，所述复合物在细胞膜中产生有利于水和溶质自由进入和离开细胞的孔。
令人吃惊地发现，本文中所述的抗体-药物缀合物能够通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)介导的裂解来介导杀伤细胞，特别是表达CLDN18.2的细胞，例如癌细胞。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体-药物缀合物通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)介导的裂解(优选通过诱导CDC介导的裂解和ADCC介导的裂解)来介导细胞杀伤。
如本文所用，如果通过免疫接种动物或通过筛选免疫球蛋白基因文库从系统获得抗体，则抗体“来源于”特定种系序列，并且其中所选抗体的氨基酸序列与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％同一性。通常来说，来源于特定种系序列的抗体显示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不超过10个氨基酸差异，更优选不超过5个，或者甚至更优选不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异。
本文中使用的术语“异抗体”是指连接在一起的两个或更多个抗体、其衍生物或抗原结合区域，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上Fc受体的结合特异性，以及对靶细胞(例如肿瘤细胞)上抗原或表位的结合特异性。
本文中使用的术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或真菌(包括酵母细胞)。
本发明包括本文中所述的所有抗体和抗体衍生物，其出于本发明的目的而涵盖在术语“抗体”中。术语“抗体衍生物”是指任何修饰形式的抗体，例如抗体与其他物质或抗体的缀合物，或抗体片段。
术语“针对肿瘤抗原的抗体”或类似术语涉及针对肿瘤抗原或具有与肿瘤抗原结合之能力的抗体。根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，如果在标准测定中抗体或抗体-药物缀合物对预定靶标具有显著亲和力并且与其结合，则所述抗体或抗体-药物缀合物能够与所述预定靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)测量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著亲和力”是指以以下解离常数(KD)与预定靶标结合：10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、或者10-12M或更小。
如果在标准测定中抗体或抗体-药物缀合物对靶标不具有显著亲和力并且不与所述靶标显著地结合，特别是不可检测地结合，则所述抗体或抗体-药物缀合物(基本上)不能够与所述靶标结合。优选地，如果以高至2、优选10、更优选20、特别是50或100μg/ml或更高的浓度存在，则抗体或抗体-药物缀合物不与所述靶标可检测地结合。优选地，如果抗体或抗体-药物缀合物与靶标结合的KD是与该抗体或抗体-药物缀合物能够结合的预定靶标结合的KD的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍高，则其对所述靶标不具有显著亲和力。例如，如果抗体或抗体-药物缀合物与该抗体或抗体-药物缀合物能够结合的靶标结合的KD为10-7M，则与该抗体或抗体-药物缀合物对其不具有显著亲和力的靶标结合的KD为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
如果抗体或抗体-药物缀合物能够与预定靶标结合而其不能够与其他靶标结合，即在标准测定中对其他靶标不具有显著亲和力并且不与其显著地结合，则所述抗体或抗体-药物缀合物是所述预定靶标特异性的。根据本发明，如果抗体或抗体-药物缀合物能够与肿瘤抗原(例如CLDN18.2)结合但是(基本上)不能够与其他靶标结合，则所述抗体或抗体-药物缀合物是所述肿瘤抗原特异性的。优选地，如果对这样的其他靶标的亲和力和结合不显著超过对肿瘤抗原不相关蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA)或非肿瘤抗原跨膜蛋白(例如MHC分子或转铁蛋白受体)或者任何其他指定多肽)的亲和力或结合，则抗体或抗体-药物缀合物是肿瘤抗原特异性的。优选地，如果抗体或抗体-药物缀合物与预定靶标结合的KD是与其非特异性靶标结合的KD的至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍低，则所述抗体或抗体-药物缀合物是所述靶标特异性的。例如，如果抗体或抗体-药物缀合物与其特异性靶标结合的KD为10-7M，则与其非特异性靶标结合的KD为至少10- 6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M
抗体与靶标的结合可以使用任何合适的方法凭实验确定；参见例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″在FundamentalImmunology中，Paul，W.E.，编辑，Raven Press New York，N Y(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and CompanyNew York，N Y(1992)；以及本文中描述的方法。亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过平衡透析；通过使用制造商概述的一般操作来使用BIAcore 2000仪器；通过使用经放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。亲和力数据可以例如通过Scatchard等，Ann N.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
本文中使用的术语“天然存在的”在应用于物体时是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，可以从天然来源分离并且没有在实验室中被人故意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文中使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在分别基本上编码完整VH或VL结构域的构象中紧邻D-J或J区段定位。可以通过与种系DNA比较来鉴定重排的免疫球蛋白(抗体)基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
本文中关于V区段使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V区段未重组以紧邻D或J区段的构型。
根据本发明，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是能够与存在于CLDN18.2中的表位(优选位于CLDN18.2的细胞外结构域内的表位，特别是CLDN18.2的第一细胞外结构域，优选笫29至78位氨基酸)结合的抗体。在一些特别的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是能够与以下表位结合的抗体：(i)CLDN18.2上的不存在于CLDN18.1上的表位，优选SEQ ID NO：3、4和5；(ii)位于CLDN18.2-环1上的表位，优选SEQ ID NO：8：(iii)位于CLDN18.2-环2上的表位，优选SEQ ID NO：10；(iv)位于CLDN18.2-环D3上的表位，优选SEQID NO：11；(v)包含CLDN18.2-环1和CLDN18.2-环D3的表位；或者(vi)位于CLDN18.2-环D3上的非糖基化表位，优选SEQ ID NO：9。
根据本发明，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选是具有结合CLDN18.2但不与CLDN18.1结合之能力的抗体。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体对于CLDN18.2是特异性的。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选是具有与细胞表面上表达的CLDN18.2结合之能力的抗体。在一些特别优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与活细胞表面上存在的CLDN18.2的天然表位结合。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与选自SEQ ID NO：1、3至11、44、46和48至50的一种或更多种肽结合。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体对上述蛋白质、肽或其免疫原性片段或衍生物是特异性的.具有与CLDN18.2结合之能力的抗体可通过包括以下步骤的方法获得：用包含选自SEQ IDNO：1、3至11、44、46和48至50的氨基酸序列的蛋白质或肽或者表达所述蛋白质或肽的核酸或宿主细胞免疫接种动物。优选地，抗体与癌细胞(特别是上述癌症类型的细胞)结合，并且优选地基本上不与非癌细胞结合。
在一个特别优选的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体由保藏在DSMZ(Mascheroder Weg 1b，31824Braunschweig，Germany；新地址：Inhoffenstr.7B，31824Braunschweig，Germany)并且具有以下名称和登记号的杂交瘤产生：
a.182-D1106-055，登记号DSM ACC2737，于2005年10月19日保藏；
b.182-D1106-056，登记号DSM ACC2738，于2005年10月19日保藏；
c.182-D1106-057，登记号DSM ACC2739，于2005年10月19日保藏；
d.182-D1106-058，登记号DSM ACC2740，于2005年10月19日保藏；
e.182-D1106-059，登记号DSM ACC2741，于2005年10月19日保藏；
f.182-D1106-062，登记号DSM ACC2742，于2005年10月19日保藏；
g.182-D1106-067，登记号DSM ACC2743，于2005年10月19日保藏；
h.182-D758-035，登记号DSM ACC2745，于2005年11月17日保藏；
i.182-D758-036，登记号DSM ACC2746，于2005年11月17日保藏；
j.182-D758-040，登记号DSM ACC2747，于2005年11月17日保藏；
k.182-D1106-061，登记号DSM ACC2748，于2005年11月17日保藏；
l.182-D1106-279，登记号DSM ACC2808，于2006年10月26日保藏；
m.182-D1106-294，登记号DSM ACC2809，于2006年10月26日保藏；
n.182-D1106-362，登记号DSM ACC2810，于2006年10月26日保藏。
根据本发明的一些优选抗体是由上述杂交瘤产生和可从其获得的那些：即，在182-D1106-055的情况下为37G11，在182-D1106-056的情况下为37H8，在182-D1106-057的情况下为38G5，在182-D1106-058的情况下为38H3，在182-D1106-059的情况下为39F11，在182-D1106-062的情况下为43A11，在182-D1106-067的情况下为61C2，在182-D758-035的情况下为26B5，在182-D758-036的情况下为26D12，在182-D758-040的情况下为28D10，在182-D1106-061的情况下为42E12，在182-D1106-279的情况下为125E1，在182-D1106-294的情况下为163E12，在182-D1106-362的情况下为175D10，及其嵌合和人源化形式。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以如下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSM ACC2737、DSM ACC2738、DSMACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSMACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSM ACC2809或DSM ACC2810；(ii)为(i)中抗体之嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体之特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点(特别是可变区)，并且优选地具有(i)中抗体之特异性的抗体。
优选抗体(特别是嵌合抗体)及其序列示于下表中。
在一些优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含重链恒定区(CH)的抗体，所述重链恒定区包含来源于人重链恒定区的氨基酸序列，例如SEQID NO：13所示氨基酸序列或其片段。在另一些优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含轻链恒定区(CL)的抗体，所述轻链恒定区包含来源于人轻链恒定区的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列或其片段。在一个特别优选实施方案中，根据本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括包含CH并且包含CL的抗体，所述CH包含来源于人CH的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列或其片段，所述CL包含来源于人CL的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列或其片段。
在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是包含κ鼠可变轻链、人κ轻链恒定区同种异型Km(3)、鼠重链可变区、人IgG1恒定区、同种异型G1m(3)的嵌合小鼠/人IgG1单克隆抗体。
在某些优选实施方案中，嵌合形式的抗体包括包含重链和/或包含轻链的抗体，所述重链包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、51的氨基酸序列及其片段，所述轻链包含选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24、25、26、27、28的氨基酸序列及其片段。
在某些优选实施方案中，嵌合形式的抗体包括包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链和轻链之组合的抗体：
(i)重链包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列或其片段；
(ii)重链包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或其片段；
(iii)重链包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列或其片段；
(iv)重链包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或其片段；
(v)重链包含SEQ ID NO：17所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段；
(vi)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列或其片段；
(vii)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列或其片段；
(viii)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列或其片段；
(ix)重链包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或其片段；以及
(x)重链包含SEQ ID NO：51所示氨基酸序列或其片段，且轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段。
根据(ii)、(v)或(x)的抗体是“具有与CLDN18.2结合之能力的抗体”的一些优选实施方案。特别优选根据(v)或(x)的抗体。
如上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗体序列的一部分，即，表示在N端和/或C端缩短的抗体序列的序列，其当替代抗体中的所述抗体序列时保留所述抗体与CLDN18.2的结合。优选地，氨基酸序列的片段包含来自所述氨基酸序列的至少80％，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸残基。选自SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和51的氨基酸序列的片段优选涉及其中在N端的17、18、19、20、21、22或23个氨基酸被除去的所述序列。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34的氨基酸序列及其片段。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42、43的氨基酸序列及其片段。
在某些优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合：
(i)VH包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：36所示氨基酸序列或其片段；
(ii)VH包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段；
(iii)VH包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：37所示氨基酸序列或其片段；
(iv)VH包含SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：40所示氨基酸序列或其片段；
(v)VH包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段；
(vi)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列或其片段；
(vii)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：41所示氨基酸序列或其片段；
(viii)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：42所示氨基酸序列或其片段；
(ix)VH包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或其片段，且VL包含SEQ ID NO：43所示氨基酸序列或其片段。
根据(ii)或(v)的抗体是“具有与CLDN18.2结合之能力的抗体”的一些优选实施方案。特别优选根据(v)的抗体。
根据本发明，术语“片段”特别是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或更多个互补性决定区(CDR)选自互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组。在一个特别优选的实施方案中，术语“片段”是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VH，所述VH包含选自以下实施方案(i)至(vi)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)CDR1：SEQ ID NO：14的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：14的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：14的第116至125位；
(ii)CDR1：SEQ ID NO：15的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：15的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：15的第116至126位；
(iii)CDR1：SEQ ID NO：16的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：16的笫70至77位，CDR3：SEQ ID NO：16的第116至124位；
(iv)CDR1：SEQ ID NO：17的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：17的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：17的第116至126位；
(v)CDR1：SEQ ID NO：18的第44至51位，CDR2：SEQ ID NO：18的第69至76位，CDR3：SEQ ID NO：18的第115至125位；以及
(vi)CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VL，所述VL包含选自以下实施方案(i)至(ix)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)CDR1：SEQ ID NO：20的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：20的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：20的笫115至123位；
(ii)CDR1：SEQ ID NO：21的第49至53位，CDR2：SEQ ID NO：21的第71至73位，CDR3：SEQ ID NO：21的第110至118位；
(iii)CDR1：SEQ ID NO：22的笫47至52位，CDR2：SEQ ID NO：22的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：22的第109至117位；
(iv)CDR1：SEQ ID NO：23的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：23的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：23的第115至123位；
(v)CDR1：SEQ ID NO：24的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：24的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：24的笫115至123位；
(vi)CDR1：SEQ ID NO：25的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：25的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：25的第115至122位；
(vii)CDR1：SEQ ID NO：26的笫47至58位，CDR2：SEQ ID NO：26的笫76至78位，CDR3：SEQ ID NO：26的第115至123位；
(viii)CDR1：SEQ ID NO：27的第47至58位，CDR2：SEQ ID NO：27的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：27的第115至123位；以及
(ix)CDR1：SEQ ID NO：28的笫47至52位，CDR2：SEQ ID NO：28的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：28的第109至117位。
在一个优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含VH和VL的组合，所述VH和VL各自包含选自以下实施方案(i)至(ix)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组：
(i)VH：CDR1：SEQ ID NO：14的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：14的笫70至77位，CDR3：SEQ ID NO：14的第116至125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：21的第49至53位，CDR2：SEQ IDNO：21的第71至73位，CDR3：SEQ ID NO：21的第110至118位；
(ii)VH：CDR1：SEQ ID NO：15的笫45至52位，CDR2：SEQ ID NO：15的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：15的第116至126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：20第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：20的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：20的第115至123位；
(iii)VH：CDR1：SEQ ID NO：16的笫45至52位，CDR2：SEQ ID NO：16的第70至77位，CDR3：SEQ ID NO：16的第116至124位，VL：CDR1：SEQ ID NO：22的第47至52位，CDR2：SEQ IDNO：22的笫70至72位，CDR3：SEQ ID NO：22的第109至117位；
(iv)VH：CDR1：SEQ ID NO：18的第44至51位，CDR2：SEQ ID NO：18的第69至76位，CDR3：SEQ ID NO：18的第115至125位，VL：CDR1：SEQ ID NO：25的笫47至58位，CDR2：SEQ IDNO：25的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：25的第115至122位；
(v)VH：CDR1：SEQ ID NO：17的第45至52位，CDR2：SEQ ID NO：17的笫70至77位，CDR3：SEQ ID NO：17的笫116至126位，VL：CDR1：SEQ ID NO：24的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：24的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：24的第115至123位；
(vi)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：23的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：23的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：23的第115至123位；
(vii)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的笫71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：26的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：26的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：26的第115至123位；
(viii)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的第117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：27的第47至58位，CDR2：SEQ IDNO：27的第76至78位，CDR3：SEQ ID NO：27的第115至123位；以及
(ix)VH：CDR1：SEQ ID NO：19的第45至53位，CDR2：SEQ ID NO：19的第71至78位，CDR3：SEQ ID NO：19的笫117至128位，VL：CDR1：SEQ ID NO：28的笫47至52位，CDR2：SEQ IDNO：28的第70至72位，CDR3：SEQ ID NO：28的第109至117位。
根据(ii)或(v)的抗体是“具有与CLDN18.2结合之能力的抗体”的一些优选实施方案。根据(v)的抗体是特别优选的。
在另一些优选实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选包含针对CLDN18.2的单克隆抗体(优选本文中所述的针对CLDN18.2的单克隆抗体)的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区，并且优选地包含本文中所述的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或更多个互补性决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或更多个互补性决定区(CDR)选自本文中所述的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3的组。在一个特别优选的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体优选包含针对CLDN18.2的单克隆抗体(优选本文中所述的针对CLDN18.2的单克隆抗体)的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3，并且优选地包含本文中所述的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，本文中所述的包含一个或更多个CDR、CDR组或CDR组的组合的抗体包含所述CDR以及其间插框架区。优选地，该部分将还包括第一区和第四框架区中任一个或两个的至少约50％，该50％是第一框架区的C端50％和第四框架区的N端50％。通过重组DNA技术进行抗体构建可导致在可变区的N端或C端引入由为了便于克隆或其他操作步骤而引入的接头编码的残基，包括引入将本发明的可变区与另外的蛋白质序列(包括免疫球蛋白重链、其他可变区(例如在双链抗体的产生中)或蛋白质标记)连接的接头。
在一个实施方案中，本文中所述的包含一个或更多个CDR、CDR组或CDR组的组合的抗体包含在人抗体框架中的所述CDR。
本文中提及抗体关于其重链包含特定链或特定区域或序列优选地涉及其中所述抗体的所有重链都包含所述特定链、区域或序列的情况。这相应地适用于抗体的轻链。
在一个实施方案中，根据本发明具有与CLDN18.2结合之能力的抗体涉及与本文中所述的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位(即与其结合)和/或与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合的抗体。
根据本发明，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体(特别是当存在于抗体-药物缀合物中时)优选对CLDN18.2具有适合于允许抗体和/或抗体-药物缀合物的胞吞的亲和力和/或特异性。
术语“胞吞”是指其中真核细胞将质膜片段、细胞表面受体和来自细胞外流体的组分内化的过程。胞吞机制包括受体介导的胞吞。术语“受体介导的胞吞”是指一种生物学机制，通过该机制，配体在与其靶标结合之后触发膜内陷和夹紧，被内化并递送到细胞溶质中或转移至合适的细胞内区室。
本发明还考虑以下实施方案，其中“具有与CLDN18.2结合之能力的抗体”具有涵盖任何“CLDN18.2的结合剂”的含义。根据本发明，“CLDN18.2的结合剂”包括对CLDN18.2具有结合能力的任何化合物。优选地，这样的结合剂包含至少一个CLDN18.2的结合结构域。该术语包括对CLDN18.2具有结合能力的所有人工结合分子(支架)，包括但不限于纳米抗体(nanobody)、亲和体(affibody)、anticalin、DARPin、单体(monobody)、avimer和微体(microbody)。在一个实施方案中，所述结合剂与CLDN18.2的细胞外结构域结合。在一个实施方案中，所述结合剂与存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位结合。在一个实施方案中，所述结合剂与CLDN18.2的第一细胞外环结合。在一个实施方案中，所述与CLDN18.2的结合是特异性结合。
术语“结合结构域”结合本发明表征与给定靶结构/抗原/表位结合/相互作用的(例如抗体的)结构。因此，根据本发明的结合结构域表示“抗原相互作用位点”。
对癌细胞发挥治疗作用的任何药剂均可用作与抗CLDN18.2抗体或其衍生物缀合的药物。优选地，如本文所讨论的，药物的缀合不会改变或显著改变抗体的结合特征，特别是特异性。因此，根据本发明的抗体-药物缀合物优选与用于缀合的抗体具有相同或基本上相同的结合特征，特别是特异性。因此，如果本文中描述了用于缀合的抗体的某些结合特征，则优选地抗体-药物缀合物也具有这样的结合特征。例如，如果描述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的细胞外结构域结合和/或与CLDN18.2的第一细胞外环结合，则优选地抗体-药物缀合物也与CLDN18.2的细胞外结构域结合和/或与CLDN18.2的第一细胞外环结合。
通常来说，药物是细胞毒性剂或细胞抑制剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害并且特别地杀伤细胞的任何药剂。
细胞毒性剂的可用类别包括例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类(enediyne)和lexitropsin)、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学治疗增敏剂、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体(ionophore)、亚硝基脲、platinol、形成前化合物(pre-forming compound)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、甾族化合物、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他塞)、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱类等。
单独细胞毒性剂包括例如雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、细胞松弛素B、达卡巴嗪、更生霉素(以前为放线菌素)、柔红霉素、达卡巴嗪、多西他塞、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、二氯甲基二乙胺(mechlorethanmine)、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼(procarbizine)、链脲菌素、替尼泊苷(tenoposide)、6-硫鸟嘌呤、硫代TEPA、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和VM-26。
抗微管蛋白剂的实例包括但不限于：多拉司他汀(例如，奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)、美登木素生物碱、紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他塞)、T67(Tularik)、长春花生物碱类(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)、巴卡亭衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和colcimid、雌莫司汀、念珠藻素(cryptophysin)、西马多丁、考布他汀、圆皮海绵内酯(discodermolide)和软珊瑚素(eleutherobin)。
在一些具体实施方案中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是奥瑞他汀E(在本领域中也称为多拉司他汀-10)或其衍生物。通常来说，奥瑞他汀E衍生物是例如在奥瑞他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，可以使奥瑞他汀E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，分别产生AEB和AEVB。另一些典型的奥瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。
在某些实施方案中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是美登木素生物碱，另一组抗微管蛋白剂。例如，在一些具体实施方案中，美登木素生物碱是美登素(maytansine)、DM-1或DM-4。
美登木素生物碱是强效的微管靶向化合物，其抑制有丝分裂时细胞的增殖。美登木素生物碱是美登素的衍生物，其是与氯化苯环连接的19元柄型大环内酯结构(19-membered ansa macrolide structure)。美登素具有下式：
发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。在例如通过引用并入本文的美国专利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,362,663和4,371,533，以及Kawai等(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451中已经报道了合成美登醇和美登醇类似物。
美登木素生物碱是本领域公知的，并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。根据本发明的特别优选的美登木素生物碱是美登素的含巯基衍生物，例如DM1和DM4。美登素的这样的含巯基衍生物包括其中与羰基结合的甲基被含有游离巯基的基团(例如基团R-SH)代替的化合物，其中R表示亚烷基或其他含碳的原子基团。
DM1，也称为mertansine，是具有下式的美登木素生物碱：
特别地，术语“mertansine”或“DM1”是指化合物N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素。
“DM4”是指化合物N2′-脱乙酰基-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素。
抗CLDN18.2抗体-美登木素生物碱缀合物可通过将抗CLDN18.2抗体与美登木素生物碱分子化学连接而不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性来制备。每个抗体分子可缀合平均3至4个美登木素生物碱分子，但是预期即使一分子的毒素/抗体相对于使用裸抗体也增强细胞毒性。
在这方面，术语“与至少一种毒素药物部分共价连接的抗体”包括其中相同药物的一个或更多个分子与抗体分子共价连接以及其中不同药物与抗体分子共价连接的情况。在后一种情况下，每种不同药物的一个或更多个分子可与抗体分子连接，或其组合(例如，连接一种药物的一个分子，同时连接另一种药物的数个分子)。
在本发明的一些实施方案中，抗体与多拉司他汀或多拉司他汀(dolostatin)肽类似物和衍生物(奥瑞他汀)(美国专利No.5,635,483、5,780,588，其通过引用并入本文)缀合。奥瑞他汀是多拉司他汀10的合成类似物，多拉司他汀10是从海洋软体动物截尾海兔(Dolabela auricularia)获得的天然产物。类似于美登木素生物碱，奥瑞他汀也是微管破坏剂。多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端与抗体连接。
示例性的奥瑞他汀实施方案包括优选N端连接的单甲基奥瑞他汀药物部分，例如MMAE和MMAF。
MMAE，也称为单甲基奥瑞他汀E，具有下式：
特别地，术语“MMAE”是指化合物(S)-N-((3R，4S，5S)-1-((S)-2-((1R，2R)-3-(((1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺。MMAE实际上是去甲基-奥瑞他汀E，即N端氨基仅具有一个甲基取代基而不是如在奥瑞他汀E本身中的两个。
根据本发明特别优选的是抗体-vc奥瑞他汀缀合物，例如抗体-vcMMAE缀合物。根据本发明，术语“抗体-vc奥瑞他汀”或“vcMMAE”是指包含通过接头与抗体连接的奥瑞他汀(例如MMAE)的抗体-药物缀合物(ADC)，所述接头包含可经溶酶体切割的二肽，缬氨酸-瓜氨酸(valine-citrulline，vc)。
也称为单甲基奥瑞他汀F的MMAF是指化合物(S)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸。
抗体-药物缀合物的产生可通过技术人员已知的任何技术来实现。抗体-药物缀合物可根据常规技术通过使药物与抗体结合来制备。抗体和药物可通过其自身接头基团直接彼此结合或者通过接头或其他物质间接彼此结合。
许多不同反应可用于药物与抗体的共价连接。通常来说，这通过抗体分子的氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基团、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基和芳香族氨基酸的多种部分)的反应完成。共价连接的最常用非特异性方法之一是将化合物的羧基(或氨基)与抗体的氨基(或羧基)连接的碳二亚胺反应。另外地，双官能剂(例如二醛或亚氨酸酯)已经用于将化合物的氨基与抗体分子的氨基连接。席夫碱(Schiff base)反应也可用于药物与抗体的连接。该方法涉及包含二醇或羟基的药物的高碘酸氧化，因此形成醛，其随后与抗体分子反应。连接通过与抗体分子的氨基形成席夫碱而发生。异硫氰酸酯也可以用作用于将药物与抗体共价连接的偶联剂。另一些技术是技术人员已知的，并且在本发明范围内。
存在许多本领域已知的用于制备抗体-药物缀合物的连接基团。接头优选地包含与抗体和药物中一种或两者反应的一种或更多种官能团。官能团的实例包括氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺和吡啶基。
在本发明的一个实施方案中，抗体通过双官能交联试剂与药物连接。本文中使用的“双官能交联试剂”是指具有两个反应基团(其中一个能够与抗体反应而另一个能够与药物反应以将抗体与药物连接从而形成缀合物)的试剂。任何合适的双官能交联试剂均可以结合本发明使用，只要接头试剂提供药物的保留(例如细胞毒性)和抗体的靶向特征即可。优选地，接头分子通过化学键将药物与抗体连接，使得药物与抗体彼此化学偶联(例如，共价键合)。
在一个实施方案中，双官能交联试剂包含不可切割的接头。不可切割的接头是能够以稳定的共价方式将药物(例如美登木素生物碱)与抗体连接的任何化学部分。优选地，不可切割的接头在生理条件下(特别是在细胞内)是不可切割的。因此，不可切割的接头在药物或抗体保持活性的条件下对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割具有显著抗性。在药物与抗体之间形成不可切割接头的合适交联试剂是本领域中公知的。在一个实施方案中，药物通过硫醚键与抗体连接。
在一个特别优选的实施方案中，连接试剂是可切割的接头。优选地，可切割的接头在生理条件下(特别是在细胞内)是可切割的。合适可切割接头的实例包括二硫化物接头、酸不稳定性接头、光不稳定性接头、肽酶不稳定性接头和酯酶不稳定性接头。
接头的实例包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、3-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、6-马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、对氨基苄氧基羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。还可使用肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)，并且上述任何接头均可以以合适的组合使用。
包含二硫化物的接头是可通过可在生理条件下发生的二硫化物交换切割的接头。在另一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯))和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。
酸不稳定性接头是在酸pH下可切割的接头。例如，某些细胞内隔室(例如内体和溶酶体)具有酸性pH(pH 4至5)，并且提供适于切割酸不稳定性接头的条件。酸不稳定性接头在中性pH条件(例如血液中的那些)下是相对稳定的，但是在低于pH 5.5或5.0下是不稳定的。例如，可以使用腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯(orthoester)、缩醛、缩酮等。
光不稳定性接头可用于身体表面和许多光可及的体腔中。此外，红外光可以穿透组织。
肽酶不稳定性接头可用于在细胞内或细胞外切割某些肽。在一个实施方案中，可切割的接头在温和条件(即细胞毒性剂的活性不受影响的细胞内条件)下被切割。
接头可以是或可以包含例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽基接头。通常来说，肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知其全部都水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内释放。例如，可使用可通过巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B(其在癌组织中高度表达)切割的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头)。在一些具体实施方案中，可通过细胞内蛋白酶切割的肽基接头为缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit；vc)接头或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)接头。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是药剂在缀合后通常是减毒的并且缀合物的血清稳定性通常是高的。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的接头包含在肿瘤细胞内被组织蛋白酶切割的二肽缬氨酸(Val)-瓜氨酸(Cit)(vc)，或由其组成。
在一个实施方案中，药物是美登木素生物碱(例如DM4)，其通过氨基和巯基反应性异双官能蛋白质交联剂与具有与CLDN18.2结合之能力的抗体偶联，所述交联剂与抗体的伯胺(如见于赖氨酸侧链或蛋白质的N端)和美登木素生物碱的巯基反应以产生可逆的二硫键。在一个实施方案中，氨基和巯基反应性异双官能蛋白质交联剂是SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)，其通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与抗体的伯胺(如见于赖氨酸侧链或蛋白质的N端)反应，并通过吡啶基二硫化物基团与DM4的巯基反应以产生可逆二硫键(图1)。
在一个实施方案中，药物是奥瑞他汀类(例如MMAE)，其通过肽接头(例如组织蛋白酶可切割的肽接头，特别是Val-Cit(vc))与具有与CLDN18.2结合之能力的抗体偶联。在一个实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的抗体被硫醇化，例如，被与赖氨酸残基的游离胺反应的异双官能接头2-IT(2-亚氨基硫杂环戊烷)硫醇化。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物包含与DM4(优选通过其巯基)偶联(优选通过其氨基)的含有重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，抗体通过SPDB接头与DM4偶联。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物包含与DM4(优选通过其巯基)偶联(优选通过其氨基)的含有重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，抗体通过SPDB接头与DM4偶联。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物包含与MMAE(优选通过其N端氨基)偶联(优选通过其氨基)的含有重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ IDNO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ IDNO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，抗体通过包含二肽vc的接头与MMAE偶联。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的抗体-药物缀合物包含与MMAE(优选通过其N端氨基)偶联(优选通过其氨基)的含有重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ IDNO：17或51所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQID NO：24所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，抗体通过包含二肽vc的接头与MMAE偶联。
本文中使用的术语“核酸”旨在包括DNA和RNA。核酸可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA或者RNA和蛋白质/肽，其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以瞬时地或稳定地进行。
本文中关于特定氨基酸序列(例如序列表中示出的那些，特别是本文中通过指定SEQ ID NO：提及的那些)给出的教导应解释为还涉及所述特定序列的变体。这样的变体序列可以与所述特定序列在功能上等同，例如显示出与特定氨基酸序列的特性相同或相似的特性的氨基酸序列。一个重要特性是保留抗体与其靶标的结合。优选地，相对于特定序列为变体的序列当其替代抗体中的该特定序列时保留所述抗体与CLDN18.2的结合。
本领域技术人员将理解，特别地，可修饰CDR、高变区和可变区的序列，而不丧失抗体结合CLDN18.2的能力。例如，CDR区与本文中指定的抗体的区域相同或高度同源。“高度同源”意指在CDR中可以进行1至5个、优选1至4个，例如1至3个或1个或2个替换。此外，可以修饰高变区和可变区使得其与本文中具体公开的抗体的区域显示出显著同源性。
根据本发明的术语“变体”特别是指突变体、剪接变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体(species variant)和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义常常是不清楚的。全基因测序通常鉴定出给定基因的多种等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何翻译后修饰的变体和构象变体。
对于本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质的N端和/或C端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。
氨基酸插入变体在特定氨基酸序列中包含单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或更多个氨基酸残基插入到氨基酸序列的特定位点，但是也可以随机插入并适当地筛选所得产物。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或更多个氨基酸，例如在于除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。
氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被除去并且在其位置插入另一个残基。优选的是修饰在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置和/或用具有类似特性的其他氨基酸替代氨基酸。优选地，蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷的氨基酸的替换。保守氨基酸变化涉及其侧链相关的氨基酸的家族中一种的替换。通常来说，天然存在的氨基酸分为以下四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。有时，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸共同地分类为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列(例如本文中通过指定SEQ ID NO：提及的氨基酸序列)与为所述给定氨基酸序列之变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性程度)为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，相似性或同一性程度给予为参考氨基酸序列全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选地相似性或同一性程度给予至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸。在一些优选实施方案中，相似性或同一性程度给予参考氨基酸序列的全长。用于确定序列相似性(优选序列同一性)的比对可以用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如使用Align，采用标准设置(优选地EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，缺口开放10.0，缺口延伸0.5)来进行。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示在最佳比对后获得的两个待比较序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，两个序列之间的差异是随机分布的并且在其整个长度上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规地通过在将这些序列最佳比对后对其进行比较来进行，所述比较通过区段或通过“比较窗”来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除人工外还可如下产生：通过Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法；通过Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法；通过Pearson和Lipman，1988，Proc.NatlAcad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法；或者通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis中)。
同一性百分比如下计算：确定两个比较序列之间的相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。
术语“转基因动物”是指具有包含一个或更多个转基因(优选重链和/或轻链转基因)或转染色体(整合或未整合到动物的天然基因组DNA中)的基因组并且优选能够表达所述转基因的动物。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得当用CLDN18.2抗原和/或表达CLDN18.2的细胞免疫接种时，小鼠产生人抗CLDN18.2抗体。人重链转基因可整合到小鼠的染色体DNA中，如转基因小鼠(例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCol2小鼠)的情况，或者人重链转基因可保持在染色体外，如在WO 02/43478中所述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况。这样的转基因和转染色体小鼠可以能够通过进行V-D-J重组和同种型转换来产生针对CLDN18.2的人单克隆抗体的多种同种型(例如，IgG、IgA和/或IgE)。
本文中使用的“减小”、“降低”或“抑制”意指水平(例如表达水平或细胞增殖水平)的以下总体降低或引起以下总体降低的能力：优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大。
术语例如“提高”或“增强”优选地涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更高。
本文中所述的抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交方法，但是原则上，可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是得到充分确立的方法。免疫接种方案和用于分离用于融合的经免疫接种脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一些优选动物系统是大鼠和兔系统(例如，在Spieker-Polet等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)中进行描述；还参见Rossi等，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。
在另一个优选实施方案中，可使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生人单克隆抗体。这些转基因和转染色小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。可如WO2004 035607中对CD20详细描述的在这样的转基因小鼠中进行人抗体的产生。
用于产生单克隆抗体的另一策略是从产生具有确定特异性的抗体的淋巴细胞直接分离编码抗体的基因，例如，参见Babcock等，1996；A novel strategy for generatingmonoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producing antibodiesof defined specificities。关于重组抗体工程的细节，还参见Welschof和Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.LoAntibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。
为了产生抗体，可以如所述用来自抗原序列(即，抗体针对的序列)的载体缀合肽、重组表达抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞免疫接种小鼠。或者，可用编码抗原或其片段的DNA免疫接种小鼠。如果使用抗原的纯化制备物或富集制备物的免疫接种不产生抗体，还可用表达抗原的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠来促进免疫应答。
可在免疫接种方案的过程中用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品监测免疫应答。具有足够免疫球蛋白效价的小鼠可用于融合。在处死和摘出脾前3天，可用抗原表达细胞腹膜内或静脉内加强小鼠以提高特异性抗体分泌杂交瘤的比例。
为了产生产生单克隆抗体的杂交瘤，可从经免疫接种的小鼠中分离出脾细胞和淋巴结细胞，并将其与合适的永生化细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后，可针对抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。然后可以通过ELISA对单个孔进行筛选以获得分泌抗体的杂交瘤。使用抗原表达细胞通过免疫荧光和FACS分析，可以鉴定对抗原具有特异性的抗体。可将分泌抗体的杂交瘤重新平板接种，再次筛选，并且如果对单克隆抗体仍呈阳性，则可通过有限稀释进行亚克隆。然后，可在组织培养基中体外培养稳定的亚克隆以产生抗体用于表征。
如本领域中公知的，还可使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生抗体(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，在一个实施方案中，可将目的基因(例如，抗体基因)连接到表达载体(例如，真核表达质粒)中，例如WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS基因表达系统或本领域公知的其他表达系统所使用的。可将具有所克隆抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞(例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞或者作为替代的其他真核细胞(如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞))中。用于引入这些基因的方法可以是本领域中所述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以鉴定并选择表达抗体的细胞。这些细胞代表随后可根据其表达水平扩增并扩大规模以生产抗体的转染瘤。可从这些培养物上清液和/或细胞中分离并纯化重组抗体。
或者，可在其他表达系统(包括原核细胞，例如微生物，如大肠杆菌(E.coli))中表达克隆的抗体基因。此外，抗体可在非人转基因动物中(例如在来自绵羊和兔的乳中或在来自母鸡的卵中)产生，或者在转基因植物中产生；参见例如，Verma，R.，等(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，等(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；以及Fischer，R，等(1999)Biol.Chem.380：825-839。
嵌合
如果相应的抗体是嵌合的或人源化的，则可以降低或完全避免人中鼠抗体的免疫原性。嵌合抗体是这样的抗体，其不同部分来自不同的动物物种，例如具有来自鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。通过将鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接实现抗体的嵌合(例如，如Kraus等，在Methods in Molecular Biology series中，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8所述)。在一个优选实施方案中，通过将人κ-轻链恒定区连接到鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。在一个同样优选的实施方案中，可通过将人λ-轻链恒定区连接到鼠轻链可变区来产生嵌合抗体。用于产生嵌合抗体的优选重链恒定区是IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合抗体的另一些优选重链恒定区是IgG2、IgA、IgD和IgM。
人源化
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补性决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDR内的氨基酸序列较CDR外的序列在个体抗体之间更多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含接枝到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列(参见，例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；以及Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为其不包含在B细胞成熟期间由V(D)J连接形成的完全组装的可变基因。种系基因序列将也不同于高亲和力次级库抗体单独地均匀分布在可变区的序列。
可使用标准结合测定(例如，ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)来确定抗体结合抗原的能力。
为了纯化抗体，可将所选择的杂交瘤在两升旋转瓶中培养以纯化单克隆抗体。或者，可以在基于透析的生物反应器中产生抗体。可将上清液过滤并(如有需要的话)浓缩，之后用蛋白G琼脂糖或蛋白A琼脂糖进行亲和色谱。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检查经洗脱的IgG，以确保纯度。可将缓冲溶液更换成PBS，并可以使用1.43消光系数通过OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等分试样并贮存于-80℃。
为了确定所选择的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用定点诱变或多位点定向诱变。
为了确定抗体的同种型，可用多种商业试剂盒(例如Zymed，Roche Diagnostics)进行同种型ELISA。可用抗小鼠Ig包被微量滴定板的孔。封闭后，使板与单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应2小时。然后可使孔与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3、IgA或小鼠IgM特异性过氧化物酶缀合探针反应。洗涤后，可用ABTS底物(1mg/ml)使板显色，并在405至650的OD下进行分析。或者，可以如制造商所述使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Roche，目录号1493027)。
为了证明在经免疫接种小鼠的血清中存在抗体或者单克隆抗体与表达抗原的活细胞结合，可以使用流式细胞术。可将天然或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照(在标准培养条件下培养)与在杂交瘤上清液中或在含有1％FBS的PBS中的不同浓度单克隆抗体混合，并且可以在4℃下孵育30分钟。洗涤后，经APC或Alexa647标记的抗IgG抗体可在与一抗染色相同的条件下与抗原结合的单克隆抗体结合。可通过流式细胞术使用FACS仪器利用光和侧向散射特性对单个活细胞设门来分析样品。为了在单测量中区分抗原特异性单克隆抗体与非特异性结合剂，可以采用共转染的方法。瞬时转染有编码抗原和荧光标志物的质粒的细胞可如上所述进行染色。可在与经抗体染色的细胞不同的荧光通道中检测经转染的细胞。由于大多数经转染的细胞表达两个转基因，抗原特异性单克隆抗体优先与表达荧光标志物的细胞结合，而非特异性抗体以相当的比例与未转染的细胞结合。作为流式细胞术测定的补充或替代，可使用利用荧光显微术的作为替代的测定。可完全如上所述准确地染色细胞，并通过荧光显微术检查。
为了证明在经免疫接种小鼠的血清中存在抗体或单克隆抗体与表达抗原的活细胞结合，可使用免疫荧光显微术分析。例如，将自发或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中的标准培养条件下在室载玻片(chamber slide)中培养。然后用甲醇或多聚甲醛固定细胞或不做处理。然后，可使细胞与针对抗原的单克隆抗体于25℃下反应30分钟。在洗涤之后，使细胞与经Alexa555标记的抗小鼠IgG第二抗体(Molecular Probes)于相同条件下反应。然后，通过荧光显微术检查细胞。
可制备来自表达抗原的细胞和合适阴性对照的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜，封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗小鼠IgG过氧化物酶检测IgG结合并用ECL底物显色。
还可以按照技术人员公知的方式，通过免疫组织化学来测试抗体与抗原的反应性，例如，使用来自在常规外科手术操作期间从患者获得或者从携带接种有自发或在转染后表达抗原之细胞系的异种移植肿瘤的小鼠获得的非癌组织或癌组织样品的经多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或经多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片。对于免疫染色，可孵育与抗原反应的抗体，然后根据供应商的说明孵育辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(DAKO)。
还可在体内模型中(例如，在携带接种有表达(例如DAN-G、SNU-16或KATO-III)或在转染后表达(例如HEK293)CLDN18.2之细胞系的异种移植肿瘤的免疫缺陷型小鼠中)测试结合CLDN18.2的抗体缀合物以确定其控制CLDN18.2表达肿瘤细胞生长的效力。
可将抗体缀合物施用于无肿瘤小鼠，随后注射肿瘤细胞以测量抗体缀合物预防肿瘤形成或肿瘤相关症状的作用。可将抗体缀合物施用于荷瘤小鼠以确定相应抗体缀合物降低肿瘤生长、转移或肿瘤相关症状的治疗效力。抗体缀合物施用可与其他物质(例如细胞抑制性药物、生长因子抑制剂、细胞周期阻滞剂、血管生成抑制剂或其他抗体)的施用组合，以确定组合的协同效力和潜在毒性。为了分析由抗体缀合物介导的毒性副作用，可用抗体缀合物或对照试剂接种动物，并彻底研究可能与CLDN18.2抗体缀合物治疗相关的症状。体内施用CLDN18.2抗体缀合物的可能副作用特别地包括在表达CLDN18.2之组织(包括胃)的毒性。
由抗体识别的表位的作图可按照在″Epitope Mapping Protocols(Methods inMolecular Biology)，Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9中和在″Epitope Mapping：APractical Approach″Practical Approach Series，248，Olwyn M.R.Westwood，FrankC.Hay中详细描述进行。
本文中所述的化合物和药剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
药物组合物优选是无菌的并且含有有效量的本文中所述的抗体缀合物以及任选地本文中所讨论的其他药剂以产生期望反应或期望效果。
药物组合物通常以均匀剂型提供，并且可以以本身已知的方式制备。药物组合物可以例如是溶液剂或混悬剂的形式。
药物组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，其全部优选是可药用的。术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
不可药用的盐可用于制备可药用的盐，并且包括在本发明中。这类可药用盐以非限制性方式包含由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物的合适缓冲物质包括盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。
用于药物组合物的合适防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
可注射制剂可包含可药用的赋形剂，例如乳酸林格液(Ringer lactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括适用于向患者施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
用于肠胃外施用的可能的载体物质是例如无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。
在本文中使用的术语“赋形剂”旨在表示可存在于药物组合物中但不是活性成分的所有物质，例如如载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
本文中所述的药剂和组合物可通过任何常规途径施用，例如，通过肠胃外施用，包括通过注射或输注。施用优选肠胃外(例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内)进行。
适于肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其优选与接受者的血液等张。相容性载体和溶剂的实例是林格液和等张氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的固定油作为溶液剂或混悬剂介质。
本文中所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病的进程。这包括减缓疾病的进展，以及特别是中断或逆转疾病的进展。在治疗疾病或病症中期望的反应也可以是延迟发作或预防所述疾病或所述病症的发作。
本文中所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症、疾病严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型大小和体重)、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果存在的话)、具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的药剂的施用剂量可取决于多个这样的参数。在初始剂量下患者中反应不充足的情况下，可使用更高剂量(或者通过不同的更局部施用途径来实现有效更高的剂量)。
本文中提供的药剂和组合物可以单独或与常规治疗方案(例如外科手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的))组合使用。
癌症的治疗代表其中尤其期望组合策略的领域，因为两种、三种、四种或甚至更多种癌症药物/治疗的组合作用经常产生比单一治疗方法的影响显著更强的协同作用。因此，在本发明的另一个实施方案中，癌症治疗可以有效地与多种其他药物组合。其中有例如与常规肿瘤治疗、多表位策略、另外的免疫治疗和靶向血管生成或凋亡的治疗方法的组合(综述参见例如，Andersen等2008：Cancer treatment：the combination of vaccinationwith other therapies.Cancer Immunology Immunotherapy，57(11)：1735-1743)。不同药剂的依次施用可抑制不同检查点的癌细胞生长，而另一些药剂可例如抑制新血管生成、恶性细胞的存活或转移，潜在地将癌症转化为慢性疾病。
本文中所述的药剂和组合物可以例如在体内施用于患者，以治疗或预防多种病症，例如本文中所述的那些。优选的患者包括患有可通过施用本文中所述的药剂和组合物而被矫正或改善的病症的人患者。这包括涉及以CLDN18.2的改变的表达模式为特征的细胞的病症。
例如，在一个实施方案中，本文中所述的药剂和组合物可以用于治疗患有癌症疾病(例如如本文中所述以存在表达CLDN18.2的癌细胞为特征的癌症疾病)的患者。
根据本发明描述的药物组合物和治疗方法也可用于免疫接种或疫苗接种以预防本文中所述的疾病。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：材料和方法
1.胞吞
CLDN18.2结合的IMAB362的胞吞使用基于细胞毒性的胞吞测定来确定，所述测定依赖于靶标结合抗体和皂草毒蛋白缀合的抗人或抗小鼠IgG Fab片段(Fab-ZAP人，Advanced Targeting Systems，IT-51，Lot：#93-23；Fab-ZAP小鼠，Advanced TargetingSystems，IT-48，Lot：#93-21)的共内化。皂草毒蛋白是核糖体失活蛋白，其在内化后抑制蛋白质生物合成，并且因此导致细胞死亡。为了保证最佳细胞裂解，与靶抗体相比，Fab-ZAP抗体以至少6倍摩尔浓度施用。
用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，25300-054)收获稳定转染的HEK293～CLDN18.2细胞，并将2.5×103个细胞/孔接种在96孔细胞培养板中的50μl生长培养基中。24小时后，将经在细胞培养基中稀释的25μl Fab-ZAP和25μl抗CLDN18.2mAB或同种型对照抗体添加至细胞(表1)。将细胞再培养72小时。
表1：用于胞吞测定的抗CLDN18.2mAB和Fab-ZAP浓度。
分子量：IMAB362为约150kDa，FabZAP为110kDa.
如6中所述分析细胞生存力。使用在Fab-ZAP存在下不用抗体孵育的细胞作为对照。
2.表位作图
通过流式细胞术(参见5)对瞬时过表达CLDN18.2突变体的HEK293T细胞分析负责CLDN18.2特异性的抗原表位。通过PCR产生总共8种CLDN18.2突变体，其在第一细胞外结构域内具有单个氨基酸替换。因此，用同源蛋白质CLDN18.1在对应位置的氨基酸替换CLDN18.2的氨基酸。用编码特定CLDN18.2突变体和作为报道基因的EGFP的质粒共转染HEK293T细胞。以5μg/ml的浓度测试纯化的抗体，而在测试前将从杂交瘤上清液获得的抗体稀释高至1∶4。为了确定抗体结合是否受特定氨基酸替换影响，在表现出最高MFI值的突变体和目的突变体之间比较在经转染(EGFP阳性)细胞群体中测量的平均荧光强度(meanfluorescence intensity，MFI)。如果目的突变体的MFI低于50％，则氨基酸残基被表征为对于抗体结合和CLDN18.2特异性是必需的。
3.抗体药物缀合物
在Piramal Healthcare(Grangemouth，UK)进行DM4和vcMMAE与单克隆抗体IMAB362(批号p412118)的缀合和分析表征。在下面部分中简要描述这些方法：
DM4通过SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)与IMAB362偶联。SPDB试剂是氨基和巯基反应性异双官能蛋白质交联剂，其通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与抗体的伯胺(如见于赖氨酸侧链或蛋白质的N端)反应并通过吡啶基二硫基与DM4的巯基反应，产生可逆二硫键(图1)。简言之，对于DM4缀合，使用超离心过滤器将IMAB362渗滤到PBS缓冲液(pH 7.2)中，并以1∶6的摩尔比(IMAB362：SPDB)与SPDB在室温(RT)下偶联1小时。将经修饰的抗体针对35mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)透析，并确定接头与抗体的比例。使DM4以1∶6的摩尔比(IMAB362-SPDB：DM4)与IMAB362-SPDB在2℃至8℃下缀合19小时。将缀合的抗体调换到储存缓冲液(20mM His，85mg/ml蔗糖，pH 5.8)中并储存在-80℃。通过UV光谱分析药物抗体比例，通过SEC-HPLC分析单体含量，并通过RP-HPLC分析游离药物含量。
使vcMMAE与硫醇化IMAB362偶联。因此，将IMAB362初始用与赖氨酸残基的游离胺反应的异双官能接头2-IT(2-亚氨基硫杂环戊烷)硫醇化。然后，使包含组织蛋白酶可切割肽接头Val-Cit(vc)的vcMMAE通过缬氨酸与硫醇化抗体的巯基缀合(图1)。简言之，使用超离心过滤器将IMAB362渗滤到PBS缓冲液(pH 7.2)中，并与2-IT以1∶20的摩尔比(IMAB362：2-IT)在室温下孵育2小时。将经修饰的抗体透析至35mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，并确定接头与抗体的比例。此后，通过在2℃至8℃下孵育20小时，使vcMMAE以1∶6的摩尔比(IMAB362-SH：vcMMAE)与硫醇化IMAB362缀合。将缀合的抗体透析至储存缓冲液(20mM His，85mg/mL蔗糖，pH 5.8)中，并储存在-80℃。通过UV光谱分析药物抗体比例，通过SEC-HPLC分析单体含量，并通过RP-HPLC分析游离药物含量。
4.细胞培养
根据供应商的说明和Ganymed细胞系数据表在含有5％或7.5％CO2的加湿培养箱中在37℃下在细胞型特异性培养基中培养细胞系(表2)。细胞培养基和补充剂从Invitrogen、Gibco和Sigma获得。
表2：细胞模型系统。
5.流式细胞术
使用CLDN18.2阳性和阴性细胞系，通过流式细胞术确定抗CLDN18.2裸抗体和抗体药物缀合物的相对结合亲和力和特异性。
用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，25300-054)收获来自指数生长培养物的细胞，并使用Neubauer计数室计数。将细胞以1,500rpm(468×g)离心5分钟，弃去上清液，并将细胞以2×106个细胞/ml重悬于FACS缓冲液中(含有2％FCS(Gibco，10270-106)的PBS，用于分析毒素缀合的抗体；含有2％FCS和2mM EDTA的PBS，用于筛选CLDN18.2反应性裸抗体)。将每孔100μl的细胞悬液(对应于2×105个细胞/孔)转移到圆底96孔微量滴定板中。在1500rpm离心1分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于含有合适浓度(高达20μg/ml，用于相对亲和力测量；或50μl/ml，用于表达对照)的毒素缀合抗体或裸抗体的FACS缓冲液中，并在4℃下孵育30至45分钟(表3)。将细胞以1500rpm离心1分钟，并弃去上清液。在将细胞用FACS缓冲液洗涤三次后，将其重悬于含有APC缀合的抗人IgG(Jackson Immuno Research，109-136-170)或APC缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research，115-136-146)或蛋白L-FITC(1μl/ml，分析chim mAB294)的FACS缓冲液中，并在4℃下孵育30分钟(表3)。孵育后，向每个样品中添加100μl FACS缓冲液，将细胞以1500rpm离心1分钟，并弃去上清液。将使用FACS缓冲液的洗涤步骤重复两次。最后，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中，并使用BD FACS ArrayBioanalyzer确定结合。
应注意的是，以相等的浓度施用毒素缀合抗体和裸抗体。抗体分子量之间的差异被忽略。
表3：流式细胞术实验细节。
6.生存力测定
使用检测细胞代谢活性的比色测定来确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对细胞生存力的作用。该测定基于代谢活性细胞将黄色XTT(2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺)还原成橙色甲(formazan)化合物的能力，这可以通过分光光度法检测。染料的强度与活细胞的数目成比例。
用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，25300-054)收获细胞，将其重悬于细胞培养基中(表2)，并将50μl具有对应量细胞的细胞悬液按照孔接种在96孔细胞培养板中(表4)。24小时后，添加经以合适浓度在50μl培养基中稀释的毒素缀合IMAB362或对照抗体，并将细胞再培养72小时。
表4：生存力测定中使用的细胞系的概述。
细胞系 细胞数目/96孔
NCI-N87～CLDN18.2 6000
NCI-N87 6000
NUGC-4 10cE8 3000
NUGC-4 10cF7-5 sort3a 3000
BxPC-3～CLDN18.2 3000
HEK293～CLDN18.2 2000
HEK293～CLDN18.1 2000
HEK293(CLDN6) 2000
根据制造商的说明使用AppliChem细胞增殖试剂盒II(AppliChem，A8088，1000)分析细胞生存力。在用XTT试剂孵育3至5小时后，使用分光光度计(Tecan)测量480nm处的吸光度(参照630nm)。使用下式计算生存力降低：
空白：培养基对照
对照：无抗体的细胞
样品：具有抗体的细胞
用GraphPad Prism 6使用非线性回归确定EC50值。
7.旁观者测定
通过在存在或不存在CLDN18.2阳性细胞系NUGC-4 10cE8下共培养CLDN18.2阴性萤光素酶表达细胞系PA-1(Luc)来在体外分析毒素缀合IMAB362抗体对靶标阴性细胞的旁观者活性。因此，在补充有10％FCS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中，每孔接种1.5×103个PA-1(Luc)细胞用于单独培养，或与每孔1.5×103个NUGC-4 10cE8细胞一起用于共培养。24小时后，添加IMAB362-DM4、IMAB362-vcMMAE或作为阴性对照的未缀合IMAB362，并将细胞再培养72小时。如6中所述分析细胞生存力。通过测量萤光素酶表达PA-1(Luc)细胞的生物发光来确定靶标阴性细胞的裂解。因此，每孔添加50μl萤光素混合物(在ddH2O中的1.92mg/ml D-萤光素(Sigma，50227)和160mM HEPES)。将板在RT下在黑暗中孵育90分钟，并使用发光计(Infinite M200，TECAN)测量生物发光。结果表示为集成数字相对光单位(relative light unit，RLU)。如6中所述计算生存力降低。
8.动物实验
所有异种移植物研究均按照国家法规和实验动物研究的伦理指导方针进行。将所有动物在独立的通风笼中并在12小时人工光照-黑暗周期下保持在特定无病原体条件下。食物和水是不限量(ad libitum)提供的。研究开始前，允许小鼠适应最少6天。
8.1.最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)研究
通过将在200μl PBS中的8.5×106个BxPC-3～CLDN18.2人胰腺肿瘤细胞皮下注射到雌性Hsd：无胸腺裸Foxn1nu小鼠的胁部来接种异种移植肿瘤。为了确定抗CLDN18.2抗体药物缀合物的MTD和效力，使荷瘤小鼠接受不同剂量的IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE。最大适用剂量受GV-SOLAS推荐用于在小鼠中静脉内注射的抗体浓度和注射体积(约200μl)限制。两种抗体作为单剂量和重复剂量以最大浓度(即，分别为15和16mg/kg)以及该浓度的一半(即，分别为7.5和8mg/kg)施用，或施用载剂对照(组大小：n＝5)。在移植后笫14天静脉内注射抗体，并且对于重复剂量，在移植后笫21天再次注射。每周两次用卡尺监测体重、动物健康状况、行为和肿瘤大小，并根据下式计算肿瘤体积：[长度×宽度×(宽度/2)]。当载剂组的第一肿瘤达到最大值1400mm3时或当肿瘤变得溃烂时(对于IMAB362-DM4，在移植后第49天；对于IMAB362-vcMMAE，在移植后第37天)，解剖所有动物。在用250μl i.p由1.25ml氯胺酮、1ml甲苯噻嗪(2％)和7.75ml H2O组成的混合物开始全身麻醉下收集用于临床化学的血液样品。随后，在全身麻醉下，向小鼠灌注PBS，然后灌注4％福尔马林。将所选的器官和组织(胃、食管、脑、心脏、肾、肝、肺、胰、脾、十二指肠、回肠、结肠、子宫和卵巢)解剖，固定在4％福尔马林中，储存在4℃，并最后进行石蜡包埋。从每个FFPE(经福尔马林固定的经石蜡包埋的)样品中切下三微米的组织切片，并将其封固在黏性载玻片(SuperFrost UltraPlus，Thermo Fisher Scientific)上。在58℃下烘烤60分钟后，使用二甲苯将FFPE组织切片脱石蜡并通过分级乙醇系列(2×100％、2×96％、2×70％乙醇，各3分钟)再水合。用Mayer苏木精在RT下将细胞核染色5分钟，随后在自来水中染成蓝色(blueing)。随后，将细胞质在RT下用0.5％伊红水溶液复染2分钟。在通过分级乙醇系列和二甲苯脱水之后，使用非水性封固剂X-TRA试剂盒封固切片。
8.2.临床生物化学
为了测试可能的器官毒性，在血清样品中分析了胰、肾单位和肝毒性的相关标志。
丙氨酸氨基转移酶/谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamie-pyruvie transaminase，GPT)、天冬氨酸氨基转移酶/谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamie-oxaloaeetietransaminase，GOT)、γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase，γ-GT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、肌酐、肌酐激酶(CK)、尿素、胆碱酯酶、胆红素、脂肪酶、α-淀粉酶、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白和总蛋白的水平在美因茨约翰尼斯·古腾堡大学医学中心(der Johannes Gutenberg (Mainz，Germany))确定。血清样品由在最终取血后获得的血液制成。在将小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后，通过球后静脉穿刺收集血液。
8.3.效力研究
为了建立人异种移植肿瘤，将合适数量的细胞悬浮于200μl PBS的体积中，并皮下注射到雌性Hsd：无胸腺裸Foxn1nu小鼠的胁部。用以不超过MTD的剂量单次静脉内注射IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理荷瘤小鼠。通过约8mg/kg IMAB362的交替IV/i.p.注射每半周一次施用裸抗体对照。在早期处理研究中，在移植后3天开始处理。在晚期处理研究中，使肿瘤生长至50至200mm3的体积，并将小鼠重新分配到在处理前具有均匀肿瘤平均体积的对照组和抗体组。用卡尺每半周一次地监测体重、动物健康状况、行为和肿瘤大小。通过下式计算肿瘤体积：[长度×宽度×(宽度/2)]。中止标准是长度或宽度＞16mm或者计算体积＞1400mm3的肿瘤大小。进一步的中止标准是溃烂性肿瘤或当动物减轻超过10％的体重时。在完全肿瘤生长抑制的情况下，在处理后观察小鼠120天。制备持续的肿瘤并固定在4％福尔马林中用于随后的IHC研究。
9.抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)
通过在存在IMAB362毒素缀合物下在向靶细胞添加人PBMC之后测量未裂解中细胞内ATP的含量来确定抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。将萤光素酶生成的生物发光用于ATP的量化。
在测定前两天，将NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10靶细胞以确定的细胞数(8×106个细胞)接种以获得可重复的汇合。
用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco，25300-054)收获靶细胞，并在含有20mM HEPES(Gibco，15630-056)的生长培养基中调节至1.6×105个细胞/ml的浓度。将每孔8×103个细胞接种到白色的96孔PP板中，并在37℃和5％CO2下孵育约5小时。
由从健康供体获得的新鲜血沉棕黄层(buffy coat)制备PBMC。将约20至25ml的血液在3个Falcon管中用PBS稀释(1∶2)，并小心铺层到四个50ml Falcon管中的15ml Ficol-Paque Plus(GE Healthcare，17144003)上。将梯度离心(25分钟，700×g，具有或不具有制动)。离心后，从间期收集PBMC，在50ml PBS/2mM EDTA中洗涤，离心(5分钟，468×g)，再次重悬于50ml PBS/2mM EDTA中并再次离心(10分钟，208×g)以除去血小板。将沉淀物重悬于50ml PBS/2mM EDTA中，并计数细胞。随后，将PBMC离心(5分钟，468×g)，重悬于含有5％人血清的X-Vivo-15培养基(Lonza，BE04-418Q)中，并在37℃，5％CO2下培养1.5小时。收获PBMC，离心(5分钟，468×g)，并重悬于X-Vivo-15培养基(Lonza，BE04-418Q)中，调节细胞浓度(对于E∶T比例为40∶1)至1.28×107个细胞/ml。将IMAB362-DM4、IMAB362-vcMMAE和IMAB362连续稀释(4.5倍稀释步骤)11次，使得浓度范围为160μg/ml至0.05ng/ml(终浓度为40μg/ml至0.01ng/ml)。将25μl的每种稀释物添加至靶细胞，并且对于每种条件，使用一式四份。将没有抗体的PBS添加至培养基和总裂解对照孔。随后，将25μl制备的PBMC(3.2×105个细胞)添加至每个孔以获得40∶1的E∶T比例，并将板在37℃，5％CO2下孵育15小时±1小时。过夜孵育后，将10μl的8％Triton X-100/PBS溶液添加到最大裂解对照孔中，并向其他孔中添加10μl PBS。最后，向每个孔中添加50μl新鲜制备的萤光素储备溶液(160mM HEPES、1×PBS、3.84mg/ml D-萤光素(Sigma Aldrich，50227))，并将板在黑暗中在室温下孵育90分钟。使用发光计(Infinite M200，TECAN)测量生物发光。结果表示为集成数字相对光单位(relative light unit，RLU)。
比裂解计算如下：
(最多活细胞：10μl PBS，无抗体；总裂解：10μl在PBS中的8％(v/v)Triton X-100，无抗体)
所有ADCC数据都用GraphPad Prism 6使用“log(agonist)vs response-find ECanything”函数进行处理。最大裂解定义为剂量响应曲线的跨度(顶部至底部的差值)，但最大值为100％。
10.补体依赖性细胞毒性(CDC)
通过在存在IMAB362毒素缀合物下在向靶细胞添加人补体之后测量未裂解中细胞内ATP的含量来确定补体依赖性细胞毒性(CDC).作为读出，测量由萤光素酶产生的ATP依赖性生物发光。
在测定前两天，将NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10或KATO-III FGF-BP#12 adMp3151#25靶细胞以确定的细胞数(分别为8×106和9×106个细胞)接种以获得可重复的汇合.
用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞并将其在含有10％(v/v)FCS的各自培养基中调节至1.6×105个细胞/ml的浓度。将8×103个细胞接种到白色96孔板中，并在37℃和5％CO2下孵育。24小时后，添加经在测定培养基(60％RPMI，含有20mM HEPES；40％人血清，从几个健康供体合并)中连续稀释的50μl抗体(终浓度80μg/ml至78.13ng/ml)并将细胞在37℃和5％CO2下孵育80分钟。随后，将10μl在PBS中的8％(v/v)Triton X-100添加至总裂解对照，而向所有其他孔(最多活细胞对照和实际样品)添加10μl PBS。通过每孔添加50μl萤光素混合物(在ddH2O中的3.84mg/ml D-萤光素、160mM HEPES)开始萤光素酶反应。将板在室温下在黑暗中保持90分钟，并使用发光计(Infinite M200，TECAN)测量生物发光。结果表示为集成数字相对光单位(RLU)。
比裂解如下计算：
(最多活细胞：10μl PBS，无抗体；总裂解：10μl在PBS中的8％(v/v)Triton X-100，无抗体)
所有CDC数据都用GraphPad 6使用“Iog(agonist)vs response-find ECanything”函数进行处理。最大裂解定义为剂量响应曲线的跨度(顶部至底部的差值)，但最大值为100％。
实施例2：抗CLDN18.2特异性抗体的胞吞筛选
虽然在用裸抗体进行肿瘤治疗中，靶标结合抗体的内化可降低主要作用模式(例如ADCC和CDC)可及的膜结合抗体的数量，但是胞吞是开发抗体-药物缀合物(ADC)的重要特征。ADC的一个重要特性是靶标-ADC复合物的胞吞。因此，裸抗体的胞吞率是开发毒素缀合抗体的必要关键因素之一。
通过流式细胞术分析确定不同鼠和嵌合抗CLDN18.2抗体的结合特性，即对CLDN18.2的相对亲和力、与CLDN18.1的交叉反应性和介导CLDN18.2特异性的抗原表位(表5和表6)。选择显示与CLDN18.2高度结合的抗体进行进一步的胞吞筛选。
通过将抗体与皂草毒蛋白缀合的Fab片段(Fab-ZAP)以及表达CLDN18.2之HEK293～CLDN18.2细胞一起共孵育来在体外测试不同CLDN18.2特异性和CLDN18.2/CLDN18.1反应性抗体的胞吞效率。在与靶标结合抗体共同内化后，皂草毒蛋白抑制细胞的蛋白质生物合成，导致细胞死亡，这可以通过细胞生存力测定来监测。该方法是评估靶标抗体复合物的胞吞的间接方式。当可利用时，将抗体作为嵌合抗体进行测试，否则用鼠抗体进行胞吞筛选。
chim mAb362(IMAB362)以及chim mAB294可以在CLDN18.2结合后高效地内化，导致即使在非常低的抗体浓度下也降低HEK293～CLDN18.2细胞生存力(IMAB362：EC50＝11ng/ml；chim mAB294：EC50＝10ng/ml)。相比之下，chim mAB308和chim mAB359未降低细胞生存力(图2)。由于chim mAB294和chim mAB359显示出相似的相对结合亲和力而在内化中显示出相当大的差异(chim mAB294：EC50＝10ng/ml；chim mAB359：无胞吞)，胞吞的效率看来不仅与抗体结合亲和力相关联，而且还取决于结合表位。
甚至mu mAB362的内化优于所有其他受试鼠CLDN18.2反应性抗体，其在Fab-Zap测定中未显示出显著胞吞(图3)。
总之，CLDN18.2特异性抗体IMAB362和chim mAB294在与CLDN18.2结合后高效内化，并且适用于作为抗体药物缀合物进一步评价。
表5：CLDN18.2反应性抗体的相对结合亲和力和特异性。
与CLDN18.2的结合(归一化EC50[％]和归一化最大结合[％]相对于IMAB362归一化)和CLDN18.1反应性在稳定表达相应蛋白质的HEK293细胞上通过流式细胞术确定.负责CLDN18.2特异性的抗原表位在瞬时过表达相应CLDN18.2突变体的HEK293T细胞上通过流式细胞术分析。n.a.：未分析。用相同数字(1、2、3或4)标记的抗体在相同的结合测定中测试。1-3：用APC缀合的二抗检测；4：用蛋白L-FITC检测；n.a.：未分析.
表6：CLDN18.2特异性抗体的相对结合亲和力和胞吞。
分别使用流式细胞术和Fab-ZAP测定针对结合和胞吞示出了相对于IMAB362归一化的相对结合亲和力[％]、最大结合[％]或最大生存力降低[％]。用相同数字(1或2)标记的抗体在相同的结合测定中测试。在一个细胞生存力测定中使用用1或2标记的抗体一起进行内化的间接评估，在第二细胞生存力测定中使用用3标记的抗体进行。1：用APC缀合的二抗检测；2和3：用蛋白L-FITC检测。
实施例3：IMAB362的毒素缀合
Piramal Healthcare进行毒素缀合，包括最终的缓冲液更换。进行稳定性研究以表明，ADC如果存储在限定储存条件下在一定时间内保持符合要求。使IMAB362通过可切割的缬氨酸-瓜氨酸接头(vc接头)与MMAE缀合，或通过可切割的N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯接头(SPDB接头)与DM4缀合。将IMAB362毒素缀合物在2℃至8℃下储存在储存缓冲液(20mM组氨酸和85mg/ml蔗糖，pH 5.8)中。
表7：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的28天稳定性测试。
DAR：药物抗体比例
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE二者都显示出≥95％的高单体含量和仅低量的游离药物(≤1％)。对于这两种ADC，毒素缀合IMAB362抗体在2℃至8℃的储存温度下的28天稳定性测试都仅显示出单体含量的少量降低和游离药物的低提高。这两种抗体均高效地缀合，并且显示IMAB362-DM4的药物抗体比值为3.2，IMAB362-vcMMAE的药物抗体比值为4.5(表7)。
实施例4：IMAB362-ADC的结合
先前已详细测试了IMAB362的结合特性：
·IMAB362与密封蛋白18剪接变体2(CLDN18.2)的第一细胞外环结合。
·对CLDN18.2的亲和力在低纳摩尔范围内。
·没有观察到与任何CLDN18.2阴性细胞或组织类型的交叉反应性。
·与最紧密相关的家族成员密封蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)无交叉反应性。
使用内源性和异位表达CLDN18.2的细胞系通过流式细胞术将DM4和MMAE缀合的IMAB362抗体的相对结合亲和力与未缀合的IMAB362进行比较。在0.1至20μg/ml范围内的不同抗体浓度下测试结合特性(图4，表8)。
表8：在CLDN18.2阳性细胞系上用IMAB362毒素缀合物进行的结合测定的概述。
Bmax：最大结合，MFI：平均荧光强度
与未缀合的IMAB362相比，DM4和MMAE缀合的IMAB362对内源性和异位表达CLDN18.2的细胞显示出略微降低的相对结合亲和力(图4，表8)。这两种毒素缀合抗体具有非常相似的EC50值，但最大结合值略有不同，其中IMAB362-DM4表现出更高的最大结合(表8)。
对异位过表达CLDN18.2的细胞和对应的CLDN18.2阴性亲本细胞系测试CLDN18.2介导的IMAB362毒素缀合抗体结合(图5，表8)。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的结合严格依赖于其靶分子CLDN18.2的存在(图5)。使用改造为过表达人CLDN18.2或高度同源蛋白质人CLDN18.1的HEK293转染子通过流式细胞术分析结合特异性。HEK293～模拟细胞用作阴性对照(图6，表8)。
IMAB362以及毒素缀合抗体IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE与异位表达人CLDN18.2的HEK293～CLDN18.2细胞以相似的相对亲和力结合(表8)。此外，IMAB362、DM4和MMAE缀合的IMAB362未显示对人CLDN18.1或模拟转染细胞的交叉反应性(图6B和6C)。
实施例5：IMAB362-ADC在体外的效力和特异性
1.对细胞生存力的影响
使用用于分光光度量化代谢活性细胞的基于XTT的比色测定用内源性和异位表达CLDN18.2的数种人胃癌和胰腺癌细胞系测试IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对细胞生存力的影响。在3至16875ng/ml范围内的不同抗体浓度下测试抗肿瘤活性(图7，表9)。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在体外高效抑制胃癌细胞系NUGC-4、NCI-N87～CLDN18.2和胰腺细胞系BxPC-3～CLDN18.2的生存力(图7).这两种IMAB362-毒素缀合物在类似浓度下均抑制内源性表达CLDN18.2的NUGC-4细胞(EC50值：155ng/ml至631ng/ml，最大生存力降低：≥85％)以及异位表达CLDN18.2的BxPC-3～CLDN18.2细胞(EC50值：43至54ng/ml，最大生存力降低：≥83％)和NCI-N87～CLDN18.2细胞(EC50值：75至180ng/ml，最大生存力降低：45％至61％)的细胞生存力(图7，表9)。
表9：在CLDN18.2阳性细胞系上用IMAB362-毒素缀合物进行的细胞生存力测定的概述。
此外，使用NCI-N87 CLDN18.2阴性细胞系和稳定转染的NCI-N87～CLDN18.2细胞系体外测试IMAB362-毒素缀合物的靶标介导的抗肿瘤活性(图8)。IMAB362-vcMMAE仅对CLDN18.2阳性细胞抑制细胞生存力而对CLDN18.2阴性细胞不抑制细胞生存力。因此，IMAB362-vcMMAE的活性严格依赖于CLDN18.2表达(图8)。
使用过表达人CLDN18.2或高度同源蛋白质人CLDN18.1的HEK293转染子分析毒素缀合IMAB362抗体的特异性。用空载体稳定转染的HEK293细胞用作阴性对照(图9)。IMAB362-vcMMAE对CLDN18.2阳性细胞降低细胞生存力，而对CLDN18.2阴性细胞不降低细胞生存力。该效果是严格CLDN18.2特异性的，因为在表达同源蛋白质18.1的细胞上不能观察到对细胞增殖的抑制(图9)。
总之，IMAB362-vcMMAE和IMAB362-DM4在体外表现出相似的效力，并且这两种ADC都能高度有效地抑制数种人胃癌和胰腺癌细胞系的细胞生存力。效果严格取决于靶标表达。
2.旁观者效应
使用由CLDN18.2阳性和阴性细胞系组成的混合肿瘤细胞培养物确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的体外旁观者活性。使用稳定表达萤火虫萤光素酶的靶标阴性PA-1(Luc)细胞作为报道细胞来测量细胞裂解。
萤光素酶表达PA-1(Luc)和萤光素酶阴性NUGC-4细胞的共培养物的萤光素酶活性显示用IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理在靶标阳性NUGC-4细胞存在下非常有效地消除靶标阴性PA-1(Luc)细胞。此外，在不存在CLDN18.2表达细胞下，PA-1(Luc)细胞不受影响(图10)。
总之，IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE ADC能够对邻近CLDN18.2阴性肿瘤细胞诱导旁观者效应。这两种毒素在CLDN18.2阳性癌细胞中均高效地从IMAB362中释放，并且由于其膜通透性而能够对旁观者细胞发挥细胞毒活性。
实施例6：IMAB362-ADC在体内的抗肿瘤效力
1.最大耐受剂量研究
在第一体内实验中，在具有晚期人BxPC-3～CLDN18.2胰腺异种移植肿瘤的裸鼠中确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的最大耐受剂量(MTD)。MTD是指在处理中将产生期望效果而没有不可接受的毒性的最高剂量。
1.1.IMAB362-DM4的MTD
将异位表达人CLDN18.2的BxPC-3～CLDN8.2细胞皮下注射到雌性Hsd：无胸腺裸Foxn1nu小鼠的胁部。在第13天肿瘤达到75±13mm3(平均值±SD)的平均大小后，将小鼠分为对照组和抗体组。分别使小鼠在笫14天通过IV推注接受单剂量的7.5或15mg/kgIMAB362-DM4，或者在第14天和第21天通过IV推注接受重复剂量的15mg/kg IMAB362-DM4。对照组的小鼠在第14天给予载剂。在植入后第49天，处死动物。为了测试毒性，收集血液样品并制备器官，并储存用于进一步的组织病理学研究。
肿瘤生长：
IMAB362-DM4在具有晚期人BxPC-3～CLDN8.2异种移植肿瘤的小鼠中抑制肿瘤生长。在研究的观察期(49天)期间，IMAB362-DM4单次或重复处理在所有经处理的小鼠中都导致几乎完全的肿瘤消退，与剂量无关。因此，单剂量的7.5mg/kg IMAB362-DM4可对完全肿瘤缓解就已足够(图11)。
健康状况：
每周两次监测体重、动物行为和一般键康状况。所有动物在整个实验中都显示出正常的体重(图12)。没有观察到行为异常。然而，由于未知原因，在静脉内施用第二剂量的15mg/kg IMAB362-DM4后，一只动物死亡。
临床化学：
我们确定了丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)碱性磷酸酶(AP)、α-淀粉酶、胆碱酯酶、肌酐激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、脂肪酶、尿素、葡萄糖、总蛋白和白蛋白的血清水平。没有检测到载剂和IMAB362-DM4组之间的差异(图13)。肌酐和γ-谷氨酰转移酶在所有组中都低于检测限(数据未显示)。所有组中的所有动物即使在重复剂量的15mg/kg IMAB362-DM4之后也都显示出肝、肾单位或胰毒性的测试替代标志物的正常血清水平。
总之，15mg/kg IMAB362-DM4(在人中相当于45mg/m2)在单次施用时在小鼠中耐受良好，并且在处理CLDN18.2阳性异种移植物中表现出高抗肿瘤效力。由于浓度和注射体积的限制，更高剂量的静脉内注射是不可行的，并且不能确定最大耐受单剂量。
组织学分析：
对于组织学分析，对来自脑、心脏、肾、肝肺、胰、脾和胃的石蜡切片进行苏木精-伊红染色，并通过显微镜检查IMAB362-vcMMAE介导的形态学变化。与经载剂处理的小鼠相比，在来自经IMAB362-DM4处理的动物的组织切片中没有观察到形态学变化。值得注意的是，表达鼠Cldn18.2的唯一组织没有表现出抗体治疗介导的组织损伤(图14)。
1.2.IMAB362-vcMMAE的MTD
使用用于IMAB362-DM4(1.1)的相同小鼠模型测试IMAB362-vcMMAE的MTD。在第13天肿瘤达到平均大小为111±27mm3(平均值±SD)之后将小鼠分组，并在第14天用单次IV推注8或16mg/kg IMAB362-vcMMAE(在人中相当于24和48mg/m2)或者在第14天和第21天用重复剂量IV推注16mg/kg IMAB362-vcMMAE进行处理。使对照组的小鼠在第14天接受载剂对照。在笫37天处死动物。确定临床生物化学，且收集器官并储存用于进行进一步的组织病理学研究。
肿瘤生长：
在具有晚期人BxPC-3～CLDN8.2异种移植肿瘤的小鼠中，IMAB362-vcMMAE处理诱导肿瘤消退，并且进一步抑制肿瘤生长。在研究结束时(37天)，IMAB362-vcMMAE单次或重复处理在所有经处理小鼠中都导致几乎完全的肿瘤消退，与剂量无关。因此，单剂量的8mg/kgIMAB362-vcMMAE可对完全肿瘤缓解是足够的(图15)。
健康状况：
每周两次监测体重、动物行为和一般健康状况。所有动物在整个实验中都显示出正常的体重(图16)。在第一次注射16mg/kg IMAB362-vcMMAE后，两只动物(来自SD组和来自RD组的一只小鼠)直接淡漠短时间。然而，在任何其他动物中或在第二次施用IMAB362-vcMMAE后未观察到这种异常行为。
临床化学：
我们确定了肝、肾或胰毒性的替代标志物(丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)碱性磷酸酶(AP)、α-淀粉酶、胆碱酯酶、肌酐激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、脂肪酶、尿素、葡萄糖、总蛋白和白蛋白)的血清水平。与载剂对照组相比，在用IMAB362-vcMMAE处理的动物中没有观察到血清替代标志的重大偏差(图17)。肌酐和γ-谷氨酰转移酶在所有组中均低于检测限。因此，在评价的剂量范围内在临床生物化学方面没有观察到肝、胰或肾毒性的迹象。
组织学分析：
对于组织学分析，对来自脑、心脏、肾、肝肺、胰、脾和胃的石蜡切片进行苏木精-伊红染色，并通过显微镜检查IMAB362-vcMMAE介导的形态学变化。
与经载剂处理的小鼠相比，在来自经IMAB362-vcMMAE处理的动物的组织切片中没有观察到IMAB362-vcMMAE相关的形态学变化，表明IMAB362-vcMMAE既不诱导组织损伤也不诱导发炎。值得注意的是，即使是胃，表达鼠Cldn18.2的唯一组织，也没有表现出抗体治疗介导的组织损伤(图22)。
2.效力研究
在皮下植入有内源性或异位表达CLDN18.2之人癌细胞的无胸腺裸Foxn 1nu小鼠中进一步体内分析IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的抗肿瘤作用。在剂量范围发现研究中确定IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在动物肿瘤模型中的最佳治疗剂量(分别为图18和图20)。用IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的最佳剂量进行人异种移植肿瘤的进一步效力研究(分别为图19和图21)。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在不同的早期异种移植模型(在肿瘤植入后3天开始治疗)中以及在晚期实体瘤处理(在约100mm3肿瘤大小时开始治疗)中高度显著地抑制肿瘤生长并改善荷瘤小鼠的存活。
晚期人NCI-N87～CLDN18.2胃异种移植肿瘤的处理：
在剂量范围发现研究中，在具有晚期CLDN18.2阳性NCI-N87～CLDN18.2异种移植肿瘤的小鼠中分析了IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的抗肿瘤效力。在植入后13天，用作为单次IV推注施用的15.2、7.6或3.8mg/kg IMAB362-DM4或者16、8或4mg/kg IMAB362-vcMMAE或者载剂对照处理动物。使来自对照组的动物接受8mg/kg未缀合的IMAB362(每周两次，IV/i.p.)。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE以剂量依赖性方式高度显著地抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，介导其肿瘤消退并延长其存活，而IMAB362裸抗体在该晚期处理模型中没有显示出统计学上显著的抗肿瘤效果(图18)。这两种IMAB362毒素缀合抗体均延长荷瘤小鼠的存活(中位存活：载剂组中为73天，与IMAB362-vcMMAE 16mg/kg中的143天和IMAB362-DM415.2mg/kg组中的136天相比)(图18)。
早期人NUGC-4 10cF7-5sort3a胃异种移植肿瘤的处理：
在皮下植入有内源性表达CLDN18.2之NUGC-4 10cF7-5sort3a胃癌细胞的小鼠中分析IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的抗肿瘤效力。在植入后第3天通过单剂量IV注射15.2mg/kg IMAB362-DM4、16mg/kg IMAB362-vcMMAE或载剂对照处理动物。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE阻止经处理动物中的肿瘤生长，而对照组的所有小鼠均发生肿瘤(p＜0.0001)(图19)。在120天的预定观察时间之后，接受IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE的10只动物中有9只活着且无肿瘤，而来自载剂对照组的所有动物由于中止标准而不得不最晚在植入后第41天实施安乐死(中位存活34天，p＜0.0003)(图19)。
晚期人BxPC-3～CLDN18.2胰腺异种移植肿瘤的处理：
在具有晚期人BxPC-3～CLDN18.2胰腺异种移植肿瘤的小鼠中在剂量范围发现研究中分析IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在体内的剂量依赖性抗肿瘤活性。在第14天用作为单次推注IV注射施用的15.2、7.6或3.8mg/kg IMAB362-DM4，16、8或4mg/kg IMAB362-vcMMAE，载剂，或者用重复剂量的8mg/kg IMAB362(每周两次，IV/i.p.)处理动物。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE以剂量依赖性方式高度显著地抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，介导其肿瘤消退并延长其存活。相比之下，未缀合的IMAB362在该晚期肿瘤模型中没有显示出统计学上显著的抗肿瘤活性(图20)。这两种IMAB362毒素缀合抗体高度显著地延长荷瘤小鼠的存活(中位存活：载剂组中为48天，与IMAB362-vcMMAE 16mg/kg中的98.5天和IMAB362-DM4 15.2mg/kg组中的81天相比)(图20)。
早期人DAN-G 1C5F2胰腺异种移植肿瘤的处理：
在皮下植入有内源性表达CLDN18.2之DAN-G 1C5F2胰腺癌细胞的小鼠中测试IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在体内的抗肿瘤活性。DAN-G 1C5F2细胞在细胞表面仅具有极低量的CLDN18.2；但是可以通过免疫印迹或qRT-PCR检测到大量的蛋白质或RNA。DAN-G1C5F2异种移植肿瘤的IHC分析表明，只有肿瘤细胞亚群显示出中度至强的膜缔合CLDN18.2染色。因此，DAN-G 1C5F2异种移植肿瘤可适于用显示出旁观者杀伤的抗体药物缀合物处理。在植入后第3天通过单剂量IV注射15.2mg/kg IMAB362-DM4、16mg/kg IMAB362-vcMMAE或载剂对照处理动物。
与载剂对照相比，IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE高度显著地抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长其存活(图21)。在大多数小鼠(＞50％)中，肿瘤生长被完全阻止。在120天的观察期后，IMAB362-DM4处理组中7只动物中有2只(中位存活87天，p＝0.0002)和IMAB362-vcMMAE处理组中7只动物中有4只仍然存活(存活不确定，p＝0.0006)，而由于例如癌症恶病质的中止标准，载剂组的所有动物不得不在31天内实施安乐死(中位存活24天)(图21)。IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE二者均显著抑制具有显示异源CLDN18.2表达的异种移植肿瘤的小鼠的肿瘤生长并延长其存活。
总之，可以用IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE高效地处理具有低和/或异源CLDN18.2表达的肿瘤(例如NUGC-4和DAN-G异种移植肿瘤)，并且大部分荷瘤动物被治愈。这两种ADC的抗肿瘤活性可以基于旁观者效应进行解释：在细胞处理后，可透过细胞膜形式的DM4和MMAE的释放有助于杀伤邻近的肿瘤细胞，即使其是靶标阴性的。因此，这两种ADC在根除仅含CLDN18.2阳性细胞级分的肿瘤方面高度有效。
实施例7：凋亡的诱导
通过测量胱天蛋白酶3/7活性和磷脂酰丝氨酸外化的凋亡测定来评价毒素缀合IMAB362的细胞毒性。胱天蛋白酶激活代表最早可测量的凋亡标志之一，其对于程序性细胞死亡的启动是重要的(Henkart 1996)。通过胱天蛋白酶3/7特异性原发光底物(pro-luminogenic substrate)的切割在基于萤光素酶的测定中确定胱天蛋白酶3/7活性。使用荧光缀合的膜联蛋白V通过流式细胞术监测凋亡中的另一早期事件(Vermes等，1995)。膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸特异性结合，其在凋亡诱导后立即从质膜的内部小叶转移到外部小叶。为了区分活细胞和死细胞，将细胞用DNA染料碘化丙啶(PI)共染色。
为了分析凋亡的诱导，用单剂量的IMAB362-毒素缀合物处理CLDN18.2阳性NUGC4细胞数天。未处理的细胞和经未缀合IMAB362处理的细胞用作对照(图23)。3天后，用IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的细胞显示出提高的胱天蛋白酶3/7活性，而与裸抗体的孵育不影响胱天蛋白酶活性(图23A)。使用膜联蛋白V和PI的共染色作为独立参数用于验证毒素缀合的IMAB362抗体对凋亡的诱导。在处理后4天，发现用IMAB362-DM4或IMAB362-vcMMAE处理的细胞中约50％为膜联蛋白V或膜联蛋白V/PI阳性的，表明通过诱导凋亡发生细胞死亡。相比之下，没有交联的裸IMAB362在所应用的浓度范围内不诱导凋亡(图23B)。总之，用与DM4或vcMMAE缀合的IMAB362处理CLDN18.2阳性肿瘤细胞诱导凋亡。
实施例8：晚期人NUGC-4 10cF7-5sort3a胃异种移植肿瘤的处理
在皮下植入有内源性表达CLDN18.2之NUGC-4 10cF7-5sort3a胃癌细胞的小鼠中分析IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的抗肿瘤效力。如下处理具有晚期肿瘤(肿瘤大小为约200mm3)的动物：在植入后笫10天IV注射15.2mg/kg IMAB362-DM4、16mg/kg IMAB362-vcMMAE或载剂对照，并且在IMAB362缀合物处理组中在肿瘤复发后第二次注射相应的药物(第38天)。
IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE在所有经处理的动物中都显著抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(第52天)，而对照组的所有小鼠均发生肿瘤(IMAB362-DM4：p＜0.05；IMAB362-vcMMAE：p＜0.001)(图24)。在治疗后28天(在植入后第38天)，在IMAB362-DM4处理组的50％动物中观察到复发性肿瘤生长(肿瘤大小≥约100mm3)。相应IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的第二次注射再次使肿瘤部分或完全缓解。最终在IMAB362-DM4组中8只动物中的7只和IMAB362-vcMMAE组中8只动物中的4只中观察到复发性肿瘤生长。在预定的处理时间点结束(在移植后第108天)之后，IMAB362-vcMMAE组中的8只动物中有4只以及IMAB362-DM4和IMAB362组中有一只动物仍存活，而载剂组的所有动物最晚在植入后第52天都死亡(中位存活：对于载剂，32.5天；对于IMAB362-DM4，90天(p＜0.0003相对于载剂)；且对于IMAB362-vcMMAE，不确定(p＜0.0003相对于载剂))(图24)。
实施例9：抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导
抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：
使用内源性表达CLDN18.2的NUGC-4 10cF7_5sort3a p3151#10人胃癌细胞将DM4和MMAE缀合的IMAB362抗体的ADCC活性与未缀合的IMAB362进行比较(图25，表10)。
表10：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对NUGC-4 10cF7_5sort3a p3151#10细胞的ADCC活性
这两种毒素缀合抗体IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE与未缀合抗体IMAB362相比表现出相似的EC50和最大裂解值，表明在药物缀合后保留ADCC活性。
补体依赖性细胞毒性(CDC)：
对内源性表达CLDN18.2的NUGC-4 10cF7_5 sort3A p3151#10和KATO-III FGF-BP#12adM p3151#25人胃癌细胞分析IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE的CDC活性(图26，表11)。
表11：IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE对内源性表达CLDN18.2之癌细胞的CDC活性。
CDC活性不受毒素与抗体IMAB362之缀合的影响。这两种毒素缀合抗体IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE与未缀合的抗体IMAB362相比表现出至少相似的EC50和最大裂解值。
因此，IMAB362-DM4和IMAB362-vcMMAE将毒素介导的细胞毒性与抗体依赖性细胞的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性(未缀合IMAB362的主要作用模式)组合，从而提高整体治疗活性。
新国际专利申请
加尼梅德药物公司(Ganymed Pharmaceuticals AG)等
“包含针对密封蛋白18.2之抗体的药物缀合物”
我方案号：342-84PCT
___________________________________________________
生物材料的附加页
另外保藏物的识别
1)保藏物(DSM ACC2738、DSM ACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSM ACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748)的保藏机构的名称和地址：
DSMZ-德国微生物菌种和细胞培养物保藏中心
Mascheroder Weg 1b
38124 Braunschweig
DE
2)保藏物(DSM ACC2808、DSM ACC2809、DSM ACC2810)的保藏机构的名称和地址：
DSMZ-德国微生物菌种和细胞培养物保藏中心
Inhoffenstr.7 B
38124 Braunschweig
DE
关于所有上述保藏物的其他说明：
-与小鼠(Mus musculus)脾细胞融合的小鼠(Mus musculus)骨髓瘤P3X63Ag8U.1
-分泌针对人密封蛋白-18A2之抗体的杂交瘤
3)保藏人：
所有上述保藏均由以下保藏人进行：
加尼梅德药物公司
Freiligrathstrasse 12
55131 Mainz
DE

Claims (68)

1.治疗或预防表达CLDN18.2之癌症的方法，其包括向癌症患者施用抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与至少一种毒素药物部分共价连接的具有与CLDN18.2结合之能力的抗体。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物被内化到细胞中。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2特异性结合。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物与CLDN18.2特异性结合。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的细胞外结构域结合。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的第一细胞外环结合。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以如下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSMACC2737、DSM ACC2738、DSM ACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSMACC2743、DSM ACC2745、DSM ACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSMACC2809或DSM ACC2810；(ii)作为(i)中抗体之嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体之特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点、特别是可变区，并且优选地具有(i)中抗体之特异性的抗体。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。
10.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。
11.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。
12.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述毒素药物部分是细胞膜可渗透性的。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述毒素药物部分是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述毒素药物部分是美登木素生物碱或奥瑞他汀类。
16.权利要求15所述的方法，其中所述美登木素生物碱选自DM1和DM4。
17.权利要求15所述的方法，其中所述奥瑞他汀类选自单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体通过接头与所述毒素药物部分共价连接。
19.权利要求18所述的方法，其中所述接头是可切割接头。
20.权利要求18或19所述的方法，其中所述接头在细胞内条件下可被切割。
21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述接头在小于5.5的pH下可水解。
22.权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述接头可被细胞内蛋白酶切割。
23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述接头是组织蛋白酶可切割接头。
24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述接头包含二肽。
25.权利要求24所述的方法，其中所述二肽是val-cit或phe-lys。
26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物以有效用于治疗或预防所述表达CLDN18.2之癌症的量施用。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物以3至30mg/kg体重的剂量施用。
28.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物以9至90mg/m2人患者体表的剂量施用。
29.权利要求1至28中任一项所述的方法，其中施用单剂的所述抗体-药物缀合物或者两个或更多个剂的所述抗体-药物缀合物。
30.权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物通过静脉内注射来施用。
31.权利要求1至30中任一项所述的方法，其还包括施用外科手术、化学治疗和/或放射治疗。
32.权利要求1至31中任一项所述的方法，其中CLDN18.2的表达是在癌细胞的细胞表面。
33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述癌症是腺癌，特别是晚期腺癌。
34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：胃癌、食管癌、胰腺癌、例如非小细胞肺癌(NSCLC)的肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌，及其转移，克鲁肯贝格瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。
35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：胃癌；食管癌，特别是下食管癌；食管-胃接合部的癌症；以及胃食管癌。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述患者是HER2/neu阴性患者或具有HER2/neu阳性状态但不适于曲妥珠单抗治疗的患者。
37.权利要求1至36中任一项所述的方法，其中CLDN18.2具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
38.抗体-药物缀合物，其包含与至少一种毒素药物部分共价连接的具有与CLDN18.2结合之能力的抗体。
39.权利要求38所述的抗体-药物缀合物，其被内化到细胞中。
40.权利要求38或39所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2特异性结合。
41.权利要求38至40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物与CLDN18.2特异性结合。
42.权利要求38至41中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是单克隆抗体。
43.权利要求38至42中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的细胞外结构域结合。
44.权利要求38至43中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与CLDN18.2的第一细胞外环结合。
45.权利要求38至44中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体是选自以下的抗体：(i)由以如下登记号保藏的克隆产生和/或可从其获得的抗体：DSM ACC2737、DSM ACC2738、DSM ACC2739、DSM ACC2740、DSM ACC2741、DSM ACC2742、DSM ACC2743、DSM ACC2745、DSM ACC2746、DSM ACC2747、DSM ACC2748、DSM ACC2808、DSMACC2809或DSM ACC2810；(ii)作为(i)中抗体之嵌合或人源化形式的抗体；(iii)具有(i)中抗体之特异性的抗体；以及(iv)包含(i)中抗体的抗原结合部分或抗原结合位点、特别是可变区，并且优选地具有(i)中抗体之特异性的抗体。
46.权利要求38至45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。
47.权利要求38至45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体。
48.权利要求38至45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。
49.权利要求38至45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与如下的CLDN18.2结合抗体识别相同或基本上相同的表位，所述CLDN18.2结合抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述轻链包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或其片段或者所述氨基酸序列或片段的变体；和/或所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体与所述CLDN18.2结合抗体竞争与CLDN18.2结合。
50.权利要求38至49中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述毒素药物部分是细胞膜可渗透性的。
51.权利要求38至50中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中毒素药物部分是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
52.权利要求38至51中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述毒素药物部分是美登木素生物碱或奥瑞他汀类。
53.权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述美登木素生物碱选自DM1和DM4。
54.权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述奥瑞他汀类选自单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。
55.权利要求38至54中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述具有与CLDN18.2结合之能力的抗体通过接头与所述毒素药物部分共价连接。
56.权利要求55所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头是可切割接头。
57.权利要求55或56所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头在细胞内条件下可被切割。
58.权利要求55至57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头在小于5.5的pH下可水解。
59.权利要求55至58中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头可被细胞内蛋白酶切割。
60.权利要求55至59中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头是组织蛋白酶可切割接头。
61.权利要求55至60中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头包含二肽。
62.权利要求61所述的抗体-药物缀合物，其中所述二肽是val-cit或phe-lys。
63.药物制剂，其包含权利要求38至62中任一项所述的抗体药物缀合物，以及可药用稀释剂、载体或赋形剂。
64.医用制品，其包含权利要求38至62中任一项所述的抗体药物缀合物。
65.权利要求64所述的医用制品，其以药盒的形式存在，所述药盒包含含有所述抗体药物缀合物的容器。
66.权利要求38至62中任一项所述的抗体药物缀合物、权利要求63所述的药物组合物或者权利要求64或65所述的医用制品，其用于治疗，特别是用于治疗或预防癌症、特别是表达CLDN18.2之癌症的方法。
67.权利要求64至66中任一项所述的医用制品，其还包含用于在治疗或预防癌症、特别是表达CLDN18.2之癌症的方法中使用所述制品的打印说明书。
68.权利要求66所述的抗体药物缀合物或药物组合物或者权利要求66或67所述的医用制品，其中治疗或预防癌症的所述方法为权利要求1至37中任一项所述的方法。
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