CN106999372A - 用于刺激角质形成细胞的分化以美白色素沉着过度的皮肤的活性物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了识别具有降低色素沉着过度的皮肤病损与色素沉着过度的皮肤病损周围的皮肤之间的颜色对比度而不直接影响黑素细胞或黑素生成的功效的材料的方法。该方法包括以下步骤：向色素沉着过度的皮肤病损施加含有待测试材料的组合物；和在一段时间间隔后，观察所述组合物是否在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中已实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形。

Description

用于刺激角质形成细胞的分化以美白色素沉着过度的皮肤的 活性物

发明背景

现有技术领域

本发明涉及用于识别在皮肤的色素过度沉着病损中抑制角质形成细胞的增殖并刺激其分化的材料的模型。此类材料降低了色素过度沉着病损与周围皮肤之间的颜色对比度，由此匀化肤色。

现有技术描述

全球消费者（尤其是女性）普遍关注的问题是肤色不匀。某些皮肤细胞——黑素细胞——负责产生决定皮肤颜色的色素。黑素细胞产生黑色素，并向表皮中周围的角质形成细胞排放黑色素。细胞更新的自然过程使得角质形成细胞朝向皮肤表面向上驱动。

随着皮肤老化，其经历直接影响其外观的转变。环境因素（主要是暴露于来自太阳的紫外（UV）辐射）以及激素因素（其导致皮肤变薄和细胞更新速率降低）的影响可能导致不均匀的肤色。暴露于UV辐射（其已经显示引起DNA损伤）还影响皮肤中黑色素的分布。UV辐射可以产生活性氧物类（ROS），其通过活化黑素细胞中的酪氨酸酶和其它酶来刺激黑色素产生。此外，随着细胞更新的放缓，角质形成细胞和黑素细胞更长时间地保持接触。由于这种增长的接触时间，导致转移至角质形成细胞的黑色素的量增加。由于表皮损失其厚度，这些黑素细胞和角质形成细胞（含有增加量的深色色素）更接近于皮肤表面并因此更为明显。

日光性斑痣（solar lentigines）或老年斑是扁平、褐色的良性皮肤病损，通常发生在老化的皮肤中，特别是在手、脸和前臂的上表面上。这些病损的外观与累积性和间歇性的UV暴露相关，并被认为是皮肤光损伤的临床标志。日光性斑痣还与暴露于污染空气中的颗粒物水平相关。这些病损在白种人群和亚洲人群中很常见，但是似乎在亚洲人的皮肤中更早发生且更为显著。

组织学研究已表明，病损皮肤的特征在于表皮的基底层（即表皮的最下层，与真皮相邻，含有黑素细胞和角质形成细胞）的色素沉着过度、增加量的黑素细胞、以及在表面上突入表皮区域，与相邻的表皮向下突起互锁的真皮乳头的伸长（Mehregan, A.H., Lentigosenilis and its evolutions. Invest Dermatol. 1975; 65(5): 429-433；Montagna,W.等人. A reinvestigation of solar lentigines. Arch Dermatol 1980; 116: 1151-1154）。已经提出，这些复杂的结构修饰可能是由于提高的表皮细胞增殖率与真皮-表皮接合处的扰动（Noblesse, E.,等人. Ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmaco. Physiol. 2006; 19: 95-100）。还已经指出，释放角质形成细胞生长因子和白介素-1α导致日光性斑痣的色素沉着过度（Chen, N.等人. The role of keratinocytegrowth factor in melanogenesis: a possible mechanism for the initiation ofsolar lentigines. Exp. Dermatol. 19(10), 865-872, 2010）。着色斑（lentigo）中的基因表达分析也表明与微炎症反应相关的基因上调（Goyarts, E.等人. MorphologicalChanges Associated with Aging: Age Spots and the Microinflammatory Model ofSkin Aging. Ann. N.Y Acad. Sci. 1119:32-39, 2007）。这与作为炎性反应的一部分在着色斑中观察到的角质形成细胞的过度增殖一致。

本发明人对白种人女性的老年斑的临床研究显示了与相邻皮肤相比与这些斑点相关的更高的表皮细胞增殖率。反射式共聚焦显微镜法（RCM）显示了真皮乳头的深度结构变形，因为高折光基底细胞的对准图形（alignment pattern）由圆形（与非病损皮肤相关）向不规则的非圆形形状（典型的日光性斑痣）推移。此外，观察到真皮乳头数量的增加。在经历五年时期进行的研究中还显示，随时间的推移，日光性斑痣变得更深且增大，并且真皮乳头变得更加变形（Pollefliet, C.等人. Morphological characterization of solarlentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinalapproach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。

不均匀的色素沉着是许多人（更特别是女性）关注的问题。具体而言，许多人认为老年斑在视觉上不美观。肤色的不均匀，尤其是皮肤中色素沉着过度区域或深色（老年）斑的外观，已经导致市场上出现许多皮肤美白（lightening）剂。粉底和遮瑕膏常用于覆盖或掩饰肤色差异。此外，影响黑素生成级联反应的化妆品治疗，特别是抑制酶（酪氨酸酶）的那些，已经显示出降低了日光性斑痣中存在的黑色素的量，导致淡化的色素斑。此类试剂包括但不限于氢醌（其据说对黑素细胞具有细胞毒性）及其衍生物，包括熊果苷；酪氨酸酶抑制剂，如维生素C（抗坏血酸）及其衍生物；曲酸；多酚；苯甲醛和苯甲酸盐衍生物；以及类视黄醇，其是维生素A的衍生物。

尽管氢醌总体上是安全的，但其潜在的副作用，包括红斑、皮肤刺激、接触性皮炎以及周围皮肤的色素沉着不足，引起了人们寻找其它更安全的皮肤美白剂的兴趣。

本发明人目前的发现是，抑制角质形成细胞的增殖并刺激它们的分化的材料令人惊讶和预料不到地改善了老年斑的外观，并使皮肤看起来色调更均匀。更令人惊讶的是，这些材料并非经典的皮肤美白（whitening）活性物（即已知影响黑素生成级联反应的那些活性物）。

发明概述

本发明提供了识别促进肤色均匀的新型美白剂的模型。含有这些新型美白剂的制剂与经典的美白制剂一样好地起作用以降低老年斑与老年斑周围的皮肤之间的颜色对比度，而不具有传统美白活性物可能导致的潜在副作用。

根据本发明，提供了识别具有降低色素沉着过度的皮肤病损与色素沉着过度的皮肤病损周围的皮肤之间的颜色对比度而不直接影响黑素细胞或黑素生成的功效的材料的方法，所述方法包括：

（a）向色素沉着过度的皮肤病损施加含有待测试材料的组合物；和

（b）在一段时间间隔后，例如在至少大约一个月，如两个、三个或四个月之后，观察该组合物是否在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中已实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形。

优选地，使用反射式共聚焦显微镜法（RCM）来评估测试制剂用于改善抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形中的至少一种的功效。

还提供了用于美白皮肤的方法，包括向需要所述美白的皮肤施加局部组合物，所述局部组合物包含至少一种活性物，所述活性物在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形，其中该活性物能够相对于色素沉着过度病损周围的皮肤美白色素沉着过度病损中的皮肤，而不直接影响黑素细胞或黑素生成。在一些实施方案中，该局部组合物进一步包含直接影响黑素细胞或黑素生成的皮肤美白剂。

本发明还涉及用于降低色素沉着过度的皮肤病损与色素沉着过度病损周围的皮肤之间的颜色对比度的经改善的局部化妆品组合物，所述组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含至少一种第一活性物，其直接影响黑素细胞或黑素生成，其中所述改善包括将第二活性物包含在所述组合物中，所述第二活性物用于在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及减小真皮乳头的压缩变形，而不直接影响黑素细胞或黑素生成。

本发明进一步涉及降低皮肤的色素沉着过度病损与色素沉着过度病损周围的皮肤之间的颜色对比度的方案，包括：

（a）向需要这样的颜色对比度降低的皮肤施加第一化妆品组合物，所述第一化妆品组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含第一皮肤美白活性物，其用于在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形中的至少一项，而不直接影响黑素细胞或黑素生成；和

（b）向需要这样的颜色对比度降低的皮肤施加第二化妆品组合物，所述第二化妆品组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含直接影响黑素细胞或黑素生成的第二皮肤美白活性物；其中（a）和（b）可以以任何顺序发生。

附图概述

图1A是表示在基线处和在使用含有Phytofix但不含传统美白活性物的分化刺激制剂的四个月治疗期后色素沉着过度病损中真皮乳头环的圆度指数的柱状图。

图1B是表示在基线处和在使用不含Phytofix或传统美白活性物的制剂的四个月治疗期后色素沉着过度病损中真皮乳头环的圆度指数的柱状图。

图1C是显示图1a和图1b中所示的圆度指数差异的柱状图。

图2A是表明使用含有Phytofix的分化刺激制剂治疗过的色素沉着过度病损中真皮乳头数量的柱状图。

图2B是显示使用不含Phytofix或传统美白活性物的制剂治疗过的色素沉着过度病损中真皮乳头数量的柱状图。

图2C是显示在图2A和图2B中所示在真皮乳头数量方面观察到的差异的柱状图。

图3是表示在皮肤治疗后1、2、3和4个月之后日光性着色斑的皮肤与周围皮肤之间的颜色对比度数据的图。

图4A是使用本发明的分化刺激制剂治疗过的日光性斑痣的一组皮肤镜照片。

图4B是使用本发明的分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣的一组皮肤镜照片。

图5是显示与使用分化刺激制剂的媒介物/基料（base）治疗相比，对使用本发明的分化刺激制剂或使用分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣中乳头环的圆度指数的影响的一组柱状图。

图6是在真皮-表皮界面处记录的一组日光性斑痣的皮肤镜照片和日光性斑痣的反射式共聚焦显微镜法（RCM）图像，表示用本发明的分化刺激制剂治疗后在圆度指数方面的改善。

图7是表示与使用分化刺激制剂的媒介物/基料治疗相比，在使用本发明的分化刺激制剂或使用分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣中存在的真皮乳头数量的一组柱状图。

图8是在真皮-表皮界面处记录的一组日光性斑痣的皮肤镜照片和日光性斑痣的RCM图像，表示用本发明的分化刺激制剂治疗后在真皮乳头环数量方面的改善。

图9A是显示与使用分化刺激制剂的媒介物/基料治疗相比，对使用本发明的分化刺激制剂或使用分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣的表皮厚度的影响的一组柱状图。

图9B是显示与使用分化刺激制剂的媒介物/基料治疗相比，对使用本发明的分化刺激制剂或使用分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣的角质层厚度的影响的一组柱状图。

图10是显示表皮细胞增殖的一组柱状图，所述表皮细胞增殖通过与使用分化刺激制剂的媒介物/基料治疗相比，使用本发明的分化刺激制剂或使用分化刺激制剂后接含有常规美白活性物的制剂治疗过的日光性斑痣的自发荧光测得。

本发明的优选实施方案的详述

通常在光老化皮肤中观察到日光性着色斑。其特征在于在受到长期照射的皮肤中出现日光性斑痣或色素沉着过度的老年斑或病损。这些斑点是良性的，通常出现在50岁后的个体的皮肤中。由显微镜研究可知，与相邻的正常皮肤相比，病损皮肤存在显著改变，包括具有黑色素积累的色素沉着过度的基底层以及黑色素过度产生的排出方面的减少、表皮网状脊（epidermis rete ridges）的伸长、以及与角质形成细胞基底微绒毛的增加相关的表皮-真皮接合处的混乱和扰乱（降低的屏障质量）。

本发明人以前的研究表明，这些病损表现出增加的经表皮失水量（Transepidermal Water Loss, TEWL）和降低的半胱天冬酶-14活性，这支持了其他人的意见：老年斑的特征在于受损的屏障功能。本发明人（使用RCM）进行的研究证实了日光性斑痣中真皮乳头的深度结构变形，并引导他们考虑该变形是否可逆。如下文所讨论的那样研究了各种局部化妆品制剂改善或逆转该变形的能力。

实施例

1. 化妆品原料对日光性斑痣形态的影响

四十一位志愿者参加了一项为期四个月的临床研究。仅有在她们的手上具有清晰可见的老年斑的组员才可参与。组员的平均年龄为61岁，最小和最大年龄分别为47岁和74岁。所有志愿者均为白种人，并表现出Fitzpatrick II型或III型皮肤。测试区域是在双手各自的背侧上的日光性着色斑。患有任何类型的皮肤病或对乙醇和/或化妆品的超敏反应或过敏症的组员不参与该研究。在进入该研究之前，从各志愿者处征得书面知情同意书。

Phytofix——一种衍生自向日葵、大麦和黄瓜提取物的含有鞘脂类、甘油三酯类和甾醇类的活性物——据称模仿皮肤膜的结构，并因其皮肤屏障修复特性而广泛使用。对不含传统美白活性物的多种制剂评估了它们的老年斑淡化功效。在下表1中显示了含有Phytofix的制剂1-3和不含Phytofix的制剂4和5。

对12名组员（一块老年斑/组员，总计12块老年斑）测试制剂1。由13名组员（一块老年斑/组员，总计13块老年斑）施用制剂2，由16名组员（两块老年斑/组员，总计32块老年斑）使用配方3，对14名组员（一块老年斑/组员，总计14块老年斑）测试制剂4，由10名组员（一块老年斑/组员，总计10块老年斑）使用制剂5。各组员自由地在她的手的整个背侧表面上施加制剂，每天两次（早晚），持续4个月。组员被指示在该临床研究期间不得在她们的手上使用任何其它化妆品。每个月对研究者选择的在每只手上的一块老年斑进行评估。

如下制备配方1：

在该批次开始时通过在容器中将3%丁二醇加热至70℃，加入1% Carbowax并在2000RPM下混合来制备预混物B（序列10）

在一个单独的辅助釜（support kettle）中：

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸并在8 RPM下侧扫（side sweep）。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5并在2500 RPM下混合，

向辅助釜中添加10% Gransil IDS，

向辅助釜中添加5% DM-fluid，

向辅助釜中添加2% Permethyl，

向辅助釜中添加0.5% Phytofix，并

将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1% KF-6017，并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜（main kettle）中添加38%去离子水，

在50°下加热，

在531 RPM下混合，

在5 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.05% EDETA，

向主釜中添加0.1%核糖核酸钠，

将温度调节至25℃。

序列6：向主釜中添加0.6% Aristoflex（50-3214）。

通过向容器中引入3%丁二醇，在70℃下加热，随后添加0.3% Barguard cp来制备预混物A（序列9）。

序列7：向主釜中添加0.2%Phenoxetol，并由辅助釜引入批料（batch）。

序列8：向主釜中添加0.2% Vitamin E。

序列9：向主釜中添加预混物A。

序列10：向主釜中添加预混物B。

序列11：向主釜中添加1.5% Simulgel 600。

序列12：向主釜中添加0.026% FD&C Yellow no 5，

向主釜中添加0.009% FD&C Yellow no 6，并混合直到均匀。

如下制备配方2：

通过向容器中添加2.5% Tween 40，在3000 RPM下混合，添加0.5% Phytofix，加热至80℃并随后关闭加热来制备预混物B（序列3）。

通过向单独的容器中添加5%去离子水，在2500 RPM下混合，并添加0.1%核糖核酸来制备预混物C（序列5）。

通过向单独的容器中添加 2% Hydrolite，在2000 RPM下混合，将该容器加热至40℃并添加0.7% Bronidox来制备预混物D（序列6）。

序列1：向主釜中添加47.87%去离子水，

将温度调节至60℃，随后在12 RPM下侧扫，并在910 RPM下混合，

向主釜中添加0.02% Edeta，

向主釜中添加0.75%蔗糖，

向主釜中添加10%透明质酸，

向主釜中添加0.1% Germazide，

向主釜中添加0.5%山梨糖醇，

向主釜中添加0.75% Rhodasurf，和

向主釜中添加0.05%柠檬酸，

序列2：向辅助釜中添加5% Xiameter，

在1000 RPM下混合，

在60℃下加热，

向辅助釜中添加10% Xiameter，

向辅助釜中添加3% DM-fluid，

向辅助釜中添加1%肉豆蔻醇，

向辅助釜中添加0.5%玉米油，

向辅助釜中添加0.75% KF-6017，和

向辅助釜中添加0.01% BHT。

序列3：向主釜中添加预混物B，随后由辅助釜添加批料。

序列4：在30℃下冷却主釜。静置（setting）。当温度达到40℃时，向主釜中添加0.1% Grasnow AE，

向主釜中添加2.5% Catezomes，

向主釜中添加2%酵母提取物，

向主釜中添加0.5%生物转化的白桦（Bio-converted white birch），在1220 RPM下混合，随后在15 RPM下侧扫。

序列5：向主釜中添加预混物C。

序列6：向主釜中添加预混物D。

序列7：向主釜中添加0.2% Maskent共混物。

序列8：通过向主釜中添加0.197%苛性钠将pH调节至5。

序列9：向主釜中添加3.4% Sepigel 305。

如下制备配方3：

通过向容器中添加2.5% Tween 40，在3000 RPM下混合，添加0.5% Phytofix，加热至80℃并随后关闭加热来制备预混物B（序列3）。

通过向单独的容器中添加5%去离子水，在2500 RPM下混合，并添加0.1%核糖核酸来制备预混物C（序列6）。

通过向单独的容器中添加 2% Hydrolite，在2000 RPM下混合，加热至40℃并添加0.7% Bronidox来制备预混物D（序列8）。

序列1：向主釜中添加47.87%去离子水，

将温度调节至60℃，

在12 RPM下侧扫，

在910 RPM下混合，

向主釜中添加0.02% Edeta，

向主釜中添加0.75%蔗糖，

向主釜中添加10%透明质酸，

向主釜中添加0.1% Germazide，

向主釜中添加0.5%山梨糖醇，

向主釜中添加0.75% Rhodasurf，和

向主釜中添加0.05%柠檬酸。

序列2：向辅助釜中添加5% Xiameter（68-0451）；

在1000 RPM下混合，

加热至60℃，

向辅助釜中添加10% Xiameter，

向辅助釜中添加3% DM-fluid，

向辅助釜中添加1%肉豆蔻醇，

向辅助釜中添加0.5%玉米油，

向辅助釜中添加0.75% KF-6017（60-0031），和

向辅助釜中添加0.01% BHT（51-0669）。

序列3：向主釜中添加预混物B，并添加辅助釜的内容物。

序列4：关闭加热，并在30℃下冷却主釜。静置。当温度达到40℃时，向主釜中添加0.1% Grasnow AE，

向主釜中添加2.5% Catezomes，

向主釜中添加2%酵母提取物，

向主釜中添加0.5%生物转化的白桦，

在1220 RPM下混合，随后在15 RPM下侧扫。

序列5：向主釜中添加预混物C。

序列6：向主釜中添加预混物D。

序列7：向主釜中添加0.2% Maskent共混物。

序列8：通过向主釜中添加0.197%苛性钠将pH调节至5。

序列9：向主釜中添加3.4% Sepigel 305。

如下制备配方4：

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸并在8 RPM下侧扫。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5，

在2500 RPM下混合，

向辅助釜中添加10% Gransil IDS，

向辅助釜中添加5% DM-fluid，

向辅助釜中添加2% Permethyl，并

将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1.5% KF-6017并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜中添加38%去离子水，

在50℃下加热，

在481 RPM下混合，

在5 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.05% EDETA，和

关闭加热。

序列6：将主釜冷却至25℃。当温度达到25℃时，向主釜中添加0.6% Aristoflex。

通过向容器中添加3%丁二醇并加热至70℃，添加0.3% Barguard cp，随后添加1%Carbowax 30，并在2000 RPM下混合来制备预混物A（序列8）。

序列7：向主釜中添加0.2% Phenoxetol。向主釜中添加来自辅助釜的配料（ingredients）。

序列8：向主釜中添加预混物A。

序列9：向主釜中添加1.5% Simulgel 600。

序列10：向主釜中添加0.026% FD&C Yellow no. 5，

向主釜中添加0.009% FD&C Yellow no. 6，并混合直到均匀。

如下制备配方5：

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸并在8 RPM下侧扫。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5，

在2500 RPM下混合，

向辅助釜中添加10% Gransil IDS，

向辅助釜中添加5% DM-fluid，

向辅助釜中添加2% Permethyl，并将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1.5% KF-6017并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜中添加38%去离子水，

将主釜加热至50℃，

在481 RPM下混合，随后在5 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.05% EDETA，并关闭加热。

序列6：将主釜冷却至25℃，当温度达到25℃时，向主釜中添加0.6% Aristoflex。

通过向容器中添加3%丁二醇并在70℃下加热，随后添加0.3% Barguard cp，添加1% Carbowax 30，并在2000 RPM下混合来制备预混物A（序列8）。

序列7：向主釜中添加0.2% Phenoxetol；随后向主釜中添加辅助釜的内容物。

序列8：向主釜中添加预混物A。

序列9：向主釜中添加1.5% Simulgel 600。

序列10：向主釜中添加0.026% FD&C Yellow no. 5，

向主釜中添加0.009% FD&C Yellow no. 6，并混合直到均匀。

在本研究中，在治疗前和随后在治疗4个月后通过使用Vivascope（Lucid 1500）的反射式共聚焦显微镜法（RCM）来评估化妆品原料对日光性斑痣形态的影响。RCM是用于皮肤“体内”检查的非侵入性技术。将Vivascope放置在手的背侧。超声凝胶（折射率1.36）用作物镜与皮肤之间的浸没介质（immersion medium）。RCM获取500×500微米视野的水平组织图像，并具有自动步进器，在水平面（XY-轴）上的相同点处获得从角膜层（corneal layer）至浅表真皮（Z-轴叠层）间隔3微米的依次更深的单独图像。由每个老年斑获得从角膜层至浅表真皮的皮肤的六个光学切面。

在共聚焦显微镜中，来自二极管激光器的近红外光聚焦在微观皮肤靶上。当所述光通过具有不同折射率的细胞结构之间时，其被自然反射，这种反射光随后被捕捉并通过计算机软件重组成二维灰度图像。显微镜的聚焦（也就是说，调节Z-轴上的焦点）能够获得皮肤中不同层次的图像。检测需要存在由黑色素、血红蛋白和细胞器提供的内在微观结构特异性对比度。黑色素是在色素沉着的皮肤中最好的内源性造影剂，因其高折射率而能够检测含有黑色素的细胞。这种类型的市售显微镜系统可以生成具有足以用于组织学分析的细节的图像（Calzavara-Pinton P., Longo C., Venturini M., Sala R., Pellacani G.Photochem Pholobiol. 2008 Nov-Dec; 84(6): 1421-30）。Vivascope 1500系统是一种反射式共聚焦显微镜，其具有穿过活体组织逐层实时使细胞成像的能力。这些图像可用于测量皮肤及其不同层的厚度和真皮乳头环的形状。Vivascope 1500使用在小于20 mW的功率下运行的830纳米的近红外激光器，并装备有数值孔径0.9的30X物镜。

由RCM图像计算高折光真皮乳头的圆度指数和数量（每平方毫米）。正圆的圆度指数等于100；因此，更低的指数对应于距圆形更显著的偏离。由于与皮肤的非病损区域相比，提高数量的真皮乳头环也与病损的变形形态相关，环数量的降低被认为是形态的改善。使用配对的Student’s t测试评估时间依赖性效应。对于未配对样品使用Student’s t测试评估治疗之间的差异。结果呈现在图1a、b、c；和图2a、b、c中。

图1a表示在基线处和在使用含有或不含Phytofix的制剂的四个月治疗期后的圆度指数，并且各制剂不含传统的美白活性物。使用各自含有0.5% Phytofix的制剂1、2和3的治疗显示出病损（老年斑）的真皮乳头的圆度指数（由72.33至73.69）的统计学显著增加（p<10^-4），表明色素沉着过度斑点的基底膜的变形形态的改善（即减少）。发现非病损皮肤的真皮乳头的圆度指数为大约80（未显示）。如图1b中所示，使用不含Phytofix的制剂4和5的四个月治疗显示对圆度指数（其范围为75.24至74.71）没有影响。

对于使用或不使用Phytofix的治疗计算治疗前后观察到的圆度指数的差异（图1c）。含有Phytofix的制剂显示出1.4的圆度指数的提高，表明变形形态的改善，而对于不含Phytofix的制剂，则没有改善（即0.5的降低）。两组制剂之间的差异是统计上显著的，表明Phytofix有助于观察到的效果。

本发明人此前已经观察到，随着时间的推移（没有治疗），老年斑中的平均圆度指数在5年内降低了1.7（Pollefliet, C等人. Morphological characterization of solarlentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinalapproach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。

如图2a中所示，用含有Phytofix的制剂1、2和3治疗过的色素沉着过度病损中真皮乳头的数量从160.7降低至151.7。如图2b中所示（其中真皮乳头数量从138.7提高至153.3），对于用制剂4和5（其不含Phytofix）治疗过的病损没有观察到这一现象。

还计算了治疗前后的真皮乳头数量的差异。这种差异，如图2c中所示，对于含有Phytofix的制剂是负的（-9.0），表明乳头环数量的降低。用不含Phytofix的制剂治疗病损显示出相反的趋势（+14.6），治疗之间的差异达到了统计学显著。

发明人此前已经观察到，随着时间的推移（没有治疗），老年斑中真皮乳头的平均数量在5年内倾向于提高18.7（Pollefliet, C.等人. Morphological characterizationof solar lentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: alongitudinal approach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。

发明人此前的研究表明，在制剂中以大约0.001重量%至大约2重量%的范围使用的Phytofix在改善色素沉着过度病损中基底膜的形态方面表现出功效（结果未显示）。

要理解的是，对色素沉着过度病损的基底膜形态表现出积极效果的各制剂除Phytofix之外还含有核糖核酸钠。但是，由于使用含有核糖核酸钠但不含Phytofix的制剂没有观察到基底膜形态的改善，本发明人得出结论，对形态的积极效果并非由核糖核酸钠导致（结果未显示）。

发明人还观察到，在一些情况下，含有经典美白活性物，例如UP302（即二甲氧基甲苯基丙基间苯二酚，衍生自Dianella ensifolia植物）或糖蜜提取物并结合Phytofix的制剂导致对日光性斑痣形态的积极效果（通过含有Phytofix但不含经典美白活性物的制剂来展现）消失（结果未显示）。另一方面，采用含有Phytofix与已知美白活性物（包括酵母提取物XP、赤糖糊糖蜜、Phytoclar II、AS-G（抗坏血酸葡糖苷）粉末和杂色栓菌（Trametesversicolor））的组合的某些制剂，或采用含有Phytofix与已知美白活性物（包括黑桑（桑树）根提取物、黄芩提取物和欧洲葡萄（葡萄）提取物）的组合的制剂的治疗表现出改善的基底膜的形态（结果未显示）。但是，与采用含有Phytofix但不含已知美白活性物的制剂的用途相比，采用除Phytofix之外还含有这些已知的美白活性物的制剂的治疗不会导致在形态方面的任何更大的改善。

数据表明，通常，含有Phytofix的局部制剂1、2和3能够改善日光性斑痣中基底膜的形态，而不含Phytofix的制剂4和5做不到这一点。此外，在不存在传统美白活性物的情况下使用含有材料Phytofix的制剂的皮肤治疗对老年斑的皮肤中变形的基底膜具有积极的效果，并倾向于使这种变形正常化。当用不含Phytofix的制剂治疗色素沉着过度病损时没有观察到这一效果。此外，向含有Phytofix的制剂中添加一些传统美白活性物对Phytofix在老年斑的基底膜形态方面实现积极变化的能力没有明显的影响，而在含有Phytofix的制剂中其它传统美白活性物的组合看起来中和了Phytofix对形态的积极效果。仍然需要研究这种不相容性以避免将可能不利地影响Phytofix改善色素沉着过度病损的基底膜形态的功效的成分混合到制剂中。

2. 分化刺激活性物对肤色和日光性斑痣中真皮乳头形态的影响

在本研究中，评估了各种制剂（显示在下表2中）在改善不均匀肤色和/或日光性斑痣中真皮乳头形态方面的能力。用（1）含有下列活性物的分化刺激制剂：水杨酸（抗增殖功能）、白藜芦醇（Sirt-1活化功能）、MPC（迁移功能）、香紫苏内酯（Sclareolide）（即快乐鼠尾草（Clary Sage）发酵提取物，在香紫苏内酯中滴定——熟化功能）和Phytofix（皮肤屏障恢复功能），或（2）分化刺激制剂后接含有下列已知美白活性物的美白配方：酵母提取物XP、杂色栓菌提取物（Trametes Extract）、AS-G粉末、Phytoclar II；Nivitol UP-302和Viapurelicorice，或（3）对照制剂（即水溶性活性物的基料或媒介物）来治疗三个组员的组各自的日光性斑痣。

如下制备配方6：

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸，并在8 RPM下侧扫。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5，并在2500 RPM下混合，

向辅助釜中添加10% Gransil IDS，

向辅助釜中添加5% DM-fluid，

向辅助釜中添加2% Permethyl，并将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1.5% KF-6017，并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜中添加38.35%去离子水，并在50℃的设定（setting）下加热主釜，

在481 RPM下混合，随后在5 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.05% EDETA，并随后关闭加热。

序列6：将主釜冷却至25℃，向主釜中添加0.6% Aristoflex，并随后添加辅助釜的内容物。

通过向容器中添加3%丁二醇，加热至70℃，添加0.2% Phenoxetol，随后添加0.3%Barguard cp，接着添加1% Carbowax 30，并在2000 RPM下混合来制备预混物A（序列7）。

序列7：向主釜中添加预混物A。

序列8：向主釜中添加1.5% Simulgel 600并混合直到均匀。

如下制备配方7：

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸，并在8 RPM下侧扫。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5，并在2500 RPM下混合，

向辅助釜中添加10% Gransil IDS，

向辅助釜中添加5% DM-fluid，

向辅助釜中添加2% Permethyl，并将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1.5% KF-6017，并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜中添加35.25%去离子水，

加热至50℃，

在481 RPM下混合，随后在5 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.05% EDETA，

向主釜中添加0.5% MPC，

向主釜中添加1% Phytofix，并随后关闭加热。

序列6：将主釜冷却至25℃；随后向主釜中添加0.6% Aristoflex；并随后向主釜中添加辅助釜的内容物。

通过向容器中添加3%丁二醇，加热至70℃，随后一次一样地加入下列成分：0.2%Phenoxetol、0.3% Barguard cp、1% Carbowax 30、0.25%水杨酸、0.05% Clary sage和0.1%白藜芦醇，并在2000 RPM下混合来制备预混物A（序列7）。

序列7：向主釜中添加预混物A 。

通过在容器中组合1%去离子水和0.2% Tris amino ultra来制备预混物B（序列8）。

序列8：向主釜中添加预混物B。

序列9：向主釜中添加1.5% Simulgel 600并混合直到均匀。

如下制备配方8：

通过向容器中引入3%丁二醇并在70℃下加热，接着在150 RPM下混合，添加0.3%Barguard cp，随后添加0.1%四氢姜黄素类化合物来制备预混物B（序列11）。

通过向容器中引入3%丁二醇，添加1% Carobowax，加热至70℃，在2000 RPM下混合，添加0.18% Nivitol UP-302，随后添加0.1% Viapure licorice，并随后添加0.03%Viapure Citrus来制备预混物C（序列12）。

通过向容器中引入4%去离子水，在150 RPM下混合，添加1.8% AS-G粉末并随后添加0.645% Tris amino ultra来制备预混物D（序列13）。

序列1：向辅助釜中添加10%透明质酸并在15 RPM下侧扫。

序列2：向辅助釜中添加0.5% Tween 20。

序列3：向辅助釜中添加23% Gransil TMG-5并在2500 RPM下混合。

向辅助釜中添加10% Gransil IDS。

向辅助釜中添加5% DM-fluid。

向辅助釜中添加2% Permethyl。

将温度调节至25℃。

序列4：向辅助釜中添加1.5% KF-6017并混合直到均匀和平滑。

序列5：向主釜中添加17.46%去离子水（53-0061），

加热至30℃。

当温度达到30℃时，在530 RPM下混合，随后在12 RPM下侧扫，

向主釜中添加0.2%咖啡因，

向主釜中添加0.05% EDETA，

向主釜中添加0.1%核糖核酸钠，

关闭加热，并冷却至25℃。

序列6：当主釜温度达到25℃时，向主釜中添加5%酵母提取物XP，

向主釜中添加2%酵母提取物NAG，

向主釜中添加0.5% Rice defense complex，

向主釜中添加1% Phytoclar，和

向主釜中添加0.5%生物转化的白桦。

序列7：向主釜中添加2% 杂色栓菌提取物，在1800 RPM下混合直到均匀，随后在10RPM下侧扫。

序列8：向主釜中添加0.6% Aristoflex。

序列9：向主釜中添加0.2% Phenoxetol，随后向主釜中添加辅助釜的内容物。

序列10：向主釜中添加0.2% Vitamin E。

序列11：向主釜中添加预混物B。

序列12：向主釜中添加预混物C。

序列13：向主釜中添加预混物D，在830 RPM下混合直到均匀，随后在12 RPM下侧扫。

序列14：向主釜中添加2.5% Catezomes。

序列15：向主釜中添加1.5% Simulgel 600。

序列16：向主釜中添加0.026% FD&C Yellow no. 5，随后向主釜中添加0.009%FD&C Yellow no. 6。

四十六位志愿者参加了一项为期四个月的临床研究。仅有在她们的手上具有清晰可见的老年斑的组员才可以参与。组员的平均年龄为62岁，最小和最大年龄分别为44岁和82岁。所有志愿者均为白种人，并表现出Fitzpatrick II型或III型皮肤。测试区域是在双手各自的背侧上的日光性着色斑。患有任何类型的皮肤病或对乙醇和/或化妆品的超敏反应或过敏症的组员不参与该研究。在进入该研究之前，从各志愿者处征得书面知情同意书。

第一治疗组包括14名组员（两块老年斑/组员，总计28块老年斑）。各组员用充当对照物的媒介物制剂（配方6）自行治疗每只手上的一块老年斑。16名组员的第二组（两块老年斑/组员，总计32块老年斑）用分化刺激配方（配方7）自行治疗每只手上的一块老年斑。对于第3组，提供两种制剂：分化刺激配方（配方7）和美白配方（配方8）。该组中的16名志愿者（两块老年斑/组员，总计32块老年斑）被要求在每只手上的一块老年斑上施加分化刺激配方，随后在5分钟后，在分化刺激配方的顶上施加美白配方。在所有三组中，组员每天施用（一种或多种）制剂两次，持续4个月。各组员自行治疗双手。组员在手的整个背侧表面上自由地施用配方，每天两次，持续4个月：在早上和晚上施用。组员被指示在该临床研究期间不得在她们的手上使用任何其它化妆品。在每只手上，由研究者选择一块老年斑，并且每个月对这一块老年斑进行评估。

在该临床研究开始时（即治疗之前）和1、2、3和4个月之后，用皮肤镜照相机（与Olympus SP-510UZ数码相机连接的Dermalite Pro II）拍摄老年斑的皮肤镜照片。使用Dermalite Pro II双偏振皮肤镜（dual-polarization dermatoscope），以交叉偏振模式拍摄老年斑的照片。交叉偏振光加强了皮肤的更深层的色素沉着。

这些照片用于计算色素沉着过度的斑点与周围皮肤之间的对比度。将该照片转换成黑白图片，由此计算灰度值。对各个斑点计算颜色对比度（定义为周围皮肤的灰度值减去老年斑处的灰度值）。

还通过具有Vivascope（Lucid 1500）的体内RCM来评估色素沉着过度的斑点，以便实现在皮肤的天然状态下皮肤的实时可视化。该分析集中于在基底膜处拍摄的共聚焦图像。由这些图像，对每平方毫米的真皮乳头数量进行计数，并计算超折光真皮乳头的圆度指数。该圆度指数是形状因子，指的是超折光基底细胞至圆形的对准图形。根据该等式，正圆的圆度指数等于100；更低的指数对应于距圆形更显著的偏离，并指示通常在日光性斑痣中观察到的超折光细胞的对准图形的变形。还计算了表皮的厚度。

在1个月和4个月的治疗后，使用Skinskan（Horiba）测量皮肤的自发荧光（即皮肤的内源性荧光）以评估表皮细胞增殖（λ_ex/λ_em=295/345纳米；反射率350-700纳米）。用在350纳米下测得的相应的反射率数据来校准表皮细胞增殖数据。使用荧光光谱法，可以检测变化的激发和发射的效果。一些体内荧光带可以归因于特定的氨基酸或蛋白质修饰。已经提出了归因于色氨酸的荧光带（λex/λem=295/345纳米）作为表皮细胞增殖或细胞更新的标志。

使用重复测量ANOVA计算来评估时间依赖性效果。另外通过用于多次比较的post hocTuckey测试确定了在时间点之间的显著差异。使用配对Student's t测试来统计学评估Vivascope数据。

结果图示在图3、4A、4B、5、6-8、9A、9B和10中。

图3表示作为治疗结果获得的日光性着色斑与周围皮肤之间的肤色对比度数据。与未治疗的皮肤相比，采用分化刺激制剂的治疗在1、2、3和4个月后分别导致2%（p=0.96）、6%（p=0.24）、20%（p<10^-4）和26%（p<10^-4）的对比度降低。当分化刺激治疗与美白治疗结合时，在1个月治疗后已经观察到统计学显著的降低。这种组合治疗在1、2、3和4个月后分别导致7%（p=0.02）、17%（p=0.0001）、19%（p=0.0001）和28%（p=0.0001）的对比度降低。作为使用媒介物制剂治疗的结果，经过相同的时间段没有观察到对比度的变化。

在图4A中显示了使用分化刺激配方治疗过的日光性斑痣的皮肤镜照片。在顶部的一组照片显示了在治疗后在颜色对比度方面的典型改善，底部的一组照片显示了在当前测试设置中发现的最大改善。

用分化刺激配方后接美白制剂治疗过的日光性斑痣的皮肤镜照片显示在图4B中。在顶部的一组照片显示了在治疗后在颜色对比度方面的典型改善，底部的一组照片显示了在当前测试设置中发现的最大改善。对于两种治疗，提供了显示平均改善的一个实例，并提供了展现出最大改善的另一实例。对于组合治疗，在一个月的治疗后已经达到了显著性，因此与单独采用分化刺激配方的治疗相比，存在颜色对比度的更快降低。

使用RCM（Vivascope）研究了日光性斑痣中真皮乳头的形态（即圆度指数和真皮乳头环的数量）。在图5中给出了圆度指数的结果。在使用分化刺激制剂的四个月治疗后，观察到圆度指数的统计学显著提高，这指示了基底膜的改善。当正圆的圆度指数等于100时，更低的指数对应于距圆形更显著的偏离。发现非病损皮肤的真皮乳头的圆度指数为大约92（数据未显示）。

对于媒介物和组合治疗组，在4个月的治疗后没有观察到真皮乳头的圆度指数的变化。

图6描绘了在日光性斑痣的真皮-表皮界面处记录的RCM（Vivascope）图像的实例。这些图像表示在用分化刺激制剂治疗4个月后的平均改善和最大改善。

如图7中所示，与治疗前水平相比。在用含有分化刺激活性物的制剂治疗的组中以及在用含有分化刺激活性物的制剂与美白制剂治疗的组中观察到在4个月的治疗后真皮乳头数量的统计学显著降低。观察到非病损皮肤中真皮乳头的数量为每平方毫米大约20个乳头（未显示）。

如图8中所示，在真皮-表皮界面处拍摄的RCM（Vivascope）图像表示在用分化刺激配方治疗四个月后乳头环的平均减少和最大减少。

所记录的Vivascope图像进一步用于表皮厚度的量化。如图9A中所示，在用分化刺激配方治疗四个月后，观察到表皮厚度（不含角质层）的统计学显著增加。此外，如图9B中所示，发现角质层变厚。在用媒介物治疗或组合治疗后没有发现差异。

皮肤自发荧光（在295/345纳米下测得）结果显示在图10中。这些波长下的信号与色氨酸（一种表皮细胞增殖的标志）相关。采用分化刺激配方的治疗在4个月后导致表皮细胞增殖的统计学显著减少。用其它治疗没有发现改变。

经过四个月用分化刺激制剂的治疗导致改善了日光性斑痣的可见外观和形态。当在施加分化刺激配方后5分钟施加含有经典美白成分的美白制剂时，在4个月的治疗后注意到肤色的类似改善。然而，与单独使用分化刺激配方相比，组合治疗在改善基底膜方面稍微不那么有效。尽管真皮乳头环的数量更少，但在圆度指数方面没有检测到改善。

Claims (12)

1.识别具有降低色素沉着过度的皮肤病损与色素沉着过度的皮肤病损周围的皮肤之间的颜色对比度而不直接影响黑素细胞或黑素生成的功效的材料的方法，所述方法包括：

（a）向色素沉着过度的皮肤病损施加含有待测试材料的组合物；和

（b）在一段时间间隔后，观察所述组合物是否在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中已实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形。

2.权利要求1的方法，其中所述时间间隔为至少大约一个月。

3.权利要求1的方法，其中所述时间间隔为至少大约二个月。

4.权利要求1的方法，其中所述时间间隔为至少大约三个月。

5.权利要求1的方法，其中所述时间间隔为至少大约四个月。

6.权利要求1的方法，其中使用反射式共聚焦显微镜法（RCM）来评估所述组合物对抑制角质形成细胞的增殖的影响。

7.权利要求1的方法，其中使用反射式共聚焦显微镜法（RCM）来评估所述组合物对刺激角质形成细胞的分化的影响。

8.权利要求1的方法，其中使用反射式共聚焦显微镜法（RCM）来评估所述组合物对改善真皮乳头的压缩变形的影响。

9.用于美白皮肤的方法，包括向需要所述美白的皮肤施加局部组合物，所述局部组合物包含至少一种活性物，所述活性物在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形，其中所述活性物能够相对于色素沉着过度病损周围的皮肤美白色素沉着过度病损中的皮肤，而不直接影响黑素细胞或黑素生成。

10.权利要求9的方法，其中所述局部组合物进一步包含直接影响黑素细胞或黑素生成的皮肤美白活性物。

11.用于降低色素沉着过度的皮肤病损与色素沉着过度病损周围的皮肤之间的颜色对比度的经改善的局部化妆品组合物，所述组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含至少一种第一活性物，其直接影响黑素细胞或黑素生成，其中所述改善包括将第二活性物包含在所述组合物中，所述第二活性物用于在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中实现以下至少一项：抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及减小真皮乳头的压缩变形，而不直接影响黑素细胞或黑素生成。

12.用于降低皮肤的色素沉着过度病损与色素沉着过度病损周围的皮肤之间的颜色对比度的方案，包括：

（a）向需要这样的颜色对比度降低的皮肤施加第一化妆品组合物，所述第一化妆品组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含第一皮肤美白活性物，其用于在皮肤的色素沉着过度病损中在表皮的基底层中抑制角质形成细胞的增殖、刺激角质形成细胞的分化、以及改善真皮乳头的压缩变形中的至少一项，而不直接影响黑素细胞或黑素生成；和

（b）向需要这样的颜色对比度降低的皮肤施加第二化妆品组合物，所述第二化妆品组合物为此在化妆品可接受的媒介物中包含直接影响黑素细胞或黑素生成的第二皮肤美白活性物；其中（a）和（b）可以以任何顺序发生。