BRPI1012557A2 - dipeptídeo como aditivos de gêneros alimentícios - Google Patents

Abstract

DIPEPTÍDEO COMO ADITIVOS DE GÊNEROS ALIMENTÍCIOS. A invenção refere-se a aditivos de gêneros alimentícios que compreendem dipeptídeo ou sais do mesmo, em que um resíduo de aminoácido do dipeptídeo é um resíduo de DL metionila e o outro resíduo de aminoácido do dipeptídeo é um aminoácido na configuração L selecionado do grupo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistidina. A invenção também se refere a misturas de gêneros alimentares que compreendem os referidos aditivos e a um mé- todo para a produção do dipeptideo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DIPEPTÍDEO COMO ADITIVOS DE GÊNEROS ALIMENTÍCIOS". ' Introdução - A presente invenção refere-se a novos dipeptídeos naturais e não naturais ligados à metionina de aminoácidos limitantes essenciais tais como lisina, treonina e triptofano, os aminoácidos contendo enxofre cisteina e cistina, e sua síntese e uso como aditivos de alimentos para alimentar a- nimais úteis, tais como frango, porcos, ruminantes, porém também em parti- cular peixe e crustáceo na aquacultura.

Técnica anterior Os aminoácidos essenciais (EAAs) metionina, lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e arginina, e os ” dois ácidos contendo enxofre cisteína e cistina são constituintes muito impor- o. tantes da alimentação animal e desempenha um papel importante nos fun- “15 —doseconômicos de animais úteis tais como frango, porcos e ruminantes.

Em particular, distribuição ideal e fornecimento suficiente de EAAs são decisivos.

Como alimentação de fontes de proteína naturais, por exemplo, soja, milho e Ú trigo, é geralmente deficiente em certos EAAs, suplementação especial com EAAs sintéticos, por exemplo, DL-metionina, L-lisina, L-treonina ou L- triptofano por um lado permite o desenvolvimento mais rápido dos animais ou uma produção de leite maior de vacas leiteiras altamente produzindo, e por outro lado também utilização mais eficiente do alimento total.

Isto ofere- ce uma vantagem econômica considerável.

Os mercados para aditivos de alimentação são de importância econômica e industrial considerável.

Além disso, eles são mercados de forte crescimento, atribuível não menos ao crescimento importante de países tais como China e Índia.

Para muitas espécies animais L-metionina (ácido (S)-2-amino-4- metiltiobutírico) representa o primeiro aminoácido limitante de todos EAAs e portanto, possui um dos mais importantes papéis na nutrição animal e como aditivo de alimentação (Rosenberg e outro(s), J.

Agr.

Food Chem. 1957, 5, 6694-700). Na síntese química clássica, entretanto, a metionina é formada como um racemato, uma mistura 50:50 de D- e L-metionina.

Esta DL- | metionina racêmica pode, portanto, ser usada diretamente como aditivo de alimentação, por que em algumas espécies animais sob condições in vivo ' existe um mecanismo de conversão que transforma o D-enantiômero não - natural de metionina no L-enantiômero natural. A D-metionina é primeiro de- saminada por meio de uma D-oxidase não específica para a-ceto-metionina e em seguida convertida por uma L-transaminase para L-metionina (Baker, D.H. in "Amino acids in farm animal nutrition", D'Mello, J.P.F. (ed.), Walling- ford (UK), CAB International, 1994, 37-61). Como um resultado a quantidade disponível de L-metionina no corpo é aumentada, e pode em seguida ser disponível ao animal para crescimento. A conversão enzimática de D- a L- metionina foi descoberta em frango, porcos e vacas, porém também em par- ticular em peixes, camarões e pitus. Por exemplo, Sveier e outro(s) (Aqua- . cult. Nutr. 2001, 7 (3), 169-181) e Kim e outro(s) (Aquaculture 1992, 101 (1- - 2), 95-103) mostrou que a conversão de D- a L-metionina é possível em truta “15 arco-írise salmão do atlântico carnívoro. O mesmo foi mostrado por Robin- son e outro(s) (J. Nutr. 1978, 108 (12), 1932-1936) and Schwarz e outro(s) (Aquaculture 1998, 161, 121-129) para espécies de peixe onívoro, por e- xemplo, bagre e carpa. Além disso, Forster e Dominy (J. World Aquacult. Soc. 2006, 37 (4), 474-480) foram capazes de mostrar, em testes de alimen- tação com camarões onívoros da espécie Lifopenaeus vannamei, que a DL- metionina é igualmente tão eficaz quanto a L-metionina. No ano de 2007, por todo o mundo mais do que 70000 toneladas de DL-metionina cristalina ou racêmica, análogo de metionina-hidróxi líquido (MHA, ácido rac-2-hidróxi-a4- (metiltio)butanoico (HMB)) e cálcio-MHA sólido foram produzidos e bem- sucedidamente usados diretamente como aditivo de alimentação para ani- mais monogástricos, por exemplo, aves domésticas e porcos.

Em contraste a metionina, com lisina, treonina e triptofano em cada caso apenas os L-enantiômeros podem ser usados como aditivos de alimentação, como os respectivos D-enantiômeros destes três aminoácidos essenciais e limitantes não podem ser convertidos pelo corpo sob condições fisiológicas aos correspondentes L-enantiômeros. Desse modo, o mercado mundial para L-lisina sozinha, o primeiro aminoácido limitante, por exemplo, | para porcos, para o ano de 2007 foi acima de um milhão de toneladas. Para os outros dois aminoácidos essenciais limitantes L-treonina e L-triptofano o mercado mundial em 2007 ficou acima de 100.000 t e exatamente abaixo de - 3.000 t, respectivamente.

No caso de animais monogástricos, por exemplo, aves domésti- cas e porcos, normalmente DL-metionina, MHA, porém também L-lisina, L- treonina e L-triptofano são usados diretamente como aditivos de alimenta- ção. Em contraste, a suplementação de alimento com EAAs tal como metio- nina, lisina, treonina ou também MHA não é efetiva para ruminantes, a mesma é quebrada por micróbios no rúmen dos ruminantes. Por causa de sua degradação, apenas uma fração dos EAAs suplementados entra no in- testino delgado do animal, onde a absorção no sangue geralmente ocorre.

- Entre os EAAs, principalmente a metionina desempenha um papel decisivo : nos ruminantes, como uma produção de Jeite elevada é apenas garantida “15 com fomecimento ideal. Para metionina estar disponível para o ruminante em eficiência elevada, é necessário usar uma forma protegida resistente ao rúmen. Existem várias possíveis formas de fornecer estas propriedades à ' DL-metionina ou rac-MHA. Uma possibilidade é obter resistência ao rúmen elevada aplicando-se uma camada protetora adequada ou distribuindo a me- tioninaem uma matriz protetora. Como um resultado, a metionina pode pas- sar através do rúmen praticamente sem perda. Subsequentemente, a cama- da protetora é em seguida removida, por exemplo, no abomaso por hidrólise ácida e a metionina que é liberada pode em seguida ser absorvida no intes- tino delgado do ruminante. Produtos comercialmente disponíveis são por exemplo Mepronº da companhia Evonik Degussa e Smartamineº da compa- nhia Adisseo. A produção e/ou revestimento de metionina são geralmente um processo laborioso e tecnicamente complicado e são, portanto caros. Além disso, o revestimento de superfície dos péletes acabados pode facil- mente ser danificado por abrasão e esforços mecânicos durante o proces- samento do alimento, o qual pode induzir a redução ou mesmo a perda completa de proteção. Portanto, não é também possível processar os péle- tes de metionina protegidos em um pélete de alimentação misturada maior, | por que mais uma vez a camada protetora seria quebrada pela carga mecâ- nica.

Isto limita o uso de tais produtos.

Outra possibilidade para aumentar a estabilidade do rúmen é a derivação química de metionina ou MHA.

Neste, - os grupos funcionais da molécula são derivados com grupos de proteção adequados. sto pode ser obtido, por exemplo, pela esterificação da função do ácido carboxílico com álcoois.

Como um resultado, a degradação no rú- men por microorganismos pode ser reduzida.

Um produto comercialmente disponível com proteção química é, por exemplo, Metasmartº, o iso-propil éster racêmico de MHA (HMBi). Uma biodisponibilidade de pelo menos 50% paraHMBiem ruminantes foi descrita em WO00/28835. A derivação química de metionina ou MHA frequentemente possui a vantagem de biodisponibili-

dade mais pobre e conteúdo comparavelmente baixo de substância ativa. - Além dos problemas de degradação ruminal de EAAs suplemen- tados tais como metionina, lisina ou treonina em ruminantes, pode também “15 ter vários problemas em peixe e crustáceos na suplementação de alimento com EAAs.

Devido ao rápido desenvolvimento econômico da reprodução de peixes e crustáceos na aquacultura altamente industrializada, um meio para ' suplementação ideal, econômica e eficiente de aminoácidos essenciais e limitantes tornou-se cada vez mais importante nesta área particular (Organi- zação de alimento e agricultura das Nações Unidas (FAO) Fisheries De- partment "State of World Aquaculture 2006", 2006, Rome.

International Food Policy Research Institute (IFPRI) "Fish 2020: Supply and Demand in Chan- ging Markets", 2003, Washington, D.C.). Entretanto, ao contrário de frango e porcos, vários problemas podem surgir quando se empregando EAAs crista- linos como aditivo de alimentação para certas variedades de peixes e crus- táceos.

Desse modo, Rumsey e Ketola (J.

Fish.

Res.

Bd.

Can. 1975, 32, 422-426), reportam que o uso de farinha de soja em conjunto com aminoáci- dos cristalinos individualmente suplementados não induziu a qualquer au- mento no crescimento no caso da truta arco-íris.

Murai e outro(s) (Bull.

Ja- pão Soc.

Sci.

Fish. 1984, 50 (11), 1957) foram capazes de mostrar que a alimentação diária de dietas de peixe com altas proporções de aminoácidos cristalinos suplementados tiveram resultado, em carpa, que mais do que

|

40% dos aminoácidos livres são excretados por meio das guelras e rins.

De- vido à rápida absorção de aminoácidos suplementados imediatamente após a ingestão de alimento, existe um aumento muito rápido na concentração de - aminoácidos no plasma sanguíneo do peixe (resposta rápida). Nesta hora, portanto, os outros aminoácidos de fontes de proteína naturais, por exemplo, farinha de soja, ainda não estão no plasma, que pode induzir ao assincro- nismo da disponibilidade simultânea de todos os aminoácidos importantes.

Uma proporção dos aminoácidos altamente concentrados é em consequên- cia rapidamente excretada ou rapidamente metabolizada no corpo e utiliza- da,por exemplo, puramente como uma fonte de energia.

Consequentemen- te, na carpa existe pouco se qualquer aumento no crescimento quando os aminoácidos cristalinos são usados como aditivos de alimentação (Ace e -” outro(s), Bull.

Japa.

Soc.

Sci.

Fish. 1970, 36, 407413). No caso de crustá- ceos a suplementação de EAAs cristalinos pode também induzir a outros “15 problemas.

Por causa do comportamento de alimentação lento de certos crustáceos, por exemplo, camarões da espécie Litopenaeus vannamei, o longo período que o alimento permanece sob a água resulta na lixiviação ] dos EAAs solúveis em água suplementados, que induz à eutroficação da - água, em vez de um aumento no desenvolvimento dos animais (Alam e ou- tro(s), Aquaculture 2005, 248, 13-16). O fornecimento efetivo para peixe e crustáceos na aquacultura, portanto requer, para certas espécies e aplica- ções, uma forma de produto especial de EAAs, por exemplo, uma forma a- propriadamente quimicamente ou fisicamente protegida.

O objetivo é, primei- ramente, que o produto deva permanecer suficientemente estável durante a alimentação no meio ambiente aquoso e não seja lixiviado da alimentação; e em segundo lugar, que o produto de aminoácido finalmente tomado pelo a- nimal seja capaz de ser utilizado otimamente e em alta eficiência no orga-

nismo do animal.

No passado, muito esforço foi despendido no desenvolvimento de aditivos de alimentação adequados, especialmente com base nos amino- ácidos essenciais metionina e lisina, para peixes e crustáceos.

Por exemplo, WOB8906497 descreve o uso de di- e tripeptídeos como aditivo de alimenta-

| ção para peixes e crustáceos.

A intenção era promover o desenvolvimento dos animais.

Entretanto, preferência foi dada ao uso de di- e tripeptídeos de aminoácidos não essenciais bem como não limitantes, por exemplo, glicina, - alanina e serina, que são mais do que adequadamente presentes em muitas fontes de proteína de planta.

Apenas DL-alanil-DL-metionina e DL-metionil- DL-glicina foram descritos como dipeptídeos contendo metionina.

Isto signifi- ca, portanto, que o dipeptídeo efetivamente apenas contém 50% de subs- tância ativa (mol/mol), que do ponto de vista econômico deve ser considera- do como muito desfavorável.

WO02088667 descreve a síntese enantiosele- tivaeouso de oligômeros de MHA e os aminoácidos, por exemplo, metioni- na, como aditivos de alimentação, para peixes e crustáceos, dentre outros.

Isto deve resultar no desenvolvimento mais rápido.

Os oligôêômeros descritos . são formados por uma reação catalizada por enzima e possuem uma distri- buição muito ampla de comprimento de cadeia dos oligômeros individuais. “15 Comoum resultado o método é não seletivo, caro e laborioso na execução e purificação.

Dabrowski e outro(s) descrevem em US20030099689 o uso de peptídeos sintéticos como aditivos de alimentação para promover o desen- volvimento de animais aquáticos.

Neste caso, os peptídeos podem represen- - tar uma proporção em peso de 6-50% da formulação de alimentação total.

Os peptídeos sintéticos preferivelmente consistem em EAAs.

A síntese e- nantioseletiva destes oligo- e polipeptídeos sintéticos é, portanto, muito labo- riosa, cara e é difícil graduar.

Além disso, a eficácia dos polipeptídeos de um aminoácido único é contestada, por que frequentemente eles são apenas convertidos em aminoácidos livres muito vagarosamente, ou de modo al- gum, sob condições fisiológicas.

Por exemplo, Baker e outro(s) (J.

Nutr. 1982, 112, 1130-1132) mostra que por que ele é completamente insolúvel em água, poli-L-metionina não possui nenhuma biodisponibilidade no frango,

assim como ele não pode ser absorvido pelo corpo.

Bem como o uso de novos derivados químicos de EAAs tais co- mo oligômeros e peptídeos contendo metionina, vários métodos físicos de proteção, por exemplo, revestir ou incrustar um EAA em uma matriz proteto- ra, foram investigados.

Por exemplo, Alam e outro(s) (Aquacult.

Nutr. 2004,

|

10, 309-316 e Aquaculture 2005, 248, 13-19) mostraram que a lisina e meti- onina revestida, ao contrário dos produtos não revestidos, possuem uma influência muito benéfica no desenvolvimento de camarões Kkuruma jovens. . Embora o uso de um revestimento especial seja capaz de impedir a lixivia- çãode metionina e lisina do pélete de alimentação, ele possui sérias des- vantagens. A produção e o revestimento de aminoácidos é geralmente um processo laborioso e tecnicamente complicado, e é, portanto, caro. Além disso, o revestimento de superfície do aminoácido revestido acabado pode facilmente ser danificado por esforços mecânicos e abrasão durante o pro- cesso de alimentação, o qual pode induzir a redução ou mesmo a perda completa da proteção física. Além disso, um revestimento ou o uso de uma substância matriz diminuí o conteúdo de aminoácido de modo que frequen- ” temente torna-se não econômico. O problema a ser resolvido pela invenção “15 Um problema geral era fornecer uma alimentação ou um aditivo de alimentação para nutrição animal com base em um novo substituto con- tendo metionina, no qual a metionina é ligada covalentemente a um aminoá- cido essencial e limitante, por exemplo, L-lisina, L-treonina e L-triptofano, e - que pode ser usado como aditivos de alimentação para alimentar animais úteis, tais como frango, porcos, ruminantes, embora em particular também peixe e crustáceos na aquacultura.

Em relação aos conhecimentos das desvantagens da técnica anterior, o problema foi principalmente fornecer um produto quimicamente protegido da combinação covalentemente ligada de DL-metionina mais EAA tal como, por exemplo, L-lisina, L-treonina ou L-triptofano para vários ani- mais úteis tais como frango, porcos e ruminantes, porém também para mui- tas espécies onivoras, herbívoras e carnívoras de peixe e crustáceos, que vivem em água salgada ou água doce, Bem como sua função como uma fonte de metionina, o referido produto deve também funcionar como uma fontede todos os outros EAAs. Em particular o referido produto deve possuir um mecanismo de "liberação lenta", e assim fornecer liberação lenta e conti- nua de metionina livre e EAAs sob condições fisiológicas. Além disso, a for- | ma quimicamente protegida do produto consistindo em metionina e EAA de- ve ser resistente ao rúmen e também deve ser adequada para todos os ru- i minantes. Para aplicação como aditivo de alimentação para peixes e crustá- : ceos a forma do produto deve ter baixa tendência à lixiviação do pélete de alimentação total ou prensado em água.

Outro problema era encontrar um substituto para EAAs cristali- nos como alimentação ou um aditivo de alimentação com biodisponibilidade muito elevada, que deve possuir boas propriedades de manipulação e esta- bilidade e capacidade de armazenagem sob as condições usuais do proces- sode alimentação misturado, em particular pelotização e extrusão.

Desta forma, por exemplo, frango, porcos, ruminantes, peixes e crustáceos devem ser fornecidos com EAAs cristalinos e com outras fontes * eficientes de aminoácidos essenciais, até possível sem as desvantagens dos produtos conhecidos ou apenas tendo-as em uma extensão reduzida.

“15 Além disso, várias novas e flexíveis rotinas de síntese devem ser desenvolvidas para os dipeptídeos contendo apenas um resíduo de metioni- na, em particular para L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (11). Pre- cursores típicos e subprodutos do processo de produção de DL-metionina . comercial devem ser usados como material de partida para uma rotina sinté- tica. Descrição da Invenção O problema é resolvido com aditivos de alimentação contendo dipeptídeos ou sais destes, onde um resíduo de aminoácido do dipeptídeo é um resíduo de DL-metionila e o outro resíduo de aminoácido do dipeptídeo é um aminoácido na configuração-L selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistina.

Preferivelmente o aditivo de alimentação contém dipeptídeos da fórmula geral DL-metionil-L-EAA (= mistura de D-metionil-L-EAA e L- —metionil-L-EAA) e/ou L-EAA-DL-metionina (= mistura de L-EAA-D-metionina e L-EAA-L-metionina), onde L-EAA é um aminoácido na configuração-L se- lecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, va- | lina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistina. A invenção também se refere a uma mistura de alimentação contendo o referido aditivo de alimentação. : O aditivo de alimentação contendo L-EAA-DL-metionina e/ou — Dl-metionil-L-EAA e os sais destes são adequados como aditivo de alimen- tação em misturas de alimentação para aves domésticas, porcos, ruminan- tes, porém também em particular para peixe e crustáceos na aquacultura.

Preferivelmente a mistura de alimentação contém de 0,01 a 5% em peso, preferivelmente de 0,05 a 0,5 % em peso de L-EAA-DL-metionina ebDl-metionil-L-EAA.

O uso de L-EAA-DL-metionina e DL-metionil-L-EAA comprovou ser particularmente vantajoso, por que estes dipeptídeos possuem bom pro- cedimento de lixiviação devido à baixa solubilidade.

Além disso, o composto exibe boa estabilidade de pelotização e “15 extrusão na produção de alimento. Os dipeptídeos L-EAA-DL-metionina e DL-metionil-L-EAA são estáveis em misturas com os componentes usuais e alimentos, por exemplo, cereais (por exemplo, milho, trigo, triticale, cevada milho miúdo, etc.), veículos de proteína animal ou planta (por exemplo, soja - e colza e produtos de seu outro processamento, legumes (por exemplo, ervi- Ilhas, feijões, tremoços , etc.), farinha de peixe, etc.) e em combinação com aminoácidos essenciais suplementados, proteínas, peptídeos, carboidratos, vitaminas, minerais, gorduras e óleos.

Outra vantagem é que por causa da alta proporção de substân- cia ativa de L-EAA-DL-metionina e DL-metionil-L-EAA por kg de substância, comparada com Dl-metionina e L-EAA, um mole de água é guardado por mole de L-EAA-DL-metionina ou DL-metionil-L-EAA.

Em um uso preferido, a mistura de alimentação contém proteí- nas e carboidratos, preferivelmente com base na farinha de peixe, farinha de soja ou farinha de milho, e pode ser suplementada com aminoácidos essen- ciais, proteinas, peptídeos, vitaminas, minerais, carboidratos, gorduras e ó- leos.

Em partícular, é preferível para DL-metionil-L-EAA e L-EAA-DL- | metionina estarem presentes na mistura de alimentação sozinhos como D- metionil-L-EAA, — L-metionil-L-EAA, — L-EAA-D-metionina ou LEAA-L- metionina, como uma mistura de um com o outro ou também como uma mis- . tura com D-metionil-D-EAA, L-metionil-D-EAA, D-EAA-D-metionina ou D- — EAA-L-metionina, preferivelmente em cada caso adicionalmente misturados com DL-metionina, preferivelmente com uma proporção de DL-metionina de 0,01 a 90 % em peso, preferivelmente de 0,1 a 50 % em peso, especialmen- te preferivelmente de 1 a 30 % em peso, preferivelmente em cada caso adi- cionalmente misturados com um L-EAA, por exemplo, L-lisina, preferivel- mente com uma proporção de L-EAA de 0,01 a 90 % em peso, preferivel mente de 0,1 a 50 % em peso, especialmente preferivelmente de 1 a 30 % em peso.

- Em um uso preferido, os animais mantidos em aquacultura são crustáceos e peixes de água salgada e água doce selecionados do grupo “15 compreendendo carpa, truta, salmão, bagre, perca, linguado, esturjão , a- tum, enguias, bream, bacalhau, camarões, "krill" e pitus, muito especialmen- te carpa de prata (Hypophthalmichthys molitrix), carpa de grama (Cteno- pharyngodon idella), carpa escamosa (Cyprinus carpio) e carpa da cabeça grande (Aristichthys nobilis), carpa cruciana (Carassius carassius), catla (Ca- tlacatla), "roho labeo” (Labeo rohiíta), salmão do pacífico e atlântico (Salmo salar e Oncorhynchus kisutch), truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), bagre americano (lctalurus punctatus), bagre africano (Clarias gariepinus), panga- sius (Pangasius bocourti e Pangasius hypothalamus), tilapia do Nilo (Oreoc- hromis niloticus), "milkfish" (Chanos chanos), cobia (Rachycentron cana- dum), camarão de pernas brancas (Litopenaeus vannamei), camarão tigre preto (Penaeus monodon) e pitu de rio gigante (Macrobrachium rosenbergil).

De acordo com a invenção, L-EAA-DL-metionina (L-EAA-DL- Met) (1) e DL-metionil-L-EAA (DL-Met-L-EAA) (II) ou sais alcalinoterrosos e de álcali destes, por exemplo, os sais de zinco ou cálcio moderadamente solúveis, são usados como aditivos nas misturas de alimentação como D- metionil-L-EAA, L-metionil-L-EAA, L-EAA-D-metionina ou L-EAA-L-metionina ou nas respectivas misturas diastereoméricas, sozinhos ou misturados com |

DL-metionina, sozinhos ou misturados com L-EAA preferivelmente para aves domésticas, porcos, ruminantes, e especialmente preferivelmente para pei- xes e crustáceos: o O À 8 HN y NO AS NH i NH, Da AÍ 2 a. Ss co, H R CO,H (1) (IT) L-EAA-DL-metionina (1) possui os dois diastereômeros L-EAA-D-Met (LD-I) e L-EAA-L-Met(LL-). Similarmente, o dipeptídeo DL-metionil-L-EAA (11) possui os dois diferentes estereoisômeros D-Met-L-EAA (DLHI) e L-Met-L-EAA (LL- - 11). Apenas os dois diastereômeros L-EAA-L-Met (LL-I) e L-Met-L-EAA (LL-II) são naturais, porém os outros dois L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL- II) são não naturais (vide o Esquema 1). o O À Rr dor HM Hy NH 7 NH Ss CO. H Ss OH (LD-TI) (LL-TI)

O S À nos HN > HY > à NH à NH A. R >coH R >coH (DL-I1IX) (LL-II) Esquema 1

Acima, o resíduo R de EAA significa: laoullaá R=1-metiletil- (valina) i lIboullb: R=2-metilpropil- (leucina) - Icoulic R=(1S)-1-metilpropil- (isoleucina) Idoulld R=(1R)1-hidroxietil- (treonina) leoulle —R=4-aminobutil- (lisina) 1f ou If R = 3-[(aminoiminometil)- (arginina) aminolpropil- Igoullg R=benzil- (fenilalanina) lhoullh R=(1Himidazol4-il)metil- (histidina) 1j ou Uj R = (1H-indol-3-il)metil- (triptofano) Os estereoisômeros L-EAA-D-metionina (LD), L-EAA-L- - metionina (LL-), D-metionil-L-EAA (DL-II) e L-metionil-L-EAA (LL-IIN) podem ser usados como aditivo de alimentação, sozinhos ou misturados um com o “15 outro, preferiveimente para aves doméstivas, porcos, ruminantes, peixes, crustáceos, bem como animais domésticos.

Além do desenvolvimento de uma nova rotina de síntese para a i preparação de L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (II), o objetivo principal da presente invenção é o uso de | e Il como mistura diastereoméri- cadeuma mistura de D-metionil-L-EAA (DL-II) e L-metionil-L-EAA (LL-I) ou de uma mistura de L-EAA-D-metionina (LD-I) e L-EAA-L-metionina (LL-I) ou em cada caso como diastereômero individual D-metionil-L-EAA (DL), L- metionil-L-EAA (LL), L-EAA-D-metionina (LD-I) ou L-EAA-L-metionina (LL- 1) como promotor de desenvolvimento para aves domésticas, porcos, rumi- nantes, porém também para crustáceos e peixes onívoros, carnívoros e her- bívoros em aquacultura.

Além disso, usando-se L-EAA-DL-metionina (1) ou DL-metionil-L-EAA (Il) como aditivo de alimentação, a produção de leite de vacas leiteiras altamente produzindo pode ser aumentada.

Desse modo, foi mostrado, como uma etapa inventiva, que L- EAA-DL-metionina (1) ou DL-metionil-L-EAA (II) como uma mistura diastere- omérica de uma mistura 50:50 de L-EAA-D-metionina (LD-I) e L-EAA-L- metionina (LL-I) ou de uma mistura 50:50 de D-metionil-L-EAA (DL-II) e L- | metionil-L-EAA (LL-II) ou em cada caso como diastereômero individual pode ser clivada enzimaticamente, sob condições fisiológicas, por frango, porcos, vacas, peixes, tais como, por exemplo, carpa e truta, porém também por - crustáceos tais como, por exemplo, Litopenaeus vannamei (camarão de per- na branca) e Macrobrachium rosenbergii (pitu de rio gigante) para D- ou L- metionina livre e em cada caso para L-EAA (vide o Esquema 2).

Por isto, as enzimas digestivas correspondentes foram isoladas, por exemplo, de frango, carpa onívora, truta carnivore e camarões de perna branca onívoros (Litopenaeus vannamei) e reagidas em testes in vitro otimi- zados sob condições fisiologicamente comparáveis com DL-metionil-L-EAA (Il) como uma mistura diastereomérica de uma mistura 50:50 de D-metionil- L-EAA (DL-II) e L-metionil-L-EAA (LL-II) ou L-EAA-DL-metionina (1) de uma - mistura de 50:50 de L-EAA-D-metionina (LD-I) e L-EAA-L-metionina (LL-I) ou em cada caso como diastereômero individual D-metionil-L-EAA (DL-II), L- “15. metionil-L-EAA (LL-IN), L-EAA-D-metionina (LD-I) ou L-EAA-L-metionina (LL- |). A característica especial de acordo com a invenção da clivagem de L- EAA-DL-metionina (1) ou DL-metionil-L-EAA (11) é que, além dos dois diaste- reômeros naturais L-EAA-L-metionina (LL-I) e L-metionil-L-EAA (LL), tam- - bém os dois diastereômeros não naturais L-EAA-D-metionina (LD-I) e D- metionil-L-EAA (DL-HII) podem ser clivados sob condições fisiológicas (vide as figuras 1 a 17). Isto se aplica igualmente ao uso da mistura de D- metionil-L-EAA (DL) e L-metionil-L-EAA (LL-II), a mistura de D-metionil-L- EAA (DL-II) e L-EAA-D-metionina (LD-l) (vide Fig. 12) ou a mistura de L- metionil-L-EAA (LL-I) e L-EAA-D-metionina (LD-I) (vide Fig. 12), porém também para a mistura total de todos os diastereômeros, e em cada caso para os diastereômeros individuais (vide as figuras 1 a 11 e 13 a 17).

| o o i ço mA e

E AA Rn >coH ou *s con D-metionil-L-EAi L-EAAh-D-metionina (DL-I1X) (LD-X) enz imas Ho digestivas o trans- NH, aminação

R subo * A cos . NH; L-EAA D-metionina : Não DEPTO, H L-metionina HO | enzimas o digestivas o s mA me í NA, ou i NH, RO oH “es Aco H D-metionil-L-EAh: L-Eik-L-metionina (LI-TII) (LL-T) Esquema 2 Os dipeptídeos naturais L-EAA-L-Met (LL-I) e L-Met-L-EAA (LL- 11) foram digeridos com enzimas digestivas de truta arco-íris carnivora, carpa espelho onívora, camarões de perna branca onívoros e frango (vide Tabela 1

- Carpa es Camarão Truta , |de pernalFrango - Dipeptídeo (carnívora) pelho dont branca —|(onívoro) vora) , onívoro: lemetovariena e ph hp | lLmetten cem) bo bh hp | LLmetre amo bo kk pk | | Imenso lemetos aire bo pk pk | | lmeticza ir le-mete-Phe em be o emeceisaem lmetetrp ap O levatmeaas bo ho kk | | [e-Leutmer o — leretmeao ko ko kk | | [etmecmeraaas | [zarg-menaao [LPnetmerano — be bh kk pp | [ester a [erpamer ao Tabela 1 Por isso, as enzimas foram separadas dos tratos digestivos dos peixese camarões, Os dipeptídeos L-EAA-L-Met (LL-I) e L-Met-L-EAA (LL-1) seriam em seguida digeridos com as soluções de enzima obtidas.

Para me- lhor comparabilidade das digestibilidades dos dipeptídeos de diferentes es- pécies, condições idênticas foram selecionadas para os estudos de digestão in vitro (87ºC, pH 9). Todos os dipeptídeos naturais são clivados pelas enzimas diges- tivas da truta arco-íris carnivora (vide figuras 3 e 4), da carpa espelho onívo- | ra (vide figuras 1 e 2), dos camarões de perna branca onívoros (vide figu- ras 5 e 6) e do frango (vide figura16). As clivagens de L-Met-L-EAA (LL-) como uma regra de procedimento mais rapidamente do que as clivagens dos - peptídeos L-EAA-L-Met (LL-I) análogos.

A fim de demonstrar a clivagem enzimática dos dipeptídeos não naturais L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-II) pelas enzimas digestivas de várias espécies de peixes tão compreensivelmente quanto possível, uma matriz experimental foi investigada (vide a Tabela 2).

Dipeptídeo s E ZE ss EF ssssasçesãs T T v E T T T 4) 8/2 a aapagêlisiaaçaçdjê 7 o = o = — o = PS + vv VV Tv E E 5 3 2) 8 2 2/2 2/3: a 2/2/2/2/2/a/4/ so 3 ' | 3 3/3) 3) a td eo 3/92/02 2) >) =| 2/2[ 2 E E) 3) 8 2/ & ololo ola al data àãdaà à) 2 o fmuatameo bb Dx | | bob |) | Carpa espelho (o- . x x x x x nívora Carpa de grama k | x x x x XxX x herbívora Camarão de perna x x x x x x branca (onívoro Tiápia (onívora ki bhik| ||) mma a dE EI E x x x x Oníivoro: Tabela 2 Por isso, as enzimas foram isoladas dos tratos digestivos dos peixes e camarões. Os dipeptídeos quimicamente sintetizados L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-lI) foram em seguida reagidos com as soluções de enzima obtidas. Para melhor comparabilidade das digestibilidades dos di-

peptídeos de várias espécies, condições idênticas foram selecionadas para os estudos de digestão in vitro (37ºC, pH 9). Todos os dipeptídeos não naturais L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met- - L-EAA (DL-II) são clivados por enzimas digestivas da carpa espelho onívora (vide figura7), da carpa de grama herbívora (vide figura. 8), da truta arco- íris carnívora (vide figura 11), do camarão de perna branca onívoro (vide figura 10) e do frango (vide figura 17). As clivagens de D-Met-L-EAA (DL-II) procedem um pouco mais vagarosamente do que as clivagens dos L-EAA-D- Met (LD-I) análogos. Com as enzimas digestivas da Tilápia (vide figura 9), em contraste, D-Met-L-EAA (DL-II) pode ser clivado mais rapidamente do que os dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I). Os dipeptídeos D-Met-L-Lys (DL-lle) e L-Lys-D-Met (LD-le) são digeridos particularmente rapidamente. Após exa- : tamente 5 horas, sob condições de reação in vitro a carga dos dipeptídeos contendo lisina foi clivada por todas as enzimas digestivas usadas.

“15 Isto segue dos resultados obtidos que cada dipeptídeo não natu- ral usado (vide figuras 7 a 11 e 17) pode ser clivado com as enzimas diges- tivas de várias espécies de peixe, camarões e frango. Empregando-se as enzimas de truta arco-íris carnívora, carpa espelho onívora, tilápias, cama- . rões de perna branca, carpa de grama, e frango, foi demonstrado que os dipeptídeos não naturais L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-II) podem ser clivados in vitro por todos os animais, os quais possuem sistemas diges- tivos acentuadamente diferentes. Adicionando-se os dipeptídeos L-EAA-D- Met (LD-I) e/ou D-Met-L-EAA (DL-II) à alimentação, é assim possível forne- cer aminoácidos essenciais deficientes (DL-Met e L-EAA) quando requerido.

A clivagem das misturas de dipeptídeo de dipeptídeos naturais e não naturais foi investigada para o exemplo de dipeptídeos dos aminoácidos L-triptofano e DL-metionina. A mistura diastereomérica consistindo em dois dipeptídeos não naturais L-Trp-D-Met (LD-lj) e D-Met-L-Trp (DL-Ilj]) pode ser clivada completamente, apenas como a mistura do dipeptídeo natural L-Met- L-Trp(LL-lj) e o dipeptídeo não natural L-Trp-D-Met (LD-lj). O efeito de "li- beração lenta" é muito mais pronunciado com a mistura LD-Ij/DL-Ilj do que com a mistura LD-Ij/LL-Ilj, isto é, os aminoácidos triptofano e metionina são | liberados por digestão enzimática dos dipeptídeos mais vagarosamente em relação um com o outro e durante um período maior. O problema é, além disso, resolvido com um dipeptideo ou um : sal deste de fórmula geral Dl-metionil-DL-EAA ou DL-EAA-DL-metionina, ondeEAAé um aminoácido, preferivelmente na configuração-L selecionada do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leuci- na, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistina. O resíduo de metioni- la na configuração-D ou L é igualmente preferido. Isto inclui os dipeptídeos Met-Lys, Met-Thr, Met-Trp, Met-His, Met-Val, Met-Leu, Met-lle, Met-Phe, Met-Arg, Met-Cys e Met-cistina, em cada caso nas configurações DD, LD, DL e LL, e Lys-Met, Thr-Met, Trp-Met, His-Met, Val-Met, Leu-Met, Ile-Met, Phe-Met, Arg-Met, Cys-Met e cistina-Met, em cada caso nas configurações - DD, LD, DLe LL. O problema é, além disso, resolvido por um método de produção “15 de um dipeptídeo contendo apenas um resíduo de metionila de acordo com a fórmula DD/LL/DL/LD-I ou DD/LL/DL/LD-II: - o O R Ss WO H A Do W AÍ NH? NHz Ss Cco,H R SCoH (DD/DL/DL/LD-I) (DD/DL/LD/DL-II) pela reação de um aminoácido com um derivado de ureia de fórmula geral III av, 1

R R

O q R? (Nav) comR definido como segue: laaVa: R=1-metiletil (valina)

lbaVb: —R=2-metilpropil- (leucina) lc a Vc: R = (1S)-1-metilpropil- (isoleucina) ' IdaVvd: R=(1R)1-hidroxietil- (treonina) - le a Ve: R = 4-aminobutil- (lisina) laVvf R = 3-[(aminoiminometil)-amino]propil- (arginina) IgaVg: R=benzil- (fenilalanina) lhaVh: R=(1IH-imidazol4-il)metil- (histidina) lja Vj: R = (1H-indol-3-i)metil- (triptofano) lk a Vk: R = -CH;-SH (cisteína) Imavm: R=-CH7S-S-CH-CNH-COOH (cistina) MnaVvn R=-CH;CH7;S-CH; (metionina) com os resíduos R' e R? nos derivados de ureia IIl, IV e V sendo definido - como segue: onde Illa-n: R' = COOH, R? = NHCONH, e) IVa-n: R' = CONH?, R? = NHCONH, Va-n: RI-R? = -CONHCONH- e onde R denota um resíduo de metionila e o aminoácido adicionado é sele- - cionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, vali- na, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína, ou cistina; ou o ami- noácido adicionado é metionina e R é um resíduo de aminoácido seleciona- do do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leu- cina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína, ou cistina.

Em uma modalidade preferida, hidantoína de metionina ou a hi- dantoína de um aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, argini- na, cisteina, cistina é usada como produto de partida ou é formada como um intermediário.

Em uma modalidade do método de acordo com a invenção é preferido para uma solução contendo hidantoína de metionina (Vn) e água ser reagida com o aminoácido sob condições básicas, ou uma solução con- tendo a hidantoína do aminoácido selecionado do grupo compreendendo | lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteina, cistina e água ser reagida com metionina sob condições básicas. - Em outra modalidade do método de acordo com a invenção é preferível para hidantoina de metionina (Vn) ser usada como produto de par- tida ou ser formada como um intermediário. A produção preferida de DL- metionil-L-EAA (11) diretamente de hidantoína de metionina (Vn), N- carbamoilmetionina (Illn) ou N-carbamoilmetioninamida (IVn) é mostrada no Esquema 3 e compreende o método A. o Ss. os Rº Método A MOO > OEA RÔ xcok (IIIn-VnN) (ITa-m) Esquema 3 : Além disso é preferível para o valor de pH da solução contendo o derivado de ureia a ser ajustado de 7 a 14, preferivelmente de 8 a 13 e muito especialmente preferivelmente de 9 a 12.

A reação é preferivelmente realizada em uma temperatura de 30 a200ºC, preferivelmente em uma temperatura de 80 a 170ºC e especial- mente preferivelmente em uma temperatura de 120 a 160ºC.

Além disso, é preferível para a reação ser realizada sob pressão, preferivelmente em uma pressão de 0,2 a 10 MPa (2 a 100 bar), especial- mente preferivelmente em uma pressão de 0,4 a 6 MPa (4 a 60 bar), muito especialmente preferivelmente em uma pressão de 0,8 a 4 MPa (8 a 40 bar).

Em outro método preferido a solução contendo hidantoína de metionina e água ou a solução contendo hidantoína do aminoácido selecio- nado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína, cistina e água foi formada antecipadamente de um ou mais dos compostos llla-n, IVa-n e Va-n. Alter- nativamente o correspondente aminonitrilo, cianoidrina ou uma mistura do | correspondente aldeído, ácido hidrociânico e amônia ou também uma mistu- ra do aldeído correspondente, sais de cianeto e amônio podem também ser usados como precursores de hidantoína. + Outra modalidade preferida do método de acordo com a inven- çãocompreende as seguintes etapas: a) Reação do derivado de ureia de acordo com as fórmulas llla- n, IVa-n ou Va-n com o aminoácido com uma dicetopiperazina Vla-m de fórmula,

O Ss

É AN HN R

O ' (VIa-m) com R como previamente definido; . 10 b) Reação da dicetopiperazina VI com uma mistura de dipepti- deos com as fórmulas DD/LL/DU/LD-| e DD/LL/DL/LD-II: o R Ss

HN O D " A NH? À NH s co H R” “>coH (DD/LL/DL/LD-I) (DD/LL/DL/LD-II) com R como previamente definido. Reação do derivado de ureia de acordo com as formulas Illn, IVn e Vn com uma dicetopiperazina Vla-m e a outra reação da dicetopipera- zina com uma mistura diastereomérica com os dipeptídeos preferidos L- EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (11) é mostrada no Esquema 4: | o ANE + LER —ã ME SN ' 2 A . (IIIN-Vh) (vIa-a) Método C | Método D o NO R . do A AAA) (1) (II) i Esquema 4 ' A reação da dicetopiperazina Vla-m com uma mistura dos dipep- tídeos preferidos L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (11). Este mé- todo compreende os métodos B, C e D apresentados no Esquema 4. Nes- * 5 tes métodos, em cada caso a dicetopiperazina Vla-m é formada como um intermediário.

A reação do derivado de ureia com o aminoácido para o diceto- piperazina é preferivelmente realizada em uma temperatura de 20ºC a 200ºC, preferivelmente de 40ºC a 180ºC e especialmente preferivelmente de 100ºCa170C.

Em um método preferido, a reação do derivado de ureia com o aminoácido ao dicetopiperazina ocorre sob pressão, preferivelmente em uma pressão de 0,2 a 9 MPa (2 a 90 bar), especialmente preferivelmente em uma pressão de 0,4 a 7 MPa (4 a 70 bar), muito especialmente preferivelmente emuma pressão de 0,5a 5 MPa (5 a 50) bar.

A reação do derivado de ureia com o aminoácido para a diceto- piperazina preferivelmente ocorre na presença de uma base. A base é prefe- rivelmente selecionada do grupo compreendendo bases contendo mistura de nitrogênio, NHAHCO;3, (NHa)2CO3, KHCO3, KCO3, NHAOH/CO;, sais de car- bamato, bases alcalinoterrosas e de álcali. |

Em outro método preferido a reação para a dicetopiperazina o- corre pela reação do derivado de ureia de fórmula,

R R - A R2 (Mav) com R significando um resíduo de metionila, com um aminoácido, seleciona- dodo grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leu- cina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína ou cistina ou pela reação do derivado de ureia de fórmula, RO —R . TF R2 : (MaV) ondeRé um resíduo de aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína ou cistina, com o aminoácido metionina.

No método preferido no qual a reação do derivado de ureia para a dicetopiperazina ocorre pela reação com metionina, uma relação do deri- vadode ureia para metionina de 1:100 a 1:0,5 é especialmente preferida.

Em outro método preferido a reação da dicetopiperazina para uma mistura de dipeptídeos de fórmula | e Il ocorre por hidrólise ácida. Pre- ferivelmente a reação da dicetopiperazina para uma mistura de L-EAA-DL- metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (II) ocorre por hidrólise ácida.

A hidrólise ácida é realizada na presença de um ácido, o qual é preferivelmente selecionado do grupo compreendendo os ácidos minerais, HCI, H2CO3, COV/H2O, H2SO;, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos e ácidos hidroxicarboxílicos.

Em outra modalidade do método de acordo com a invenção a | reação da dicetopiperazina para uma mistura de dipeptídeos de fórmula (1) e (11) ocorre por hidrólise básica. Preferivelmente a reação da dicetopiperazina i para uma mistura de L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (II) ocorre - por hidrólise básica.

A hidrólise básica é preferivelmente realizada em um pH de 7 a 14, especialmente preferivelmente em um pH de 8 a 13, muito especialmen- te preferivelmente em um pH de 9 a 12. A racemização completa pode ocor- rer. As condições básicas podem ser fornecidas empregando-se uma subs- tância que é preferivelmente selecionada do grupo compreendendo as bases contendo mistura de nitrogênio, NHAHCO;s, (NHa4).CO3, NHAOH/CO;, sais de carbamato, KHCO;z, K2CO;, carbonatos, bases alcalinoterrosas e de álcali. A hidrólise ácida ou básica é preferivelmente realizada em tem- . peraturas de 50ºC a 200ºC, preferivelmente de 80ºC a 180ºC e especial- mente preferivelmente de 90ºC a 160ºC.

Em um método preferido o resíduo de aminoácido do derivado de ureia Ill a V está na configuração-D ou L ou em uma mistura da configu- ração-D e L, preferivelmente em uma mistura da configuração-D e L, se o derivado de ureia for derivado de metionina. : Em outro método preferido o resíduo de aminoácido do derivado deureialllaV está na configuração-D ou L ou em uma mistura da configu- ração-D ou L, preferivelmente na configuração-L, se o derivado de ureia for derivado de um aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, argini- na, cisteína, cistina. Em outro método preferido, os dipeptíideos são obtidos como uma mistura de LL, DL, LD e DD, preferivelmente como uma mistura de LL, LD, DL. Em um método preferido a dicetopiperazina é isolada antes da hidrólise. É preferível para a dicetopiperazina ser isolada pela cristalização da solução de reação, preferivelmente em uma temperatura de -30 a 120ºC, especialmente preferivelmente em uma temperatura de 10 a 70ºC. Para a isolação da mistura diastereomérica dos dipeptídeos de | fórmula DD/LL/DL/LD-(1) e DD/LL/DU/LD-(Il), preferivelmente da mistura di- astereomérica de L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (II), das solu- ] ções de reação básicas, é acidificada e obtida por cristalização ou precipita- . ção. Um valor de pH de 2 a 10 é preferido, um valor de pH de 3 a 9 é espe- cialmente preferido, e o ponto isoelétrico correspondente do respectivo di- peptídeo de fórmula | e Il é muito especialmente preferido. Os ácidos preferi- . velmente do grupo compreendendo os ácidos minerais, HCl, HxCO;, COZ/H2O, H2SOs, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos e ácidos hidroxicar- boxílicos podem ser usados para a acidificação.

Para isolação da mistura diastereomérica dos dipeptídeos de fórmula DD/LL/DL/LD-(1) e DD/LL/DL/LD-(II), preferivelmente da mistura di- astereomérica de L-EAA-DL-metionina (1) e DL-metionil-L-EAA (11), das solu- - ções de reação acídicas, após a neutralização adicionando-se bases é obti- da por cristalização ou precipitação. Um valor de pH de 2 a 10 é preferido, um valordepHde3a9 é especialmente preferido, e o ponto isoelétrico cor- respondente do respectivo dipeptídeo de fórmula | e Il é muito especialmente preferido. As bases usadas para neutralização são preferivelmente do grupo compreendendo NHAHCO;3, (NHa)2CO;s, bases contendo nitrogênio, NH,OH, - sais de carbamato, KHCO;z, K2CO;, carbonatos, bases alcalinoterrosas e de Áálcali Outra modalidade alternativa do método de acordo com a inven- ção compreende a síntese dos dipeptídeos não naturais L-EAA-D-metionina la-lj ou D-metionil-L-EAA Ila-llj empregando-se a tecnologia do grupo de proteção. Desse modo, para a síntese dos dipeptídeos L-EAA-D-metionina (LD-I) o grupo amino do L-EAA livre foi primeiro protegido com o grupo de proteção BOC (ferc-butoxicarbonil-). Alternativamente, o grupo de proteção Z (benzoxicarbonil-) pode também ser usado bem-sucedidamente. D- metionina foi esterificada com metanol, para a que função ácida fosse prote- gida. Em seguida a reação de acoplamento do L-EAA protegido por BOC ou Z com bD-metionina metil éster foi realizada empregando-se DCC (diciclo- hexilcarbodi-imida) (vide o Esquema 5).

|

PN O . R Y ) po R = ” HÃo a z ————— - /"/ÀÀ.À. | ["""". E) - ã R Nelz Yv

[9] + : NH2 MeOH AN b) At. >s COH <HCIi(g> S O. Me ã o

À R À, ' ' NH Ox 3 É. Ss omel R o ' R= Terc-butil.,benzil ' Esquema 5 Após a purificação de BOC-L-EAA-D-metionina-OMe ou Z-L- EAA-D-metionina-OMe, primeiro o metil éster foi clivado sob condições bási- cas suaves. Finalmente, o grupo de proteção BOC ou Z foi clivado acidica- mentecom HBr em ácido acético glacial e o dipeptídeo livre L-EAA-D- metionina (LD-I) foi purificado por reprecipitação e recristalização (vide o Esquema 6).

HN Às RE terc-butil-, benzil- Ad NH Ox à . s comel R

O NaOH (aq) HBr a Door O É * O

OA XE AO Rs ON

O DD Ao (aq) - CH;kCOOH

NH i >s CO LD-I Esquema 6 Alternativamente o dipeptídeo metil éster BOC protegido BOC-L- EAA-D-metionina-OMe pode também primeiro ser reagido com HBr em áci- do acético glacial, desse modo removendo o grupo de proteção BOC. Após a concentração por evaporação, o metil éster pode em seguida ser clivado adicionando-se solução de ácido clorídrico diluída. O dipeptídeo livre L-EAA- D-metionina (LD-l) pode mais uma vez ser puríficado por reprecipitação e recristalização (vide o Esquema 6). Foi também possível transferir a rotina completa para os dipepti- deos L-EAA-D-metionina la-lj. Neste caso os metil ésteres de L-EAA e D- metionina protegida por BOC ou Z foram usados. Todos os métodos estabelecidos da presente invenção são pre- | ferivelmente realizados em um meio aquoso.

Além disso, os métodos da presente invenção podem ser reali- zados em métodos de batelada ou em métodos contínuos, os quais são co- - nhecidos por uma pessoa versada na técnica.

llustrações Fig. 1 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-L-Met (LL-I) . com as enzimas da carpa espelho. Fig. 2 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-Met-L-EAA (LL-II) com as enzimas da carpa espelho. Fig. 3 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-L-Met (LL-I) com as enzimas da truta arco-íris. Fig. 4 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-Met-L-EAA (LL-I) . com as enzimas da truta arco-íris.

Fig. 5 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-L-Met (LL-I) “15 comasenzimas dos camarões de perna branca.

Fig. 6 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-Met-L-EAA (LL-II) : com as enzimas dos camarões de perna branca. Fig. 7 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-II) com as enzimas da carpa espelho. Fig. 8 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-ll) com as enzimas da carpa de grama. Fig. 9 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-II) com as enzimas da Tilápia. Fig. 10 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I) e —D-Met-L-EAA (DL-II) com as enzimas dos camarões de perna branca. Fig. 11 mostra a clivagem dos dipeptideos L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-II) com as enzimas da truta arco-íris. Fig. 12 mostra a clivagem de misturas de L-Trp-D-Met/D-Met-L- Trp (LD-Iji/DL-Ilj) e L-Trp-D-Met/L-Met-L-Trp (LD-Ii/LL-Ilj]) com as enzimas da carpa espelho. Fig. 13 mostra a clivagem in vitro dos dipeptídeos naturais L-lle- L-Met (LL-lc) ou L-Met-L-lle (LL-llc) com 1% de solução de enzima e os di- | peptídeos não naturais L-lle-D-Met (LD-lc) ou D-Met-L-lle (DL-lce) com 10% de solução de enzima da carpa espelho. ' Fig. 14 mostra a clivagem in vitro dos dipeptídeos naturais L- . Thr-L-Met (LL-Id) ou L-Met-L-Thr (LL-Ild) com 1% de solução de enzima e os dipeptídeos não naturais L-Thr-D-Met (LD-ld) ou D-Met-L-Thr (DL-Ild) com B 10% de solução de enzima da carpa espelho.

. Fig. 15 mostra a clivagem in vitro dos dipeptídeos naturais L- Lys-L-Met (LL-le) ou L-Met-L-Lys (LL-lle) com 1% de solução de enzima e os dipeptídeos não naturais L-Lys-D-Met (LD-le) ou D-Met-L-Lys (DL-lle) com 10% de solução de enzima da carpa espelho. Fig. 16 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-Met-L-EAA (LL-II) com as enzimas do frango.

- Fig. 17 mostra a clivagem dos dipeptídeos L-EAA-D-Met (LD-I) e D-Met-L-EAA (DL-l) com as enzimas do frango.

“15 EXEMPLOS Exemplo 1: Método geral para a síntese dos dipeptídeos não naturais L-EAA-D- metionina la-lj ou D-metionil-L-EAA lla-llj empregando-se tecnologia de grupo de proteção: Para a síntese dos dipeptídeos L-EAA-D-metionina (LD-I), o gru- po amino do L-EAA livre foi primeiro protegido com o grupo de proteção BOC (ferc-butoxicarbonil-). Alternativamente, o grupo de proteção Z (benzo- xicarbonil-) pode também ser bem sucedidamente usado. D-metionina foi esterificada com metanol, para que a função de ácido seja protegida. Em seguida a reação de acoplamento do L-EAA protegido por BOC ou Z com D- metionina metil éster foi realizada empregando-se DCC (diciclo-hexilcarbodi- imida) (vide o Esquema 5). |

3 de FDA : . ) À x o cl HO vá o a HO po—————————— “oê

H R ! É Y

O + NH? MeOH Hz as aaa Ss >s COH <HCl(g> O Me DCC | Oo : AR Ad À À NH Ox a >s comel R o 3 ; i R = Terc-butil- benzyl- - Esquema 5 Após a purificação de BOC-L-EAA-D-metionina-OMe ou Z-L- EAA-D-metionina-OMe primeiro o metil éster foi clivado sob condições bási- cas suaves. Finalmente, o grupo de proteção BOC ou Z foi clivado acidica- mentecom HBrem ácido acético glacial e o L-EAA-D-metionina de dipepti- deo livre (LD-I) foi purificado pela reprecipitação e recristalização (vide o Es- quema 6).

HW À R= Terc-butil benzit

NH O NX. Ad Não : Ss comel R

O - NaOH (aq) HBr MeOH CH;COOH À x À Ad ; À ! NH Ox 3 Ad NH, . . Ss com | R >s CO Me

O HBr HCl! (ag) . CH.kCOOH

À Ad ! NH;7 “. - Ss COH LD-I Esquema 6 Alternativamente, o BOC-L-EAA-D-metionina-OMe de dipeptídeo metil éster BOC protegido pode também ser reagido primeiro com HBr em ácido acético glacial, assim removendo o grupo de proteção BOC. Após a concentração por evaporação, o metil éster pode em seguida ser clivado adicionando-se solução de ácido clorídrico diluída. O dipeptideo L-EAA-D- metionina (LD-l) livre pode em seguida mais uma vez ser purificado por re- precipitação e recristalização (vide Esquema 6). Foi também possível transferir a rotina completa para os dipeptí- deosL-EAA-D-metionina la-lj. Por isso, os metil ésteresde D-metionina pro- tegida por BOC ou Z e L-EAA foram usados. Exemplo 2: | a) Especificação para a síntese de Z-D-Met 30,0 g (0,201 mol) de D-metionina e 42,4 g (0,4 mol) de Na;CO;3 foram colocados em 200 ml de água e resfriados a 0ºC em um banho de - gelo. Em seguida, 51,2 g (0,3 mol) de carboxibenziloxicloreto (Cbz-Cl) foi adicionado vagarosamente e a mistura reacional foi agitada durante 3 horas ' em temperatura ambiente. Em seguida ela foi acidificada com ácido clorídri- . co diluido e a solução reacional foi extraída três vezes com 50 ml de MTBE de cada vez. As fases orgânicas combinadas foram secadas sobre MgSO, e concentradas no evaporador giratório. O resíduo obtido foi recristalizado de dietil éter/acetato de etila e secado a vácuo.a vácuo a 30ºC. 36,4 9g (64%) de carboxibenzilóxi-D-metionina (Z-D-Met) foi isolado como um sólido cristalino branco.

- b) Especificação geral para síntese de Z-L-EAA 50 mmols de L-EAA e 10,6 g (100 mmols) de Na-CO; foram co- “15 locadosem 50 mlde água e resfriados a 0ºC em um banho de gelo. Em se- guida 12,8 g (75 mmols) de carboxibenziloxicloreto (Cbz-Cl) foi adicionado : vagarosamente e a mistura reacional foi agitada durante 3 horas em tempe- ratura ambiente. Em seguida ela foi acidificada com ácido clorídrico diluído e - a solução reacional foi extraída três vezes com 25 ml! de MTBE de cada vez.

As fases orgânicas combinadas foram secadas sobre MgSO, e concentra- das no evaporador giratório. O resíduo obtido foi recristalizado e secado a vácuo a 30ºC.

Exemplo 3: Especificação para a síntese de D-Met-OMe x HC] 50,0 g (0,335 mol) de D-metionina foj suspenso em 500 ml de metanol e gás de HCl foi passado do começo ao fim em uma taxa moderada até saturar. A metionina dissolvida e a solução aquecidas até 55ºC. Em se- guida a mistura reacional foi agitada durante a noite em temperatura ambien- te. Na manhã seguinte, a mistura foi concentrada à secura no evaporador giratório a40ºC e o resíduo obtido foi recristalizado duas vezes de dietil éter. 47,1 g (86%) de cloridrato de D-metionina metil éster foi isolado como um sólido cristalino branco.

|

Exemplo 4: Especificação geral para a síntese de L-EAA-OMe x HCI 0,3 mol de L-EAA foi suspenso em 500 ml de metanol e gás de - HCI foi passado do começo ao fim em uma taxa moderada até saturar. O aminoácido dissolvido e a solução aquecida até 50-60ºC. A mistura reacio- ' nal foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. Na manhã seguin- . te, a mistura foi concentrada à secura no evaporador giratório a 40ºC e o resíduo obtido foi recristalizado duas vezes de dietil éter ou mistura de dietil éter /metanol. Exemplo5: Especificação geral para a síntese dos compostos do grupo PG-D-Met- L-EAA-OMe (PG-DL-I|-OMe) (reação de acoplamento) - 20,0 mmols de cloridrato de L-EAA-OMe foi suspenso em uma mistura de 30 ml de clorofórmio e 5 ml de metanol, 4,15 g (30 mmols) de “15 K2CO; foi adicionado e foi agitado durante 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida o sal foi filtrado e lavado com um pouco de clorofórmio. Após a concentração do filtrado por evaporação, o resíduo obtido foi absorvido em 50 ml de tetra-hidrofurano, 4,37 g (21,0 mmois; 1,05 eq.) DCC e 5,669 (20,0 mmols) de Z-D-metionina foram adicionados e foi agitado durante 16horasem temperatura ambiente. Em seguida 3 ml de ácido acético glacial foi adicionado à mistura reacional, agitado durante 30 minutos e o sólido branco precipitado (N,N'-diciclo-hexilureia) foi filtrado. O filtrado foi concen- trado no evaporador giratório e todo N,N'-diciclo-hexilureia precipitado foi filtrado. O resíduo oleoso foi em seguida recristalizado duas vezes de cloro- fórmio/n-hexano e secado sob bomba de óleo a vácuo. PG: grupo de proteção (grupo de proteção de Z ou BOC) 5a) Z-D-Met-L-Val-OMe (Z-DL-Ila-OMe) 2 EX

ONA i Aa Fórmula empírica: CioH2gN2O0sS (396,50 g/mol), rendimento: 4,60 g (58%), | pureza: 97%, sólido branco. ?H-RMN de Z-D-Met-L-Val-OMe (Z-DL-Ila-OMe) (500 MHz, CDCI3): à = 0,88 ] (d, *J = 6,8 Hz, 3H, CHs); 0,93 (d, ?J = 6,8 Hz, 3H, CHs); 1,90-2,20 (m, 3H, - SCH2CH72, CH(CH3)2); 2,10 (s, 3H, SCH3); 2,50-2,64 (m, 2H, SCH>); 3,73 (s, 3H,OCH;3);4,38-4,44 (m, 1H, CH); 4,48-4,54 (m, 1H, CH); 5,08-5,18 (m, 2H, ' OCH;z); 5,49 (bs, 1H, NH); 6,58 (bs, 1H, NH); 7,24-7,38 (m, 5H, Ph) : C-RMN de Z-D-Met-L-Val-OMe (Z-DL-la-OMe) (125 MHz, CDC): à = 15,26; 17,74; 19,01; 30,13; 31,16; 31,67; 52,21; 57,24; 67,22; 128,16; 128,27; 128,58; 136,16; 156,13; 171,01; 171,95 5b)Z-D-Met-L-Leu-OMe (Z-DL-IIb-OMe)

AAA - É E o: NH : OS Fórmula empírica: CaoHaoN2O5sS (410,53 g/mol), rendimento: 5,40 g . (66%), pureza: 97%, sólido branco. 1H-RMN de ZD-Met-L-Leu-OMe (Z-DL-Ib-OMe) (500 MHz, ds-DMSO): 5 = . 0,90-0,95 (m, 68H, CH(CH3)2); 1,50-1,72 (m, 3H, CHCH(CH3)2); 1,90-2,15 (m, 2H, SCH;CH>); 2,09 (s, 3H, SCH3); 2,48-2,64 (m, 2H, SCH2); 3,71 (s, 3H, OCH;3); 4,36-4,44 (m, 1H, CH); 4,56-4,62 (m, 1H, CH); 5,12 (s, 2H, OCHz); 5,56 (d, = 7,6 Hz, 1H, OC(=O)NH); 6,59 (bs, 1H, NH); 7,26-7,36 (m, 5H, Ph) C-RMN de Z-D-Met-L-Leu-OMe (Z-DL-IIb-OMe) (125 MHz, ds-DMSO): ô = 15,27;21,86; 22,78; 24,95; 30,11; 31,62; 33,96; 41,35; 50,86; 52,33; 67,20; 128,09; 128,25; 128,57; 156,97; 170,95; 173,01 5c) Z-D-Met-L-lle-OMe (Z-DL-lIc-OMe) o PN ê H o |

Fórmula empírica: CaoH3oN2O5S (410,53 g/mol), rendimento: 5,09 g (62%), pureza: 97%, sólido branco. ?H-RMN de Z-D-Met-L-lle-OMe (Z-DL-Ilc-OMe) (500 MHz, CDCI3): ô = 0,86- ' 0,94 (m, 6H, CH(CH3)CH2CH;3); 1,10-1,45 (m, 2H, CH2CH;3); 1,84-1,94 (m, 1H, CH(CH3); 1,94-2,16 (m, 2H, SCH2CH>2); 2,10 (s, 3H, SCH3); 2,49-2,64 ' (m, 2H, SCH2); 3,72 (s, 3H, OCH); 4,36-4,44 (m, 1H, CH); 4,52-4,58 (m, 1H, . CH); 5,08-5,18 (m, 2H, OCH>); 5,46 (bs, 1H, NH); 6,58 (bs, 1H, NH); 7,28- 7,38 (m, 5H, Ph) PC-RMN de Z-D-Met-L-lle-OMe (Z-DL-lle-OMe) (125 MHz, CDCI3): 8 = 11,55; 15,26; 15,54; 25,19; 30,12; 31,70; 33,96; 37,79; 52,15; 45,07; 56,55; 67,18; 128,12; 128,24; 128,56; 156,13; 170,92; 171,96 5d) Z-D-Met-L-Thr-OMe (Z-DL-Ild-OMe)

PA

OT . Fórmula empírica: CisH2osN2OsS (398,47 g/mol), rendimento: 2,14 g (36%), pureza: 95%, sólido levemente amarelado. “15 H-RMNde2Z-D-Met-L-Thr-OMe (Z-DL-Ild-OMe) (500 MHz, CDC): ê = 1,10- 1,25 (m, 3H, CHCH;); 1,95-2,20 (m, 2H, SCH2CH;>); 2,09 (s, 3H, SCH;3); 2,49 (bs, 1H, OH); 2,52-2,62 (m, 2H, SCH>2); 3,74 (s, 3H, OCH;3); 4,30-4,56 (m, 3H, 3 x CH); 5,12 (s, 2H, OCH2); 5,70-5,78 (m, 1H, NH); 7,03 (d, *J = 8,9 Hz, 1H, NH); 7,28-7,38 (m, SH, Ph) “C-RMN de Z-D-Met-L-Thr-OMe (Z-DL-Ild-OMe) (125 MHz, CDCI;): 8 = 15,15; 20,05; 30,10; 31,91; 52,66; 54,37; 57,44; 67,23; 67,82; 128,17; 128,26; 128,57; 136,16; 156,18; 171,25; 171,87 5e) Z-D-Met-L-Lys(BOC)-OMe (Z-DL-le(BOC)-OMe) DE o Adoos A Ú Da Fórmula empírica: CosH39N3O7S (525,66 g/mol), rendimento: 10,86 g (33%), | pureza: 95%, sólido levemente amarelado. 'H-RMN de Z-D-Met-L-Lys(BOC)-OMe (Z-DL-le(BOC)-OMe) (500 MHz, CDC): 8 = 1,25-1,90 (m, 6H, 3 x CHa(Lys)); 1,43 (s, 9H, C(CH3)3); 1,92-2,16 - (m, 2H, SCH;CH>2); 2,09 (s, 3H, SCH3); 2,48-2,62 (m, 2H, SCH>); 3,02-3,12 (m, 2H, NCH>);3,72(s, 3H, OCH;3); 4,35-4,65 (m, 3H, 2 x CH, NH); 5,13 (s, Ú 2H, OCH); 5,58 (d, *J = 7,5 Hz, 1H, NH); 6,75 (bs, 1H, NH); 7,28-7,36 (m, 5H, Ph) PC-RMN de Z-D-Met-L-Lys(BOC)-OMe (Z-DL-Ile(BOC)-OMe) (125 MHz, CDCl3): 8 = 15,31; 22,44; 28,45; 29,47; 30,12; 31,82; 52,08; 52,45; 67,20; 79,15;128,08; 128,25; 128,34; 128,57; 156,07; 170,97; 172,38 5f) Z-D-Met-L-Phe-OMe (Z-DL-IIg-OMe) xo AA, . ! Dl : Fórmula empírica: CosH2gN205S (444,54 g/mol), rendimento: 3,739 (42%), pureza: 95% (HPLC), sólido branco. . HRMN de Z-D-MetL-Phe-OMe (Z-DL-Ig-OMe) (500 MHz, ds DMSO/CDCI3): 8 = 1,72-1,94 (m, 2H, SCH2CH72); 2,01 (s, 3H, SCH;3); 2,30- 2,38 (m, 2H, SCH2); 2,94-3,14 (m, 2H, CHsPh); 3,70 (s, 3H, OCH); 4,25- 4,32 (m, 1H, CHCH;CH2S); 4,704,78 (m, 1H, CHCH3Ph); 5,00-5,10 (bs, 2H, OCH>2Ph); 6,60-6,70 (m, 1H, NH); 7,10-7,35 (m, 10H, 2 x Ph); 7,75-7,80 (bs, 1H, NH) 5g)Z-D-Met-L-His-OMe (Z-DL-Ilh-OMe) ; - ANA AA ” Ú Da Fórmula empírica: CaoH26eN4OsS (434,51 g/mol), rendimento: 2,359 (27%), pureza: 95% (HPLC), sólido levemente amarelado. |

!H-RMN de Z-D-Met-L-His-OMe (Z-DL-IIh-OMe) (500 MHz, CDCI3): ô = 1,88- 2,14 (m, 2H, SCH2CH>7); 2,05 (s, 3H, SCH3); 2,44-2,56 (m, 2H, SCH2); 3,06- ' 3,14 (m, 2H, CHz-imidazolil); 3,68 (s, 3H, OCH); 4,20-4,40 (m, 2H, NH, CH); - 4,70-4,76 (m, 1H, CH); 5,11 (s, 2H, OCH); 5,91 (d, *J = 7,6 Hz, 1H, NH); 6,76 (bs, 1H, CH(imidazolil); 7,26-745 (m, 5H, Ph); 7,73 (bs, 1H,

' CH(imidazolil)); 9,30 (bs, 1H, NH)

. PC-RMN de Z-D-Met-L-His-OMe (Z-DL-IIh-OMe) (125 MHz, CDCk): ô = 15,27; 29,94; 31,81; 33,92; 52,46; 67,14; 116,88; 128,02; 128,12; 128,23; 128,49; 128,58; 133,23; 135,20; 136,21; 156,97; 171,17; 171,57

5h) Z-D-Met-L-Trp-OMe (Z-DL-Ilj-OMe)

g O ANA, ô o. sh

Fórmula empírica: CasH2o9N3O05S (483,58 g/mol), rendimento: 5,719

(59%), pureza: 98% (HPLC), sólido levemente amarelado. . 'H-RMN de Z-D-Met-L-Trp-OMe (Z-DL-j-OMe) (500 MHz, ds-DMSO): 6 = 1,60-1,80 (m, 2H, SCH2CH>2); 1,95 (s, 1H, SCH3); 2,25-2,35 (m, 2H, SCH>2); - 15 3,02-3,20 (m, 2H, CHz-indolila); 3,60 (s, 3H, OCH3); 4,10-4,16 (m, 1H, CH); 4,50-4,60 (m, 1H, CH); 4,98-5,08 (m, 2H, OCH); 6,94-7,50 (m, 12H, indolila, Ph, OC(=O)NH); 8,25 (d, *J = 8,6 Hz, 1H, CONH-Trp) C-RMN de Z-D-Met-L-Trp-OMe (Z-DL-Ilj-OMe) (125 MHz, ds-DMSO): ô = 14,42; 27,01; 29,40; 31,59; 51,75; 52,78; 53,60; 65,36; 109,16; 111,31;

117,84; 118,31; 120,86; 123,60; 126,90; 127,59; 127,68; 128,21; 136,02; 136,89; 155,81; 171,32; 172,06 Exemplo 6:

Especificação geral para a síntese dos compostos do grupo PG-L-EAA- D-Met-OMe (PG-LD-l-OMe) (reação de acoplamento)

3,99 g (20,0 mmols) de cloridrato de D-metionina metil éster foi suspenso em uma mistura de 30 ml de clorofórmio e 5 ml de metanol, 4,159 (30 mmols) de K2CO; foi adicionado e foi agitado durante 1 hora em tempe- ratura ambiente.

Em seguida o sal foi filtrado e lavado com um pouco de clo-

| rofórmio. Após a concentração do filtrado por evaporação, o resíduo obtido foi absorvido em 50 ml de tetra-hidrofurano, 4,37 g (21,0 mmolis; 1,05 eq.) ' DCC e 20,0 mmois do correspondente PG-L-EAA (PG-L-aminoácido) foram . adicionados e foi agitado durante 16 horas em temperatura ambiente. Em seguida, 3 ml de ácido acético glacial foi adicionado à mistura reacional, ela ' foi agitada durante 30 minutos e o sólido branco precipitado (N,N'-diciclo- ' hexilureia) foi filtrado. O filtrado foi concentrado no evaporador giratório e todo N,N'-diciclo-hexilureia precipitado foi filtrado. O resíduo oleoso foi em seguida recristalizado duas vezes de clorofórmio/n-hexano e secado sob bomba de óleo a vácuo. PG: grupo de proteção (grupo de proteção de Z ou BOC) 6a) Z-L-Val-D-Met-OMe (Z-LD-la-OMe) o NS ' ALTO . Wo o

TO Fórmula empírica: CisH28N205S (396,50 g/mol), rendimento: 3,01 g (38%), ' pureza: 95% (HPLC), sólido branco 'H-RMN de Z-L-Val-D-Met-OMe (Z-LD-la-OMe) (500 MHz, CDC): ô = 0,92 (d, *J = 6,9 Hz, 3H, CH3); 0,99 (d, *J = 6,9 Hz, 3H, CH); 1,90-2,25 (m, 3H, SCH2CH72, CH(CH3)2); 2,07 (s, 3H, SCH3); 2,44-2,54 (m, 2H, SCH>2); 3,74 (s, 3H, OCH); 4,04-4,10 (m, 1H, CH); 4,67-4,74 (m, 1H, CH); 5,12 (s, 2H, O- CH2); 5,28 (bs, 1H, NH); 6,65 (d, *J = 7,5 Hz, 1H, NH); 7,28-7,38 (m, 5H, Ph) “C-RMN de Z-L-Val-D-Met-OMe (Z-LD-la-OMe) (125 MHz, CDCk): 8 = 15,45; 17,46; 19,30; 29,96; 30,87; 31,40; 51,57; 52,55; 60,37; 67,18; 128,08; 128,24; 128,57; 136,19; 156,38; 171,04; 172,04 6b) Z-L-Leu-D-Met-OMe (Z-LD-lb-OMe) o. %

A "s

TO Fórmula empírica: CoaoH3oN2OsS (410,53 g/mol), rendimento: 4,489 |

(55%), pureza: 96% (HPLC), sólido branco TH-RMN de Z—L-Leu-D-Met-OMe (Z-LD-Ib-OMe) (500 MHz, CDC): ô = 0,94 (d, *J = 6,3 Hz, 6H, CH(CHs)2); 1,48-1,72 (m, 3H, CHCH(CHs)2); 1,90- - 2,20 (m, 2H, SCH>CH>); 2,07 (s, 3h, SCHs3); 2,42-2,52 (m, 2H, SCH2); 3,73 (s,3H, OCH3); 4,20-4,30 (m, 1H, CH); 4,64-4,72 (m, 1H, CH); 5,12 (s, 2H, OCH>); 5,23 (d, *J = 7,9 Hz, 1H, NH); 6,84 (d, *J = 7,2 Hz, 1H, NH); 7,28- 7,38 (m, 5H, Ph) "IC-RMN de Z—L-Leu-D-Met-OMe (Z-LD-lb-OMe) (125 MHz, CDCI3): ô = 15,47; 22,97; 24,81; 29,97; 31,46; 51,58; 52,55; 67,23; 128,09; 128,26; 128,58; 136,16; 156,23; 172,02; 172,09 6c) Z-L-lle-D-Met-OMe (Z-LD-lc-OMe)

TN BR ANAL, Fórmula empírica: CooH3oN2O5S (410,53 g/mol), rendimento: 3,89 g + (47%), pureza: 97% (HPLC), sólido branco H-RMN de Z-L-Ile—D-Met-OMe (Z-LD-lce-OMe) (500 MHz, CDCI3): 8 = 0,91 “15. (t?J=71 Hz, 3H, CHCH3); 0,96 (d, *J = 7,1 Hz; 3H, CH(CH3); 1,08-1,16 (m, 1H, CHH"CH3); 1,46-1,54 (m, 1H, CHH”CH3); 1,88-2,20 (m, 3H, CH(CH3), SCHCH2); 2,07 (s, 3H, SCHs); 2,44-2,52 (m, 2H, SCH3); 3,73 (s, 3H, OCHz); 4,08-4,16 (m, 1H, CH); 4,66-4,74 (m, 1H, CH); 5,11 (s, 2H, O- CH); 5,34 (d, *J = 7,6 Hz, 1H; NH); 6,74 (d, *J = 8,0 Hz, 1H, NH); 7,28-7,38 (m,5H,Ph) IC-RMN de Z-L-lle-D-Met-OMe (Z-LD-lce-OMe) (125 MHz, CDCI3): ô = 11,54; 15,46; 15,68; 24,66; 29,96; 31,42; 37,36; 51,59; 52,57; 59,83; 67,19; 128,10; 128,25; 128,58; 136,20; 156,34; 170,99; 172,03 6d) Z-L-Thr-D-Met-OMe (Z-LD-ld-OMe) " >.

IA ! O ' |

Fórmula empírica: CigH26N2O0sS (398,47 g/mol), rendimento: 2,47 g (31%), pureza: 99% (HPLC), sólido levemente amarelado ' ?H-RMN de Z-L-Thr-D-Met-OMe (Z-LD-ld-OMe) (500 MHz, CDCI3): 8 = 1,19 . (d, ?J = 6,4 Hz, 3H, CH3); 1,94-2,20 (m, 2H, SCH2CH>2); 2,06 (s, 3H, SCHs); 2,45-2,55 (m, 2H, SCH2); 3,73 (s, 3H, OCH;3); 4,18 (bs, 1H, CH); 4,39 (bs, 1H; CH); 4,66-4,74 (m, 1H, CH); 5,10-5,18 (m, 2H, OCH>2); 5,85 (bs, 1H, . OC(=O)NH); 7,21 (bs, 1H, NH); 7,28-7,38 (m, 5H, Ph) SC-RMN de Z-L-Thr-D-Met-OMe (Z-LD-Ild-OMe) (125 MHz, CDC): ô = 15,43; 18,48; 30,10; 30,91; 51,80; 52,66; 59,16; 66,99; 67,36; 128,04; 128,29;128,59; 136,08; 156,94; 171,27; 172,25 6e) BOC-L-Lys(BOC)-D-Met-OMe (BOC-LD-le(BOC)-OMe)

RN SOS 2Os o O - A Fórmula empírica: Ca2H4N3O0;7S (491,64 g/mol), rendimento: 5,229 - (53,1%), pureza: 97% (HPLC), sólido amorfo branco H-RMN de BOC-L-Lys(BOC)-D-Met-OMe (BOC-LD-le(BOC)-OMe) (500 “15 MHz CDCIs):8=1,32-1,42 (m, 2H, CHx(Lys)); 1,44 (s, 9H, C(CH3)3); 1,45 (s, 9H, C(CH3);); 1,46-1,568 (m, 2H, CHx(Lys)); 1,60-1,72 (m, 1H, CH- CcH'H'(Lys)); 1,82-1,92 (m, 1H, CHCHCH”(Lys); 1,92-2,03 (m, 1H, S- CHICHH'H”); 2,09 (s, 3H, SCH;3); 2,12-2,22 (m, 1H, SCH;CH'H”); 2,51 (t, *J =7,4 Hz, 2H, SCH2); 3,08-3,16 (m, 2H, NCH;>z); 3,75 (s, 3H, OCH3); 4,024,12 (m, 1H, CH), 4,54-4,62 (m, 1H, NH); 4,66-4,74 (m, 1H, CH): 5,06-4,14 (m, 1H, NH); 6,81 (d, *J = 7,4 Hz, 1H, NH) 6f) Z-L-Phe-D-Met-OMe (Z-LD-lg-OMe)

XX

A We o

TO Fórmula empírica: Ca3H28N205S (444,54 gímol), rendimento: 3,51 g (40%), | pureza: 99% (HPLC), sólido branco TH-RMN de Z-L-Phe-D-Met-OMe (Z-LD-lg-OMe) (500 MHz, CDCI): 8 = 1,78- ] 2,04 (m, 2H, SCH2CH;>); 2,02 (s, 3H, SCHs); 2,20-2,30 (m, 2H, SCH;z); 3,02- - 3,14 (m, 2H, CH2Ph); 3,71 (s, 3H, OCHz3); 4,404,50 (m, 1H, CH); 4,60-4,66 (m,1H,CH);5,09(s, 2H, OCH2); 5,31 (bs, 1H, OC(=O)NH); 6,42 (d, *J=7,6 : Hz, 1H, NH); 7,16-7,36 (m, 10H, 2x Ph) . C-RMN de Z-L-Phe-D-Met-OMe (Z-LD-Ig-OMe) (125 MHz, CDCI3): ô = 15,37; 29,67; 31,35; 38,63; 51,52; 52,53; 56,36; 67,15; 127,18; 128,06; 128,24; 128,57; 128,83; 129,26; 136,13; 136,30; 155,90; 170,63; 171,88 6g)BOC-L-Phe-D-Met-OMe (BOC-LD-lg-OMe)

PI

SAE : nº o & Fórmula empírica: CaoH3oN2O05S (410,53 g/mol), rendimento: 4,03 g (49%), + pureza: 98% (HPLC), sólido branco 1H-RMN de BOC-L-Phe-D-Met-OMe (BOC-LD-lg-OMe) (500 MHz, CDCI3): & ' = 1,42 (s, 9H, C(CH3)s); 1,80-2,08 (m, 2H, SCHxCH7); 2,04 (s, 3H, SCH;3); 2,24-2,34 (m, 2H, SCH2); 3,07 (d, *J = 7,2 Hz, 2H, CHoPh); 3,73 (s, 3H, O- CH3); 4,30-4,42 (m, 1H, CH); 4,60-4,68 (m, 1H, CH); 4,90-5,02 (bs, 1H, NH); 6,44 (d, *J=7,9 Hz, 1H, NH); 7,18-7,34 (m, 5H, Ph) *SC-RMN de BOC-L-Phe-D-Met-OMe (BOC-LD-lg-OMe) (125 MHz, CDCI): 6 = 15,39; 28,29; 29,67; 31,51; 38,42; 51,47; 52,50; 56,00; 80,38; 127,07; 128,79;129,27; 136,60; 156,42; 171,00; 171,94 6h) Z-L-His-D-Met-OMe (Z-LD-lh-OMe) o O: tia

AO TO nº NEN No o

TO Fórmula empírica: CooHosN4OsS (434,51 g/mol), rendimento: 1,659 (19%), | pureza: 95% (HPLC), sólido levemente amarelado 1H-RMN de Z-L-His-D-Met-OMe (Z-LD-lh-OMe) (500 MHz, ds-DMSO/CDCIa): 8 = 1,82-1,98 (m, 2H, SCH;CH>); 2,01 (s, 3H, SCHs); 2,30-2,44 (m, 2H, S- - CH2); 2,76-2,94 (m, 2H, CHz-imidazolil); 3,63 (s, 3H, OCHs3); 4,28-4,42 (m, 2H,2xCH); 5,01 (s, 2H, OCHz); 6,78 (bs, 1H, CH(imidazolil)); 7,25-7,37 (m, ' 6H, Ph, NH); 7,50 (bs, 1H, CH(imidazolil)); 8,27 (bs, 1H, NH); 11,76 (bs, 1H, . NH(imidazolil)) PCRMN de ZL-His-D-Met-OMe (ZLD-lh-OMe) (125 MHz, de DMSO/CDCI3): à = 14,54; 29,40; 30,52; 50,78; 51,79; 54,61; 65,35; 127,47; 127,61;128,20; 134,53; 136,92; 155,57; 171,39; 171,94 6i) Z-L-Trp-D-Met-OMe (Z-LD-lj-OMe) o Ns . QA à O . Fórmula empírica: CasH29N3O05S (483,58 g/mol), rendimento: 5,50 g (57%), pureza: 99% (HPLC), sólido levemente amarelado ' ?H-RMN de Z-L-Trp-D-Met-OMe (Z-LD-lj-OMe) (500 MHz, CDCI3): à = 1,68- 1,92 (m, 2H, SCH2CH>2); 1,97 (s, 3H, SCH3); 2,08-2,14 (m, 2H, SCH2); 3,14- 3,34 (m, 2H, CHz-indolila); 3,64 (s, 3H, OCH); 4,50-4,62 (m, 2H, 2 x CH); 5,10 (s, 2H, OCH); 5,44 (bs, 1H, NH); 6,32 (bs, 1H, NH); 7,00-7,38, 10H; aromat.); 8,17 (bs, 1H, NH) C-RMN de Z-L-Trp-D-Met-OMe (Z-LD-lj-OMe) (125 MHz, CDCI): à = 15,31; 29,48; 31,26; 33,97; 51,48; 52,45; 55,65; 67,10; 1101,387; 111,34; 118,77; 119,94; 122,44; 123,14; 127,32; 128,09; 128,22; 128,56; 136,20; 136,28; 155,99; 171,15; 171,80 6j) BOC-L-Trp-D-Met-OMe (BOC-LD-lj-OMe) |

A O

DO o. Y* i Fórmula empírica: Ca2H3;N3O05S (449,56 g/mol), rendimento: 5,91 g (66%), . pureza: 99% (HPLC), sólido branco 1H-RMN de BOC-L-Trp-D-Met-OMe (BOC-LD-Ij-OMe) (500 MHz, CDC): ô = 1,42 (s, 8H, C(CH3)s); 1,70-1,98 (m, 2H, SCH;CH>2); 1,99 (s, 3H, SCH;3); 2,10-2,20 (m, 2H, SCH2); 3,14-3,34 (m, 2H, CHz-indolila); 3,66 (s, 3H, O- CH3); 4,44-4,52 (m, 1H, CH); 4,56-4,62 (m, 1H, CH); 5,12 (bs, 1H, NH); 6,39 (d, *J = 8,0 Hz, 1H, NH); 7,04-7,38 (m, 5H, indolit-CH); 8,17 (d, *J = 7,9 Hz, . 1H, NH) *SC-RMN de BOC-L-Trp-D-Met-OMe (BOC-LD-lj-OMe) (125 MHz, CDCk): 8 “10 =15,28;28,27; 29,43; 31,36; 33,93; 52,38; 55,25; 80,19; 110,54; 111,25; 118,78; 119,80; 122,31; 123,06; 127,40; 136,25; 155,40; 171,53; 171,85 Exemplo 7: Ú Especificação geral para a síntese dos compostos do grupo PG-L-EAA- - D-Met (PG-LD-I) e PG-D-Met-L-EAA (PG-DL-II) (clivagem de metil éster) 10,0 mmols de PG-L-EAA-D-Met-OMe (PG-LD-I-OMe) ou PG-D- Met-L-EAA-OMe (PG-DL-IIl-OMe) foi suspenso em 15 ml de água e 200 ml de metanol e 1,2 eq. (12,0 mmols) de NaOH (12,0 ml! 1N de NaOH) foi adi- cionado. Após agitar durante 2 horas, a solução reacional homogênea foi acidificada com ácido clorídrico diluído e o metano! foi parcialmente destilado no evaporador giratório. O sólido branco que cristalizou foi filtrado, lavado com 20 ml de água e recristalizado. PG: grupo de proteção (grupo de proteção de Z ou BOC) Exemplo 8: Especificação geral para a síntese dos compostos do grupo L-EAA-D- Met(LDH)e D-Met-L-EAA (DL-llI) (clivagem do grupo de proteção de Z de terminal-N) 5,0 mmols de Z-L-EAA-D-Met (Z-LD-l) ou Z-D-Met-L-EAA (Z-LD- |

11) foi dissolvido em 50 ml de ácido acético glacial, e 18,5ml (15,6 g; 250 mmois; 50 eq.) de dimetilsulfeto e 5,0 g (3,6 ml!) de 33% de HBr em áci- do acético (1,65 g; 4,0 eq.) foram adicionados. Na conclusão da reação, a . solução reacíional foi concentrada no evaporador giratório. O resíduo foi dis- — solvido em aproximadamente 50 ml de metanol e 3,5 g (50 mmols; 10 eq.) ' de tiolato de metano sódico foi adicionado. Após agitar durante 20 minutos, a . solução foi neutralizada em temperatura ambiente com ácido clorídrico con- centrado e a solução foi concentrada no evaporador giratório. O resíduo foi absorvido em 40 ml de água e extraído três vezes com 40 ml de dietil éter de cada vez A fase aquosa foi concentrada no evaporador giratório: um sólido branco volumoso foi precipitado. O dipeptídeo foi removido com sucção, la- vado com um pouco de água e secado a vácuo.. - Exemplo 9: Especificação geral para a síntese dos compostos do grupo L-EAA-D- “15 Met(LD+)e D-Met-L-EAA (DL-I) (clivagem do grupo de proteção BOC de terminal-N) 5,0 mmols de BOC-L-EAA-D-Met (BOC-LD-I) ou BOC-D-Met-L- EAA (BOC-DL-II) foi dissolvido em 50 ml de ácido acético glacial e 5,09 : (3,6 ml) de 33% de HBr em ácido acético (1,65 g (4,0 eq.)) foi adicionado. Na conclusão da reação, a solução reacional foi concentrada em um evaporador giratório. O resíduo foi absorvido em 40 ml de água e extraído três vezes com 40 ml de dietil éter de cada vez. A fase aquosa foi vagarosamente neu- tralizada com 20% de solução de NaOH, ao mesmo tempo que resfriando continuamente em um banho de gelo. A solução foi lavada três vezes com 40mlde dietil éter de cada vez e a fase aquosa foi concentrada no evapora- dor giratório, com a precipitação de um sólido branco volumoso. O dipepti- deo foi retirado por sucção, lavado com um pouco de água e secado a vá- cuo. 9a) D-Met-L-Leu (DL-Ilb) o ia

AA AA ã H

NH |

Rendimento: 860 mg (66%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso ?H-RMN de H—D-Met-L-Leu (DL-Ilb) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): ô = 0,85 (d, ?3J=6,3 Hz, 3H, CHs3); 0,90 (d, *J = 6,3 Hz, 3H, CH3); 1,50-1,70 (m, 3H, S- - CH2CH2, CH(CH3)2); 2,00-2,10 (m, 5H, SCH3, CHCH); 2,45-2,55 (m, 2H, SCH»); 3,88-3,94 (m, 1H, CH); 4,22-4,30 (m, 1H, CH); 8,40-8,60 (m, 3H, ' NH3*); 8,95 (d, ?J = 8,3 Hz, 1H, NH) . *C-RMN de D-Met-L-Leu (DL-Ilb) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): 8 = 14,56; 21,16; 22,95; 24,50; 28,21; 31,22; 50,66; 51,77; 168,16; 173,50 HRMS (pESI): Calculado:263,14294 C1H23N203S (MH*) Encontrado: 263,14224 9b) D-Met-L-lle (DL-llc) o AA : AC NH; Rendimento: 900 mg (69%), pureza: 99% (HPLC), sólido branco volumoso 1H-RMN de D-Met-L-lle (DL-Illc) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): ô = 0,82-0,90 (m, 6H, 2xCH3); 1,16-1,44 (m, 2H, SCH;CH;3); 1,80-1,90 (m, 1H, CH); 2,00-2,10 (m, 2H, CH>); 2,05 (s, 3H, SCH3); 2,46-2,54 (m, 2H, SCH2); 3,96-4,02 (m, 1H, CH); 4,24-4,30 (m, 1H, CH); 8,36-8,44 (m, 3H, NH3”); 8,79 (d, *J = 8,5 Hz, 1H, NH) *C-RMN de D-Met-L-lle (DL-llc) (500 MHz, de-DMSO+HCI): ê = 11,44; 14,86;15,96;24,95;28,58; 31,71; 36,75; 52,00; 56,82; 168,64; 172,74 HRMS (pESI): Calculado: 263,14294 C11H23N2O03S (MH*) Encontrado: 263,14215 9c) D-Met-L-Thr (DL-Ild)

R VA sen : o»

PA Y OX NH7 Rendimento: 640 mg (51%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso |

1H-RMN de D-Met-L-Thr (DL-Ild) (500 MHz, ds-DMSO+HCI]): 8 = 1,10 (d, ?J= 6,2 Hz, 3H, CHCHs3); 2,06 (s, 3H, SCH3); 2,06-2,14 (m, 2H, SCH2CH;>); 2,48- ' 2,60 (m, 2H, SCH>2); 4,00-4,28 (m, 4H, 2 x CH, CHOH); 8,40-8,46 (m, 3H, . NH3*); 8,77 (d, *J = 8,6 Hz, 1H, NH) ºC-RMN de D-Met-L-Thr (DL-Hld) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): à = 15,14; ] 20,94; 28,74; 31,94; 52,44; 58,81; 66,97; 169,22; 172,20 ç HRMS (pES]): Calculado: 251,10655 CoHIoN204S (MH*) Encontrado: 251,10583 9d) D-Met-L-Lys x 2 HCI (DL-Ile-2HCI) o QI DA NAN Nao FM. . Rendimento: 613 mg (49%), pureza: 97% (HPLC), sólido amarelado ?H-RMN de D-Met-L-Lys x 2 HCI (DL4le-2HCI) (500 MHz, DMSO): ô = 1,32- 1,42 (m, 2H, CHxX(Lys); 1,52-1,62 (m, 2H, CHx(Lys); 1,64-1,80 (m, 2H, : CH2(Lys); 2,00-2,10 (m, 5H, SCHCH7z, SCHs); 2,46-2,56 (m, 2H, SCH>); — 15 2,70-2,82 (m, 2H, NCH>); 3,92-4,00 (m, 1H, CH); 4,16-4,24 (m, 1H, CH); 7,9 (bs, 3H, NH3”); 8,3 (bs, SH, NH3*); 8,92 (d, *J =7,7 Hz, 1H, NH) HRMS (pES]): Calculado: 278,15384 Cn1H24038S (MH”*) Encontrado: 278,15288 S9e)D-Met-L-Phe (DLHlg) ANA, Í ã H [A Rendimento: 930 mg (63%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso 1H-RMN de D-Met-L-Phe (DL-lg) (500 MHz, de-DMSO+HCI): 8 = 1,64-1,82 (m, 2H, SCHzCH2); 1,95 (s, 3H, SCH3); 2,10-2,26 (m, 2H, SCH>); 2,80-3,20 (m, 2H, CH2Ph); 3,70 (t, *U=6,1 Hz, 1H, CHCH;Ph); 4,42-4,50 (m, 1H, CH- CH;CHS);7,16-7,28 (m, 5H, Ph); 8,50-8,60 (bs, 1H, NH) |

C-RMN de D-Met-L-Phe (DL-llg) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): & = 14,28; 28,08; 31,63; 37,03; 51,84; 53,78; 126,28; 127,97; 129,08; 137,69; 168,90; 172,65 - HRMS (pES]): Calculado:297,12729 — CuHaNsO3S (MH”) ] Encontrado: 297,12643 NR 9f) D-Met-L-Trp (DL-!lj) Ao Rendimento: 1,38 g (82%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso 'H-RMN de D-Met-L-Trp (DL-Ilj) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): 5 = 1,50-1,80 (m,2H,SCHCH2); 1,93 (s, 3H, SCH3); 2,30-2,40 (m, 2H, SCH>2); 3,02-3,22 (m, 2H, CH); 3,34-3,40 (m, 1H, SCH2CH2CH); 4,38-4,40 (m, 1H, CH); 6,90- ' 7,60 (m, 5H, indolila); 8,05-8,15 (bs, 1H, CONH); 10,80 (bs, 1H, NH) C-RMN de D-Met-L-Trp (DL-Ilj)) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): à = 14,37; 27,38; 29,12; 33,28; 53,00; 53,49; 110,26; 111,17; 118,07; 118,26; 120,64; 123,36;127,52; 135,98; 171,87; 173,53 : HRMS (pES]): Calculado: 336,13819 — — CisHo2N3O03S (MH”) Encontrado: 336,13718 9g) L-Leu-D-Met (LD-lb) O: OH o

A NH, Rendimento: 710 mg (54%), pureza: 99% (HPLC), sólido branco volumoso 1H-RMN de H—L-Leu-D-Met (LD-Ib) (500 MHz, de-DMSO+HCI): ê = 0,91 (t, ?y=5,4 Hz, 6H, 2 x CH3); 1,62 (t, */ = 6,8 Hz, 2H, CHXCH(CH3)2); 1,60-1,75 (m, 1H, CH(CHs)2); 1,88-2,04 (m, 2H, SCH2CH2); 2,04 (s, 3H, SCH3); 2,40- 2,54 (m, 2H, SCH>); 3,78-3,86 (m, 1H, CH); 4,32-4,40 (m, 1H, CH); 8,36 (d, ?J=4,0 Hz, 3H, NH;); 9,03 (d, *U = 7,8 Hz, 1H, NH) 13C-RMN de H—L-Leu-D-Met (LD-lb) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): ô = 14,56; |

22,78; 23,33; 23,93; 29,89; 30,58; 41,03; 51,40; 51,56; 169,41; 173,03 HRMS (pES]): ] Calculado: 263,14294 — CiiHo3N203S (MH*) . Encontrado: 263,14218 9h)L-Hle-D-Met(LD-c) - O. OH o

ALL NH, Rendimento: 790 mg (59%), pureza: 97% (HPLC), sólido branco volumoso TH-RMN de L-lle—D-Met (LD-lc) (500 MHz, ds-DMSO): ô = 0,82 (t, *J=7,4 Hz, 3H, CH;CH>); 0,86 (2, ?) = 6,6 Hz, 3H, CH3;CH); 1,02-1,12 (m, 1H, CH;CH'H"”); 1,36-1,46 (m, 1H, CH;CH'H”); 1,64-1,72 (m, 1H, CH;CH); 1,80- 1,98 (m, 2H, SCH2CH>); 2,00 (s, 3H, SCH;3); 2,36-2,44 (m, 2H, SCH2); 3,27 - (d, 3J=5,1 Hz, 1H, CH); 3,99 (1, *J = 5,3 Hz; 1H, CH); 7,92 (bs, 1H, NH) *SC-RMN de L-lle-D-Met (LD-lc) (500 MHz, ds-DMSO): 8 = 11,57; 14,54; 15,60; 23,58; 29,69; 32,42; 37,90; 53,06; 58,79; 172,09; 173,37 ' HRMS (pES]): Calculado:263,14294 CnH23N2038S (MH) | Encontrado: 263,14224 9i) L-Thr-D-Met (LD-ld) O: oH

OH

LA NH; Rendimento: 690 mg (55%), pureza: 99% (HPLC), sólido branco volumoso 1H-RMN de L-Thr-D-Met (LD-ld) (500 MHz, de-DMSO+CDCI3): ô = 1,08 (d, ) =6,6Hz 3H, CH3); 1,82-2,08 (m, 2H, SCH2CH;>), 2,02 (s, 3H, SCH3); 2,38- 2,50 (m, 2H, SCH>2); 3,06 (d, *J = 4,2 Hz, 1H, CH); 3,88-3,94 (m, 1H, CH); 3,98-4,04 (m, 1H, CH); 7,91 (d, 3J=7,3 Hz, 1H, NH) 1C-RMN de L-Thr-D-Met (LD-ld) (500 MHz, ds-DMSO+CDCI3): ê = 14,75; 19,70; 30,07; 32,45; 53,71; 60,22; 67,45; 172,58; 174,24 HRMS(pES)): |

Calculado: 251,10655 CaHIoN20,4S (MH”*) Encontrado: 251,10586 i 9j) L-Lys-D-Met x 2 HCI (LD-le-2HCI) : PANOS O NHºCr ' Rendimento: 676 mg (54%), pureza: 96% (HPLC), cristais incolores H-RMN de L-Lys-D-Met x 2 HCI (LD-le-2HCI) (500 MHz, ds-DMSO): 3 = 1,30-1,44 (m, 2H, CH>(Lys)); 1,54-1,64 (m, 2H, CH(Lys)); 1,72-1,84 (m, 1H, CHLys)); 1,90-2,04 (m, 2H, SCH2CH2); 2,05 (s, 3H, SCH;3); 2,44-2,58 (m, 2H, SCH2); 2,70-2,80 (m, 2H, NCH>2); 3,82-3,90 (m, 1H, CH); 4,34-4,42 (m, 1H, CH); 7,9 (bs, 3H, NH3*); 8,3 (bs, 3H, NH3”); 8,91 (d, 3y=7,9 Hz, 1H, NH) “10 HRMS(pPES): “ Calculado: 278,15384 C11H2403S (MH) Encontrado: 278,15290 9k) L-Phe-D-Met (LD-lg) - SAO UA NH? Rendimento: 880 mg (59%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso H-RMN de L-Phe-D-Met (LD-lg) (500 MHz, ds-DMSO+D20): ô = 1,60-2,02 (m, 4H, SCHxCH>z); 2,05 (s, 3H, SCH3); 3,08-3,32 (m, 2H, PRCH>2); 4,12-4,16 (m, 1H, CH); 4,204,26 (m, 1H, CH); 7,30-7,50 (m, 5H, Ph) C-RMN de L-Phe-D-Met (LD-lg) (500 MHz, ds-DMSO+D20O): ô = 15,37; 30,72; 32,10; 38,09; 55,40; 55,96; 129,24; 130,50; 130,71; 136,55; 169,47; 17842 HRMS (pES]): Calculado: 297,12729 CiaHo1N203S (MH*) Encontrado: 297,12646 91) L-Trp-D-Met (LD-lj) |

PA . Rendimento: 1,40 g (83%), pureza: 98% (HPLC), sólido branco volumoso TH-RMN de L-Trp-D-Met (LD-lj) (500 MHz, ds-DMSO): 8 = 1,68-1,88 (m, 2H, : SCH2CH2); 1,94 (s, 3H, SCH3); 2,24 (d, *J = 7,9 Hz, 2H, SCH>); 2,80-2,88 . (m, 1H, CH); 3,10-3,16 (m, 1H, CH); 3,70-3,76 (m, 1H, CH); 4,00-4,06 (m, 1H,CH);6,90-7,60 (m, SH, indolila); 8,10 (bs, 1H, NH); 10,90 (bs, 1H, NH) "SC-RMN de L-Trp-D-Met (LD-li) (500 MHz, ds-DMSO): ô = 14,51; 29,56; 29,90; 32,09; 52,78; 54,59; 109,82; 111,26; 118,15; 118,30; 120,80; 123,82; 127,20; 136,16; 172,03; 173,02 HRMS (pES]): Calculado:336,13819 CisH22N3O03S (MH*) Encontrado: 336,13724 ' Exemplo 10: Síntese química da mistura diastereomérica de Met-lle (llc) de 5-[2- (metiltio)etil]-2,4-imidazolidinadiona (hidantoina de metionina) (Vn) e L- “15 isoleucina com KOH - 11,8 g (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de 5-[2-(metiltio)etil)-2 4-imidazolidinadiona (Vn) e 11,9 g (0,8 mol) de 85% de KOH foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados em um autoclave de aço de 200 ml Roth com agitador magnético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão para 0,8 MPa (8 bar). Na conclusão da reação, a autoclave foi resfriada, o sólido precipitado foi filtrado e lavado com um pou- co de água.

Uma corrente de CO7z moderada foi passada através do filtrado.

O sólido que agora precipitou foi retirado mais uma vez, lavado com um pouco de água fria e secado sob bomba de óleo a vácuo durante várias ho- rasa30ºC; peso final: 7,3 g (31% de teoria) de sólido branco. *H-RMN coin- cidiu com os espectros de *H-RMN sobrepostos de L-Met-L-lle (LL-llc) e D- Met-L-lle (DL-llc) (vide Exemplo 9b). Exemplo 11: Síntese química da mistura diastereomérica de Met-lle (llc) de N- | carbamoilmetionina (Illn) e L-isoleucina com KOH 11,8 g (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,5 g (0,09 mol, pureza: 99%) Ú de N-carbamoilmetionina (Illn) e 11,9 g (0,18 mol) de 85% de KOH foram dis- . solvidos em 150 ml de água e agitados em um autoclave de aço de 200 ml Rothcom agitador magnético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão para 0,7 MPa (7 bar). Na conclusão da reação a autoclave foi resfria- ' da, o sólido precipitado foi filtrado e lavado com um pouco de água. O filtrado foi neutralizado com 10% de ácido sulfúrico e o sólido que precipitou foi retira- do por sucção, lavado com um pouco de água fria e secado sob bomba de óleoa vácuo durante várias horas a 30ºC; peso final: 6,4 g (27% de teoria) de sólido branco. *H-RMN coincidiu com os espectros de *H-RMN sobrepostos de L-Met-L-lle (LL-llc) e D-Met-L-lle (DL-llc) (vide o Exemplo 9b).

- Exemplo 12: Síntese química da mistura diastereomérica de Met-lle (llc) de (N- "15 carbamoilmetioninamida) de amida de ácido 2-[(aminocarbonil)amino]- 4-(metiltio)butanoico (IVn) e L-isoleucina com KOH 11,89 (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,49 (90 mmols, pureza: i 98,5%) de amida de ácido 2-[(aminocarbonil)amino]-4-(metiltio)butanoico . (IVn) e 11,9 9 (0,8 mol) de 85% de KOH foram dissolvidos em 150 ml de á- guae agitados em um autoclave de aço de 200 ml Roth com agitador mag- nético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão para 0,7 MPa (7 bar). Na conclusão da reação, a autoclave foi resfriada, o sólido precipitado foi filtrado e lavado com um pouco de água. O filtrado foi neutralizado com ácido clorídrico semiconcentrado e o sólido que precipitou foi retirado por sucção, lavado com um pouco de água fria e secado sob bomba de óleo a vácuo durante várias horas a 30ºC; peso final: 8,0 g (34% de teoria) de sóli- do branco. *H-RMN coincidiu com os espectros de *H-RMN sobrepostos de L-Met-L-lle (LL-llc) e D-Met-L-lle (DL-llc) (vide o Exemplo 9b).

Exemplo 13: Síntese química de 3-[2-(metiltio)etil]-8-(1-(metil)propil)-2,5- piperazinadiona (Vic) de 5-[2-(metiltio)etil]-2,4-imidazolidinadiona (hi- dantoína de metionina) (Vn) e L-isoleucina |

11,8 g (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de 5-[2-(metiltio)etil])-2 4-imidazolidinadiona (Vn) e 7,19 (0,9 mol) de (NHa)HCO; foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados em um autocla- .: ve de aço de 200 ml Roth com agitador magnético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão. Liberando-se gás de vez em quando a pressão foi ' mantida constante a 0,8 MPa (8 bar). Na conclusão da reação a autoclave . foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão obtida foi em seguida filtra- da, o sólido filtrado foi lavado várias vezes com água e secado sob bomba de óleo a vácuo durante várias horas a 30ºC; peso final: 9,9 g (45% de teori- a)deVlccomo um sólido branco. o

AD . VS o ' !H-RMN de 3-[2-(metiltio)etil]-6-(1-(metil)propil)-2,5-piperazinadiona (Vic) (500 MHz, ds-DMSO): ô = 0,85 (t, *J = 7,4 Hz, 3H, CHsCHs3); 0,90 (d, ?J = : 7,4 Hz, 3H, CHCH3); 1,10-1,50 (m, 2H, SCH2CH>2); 1,80-1,90 (m, 1H, CH); 1,90- 2,00 (m, 2H, CH>2); 2,04 (s, 3H, SCH3); 2,42-2,58 (m, 2H, SCH2); 3,64-3,68 (m, - 15 1H/CH);3,94-3,98(m, 1H, CH); 8,08-8,16 (m, 2H, 2 x NH) *C-RMN de 3-[2-(metiltio)etil]-6-(1-(metil)propil)-2,5-piperazinadiona (Vic) (500 MHz, ds-DMSO+HCI): à = 12,02; 14,85; 15,27; 24,61; 28,74; 32,15; 39,90; 52,92; 59,34; 167,90; 168,10 Exemplo 14: Síntese química de 3-[2-(metiltio)etil] -6-(1-metil)propil)-2,5- piperazinadiona (Vic) de N-carbamoilmetionina (llln) e L-isoleucina 11,8 g (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,5 g (0,09 mol, pureza: 99%) de N-carbamoilmetionina (Illn) e 7,1 g (0,9 mol) de (NHJHCO; foram dissolvi- dos em 150 ml de água e agitados em um autoclave de aço de 200 ml Roth com agitador magnético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão. Liberando-se gás de vez em quando a pressão foi mantida constante a 0,8 MPa (8 bar). Na conclusão da reação a autoclave foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão obtida foi em seguida filtrada, o sólido filtrado foi lavado | várias vezes com água e secado e secado sob bomba de óleo a vácuo duran- te várias horas a 30ºC; peso final: 9,1 g (41,3% de teoria) do composto Vlc ' como um sólido branco.

RMN coincidiu com o RMN do Exemplo 13. . Exemplo 15: Síntese química de 3-[2-(metiltio)etil]-6-(1-metil)propil)-2,5-

' piperazinadiona (Vlc) de (N-carbamoilmetioninamida) de amida de ácido

. 2-[(aminocarbonil)amino]-4-(metiltio)butanoico (IVn) e L-isoleucina

11,89 (0,09 mol) de L-isoleucina, 17,4 g (90 mmois, pureza: 98,5%) de amida de ácido 2-[(aminocarbonil)amino]-4-(metiltio)butanoico

(IVn)e7,19(0,9mol) de (NHJHCO; foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados em um autoclave de aço de 200 ml Roth com agitador magnético durante 5 horas a 150ºC, com aumento na pressão.

Liberando-se gás de

. vez em quando a pressão foi mantida constante a 0,8 MPa (8 bar). Na con- clusão da reação a autoclave foi resfriada em um banho de gelo.

A suspen- “15 são obtida foi em seguida filtrada, o sólido filtrado foi lavado várias vezes com água e secado sob bomba de óleo a vácuo durante várias horas a 30ºC; peso final: 10,3 g (47% de teoria) de sólido branco IVc.

RMN coincidiu i com o RMN do Exemplo 13. - Exemplo 16:

Síntese da mistura diastereomérica de lle-Met (Ic) Met-lle (llc) de 3-[2- (metiltio)etil]-6-(1-metil)propil)-2,5-piperazinadiona (Vic) com ácido clo- rídrico concentrado

24,49 (100 mmoIls) de 3-[2-(metiltio)etil]-6-(1-metil)propil)-2,5- piperazinadiona (Vlc) foi suspenso em 66 g de água.

Ao mesmo tempo que emagitação, 11 g de ácido clorídrico concentrado foi vagarosamente adicio- nado gota a gota e em seguida cuidadosamente aquecido ao refluxo, agitan- do muito vigorosamente.

A mistura reacional foi em seguida aquecida sob refluxo durante 8 horas, para que todo sólido entrasse na solução.

Durante subsequente resfriamento, uma pequena quantidade de dicetopiperazina não reagida foi precipitada, e foi filtrada.

O filtrado foi em seguida ajustado ao pH 5-6 com 32% de água de amônia em um béquer em um banho de ge- lo.

Uma mistura de DL-Met-DL-lle (mistura diastereomérica de llc) e DL-lle-

|

DL-Met (mistura diastereomérica de lc) foi precipitada como um sólido bran- co volumoso.

O sólido foi secado em um gabinete de secagem a 40ºC sob Ú bomba de jato de água a vácuo; rendimento: 21,5 g (82,0%). - Exemplo 17: Sínteseda mistura diastereomérica de Ile-Met (Ic) e Met-lle (llc) de 3-[2- B (metiltio)etil]-6-(1-metil)propil)-2,5-piperazinadiona (Vlc) em condições BR alcalinas com amônia 196g (0,8 mol) de 3-[2-(metiltio)etil)-6-(1-metil)propil)-2,5- piperazinadiona (Vlc), 22,4 ml de 25% de solução de amônia e 160 ml de água foram aquecidos em um autoclave a 150ºC durante 2 horas.

Após res- friar, a dicetopiperazina não reagida foi retirada com sucção.

Esta pode ser usada novamente em uma subsequente preparação.

O filtrado foi concen- . trado em um evaporador giratório em uma temperatura de água de 80ºC até os primeiros cristais serem precipitados.

Após resfriar e deixar repousar du- “15 rantea noite, após filtração e secagem, uma mistura de DL-Met-DL-lle (mis- tura diastereomérica de Illc) e DL-lle-DL-Met (mistura diastereomérica de lc) . foi isolada como um sólido branco volumoso; rendimento: 12,2 9g (58%). Exemplo 18: - Testes de digestão !n vitro em L-EAA-L-Met (LL) ou L-Met-L-EAA (LL- Il)com enzimas digestivas de carpa onivora a) Isolação das enzimas digestivas de carpa espelho (Cyprinus carpio morpha noblis) As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de EID e MATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de cinco carpas de espelho com um ano de idade (Cypri- ' nus carpio morpha noblis), enxaguados com água, cortados longitudinalmen- te e em cada caso a mucosa intestinal foi raspada.

Esta foi fragmentada em um misturador junto com gelo moido.

A suspensão resultante foi tratada com uma vara de ultrassom, para quebrar quaisquer células que estavam ainda intactas.

Para separar os constituintes de célula e gordura, a suspensão foi centrifugada durante 30 minutos a 4ºC, o homogenado foi decantado e este- rilizado com um traço de tiomersal.

De 5 carpas de espelho, 296,3 ml! de so- | lução de enzima da mucosa intestinal foram obtidos.

A solução foi armaze- nada no escuro a 4ºC. ' b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro . L-Met-L-EAA (LL-II) ou L-EAA-L-Met (LL) foi absorvido em so- lução de tampão de TRIS/HCI e a solução de enzima foi adicionada.

Como ' comparação e para avaliar a taxa de clivagem puramente química, em cada . caso um branco foi preparado sem solução de enzima (vide a Tabela 3). Uma amostra foi tomada ocasionalmente e sua composição foi detectada e quantificada por meio de uma HPLC calibrada.

A conversão foi determinada como o quociente do conteúdo de metionina e o conteúdo de L-Met-L-EAA (LL-I) ou L-EAA-L-Met (LL) (vide as figuras 1 e 2). Amostra Branco - Carga Substrato 0,15mmols —0,15mmols (LLA ou LL) ' Solução de tampão 7,5 ml 8,1ml TRIS/HCI, . pH 9,5 Começo da rea- Solução de enzima 589 ul — ção (& 1,5% de solução carpa) Reação 37ºC 37ºC Interrupção — da 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de reação 10% de solução de H;PO;,. Tabela 3 Exemplo 19: Testes de digestão in vitro em L-EAA-D-Met (LD-!I) ou D-Met-L-EAA (DL- Il) com enzimas digestivas de carpa onívora a)lsolação das enzimas digestivas de carpa espelho — (Cyprinus car pio morpha noblis)

As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de EID e MATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de cinco carpas espelho de um ano de idade (Cyprinus carpiomorpha noblis) e processados como descrito no Exemplo 18. | b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro D-Met-L-EAA (DL-II) ou L-EAA-D-Met (LD-I) foi absorvido em solução de tampão de TRIS/HCI e a solução de enzima foi adicionada.

Co- . mo comparação e para avaliar a taxa de clivagem puramente química, um branco sem solução de enzima foi preparado em cada caso (vide a Tabela : 4). Uma amostra foi tirada de vez em quando e sua composição foi detecta- ' da e quantificada por meio de uma HPLC calibrada.

A conversão foi deter- minada como o quociente da área de metionina e a área de D-Met-L-EAA (DL-II) ou L-EAA-D-Met (LD-I) (vide a Figura 7). Amostra Branco Carga Substrato 0,15mmols —0,15mmols (LD-I ou DL-II) . Solução de tampão de 7,5ml 13,4 ml TRIS/HCI, , pH 9,5 Começo da rea- Solução de enzima 5,89 ml — . ção (2 15% de solução de carpa) Reação 37ºC 37ºC - Interrupção da — 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de reação 10% de solução de H;PO,. Tabela 4 Exemplo 20: Testes de digestão /n vitro em L-EAA-L-Met (LL-I) ou L-Met-L-EAA (LL- II) com enzimas digestivas de truta carnivora a) Isolação das enzimas digestivas de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de EID e MATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de seis trutas arco-íris de um ano de idade (Oncorhynchus mykiss) e processados como descrito no Exemplo 18. b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro As investigações in vitro foram realizadas similavmente ao E- xemplo 18 (vide a Tabela 5,figuras 3e 4). |

Amostra Branco Carga Substrato 0,15 mmols — 0,45 mmois (LL ou LL-IM) . Solução de tampão de 7,5 ml 7eml TRIS/HCI, pH 9,5 ] Começoda Solução de enzima 424 ul — . reação 2 1,0% de solução de truta) Reação 37ºe 37ºC Interrupção — 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de 10% da reação de solução de H;PO,. Tabela 5 Exemplo 21: - Testes de digestão In vitro em L-EAA-D-Met (LD-I) ou D-Met-L-EAA (DL- 11) com enzimas digestivas de truta carnívora “5 a)lsolaçãodas enzimas digestivas de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método . de EID e MATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de seis trutas arco-íris de um ano de idade (Oncorhynchus - mykiss) e processados como descrito no Exemplo 18. b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro As investigações in vitro foram realizadas similarmente ao Exemplo 19 (vide a Tabela 6, Fig. 11). Amostra Branco Carga Substrato 0,143mol 0,143mol (LD-I ou DL-II) (40,1mg) (40,1mg) Solução de tampão de 5,7 ml 29,9 ml TRIS/HCI, pH 9,5 Começo da rea- Solução de enzima 4,2 ml — ção (2 10% trout solution) Reação 37ºC 37ºC Interrupção da — 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml! de reação 10% de solução de H;PO,. |

Tabela 6 Exemplo 22: Ú Testes de digestão /n vitro em L-EAA-L-Met (LL) ou L-Met-L-EAA (LL- - Il) com enzimas digestivas de camarões onívoros a)lsolaçãodas enzimas digestivas de camarões de perna branca (Litope-

' naeus vannamel)

: As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de Ezquerra e Garcia-Carreno (J.

Food Biochem. 1999, 23, 59-74). Por isso, os hepatopâncreas foram removidos de cinco quilogramas de camarões de perna branca (Litopenaeus vannamei) e fragmentados em um misturador junto com gelo moído.

Outro processamento foi realizado similarmente ao Exemplo 18. - b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro As investigações in vitro foram realizadas similarmente ao Exemplo 18 (vide “15 aTabela7,figuras5e6). Amostra Branco : Carga Substrato 0,15 mmols 0,15 mmols (LL-1 ou LL) - Solução de tampão de 7,5 ml 7,8 ml TRIS/HCI, pH 9,5 Começo da rea- Solução de enzima 258 ul — ção 2 2 camarões) Reação 37ºC 37ºC Interrupção da — 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de reação 10% de solução de H;PO,. Tabela 7 Exemplo 23: Testes de digestão /n vitro em L-EAA-D-Met (LD-I) ou D-Met-L-EAA (DL- 11) com enzimas digestivas de camarões onívoros a) Isolação das enzimas digestivas de camarões de perna branca (Litope- naeusvannamel) |

As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de Ezquerra e Garcia-Carreno (J.

Food Biochem. 1999, 23, 59-74). Por isso, os hepatopâncreas foram removidos de cinco quilogramas de camarões de . perna branca (Litopenaeus vannamei) e fragmentados em um misturador junto com gelo moído.

Outro processamento foi realizado similarmente ao ' Exemplo 18. : b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro As investigações in vitro foram realizadas similarmente ao E- xemplo 19 (vide a Tabela 8, Fig. 10). Amostra Branco Carga Substrato 0,143 mmols — 0,143 mmols (LD ou DL-II) (40,1 mg) (40,1 ma) - Solução de tampão de 5,7 ml 7,9ml TRIS/HCI, , pH 9,5 Começo da rea- Solução de enzima 2,2m -— : ção (2 8 camarões) Reação 37ºC 37ºC - Interrupção da — 0,2 m! de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de 10% reação de solução de H;PO,. Tabela 8 Exemplo 24: Testes de digestão /n vitro em L-EAA-L-Met (LL-I) ou L-Met-L-EAA (LL- 1l) com enzimas digestivas de frango a) Isolação das enzimas digestivas de frango As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de EIDe MATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de um frango, enxaguados em água, cortados longitudi- nalmente e em cada caso a mucosa intestinal foi raspada.

Esta foi fragmen- tada em um misturador junto com gelo moído.

A suspensão resultante foi tratada com uma vara de ultrassom, para quebrar as células que ainda esta- vamintactas.

Para separar os constituintes de célula e gordura, a suspensão | foi centrifugada durante 30 minutos a 4ºC, o homogenado foi decantado e esterilizado com um traço de tiomerosal.

De um frango, 118,9 ml de solução Ú de enzima da mucosa intestinal foram obtidos; a solução foi armazenada no escuro a 4ºC. b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro ' L-Met-L-EAA (LL-IIN) ou L-EAA-L-Met (LL-I) foi absorvido em so- . lução de tampão de TRIS/HCI e a solução de enzima foi adicionada.

Como comparação e para avaliar a taxa de clivagem puramente química, um bran- co sem solução de enzima foi preparado em cada caso.

Uma amostra foi tiradade vez em quando e sua composição foi detectada e quantificada por meio de uma HPLC calibrada.

A conversão foi determinada como o quocien- te do conteúdo de metionina e do conteúdo de L-Met-L-EAA (LL-II) ou L- . EAA-L-Met (LL-I) (vide a Tabela 9, Fig. 16). Amostra Branco ] Carga Substrato 0,15 mmols — 0,15 mmols (LL-I ou LL-II) Solução de tampão de 11,3ml 12,5ml i TRIS/HCI, - pH 9,5 Começo da Solução de enzima 1,19 ml — reação É 1,0% de solução de frango) Reação 37ºC 37ºC Interrupção da 0,2 m! de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de 10% reação de solução de H3PO,,. Tabela 9 Exemplo 25: Testes de digestão In vitro em L-EAA-D-Met (LD-I) ou D-Met-L-EAA (DL- II) com enzimas digestivas de frango a) Isolação das enzimas digestivas de frango As enzimas digestivas foram isoladas de acordo com o método de EIDeMATTY (Aquacultura 1989, 79, 111-119). Por isso, os intestinos foram removidos de um frango e processados como descrito no Exemplo 24. | b) Procedimento para os estudos de digestão in vitro D-Met-L-EAA (DL-II) ou L-EAA-D-Met (LD-I) foi absorvido em : solução de tampão de TRIS/HCI e a solução de enzima foi adicionada.

Co- mo comparação e para avaliar a taxa de clivagem puramente química, um branco sem solução de enzima foi preparado em cada caso.

Uma amostra ' foi tirada ocasionalmente e sua composição foi detectada e quantificada por . meio de uma HPLC calibrada.

A conversão foi determinada como o quocien- te da área de metionina e a área de D-Met-L-EAA (DL-II) ou L-EAA-D-Met (LD-I) (vide a Tabela 10, Fig. 17). Amostra Branco Carga Substrato 0,15 mmols 0,15 mmols (LD-I ou DL-II) R Solução de tampão de 11,3 ml 125 ml TRIS/HCI, pH 9,5 ' Começo da rea- Solução de enzima 1,19ml -— ção (2 1% de solução de frango) . Reação 37ºC 37ºC Interrupção da — 0,2 ml de solução reacional foi absorvido em 9,8 ml de . reação 10% de solução de H;PO,. Tabela 10 |

Claims (20)

U7 REIVINDICAÇÕES

1. Dipeptídeos contendo aditivo de alimentação ou sais dos Ú mesmos, caracterizados pelo fato de que um resíduo de aminoácido do di- peptídeo é um resíduo de DL-metionila e o outro resíduo de aminoácido do dipeptideo é um aminoácido na configuração-L selecionado do grupo com- ] preendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, . fenilalanina, arginina, cisteína e cistina.

2. Aditivo de alimentação como definido na reivindicação 1, con- tendo os dipeptídeos de fórmula geral DL-metionil-L-EAA e/ou L-EAA-DL- metionina, caracterizado pelo fato de que L-EAA é um aminoácido na confi- guração-L selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteina e cistina.

. 3. Mistura de alimentação contendo um aditivo de alimentação como definido na reivindicação 1 ou 2.

“15 4. Mistura de alimentação de acordo com a reivindicação 3, con- tendo Dl-metionil-L-EAA e/ou L-EAA-DL-metionina sozinha como D- metionil-L-EAA, — L-metionil-L-EAA, — L-EAA-D-metionina ou L-EAAHYL- metionina, como uma mistura de um com o outro ou também como uma mis- : tura com D-metionil-D-EAA, L-metionil-D-EAA, D-EAA-D-metionina ou D- EAA-L-metionina, preferivelmente em cada caso adicionalmente misturada com DL-metionina, preferivelmente com uma proporção de DL-metionina de 0,01 a 90% em peso, preferivelmente de 0,1 a 50% em peso, especialmente preferivelmente de 1 a 30 % em peso, preferivelmente em cada caso adicio- nalmente misturado com um L-EAA tal como, por exemplo, L-lisina, preferi- velmente com uma proporção de L-EAA de 0,01 a 90 % em peso, preferi- velmente de 0,1 a 50 % em peso, especialmente preferivelmente de 1 a 30 % em peso.

5. Dipeptídeo ou um sal do mesmo de fórmula geral DL-metionil- DL-EAA ou DL-EAA-DL-metionina, caracterizado pelo fato de que EAA é um aminoácido, preferivelmente na configuração-L selecionado do grupo com- preendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistina.

|

6. Método de produção de um dipeptídeo contendo apenas um resíduo de metionila de acordo com a fórmula DD/LI/DU/LD-I ou Ú DD/LL/DL/LD-II: Oo O R Ss . e. AA " - X AÍ NH, À NHz Ss Co, H R co,H (DD/LL/DL/LD-I) (DD/LL/DL/LD-II) reagindo-se um aminoácido com um derivado de ureia de fórmu- lageralillaV, , 1

R R

NÓ . TT R? : (Nav) onde R é definido como segue: la a Va: R = 1-metiletil- (valina) lb a Vb: R = 2-metilpropil- (leucina) IcavVec: R = (1S)-1-metilpropil- (isoleucina) ld a Vd: R = (1R)-1-hidroxietil- (treonina) le a Ve: R = 4-aminobutil- (lisina) Ifa Vf R = 3-[(aminoiminometil)- amino]propil- (arginina) lg a Vg: R = benzil- (fenilalanina) lhaVh: R = (1H-imidazol-4-il)metil- (histidina) lja Vj: R = (1H-indol-3-il)]metil- (triptofano) lka Vk: R = -CH;-SH (cisteína) Imavm: | R=-CH7S-S-CH7-CNH7-COOH (cistina) Illn a Vn: R = -CH7-CH>-S-CH;3 (metionina) com os resíduos R' e R? nos derivados de ureia III, IV e V sendo definidos como segue:

onde Illa-n: R' = COOH, R? = NHCONH, IVa-n: Rº = CONH>, Rº = NHCONH, ' Va-n: RI-R? = -CONHCONH- e Ss onde R denota um resíduo de metionila e o aminoácido adicio- ' nado é selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, his- R tidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteina e cistina ou o aminoácido adicionado é metionina e R é um resíduo de ami- —noácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína e cistina.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo . fato de que a hidantoína de metionina ou a hidantoína de um aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, “15 valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteina, cistina é usada como produto de partida ou é formada como um intermediário.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado | pelo fato de que uma solução contendo hidantoina de metionina e água é - reagida com o aminoácido sob condições básicas, ou uma solução contendo a hidantoína do aminoácido selecionada do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, argini- na, cisteina, cistina e água é reagida com metionina sob condições básicas.

9. Método de acordo com uma das reivindicações 6 a 8, caracte- rizado pelo fato de que o valor de pH da solução contendo o derivado de ureiaé ajustado a7 a 14 e/ou a reação é realizada em uma temperatura de a 200ºC e/ou a reação é realizada em uma pressão de 0,2 a 10 MPa (2 a 100 bar).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a solução contendo hidantoína de metioni- 30 naeáguaoua solução contendo a hidantoína do aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leuci- na, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína, cistina e água foi formada an- | tecipadamente de um ou mais dos compostos Ill, IV e V.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendo as ' seguintes etapas: a) Reaçãodo derivado de ureia de acordo com as fórmulas II, IVouV como aminoácido para um dicetopiperazina VI de fórmula,

O : Ss

PA AN

HN

R

O (VT) : onde R é definido como na reivindicação 6. b) Reação da dicetopiperazina VI a uma mistura de dipepti- deos com as fórmulas DD/LL/DL/LD-I e DD/LL/DL/LD-II: O Oo - R Ss HN a HN A XxX do À a, Es CO, H R CO, H (DD/LL/DL/LD-I) (DD/LL/DL/LD-II) onde R é definido como na reivindicação 6.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que a reação do derivado de ureia com o aminoácido à dicetopipe- razina ocorre em uma temperatura de 20ºC a 200ºC e/ou sob pressão, pre- ferivelmente em uma pressão de 0,2 a 9 MPa (2 a 90 bar).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a12, caracterizado pelo fato de que a reação do derivado de ureia com o aminoácido à dicetopiperazina ocorre na presença de uma base, preferivel mente uma base selecionada do grupo compreendendo bases contendo ni- trogênio, mistura de NHHCOz, (NHa)=CO3, KHCO3, K2CO3, NH.OH/CO,>,

sais de carbamato, bases de alcalino-terrosas e de álcali.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de ' 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a reação à dicetopiperazina ocorre pela reação do derivado de ureia de fórmula, 1 7 R R

NO q R2 (INaV) onde R denota um resíduo de metionila, com um aminoácido se- lecionado do grupo compreendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, va- lina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína ou cistina, ' ou 2 1o pela reação do derivado de ureia de fórmula, «|

R R Da PÔ q : 2

R (Mav) onde R é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo com- preendendo lisina, treonina, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cisteína ou cistina, com o aminoácido metionina.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a reação da dicetopiperazina a uma mistura de dipeptídeos de fórmula | e Il ocorre por hidrólise de ácido, preferi- velmente na presença de um ácido selecionado do grupo compreendendo os ácidos minerais, HCl, HCO3, CO/H2zO0, H2SO,, ácidos fosfóricos, ácidos —carboxílicos e ácidos hidroxicarboxílicos.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a reação da dicetopiperazina a uma mistura de dipeptídeos de fórmula | e Il ocorre por hidrólise básica, preferi-

velmente em um pH de 7 a 14, e preferivelmente é realizada empregando-se uma base do grupo compreendendo bases contendo nitrogênio, mistura de ' NHaAHCO;, (NH4)2CO3, NH4OH/CO;,, sais de carbamato, KHCO3, K2CO;, car- bonatos, bases alcalino-terrosas e de álcali.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a ' 16, caracterizado pelo fato de que o derivado de ureia Ill a V está na configu- : ração-D, na configuração-L ou em uma mistura da configuração-D e L, prefe- rivelmente em uma mistura da configuração-D e L, se o derivado de ureia for derivado de metionina (Illn a Vn), ou caracterizado pelo fato de que o derivado de ureia Ill a V está na configuração-D, na configuração-L ou em uma mistura da configuração-D e L, preferivelmente na configuração-L, se o derivado de ureia Ill a V for deri- ' vado de um aminoácido selecionado do grupo compreendendo lisina, treoni- na, triptofano, histidina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, arginina, cis- 715 teína,cistina.

18. Método de isolamento da mistura diastereomérica dos dipep- tídeos de fórmula | e Il pela cristalização de soluções de reação básicas que foram obtidas de acordo com a reivindicação 16, preferivelmente visto que a . solução é ajustada com um ácido para um valor de pH de 2 a 10, especial- mente preferivelmente para um valor de pH de 3 a 9, muito especialmente preferivelmente ao correspondente ponto isoelétrico do respectivo dipeptídeo de fórmula | ou Il, e o ajuste do pH preferivelmente ocorre com um ácido se- lecionado do grupo compreendendo os ácidos minerais, HCl, HxCO;s, COZ/H2O, H2SO,, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos e ácidos hidroxicar- boxílicos.

19. Método de isolamento da mistura diastereomérica dos dipep- tídeos de fórmula | e Il pela cristalização das soluções de reação acídicas que foram obtidas de acordo com a reivindicação 15, preferivelmente visto que a solução é ajustada adicionando-se uma para um valor de pH de 2 a 10, especialmente preferivelmente para um valor de pH de 3 a 9, muito es- pecialmente preferivelmente ao ponto isoelétrico correspondente do respec- tivo dipeptídeo de fórmula | ou Il, caracterizado pelo fato de que a base é | preferivelmente — selecionada do grupo compreendendo NH,HCO;, (NH4)2CO;s, bases contendo nitrogênio, NH,OH, sais de carbamato, KHCO;, ] K2CO;, carbonatos, bases alcalinoterrosas e de álcali.

20. Uso dos compostos | e Il como definidos na reivindicação 6, como aditivo de alimentação para animais úteis, preferivelmente para aves ' domésticas, porcos, ruminantes, peixes de água doce ou de água salgada, : crustáceos ou animais domésticos.

|

| FAREARSA

T 133 A 3 A RA d2osco2e22 : 2282 122 ; |EE$2393? E piso 7 E ASSS2A & TuViTvTTT o MAIA dadao “ & levrtitar

S o o Ss . 7” O Sd k

A 2 R d o 8 s o ' q E 2 ê : 2 E 5 =D = " E iL o

A

T dd Ihh í o n o a - x

S vs vp ns o os fo " y a Pp AA bh y o” 8 é NM om. 4 E à E Ps < so 7 - Oo o FI A A TATA A o Se F o o e 3 ê 8 Ss s % “ODESISAUOO

TATTIUCES

AASSANSAR

HHAHSHSARS

A AA A SESssSsS88 É |dissboBRE 7 |[SSSETSZARE 2 mo Aa adanãoa un AAA ada aaa o PDPDDDODOODOU 2200912000 “ 2H ZHNZZZS & JB ASAASA o CEE A ARA: o "o a "

F S É mor

N s . o

E o o : s = S =

A 2 QN â =” 7 uu ' E Ss vp . 3 < : 8 HR q o | E n ô P ke 2 "H : o a o o o " a o o” TESS o

E DR

KO D NA o ct OO ESA &

III IT II DA e o 2 e e o 8 2 8 z R & 9% “OESJOAUOO

ATaTNÇaR Hº4A9349449494944A42 - na doddúíndoas a SESSSSSSS E cr o TFTTRTRTTITAA : FW TTTTTTTTO

H

FEAZAZEAD gg |ESTESTSAS o AnAnadddas “o 3 GETTÍRAIAA + o ” e bh o e z

É : ã

N

E o à s 8 7 o

DD = sa oe HH . 7 > . p o u 4 9 = . 7 < â à h à dh q , E Ha o; a Lo a & oO "”

SÍ Pp os

O Q.

A "” a O REA h ” 2 à SO g h Se ei E 5 Ca A SE: v — à o Po HA o o s e 2 o 8 Ê 8 s R ã 9% “OBSISNUOO

: TATTITNEARS

ABSSSSSAS

GOTRÇNRRHRÇH HH9494944949434H4

SSSSSSSSS S nm T lgRSSRRASA

PAHHALCNEE À e TI TILTA ) HAIA 434d3d091942A 8 DobDODODO+S E er RRRo o As HºIS49I9d939A ” T lrstotair 2 à vv q - o E 4 er " 7 “ - [=

A

S o a

É o o : 2 | xi 3 bs - É s s h 7 1 4 nn | g à 7 ESA E 2 2 = ã o a À = 7 ê Ke) & +p f” À o À & AA kh . ") "” E à o e 8 = OA

FE SE | ? FE os o TA DER n =

F EEE E Ro = - do o o e a Ss 8 s 8 s a 8 9% "OESIONUOO

EEE aAd344944d9494H4HH4 Aadddosdo O 6 lsssesros ns |ETFFZXT « É FiTtiviTi AQ asbinbos

EC UOAL NL A E =ÁAHBA<COEO a [ETTETTIS õ aIsdIddgaaa

O & | & lorTtitar v Oo

H É no Ê s v & o “ [ - o” vm “

É . Ê À o S z o

E o

UU . = o 3 2 F) . = 7 u " EL o o ã E 4 x bh h ro ii o 4 Pr ú es : gs no a o o " yw Bs. À & ) ON º ú S ) a > a - NS É â, õ o $ = o A o o o o o o à 8 É 2 z % “OESIJOAUOI

: AARISSSAS

HHHHASSOS o ERRRRHRAA

SAS gg [eSss2aDO " o à lg3228B 228 3 ESTREITAR do evdivTTTT É [LDL ZDLLOS 3 22222222

A VTTITITTITA o ASSIS AAIIAIA o a PPTTIRAIA o

É E s o np q oem Q s DvD o "o 3 ã s d & s o

H o . 8 — o = " > - a SN o a q ç 4 & 5 le) Um 2 à s = ; " a o o vv

S

2. À b x º 8 8 > a vo

É Í em AN 8 EQ Y

E NS é ——— = $ >. o 8 3 8 : & º 8 " U 9% 'OESISAUOO o S——— Ss lovossdso & RTSERSSO & ABdAsAdA à |24428S98 - É Daba3ssE o HE 4 [EEFTITETO ASAdnAdoA o DA aa aaa

BABADO DO - g8 |dfEZE2S22 o CETME TTTA a dessa ada

E É fontodart

N o ? o " 8 8 4 E q

À 8 7 o â x ; r on ; 2 2 n õ : a o > Ss & o uu « = E à a 8 e b 5 - À XY ê + 2 o 8 Ss

à " Í á á n na 7 $ S ”

HH bh n — > à o - & = o = +. un — << O o o o o o o o o 8 8 8 es & E = o & 9% 'OESI/OAUOO Za ns

UV a TTSSEARS

É STR AROO ú AAAnAIGHAOA jnIc0888 e |brvvupOO v |ERSSEXSAE + VIT TTAA & lnpanvTs ê H NAU 2 SS GAS S222 - o AAA a AA A u ASIsAadaio o a [PRAIA ã b o

N É o o Rs 5 E | o õ 7 o . à | s : 4 Í

HÁ t a í

D z Ri Ô . “ a E e o "o o 2 o dd m o | 4 õ te o PF

E Pp

EG z a â =) t = à 2

F AVE

O À o À " Ô li H =—=

S or a TEA s E O o =) o o o e o n o E e Ss s 8 As o & 9% 'OBSIBAUOO m

É > o

À )

ms Om o CUnHH o HÁAHHH & |8a8id = ENSSSE=E) . À 22228 E gg o EE

TIA . é Fest q |Sébss

É TESTA "| “sSnoo s & lnodtt

É 8 o o P = 4 q Q 7

H 8 É e , =

Ú »v 2 * 9 o o s * 2 2 q Pe E

A - A o Dá 2a 2 | ?X õ 8 ê A o 4 Ss

HÁ , o a fo v H 8 vp o o O. o nd Rh o E FE Naa. N õ À Es) 4 o 4 É o o o F) o o gs s s s si ? « o 9/, "OBSIOAUOO

U q us A — q GRIHBARAR & DATA RT . o AAdAàdasA o Se2d420888 o : : "o Fec2TAhE

FITITVIVA ' 8 ABdAaAAAS o SERA SSDOS 4 gd NESTISAS ú Aaaaádão

U 2 lntigart Fi Ê 8 7 o q q

Y - 58 | v s = 7 s ' | a â e í - a o : : :; a É 2 = E o à Í o & 4 i. E N So Es Y Fr F v o 8 q

D A 2 = f- 7 â o , o 8 d > y à o CF LIDO Es) es o E =D & Cr O o A eo o - e o o vw Ss se Ss Ss a a 9% “OESISALOO o 5 z >

A o a = a so es : 3 |âã 8 |8ã o vo = g> 3 E 7 les o no 8 ' 8 v ao o 8 lt z É 8

A

N o o = o o " = o T =

HH 8 â

H Q =) = 3 = « 2 ec . = 6 2 A o u : o 5 = rr 7 À SE. + v =

Q ; 4 o É Se : à n o o ” nv

D s o

O & B 2 S 3 2 "v o o es = ss n 4 8 9% “OESIONUOO s v m “o >

E ns v

= o Oo FE) a ns = A T ds À E) no | ad e as E = 7 no ; ê g& z Ss 8 às " às s o == (2) = 33 [=] - : ae 8 2º E é & & 2 Tr 8 e É ss o s tt 7 3 Hu ao Ss e 7 4 ce 8a ; = o ' o o

É E 8 £ o à Fr à s 7 & é 2 Sã Hs

S > Ko = Ê 2 á = ns

H

S

HH o o so a Fo A “o o o o o o o u Ss E) Ê s Ss õ a 9% OBSISAUOT

E o o

E o m o >

A

À

U

” “

E s sn o [o vo 2? 8888 o Ecccco v sSss ão ss555 ' o É EEE “o 2 28868

CN TFRTATATGA vo NERVOS ' ao O sSidâsdoãâeo p se2sed2e2ce e So Devoeucore o Soso2oaso dE AnMAnaaoas o TATA AO go ESESEIEA = HEMNESNEOEZ TE TETETO " az AAA AAaa s az 2 CERA RAS, o o a ro 2 o 7 D o » o Ss = p í o . 2 o

É -| o º 2

PN B >? s nº To v ass << R « 27 E go as 2 E » 2 o 5 o =p 8 Pr - > 2 = 8 A 1 o às

A nn o v un ao . $a s Bo Bo 4 E o * “ o o s 3 º ps FIFA II INI II EIA à nn o o o o o o o o e so o s Ss & 7 9% 'OBSIGNUOO + sa go Pv à 2% So co E [3 o g E >A 2 FR Oo à o

Í s s CR - vo o? 8888 vo sSss z E555 ã . FE 2 5555 õ TFiTITATA o HHHHHHHH Pv o AABABIAA a SESSSSSS - & Ss PAPHOUPOS go iiieddis ve NS nadS = 8 RELLLEAS

E FENERITA Ts SARA LADE s 2 3 TA CERALEADA) 4 8

É 2 3 . go =» 2 na 2 o - a dã o º 7% ao E 8 z a Es e . aT7 E gq as “Aq a L * 2 2 o E Ko o = 2 e RO o - 7 = 8 a s

E

E na as n so dB x ss a É So É o - à o o Ta 8 s = q & EE o % s 9% 'OESISAUOO na v à 2 So co E o o qo & E 2 4 Oo 6 o â 8 a 888 & o ESSES ? 2 E ESS : 5555 % 4 TCC TFT 2022 E : ARARANAR | s ha nHOos ” ddssssds x a. a 4 LUAS g ISS SSSSA = Y ” DERTTTRO i mo nu ES 842: : : METENATA E. verita a ro a28 o 2 25% n 9 | ES) Ts | : Ts

AA 2 : E nã | : : Í : o! | cs :$ : : 2 LL : do E TE | E i SA | | & d B 3 | i id go 7

E o ” A 7 4 À 1 a

H FS há O 3 3 DO o | ' 3 e E TEA cs 8 s : g + s s 2 à & 1 7 B n o 8 8 ' Í /AnUO: : é % “OESISALCI vs a a 3 8

É 255 > mn £ o E o

FE 2 O «à o o

Es ns 4 se us. Es

FT o =” 77 ú ss à Es * as o ft? ê ã

É S õ

E o o z o 4 Ss â o Hm Ls . E > Pp u D o 2 &

E E o 8 FS ê õ = r > o Ss v 8 - ns = 8 <

E D nº 8 = = v o

T 2 e - Ss - Ss 8 8 s s & 9% “OESISAUOO

A o TER . D lRFATaTA s HHHHHH & Jadadas & |Ad338a 7 o 2 QD 490 v l242228 238 H6XZA 2 Jada dds é |PTPVTT

É OU HOD UU 4 lg 2252 N wHERZIAZ S hahaha o

E & lototit

Ú = 3 4H - 8 â o

D v Ss = 9 Do = 4 o : s = O x

A - Hs sg cn pb - o 2 a à E : 8 â e . &

A nn o . S = a & - Ex o on o o

E

O z o A o o o o o o a 3 3 s SR 2 8 9% “OESISAUOO