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KR102336566B1 - 클라우딘 18.2에 대한 항체를 포함하는 약물 접합체 - Google Patents

클라우딘 18.2에 대한 항체를 포함하는 약물 접합체 Download PDF

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KR102336566B1
KR102336566B1 KR1020177029588A KR20177029588A KR102336566B1 KR 102336566 B1 KR102336566 B1 KR 102336566B1 KR 1020177029588 A KR1020177029588 A KR 1020177029588A KR 20177029588 A KR20177029588 A KR 20177029588A KR 102336566 B1 KR102336566 B1 KR 102336566B1
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antibody
cancer
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val
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우구르 샤힌
오즈렘 투리씨
코르덴 월터
마리아 크로이츠베르크
리타 민트나츠-크라우스
파브리스 레 갈
스테판 제이콥스
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아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤
트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
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Publication date
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Abstract

본 발명은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암 및 담낭암 및 이의 전이를 포함하는 CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 암 질환의 치료 및/또는 예방에 효과적인 항-CLDN18.2 항체 약물 접합체를 제공한다.

Description

클라우딘 18.2에 대한 항체를 포함하는 약물 접합체
본 발명은 클라우딘 18.2에 대한 항체를 포함하는 약물 접합체에 관한 것이다.
단일클론항체(mAB)는 지난 20년간 암 치료에 혁명을 일으켰다(문헌 [Sliwkowski, M. X. et al. (2013) Science 341 (6151), 1192-1198]). mAB의 중요한 특징은 이들의 높은 특이성과 종양 세포를 표적화 할 수 있는 능력이며, 이는 면역-효과기를 매개로 하는 세포살상(보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포독성(ADCC))을 나타내고 및/또는 감소된 증식 및 세포사멸을 유도한다(문헌 [Kubota, T. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (9), 1566-1572]). 세포독성 약물로의 접합은 mAB의 유용성을 확대시키고 이들의 효능과 효과를 향상시킬 수 있다(문헌 [Goldmacher, V. S. et al. (2011) Ther. Deliv. 2 (3), 397-416; Sievers, E. L. (2013) Annu. Rev. Med. 64, 15-29]).
역사적으로, 암 치료를 위한 세포독성 약물의 사용은 암 세포 분열을 표적으로 하는 화학요법을 중심으로 이루어졌다. 이 화합물은 암 세포뿐만 아니라 신체내의 다른 건강한 세포를 표적으로 하며, 치료를 받는 환자들은 심각한 부작용을 겪게 되고, 용량이 제한된다. 이들 약물에 대한 치료학적 지수(최대 허용 용량/최소 유효 용량)는 낮으며, 이는 치료의 창을 좁게한다(문헌 [Ismael, G. F. V. et al. (2008) Cancer Treat Rev. 34 (1), 81-91]). 약물 개발에서의 이러한 장애를 회피하고 치료학적 지수를 향상시키기 위해, 항체를 사용하여 세포독성 약물을 종양에 특이적으로 전달할 수 있다. 항체의 독특한 표적화 능력을 세포독성 약물의 암-살상 능력과 결합시킴으로써, 항체 약물 접합체(ADC)는 보다 낮은 부작용을 나타내며 전통적인 화학요법제와 비교하여 보다 넓은 치료의 창을 제공한다(문헌 [Gerber, H.-P. et al. (2013) Nat. Prod. Rep. 30 (5), 625-639]).
ADC는 표적-의존적 방식으로 암 세포를 사멸시키기 위해 고안되었다. 이 과정의 첫 번째 단계는 항체와 이의 항원에 대한 결합이다. ADC 결합 시, 전체 항원-ADC 복합체가 내부화되고 세포독성이 종양 세포로 방출되어 세포사멸을 일으킨다. ADC의 치료학적 지수에 영향을 미치는 요소에는 항체, 종양 표적 항원, 세포독성 약물 및 링커가 포함된다(문헌 [Panowksi, S. et al. (2014) MAbs 6 (1), 34-45]).
ADC의 개발을 위한 기본 전제 조건으로, 종양 표적 항원은 세포 표면에 국소화되어야 하고 혈중항체에 접근이 가능해야 한다. 또한, 표적 항원의 종양 선택성 및 발현 수준은 안전하고 효과적인 ADC의 설계에 중요한 매개변수이다. 현재, 다양한 종양-관련 세포 표면 항원들이 암 치료를 위한 ADC 표적으로 평가되고 있다(문헌 [Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129; Teicher, B. A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9 (8), 982-1004]).
또한 ADC의 효율은 세포독성 약물에 따라 달라진다. 종양에 국소화되는 항체의 양은 투여 용량에 비해 매우 적기 때문에 나노몰 수준 이하의 효능을 갖는 독성 화합물이 필요하다. 아우리스타틴 및 메이탄시노이드 현재 ADC 개발에 사용되는 두 가지 종류의 매우 강력한 세포독소이다(문헌 [Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129]). 이들 모두는 유사분열 억제제로서 튜뷸린의 중합을 차단시켜 G2/M기의 세포주기를 정지시켜 세포 사멸을 유도한다(문헌 [Lopus, M. et al. (2010) Mol. Cancer Ther. 9 (10), 2689-2699; Francisco, J. A et al. (2003) Blood 102 (4), 1458-1465]). mAB의 특이성과 약물의 효능 이외에도, 링커는 ADC 개발에 중요한 요소이다. 링커는 mAB의 약동학적 반감기(pharmacokinetic half-life)를 이용하기에 안정해야 하며, 항원을 매개로 하는 내재화가 되기까지 세포독성 약물을 방출해서는 안된다. 링커는 약물 방출 메커니즘에 의해 분류될 수 있다: 절단성 링커는 항원-특이적 내재화 후 가수 분해 또는 효소 절단에 의해 약물을 방출하지만, 비-절단상 링커는 내재화 후 리소좀에서 mAB의 분해를 통해 약물을 방출한다(문헌 [Dosio, F. et al. (2011) 독소s (Basel) 3 (7), S. 848-883]).
링커 설계에 따라서, 표적 양성 세포 내에서 방출되는 막 투과성(친유성) 독소는 세포막을 통과하고 항원 발현이 결여된 이웃 암 세포(방관자 효과)를 포함하여 인접한 다른 세포를 살멸시킬 수 있다(문헌 [Kovtun, Y. V. et al. (2006) Cancer Res. 66 (6), 3214-3221]). 이 세포독성 약물이 국소 방관자 살상(bystander killing)을 매개하는 능력은 종양에서 이질적으로 발현되는 항원에 대한 ADC의 중요한 선택 기준이다.
융합막 분자 클라우딘 18 아이소타입 2(CLDN18.2)는 클라우딘 18의 암-관련 스플라이스 변이체이다. CLDN18.2는 27.8kDa의 막관통 단백질로서, 2개의 작은 세포외 루프(소수성 영역 1 및 소수성 영역 2로 둘러싸인 루프1; 소수성 영역 3 및 소수성 영역 4로 둘러싸인 루프2)를 갖는 4개의 막 스패닝 도메인이 포함된다. CLDN18.2는 매우 선택적인 위(gastric)의 혈통 항원이며, 짧은 수명을 갖는 분화된 위 상피 세포에서만 독점적으로 발현되며 다른 정상 인간 조직에서는 검출되지 않는다. 항원은 위식도암 및 췌장암을 포함하는 다양한 종류의 인간 암에서 이소성으로 발현된다(문헌 [Sahin, U., et al., Clin Cancer Res, 2008. 14(23): p. 7624-34]). 또한, CLDN18.2 단백질은 종종 위암의 림프절 전이 및 원격 전이에서 검출된다. CLDN18.2는 CLDN18.2 양성 종양 세포의 증식에 관여하는 것이로 보이며, 이는 siRNA 기술에 의한 표적으로 하향조절(down regulation)되면 위암 세포의 증식이 억제되기 때문이다.
IMAB362는 CLDN18.2에 대한 IgG1 아형의 키메라 단일클론항체이다. IMAB362는 높은 친화도 및 특이성으로 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 도메인을 인식하며, 밀접하게 관련된 클라우딘 18의 스플라이스 변이체 1(CLDN18.1) 을 포함하는 임의의 다른 클라우딘 계열의 구성원에는 결합하지 않는다. CLDN18.2를 발현하는 인간 이종 이식 동물에서는 IMAB362 투여 후 마우스에서 생존율 증가 및 종양 퇴보가 관찰되었다. 관련 동물 종에서 정맥내 투여될 때, 표적 에피토프에 접근할 수 없기 때문에 위 조직에서의 독성은 관찰되지 않는다. 그러나, 종양 표적은 악성 변환 동안 IMAB362에 대한 접근이 가능해진다. IMAB362는 4가지의 독립적으로 매우 강력한 작용 메커니즘을 제공한다: (i) 항체-의존성 세포독성(ADCC), (ii) 보체-의존성 세포독성(CDC), (iii) 종양 표면에서 표적의 교차 결합에 의해 유도된 세포사멸의 유도 및 (iv) 증식의 직접적인 억제. 이전 1상 임상 시험에서는 단일요법으로서 IMAB362가 후기 위식도암 환자에서 단일 용량으로 평가되었다. 이 연구는 항체의 단일 투여가 용량 군 간의 AE 프로파일 및 다른 안전성 매개변수에서 관련 상이성이 없으므로 1000mg/m2 이하의 용량으로 안전하고 내성이 좋다는 것을 보여준다(AE=부작용). 300mg/m2 및 600mg/m2 군에서 항종양 활성에 관한 최상의 결과가 수득되었다. 2상 임상 시험을 실시하여 조직학적으로 입증된 위 또는 하부 식도의 진행성 선암종의 전이성, 불응성 또는 재발성 질환을 갖는 환자에서 IMAB362 반복 용량의 안전성, 내약성(tolerability) 및 항종양 활성을 확인하였다.
전술한 바와 같이, CLDN18.2는 정상 세포에서 제한된 발현 패턴을 가지며, 따라서 CLDN18.2를 발현하는 암의 항체-직접 치료를 위한 이상적인 표적으로 보인다. 따라서, 특히 비-CLDN18.2-발현 세포에 바람직하지 않은 영향을 미치지 않으면서 CLDN18.2-발현 세포에 임상적으로 유용한 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 나타낼 수 있는 CLDN18.2-발현 암 세포에 대한 치료법이 필요하다. 바람직하게는, 치료법은 방사성 표지 및 화학요법과의 조합과 같은 항체의 치료학적 효능을 증가시키는데 사용되는 접근법과 일반적으로 관련된 단점 및 바람직하지 못한 부작용과 관련되어서는 안된다. 예를 들어, 동위원소 치료는 골수억제와 관련이 있으며, 항체와 화학요법과의 병용 요법은 면역억제와 관련되어 있다. 또한, 동위원소 표지 물질은 생산하기가 어렵고, 환자에 동위원소 표지 물질로 초기 치료한 후에 질환이 종종 재발된다.
본 발명은 CLDN18.2-발현 세포상에서 CLDN18.2 결합 시 매우 효율적으로 내재화될 수 있는 항-CLDN18.2 단일클론항체의 존재를 입증하며, 따라서 ADC 개발에 적합하다. 또한, 절단성 SPDB 또는 Val-Cit(vc) 링커를 각각 사용하여 DM4 및 MMAE 약물에 대한 이러한 항체의 성공적인 접합에 대해 기술된다. 시험관내에서, 항체 접합체는 CLDN18.2를 발현하는 위암 및 췌장암 세포의 생존력을 감소시킨다. IMAB362-vcMMAE 및 IMAB362-DM4는 CLDN18.2 음성 세포에 결합하거나 생존력에 영향을 미치지 않는다. DM4 및 vcMMAE 접합체 모두 시험관내에서 CLDN18.2 양성 암 세포와 공동 배양한 CLDN18.2 음성 암 세포 상에서 방관자 살상 효과를 나타낸다. 또한, 생체내에서, CLDN18.2-양성 위암 또는 췌장 이종 이식 종양을 갖는 누드 마우스에서 항체 접합체의 정맥내 투여는 용량-의존적 종양 성장 억제, 생존 효과 및 심지어 초기 및 진행된 종양의 완전한 퇴보가 야기된다. 유의한 치료 효과는 약 4-8mg/kg의 단일 용량을 정맥내 투여하여 관찰된다; 최적의 치료 효과는 15-16mg/kg에서 달성된다. 15.2및 16mg/kg의 가능한 최대의 시험 용량이 간 독성 또는 다른 독성 영향을 초래하지 않았기 때문에 두 가지 접합체의 최대 허용 단일 용량은 결정될 수 없었다.
본원에 제시된 데이터로부터, 본원에 기술된 바와 같은 항-CLDN18.2 항체 약물 접합체는 위암 및 췌장암종과 같은 CLDN18.2-양성 인간 암종의 치료를 위한 매우 강력한 약제라고 결론내릴 수 있다.
본 발명은 일반적으로 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포성 폐암(NSCLC), 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암, 및 담낭암 및 이의 전이, 특히 위암 전이 예컨대 크루켄버그 종양(Krukenberg tumor), 복막 전이 및 림프절 전이와 같은 CLDN18.2를 발현하는 세포와 관련된 암을 효과적으로 치료 및/또는 예방하기 위한 치료법을 제공한다. 특히 바람직하게는 암 질환은 위, 식도, 췌장관, 담관, 폐 및 난소의 선암종이다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 독소 약물 잔기에 공유결합된 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체를 포함하는 항체 약물 접합체를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 CLDN18.2-발현 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 세포에 의해 발현되는 CLDN18.2에 결합한 후에 세포로 내재화된다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일클론, 키메라 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편이다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일클론항체이다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 살아있는 세포의 표면상에 존재하는 CLDN18.2의 천연(native) 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2의 세포외 도메인에 결합한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론에 의해 생산되는 항체 및/또는 이로부터 수득 가능한 항체, (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체, (iii) (i) 에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체, 및 (iv) (i)에 따른 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 가변 영역을 포함하며, 바람직하게는 (i)에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄가 포함된다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄가 포함된다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄가 포함된다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 표적으로의 결합에 대해 이차 항체와 경쟁하는 항체는 바람직하게는 상기 이차 항체에 대해 길항적이다.
일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 세포막 투과성이다. 일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 세포독성제 또는 세포증식억제제이다. 일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴이다. 일 구현예에서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 링커에 의해 독소 약물 잔기에 공유결합된다. 일 구현예에서, 링커는 절단성 링커이다. 일 구현예에서, 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 카텝신-절단성 링커이다. 일 구현예에서, 링커는 디펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 디펩타이드는 val-cit 또는 phe-lys이다. 일 구현예에서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합된다. 일 구현예에서, 항체는 아민기, 특히 항체의 리신 잔기의 아민기를 통해 링커에 결합된다.
일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 CLDN18.2-발현 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 체중의 3 내지 30mg/kg의 투여량, 예컨대 체중의 4 내지 25, 5 내지 20, 10 내지 18 또는 15 내지 16mg/kg으로 투여된다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 환자 신체 표면의 8 내지 150, 9 내지 100 또는 9 내지 90mg/m2의 용량, 예컨대 환자 신체 표면의 12 내지 75, 15 내지 60, 30 내지 54 또는 45 내지 48mg/m2로 투여된다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체의 단일 용량 또는 항체 약물 접합체의 2회 이상의 용량이 투여된다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 정맥내 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 발명은 수술, 화학요법 및/또는 방사선 치료하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, CLDN18.2의 발현은 암 세포의 세포 표면에서 일어난다. 일 구현예에서, 암은 선암종, 특히 진행성 선암종이다. 일 구현예에서, 암은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포성 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암, 담낭암 및 이의 전이, 크루켄버그 종양, 복막 전이 및/또는 림프절 전이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 위암(cancer of the stomach), 식도암(cancer of the esophagus), 특히 하부 식도암, 위점막 접합부 암(cancer of the eso-gastric junction) 및 위식도암(gastroesophageal cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 환자는 HER2/neu 음성 환자 또는 HER2/neu 양성 상태이지만 트라스투주맙 치료에 적합하지 않은 환자이다.
일 구현예에서, CLDN18.2는 서열번호 1에 따른 아미노산을 갖는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 독소 약물 잔기에 공유결합된 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체를 포함하는 항체 약물 접합체를 제공한다.
일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 세포에 의해 발현되는 CLDN18.2에 결합한 후 세포로 내재화된다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체 약물 접합체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일클론항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편이다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일클론항체이다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 살아있는 세포의 표면에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2의 세포외 도메인에 결합한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프(loop)에 결합한다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론에 의해 생산되는 항체 및/또는 이로부터 수득 가능한 항체, (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체, (iii) (i) 에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체, 및 (iv) (i)에 따른 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 가변 영역을 포함하며, 바람직하게는 (i)에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체이다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고/인식하거나 상기 CLDN18.2-결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁한다. 표적으로의 결합에 대해 이차 항체와 경쟁하는 항체는 바람직하게는 상기 이차 항체에 대해 길항적이다.
일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 세포막 투과성이다. 일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 세포독성제 또는 세포증식억제제이다. 일 구현예에서, 독소 약물 잔기는 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴이다. 일 구현예에서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 링커에 의해 독소 약물 잔기에 공유결합된다. 일 구현예에서, 링커는 절단성 링커이다. 일 구현예에서, 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일 구현예에서, 링커는 카텝신-절단성 링커이다. 일 구현예에서, 링커는 디펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 디펩타이드는 val-cit 또는 phe-lys이다. 일 구현예에서, 항체는 항체의 시스테인 티올을 통해 링커에 결합된다. 일 구현예에서, 항체는 아민기, 특히 항체의 리신 잔기의 아민기를 통해 링커에 결합된다.
일 구현예에서, CLDN18.2는 서열번호 1에 따른 아미노산을 갖는다.
추가의 양태에서, 본 발명의 항체 약물 접합체, 및 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 제형이 제공된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 약물 접합체를 포함하는 의약 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 의약 제제는 항체 약물 접합체를 포함하는 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재한다. 일 구현예에서, 의약 제제는 암, 특히 CLDN18.2-발현 암을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서 상기 제제를 사용하기 위한 인쇄된 설명서를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료, 특히 암, 특히 CLDN18.2-발현 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되는 본 발명의 항체 약물 접합체, 본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 의약 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 암을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 CLDN18.2-발현 암을 치료 또는 예방하는 방법이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1: 항체 약물 접합.
도 2: HEK293 ~ CLDN18 .2 세포와 키메라 항- CLDN18 .2 mAbs 및 Fab -ZAP의 공동 배양 후 생존력 감소(내재화의 간접적 평가).
HEK293~CLDN18.2 세포를 72시간 동안 항-CLDN18.2 특이적 항체 및 사포린 접합 항-인간 IgG Fab 단편(Fab-ZAP 인간)과 배양하였다. IMAB362, chim mAB294, chim mAB308 및 chim mAB359의 세포내섭취를 세포 생존력을 측정하여 간접적으로 측정하였다. 데이터 포인트(n=3 복제)를 평균± SD로 표시하였다.
도 3: HEK293 ~ CLDN18 .2 세포와 뮤린 항- CLDN18 .2 항체 및 Fab -ZAP의 공동 배양 후 생존력 감소(내재화의 간접적 평가).
HEK293~CLDN18.2 세포를 72시간 동안 항-CLDN18.2 반응성 뮤린 항체 및 세포린 접합 항-마우스 IgG Fab 단편(Fab-ZAP 뮤린)과 배양하였다. 상이한 항-CLDN18.2 반응성 뮤린 항체의 세포내섭취를 세포 생존력을 측정하여 간접적으로 측정하였다.
도 4: CLDN18 .2 양성 세포에 대한 IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 상대 결합 친화도
비접합 IMAB362와 비교하여 IMAB362-독소 접합체의 상대 결합 친화도를 (A) NUGC-4 10cF7-5 sort3a 및 (B) CLDN18.2를 내인성으로(endogenously) 발현하는 DAN-G 1C5F2 세포, (C) NCI-N87~CLDN18.2 및 (D) CLDN18.2를 이소성으로(ectopically) 과발현하는 BxPC-3~CLDN18.2 세포에서 유동세포계측법으로 20㎍/ml이하의 항체 농도에서 측정하였다. 데이터 포인트(n=2 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 5: IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 CLDN18 .2-매개 결합.
IMAB362-독소 접합체의 CLDN18.2-매개 결합을 (A) CLDN18.2를 이소성으로 과발현하는 NCI-N87~CLDN18.2 세포 및 (B) 상응하는 CLDN18.2 음성 인간 종양 세포주에서 유동세포계측법으로 20㎍/ml 이하의 항체 농도에서 분석하였다. 데이터 포인트(n=2 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 6: IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 결합 특이성.
IMAB362-독소 접합체의 결합 특이성을 (A) HEK293~CLDN18.2, (B) HEK293~CLDN18.1 또는 음성 대조군으로서 (C) HEK293~모의 세포에서 측정하였다. 결합을 유동세포계측법으로 20㎍/ml 이하의 항체 농도에서 분석하였다. 데이터 포인트(n=2 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 7: CLDN18 .2 발현 인간 암종 세포주의 생존력에 대한 IMAB362 -DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 효과.
IMAB362-DM4-매개 및 IMAB362-vcMMAE-매개된 (A) NUGC-4 10cF7-5 sort 3a, (B) NCI-N87~CLDN18.2 및 (C) BxPC-3~CLDN18.2 세포 생존력 감소에 대한 용량-반응 곡선. IMAB362 를 음성 대조군으로 사용하였다(이 조건하에서는 생존력 분석에 대한 효과가 없음). 세포를 16875ng/ml 이하 농도의 항체 존재하에서 72시간 동안 배양하였다. 생포 생존력의 감소를 XTT-기반 생존력 분석을 사용하여 측정하였다. 데이터 포인트(n=3 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 8: IMAB362 - vcMMAE 매개된 종양 세포 생존력 감소의 CLDN18 .2 의존성.
IMAB362-vcMMAE-매개된 세포 생존력 감소의 표적 의존성을 NCI-N87 세포(CLDN18.2 음성) 및 표적을 이소성으로 발현하는 NCI-N87~CLDN18.2 세포에서 측정하였다. 세포를72시간 동안 IMAB362-vcMMAE 또는 비접합 IMAB362와 16875ng/ml 이하의 농도에서 배양하였다. IMAB362는 본원에서 사용된 실험 조건하에서 활성이 없는 것으로 알려져 있다. 세포 생존력의 감소를 XTT-기반 생존력 분석을 사용하여 측정하였다. 데이터 포인트(n=3 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 9: IMAB362 - vcMMAE - 매개된 세포 생존력 감소의 특이성.
IMAB362-vcMMAE-매개된 세포 생존력 감소의 표적 특이성을 안정적으로 형질감염된 HEK293~CLDN18.2, HEK293~CLDN18.1 및 HEK293~모의 세포로 시험하였다. 세포를 72시간 동안 IMAB362-vcMMAE의 존재하에 16875ng/ml 이하의 농도에서 배양하였다. 세포 생존력의 감소를 XTT-기반 생존력 분석을 사용하여 측정하였다. 데이터 포인트(n=3 복제)를 평균±SD로 표시하였다.
도 10: IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 방관자 활성.
방관자 효과의 IMAB362-DM4-매개 유도 및 IMAB362-vcMMAE매개 유도를 PA-1(Luc) 세포(CLDN18.2 음성/루시페라아제 양성) 및 NUGC-4 10cE8 세포(CLDN18.2 양성/루시페라아제 음성)를 사용하여 공동 배양 실험에서 측정하였다. 백그라운드 대조군으로서 PA-1(Luc) 세포를 IMAB362-DM4- vcMMAE 또는 IMAB362-vcMMAE 중 어느 하나와 배양하였다. 처리를 위해, 세포를 4일 동안 200ng/ml IMAB362-DM4, 800ng/ml IMAB362-vcMMAE 또는 800ng/ml IMAB362의 존재하에서 배양하였다. 루시페라아제 활성을 측정하였다.
도 11: IMAB362 -DM4에 의한 진행성 BxPC -3~ CLDN18 .2 이종 이식종양의 성장 억제.
CLDN18.2-양성 BxPC-3~CLDN18.2 세포를 암컷 무흉선 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 14일에, 마우스를 4개의 군으로 조직하고 비히클의 7.5mg/kg, 15mg/kg IMAB362-DM4의 단일 용량 또는 15mg/kg IMAB362-DM4의 반복 용량으로(14일 및 21일) 정맥내 주사하였다. 피하 종양의 크기를 주 2회 측정하였다(평균±SEM). 군 크기 n=5. SD: 단일 용량, RD: 반복 용량.
도 12: IMAB362 -DM4로 처리한 마우스의 평균 체중.
비히클 대조군, 7.5mg/kg 또는 15mg/kg의 단일 용량, 또는 15mg/kg IMAB362-DM4의 반복 용량으로 각각 처리한 BxPC-3~CLDN18.2 종양 보유 누드 마우스의 체중을 주 2회 모니터링하였다. 4개의 군의 체중을 평균으로 표시하였다. 군 크기 n=5.
도 13: 이종 이식 누드 마우스에서 IMAB362 -DM4의 단일 및 반복 용량의 임상 화학 매개변수.
비히클의 7.5mg/kg, 15mg/kg IMAB362-DM4 단일 용량 또는 15mg/kg IMAB362-DM4의 반복 용량으로 정맥내 처리한 BxPC-3~CLDN18.2-종양 보유 암컷 누드 마우스의 임상 화학을 이식 후 49일에 분석하였다. A) 알라닌 트랜스아미나아제(GPT), B) 아스파테이트 트랜스아미나아제(GOT), C) 글루탐산 탈수소효소, D) 알칼린 포스파타아제, E) α-아밀라아제, F) 콜린에스테라아제, G) 크레아틴 키나아제(CK), H) 락트산 탈수소효소(LDH), I) 리파아제, J) 우레아, K) 글루코스, L) 총 단백질 및 M) 알부민.
도 14: IMAB362 -DM4 및 비히클 처리 마우스의 위 절편의 조직학적 분석.
BxPC-3~CLDN18.2 이종 이식 종양을 보유한 마우스를 IMAB362-DM4로 처리하였다. 이식 후 49일에 마우스를 희생시키고 선별한 장기를 절제하고 포르말린으로 고정시켰다. 이 FFPE 조직 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 형태학적 변화를 현미경으로 검사하였다. (A, C) 최대 IMAB362-DM4 노출(이식 후 14일 및 21일에 15mg/kg IMAB362-DM4)시킨 처리군으로부터의 대표적인 마우스의 위 조직. (B, D) 비히클만으로 처리한 대조군 마우스의 위 조직. 배율: 스케일 바 참조
도 15: 진행성 BxPC -3~ CLDN18 .2 이종 이식 종양에 있어서 IMAB362 - vcMMAE의 종양 성장 억제.
CLDN18.2-양성 BxPC-3~CLDN18.2 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 14일에, 마우스를 4개의 군으로 조직하고 비히클, 8mg/kg, 16mg/kg IMAB362- vcMMAE의 단일 용량 또는 16mg/kg IMAB362- vcMMAE의 반복 용량(14일 및 21일)으로 정맥내 주사하였다. 피하 종양의 크기를 주 2회 측정하였다(평균±SEM). 군 크기 n=5.
도 16: IMAB362 - vcMMAE로 처리한 마우스의 평균 체중.
비히클, 8mg/kg 또는 16mg/kg의 단일 용량 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 반복 용량으로 처리한 종양 보유 암컷 누드 마우스의 체중을 주 2회 모니터링하였다. 4개의 군의 체중을 평균으로 나타내었다. 군 크기 n=5.
도 17: 이종 이식 누드 마우스에서 IMAB362 - vcMMAE의 단일 및 반복 용량의 임상 화학 매개변수.
비히클, 8mg/kg, 16mg/kg IMAB362-vcMMAE 단일 용량 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 반복 용량으로 정맥내 처리한 BxPC-3~CLDN18.2-종양 보유 암컷 누드 마우스의 임상 화학을 이식 후 37일에 분석하였다. A) 알라닌 트랜스아미나아제(GPT), B) 아스파테이트 트랜스아미나아제(GOT), C) 글루탐산 탈수소효소, D) 알칼린 포스파타아제, E) α-아밀라아제, F) 콜린에스테라아제, G) 크레아틴 키나아제(CK), H) 락트산 탈수소효소(LDH), I) 리파아제, J) 우레아, K) 글루코스, L) 총 단백질 및 M) 알부민.
도 18: 진행성 인간 NCI-N87~ CLDN18 . 2 위 이종 이식 종양 모델에서 IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 용량-의존성 항-종양 효능.
인간 CLDN18.2를 이소성으로 발현하는 NCI-N87~CLDN18.2 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 이식 후 10일에, 마우스를 여러 군으로 조직하고 비히클, 3.8, 7.6 또는 15.2mg/kg IMAB362-DM4 또는 4, 8 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 단일 용량을 13일에 정맥내 주사하였다. 다른 대조군에 약 8mg/kg IMAB362의 반복 용량의 IV 및 i.p. 주사를 교대로 주 2회 투여하였다. 종양의 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피가 1400mm3를 초과하거나 종양이 궤양되었을 때 동물을 희생시켰다. 종양 성장의 통계학적 분석을 Kruskal-Wallis 및 post-hoc Dunn 시험을 사용하여 수행하였다. 생존을 각각 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE로 처리한 비히클 대조군과 비교하여 Mantel Cox 시험을 사용하여 분석하였다. (A-H) 종양 성장 곡선, (I, K) 평균 종양 성장(±SEM) 및 (J, L) 비히클 대조군 IMAB362 또는 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리한 마우스의 생존도. 군 크기: n=11; *: p<0.05; ***p<0.001. 화살표는 처리 시작점을 나타낸다.
도 19: 초기 인간 NUGC -4 10cF7 -5 sort3a 위종양 이종 이식 모델에서 IMAB362-DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 항-종양 효능.
CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7-5 sort3a 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 3일에, 마우스에 비히클, 15.2mg/kg IMAB362-DM4 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE를 단일 IV 주사하여 투여하였다. 종양의 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피가 1400mm3를 초과하거나 종양이 궤양되었을 때 또는 사전-정의한 120일의 관찰 기간 이후에 동물을 희생시켰다. 종양 성장의 통계학적 분석을 Kruskal-Wallis 및 post-hoc Dunn 시험을 사용하여 수행하였다. 생존을 Mantel Cox 시험을 사용하여 분석하였다. (A-C) 종양 성장 곡선, (D) 평균 종양 성장(±SEM) 및 (E, F) 비히클 대조군, IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리한 마우스의 생존도. 군 크기: n=10; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. 화살표는 처리 시점을 나타낸다.
도 20: 진행성 인간 BxPC -3~ CLDN18 .2 췌장 종양 이종 이식 모델에서 IMAB362-DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 용량-의존적 항-종양 효능.
인간 CLDN18.2를 이소성으로 발현하는 BxPC-3~CLDN18.2 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 이식 후 13일에, 마우스를 여러 군으로 조직하고 비히클, 3.8, 7.6 또는 15.2mg/kg IMAB362-DM4 또는 4, 8 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 단일 용량을 14일에 정맥내 주사하였다. 항체 대조군 마우스에 약 8mg/kg 비접합 IMAB362의 IV 및 i.p. 주사를 교대로 주 2회 투여하였다. 종양 크기를 주 2회 측정하였다. 종양 부피가 1400mm3를 초과하거나 종양이 궤양되었을 때 동물을 희생시켰다. 종양 성장의 통계학적 분석을 Kruskal-Wallis 및 post-hoc Dunn 시험을 사용하여 수행하였다. 생존을 각각 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE로 처리한 비히클 대조군과 비교하여 Mantel Cox 시험을 사용하여 분석하였다. (A-H) 종양 성장 곡선, (I, K) 평균 종양 성장(±SEM) 및 (J, L) 비히클 대조군 IMAB362 또는 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리한 마우스의 생존도. 군 크기: n=11; p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. 화살표는 처리 시점을 나타낸다.
도 21: 초기 인간 DAN-G 1C5F2 췌장 종양 이종 이식 모델에서 IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 항-종양 효능.
CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 DAN-G 1C5F2 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 이식 후 3 일에, 마우스를 비히클 대조군, 15.2mg/kg IMAB362-DM4 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE를 단일 IV 주사하여 처리하였다. 종양의 부피를 주 2회 측정하였다. 암 악액질로 인해 마우스가 10% 이상의 체중을 잃었을 때, 종양이 궤양되었을 때 또는 사전-정의한 120일의 관찰 기간 이후에 동물을 희생시켰다. 종양 성장의 통계학적 분석을 Kruskal-Wallis 및 post-hoc Dunn을 사용하여 수행하였다. 생존을 Mantel Cox 시험을 이용하여 분석하였다. (A-C) 종양 성장 곡선 (D) 평균 종양 성장(±SEM) 및 (E, F) 비히클 대조군, IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리한 마우스의 생존도. 군 크기: n=10; **: p<0.01; ***: p<0.001. 화살표는 처리 시점을 나타낸다.
도 22: IMAB362 - vcMMAE 및 비히클 처리 마우스의 위 절편의 조직학적 분석.
BxPC-3~CLDN18.2 이종 이식 종양을 보유한 마우스를 IMAB362-vcMMAE로 처리하였다. 이식 후 37일에 마우스를 희생시키고 선별한 장기를 절단하고 포르말린으로 고정시켰다. 이 FFPE 조직의 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 형태학적 변화를 현미경으로 검사하였다. (A, C) 최대 IMAB362- vcMMAE 노출(이식 후 14일 및 21일에 16mg/kg IMAB362-vcMMAE)을 갖는 처리군으로부터의 대표적인 마우스의 위 조직. (B, D) 비히클만으로 처리한 대조군의 마우스의 위 조직. 배율: 스케일 바 참조.
도 23: IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE에 의한 세포사멸의 유도.
IMAB362-DM4- 및 IMAB362-vcMMAE-매개된 세포사멸의 유도를 카스파제 3/7 활성을 측정하고 표적 양성 NUGC-4 10cE8 세포를 사용하여 아넥신 V으로 염색하여 측정하였다. A) 카스파제 3/7 활성을 2.5㎍/ml IMAB362 항체(n=3 복제, 평균±SD)의 존재하에서 3일 동안 세포를 배양한 후 분석하였다. B) 아넥신 V 및 프로피듐 아이오다이드(PI)로 공동 염색한 세포의 유동세포계측법 분석을 2.5㎍/ml IMAB362 항체(n=3 복제)로 처리한 후 4일에 수행하였다. 대조군으로서 비처리 세포를 사용하였다.
도 24: 진행성 인간 NUGC -4 10cF7 -5 sort3a 위 종양 이종 이식 모델에서 IMAB362-DM4 및 IMAB362 - vcMMAE의 항-종양 효능.
CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7-5 sort3a 세포를 암컷 누드 마우스의 측면에서 피하로 이식하였다. 10일에, 마우스에 비히클, 15.2mg/kg IMAB362-DM4 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE를 단일 IV 주사하여 투여하였다. 종양 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피가 1400mm3를 초과하거나 종양이 궤양되었을 때 또는 120일의 사전 정의된 관찰 기간 후 동물을 희생시켰다. 종양 성장의 통계학적 분석을 Kruskal-Wallis 및 post-hoc Dunn을 사용하여 수행하였다. 생존을 Mantel Cox 시험을 이용하여 분석하였다. (A-C) 종양 성장 곡선 (D) 평균 종양 성장(±SEM) 및 (E, F) 비히클 대조군 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리한 마우스의 생존도. 군 크기: n=10; *: p<0.05; ***: p<0.001. 화살표는 처리 시점을 나타낸다.
도 25: CLDN18 .2를 발현하는 인간 종양 세포에서의 IMAB362 -DM4 및 IMAB362 -vcMMAE 매개된 ADCC .
A) CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 인간 위암 세포상에서의 IMAB362-DM4(채워져있는 검은색 원형), IMAB362-vcMMAE(채워져있는 검은색 삼각형) 및 IMAB362(뚫려있는 검은색 사각형) 매개된 ADCC의 용량 반응 곡선. 실험은 약 40:1의 효과기 대 표적 비율을 사용하여 수행하였다. 데이터 포인트(n=4 복제)를 평균±SD로 표시하였다. B) NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 세포에서 CLDN18.2 발현의 유동세포계측법 분석. 회색으로 채워진 히스토그램: 항-CLDN18.2(IMAB362, 50㎍/ml). 검은색 점선: 아이소타입 대조군.
도 26: CLDN18 .2 발현 인간 암 세포에서의 IMAB362 -DM4 및 IMAB362 - vcMMAE 매개된 CDC .
A) CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25(왼쪽) 및 NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 인간 위암 세포(오른쪽)에서 IMAB362-DM4(채워져있는 검은색 원형), IMAB362-vcMMAE(채워져있는 검은색 삼각형) 및 IMAB362(뚫려있는 검은색 사각형) 매개된 CDC의 용량 반응 곡선. 루시페라아제 발현 표적 세포를 90분 동안 (건강한 기증자로부터 모은) 20% 인간 혈청 및 지시된 농도에서 각 항체로 배양하였다. 데이터 포인트(n=3 복제)를 평균±SD으로 표시하였다. B) KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25(왼쪽) 및 NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 세포(오른쪽)에서의 CLDN18.2 발현의 유동세포계측법 분석. 회색으로 채워진 히스토그램: 항-CLDN18.2(IMAB362, 50㎍/ml). 검은색 점선: 아이소타입 대조군.
이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 방법론, 프로토콜 및 시약들이 다양한 만큼 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
이하에서, 본 발명의 구성요소들을 설명한다. 이 구성요소들은 특정 구현예와 함께 열거되지만, 이들은 임의의 방식 및 임의의 횟수로든 조합되어 부가적인 구현예를 구현할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 구현예 및 바람직한 구현예들은 단지 명시적으로 설명된 구현예들만으로 본 발명을 한정짓는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서는 명시적으로 기재된 구현예들과 개시된 및/또는 바람직한 임의의 수의 구성요소들을 조합하는 구현예들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 출원의 지재된 모든 구성요소들의 임의의 순열 및 조합들은 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 기재된 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게는, 본원에 사용되는 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재되어 있는 바와 같이 정의된다.
발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 분야의 문헌에서 설명되어 있는 종래의 화학적, 생화학적, 세포 생물학적, 면역학적, 및 재조합 DNA 기술의 밥법을 채용할 것이다(예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전반에서, 문맥이 달리 요구하지 않는다면, 단어 "포함하다", 및 "포함한다"와 "포함하는"과 같이 변형어는 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하되, 비록 일부 구현예에서 그러한 다른 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제할 수도 있지만, 임의의 다른 멤버, 정수 또는 단계, 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이며, 즉 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것이다. 본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇 가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
클라우딘은 융합막의 가장 중요한 구성요소인 단백질 계열로 상피의 세포 사이의 세포내 공간에서 분자 흐름을 제어하는 세포간 장벽을 만든다. 클라우딘은 세포막에 위치하는 N-말단 및 C-말단을 가지고 막을 4번 통과하는 막관통 단백질이다. 첫 번째 세포외 루프 또는 도메인은 평균 53개의 아미노산으로 이루어지며, 두 번째 세포외 루프 및 도메인은 약 24개의 아미노산으로 이루어진다. CLDN18.2와 같은 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질은 다양한 기원의 종양에서 발현되며, 이들의 선택적 발현(독성 관련 정상 조직에서 발현하지 않음) 및 원형질 막으로의 국소화로 인해 항체-매개 암 면역요법과 관련하여 표적 구조로서 특히 적합하다.
본원에 사용되는 용어 "CLDN"은 클라우딘을 의미하며 CLDN18.2를 포함한다. 바람직하게는, 클라우딘은 인간 클라우딘이다.
용어 "CLDN18"은 클라우딘 18과 관련되며 클라우딘 18 스플라이스 변이체 1(클라우딘 18.1(CLDN18.1)) 및 클라우딘 18 스플라이스 변이체 2(클라우딘 18.2(CLDN18.2))를 포함하는 임의의 변이체를 포함한다.
용어 "CLDN18.2"는 바람직하게는 인간 CLDN18.2에 관한 것이며, 특히, 서열목록의 서열번호 1에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진 단백질에 관한 것이다. CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프 또는 도메인은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산의 27 내지 81개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 29 내지 78개의 아미노산을 포함한다. CLDN18.2의 두 번째 세포외 루프 또는 도메인은 서열번호 1에 나타나는 아미노산 서열의 140 내지 180개의 아미노산을 포함한다. 상기 첫 번째 또는 두 번째 세포외 루프 또는 도메인은 바람직하게는 CLDN18.2의 세포외 부분 또는 도메인을 형성한다.
CLDN18.2는 위점막의 분화된 상피 세포에서의 정상 조직에서 선택적으로 발현된다. CLDN18.2는 다양한 기원의 암, 예컨대 췌장암종, 식도암종, 위암종, 기관지암종, 유방암좀 및 ENT 종양에서 발현된다. CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포성 폐암(NSCLC), 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암, 및 담낭암 및 이의 전이, 특히 위암 전이 예컨대 크루켄버그 종양, 복막 전이 및 림프절 전이과 같은 원발성 종양의 예방 및/또는 치료에 대한 중요한 표적이다.
용어 "CLDN18.1"은 바람직하게는 인간 CLDN18.1에 관한 것이며, 특히, 서열목록의 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 용어 "변이체"는 특히, 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 배좌(conformation), 동형단백질(isoform), 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것을 지칭한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열의 변경과 관련이 있으며, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 식별한다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 상이한 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 용어 "변이체"는 번역 후 변형된 임의의 변이체 및 임의의 형태 변이체를 포괄한다.
본 발명에 따르면, 용어 "CLDN18.2-발현 암" 또는 "CLDN18.2-양성 암"은 바람직하게는 상기 암 세포의 표면에서 발현되는 CLDN18.2를 발현하는 암 세포와 관련된 암을 의미한다.
"세포 표면"은 본 기술분야에서 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 다른 분자에 의한 결합이 가능한 세포 외부를 포함한다.
세포의 표면에 위치하고 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합이 가능하다면 CLDN18.2는 상기 세포의 표면상에서 발현된다.
본 발명의 문맥에서 용어 "세포외 부분" 또는 "세포외 도메인"은 세포의 세포외 공간을 향하는 단백질, 바람직하게는 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어 세포의 외부에 존재하는 항체와 같은 결합제에 의해 결합이 가능한 단백질과 같은 분자의 일부를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 용어는 하나의 또는 그 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 의미한다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2는 발현 수준이 위 세포 또는 위 조직에서의 발현 수준보다 낮을 경우 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다. 바람직하게는, 발현 수준은 위 세포 또는 위 조직에서의 발현의 10% 미만, 바람직하게는 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.05% 미만이거나 심지어 더 낮다. 바람직하게는, 발현 수준이 위 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 바람직하게는 1.5배로 초과하고, 바람직하게는 상기 비-암성 조직에서 발현 수준을 초과하지 않으면 CLDN18.2는 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다. 바람직하게는, CLDN18.2는 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 너무 낮아 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용할 수 없는 경우 세포에서 실질적으로 발현되지 않는다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2는 발현 수준이 바람직하게는 위암 이외의 비-암성 조직에서의 발현 수준을 2 배 초과, 바람직하게는 10배, 100배, 1000배 또는 10000배로 초과하는 경우 세포에서 발현된다. 바람직하게는, CLDN18.2는 발현 수준이 상기 검출 한계를 초과하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분히 높은 경우 바람직하게 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 세포에서 발현된 CLDN18.2는 상기 세포 표면에서 발현되거나 노출된다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 건강 상태로 해석된다. 질환은 전염병과 같은 외부 원인으로부터 기인한 요인에 의해 야기되거나, 자가면역질환과 같은 내적 기능장애에 의해 야기될 수 있다. 사람의 경우, "질환"은 통증, 기능장애, 고통, 사회적 문제, 또는 고통받는 개체에게 죽음, 또는 개체와 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 초래하는 임의의 상태를 지칭하도록 더 광범위하게 사용된다. 보다 넓은 의미에서는, 때때로 상해, 장애, 장애증상, 증후군, 감염, 격리된 증상, 비정상적인 행동, 및 구조와 기능의 비정형 변화를 포함하는 반면, 다른 문맥에서 및 다른 목적에 대해서 이들은 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질환은 대개 신체적뿐만 아니라 감정적으로도 영향을 미치며, 이는 많은 질병에 걸리고 질병과 삶을 사는 것은 삶에 대한 자신의 견해와 개인의 성격을 바꿀 수 있기 때문이다. 본 발명에 따르면, 용어 "질환"은 암, 특히 본원에 기재된 암의 형태를 포함한다. 본원에서 암 또는 암의 특정 형태에 대한 임의의 언급은 이의 암 전이를 또한 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 따라 치료될 질병은 CLDN18.2를 발현하는 세포를 포함한다.
"CLDN18.2를 발현하는 세포를 포함하는 질환" 또는 "CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 질병" 또는 유사한 표현은 본 발명에 따라 CLDN18.2가 질환 조직 또는 기관의 세포에서 발현된다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 질환 조직 또는 기관의 세포에서의 CLDN18.2 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태와 비교하여 증가된다. 증가는 10% 이상, 특히 20% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 500% 이상, 1000% 이상, 10000% 이상 또는 그 이상으로 증가되는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 발현은 질환 조직에서만 발견되는 반면, 상응하는 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, CLDN18.2를 발현하는 세포와 연관된 질환에는 암 질환이 포함된다. 또한, 본 발명에 따르면, 암 질환은 바람직하게는 암 세포가 CLDN18.2를 발현하는 질환이다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리학적 조건을 나타내거나 이를 기술한다. 암의 예로서는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 이러한 암의 예로서는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암종, 자궁암, 성기 및 생식 기관의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암종, 부갑상선암종, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포암종, 신우암, 중추신경 종양(CNS), 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경교종, 뇌수막종 및 뇌하수체 선종이다. 또한, 본 발명에 따르면 용어 "암"은 암 전이를 포함한다. 바람직하게는, "암 질환"은 CLDN18.2를 발현하는 세포 및 CLDN18.2를 발현하는 암 세포인 것을 특징으로 한다. CLDN18.2를 발현하는 세포는 바람직하게는 암 세포, 바람직하게는 본원에 기재된 암 세포이다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 바람직하게는 종창 또는 병변을 형성하는 세포(종양(neoplastic) 세포, 종양유전자성(tumorigenous) 세포 또는 종양 세포라고 함)의 비정상적인 성장을 지칭한다. "종양 세포"란 급속하고 통제되지 않은 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 시작한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 조직체 및 기능적 협응이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있고, 일반적으로 양성(benign), 전-악성 또는 악성일 수 있는 별개의 조직 덩어리를 형성한다. 본 발명에 따르면, "암 질환"은 바람직하게는 "종양 질환"이다. 그러나 일반적으로 용어 "암" 및 "종양"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 암은 CLDN18.2를 발현하는 암 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 암은 CLDN18.2 양성이다. 일 구현예에서, CLDN18.2의 발현은 세포의 표면에서 일어난다. 일 구현예에서, 암 세포의 50% 이상, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%는 CLDN18.2 양성이고/양성이거나 암 세포의40% 이상, 암 세포의 바람직하게는 50% 이상은 CLDN18.2의 표면 발현에 대해 양성이다. 일 구현예에서, 암 세포의 95% 이상 또는 98% 이상은 CLDN18.2 양성이다. 일 구현예에서, 암 세포의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상은 CLDN18.2의 표면 발현에 대해 양성이다.
일 구현예에서, CLDN18.2-발현 암, CLDN18.2 발현하는 암 세포를 포함하는 암 또는 CLDN18.2-양성 암은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포성 폐암(NSCLC), 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암 및 담낭암 및 이의 전이, 특히 위암 전이 예컨대 크루켄버그 종양, 복막 전이 및 림프절 전이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 선암종, 특히 진행성 선암종이다. 특히 바람직한 암 질환은 위, 식도, 췌장관, 담관, 폐 및 난소의 선암종이다. 일 구현예에서, 암은 위암, 식도암, 특히 하부 식도암, 위점막 접합부 암 및 위식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, 암은 위식도암, 예컨대 전이성, 불응성 또는 재발성 진행성 위식도암이다.
본 발명에 따르면, "암종"은 상피세포로부터 유래된 악성 종양이다. 이 군은 일반적인 형태의 유방암, 전립선암종, 폐암 및 대장암을 포함하는 가장 흔한 암을 나타낸다.
"선암종"은 선상 조직으로부터 기원되는 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직으로 알려진 더 큰 조직의 일부이다. 상피 조직에는 피부, 샘(gland), 공동(cavity) 및 신체 기관을 싸고있는 다양한 조직이 포함된다. 상피는 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 발생학적으로 유래된다. 선암종으로 분류되기 위해, 세포는 분비 성질이 있는 한에서는 반드시 샘의 일부가 될 필요는 없다. 이 형태의 암종은 인간을 포함한 일부 고등 포유류에서 발생할 수 있다. 잘 분화된 선암종은 이들이 유래된 선상 조직과 유사한 경향이 있지만, 불환전하게 분화된 것은 그렇지 않을 수 있다. 생체검사에서 세포를 염색함으로서, 병리학자는 종양이 선암종 또는 다른 유형의 암인지 여부를 결정한다. 선암종은 신체 내 샘의 유비쿼터스 성질로 인해 신체의 많은 조직에서 발생할 수 있다. 각 샘은 동일한 물질을 분비하지 않을 수 있지만, 세포로의 외분비 기능이 있는 한, 이는 샘으로 간주되며 따라서 이의 악성 형태는 선암종으로 명명된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침범하고 침범하기 충분한 시간이 주어지면 종종 전이되기도 한다. 난소 선암종은 가장 흔한 유형의 난소암종이다. 이는 장액성 및 점액성 선암종, 투명 세포 선암종 및 자궁내막모양 선암종을 포함한다.
"전이"란 암 세포가 원래 위치에서 신체 다른 부위로 전파되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포외 기질로의 침투, 내피 기저막으로 침투하여 체강과 혈관에 침투한 다음, 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관으로의 침투에 따라 달라진다. 최종적으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장은 신생혈관에 따라 달라진다. 종양 전이는 종양 세포 또는 성분이 전이 잠재성을 유지하고 발달시킬 수 있기 때문에 원발성 종양의 제거 후에도 종종 발생한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절계로부터 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 림프절 전이에 관한 것이다. 본 발명의 치료법을 사용하여 치료할 수 있는 전이의 특정 형태는 위암을 원발성으로 하는 전이이다. 바람직한 구현예, 예컨대 위암 전이는 크루켄버그 종양, 복막 전이 및/또는 림프절 전이이다.
크루켄버그 종양은 모든 난소 종양의 1% 내지 2%를 차지하는 난소의 흔치않은 전이성 종양이다. 크루켄버그 종양의 예후는 여전히 매우 저조하며 크루켄버그 종양에 대한 치료법은 확립되어 있지 않다. 크루켄버그 종양은 난소의 전이성 인환 세포 선암종이다. 위는 대부분의 크루켄버그 종양 사례(70%)의 원발부위이다. 결장, 맹장 및 유방(주로 침윤성 소엽암종)은 다음으로 가장 흔한 원발부위이다. 담낭, 담관, 췌장, 소장, 파터팽대(Vater's ampulla), 자궁경부 및 방광/요막관의 암종에서 기원되는 크루켄버그 종양의 희귀한 사례가 보고되고 있다. 원발성 암종의 진단과 이에 따른 난소 개입을 발견하는 사이의 간격은 대개 6개월 또는 그 미만이지만, 더 긴 기간이 보고되었다. 많은 경우에, 원발성 종양은 매우 작아서 검출을 피할 수 있다. 이전의 위 또는 다른 기관의 암종에 대한 병력은 20% 내지 30%의 경우에서만 수득될 수 있다.
크루켄버그 종양 환자는 전반적인 사망률이 현저하게 높다. 대부분의 환자는 2년 이내에 사망한다(중간 생존, 14개월). 여러 연구에 따르면 난소로의 전이가 발견된 후 원발성 종양이 확인되면 예후가 좋지 않으며 원발성 종양이 은밀한(covert) 상태로 남아있다면 예후가 더욱 악화된다.
크루켄버그 종양에 대한 최적의 치료 전략은 문헌에 명확하게 제시되어 있지 않다. 외과적 절제술을 시행해야하는지 여부는 적절하게 다루어지지 않고 있다. 화학요법 또는 방사선 요법은 크루켄버그 종양 환자의 예후에 유의한 영향을 미치지 않는다.
용어 "(치료학적) 처리"는, 특히 본원에서 사용된 바와 같이 암의 치료와 관련하여, 환자의 건강 상태의 개선 및/또는 환자의 수명을 연장 (증가)시키는 것을 목적으로 하는 임의의 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 암을 제거하거나, 환자에서의 종양 크기 또는 수를 감소시키거나, 환자에서 암의 발달을 막거나 저감시키거나, 환자에서 새로운 암의 발달을 억제하거나 저감시키거나, 환자에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/감소시키거나 현재 암에 걸렸거나 이전에 암에 걸렸던 환자에서의 재발을 감소시킬 수 있다. 암의 (치료학적) 처리는 수술, 화학요법, 방사선 치료 및 표적 치료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수술"은 수술에서 종양의 제거를 포함한다. 이는 암에 대한 일반적인 치료법이다. 외과 의사는 국소 절제술을 사용하여 종양을 제거할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화학요법"은 화학요법제 또는 화학요법제의 조합을 사용하는 것을 지칭하며, 바람직하게는 세포를 사멸시키거나 분열을 중단시킴으로써 암 세포의 성장을 중단시키는 것을 지칭한다. 화학요법제가 구강 섭취 또는 정맥이나 근육에 주사되면, 약물이 혈류에 들어가 몸 전체의 암 세포에 도달할 수 있다(전신성 화학요법). 화학요법이 뇌척수액, 기관 또는 복부와 같은 체강에 직접적으로 배치되면, 약물은 주로 해당 부분의 암 세포에 영향을 준다(국소성 화학요법).
본 발명에 따른 화학요법제는 세포증식억제 화합물 및 세포독성 화합물을 포함한다. 전통적인 화학요법제는 대부분의 암 세포의 주요 특성 중 하나인, 급속하게 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 작용한다. 이는 화학요법이 골수, 소화관 및 모낭에 있는 세포와 같이 정상적인 환경에서 빠르게 분열하는 세포에도 해를 끼친다는 것을 의미한다. 이는 화학요법의 가장 흔한 부작용을 초래한다. 본 발명에 따르면, 용어 "화학요법"은 암 세포(CLDN18.2와 같은 종양 항원)에서 비정상적으로 발현되는 단백질을 표적으로 하고 환자의 면역계를 모집(recriut)하여 종양 세포를 파괴하는 작용을 하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 암 세포(CLDN18.2와 같은 종양 항원)에서 비정상적으로 발현되는 단백질을 표적으로 하고, 항체에 접합되는 치료학적 잔기 또는 제제를 통해 작용하는 항체는 화학요법의 한 형태로 볼 수 있다. 그러나, 가장 엄격한 의미에서, 본 발명에 따른 용어 "화학요법"은 표적 치료를 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "표적 치료"는 암 세포와 같은 질환 세포를 우선적으로 표적화하는 반면, 비-질환 세포는 표적화하지 않거나 보다 적은 정도로 표적화하는데 사용할 수 있는 임의의 치료법에 관한 것이다. 질환 세포의 표적화는 바람직하게는 질환 세포의 사멸 및/또는 증식 또는 생존력의 감소를 초래한다. 이러한 치료법은 i) 질환 세포, 예컨대 종양 항원상에서의 특정 세포 표면 표적을 표적으로 하는 치료학적 잔기, 예를 들어 CLDN18.2에 노출되거나 접합되는 항체, 항체 단편 및 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, CLDN18.2에 대한 항체 또는 항체 접합제) 또는 ii) 질환 세포의 증식 또는 생존력을 저해하는 작은 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 제제는 정상 줄기세포보다 질환 줄기세포에서 더 많은 수준으로 발현되는 항원에 결합한다. 특정 구현예에서, 제제는 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 전통적인 화학요법 또는 방사선 요법은 종양을 겨냥하고 있음에도 불구하고 "표적 치료"로 간주되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 용어 "항체 요법"은 바람직하게는 치료학적 잔기에 접합되는 항체, 이의 단편 또는 유도체를 이용한 치료를 포함하지 않지만, 단지 환자의 면역계를 모집하여 종양 세포를 파괴하는 작용을 하는 항체, 이의 단편 또는 유도체를 이용한 치료에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, "보호", "예방" 또는 "예방법"과 같은 용어는 개체에서 질환의 발병 및/또는 전파를 예방하는 것과 관련이 있으며, 특히 피검체에서 질환이 발병할 수 있는 가능성을 최소하하거나, 질환의 발병을 지연시킬 수 있는 것과 관련이 있다. 예를 들어, 암에 걸릴 위험이 있는 피검체는 암을 예방하기 위한 치료법의 후보자가 된다.
"위험이 있는"이란 일반 인구와 비교하여 질환, 특히 암이 발병할 확률이 정상보다 높은 것으로 확인되는 피검체를 의미한다. 또한, 질환, 특히 암에 걸렸거나 현재 암에 걸린 피검체는 이러한 피검체에서 계속해서 질환이 발병할 수 있기 때문에, 질환이 발병할 위험성이 증가된 피검체이다. 또한, 현재 암에 걸렸거나 암에 걸린 적이 있는 피검체는 암 전이 위험성이 증가된다.
"개체" 및 "피검체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)로 고통받거나 민감할 수 있는 비인간 영장류 또는 기타 포유류(예를 들어 마우스, 랫트, 래빗, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만 이들은 질환 또는 장애를 가지거나 가지지 않을수도 있다. 많은 구현예에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "개체" 및 "피검체"는 특정 연령을 나타내지 않으므로 성인, 연장자, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, "개체" 또는 "피검체"는 "환자"이다. 용어 "환자"는 본 발명에 따라 치료 대상, 특히 질환이 있는 대상을 의미한다.
용어 "항원"은 면역 반응이 유도되고/유도되거나 유도될 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 같은 제제에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 항원은 CLDN18.2와 같은 종양-관련 항원이며, 즉 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 구성 성분, 특히 암 세포의 표면 또는 세포내, 바람직하게는 대량으로 생성되는 항원이다.(제 번역이 의미가 이상한지 확인 부탁드려요.)
본 발명의 문맥에서, 용어 "종양-관련 항원" 또는 "종양 항원"은 바람직하게는 제한된 수의 조직 및/또는 기관에 또는 특정 발달 단계에서 정상 조건하에 특이적으로 발현되고 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 문맥에서, 종양-관련 항원은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면과 결합하고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는다.
용어 "에피토프"는 항원 결정기를 지칭하는 것으로, 면역계에 의해 인식되는 분자의 일부분이며, 예를 들어, 에피토프는 항체에 의해 인식된다. 예를 들어, 항체는 면역계에 의해 인식되는 항원 상의 별개의 3차원 부위이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며 일반적으로 특이적 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 갖는다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자(former)는 결합되지만, 후자(latter)는 결합을 상실한다는 점에서 구별된다. CLDN18.2와 같은 단백질의 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하고, 바람직하게는 길이가 5 내지 100개, 바람직하게는 5 내지 50개, 더욱 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 10 내지 25개인 아미노산이고, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개인 아미노산일 수 있다.
용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개 이상의 중(H)쇄 및 경(L)쇄를 포함하는 당단백질을 포함하고 이러한 당단백질의 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 단일클론항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일사슬 항체, 예를 들어 scFv 및 항원-결합 항체 단편 예컨대 Fab 및 Fab' 단편을 제한없이 포함하는 항체의 결합 단편 또는 유도체를 포함하는 분자를 포함하고, 항체의 모든 재조합 형태, 예를 들어, 원핵생물에서 발현된 항체, 비글리코실화된 항체, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체도 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크영역(FR)으로 지칭되는, 더욱 보전된 영역으로 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변적 영역으로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지에 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전형적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물질을 지칭한다. 단일클론항체는 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서, 단일클론항체는 불멸화된 세포에 융합된, 비인간 동물, 예를 들어, 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리된 모든 항체, 예컨대 (a) 면역글로불린 유전자에 대하여 유전자이식(transgenic) 또는 염색체이식(transchromosomal)한 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이들로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체들, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질감염세포(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합의 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리된 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간종의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기서 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인으로 융합된 완전 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형일 수 있거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더욱 유사하게 변형될 수 있다. 인간화 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열들과 상동성인 반면, 사슬의 남아있는 부분은 다른 사슬에서의 상응하는 서열과 상동성인 이들 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유류의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 것으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 분명한 이점은 가변 영역이 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 용이하게 이용가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 알려진 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조의 용이함이라는 이점을 가지고, 특이성은 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역인 것보다는 인간의 것인 불변 영역은 항체가 주사될 때 인간 피검체로부터의 면역반응을 이끌어 낼 확률이 낮다. 그러나, 정의는 이러한 특정 예에 한정되는 것은 아니다.
용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 단순히 "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "결합 단편") 또는 유사한 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 경첩 영역(hinge region)에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546]); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합이 포함된다. 또한, Fv 단편인 VL 및 VH의 2개의 도메인이 별도의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 또한, 이러한 단일 항체는 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 또 다른 예로는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이 있으며, 이는 (i) 면역글로불린 경첩 영역 폴리펩타이드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 경첩 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합되는 면역글로블린을 중쇄 CH3 불변 영역을 포함된다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 기재되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.
자연적으로 발생하는 항체는 일반적으로 단일특이적으로, 즉, 단일 항원에 결합한다. 본 발명은 표적 세포(종양 항원에 관여시킴으로써) 및 세포독성 세포와 같은 제2개체(예를 들어, CD3 수용체에 관여시킴으로써)에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 이중특이적 또는 다중특이적, 예컨대 삼중특이적, 사중특이적일 수 있다.
용어 "이중특이적 분자"는 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) CLDN18.2와 같은 세포 표면 항원, 및 (b) 효과기 세포의 표면상의 Fc 수용체와 같은 수용체와 결합하거나 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자"는 2가지 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 제제를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) CLDN18.2와 같은 세포 표면 항원, (b) 효과기 세포의 표면상의 Fc 수용체와 같은 수용체, 및 (c) 하나 이상의 다른 구성요소와 결합하거나 상호작용할 수 있다. 따라서, 용어 "항체"는 종양 항원 및 다른 표적, 예컨대 효과기 세포상의 Fc 수용체에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 용어 "이중특이적 항체"에는 이중체(diabody)가 포함된다. 이중체는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일한 사슬의 두 도메인 사이에 쌍을 이룰 수 없는 링커를 사용하는 이가의 이중특이적 항체로서, 상기 도메인이 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록하고 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다(예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123] 참조).
항체는 마우스, 랫트, 래빗, 기니피그 및 인간을 포함하는 상이한 종으로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다
본원에서 사용된 바와 같이, "아이소타입 스위칭"은 항체의 부류 또는 아이소타입에 의해 하나의 Ig 부류에서 다른 Ig 부류 중 하나로 변화되는 현상을 지칭한다.
본원에 기재된 항체는 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체와 같은 IgA를 포함한다. 다양한 구현예에서, 항체는 IgG1 항체, 보다 특히 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 아이소타입(즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체(예를 들어, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체(예를 들어, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체(예를 들어, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체(예를 들어, IgG4, κ, λ)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이종항체"는 그러한 항체를 생성하는 형질전환 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 형질전환 유기체로 이루어지지 않은 유기체에서 발견되는 것과 상응하고, 일반적으로 형질전환 유기체 이외의 종으로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 코딩된 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 연결된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본원에 기재된 항체는 바람직하게는 분리된다. 본원에 사용된 바와 같이, "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로는 포함하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 종양 항원 이외에 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로는 포함하지 않는다). 그러나, 인간 종양 항원의 에피토프, 동형단백질 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원(예를 들어, 종양 항원 종 동족체)과 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, "분리된" 단일클론항체의 조합은 상이한 특이성을 가지며 명확히 정의된 조성물 또는 혼합물에 결합된 항체에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, 본원에 기재한 바와 같이, 항체가 특히 질환 세포상의 종양 항원과 같은 이의 표적에 결합될 때, 면역 효과기 기능을 유도하는 경우, 환자의 면역계를 모집하여 종양 세포를 파괴하는 작용을 한다. 바람직하게는, 상기 면역 효과기 기능은 표면 상에 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 갖는 암 세포와 같은 세포에 대해 작용한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "면역 효과기 기능"이란 예를 들어, 종양의 확산 및 전이의 억제를 포함하는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 발생의 억제를 야기하는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 면역 효과기 기능은 암 세포의 사멸을 야기한다. 이러한 기능은 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포-매개 식균작용(ADCP), 종양 항원을 보유하는 세포에서의 세포사멸 유도, 종양을 보유하는 세포의 세포 용해 및/또는 종양 항원을 보유하는 세포의 증식 억제를 포함한다.
항체-의존성 세포-매개 세포독성
ADCC는 효과기 세포, 특히 림프구의 세포 살상 능력을 기술하며, 이는 바람직하게는 표적 세포가 항체에 의해 표시되도록 한다.
ADCC는 바람직하게는 항체가 종양 세포상의 항원에 결합하고 항체 Fc 도메인이 면역 효과기 세포 표면의 Fc 수용체(FcR)와 결합할 때 발생한다. Fc 수용체의 여러 계열이 확인되었으며, 특정 세포 집단은 정의된 Fc 수용체를 특이적으로 발현한다. ADCC는 항원 제시 및 종양-지향성 T 세포 반응의 유도를 야기하는 다양한 수준의 즉각적인 종양 파괴를 직접적으로 유도하는 기작으로 볼 수 있다. 바람직하게는, ADCC의 생체내 유도는 종양-지향성 T 세포 반응 및 숙주-유래 항체 반응을 야기할 것이다.
보체 -의존성 세포독성
CDC는 항체에 의해 유도될 수 있는 또 다른 세포-살상 방법이다. IgM은 보체 활성화에 가장 효과적인 아이소타입이다. IgG1 및 IgG3은 또한 전형적인 보체-활성화 경로를 통해 CDC를 유도하는데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 이 캐스케이드에서, 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자(C1q는 보체 C1의 3 개의 부성분 중 하나임)와 같은 참여 항체 분자의 CH2 도메인상에서 근접한 다수의 C1q 결합 부위의 비클로킹(uncloaking)을 초래한다. 바람직하게는 이들 비클로킹된 C1q 결합 부위는 이전에 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호작용을 일련의 다른 보체 단백질과 관련된 캐스케이드의 사건을 유발하고 효과기-세포 화학주성/활성화 제제인 C3a 및 C5a의 단백질분해성 방출을 유도하는 높은 결합활성 중 하나로 전환시킨다. 바람직하게는, 보체 캐스케이드는 막 침투 복합체의 형성을 종료시키며, 이는 세포 안팎으로 물과 용질의 자유로운 통과를 용이하게 하는 세포막 내에 공극을 생성한다.
놀랍게도, 본원에 기재된 항체 약물 접합체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개 용해 및/또는 항체 의존성 세포독성(ADCC) 매개 용해를 유도함으로써 세포, 특히 CLDN18.2를 발현하는 세포, 예컨대 암세포의 살상을 매개할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 접합체는 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개 용해 및/또는 항체 의존성 세포독성(ADCC) 매개 용해, 바람직하게는 CDC 매개 용해 및 ADCC 매개 용해를 통해 유도함으로써 세포의 살상을 매개한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체가 동물을 면역화시키거나 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 시스템으로부터 수득된 경우 특정 생식세포계 서열로부터 "유래된" 것이며, 선별된 항체는 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하다. 전형적으로, 특정 생식세포계 서열로부터 유래되는 항체는 생식생포계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산, 바람직하게는 5개 이하, 보다 더 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1 이하의 상이한 아미노산을 나타낼 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로항체"는 함께 연결된 2개 이상의 항체, 이의 유도체 또는 항원 결합 영역을 지칭하며, 이들 중 2개 이상은 상이한 특이성을 갖는다. 이러한 상이한 특이성은 효과기 세포상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성, 및 항원 또는 에피토프 또는 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포에 대한 결합 특이성을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질감염종"은 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포 또는 효모 세포를 포함하는 진균과 같은 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 본원에서 기재된 바와 같이 모든 항체 및 항체의 유도체를 포함하며, 이는 본 발명의 목적상 "항체"라는 용어에 포괄된다. 용어 "항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어, 항체와 다른 제제 또는 항체와의 접합체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "종양 항원에 대한 항체" 또는 유사한 용어는 종양 항원에 결합하거나 종양 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항체 약물 접합체는 미리 결정된 표적에 대해 유의한 친화도를 갖고 표준 검정법에서 상기 미리 결정된 표적에 결합하는 경우에 상기 미리 결정된 표적에 결합할 수 있다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 종종 평형 해리상수(KD)에 의해 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의한 친화도"는 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하의 해리상수(KD)로 미리 결정된 표적에 대한 결합을 의미한다.
항체 또는 항체 약물 접합체가 표적에 대해 유의한 친화도를 나타내지 않으면, 상기 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없고 표준 검정법에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않고, 특히 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 약물 접합체는 2 이하, 바람직하게는 10, 더욱 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100μg/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하는 경우에 상기 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 약물 접합체가 결합 가능한 미리 결정된 표적에 결합하는 것에 대한 KD보다 적어도 10배, 102배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 높은 KD로 상기 표적에 결합하면, 항체 또는 항체 약물 접합체는 표적에 대한 유의적 친화도를 갖지 않는다. 예를 들어, 항체 또는 항체 약물 접합체가 결합 가능한 표적에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체의 결합에 대한 KD가 10-7M이면, 항체 또는 항체 약물 접합체가 유의한 친화도를 갖지 않는 경우에 표적에의 결합에 대한 KD는 적어도 10-6M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 10-2M, 또는 10-1M일 수 있다.
항체 또는 항체 약물 접합체는 미리 결정된 표적에 결합 가능하지만 다른 표적에 결합 가능하지 않는 것, 즉 표준 검정법에서 다른 표적에 대해 유의적 친화도가 없고 다른 표적에 유의적으로 결합하지 않으면 상기 미리 결정된 표적에 대해 특이적이다. 본 발명에 따르면, 항체 또는 항체 약물 접합체가 종양 항원에 결합 가능하지만 다른 표적에 (실질적으로) 결합 가능하지 않으면 CLDN18.2와 같은 종양 항원에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 이러한 다른 표적에 대한 친화도 및 결합이 종양 항원과 관련이 없는 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 사람 혈청 알부민(HSA) 또는 비-종양 항원 막관통 단백질, 예컨대 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체 또는 다른 임의의 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 및 결합이 유의적으로 초과되지 않으면 항체 또는 항체 약물 접합체는 종양 항원에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 특이적이지 않은 표적에 결합하는 것에 대한 KD보다 적어도 102배, 103배, 104배, 105배, 106배, 107배, 108배, 109배, 또는 1010배 미만인 KD로 표적에 결합하면 항체 또는 항체 약물 접합체는 미리 결정된 표적에 대해 특이적이다. 예를 들어, 특이적인 표적에 대한 항체 또는 항체 약물 접합체의 결합에 대한 KD가 10- 7M인 경우, 비특이적 표적과의 결합에 대한 KD는 적어도 10-6M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 10-2M, 또는 10-1M이다.
표적에 대한 항체의 결합은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있으며, 예를 들어, 문헌 [Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본원에 기재된 방법이 참조된다. 친화도는 평형 투석법과 같은 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있고, 제조자에 의해 개설된 일반적인 절차를 사용하여 BIAcore 200 기기를 사용함으로써 용이하게 결정될 수 있고, 방사성 표지된 표적 항원을 사용하는 방사면역측정법, 또는 숙련된 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 문헌 [Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)]의 방법에 의해 분석될 수 있다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예를 들어, 염 농도, pH 하에서 측정되는 경우에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 결합 매개변수, 예를 들어 KD, IC50의 측정은 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액을 가지고 이루어지는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "자연적 발생"은 대상에 적용되는 것으로서, 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 원천으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적인 것이다.
본원에서 사용된 용어 "재배열된"은 V 세그먼트가 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 각각 코딩하는 형태로 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자 좌위의 배열을 지칭한다. 재배열된 면역글로불린(항체) 유전자 좌위는 생식세포계 DNA와 비교하여 확인할 수 있다. 재배열된 유전자 좌위는 하나 이상의 재조합 헵타머/노나머 상동성 요소를 가질 것이다
V 세그먼트와 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식세포계 배열"이라는 용어는 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접하도록 재조합되지 않는 구성을 지칭한다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 CLDN18.2의 세포외 도메인, 특히 첫 번째 세포외 도메인 내에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 CLDN18.2의 29 내지 78 아미노산 위치에 위치하는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 특정 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) CLDN18.1, 바람직하게는 서열번호 3, 4, 및 5에 존재하지 않는 CLDN18.2 상에서의 에피토프, (ii) CLDN18.2-loop1, 바람직하게는 서열번호 8상에 위치하는 에피토프, (iii) CLDN18.2-loop2, 바람직하게는 서열번호 10 상에 위치하는 에피토프, (iv) CLDN18.2-loopD3, 바람직하게는 서열번호 11상에 위치하는 에피토프, (v) CLDN18.2-loop1 및 CLDN18.2-loopD3를 포함하는 에피토프, 또는 (vi) CLDN18.2-loopD3, 바람직하게는 서열번호 9 상에 위치하는 비-글리코실화 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다.
본 발명에 따라, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.1이 아닌 CLDN18.2에 결합할 수 있는 능력을 갖는 항체이다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 CLDN18.2에 특이적이다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 세포 표면상에서 발현되는 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체이다. 특히 바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 살아있는 세포의 표면상에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 1, 3-11, 44, 46 및 48-50로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드에 결합한다. 바람직하게는, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 전술한 단백질, 펩타이드 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체에 대해 특이적이다. CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 1, 3-11, 44-46 및 48-50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩타이드, 또는 핵산 또는 상기 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 숙주세포로 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 암 세포, 특히 상기 언급된 암 유형의 세포에 결합하고, 바람직하게는 실질적으로 비-암성 세포에 결합하지 않는다.
특히 바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 DSMZ(Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; new address: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany)에 기탁된 하이브리도마에 의해 제조되며, 하기 지정 번호 및 등록 번호를 갖는다:
a. 182-D1106-055, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2737
b. 182-D1106-056, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2738
c. 182-D1106-057, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2739
d. 182-D1106-058, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2740
e. 182-D1106-059, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2741
f. 182-D1106-062, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2742
g. 182-D1106-067, 2005년 10월 19일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2743
h. 182-D758-035, 2005년 11월 17일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2745
i. 182-D758-036, 2005년 11월 17일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2746
j. 182-D758-040, 2005년 11월 17일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2747
k. 182-D1106-061, 2005년 11월 17일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2748
l. 182-D1106-279, 2006년 10월 26일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2808
m. 182-D1106-294, 2006년 10월 26일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2809
n. 182-D1106-362, 2006년 10월 26일에 기탁된 수탁번호 DSM ACC2810.
본 발명에 따른 바람직한 항체는 상술한 하이브리도마에 의해 생산되고 이로부터 수득 가능한 항체이다; 즉, 182-D1106-055의 경우 37G11, 182-D1106-056의 경우 37H8, 182-D1106-057의 경우 38G5, 182-D1106-058의 경우 38H3, 182-D1106-059의 경우 39F11, 182-D1106-062의 경우 43A11, 182-D1106-067의 경우 61C2, 182-D758-035의 경우 26B5, 182-D758-036의 경우 26D12, 182-D758-040의 경우 28D10, 182-D1106-061의 경우 42E12, 182-D1106-279의 경우 125E1, 182-D1106-294의 경우 163E12 및 182-D1106-362의 경우 175D10; 및 이들의 키메라화 및 인간화 형태이다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 (i) 수탁번호 DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 또는 DSM ACC2810으로 기탁된 클론에 의해 생산되는 항체 및/또는 이로부터 수득 가능한 항체, (ii) (i)에 따른 항체의 키메라화 또는 인간화 형태인 항체, (iii) (i) 에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체, 및 (iv) (i)에 따른 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 부위, 특히 가변 영역을 포함하며, 바람직하게는 (i)에 따른 항체의 특이성을 갖는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다
바람직한 항체, 특히 키메라화 항체 및 이들의 서열을 하기 표에 나타내었다.
Figure 112017101154150-pct00001
바람직한 구현예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 키메라화 형태의 항체는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열과 같은 인간 중쇄 불변 영역으로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하는 항체를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 키메라화 형태의 항체는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 같은 인간 경쇄 불변 영역으로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체, 특히 본 발명에 따른 키메라화 형태의 항체는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열과 같은 인간 CH로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 CH 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 같은 인간 CL로부터 유래되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 CL을 포함하는 항체를 포함한다.
일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 카파(kappa), 뮤린 가변 경쇄, 인간 카파 경쇄 불변 영역 알로타입(allotype) Km(3), 뮤린 중쇄 가변 영역, 인간 IgG1 불변 영역, 알로타입 G1m(3)을 포함하는 키메라 마우스/인간 IgG1 단일클론항체이다.
특정 바람직한 구현예에서, 키메라화 형태의 항체는 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 바람직한 구현예에서, 키메라화 형태의 항체는 하기 가능한 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체를 포함한다:
(i) 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(ii) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(iii) 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(iv) 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(v) 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(vi) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(vii) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(viii) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(ix) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(x) 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄.
(ii), (v) 또는 (x)에 따른 항체는 "CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체"의 바람직한 구현예이다. (v) 또는 (x)에 따른 항체가 특히 바람직하다.
상기에서 사용된 "단편" 또는 "아미노산 서열의 단편"은 항체 서열의 일부, 즉, N-말단 및/또는 C-말단이 짧아진 항체 서열을 나타내는 서열에 관한 것이며, 이는 항체에서 상기 항체 서열을 대체할 때CLDN18.2에 대한 상기 항체의 결합을 유지한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 단편은 상기 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 포함한다. 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 단편은 바람직하게는 N-말단의 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산이 제거된 상기 서열에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 하기 가능한 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 조합을 포함한다:
(i) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(ii) 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(iii) 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(iv) 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(v) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(vi) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(vii) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(viii) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL,
(ix) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VH 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 VL.
(ii) 또는 (v)에 따른 항체는 "CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체"의 바람직한 구현예이다. (v)에 따른 항체가 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 용어 "단편"은 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변 영역을 지칭한다. 일 구현예에서 상기 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)은 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, 용어 "단편"은 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 지칭한다.
바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 하기 구현예 (i) 내지 (vi)로부터 선택되는 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VH를 포함한다:
(i) CDR1: 서열번호 14의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 14의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 14의 위치 116-125,
(ii) CDR1: 서열번호 15의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 15의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 15의 위치 116-126,
(iii) CDR1: 서열번호 16의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 16의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 16의 위치 116-124,
(iv) CDR1: 서열번호 17의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 17의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 17의 위치 116-126,
(v) CDR1: 서열번호 18의 위치 44-51, CDR2: 서열번호 18의 위치 69-76, CDR3: 서열번호 18의 위치 115-125, 및
(vi) CDR1: 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2: 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3: 서열번호 19의 위치 117-128.
바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 하기 구현예 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VL을 포함한다:
(i) CDR1: 서열번호 20의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 20의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 20의 위치 115-123,
(ii) CDR1: 서열번호 21의 위치 49-53, CDR2: 서열번호 21의 위치 71-73, CDR3: 서열번호 21의 위치 110-118,
(iii) CDR1: 서열번호 22의 위치 47-52, CDR2: 서열번호 22의 위치 70-72, CDR3: 서열번호 22의 위치 109-117,
(iv) CDR1: 서열번호 23의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 23의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 23의 위치 115-123,
(v) CDR1: 서열번호 24의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 24의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 24의 위치 115-123,
(vi) CDR1: 서열번호 25의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 25의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 25의 위치 115-122,
(vii) CDR1: 서열번호 26의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 26의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 26의 위치 115-123,
(viii) CDR1: 서열번호 27의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 27의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 27의 위치 115-123, 및
(ix) CDR1: 서열번호 28의 위치 47-52, CDR2: 서열번호 28의 위치 70-72, CDR3: 서열번호 28의 위치 109-117.
바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 하기 구현예 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 각 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 14의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 14의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 14의 위치 116-125, VL: CDR1: 서열번호 21의 위치 49-53, CDR2: 서열번호 21의 위치 71-73, CDR3: 서열번호 21의 위치 110-118,
(ii) VH: CDR1: 서열번호 15의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 15의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 15의 위치 116-126, VL: CDR1: 서열번호 20의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 20의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 20의 위치 115-123,
(iii) VH: CDR1: 서열번호 16의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 16의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 16의 위치 116-124, VL: CDR1: 서열번호 22의 위치 47-52, CDR2: 서열번호 22의 위치 70-72, CDR3: 서열번호 22의 위치 109-117,
(iv) VH: CDR1: 서열번호 18의 위치 44-51, CDR2: 서열번호 18의 위치 69-76, CDR3: 서열번호 18의 위치 115-125, VL: CDR1: 서열번호 25의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 25의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 25의 위치 115-122,
(v) VH: CDR1: 서열번호 17의 위치 45-52, CDR2: 서열번호 17의 위치 70-77, CDR3: 서열번호 17의 위치 116-126, VL: CDR1: 서열번호 24의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 24의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 24의 위치 115-123,
(vi) VH: CDR1: 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2: 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3: 서열번호 19의 위치 117-128, VL: CDR1: 서열번호 23의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 23의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 23의 위치 115-123,
(vii) VH: CDR1: 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2: 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3: 서열번호 19의 위치 117-128, VL: CDR1: 서열번호 26의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 26의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 26의 위치 115-123,
(viii) VH: CDR1: 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2: 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3: 서열번호 19의 위치 117-128, VL: CDR1: 서열번호 27의 위치 47-58, CDR2: 서열번호 27의 위치 76-78, CDR3: 서열번호 27의 위치 115-123, 및
(ix) VH: CDR1: 서열번호 19의 위치 45-53, CDR2: 서열번호 19의 위치 71-78, CDR3: 서열번호 19의 위치 117-128, VL: CDR1: 서열번호 28의 위치 47-52, CDR2: 서열번호 28의 위치 70-72, CDR3: 서열번호 28의 위치 109-117.
(ii) 또는 (v)에 따른 항체는 "CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체"의 바람직한 구현예이다. (v)에 따른 항체가 특히 바람직하다.
추가의 바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.2에 대한 단일클론항체, 바람직하게는 본원에 기재된 CLDN18.2에 대한 단일클론항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변 영역을 포함하고, 바람직하게는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 바람직하게는 적어도 CDR3 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)은 본원에 기재된 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 바람직하게는 CLDN18.2에 대한 단일클론항체, 바람직하게는 본원에 기재된 CLDN18.2에 대한 단일클론항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 CDR, CDR 세트 또는 CDR 세트의 조합을 포함하는 항체는 상기 CDR과 이의 개재(intervening) 프레임워크 영역을 함께 포함한다. 바람직하게는, 상기 부분은 또한 제 1 및 제 4프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 모두의 약 50% 이상을 포함할 것이며, 50%는 제1프레임워크 영역의 C-말단 50% 및 제4프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 항체의 구축은 본 발명의 가변 영역을 면역글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인(예를 들어 이중체(diabody)의 생산) 또는 단백질 표지를 포함하는 추가의 단백질 서열에 결합시키는 링커의 도입을 포함하는 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 코딩되는 가변 영역에 잔기 N-말단 또는 C-말단의 도입을 초래한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR, CDR 세트 또는 CDR 세트의 조합을 포함하는 항체는 인간 항체 프레임워크에서 상기 CDR을 포함한다.
본원에서 항체의 중쇄와 관련하여 특정 사슬, 또는 특정 영역 또는 서열을 포함하는 항체는 바람직하게는 상기 항체의 모든 중쇄가 상기 특정 사슬, 영역 또는 서열을 포함하는 경우에 관한 것이다. 이는 항체의 경쇄에 상응하여 적용된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 본원에 기재된 CLDN18.2-결합 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 에피토프를 인식, 즉 결합하고/결합하거나 상기 CLDN18.2 결합 항체와 CLDN18.2 결합에 대해 경쟁하는 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는, 특히 항체 약물 접합체에 존재하는 경우, 바람직하게는 항체 및/또는 항체 약물 접합체의 세포내섭취를 허용하기에 적합한 CLDN18.2에 대한 친화도 및/또는 특이성을 갖는다.
용어 "세포내섭취"는 진핵 세포가 원형질 막의 세그먼트, 세포 표면 수용체 및 세포 외액의 성분을 내부화하는 과정을 지칭한다. 세포내섭취 기작은 수용체 매개 세포내섭취를 포함한다. 용어 "수용체-매개 세포내섭취"는 리간드가 표적에 결합할 때, 막의 함입 및 핀칭(pinching)을 유발하고, 내재화되고, 세포질로 전달되거나 적절한 세포내 구획으로 전달되는 생물학적 기작을 지칭한다.
또한, 본 발명은 "CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체"가 임의의 "CLDN18.2에 대한 결합제"를 포괄하는 의미를 갖는 구현예를 구상한다. 본 발명에 따라, "CLDN18.2에 대한 결합제"는 CLDN18.2에 대한 결합 능력을 갖는 임의의 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 결합제는 CLDN18.2에 대한 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 이 용어는 나노본체, 애피바디(affibody), 안티칼린(anticalin), DARPin, 모노바디(monobody), 아비머(avimer) 및 미소체를 포함하는 CLDN18.2에 대한 결합 능력을 갖는 모든 인공 결합 분자(골격; scaffold)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일 구현예에서, 상기 결합제는 CLDN18.2의 세포외 도메인에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 결합제는 살아있는 세포의 표면 상에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 결합제는 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 대한 상기 결합은 특이적 결합이다.
용어 "결합 도메인"은 본 발명과 관련하여, 예를 들어, 주어진 표적 구조/항원/에피토프에 결합/상호작용하는 항체의 구조인 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 도메인은 "항원-상호작용-부위"를 나타낸다.
암 세포에 대한 치료 효과를 나타내는 임의의 제제는 항-CLDN18.2 항체 또는 이의 유도체에 대한 접합용 약물로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약물의 접합은 본원에 기재된 바와 같이, 항체의 결합 특성, 특히 특이성을 변경시키지 않거나 현저하게 변경시키지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 약물 접합체는 바람직하게는 접합에 사용된 항체와 동일하거나 본질적으로 동일한 결합 특성, 특히 특이성을 갖는다. 따라서, 접합에 사용되는 항체에 대해 특정 결합 특성이 본원에 기재된 경우, 항체 약물 접합체 또한 그러한 결합 특성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체가 CLDN18.2의 세포외 도메인에 결합하고/결합하거나 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다고 기재된 경우, 항체 약물 접합체는 LDN18.2의 세포외 도메인에 결합하고/결합하거나 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프에 결합하는 것이 바람직하다.
통상적으로, 약물은 세포독성제 또는 세포증식억제제이다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해롭고, 특히 세포를 살상시키는 임의의 제제를 포함한다.
유용한 부류의 세포독성 제제는 예를 들어, 항-튜불린(antitubulin) 제제, DNA 마이너 그루브 바인더(minor groove binder)(예를 들어, 에네다인(enediyne) 및 렉시트롭신(lexitropsin)), DNA 복제 저해제, 알킬화제(예를 들어, 시스-백금, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 복합체 및 카보플라틴(carboplatin)), 안트라사이클린(anthracycline), 항생제, 항엽산(antifolate), 대사저해제, 화학요법 증감제, 듀오카마이신(duocarmycin), 에토포시드(etoposide), 플루오르화 피리미딘, 이오노포어(ionophore), 니트로소우레아(nitrosourea), 플래티놀(platinol), 예비성형(pre-forming) 화합물, 푸린 대사저해제(purine antimetabolite), 퓨로마이신(puromycin), 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산(taxane)(예를 들어, 파크리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)), 국소이성화효소 억제제(topoisomerase inhibitor), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 등을 포함한다.
개개의 세포독성 재재는 예를 들어, 안드로겐, 안트라마이신(AMC), 아스파라기나아제, 5-아자시티딘(5-azacytidine), 아자티오프린(azathioprine), 블레오마이신(bleomycin), 부설판(busulfan), 부티오닌 설폭시민(buthionine sulfoximine), 캄프토테신(camptothecin), 카보플라틴, 카스무스틴(BSNU), CC-1065, 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴, 콜히친(colchicine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 시티딘 아라비노사이드(cytidine arabinoside), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin)(이전의 안티노마이신), 다우노루비신(daunorubicin), 디카바진(dacarbazine), 도세탁셀, 독소루비신(doxorubicin), 에스트로겐, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D(gramicidin D), 하이드록시우레아, 아이다루비신(idarubicin), 아이포스파마이드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 로무스틴(CCNU), 메클로레타민(mechlorethamine), 멜파란(melphalan), 6-머캅토푸린, 메토트렉사트(methotrexate), 미스라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin C), 미토산트론(mitoxantrone), 니트로이미다졸, 파크리탁셀, 플리카마이신(plicamycin), 프로카비진(procarbazine), 스트렙토조토신(streptozotocin), 테노포시드(tenoposide), 6-티오구아닌, 티오테파(thioTEPA), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), VP-16 및 VM-26을 포함한다.
항-튜불린 제제의 예로는 돌라스타틴(dolastatin)(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), 메이탄시노이드(maytansinoid), 탁산(예를 들어, 파크리탁셀, 도세탁셀), T67(Tularik), 빈카 알킬로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈주), 바카틴(baccatin) 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론(epothilone) A 및 B), 노코다졸(nocodazole), 콜히친(colchicine) 및 콜시미드(colcimid), 에스트라무스틴(estramustine), 크립토피신(cryptophysin), 세마도틴(cemadotin), 콤브레타스타틴(combretastatin), 디스코데르몰리드(discodermolide) 및 엘루테로빈(eleutherobin)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 구현예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 아우리스타틴 E(당업계에서 돌라스타틴-10으로도 알려짐) 또는 이의 유도체이다. 통상적으로, 아우리스타틴 E 유도체는 예를 들어, 아우리스타틴 E 및 케토산 사이에 형선된 에스테르이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 통상적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF 및 MMAE를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 다른 유형의 항-튜불린 제제인 메이탄시노이드이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 메이탄시노이드는 메이탄신, DM-1 또는 DM-4이다.
메이탄시노이드는 유사분열 시 세포의 증식을 억제하는 강력한 미세소관-표적 화합물이다. 메이탄시노이드는 염소화 벤젠 고리에 결합된 19-원 안사 매크로라이드(ansa macrolide) 구조인 메이탄신 유도체이다. 메이탄신에는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112017101154150-pct00002
또한, 특정 미생물이 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생성한다는 것을 발견하였다(미국 특허번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 예를 들어, 미국 특허번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,362,663; 및 4,371,533 및 문헌 [Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451]에서 보고된 바 있으며, 본원에서 참고로 인용된다.
메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 원료로부터 분리될 수 있다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4와 같은 메티탄신의 티올-함유 유도체이다. 이러한 메이탄신의 티올-함유 유도체는 카보닐기에 결합된 메틸기가 -R-SH와 같은 유리 설프하이드릴기를 함유하는 기로 대체되는 화합물을 포함하며, 여기서 R은 알킬렌기 또는 기타 탄소-함유 기이다.
메르탄신으로도 알려져 있는 DM1은 하기 화학식을 갖는 메이탄시노이드이다:
Figure 112017101154150-pct00003
특히, 용어 "메르탄신" 또는 "DM1"는 화합물 N 2'-디아세틸-N 2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신을 지칭한다.
"DM4"는 화합물 N 2'-디아세틸-N 2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신을 지칭한다.
항-CLDN18.2 항체-메이탄시노이드 접합체는 항-CLDN18.2 항체를 항체 또는 메이탄시노이드 분자 중 어느 하나의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로서 제조될 수 있다. 독소/항체의 하나의 분자조차도 노출 항체의 사용에 비해 세포독성을 증가시킬 것으로 기대되지만, 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자가 항체 분자 당 접합될 수 있다.
이와 관련하여, 용어 "하나 이상의 독소 약물 잔기에 공유결합된 항체" 는 동일한 약물의 하나 이상의 분자가 항체 분자에 공유결합된 경우뿐만 아니라 상이한 약물이 항체 분자에 공유결합된 경우를 포함한다. 후자의 경우, 각각의 상이한 약물의 하나 이상의 분자가 항체 분자 또는 이의 조합에 결합될 수 있다(예를 들어, 한 약물의 한 분자가 결합되고 다른 약물의 여러 분자가 결합됨).
본 발명의 일부 구현예에서, 항체는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체인 아우리스타틴(미국 특허번호 5,635,483; 5,780,588; 본원에 참고로 인용됨)에 접합된다. 아우리스타틴은 해양 연체동물인 돌라벨라 오리큘라리아 (Dolabella auricularia )에서 유래한 천연물질인 돌라스타틴 10의 합성 유사체이다. 메이탄시노이드와 마찬가지로, 아우리스타틴은 미세소관 교란물질(disruptor)이다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 잔기는 펩타이드성 약물 잔기의 N(아미노) 말단 또는 C(카복시) 말단을 통해 항체에 결합될 수 있다.
예시적인 아우리스타틴 구현예는 바람직하게는 N-말단 연결된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸 아우리스타틴 약물 잔기를 포함한다.
모노메틸 아우리스타틴 E로도 알려진 MMAE는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112017101154150-pct00004
특히, 용어 "MMAE"는 화합물 (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드를 지칭한다. MMAE는 실제로 데스메틸-아우리스타틴 E이고, 즉, N-말단 아미노기는 아우리스타틴 E 자체에서와 같이 2개 대신에 하나의 메틸 치환기만을 갖는다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 것은 항체-vc아우리스타틴 접합체, 예컨대 항-vcMMAE 접합체이다. 본 발명에 따르면, 용어 "항체-vc아우리스타틴" 또는 "vcMMAE"는 리소좀 분해성 디펩타이드, 발린-시트률린(vc)을 포함하는 링커를 통해 항체에 연결된 MMAE와 같은 아우리스타틴을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 지칭한다.
모노메틸 아우리스타틴 F로도 알려진 MMAF는 화합물 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익산을 지칭한다.
항체 약물 접합체의 생성은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 항체 약물 접합체는 통상적인 기술에 따라 항체에 약물을 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 항체 및 약물은 이들 자신의 링커 그룹을 통해 직접적으로 서로 결합되거나 링커 또는 다른 물질을 통해 간접적으로 서로 결합될 수 있다.
항체에 약물을 공유결합시키는데는 여러 다양한 반응이 가능하다. 이는 종종 리신의 아민기, 글루탐산 및 아스파프트산의 유리 카복실산기, 시스테인의 설프하이드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 잔기를 포함하는 항체 분자의 아미노산 잔기의 반응에 의해 달성된다. 공유결합의 가장 일반적으로 사용되는 비특이적 방법 중 하나는 화합물의 카복시(또는 아미노)기를 항체의 아미노(또는 카복시)기에 연결시키는 카보디이미드 반응이다. 또한, 디알데히드 또는 이미도에스테르와 같은 이관능성 제제는 화합물의 아미노기를 항체 분자의 아미노기와 연결시키는데 사용되어 왔다. 또한 항체에 약물을 결합하는데 쉬프(Schiff) 염기 반응이 가능하다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 함유하는 약물의 과요오드산 산화를 포함하며, 따라서 알데히드를 형성한 후 알데히드를 항체 분자와 반응시킨다. 결합은 항체 분자의 아미노기를 갖는 쉬프 염기의 형성을 통해 일어난다. 또한, 이소티오시아네이트는 약물을 항체에 공유결합시키는 커플링제로 사용될 수 있다. 다른 기술은 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명의 범위 내에 있다.
항체 약물 접합체를 제조하기 위한 많은 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커는 바람직하게는 항체 및 약물 중 하나 또는 모두와 반응하는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 작용기의 예로는 아미노, 카복실, 머캅토, 말레이미드 및 피리디닐기를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체는 이관능성 가교 결합제를 통해 약물과 결합된다. 본원에 사용된 바와 같이, "이관능성 가교 결합제"는 항체와 반응할 수 있는 2개의 반응성기 중 하나를 보유하고, 다른 하나는 약물과 반응하여 항체와 약물을 연결시킬 수 있는 제제를 지칭하며, 접합체를 형성한다. 링커 제제가 약물의 보유, 예를 들어 항체의 세포독성 및 표적 특성을 제공하는 한, 임의의 적합한 이관능성 가교 결합제가 본 발명과 관련되어 사용될 수 있다. 바람직하게는, 링커 분자는 약물 및 항체가 서로 화학적으로 결합(예를 들어, 공유결합)되도록 화학 결합을 통해 항체에 결합된다.
일 구현예에서, 이관능성 가교 결합제는 비-절단성 링커를 포함한다. 비-절단성 링커는 메이탄시노이드와 같은 약물을 항체에 안정한 공유결합 방식으로 결합시킬 수 있는 임의의 화학적 잔기이다. 바람직하게는, 비-절단성 링커는 생리학적 조건하에서, 특히 세포 내에서 절단될 수 없다. 따라서, 비-절단성 링커는 약물 또는 항체가 활성 상태로 남아있는 조건에서 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다아제-유도 절단, 에스테라제-유도 절단 및 다이설파이드 결합 절단에 대해 실질적으로 저항력이 있다. 약물과 항체 사이의 비-절단성 링커를 형성하는 적합한 가교 결합제는 당업계에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 약물은 티오에테르 결합을 통해 항체에 결합된다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 연결 제제는 절단성 링커이다. 바람직하게는, 절단성 링커는 생리학적 조건 하에서, 특히 세포 내에서 절단 가능하다. 적합한 절단성 링커의 예로는 다이설파이드 링커, 산분해성(acid labile) 링커, 광분해성(photolabile) 링커, 펩티다아제 분해성 링커 및 에스테아제 분해성 링커가 포함된다.
링커의 예로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(SPDB), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC), N-숙신이미딜-4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트(SMCC), N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), 4-말레이미도부티르산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(GMBS), 3-말레이미도카프로산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-숙신이미드 에스테르(AMAS), 숙신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH), N-숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트(SMPB), N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(PMPI), 6-말레이미도카프로일(MC), 말레이미도프로파노일(MP), p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP) 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 발린-시트룰린(Val-Cit) 또는 알라닌-페닐알라닌(ala-phe)과 같은 펩타이드 링커가 사용될 수 있으며, 전술한 링커 중 임의의 것이 적절하게 조합되어 사용될 수 있다.
디설파이드를 함유하는 링커는 생리학적 조건하에서 발생할 수 있는 디설파이드 교환을 통해 절단 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 링커는 환원 조건(예를 들어, 디설파이드 링커)하에서 절단 가능하다. 공지된 다양한 디설파이드 링커는 예를 들어, SATA(N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)을 사용하여 형성될 수 있는 것을 포함한다.
산분해성 링커는 산성 pH에서 절단 가능한 링커이다. 예를 들어, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 세포내 구획은 산성 pH(pH 4-5)를 가지며, 산분해성 링커를 절단하기에 적합한 조건을 제공한다. 산분해성 링커는 혈액과 같은 중성 pH 조건하에서 비교적 안정하지만, pH 5.5 또는 5.0 이하에서는 불안정하다. 예를 들어, 히드라존(hydrazone), 세미카바존(semicarbazone), 티오세미카바존(thiosemicarbazone), 시스-아코니틱 아미드(cis-aconitic amide), 오르토 에스테르(orthoester), 아세탈, 케탈 등이 사용될 수 있다.
광분해성 링커는 빛에 접근 가능한 신체 표면 및 많은 체강에서 유용하다. 또한, 적외선은 조직을 투과할 수 있다.
펩티다아제 분해성 링커는 세포 내부 또는 외부의 특정 펩타이드를 절단하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 절단성 링커는 온화한 조건, 즉 세포독성 제제의 활성이 영향을 받지 않는 세포 내 조건에서 절단된다.
링커는 예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있거나 이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 통상적으로, 펩티딜 링커는 2개 이상의 아미노산 길이 또는 3개 이상의 아미노산 길이이다. 절단제에는 카텝신 B 및 D 및 플라스민이 포함될 수 있으며, 이들 모두는 표적 세포 내부에서 활성 약물의 방출을 야기하는 디펩타이드 약물 유도체를 가수 분해하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 암 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커(예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커)가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커는 발린-시트룰린(Val-Cit; vc) 링커 또는 페닐알라닌-리신(Phe-Lys) 링커이다. 치료학적 제제의 세포내 단백질분해 방출을 이용하는 한가지 장점은 통상적으로 제제가 접합되어 있을 때 약화되고 접합체의 혈청 안정성이 통상적으로 높다는 것이다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 링커는 종양 세포 내부의 카텝신에 의해 절단되는 디펩타이드 발린(Val)-시트룰린(Cit)(vc)을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, 약물은 DM4와 같은 메이탄시노이드이며, 이는 아미노, 및 항체의 일차 아민(단백질의 리신 측쇄 또는 N-말단에서 발견)과 반응하고 메이틴사노이드의 설프하이드릴기와 반응하여 가역적인 디설파이 본드를 생성하는 반응성 헤테로 이관능성 단백질 가교제를 통해 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체에 커플링된다. 일 구현예에서, 아미노 및 설프하이드릴 반응성 헤테로 이관능성 단백질 가교제는 N-하이드록시 숙신이미드(NHS) 에스테르와 항체의 일차 아민(리신 측쇄 및 단백질의 N-말단에서 발견)을 통해 반응하고, 가역적인 디설파이드 본드를 생성하기 위한 피리디닐디설파이드기와 설프하이드릴기를 통해 반응하는SPDB(N-숙신이미딜-3- (2-피리딜디티오)부티레이트)이다(도 1).
일 구현예에서, 약물은 MMAE와 같은 아우리스타틴이며, 이는 카텝신 분해성 펩타이드 링커, 특히 Val-Cit(vc)와 같은 펩타이드 링커를 통해 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체에 커플링된다. 일 구현예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 예를 들어, 리신 잔기의 유리 아민과 반응하는 헤테로 이관능성 링커 2-IT(2-이미노티올란)로 티올화된다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 약물 접합체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 또는 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 DM4(바람직하게는 이의 설프하이드릴기를 통해)에 커플링(바람직하게는 이의 아미노기를 통해)되는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포한한다. 일 구현예에서, 항체는 SPDB 링커를 통해 DM4에 커플링된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 약물 접합체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 DM4(바람직하게는 이의 설프하이드릴기를 통해)에 커플링(바람직하게는 이의 아미노기를 통해)되는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 SPDB 링커를 통해 DM4에 커플링된다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 약물 접합체는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 MMAE(바람직하게는 이의 N-말단 아미노기를 통해)에 커플링(바람직하게는 이의 아미노기를 통해)되는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 디펩타이드 vc를 포함하는 링커를 통해 MMAE에 커플링된다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 약물 접합체는 서열번호 17 또는 51로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 MMAE(바람직하게는 이의 N-말단 아미노기를 통해)에 커플링(바람직하게는 이의 아미노기를 통해)되는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 디펩타이드 vc를 포함하는 링커를 통해 MMAE에 커플링된다.
본원에서 사용된 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본 발명에 따르면 용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, RNA 및/또는 펩티드 또는 단백질의 생성을 포함한다. 또한, 이는 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
예를 들어, 서열 목록에 나타낸 특정 아미노산 서열, 특히 서열번호로 표시하여 본원에 언급한 것과 관련하여, 상기 특정 서열의 변이체와 관련되도록 해석되어야 한다. 이러한 변이체 서열은 상기 특정 서열, 예를 들어 상기 특정 아미노산 서열의 것과 동일하거나 유사한 특성을 나타내는 아미노산 서열과 기능적으로 동등할 수 있다. 하나의 중요한 특성은 항체와 이의 표적에 대한 결합을 유지하는 것이다. 바람직하게는, 항체 내의 특정 서열을 대체할 때 특정 서열에 대한 변이체인 서열은 CLDN18.2에 대한 상기 항체의 결합을 유지한다.
특히 CDR, 초가변 영역 및 가변 영역의 서열이 CLDN18.2에 결합하는 능력을 잃지 않고 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본원에서 특정된 항체 영역과 동일하거나 높은 상동성을 나타낼 것이다. "높은 상동성"이란 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개 또는 1 개 또는 2개 치환이 CDR에서 이루어질 수 있다고 고려된다. 또한, 초가변 영역 및 가변 영역은 본원에서 구체적으로 기재된 항체의 영역과 실질적인 상동성을 나타내도록 변형될 수 있다.
본 발명에 따튼 용어 "변이체"는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 배좌, 동형단백질, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것을 지칭한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열의 변경과 관련이 있으며, 이의 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 식별한다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 상이한 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 용어 "변이체"는 번역 후 변형된 임의의 변이체 및 배좌 변이체를 포괄한다.
본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산의 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로도 불린다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2 개 이상의 아미노산 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 생성물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입도 가능하다.
아미노산 첨가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50 개 또는 그 이상의 아미노산이 제거되는 것을 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 상동성 단백질 또는 펩타이드간에 보존되지 않고/않거나 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 아미노산 서열에 위치에 있는 변형이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이의 측쇄와 관련된 아미노산 계열 중 하나의 치환을 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 분류된다: 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전된 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산. 때때로 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산으로 분류된다.
바람직하게는, 서열번호로 나타냄으로서 본원에 언급된 아미노산 서열과 같은 주어진 아미노산 서열 및 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 기준 아미노산 서열의 총 길이의 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 또는 약 100% 이상인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 약 20 이상, 약 40 이상, 약 60 이상, 약 80 이상, 약 100 이상, 약 120 이상, 약 140 이상, 약 160 이상, 약 180 이상 또는 약 200 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산에 대해 주어진다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 바람직하게는 공지된 도구, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어 표준 설정을 사용하는 Align, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5을 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 2개 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "퍼센트 동일성"은 최상의 정렬 후에 수득된 비교될 두 서열 간에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내고, 이 백분율은 오직 통계적이며, 두 서열 간의 차이가 무작위 분포되고 그 전체 길이에 걸쳐 분포되는 것으로 의도된다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 통상적으로 이들을 최적으로 정렬시킨 후 이들 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국부적 영역을 식별하고 비교하기 위한 세그먼트 또는 "비교 윈도우"로 수행된다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적으로 이외에도 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색방법 또는 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)을 사용하는 컴퓨터 프로그램에 의해 생성될 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교될 두 서열 간의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 간의 퍼센트 동일성을 수득함으로써 계산된다.
용어 "형질전환 동물"은 하나 이상의 전이유전자, 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 전이유전자, 또는 트랜스염색체(동물의 천연 게놈 DNA에 통합되거나 통합되지 않음) 를 포함하는 게놈을 갖는 동물을 지칭하며, 바람직하게는 전이유전자를 발현할 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스는 인간 경쇄 전이유전자 및 인간 중쇄 전이유전자 또는 인간 중쇄 트랜스염색체 중 어느 하나를 가질 수 있으며, CLDN18.2 항원 및/또는 CLDN18.2를 발현하는 세포로 면역화될 때 마우스는 인간 항- CLDN18.2 항원을 생성한다. 형질전환 마우스, 예를 들어, HCo7 또는 HCol2 마우스와 같은 HuMAb 마우스의 경우와 같이, 인간 중쇄 전이유전자는 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있거나, WO 02/43478에 기재된 것과 같은 트랜스염색체(예를 들어, KM 마우스)의 경우와 같이, 인간 중쇄 전이유전자는 염색체 외에서 유지될 수 있다. 이러한 형질전환 및 트랜스염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 통해 CLDN18.2에 대한 인간 단일클론항체의 다중 아이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및/또는 IgE)을 생성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "저감", "감소" 또는 "억제"는 수준, 예를 들어 세포의 발현 수준에서나 증식 수준에서 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상의 감소, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상의 전체 감소 또는 전체 감소를 야기하는 능력을 의미한다.
"증가" 또는 "증진"과 같은 용어는 약 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 100% 이상, 200% 이상, 500% 이상, 1000% 이상, 10000% 이상 또는 그 이상으로 증가 또는 증진되는 것에 관한 것이다.
본원에 기재된 항체는 통상적인 단일클론항체 방법론, 예를 들어 Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 원칙적으로 바람직하지만, 단일클론항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어, B-림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환 또는 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물계는 뮤린계이다. 마우스의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장 세포의 분리에 대한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 융합 파트너(예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 공지되어 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 바람직한 동물계는 랫트 및 래빗계이다(예를 들어, 문헌 [Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)에 기재되어 있음, 및 Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)] 참조).
또 다른 바람직한 구현예에서, 인간 단일클론항체는 마우스계가 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 형질전환 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 형질전환 및 트랜스염색체 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 알려진 마우스를 포함하며, 총칭하여 본원에서 "형질전환 마우스"로 지칭된다. 이러한 형질전환 마우스에서의 인간 항체의 생산은 WO2004/035607에서 CD20에 대해 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
단일클론항체를 생성하는 또 다른 전략은 정의된 특이성의 항체를 생산하는 림프구로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이며, 예를 들어 Babcock et al., 1996가 참조된다; 정의된 특이성의 항체를 생성하는 단일의 분리된 림프구로부터 단일클론항체를 생성하는 신규한 전략이다. 또한, 재조합 항체 공학에 대한 자세한 내용은 문헌 [Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1]가 참조된다.
기재된 바와 같이, 항체를 생성하기 위해, 마우스는 항원 서열 즉, 항체가 유도되는 서열, 재조합적으로 발현되는 항원 또는 이의 단편의 농축된 제조물 및/또는 항원을 발현하는 세포로부터 유도되는 담체-접합 펩타이드로 면역화될 수 있다. 또는, 마우스는 항원 및 이의 단편을 코팅하는 DNA로 면역화될 수 있다. 항원의 정제 또는 농축된 제조물을 이용하는 면역화가 항체를 초래하지 않는 경우, 마우스는 또한 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, 세포주로 면역화되어 면역 반응을 촉진시킬 수 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와 출혈(retroorbital bleed)로부터 수득되는 플라스마 및 혈청 샘플로 면역 프로토콜 과정에서 모니터링될 수 있다. 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스가 융합에 사용될 수 있다. 마우스를 희생시키고 비장을 제거하기 3일 전에 특정 항체 분비 하이브리도마의 비율을 증가시키기 위해 항원 발현 세포로 복강 내 또는 정맥내로 증강시킬 수 있다.
단일클론항체를 생성하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포 및 림프절 세포가 분리될 수 있고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합될 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝될 수 있다. 이어서, 개별의 웰은 항체 분비 하이브리도마에 대한 ELISA로 스크리닝될 수 있다. 항원 발현 세포를 이용한 면역형광 및 FACS 분석을 통해 항원에 대한 특이성을 갖는 항체가 식별될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 다시 도포될 수 있고, 다시 스크리닝될 수 있으며, 아직 단일클론항체가 양성일 경우에, 한계 희석에 의해 서브클로닝될 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성시킬 수 있다.
또한, 항체는 예를 들어 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 형질감염체에서 생산될 수 있다(문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229: 1202]).
일 구현예에서, 예를 들어, 관심 유전자(들), 예를 들어 항체 유전자는 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 기재된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당업계에 공지된 다른 발현 시스템에 의해 사용되는 것과 같이 진핵 발현 플라스미드와 같은 발현 벡터에 재연결될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293 세포 또는 대안적으로 식물 유래 세포, 진균 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포와 같은 진핵 숙주 세포에 도입될 수 있다. 이들 유전자를 도입하는 방법은 전기천공법, 리포펙틴, 리포펙타민 등과 같은 당업계에 기재된 방법일 수 있다. 이들 항체 유전자가 숙주 세포에 도입된 후, 항체를 발현하는 세포가 식별되고 선별될 수 있다. 이들 세포들은 형질감염종을 나타내며, 이의 발현 수준으로 증폭될 수 있고 항체 생산을 위해 증가될 수 있다. 재조합 항체는 이들 배양 상등액 및/또는 세포로부터 분리되고 정제될 수 있다.
대안적으로, 클로닝된 항체 유전자는 미생물, 예를 들어, 대장균과 같은 원핵 세포를 포함하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체는 양 및 래빗의 우유 또는 암탉의 난자 또는 형질전환 식물과 같은 형질전환 비-인간 동물에서 생산될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839] 참조.
키메라화
인간에서의 뮤린 항체의 면역원성은 각각의 항체가 키메라화되거나 인간화되는 경우 감소되거나 완전히 회피될 수 있다. 키메라 항체는 뮤린 항체 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 상이한 동물 종으로부터 유래된 상이한 부분을 갖는 항체이다. 항체의 키메라화는 뮤린 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 결합시킴으로써 달성된다(예를 들어, 문헌 [Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8]에 기재). 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 카파-경쇄 불변 영역을 뮤린 경쇄 가변 영역에 결합시킴으로써 생성된다. 또한 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간 람다-경쇄 불변 영역을 뮤린 경쇄 가변 영역에 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 키메라 항체를 생성하기 위한 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 키메라 항체를 생성하기 위한 다른 바람직한 중쇄 불변 영역은 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이다.
인간화
항체는 대부분 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부 서열보다 개별 항체 사이에서 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프트된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로서 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033] 참조). 이러한 프레임워크 서열은 생식세포계 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스로부터 수득 가능하다. 이들 생식세포계 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과는 상이하며, 이는 B 세포 성숙 과정 동안 V (D) J 결합에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않기 때문이다. 또한, 생식세포계 유전자 서열은 가변 영역에 걸쳐 고르게 분포된 높은 친화도를 갖는 이차 레퍼토리 항체의 서열과는 개별적으로 상이할 것이다.
항체가 항원에 결합하는 능력은 표준 결합 분석(예를 들어, ELISA, 웨스턴 블랏, 면역형광 및 유동세포계측법)을 사용하여 결정될 수 있다.
항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 단일클론항체의 정제를 위해 2리터 스피너 플라스크에서 성장시킬 수 있다. 대안적으로, 항체는 투석에 기반한 생물 반응기에서 생산될 수 있다. 상등액을 여과하고, 필요한 경우, 친화성 크로마토그래피 전에 단백질 G-세파로스 또는 단백질 A-세파로스를 사용하여 농축할 수 있다. 용출된 IgG는 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 검사할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교환될 수 있으며, 농도는 1.43 흡광 계수를 사용하여 OD280로 결정될 수 있다. 단일클론항체는 분취(aliquot)되고, -80℃에서 보관될 수 있다.
선별된 단일클론항체가 특유의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 부위-지시 또는 다중-위치 지시 돌연변이유발이 사용될 수 있다.
항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 다양한 시판 키트(예를 들어, Zymed, Roche Diagnostics)를 이용한 아이소타입 ELISA가 수행될 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰은 항-마우스 Ig로 코팅될 수 있다. 블로킹 후, 플레이트를 단일클론항체 또는 정제된 아이소타입 대조군과 주위 온도에서 2시간 동안 반응시킨다. 그 후, 웰을 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적 퍼옥시다아제-접합 프로브와 반응시킬 수 있다. 세척 후, 플레이트는 ABTS 기질(1mg/ml)로 성장시키고 OD 405-650에서 분석할 수 있다. 대안적으로, IsoStrip 마우스 단일클론항체 아이소타입 키트(Roche, Cat. No. 1493027)를 제조업체의 지침대로 사용할 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일클론항체의 결합을 입증하기 위해, 유동세포계측법이 사용될 수 있다. 자연적으로 또는 형질감염 후 항원을 발현하는 세포주 및 항원 발현이 결핍된 음성 대조군(표준 성장 조건하에서 성장)은 하이브리도마 상층액 또는 1% FBS를 함유하는 PBS에서 다양한 농도의 단일클론항체와 혼합될 수 있으며, 4℃에서 30분 동안 배양될 수 있다. 세척 후, APC-표지 항 IgG 항체 또는 Alexa647-표지 항 IgG 항체는 일차 항체 염색과 동일한 조건하에서 항원-결합 단일클론항체에 결합될 수 있다. 샘플은 살아있는 단일 세포에서 게이트로 빛과 측면 산란(side scatter) 성질을 사용하는 FACS 기구를 이용하여 유동세포계측법으로 분석될 수 있다. 단일 측정에서 항원-특이적 단일클론항체와 비특이적 바인더를 구별하기 위해서, 동시 형질감염 방법이 사용될 수 있다. 항원을 코딩하는 플라스미스 및 형광 마커로 일시적으로 형질감염된 세포는 상술한 바와 같이 염색될 수 있다. 형질감염 세포는 항체-염색 세포와는 상이한 형광 채널에서 검출될 수 있다. 대부분의 형질감염 세포는 두 가지의 전이유전자를 발현하기에, 항원-특이적 단일클론항체는 형광 마커 발현 세포에 우선적으로 결합하는 반면에 비특이적 항체는 비-형질감염 세포에 비교할 만한 비율로 결합된다. 형광 현미경을 사용하는 대체 분석법은 유동세포계측법 분석법에 추가 또는 이를 대신하여 사용될 수 있다. 세포는 정확히 상술한 바와 같이 염색되어, 형광 현미경으로 검사될 수 있다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항체의 존재 또는 항원을 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일클론항체의 결합을 입증하기 위해, 면역형광 현미경 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어, 자발적으로 또는 형질감염 후 항원을 발현하는 세포주 및 항원 발현이 결핍된 음성 대조군은 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 2mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린 및 l00㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건하에서 챔버 슬라이드에서 성장된다. 그 후, 세포는 메탄올 또는 파라포름알데히드로 고정시키거나 처리하지 않고 방치될 수 있다. 이어서, 세포는 항원에 대한 단일클론항체와 30분 동안 25℃에서 반응할 수 있다. 세척 후, 세포를 동일한 조건하에서 Alexa555-표지 항-마우스 IgG 이차 항체(Molecular Probes)와 반응시킬 수 있다. 그 후, 형광 현미경으로 세포를 검사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포 및 적절한 음성 대조군으로부터의 세포 추출물을 제조하여 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 가할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨, 차단되고, 시험할 단일클론항체로 프로빙(probe)된다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 퍼옥시다아제를 사용하여 검출되고, ECL 기질로 전개될 수 있다.
항체는 항원과의 반응성은 당업자에게 공지된 방식, 예를 들어, 일성적인 외과적 절차 동안 환자로부터 수득되거나 자발적으로 또는 형질감염 후 항원을 발현하는 세포주로 접종된 이종 이식 종양을 보유한 마우스로부터 수득된 암이 아닌 조직 샘플 또는 암 조직 샘플로부터의 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정 크리오섹션(cryosection) 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 임베디드(embedded) 조직 절편을 사용하여 면역조직화학법으로 추가로 시험될 수 있다. 면역염색을 위해, 항원에 반응하는 항체는 공급업체의 지침에 따라 홀스래디쉬-퍼옥시다아제 접합 고트 항-마우스 또는 고트 항-래빗 항체(DAKO)로 배양될 수 있다.
또한, CLDN18.2에 결합하는 항체 접합체는 생체내 모델(예를 들어, DAN-G, SNU-16 또는 KATO-III 또는 형질감염 후, 예를 들어 HEK293과 같은 CLDN18.2를 발현하는 세포주를 접종한 이종 이식 종양을 보유한 면역 결핍 마우스)에서 시험하여 CLDN18.2-발현 종양 세포의 성장을 조절하는 이들의 효능을 측정할 수 있다.
항체 접합체를 종양이 없는 마우스에 투여한 후 종양 세포를 주사하여 항체 접합체가 종양 또는 종양 관련 증상의 형성을 예방하는 효과를 측정할 수 있다. 항체 접합체를 종양 보유 마우스에게 투여하여 종양 성장, 전이 또는 종양 관련 증상을 감소시키는 각각의 항체 접합체의 치료학적 효능을 측정할 수 있다. 항체 접합체 적용은 조합의 시너지적 효과 및 잠재적 독성을 결정하기 위해 세포증식억제 약물, 성장 인자 억제제, 세포주기 차단제, 혈관신생 저해제 또는 다른 항체와 같은 다른 물질의 적용과 조합될 수 있다. 항체 접합체에 의해 매개되는 독성 부작용을 분석하기 위해, 동물에 항체 접합체 또는 대조군 시약을 접종할 수 있으며, 임의적으로 CLDN18.2 항체 접합 치료와 관련된 증상을 철저히 조사할 수 있다. CLDN18.2 항체 접합체의 생체내 적용의 가능한 부작용은 특히 위를 포함하는 CLDN18.2 발현 조직에서의 독성을 포함한다.
항체에 의해 인식되는 에피토프의 맵핑(mapping)은 문헌 ["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9] 및 문헌 ["Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay] 에 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 제제는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고, 본원에 기재된 항체 접합체 및 임의적으로 본원에 기재된 바와 같은 추가의 제제를 함유하여, 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 발생시킨다.
약학적 조성물은 일반적으로 균일한 투여 형태로 제공되며, 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어, 용액이나 현탁액의 형태일 수 있다.
약학적 조성물은 바람직하게는 모두 약학적으로 허용 가능한 염, 완충 물질, 방부제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
약학적으로 허용되지 않는 염은 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 이는 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산 및 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것들을 비제한적으로 포함한다. 또한, 약학적으로 허용 가능한 염은 소듐염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.
약학적 조성물에 사용하기 적합한 완충 물질은 염의 아세트산, 염의 시트르산, 염의 붕산 및 염의 인산을 포함한다.
약학적 조성물에 사용하기 적합한 방부제는 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.
주사 가능한 제형은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 링거 락테이트(Ringer Lactate)를 포함할 수 있다.
용어 "담체"는 자연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 의미하며, 활성 성분이 적용을 촉진, 증진 또는 가능하게 하기 위해 조합되어 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 용어 "담체"는 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다.
가능한 비경구 투여용 담체 물질은 예를 들어, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체혼용 가능한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜리드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "부형제"는 약학적 조성물에 존재할 수 있고 예를 들어 담체, 바인더, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충액, 방향제 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해, 예컨대 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여 될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 활성 화합물의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이는 바람직하게는 수혈자의 혈액과 등장성(isotonic)이다. 호환성 담체 및 용매의 예로는 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 일반적으로 멸균된 고정유(fixed oil)가 용액 또는 현탁 매질로 사용된다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 단독으로 또는 추가 용량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 상태의 치료의 경우, 목적하는 반응은 바람직하게는 질환 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 또한, 질환 또는 상태의 치료에서 목적하는 반응은 상기 질환 또는 상기 상태의 발병을 지연시키거나 발병을 예방할 수 있다.
본원에 기재된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 상태, 질환의 중증도, 환자의 연령, 생리 상태, 사이즈 및 체중, 치료 기간, 동반되는 치료법의 종류(있는 경우), 특정 투여 경로 및 이와 유사한 인자들을 포함하는 환자의 개별 매개변수에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기재된 제제의 용량 투여는 이러한 매개변수의 다양성에 따라 달라질 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우에는, 보다 많은 용량(또는 보다 국소화된 상이한 투여 경로에 의해 달성되는 보다 높은 용량)이 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독 또는 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가(autologous), 동종(syngeneic), 동종이계(allogeneic) 또는 비관련)과 같은 통상적인 치료학적 섭생(therapeutic regimen)과 조합되어 사용될 수 있다.
암의 치료는 병용 요법이 특히 바람직한 분야를 나타내며, 이는 종종 2가지, 3 가지, 4 가지 또는 그 이상의 암 약물/치료의 병용 요법이 단독 치료법의 영향보다 훨씬 강한 시너지적 효과를 발생시키기 때문이다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서, 암 치료는 다양한 다른 약물과 효과적으로 조합될 수 있다. 특히, 이들은 예를 들어, 기존의 종양 치료법, 다중-에피토프 요법, 추가 면역요법 및 혈관신생 또는 세포사멸을 표적하는 치료법과 조합될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743] 참조). 상이한 제제의 순차적 투여는 상이한 체크 포인트에서 암 세포 성장을 억제할 수 있는 반면, 다른 제제는 예를 들어, 신혈관신생, 악성 세포의 생존 또는 전이를 억제하여 암을 만성 질환으로 전환시킬 수 있다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 질환을 치료 또는 예방하기 위해 환자에게, 예를 들어, 생체내로 투여될 수 있다. 바람직한 환자는 본원에 기재된 제제 및 조성물을 투여함으로써 교정되거나 개선될 수 있는 질환을 갖는 환자를 포함한다. 여기에는 CLDN18.2의 변화된 발현 양상을 특징으로 하는 세포가 관련된 질환이 포함된다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 기재된 제제 및 조성물은 암 질환 환자 예를 들어, CLDN18.2를 발현하는 암 세포의 존재를 특징으로 하는 본원에 기재된 바와 같은 암 질환 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 기술된 약학적 조성물 및 치료 방법은 본원에 기재된 질환을 예방하기 위한 면역화 또는 예방접종에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
1. 세포내섭취 ( Endocytosis )
CLDN18.2 결합 IMAB362의 세포내섭취를 표적 결합 항체 및 사포린-접합 항-인간 또는 항-마우스 IgG Fab 단편(Fab-ZAP 인간, Advanced Targeting Systems, IT-51, Lot: #93-23; Fab-ZAP 마우스, Advanced Targeting Systems, IT-48, Lot: #93-21)의 동시 내재화(co-internalization)에 의존하는 세포독성에 기반한 세포내섭취 분석을 사용하여 결정하였다. 사포린은 리보좀-불활성화 단백질이며, 이는 내재화 시, 단백질의 생합성을 억제하여 사포 사멸을 야기한다. 최적의 세포 용해를 보장하기 위해, Fab-ZAP 항체를 표적 항체와 비교하여 6배 이상의 몰농도로 적용하였다.
안정하게 형질감염된 HEK293~CLDN18.2 세포를 0.05% 트립신/EDTA(Gibco, 25300-054)로 수확하고 2.5x103개의 세포/웰을 96-웰 세포 배양 플레이트 내 50㎕ 성장 배지에 시딩(seeding)하였다. 24시간 후, 25㎕의 Fab-ZAP 및 25㎕의 항-CLDN18.2 mAB 또는 세포 배양 배지로 희석된 아이소타입 대조 항체를 세포에 첨가하였다(표 1). 세포를 72시간 동안 추가로 배양하였다.
Figure 112017101154150-pct00005
세포 생존력을 6에 기재된 바와 같이 분석하였다. Fab-ZAP의 존재하에서 항체없이 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다.
2. 에피토프 맵핑 ( Epitope mapping)
CLDN18.2 돌연변이를 일시적으로 과발현하는 HEK293T 세포에서 CLDN18.2 특이성을 담당하는 항원성 에피토프를 유동세포계측법(5 참조)으로 분석하였다. 첫 번째 세포외 도메인 내에 단일 아미노산 치환을 갖는 총 8개의 CLDN18.2 돌연변이를 PCR로 생성하였다. 따라서, CLDN18.2의 아미노산을 상응하는 위치에서 상동성 단백질 CLDN18.1의 아미노산으로 치환하였다. HEK293T 세포를 리포터 유전자로서 특정 CLDN18.2 돌연변이 및 EGFP를 코팅하는 플라스미드와 함께 동시 형질감염시켰다. 정제된 항체를 5㎍/ml의 농도로 시험한 반면, 하이브리도마 상등액으로부터 유도된 항체는 시험 전에 1:4로 희석시켰다. 항체 결합이 특정 아미노산 치환에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해, 형질감염된(EGFP 양성) 세포 집단에서 측정gks 평균 형광 강도(MFI)를 가장 높은 MFI 값을 나타내는 돌연변이와 관심 돌연변이 간에 비교하였다. 관심 돌연변이의 MFI가 50% 이하인 경우, 아미노산 잔기는 항체 결합 및 CLDN18.2 특이성에 필수적임을 특징으로 한다.
3. 항체 약물 접합체
단일클론항체 IMAB362(배치 # p412118)에 대한 DM4 및 vcMMAE의 접합 및 분석 특성화를 피라말 헬스케어(Grangemouth, UK)에서 수행하였다. 이 방법은 다음에서 간략하게 설명된다:
DM4를 SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트)를 통해 IMAB362에 커플링시켰다. SPDB 시약은 아미노 및 설프하이드릴 반응성 헤테로 이관능성 단백질 가교제이며, 이는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르를 통해 항체의 일차 아민(단백질의 리신 측쇄 또는 N-말단에서 발견)와 반응하고, 피리딜디설파이드기를 통해 DM4의 설프하이드릴기와 반응하여, 가역적인 디설파이드 결합을 생성한다(도 1). 즉, DM4 접합을 위해, IMAB362를 초원심분리 필터를 사용하여 PBS 완충액(pH 7.2)에 투석여과(diafilter)시키고, 1:6의 몰비(IMAB362:SPDB)로 SPDB에 1시간 동안 실온에서 커플링시켰다. 변형된 항체를 35mM 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 대해 투석하고, 항체에 대한 링커 비율을 측정하였다. DM4를 1:6의 몰비(IMAB362-SPDB:DM4)로 19시간 동안 2-8℃에서 IMAB362-SPDB에 접합시켰다. 접합 항체를 저장 완충액(20mM His, 85mg/ml 수크로스, pH 5.8)으로 조정하고 -80℃에서 보관하였다. 약물 항체 비율을 UV 분광법, SEC-HPLC에 의한 단량체 함량 및 RP-HPLC에 의한 유리(free) 약물 함량으로 분석하였다.
vcMMAE를 티올화 IMAB362에 커플링시켰다. 따라서, IMAB362는 리신 잔기의 유리 아민과 반응하는 헤테로이관능성 링커 2-IT(2-이미노티올란)로 처음에 티올화되었다. 그 후, 카텝신 절단성 펩타이드 링커 Val-Cit(vc)를 함유하는 vcMMAE를 발린을 통해 티올화 항체의 설프하이드릴기에 접합시켰다(도 1). 즉, IMAB362를 초원심분리 필터를 사용하여 PBS 완충액(pH 7.2)에 투석여과시키고, 1:20의 몰비(IMAB362:2-IT)로 2-IT와 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 변형된 항체를 35mM 시트레이트 완충액(pH 5.5)으로 투석하고, 항체에 대한 링커 비율을 측정하였다. 이어서, vcMMAE를 1:6의 몰비(IMAB362-SH:vcMMAE)로 20시간 동안 2 내지 8℃에서 티올화 IMAB362 에 접합시켰다. 접합 항체를 저장 완충액(20mM His, 85mg/ml 수크로스, pH 5.8)으로 조정하고 -80℃에서 보관하였다. 약물 항체 비율을 UV 분광법, SEC-HPLC에 의한 단량체 함량 및 RP-HPLC에 의한 유리 약물 함량으로 분석하였다.
4. 세포 배양
세포주응 공급업체의 지침 및 Ganymed 세포주 데이터 시트에 따라 5% 또는 7.5%의 CO2가 포함된 가습 배양기 내 세포형 특정 배지에서 37℃로 배양하였다(표 2). 세포 배양 배지 및 보충제는 Invitrogen, Gibco 및 Sigma로부터 구입하였다.
Figure 112017101154150-pct00006
5. 유동세포계측법
항-CLDN18.2 노출(naked) 항체 및 항체 약물 접합체의 상대 결합 친화도 및 특이성을 CLDN18.2 양성 및 음성 세포주를 사용하여 유동세포계측법으로 측정하였다.
기하급수적으로 성장하는 배양물의 세포를 0.05% 트립신/EDTA(Gibco, 25300-054)로 수확하고, 노이바우어(Neubauer) 계수 챔버를 사용하여 계수하였다. 세포를 5분간 1,500rpm(468xg)에서 원심분리하고, 상등액을 버리고 세포를 2x106개의 세포/ml에서 FACS 완충액(독소-접합 항체를 분석하기 위한 2% FCS 함유 PBS(Gibco, 10270-106), CLDN18.2 반응성 노출 항체의 스크리닝을 위한 2% FCS 및 2mM EDTA 함유 PBS) 에서 재현탁시켰다. 웰 당 100㎕의 세포 현탁액(2x105개의 세포/웰에 상응)을 둥근 바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 1분 동안 1500 rpm에서 원심분리한 후, 상등액을 버리고 적절한 농도(상대 친화도 측정을 위해 20μg/ml 이하 또는 발현 조절을 위해 50μg/ml이하로)로 독소-접합 또는 네이티드 항체를 함유하는 FACS 완충액에서 재현탁시키고 30 내지 45분 동안 4℃에서 배양하였다(표 3). 세포를 1 분 동안 1500rpm에서 원심분리하고 상등액을 버렸다. 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척한 후, APC-접합 항-인간 IgG(Jackson Immuno Research, 109-136-170) 또는 APC-접합 고트-항-마우스 IgG(Jackson Immuno Research) 또는 단백질 L-FITC(1μg/ml, chim mAB294 분석)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시키고, 30분 동안 4℃에서 배양하였다(표 3). 배양 후, 100㎕ FACS 완충액을 각 샘플에 첨가하고, 세포를 1분 동안 1500rpm에서 원심분리하고, 상등액을 버렸다. FACS 완충액으로 세척하는 단계를 2회 반복하였다. 최종적으로, 세포를 100㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고 BD FACS 어레이 바이오분석기를 사용하여 결합을 측정하였다.
독소-결합 및 노출 항체가 동일한 농도로 적용되었음을 유의해야 한다. 항체의 분자량 간의 차이는 무시하였다.
Figure 112017101154150-pct00007
6. 생존력 분석
세포 생존력에 대한 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 효과를 세포 대사 활성을 검출하는 비색 분석을 사용하여 측정하였다. 이 분석은 황색 XTT(2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카복스아닐리드)를 오렌지색 포르마잔 화합물로 환원시키는 대사 활성 세포의 능력을 기반으로 하며, 이는 분광광도계로 검출할 수 있다. 염료의 강도는 살아있는 세포의 수에 비례한다.
세포를 세포 배양 배지(표 2)에 재현탁시킨 0.05% 트립신/EDTA(Gibco, 25300-054)로 수확하고, 상응하는 양의 세포를 갖는 50㎕의 세포 현탁액을 96-웰 세포 배양 플레이트 내 웰 마다 시딩하였다(표 4). 24시간 후, 적절한 농도에서 50㎕ 배지로 희석한 독소-접합 IMAB362 또는 대조군 항체를 첨가하고 세포를 72시간 추가로 배양하였다.
Figure 112017101154150-pct00008
세포생존력을 AppliChem 세포 증식 키트 II(AppliChem, A8088, 1000)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분석하였다. XTT 시약으로 3-5시간 배양한 후, 분광광도계(Tecan)를 사용하여 480nm에서의 흡광도를 측정하였다(630nm 기준). 생존력 감소를 다음 식을 사용하여 계산하였다.
Figure 112017101154150-pct00009
블랭크: 배지 조절
대조군: 항체가 없는 세포
샘플: 항체가 있는 세포
비선형 회귀를 사용하여 GraphPad Prism 6으로 EC50 값을 결정하였다.
7. 방관자 분석(Bystander assay)
표적 음성 세포상에서 독소-접합 IMAB362 항체의 방관자 활성을 CLDN18.2 양성 세포주 NUGC-4 10cE8의 존재 또는 부재하에서 CLDN18.2 음성 루시퍼라아제 발현 세포주 PA-1(Luc)을 공동 배양하여 시험관내에서 분석하였다. 따라서, 웰 당 1.5x103개의 PA-1(Luc) 세포를 단일 배양하거나 웰 당 1.5x103개의 NUGC-4 10cE8 세포를 공동 배양하기 위해, 10% FCS 및 1% pen/strep이 보충된 RPMI 배지에 시딩하였다. 24시간 후, 음성 대조군으로서 IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE 또는 비접합 IMAB362를 첨가하고 세포를 72시간 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존력을 6에 기재된 바와 같이 분석하였다. 표적 음성 세포의 용해를 루시페라아제 발현 PA-1(Luc) 세포의 생물발광을 측정하여 결정하였다. 따라서, 50μl 루시페린 혼합물(ddH2O 중 1.92mg/ml D-루시페린(Sigma, 50227) 및 160mM HEPES)을 웰 마다 추가하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 실온으로 90분 동안 배양하고, 생물발광을 루미노미터(Infinite M200, TECAN)를 사용하여 측정하였다. 결과를 통합 디지털 상대 라이트 단위(RLU)로 표시하였다. 생존력의 감소를 6에 기재된 바와 같이 계산하였다.
8. 동물 실험
모든 이종 이식 연구를 실험 동물 연구를 위한 국가 규정 및 윤리 지침을 준수하여 수행하였다. 특정 병원균이 없는 조건하에서 모든 동물을 개별의 환기 케이지 및 12시간의 인공적인 명암 사이클하에서 유지하였다. 음식과 물을 자유롭게 제공하였다. 연구 시작 전에 마우스를 최소 6일 동안 적응시켰다.
8.1. 최대 허용 용량( MTD ) 연구
이종 이식 종양을 암컷 Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스의 측면으로 200μl PBS 중 8.5x106개의 BxPC-3~CLDN18.2 인간 췌장 종양 세포로 피하 주사하여 접종하였다. 항-CLDN18.2 항체 약물 접합체의 MTD 및 효능을 측정하기 위해, 종양-보유 마우스에 상이한 용량의 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE를 투여하였다. 최대 적용 가능한 용량은 마우스 내 주사에 대한 GV-SOLAS로부터 권장되는 항체 농도 및 주사량으로 제한하였다. 두 항체를 단일 용량 및 반복 용량(즉, 각각 15 및 16mg/kg)뿐만 아니라 이 농도의 절반(즉, 각각 7.5 및 8mg/kg) 또는 비히클 대조군(군 크기: n=5)로써 최대 농도에서 적용하였다. 항체를 이식 후 14 일에 정맥내 주사하고, 반복 용량의 경우 이식 후 21 일에 추가로 주사하였다. 체중, 동물 건강, 행동 및 종양 크기를 캘리퍼(caliper)로 주 2회 모니터링하고 종양 부피를 다음의 식에 따라 계산하였다: [길이×폭×(폭/2)]. 모든 동물을 비히클 군의 첫 번째 종양이 최대 1400mm3에 도달하거나 종양이 궤양되었을 때 해부하였다(IMAB362-DM4의 경우 이식 후 49일, IMAB362-vcMMAE의 경우 이식 후 37일). 임상 화학에 대한 혈액 샘플을 1.25ml 케타민, 1ml 지일라진(2%) 및 7.75ml H2O로 이루어진 혼합물 250μl를 i.p.하여 개시된 전신 마취하에서 채취하였다. 이어서, 마우스를 PBS로 관류시킨 후 전신 마취하에서 4% 포르말린으로 관류시켰다. 선별한 장기와 조직(위, 식도, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 비장, 십이지장, 회장, 결장, 자궁 및 난소)을 4% 포르말린에 고정시키고, 4℃에서 보관하고, 최종적으로 파라핀 임베디드시켰다. 3마이크로미터 조직 절편을 각 FFPE(formalin fixated paraffin embedded) 샘플로부터 잘라내어 접착 슬라이드(SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific)에 올려놓았다. 58℃에서 60분 동안 베이킹한 후, FFPE 조직 절편을 크실렌을 사용하여 탈파라핀화하고 일련의 에탄올 계열(각각 3 분씩 2x100%, 2x96%, 2x70% 에탄올)로 재수화하였다. 핵을 마이어 헤마토자일(Mayer's hematoxyline)로 5분 동안 실온에서로 염색시킨 후, 수돗물로 블루잉(bleuing)시켰다. 이어서, 세포질을 0.5% 에오신 수용액으로 2분 동안 실온에서 대조염색하였다. 일련의 에탄올 계열을 통한 탈수 후, 자일렌 절편을 비수용성 마운팅 미디아 X-TRA 키트를 사용하여 고정(mounted)시켰다.
8.2. 임상 생화학
가능성이 있는 기관 독성을 시험하기 위해, 혈청 샘플에서 췌장 독성, 네프론 독성 및 간 독성에 대한 관련 마커를 분석하였다.
알라닌 아미노트랜스퍼라제/글루탐산-피루브산 트랜스아미나아제(GPT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제/글루탐산-옥살아세틱 트랜스아미나아제(GOT), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(감마-GT), 알칼린 포스파타아제(AP), 글루탐산 탈수소효소(GLDH), 크레아티닌, 크레아티닌 키나아제(CK), 우레아, 콜린에스테라아제, 빌리루빈, 리파아제, 알파-아밀라아제, 락트산 탈수소효소(LDH), 알부민 및 총 단백질을 요하네스 구텐베르크 대학(Mainz, Germany)에서 측정하였다. 혈청 샘플을 최종 출혈 후 수득한 혈액으로부터 준비하였다. 마우스를 케타민/자일라진으로 마취한 후 안구 뒤쪽의 정맥 천자(retrobulbar venipuncture)로 혈액을 채취하였다.
8.3. 효능 연구
인간 이종 이식 종양을 확립하기 위해 적절한 수의 세포를 200μl 부피의 PBS에 부유시키고 암컷 Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스의 측면으로 피하 주사하였다. 종양 보유 마우스를 MTD를 초과하지 않는 용량에서 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE의 단일 정맥 주사하여 치료하였다. 노출 항체 대조군을 약 8mg/kg IMAB362의 IV/i.p. 주사를 교대로 주 2회 투여하였다. 초기 치료 연구에서 이식 후 3 일에 치료를 시작하였다. 진행성 치료 연구에서, 종양은 50 내지 200㎜3의 부피로 성장하였고, 치료 전 균질 종양 평균 부피로 마우스를 대조군 및 항체군으로 재분배하였다. 체중, 동물 건강, 행동 및 종양 크기를 캘리퍼로 주 2회 모니터링하였다. 종양 부피를 다음의 식으로 계산하였다: [길이x너비x(너비/2)]. 중단 기준은 종양 크기가 길이 또는 너비 >16mm 또는 계산된 부피 >1400mm3가 되었을 때이다. 추가의 중단 기준은 종양이 궤양되거나 동물의 체중이 10 % 이상 감소되었을 때이다. 완전한 종양 성장 억제의 경우, 마우스를 치료 후 120일 동안 관찰하였다. 이후의 IHC 연구를 위해 지속적인 종양을 준비하고 4% 포르말린에 고정시켰다.
9. 항체-의존성 세포독성( ADCC )
항체-의존성 세포독성(ADCC)을 IMAB362 독소-접합체의 존재하에서 표적 세포에 인간 PBMC를 첨가한 후 비-용해 세포에서 세포내 ATP의 함량을 측정하여 결정하였다. 루시페라아제-생성 생물발광을 ATP의 정량화에 사용하였다.
NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 표적 세포를 재현가능한 합류를 수득하기 위해 분석 전 2일에 정의된 세포 수(8x106개의 세포)로 시딩하였다.
표적 세포를 0.05% 트립신/EDTA(Gibco, 25300-054)로 수확하고 20mM HEPES(Gibco, 15630-056)를 함유하는 성장 배지에서 1.6x105개의 세포/ml 농도로 조정하였다. 웰 당 8x103개의 세포를 백색 96-웰 PP-플레이트에 시딩하고 약 5시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다.
PBMC를 건강한 기증자로부터 수득한 신선한 연층(buffy coat)으로부터 준비하였다. 약 20-25ml의 혈액을 3개의 팔콘 튜브에서 PBS로 희석시키고(1:2), 4개의 50ml 팔콘 튜브에서 15ml Ficol-Paque Plus(GE Healthcare, 17144003)에 조심스럽게 레이어드하였다. 구배(Gradient)를 원심분리(25분, 700xg, 중지없음)하였다. 원심분리 후 PBMC를 중간 단계에서 채취하고, 50ml PBS/2mM EDTA로 세척하고, 원심분리(5분, 468xg)하고, 다시 50ml PBS/2mM EDTA에 재현탁시키고, 다시 원심분리(10분, 208xg)하여 혈소판을 제거하였다. 펠렛을 50ml PBS/2mM EDTA에 재현탁시키고 세포 수를 계수하였다. 이어서, PBMC를 원심분리(5분, 468xg)하고, 5% 인간 혈청을 함유한 X-Vivo-15 배양 배지(Lonza, BE04-418Q)에 재현탁시키고, 1.5시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. PBMC를 수확하고, 원심분리(5분, 468×g)하고 세포 농도(40:1의 E:T 비율에 대해)를 1.28x107개의 세포/ml로 조정한 X-Vivo-15 배양 배지(Lonza, BE04-418Q)에서 재현탁시켰다. IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE 및 IMAB362를 연속적으로 11회 희석(4.5배 희석 단계)시켜 160㎍/ml 내지 0.05ng/ml(최종 농도 40㎍/ml 내지 0.01ng/ml)의 농도 범위를 얻었다. 각각의 희석액 25㎕를 표적 세포에 첨가하고 각 조건에 대해 4번씩 사용하였다. 항체가 없는 PBS를 배지 및 총 용해 대조 웰에 첨가하였다. 이어서, 25μL의 준비된 PBMC(3.2x105개의 세포) 를 각 웰에 첨가하여 40:1의 E:T 비율을 달성하고, 플레이트를 15시간±1시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 10μl 8% 트리톤 X-100/PBS 용액을 최대 용해 대조 웰에 첨가하였고 10μl PBS를 다른 웰에 첨가하였다. 최종적으로, 50μl의 새로 제조한 루시페린 저장액(160mM HEPES, 1x PBS, 3.84mg/ml D-루시페린(Sigma Aldrich, 50227))을 각 웰에 첨가하고, 90분 동안 실온으로 어두운 곳에서 배양하였다. 생물발광을 루미노미터(Infinite M200, TECAN)를 사용하여 측정하였다. 결과를 통합 디지털 상대 라이트 유닛(RLU)으로 표시하였다.
특정 용해를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112017101154150-pct00010
(최대 생존 세포: 10μl PBS, 항체를 포함하지 않음; 총 용해: PBS 중 10μl 8%(v/v) 트리톤 X-100, 항체를 포함하지 않음)
모든 ADCC 데이터를 "log(agonist) vs response-find EC anything" 기능을 사용하여 GraphPad Prism 6으로 처리하였다. 최대 용해는 용량 반응 곡선의 스팬(상단에서 하단으로의 차이)으로 정의하였지만 최대 100%이다.
10. 보체 -의존성 세포독성( CDC )
보체-의존성 세포독성(CDC)을 IMAB362 독소-접합체의 존재하에서 표적 세포에 인간 보체를 첨가한 후 비-용해된 세포에서 세포내 ATP의 함량을 측정하여 결정하였다. 판독값으로서 루시페라아제에 의해 생성된 ATP-의존성 생물발광을 측정하였다.
NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 또는 KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 표적 세포를 재현가능한 합류를 수득하기 위해 분석 전 2일에 정의된 세포 수(각각 8x106개 및 9x106 개의 세포)로 시딩하였다.
표적 세포를 0.05% 트립신/EDTA로 수확하고 10%(v/v) FCS를 함유하는 각각의 배양 배지에서 1.6x105개의 세포/ml 농도로 조정하였다. 8x103개의 세포를 백색 96-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 24시간 후, 분석 배지(60% RPMI, 20mM HEPES 함유, 여러 건강한 기증자로부터 모은 40% 인간 혈청)에서 연속적으로 희석시킨 50㎕ 항체를 첨가(최종 농도 80μg/ml 내지 78.13ng/ml)하고, 세포를 80분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 이어서, PBS 중 10μl 8%(v/v) 트리톤 X-100을 총 용해 대조군에 첨가하는 반면에 10μl PBS를 다른 모든 웰에 첨가하였다(최대 생존 세포 대조군 및 실제 샘플). 루시페라아제 반응을 웰 당 50㎕의 루시페린 혼합물(3.84mg/ml D-루시페린, ddH2O 중 160mM HEPES)을 첨가함으로써 시작하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 실온으로 90분 동안 보관하고, 생물발광을 루미노미터(Infinite M200, TECAN)를 사용하여 측정하였다. 결과를 통합 디지털 상대 라이트 유닛(RLU)으로 표시하였다.
특정 용해를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112017101154150-pct00011
(최대 생존 세포: 10μl PBS, 항체를 포함하지 않음; 총 용해: PBS 중 10μl 8%(v/v) 트리톤 X-100, 항체를 포함하지 않음)
모든 CDC 데이터를 "log(agonist) vs response-find EC anything" 기능을 사용하여 GraphPad Prism 6으로 처리하였다. 최대 용해는 용량 반응 곡선의 스팬(상단에서 하단으로의 차이)으로 정의하였지만 최대 100%이다.
실시예 2: 항- CLDN18 .2 특이적 항체의 세포내섭취 스크리닝
노출 항체를 이용한 종양 치료 동안, 표적 결합 항체의 내재화는 마이어 모드(mayor mode)의 작용, 예를 들어 ADCC 및 CDC에 접근할 수 있는 막 결합 항체의 수를 감소시킬 수 있으며, 세포내섭취는 항체 약물 접합체(ADC)의 개발에 필수적인 특성이다. ADC의 중요한 특성 중 하나는 표적-ADC 복합체의 세포내섭취다이다. 따라서, 노출 항체의 세포내섭취 속도는 독소-접합 항체의 개발에 핵심적인 요소 중 하나이다.
결합 특성, 즉 각각 CLDN18.2에 대한 상대 친화도, CLDN18.1에 대한 교차 반응성 및 항원성 에피토프 매개 CLDN18.2 특이성을 상이한 뮤린 및 키메라 항-CLDN18.2 항체에 대해 유동세포계측법 분석으로 측정하였다(표 5 및 표 6). CLDN18.2에 대한 높은 결합을 보이는 항체를 추가 세포내섭취 스크리닝을 위해 선별하였다.
상이한 CLDN18.2 특이성 및 CLDN18.2/CLDN18.1 반응성 항체의 세포내섭취 효율을 시험관내에서 사포닌 접합 Fab 단편(Fab-ZAP)을 갖는 항체와 CLDN18.2를 발현하는 HEK293~CLDN18.2 세포를 함께 공동 배양하여 시험하였다. 표적 결합 항체와 공동 내부화 시, 사포닌은 세포의 단백질 생합성을 억제하며, 세포 생존력 분석에 의해 모니터링될 수 있는 세포사멸을 야기한다. 이 방법은 표적-항체 복합체의 세포내섭취를 평가하는 간접적인 방법이다. 항체를 이용 가능한 경우 키메라 항체로서 시험하였고, 그렇지 않은 경우 뮤린 항체로 세포내섭취 스크리닝을 수행하였다.
chim mAb362(IMAB362)뿐만 아니라 chim mAB294는 CLDN18.2 결합 시 효율적으로 내재화될 수 있으며, 매우 낮은 항체 농도(IMAB362: EC50=11ng/ml; chim mAB294: EC50=10ng/ml)에서 조차도 HEK293~CLDN18.2 세포 생존력의 감소로 이어진다. 이와 대조적으로, chim mAB308 및 chim mAB359는 세포 생존력을 감소시키지 않았다(도 2). 유사한 상대 결합 친화도를 나타내며 내재화에서 상당한 불일치(chim mAB294: EC50=10ng/ml; chim mAB359: 세포내섭취 없음)를 나타내는 chim mAB294 및 chim mAB359로서, 세포내섭취의 효율은 항체 결합 친화도와 관련이 있을뿐만 아니라 결합 에피토프에 의존적인 것으로 보인다.
mu mAB362의 내재화조차도 Fab-Zap 분석에서 실질적인 세포내섭취를 나타내지 않은 다른 모든 시험된 뮤린 CLDN18.2 반응 항체보다 우수하였다(도 3).
요약하면, CLDN18.2 특이적 항체 IMAB362 및 chim mAB294는 CLDN18.2에 결합 시 효율적으로 내재화되며 항체 약물 접합체로서 추가의 평가에 적합하다.
Figure 112017101154150-pct00012
Figure 112017101154150-pct00013
Figure 112017101154150-pct00014
실시예 3: IMAB362의 독소-접합
피라말 헬스케어는 최종 완충액 교환을 포함하는 독소 접합을 수행하였다. 정의한 보관 조건하에서 보관되는 경우 일정 기간 동안 ADC가 규격화된 상태로 유지된다는 것을 보여주기 위해 안정성 연구를 수행하였다. IMAB362를 절단성 발린-시트룰린 링커(vc 링커)를 통해 MMAE에 접합시키거나 절단성 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부티레이트 링커(SPDB 링커)를 통해 DM4에 접합시켰다. MAB362 독소 접합체를 2-8℃에서 저장 완충액(20mM 히스티딘 및 85mg/ml 수크로오스, pH 5.8)에서 보관하였다.
Figure 112017101154150-pct00015
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 모두 ≥95%의 높은 모노머 함량 및 소량의 유리 약물(≤1%)만을 나타낸다. 2-8℃의 보관 온도에서 독소-접합 IMAB362 항체의 28일 안정성 시험은 모노머의 함량만이 약간 감소하고 두 ADC 모두에 대하여 유리 약물이 적게 증가함을 보여준다. 두 항체 모두 효율적으로 접합되었으며 항체에 대한 약물의 비율은 IMAB362-DM4의 경우 3.2의 비율 및 IMAB362-vcMMAE의 경우 4.5를 나타낸다(표 7).
실시예 4: IMAB362 - ADCs의 결합
IMAB362의 결합 특성을 이전에 상세히 시험하였다:
* IMAB362는 클라우딘 18 스플라이스 변이체 2(CLDN18.2)의 첫 번째 세포외 루프에 결합한다.
* CLDN18.2의 친화도는 낮은 나노몰 범위이다.
* 임의의 CLDN18.2 음성 세포 또는 조직 유형과의 교차 반응성은 관찰되지 않았다.
* 가장 가까운 관련 패밀리 멤버 클라우딘 18 스플라이스 변이체-1(CLDN18.1)과의 교차 반응성은 없었다.
DM4-접합 IMAB362 항체 및 MMAE-접합 IMAB362 항체의 상대 결합 친화도를 CLDN18.2를 내인성 및 이소성으로 발현하는 세포주를 사용하는 유동 세포 계측법에 의해 비접합 IMAB362와 비교하였다. 결합 특성을 0.1 내지 20μg/ml의 범위로 상이한 항체 농도에서 시험하였다(도 4, 표 8).
Figure 112017101154150-pct00016
비접합 IMAB362와 비교하여, DM4-접합 IMAB362 및 MMAE-접합 IMAB362는 CLDN18.2를 내인성 및 이소성으로 발현하는 세포에서 약간 감소된 상대 결합 친화도를 보였다(도 4, 표 8). 독소-접합 항체 모두 매우 유사한 EC50 값을 가지지만, 보다 높은 최대 결합을 나타내는 IMAB362-DM4에서 약간 상이한 최대 결합 값을 가졌다(표 8).
IMAB362-독소 접합 항체의 CLDN18.2-매개 결합을 CLDN18.2를 이소성으로 과발현하는 세포 및 상응하는 CLDN18.2 음성 부모 세포주에서 시험하였다(도 5, 표 8).
IMAB362-DM4와 IMAB362-vcMMAE의 결합은 표적 분자인 CLDN18.2의 존재 여부에 따라 엄격히 달라진다(도 5). 결합 특이성은 인간 CLDN18.2 또는 고도의 상동성 단백질 인간 CLDN18.1을 과발현하도록 조작된 HEK293 형질감염체를 사용하여 유동세포계측법으로 분석하였다. HEK293~모의 세포를 음성 대조군으로 사용하였다(도 6, 표 8).
IMAB362 및 독소-결합 항체 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 유사한 상대 친화도로 인간 CLDN18.2를 이소성으로 발현하는 HEK293~CLDN18.2 세포에 결합하였다(표 8). 또한, IMAB362, DM4-접합 IMAB36 및 MMAE-접합 IMAB362는 인간 CLDN18.1 또는 모의 형질감염 세포에 대해 교차 반응성을 보이지 않았다(도 6B및 도 C).
실시예 5: 시험관내 IMAB362 - ADCs의 효능 및 특이성
1. 세포 생존력에 대한 영향
세포 생존력에 대한 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 영향을 대사 활성 세포의 분광 광도 정량화를 위한 비색 XTT-기반 분석법을 사용하여 CLDN18.2를 내인성 및 이소성으로 발현하는 다양한 인간 위암 및 췌장암 세포주로 시험하였다. 항-종양 활성을 3 내지 16875ng/ml의 범위에서 상이한 항체 농도에서 시험하였다(도 7, 표 9).
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 시험관내에서 위암 세포주 NUGC-4, NCI-N87~CLDN18.2 및 췌장 세포주 BxPC-3~CLDN18.2의 생존력을 효율적으로 억제하였다(도 7). 두 IMAB362-독소 접합체 모두 유사한 농도에서 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 세포(EC50 값: 155-631ng/ml, 생존력의 최대 감소: ≥85%) 및 CLDN 18.2를 이소성으로 발현하는 BxPC-3~CLDN18.2 세포(EC50 값: 43-54ng/ml, 생존력의 최대 감소: ≥83%) 및 NCI-N87~CLDN18.2 세포(EC50 값: 75-180ng/ml, 생존력의 최대 감소: 45-61%) 의 세포 생존력을 억제하였다(도 7, 표 9).
Figure 112017101154150-pct00017
또한, IMAB362-독소 접합체의 표적-매개 항-종양 활성을 시험관내에서 NCI-N87 CLDN18.2 음성 세포주 및 안정적으로 형질감염된 NCI-N87~CLDN18.2 세포주를 사용하여 시험하였다(도 8). IMAB362-vcMMAE는 CLDN18.2 양성 세포에서만 세포 생존력을 억제하였지만, CLDN18.2 음성 세포에서는 그렇지 않았다. 따라서, IMAB362-vcMMAE의 활성은 CLDN18.2 발현에 따라 엄격히 달라진다(도 8).
독소-결합 IMAB362 항체의 특이성을 인간 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 형질감염체 또는 고도의 상동성 단백질 인간 CLDN18.1을 사용하여 분석하였다. 공벡터로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 음성 대조군으로 사용하였다(도 9). IMAB362-vcMMAE는 CLDN18.2 양성 세포에서는 세포 생존력을 감소시키지만, CLDN18.2 음성 세포에서는 그렇지 않았다. 이 효과는 엄격하게 CLDN18.2 특이적이며, 이는 상동성 단백질 18.1을 발현하는 세포에서 세포 증식의 억제가 관찰될 수 없기 때문이다(도 9).
요약하면, IMAB362-vcMMAE 및 IMAB362-DM4는 시험관내에서 유사한 효능을 보였고, 두 ADC 모두 다양한 인간 위암 및 췌장암 세포주의 세포 생존력을 매우 효율적으로 억제 하였다. 이 효과는 표적 발현에 따라 엄격히 달라진다.
2. 방관자 효과
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 방관자 활성을 시험관내에서 CLDN18.2 양성 및 음성 세포주로 이루어진 혼합 종양 세포 배양물을 사용하여 측정하였다. 파이어플라이 루시페라아제(firefly luciferase)를 안정적으로 발현하는 표적-음성 PA-1(Luc) 세포를 리포터 세포로 사용하여 세포 용해를 측정하였다.
루시페라아제 발현 PA-1(Luc)과 루시페라아제 음성 NUGC-4 세포의 공동 배양에서의 루시페라아제 활성은 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로의 처리가 표적 양성 NUGC-4 세포의 존재하에서 표적 음성 PA-1(Luc) 세포를 매우 효과적으로 제거한다는 것을 보였다. 또한, PA-1(Luc) 세포는 CLDN18.2 발현 세포의 부재에 영향을 받지 않았다(도 10).
요약하면, IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE ADC는 인접한 CLDN18.2-음성 종양 세포에서 방관자 효과를 유도 할 수 있었다. 두 독소 모두 CLDN18.2 양성 암 세포 내에서 IMAB362로부터 효율적으로 방출되었으며, 이들의 막 투과성으로 인해 방관자 세포에서 세포독성 활성을 나타낼 수 있다.
실시예 6: 생체내 IMAB362 - ADCs의 항-종양 효과
1. 최대 허용 용량 연구
첫 번째 생체내 실험에서, IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 최대 허용 용량(MTD)을 진행성 인간 BxPC-3~CLDN18.2 췌장 이종 이식 종양을 가진 누드 마우스에서 측정하였다. MTD는 허용할 수 없는 독성이 없으면서도 목적하는 효과를 낼 수 있는 치료에서의 최대 용량을 지칭한다.
1.1. IMAB362 -DM4의 MTD
인간 CLDN18.2를 이소성으로 발현하는 BxPC-3~CLDN8.2를 암컷 Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스의 측면에서 피하로 주사하였다. 13일에 종양이 75±13mm3(평균±SD)의 평균 크기에 도달한 후, 마우스를 대조군과 항체군으로 분류하였다. 마우스에 7.5 내지 15mg/kg IMAB362-DM4의 단일 용량을 IV 볼러스 주사 또는 15mg/kg IMAB362-DM4의 반복 용량을 IV 볼러스 주사하여 각각 투여하였다. 14일에 대조군 마우스에 비히클을 투여하였다. 이식 후 49일에, 동물을 희생시켰다. 독성을 시험하기 위해, 혈액 샘플을 채취하고, 추가의 조직병리학적 연구를 위해 장기를 준비하고 보관하였다.
종양 성장:
IMAB362-DM4는 진행성 BxPC-3~CLDN8.2 이종 이식 종양을 가진 마우스에서 종양 성장을 억제하였다. IMAB362-DM4 단일 또는 반복 처리는 용량과 관계없이 연구 관찰 기간(49일) 동안 모든 처리 마우스에서 거의 완전한 종양 퇴보를 야기하였다. 따라서, 7.5mg/kg IMAB362-DM4의 단일 용량은 완전한 종양 완화에 충분할 수 있다(도 11).
건강 상태:
체중, 동물 행동 및 전반적인 건강 상태를 주 2회씩 모니터링하였다. 모든 동물은 실험동안 정상적인 체중을 보였다(도 12). 이상 행동은 관찰되지 않았다. 그러나, 1마리의 동물은 알수없는 이유로 15mg/kg IMAB362-DM4의 두 번째 투여량을 정맥 투여한 후 사망하였다.
임상 화학:
알라닌 트랜스아미나아제(GPT), 아스파테이트 트랜스아미나아제(GOT), 글루탐산 탈수소효소(GLDH), 알칼린 포스파타아제(AP), α-아밀라아제, 콜린에스테라아제, 크레아티닌 키나아제(CK), 락트산 탈수소효소(LDH), 리파아제, 우레아, 글루코스, 총 단백질 및 알부민의 혈청 수준을 측정하였다. 비히클과 IMAB362-DM4 군 간의 차이는 검출되지 않았다(도 13). 크레아티닌 및 감마-글루타밀 트랜스페라아제는 모든 군에서 검출 한계 이하였다(데이터는 나타내지 않음). 모든 군의 모든 동물은15mg/kg IMAB362-DM4의 반복 투여 이후에도 간 독성, 네프론 독성 또는 췌장 독성에 대해 시험한 대용 표지자의 정상 혈청 수준을 보였다.
요약하면, 단일 투여로서 15mg/kg IMAB362-DM4(인간에서 45mg/m2에 상응)는 마우스에서 내성이 좋으며 CLDN18.2 양성 이종 이식의 치료에서 높은 항-종양 효능을 입증하였다. 농도 및 주사량의 한계로 인해 보다 높은 복용량의 정맥 주사는 가능하지 않았으며 최대 허용 단일 용량을 결정할 수 없었다.
조직학적 분석:
조직학적 분석을 위해 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 비장 및 위의 파라핀 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 IMAB362-vcMMAE 매개 형태학적 변화를 현미경으로 검사하였다. 비히클 처리 마우스와 비교하여 IMAB362-DM4 처리 동물의 조직 절편에서는 어떠한 형태학적 변화도 관찰되지 않았다. 특히, 뮤린 Cldn18.2를 발현하는 유일한 조직은 항체 치료에 의한 조직 손상을 입증하지 못하였다(도 14).
1.2. IMAB362 - vcMMAE의 MTD
IMAB362-vcMMAE의 MTD를 IMAB362-DM4(1.1)에서의 동일한 마우스 모델을 사용하여 시험하였다. 13일에 종양이 111±27mm3(평균±SD)의 평균 크기에 도달한 후, 마우스를 분류하고, 14일에 8 또는 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 단일 IV 볼러스 주사(인간에서 24 및 48mg/m2에 상응) 또는 14일 및 21일에 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 반복 용량 IV 볼러스 주사하여 처리하였다. 14일에 대조군 마우스에 비히클을 투여하였다. 이식 후 37일에, 동물을 희생시켰다. 추가의 조직병리학적 연구를 위해 임상 생화학을 결정하고, 장기를 채취하고 보관하였다.
종양 성장:
IMAB362-vcMMAE 처리는 진행성 BxPC-3~CLDN8.2 이종 이식 종양을 가진 마우스에서 종양 퇴보를 유도하였으며, 종양 성장 또한 억제하였다. 연구 종료 시(37일), IMAB362-vcMMAE 단일 또는 반복 처리는 용량과 관계없이 모든 처리 마우스에서 거의 완전한 종양 퇴보를 야기하였다. 따라서, 8mg/kg IMAB362-vcMMAE의 단일 용량은 완전한 종양 완화에 충분할 수 있다(도 15).
건강 상태:
체중, 동물 행동 및 전반적인 건강 상태를 주 2회씩 모니터링하였다. 모든 동물은 실험동안 정상적인 체중을 보였다(도 16). 16mg/kg IMAB362-vcMMAE의 첫 번째 주사 직후 2 마리의 동물(SD 및 RD 군에서 1마리)이 짧은 시간 동안 반응을 보이지 않았다. 그러나, 이 비정상적인 행동은 임의의 다른 동물 또는 IMAB362-vcMMAE의 두 번째 투여 이후에는 관찰되지 않았다.
임상 화학:
간 독성, 네프론 독성 또는 췌장 독성에 대해 시험한 대용 표지자(알라닌 트랜스아미나아제(GPT), 아스파테이트 트랜스아미나아제(GOT), 글루탐산 탈수소효소(GLDH), 알칼린 포스파타아제(AP), 알파-아밀라아제, 콜린에스테라아제, 크레아티닌 키나아제(CK), 락트산 탈수소효소(LDH), 리파아제, 우레아, 글루코스, 총 단백질 및 알부민)의 혈청 수준을 측정하였다. 비히클 대조군과 비교하여, IMAB362-vcMMAE로 처리한 동물에서 혈청 대용 표지자의 큰 편차는 관찰되지 않았다(도 17). 크레아티닌 및 감마-글루타밀 트랜스페라아제는 모든 군에서 검출 한계 이하였다. 따라서, 측정된 용량 범위에서 임상 생화학에서 간, 췌장 또는 네프론 독성의 징후는 관찰되지 않았다.
조직학적 분석:
조직학적 분석을 위해 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 비장 및 위의 파라핀 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 IMAB362-vcMMAE 매개 형태학적 변화를 현미경으로 검사하였다.
비히클 처리 마우스와 비교하여 IMAB362-DM4 처리 동물의 조직 절편에서 어떠한 IMAB362-vcMMAE 관련 형태학적 변화도 관찰되지 않았으며, 이는 IMAB362-vcMMAE가 조직 손상이나 염증을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. 특히, 위(stomach)에서 조차 뮤린 Cldn18.2를 발현하는 유일한 조직은 항체 치료에 의한 조직 손상을 입증하지 못하였다(도 22).
2. 효능 연구
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 항-종양 효과를 생체내에서 CLDN18.2를 내인성 또는 이소성으로 발현하는 인간 암종 세포로 피하 이식한 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스에서 추가로 분석하였다. 동물 종양 모델에서 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 최적 치료학적 용량을 용량 범위 조사 연구에서 결정하였다(각각 도 18 및 도 20). 인간 이종 이식 종양에 대한 추가의 효능 연구를 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 최적 투여량으로 수행하였다(각각 도 19 및 도 21).
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 상이한 초기 이종 이식 모델(종양 이식 후 치료 시작 3일)뿐만 아니라 진행성 고형 종양(약 100 mm3의 종양 크기에서 치료 시작)의 치료에서 매우 현저하게 종양 보유 마우스의 종양 성장을 억제하고 생존율을 증가시킨다.
진행성 인간 NCI-N87~ CLDN18 . 2 위 이종 이식 종양의 치료:
용량 범위 조사 연구에서, IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 항-종양 효능을 진행성 CLDN18.2 양성 NCI-N87~CLDN18.2 이종 이식 종양을 가진 마우스로 분석하였다. 이식 후 13일에, 단일 IV 볼러스 투여로서 동물을 15.2, 7.6 또는 3.8mg/kg IMAB362-DM4 또는 16, 8 또는 4mg/kg IMAB362-vcMMAE로 처리하거나, 비히클 대조군을 투여하였다. 대조군 동물에 8mg/kg 비접합 IMAB362를 투여하였다(주 2회, IV/i.p.).
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 용량 의존적으로 현저하게 종양 보유 마우스의 종양 성장을 억제하고, 종양 퇴보를 매개하고, 생존율을 연장시킨 반면, 진행성 치료 모델에서 IMAB362 노출 항체는 통계적으로 유의한 항-종양 효과를 나타내지 않았다(도 18). 두 IMAB362 독소-접합 항체 모두 종양 보유 마우스의 생존율을 연장시켰다(생존 중간값: 비히클 군에서 73일, IMAB362-vcMMAE 16mg/kg군에서 143일 및 IMAB362-DM4 15.2mg/kg군에서 136일)(도 18).
초기 인간 NUGC -4 10cF7 -5 sort3a 위 이종 이식 종양의 치료:
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 항-종양 효능을 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7-5 sort3a 위암종 세포로 피하 이식한 마우스에서 분석하였다. 이식 후 3일에, 동물을 단일 용량 IV 주사하여 15.2mg/kg IMAB362-DM4, 16mg/kg IMAB362-vcMMAE 또는 비히클 대조군 처리하였다.
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 처리 동물에서 종양 성장을 예방하는 반면, 대조군의 모든 마우스는 종양을 발생시켰다(p<0.0001)(도 19). 사전 정의한 120일의 관찰 시간 후, IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE를 투여한 10마리의 동물 중 9마리는 살아있고 종양이 없는 반면, 비히클 대조군의 모든 동물은 최근 이식후 41일의 중단 기준으로 인해 안락사시켜야 했다(생존 중간값 34 일, p<0.0003)(도 19).
진행성 인간 BxPC -3~ CLDN18 .2 췌장 이종 이식 종양의 치료:
용량 범위 조사 연구에서 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 투여량-의존적 항-종양 활성을 생체내에서 진행성 인간 BxPC-3~CLDN18.2 췌장 이종 이식 종양을 가진 마우스로 분석하였다. 동물을 14일에 단일 볼러스 IV 주사하여 15.2, 7.6 또는 3.8mg/kg IMAB362-DM4, 16, 8 또는 4mg/kg IMAB362-vcMMAE로 처리하거나, 비히클 투여하거나, 8mg/kg IMAB362의 반복 용량으로 처리하였다(주 2회, IV/i.p.).
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 용량 의존적으로 매우 현저하게 종양 보유 마우스의 종양 성장을 억제하고, 종양 퇴보를 매개하고, 생존율을 연장시켰다. 반면, 비접합 IMAB362는 진행성 종양 모델에서 통계적으로 유의한 항-종양 활성을 나타내지 않았다(도 20). 두 IMAB362 독소-접합 항체 모두 종양 보유 마우스의 생존율을 현저하게 연장시켰다(중간 생존: 비히클 군에서 48일, IMAB362-vcMMAE 16mg/kg군에서 98.5일 및 IMAB362-DM4 15.2mg/kg군에서 81일)(도 20).
초기 인간 DAN-G 1C5F2 췌장 이종 이식 종양의 치료:
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 항-종양 활성을 생체내에서 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 DAN-G 1C5F2 췌장 암종 세포로 피하 이식한 마우스로 시험하였다. DAN-G 1C5F2 세포는 세포 표면에 매우 적은 양의 CLDN18.2만을 갖지만, 상당한 양의 단백질 또는 RNA를 면역블롯 또는 qRT-PCR로 검출할 수 있다. DAN-G 1C5F2 이종 이식 종양의 IHC 분석은 종양 세포의 하위 집단만이 중간 내지 강한 막 관련 CLDN18.2 염색을 보인다는 것을 입증하였다. 따라서, DAN-G 1C5F2 이종 이식 종양은 방관자 살상을 나타내는 항체 약물 접합체로 치료하는데 적합할 수 있다. 동물을 이식 후 3 일에 단일 용량 IV 주사하여 15.2mg/kg IMAB362-DM4, 16mg/kg IMAB362-vcMMAE 또는 비히클 대조군으로 처리하였다.
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 비히클 대조군에 비해 매우 현저하게 종양 보유 마우스의 종양 성장을 억제하고 생존율을 연장하였다(도 21). 대다수의 마우스(>50%)에서 종양 성장이 완전히 예방되었다. 120일의 관찰 기간 후, IMAB362-DM4에서 7 마리 중 2 마리(생존 중앙값 87일, p=0.0002) 및 IMAB362-vcMMAE 처리군에서 7마리 중 4마리가 여전히 생존한 반면(생존은 정의되지 않음, p=0.0006), 암 악액질과 같은 중단 기준으로 인해 비히클 군의 모든 동물을 31일 이내에 안락사시켜야 했다(생존 중간값 24일)(도 21). IMAB362-DM4및 IMAB362-vcMMAE는 모두 현저하게 이질적 CLDN18.2 발현을 나타내는 이종 이식 종양을 가진 마우스의 종양 성장을 억제하고 생존율을 연장시킨다.
요약하면, CLDN18.2의 낮고/낮거나 이질적 발현을 갖는 종양(예를 들어, NUGC-4 및 DAN-G 이종 이식 종양)은 IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 효율적으로 치료할 수 있으며 종양 보유 동물의 상당 부분이 완치되었다. 두 ADC 모두의 항-종양 활성은 방관자 효과를 기초하여 설명될 수 있다: 세포 과정 후 DM4및 MMAE의 세포막 투과성 형태의 방출은 이들이 표적 음성인 경우에도 인접한 종양 세포의 제거를 촉진한다. 따라서, 두 ADC 모두 CLDN18.2 양성 세포의 분획만을 함유하는 종양을 박멸하는데 매우 효과적이다.
실시예 7: 세포사멸 유도
독소-접합 IMAB362의 세포독성을 카스파제 3/7 활성 및 포스파티딜세린의 외재화를 측정하는 세포사멸 분석으로 평가하였다. 카스파제 활성은 예정된 세포사의 시작에 중요한 세포사멸의 가장 빠른 측정 가능한 마커 중 하나이다(Henkart 1996). 카스파제 3/7 활성을 카스파제 3/7 특이적 전구-발광 기질의 절단에 의해 루시퍼라아제-기반 분석으로 측정하였다. 세포사멸의 다른 초기 사건을 형광-접합 아넥신 V를 사용하여 유동세포계측법으로 모니터링하였다(Vermes et al. 1995). 아넥신 V는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합하며, 이는 세포사멸 유도 이후에 즉시 원형질 막의 내부 소엽으로부터 외부 소엽으로 전좌된다. 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해, 세포를 DNA 염료 프로피듐 아이오다이드(PI)로 동시 염색하였다.
세포사멸 유도를 분석하기 위해, CLDN18.2 양성 NUGC4 세포를 수일 동안 IMAB362-독소 접합체의 단일 용량으로 처리하였다. 비처리된 세포 및 비접합 IMAB362로 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다(도 23). 3일 후, IMAB362-DM4 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리된 세포는 증가된 카스파제 3/7 활성을 보인 반면, 노출 항체과의 배양은 카스파제 활성에 영향을 미치지 않았다(도 23A). 아넥신 V와 PI의 동시 염색을 독소-접합 IMAB362 항체에 의한 세포사멸 유도를 확인하기 위한 독립적인 매개변수로 사용하였다. 처리 후 4일에, IMAB362-DM4-vcMMAE 또는 IMAB362-vcMMAE로 처리된 세포의 약 50%가 아넥신 V 또는 아넥신 V/PI 양성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 세포사멸 유도를 통해 세포사가 일어났다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 교차 결합하지 않는 노출 IMAB362는 적용된 농도 범위에서 세포사멸을 유도하지 않는다(도 23B).
요약하면, DM4 또는 vcMMAE에 접합된 IMAB362를 갖는 CLDN18.2 양성 종양 세포의 처리는 세포사멸을 유도한다.
실시예 8: 진행성 인간 NUGC -4 10cF7 -5 sort3a 위 이종 이식 종양의 치료
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 항-종양 효과를 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7-5 sort3a 위암종 세포를 피하로 이식한 마우스로 분석하였다. 진행성 종양(약 200mm3의 종양 크기)을 가진 모든 동물을 이식 후 10일에 IV 주사하여 15.2mg/kg IMAB362-DM4, 16mg/kg IMAB362-vcMMAE 또는 비히클 대조군을 처리하고, 각각의 약물의 두 번째 주사하여 IMAB362 접합체 처리된 군에서 종양이 재발된 후에(38일에) 처리하였다.
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 모든 처리 동물에서 현저하게 종양 성장을 억제하고 종양 퇴보를 매개한 반면(52일), 대조군의 모든 마우스는 종양을 생성하였다(IMAB362-DM4: p<0.05; IMAB362-vcMMAE: p<0.001)(도 24). 치료 후 28일(이식 후 38 일), IMAB362-DM4 처리 군의 50%의 동물에서 재발성 종양 성장(종양 크기 ≥약 100mm3)을 관찰하였다. 각각의 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 두 번째 주사는 다시 종양의 부분 또는 완전 완화를 야기한다. 최종적으로 재발성 종양 성장을 IMAB362-DM4 군에서 8마리 중 7마리 및 IMAB362-vcMMAE 군에서 8마리 중 4마리에서 관찰하였다. 치료 종료의 사전 정의된 시점 후(이식 후 108일), IMAB362-vcMMAE 군에서 8마리 중 4마리 및 IMAB362-DM4 및 IMAB362 군에서 1마리의 동물이 살아남았고, 최근 이식 후 52일(비히클의 경우 32.5일, IMAB362-DM4의 경우 90일(p<0.0003 vs 비히클), 및 IMAB362-vcMMAE의 경우 정의되지 않음(p<0.0003 vs 비히클))에 비히클 군의 모든 동물이 사망하였다(도 24).
실시예 9: 항체-의존성 세포 세포독성( ADCC ) 및 보체 -의존성 세포독성( CDC ) 유도
항체-의존성 세포 세포독성( ADCC ):
DM4-접합 IMAB362 항체 및 MMAE-접합 IMAB362 항체의 ADCC 활성을 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151 # 10 인간 위암종 세포를 사용하여 비접합 IMAB362와 비교하였다(도 25, 표 10).
Figure 112017101154150-pct00018
두 독소-접합 항체인 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE 모두 비접합 항체 IMAB362와 비교하여 유사한 EC50 및 최대 용해 값을 나타내었으며, 이는 약물 접합 후 ADCC- 활성이 유지되었음을 나타낸다.
보체 의존성 세포독성( CDC ):
IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE의 CDC 활성을 CLDN18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC-4 10cF7_5 sort3A p3151#10 및 KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 인간 위암 세포에서 분석하였다(도 26, 표 11).
Figure 112017101154150-pct00019
CDC 활성은 항체 IMAB362에 대한 독소의 접합에 의해 영향을 받지 않았다. 두 독소-접합 항체인 IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE 모두 비접합 항체 IMAB362와 비교하여 적어도 유사한 EC50 및 최대 용해 값을 나타내었다.
따라서, IMAB362-DM4 및 IMAB362-vcMMAE는 독소-매개 세포독성을 비접합 IMAB362의 주요 작용 방식인 항체 의존성 세포독성 및 보체 의존성 세포독성과 결합시킴으로써 전반적인 치료 활성을 개선시킨다.
미생물 또는 생물학적 물질 기탁에 관한 기재(PCT 규칙 13 bis )
Figure 112017101154150-pct00020
신규 국제 출원
가니메드 파마슈티칼스 아게, 외.
"클라우딘 18.2에 대한 항체를 포함하는 약물 접합체"
당소 번호: 342-84 PCT
생물학적 물질에 대한 별지
기탁 사항에 대한 추가 기재:
1) 수탁물(DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는:
DSMZ-독일 미생물보존센터(독일 38124 브라운슈바이크 마스체로데르 베그 1b)이다.
2) 수탁물(DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는:
DSMZ-독일 미생물보존센터(독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라세 7B)이다.
Figure 112017101154150-pct00021
상기에 언급된 모든 기탁에 대한 추가 기재 사항
-마우스(Mus musculus) 비장 세포와 융합된 마우스(Mus musculus) 미엘로마 P3X63Ag8U.1
-인간 클라우딘-18A2에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마
3) 기탁자:
상기 언급된 모든 기탁은 가니메드 파마슈티칼스 아게(독일 55131 마인츠 프라일리그라트슈트라쎄 12)에 의하여 이루어졌다.
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2737 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2738 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2739 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2740 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2741 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2742 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2743 20051019 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2745 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2746 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2747 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2748 20051117 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2808 20061026 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2809 20061026 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMZDSMACC2810 20061026
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> DRUG CONJUGATES COMPRISING ANTIBODIES AGAINST CLAUDIN 18.2 <130> 342-84 PCT <150> PCT/EP2015/058206 <151> 2015-04-15 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met 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Claims (68)

  1. 세포독성제 또는 세포증식억제제가 링커에 의해 공유결합된 CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체를 포함하는 항체 약물 접합체를 포함하며,
    상기 항체는
    (a) 서열 번호 32로 표시되는 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 중쇄 서열, 및 서열 번호 39로 표시되는 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 경쇄 서열을 포함하는 CLDN18.2에 결합하는 항체; 및
    (b) 서열 번호 30으로 표시되는 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 중쇄 서열, 및 서열 번호 35로 표시되는 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 경쇄 서열을 포함하는 CLDN18.2에 결합하는 항체;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 환자의 CLDN18.2-발현 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 세포로 내재화되는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체가 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체는 단일클론항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 항체, 인간화 또는 키메라 항체인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체가 CLDN18.2의 세포외 도메인에 결합하는 것인, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 항체가 CLDN18.2의 첫 번째 세포외 루프(loop)에 결합하는 것인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    세포독성제 또는 세포증식억제제는 세포막 투과성인, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    세포독성제 또는 세포증식억제제는 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 아우리스타틴(auristatin)인, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    메이탄시노이드는 DM1및 DM4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    아우리스타틴은 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    링커는 절단성 링커(cleavable linker)인, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    링커가 세포내 조건하에서 절단 가능한 것인, 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    링커가 5.5 미만의 pH에서 가수분해 가능한 것인, 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    링커가 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인, 약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    링커는 카텝신-절단성 링커인, 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    링커가 디펩타이드를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    디펩타이드는 val-cit 또는 phe-lys인, 약학 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 CLDN18.2-발현 암의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 투여되는 것인, 약학 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 체중의 3 내지 30mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인, 약학 조성물.
  21. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 환자의 신체 표면의 9 내지 90mg/m2의 투여량으로 투여되는 것인, 약학 조성물.
  22. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체의 단일 용량 또는 항체 약물 접합체의 2회 이상의 용량으로 투여되는, 약학 조성물.
  23. 제1항에 있어서,
    항체 약물 접합체가 정맥 내 주사되는 것인, 약학 조성물.
  24. 제1항에 있어서,
    암은 선암종(adenocarcinoma)인, 약학 조성물.
  25. 제1항에 있어서,
    암은 진행성 선암종(adenocarcinoma)인, 약학 조성물.
  26. 제1항에 있어서,
    암이 위암(gastric cancer), 식도암(esophageal cancer), 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포성 폐암(NSCLC), 유방암, 난소암, 대장암, 간장암, 두경부암, 담낭암 및 이의 전이, 크루켄버그 종양(Krukenberg tumor), 복막 전이 및 림프절 전이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  27. 제1항에 있어서,
    암이 위암(cancer of the stomach) 및 식도암(cancer of the esophagus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  28. 제1항에 있어서,
    환자는 HER2/neu 음성 환자 또는 HER2/neu 양성 상태이지만 트라스투주맙 치료에 적합하지 않은 환자인, 약학 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    CLDN18.2는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  30. 제1항의 약학 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 환자의 CLDN18.2-발현 암의 치료 또는 예방용 약학적 제형.
  31. 제1항의 약학 조성물을 포함하는, 암 환자의 CLDN18.2-발현 암의 치료 또는 예방용 의약 제제.
  32. 제31항에 있어서,
    약학 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트의 형태로 존재하는 것인, 의약 제제.
  33. 제31항에 있어서,
    CLDN18.2-발현 암을 치료 또는 예방에 상기 제제를 사용하기 위한 인쇄된 설명서를 추가로 포함하는 것인, 의약 제제.
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