BR9712761B1

BR9712761B1 - mÉtodo para a produÇço de 1,3- propanodiol e microorganismo hospedeiro transformado.

Info

Publication number: BR9712761B1
Application number: BRPI9712761-2A
Authority: BR
Inventors: Anthony Arthur Gatenby; Sharon Loretta Haynie; Vasantha Nagarajan; Ramesh V Nair; Charles E Nakamura; Mark Scott Payne; Stephen Kenneth Picataggio; Maria Dias-Torres; Amy Kuang-Hua Hsu; Richard D Lareau; Donald E Trimbur; Gregory M Whited
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-10
Publication date: 2010-02-23
Also published as: EP0946732B1; ZA9710194B; BR9714313B1; EP0942989B1; JP2001503636A; DE69736070T2; EP0946732A2; IL129722A0; ATE452979T1; US6953684B2; ES2336858T3; AU5507698A; NZ335392A; US6013494A; CN1198935C; DE69736070D1; ATE329034T1; CN1239511A; AU733534B2; ID21487A

Description

"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL EMICROORGANISMO HOSPEDEIRO TRANSFORMADO"

Campo da Invenção

A presente invenção diz a respeito ao campo da biologiamolecular e ao uso de organismos recombinantes para a produção decompostos desejados. Mais especificamente, ela descreve a expressão de genesclonados para glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase(C3P fosfatase), glicerol desidratase (dhaB), e 1,3-propanodiol oxidoreductase(dhaT), seja separada ou conjuntamente, para a produção aperfeiçoada de 1,3-propanodiol.

Antecedentes da Invenção

O 1,3-propanodiol é um monômero que tem uma utilidade potencialna produção de fibras de poliéster e na manufatura de poliuretanos e compostoscíclicos.

É conhecida uma grande variedade de modos de se chegar ao 1,3-propanodiol. Por exemplo, o óxido de etileno pode ser convertido em 1,3-propanodiol sobre um catalisador na presença de fosfina, água, monóxido decarbono, hidrogênio e um ácido, pela hidratação da fase de solução catalítica daacroleína, seguido por redução, ou a partir de hidrocarbonetos como glicerol,feito reagir na presença de monóxido de carbono e hidrogênio sobrecatalisadores, contendo átomos do grupo VIII da tabela periódica. Embora sejapossível gerar 1,3-propanodiol por estes métodos, eles são caros e produzemresíduos eliminados pelas vias de eliminação de detritos, contendo poluentespara o meio ambiente.

Já se conhece há mais de um século que 1,3-propanodiol podeser produzido através da fermentação de glicerol. Foram encontradaslinhagens de bactérias capazes de produzir 1,3-propanodiol, por exemplo nosgrupos Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella,Lactobacillus e Pelobacter. Em cada um dos casos estudados, o glicerol éconvertido em 1,3-propanodiol em uma seqüência de reação de duas fasescatalisadas por enzimas. Na primeira fase, uma desidratase catalisa aconversão de glicerol em 3-hidroxipropionaldeído (3-HP) e água (Equação 1).

Na segunda fase, o 3-HP é reduzido a 1,3-propanodiol por umaoxidoreductase ligada por um NAD+ (Equação 2).Glicerol 3-HP + H2O (Equação 1)

3-HP + NADH + H+ -> 1,3-propanodiol + NAD+ (Equação 2)

O 1,3-propanodiol não é metabolizado adicionalmente, econseqüentemente acumula-se a alta concentração no meio. A totalidade dareação consome um equivalente de redução na forma de um co-fator,dinucleotídeo de adenina de β-nicotinamida reduzido (NADH), que éoxidado resultando em dinucleotídeo de adenina de nicotinamida(NAD+).

A produção de 1,3-propanodiol a partir de glicerol é geralmenterealizada em condições anaeróbicas usando glicerol como a única fonte decarbono e na ausência de outros aceptores exógenos de reduçãoequivalentes. Sob estas condições, por exemplo, em linhagens de Citrobaeter,Clostridium e Klebsiella, uma via paralela para se chegar ao glicerol consisteem que primeiramente envolve oxidação de glicerol resultando emdihidroxiacetona (DHA) por uma glicerol desidrogenase ligada a NAD+ ou(NADP+) (Equação 3). A DHA, após a fosforilação resultando em fosfato dedihidroxiacetona (DHAP) por uma quinase DHA (Equação 4), torna-sedisponível para a biossíntese para servir de apoio a uma geração de ATPatravés de, por exemplo, glicólise.

Glicerol + NAD+ DHA + NADH + H+ (Equação 3)

DHA +ATP DHAP + ADP (Equação 4)

Ao contrário do que ocorre com a seqüência para se chegar ao1,3-propanodiol, esta seqüência pode fornecer carbono 9 energia à célula, eproduz NADH ao invés de consumi-la.

Na Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii, os genes quecodificam as atividades funcionalmente ligadas da glicerol desidratase(dhaB), a 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT), a glicerol desidrogenase0dhaD), e a quinase de dihidroxiacetona (dhaK) são abrangidas pelo regulondha. Os regulons de dha da Citrobacter e da Klebsiella, foram expressadosna Escheriehia eoli e se demonstrou que convertem glicerol em 1,3-propanodiol.

Já são conhecidos processos biológicos para a preparação deglicerol. A esmagadora maioria de produtores de glicerol são constituídospelas leveduras, ainda que algumas bactérias, outros fungos e algas, tambémsão produtores de glicerol. Tanto as bactérias quanto as leveduras produzemglicerol convertendo glicose ou outros carboidratos mediante a seqüência dereações de frutose-l,6-bifosfato em glicólise ou pela seqüência de reações deEmbden Meyerhof Parnas, ao passo que determinadas algas convertemdióxido de carbono dissolvido ou bicarbonato nos cloroplastos emintermediários de 3 carbonos do ciclo de Calvin. Em uma série de etapas, oácido fosfoglicérico, intermediário de 3-carbono, é convertido emgliceraldeído 3-fosfato que pode ser imediatamente interconvertido em seufosfato de dihidroxiacetona de queto-isômero e finalmente em glicerol.

Em especial, a bactéria Bacillus lieheniformis e a Lactobacilluslyeopersiea sintetizam glicerol, e a produção de glicerol é encontrada nasalgas halotolerantes Dunaliella sp. e Asteromonas graeilis para proteçãocontra elevadas concentrações externas de sal (Ben-Amotz et al., Experientia38, 49-52, (1982)). De modo semelhante, várias leveduras osmotolerantessintetizam glicerol como medida de proteção. A maior parte das linhagens deSaccharomyees produz alguma quantidade de glicerol durante a fermentaçãoalcoólica, e isto pode ser aumentado fisiologicamente mediante a aplicaçãode pressão osmótica (Albertyn et al., Mol. Cell Biol 14, 4135-4144 (1994)).No início deste século conseguiu-se a produção comercial de glicerol pelo usode culturas de Saccharomyces, às quais eram adicionados "reagentes deorientação" tais como sulfitos ou álcalis. Mediante a formação de umcomplexo inativo, os agentes de orientação bloqueiam ou inibem a conversãode acetaldeído e etanol; dessa forma, equivalentes redutores em excesso(NADH) tornam-se disponíveis ou "orientados" em direção ao DHAP para aredução, resultando em glicerol. Esse método é limitado pela inibição parcialde crescimento de leveduras que se deve aos sulfitos. Esta limitação pode serparcialmente resolvida pelo uso de álcalis que criam excesso de equivalentesde NADH através de um mecanismo diferente. Nesta prática, os álcalisiniciam uma reação de desproporcionamento de Cannizarro para forneceretanol e ácido acético a partir de dois equivalentes de acetaldeído.

O gene que codifica glicerol 3-fosfato desidrogenase (DARl,GPD1) foi clonado e seqüenciado a partir de S. diastatieus (Wang. Et al., J.Baet. 176, 7091-7095, (1994)). O gene DARl foi clonado em um vetor e usadopara transformar a E.eoli, onde a expressão produziu enzimas ativas. Wang.Et al. (supra) reconhece que o DARl é regulado pelo meio osmòtico celularmas não sugere como o gene poderia ser usado para aperfeiçoar a produçãode 1,3-propanodiol em um organismo recombinante.

Outras enzimas de glicerol 3-fosfato desidrogenase foramisoladas: por exemplo sn-glicerol-3-fosfato desidrogenase foi clonada eseqüenciada a partir de S. eerevisiae ( Larason et al., Mol. Mierobiol 10,1101, (1993)) e Albertyn et al., {Mol Cell Biol 14, 4135, (1994)) ensina aclonagem de GPDl que codifica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase a partirde S. eerevisiae. Tal como Wang et al., (supra), tanto Albertyn et al. quantoLarason et al., reconhecem a osmo-sensibilidade da regulação deste genemas não sugerem como o gene poderia ser usado na produção de 1,3-propanodiol em um organismo recombinante.

Da mesma forma como com G3PDH, a glicerol-3-fosfatase foiisolada de Saccharomyces eerevisiae e a proteína foi identificada como sendocodificada pelos genes GPPl e GPP2 (Norbeck et. al., J. Biol. Chem. 271,13875, (1996)). Da mesma forma que os genes que codificam a G3PDH,parece que o GPP2 é osmo-sensível.

Embora os métodos de produção biológicos tanto do glicerolcomo de 1,3-propanodiol sejam conhecidos, nunca se demonstrou que atotalidade do processo possa ser feita por um único organismo recombinante.

Nem os métodos químicos nem os biológicos descritos acimapara a produção de 1,3-propanodiol, estão bem adaptados para a produçãoem escala industrial, uma vez que os processos químicos requerem altosníveis de energia, e os processos biológicos requerem o caro material inicial,glicerol. Precisa-se de um método que requeira uma baixa carga e ummaterial inicial que não seja caro. Um processo mais desejável deveriaincorporar um microorganismo que tivesse a capacidade de converter fontesbásicas de carbono, tais como carboidratos ou açúcares, no produto final 1,3-propanodiol.

Embora seja desejável uma conversão de organismo único defonte de carbono fermentável que não seja glicerol nem dihidroxiacetona em1,3-propanodiol, foi documentado que há dificuldades significativas a seremvencidas em um empreendimento desses. Por exemplo Gottschalk et al., (EP373 230) ensina que o crescimento da maior parte das linhagens úteis para aprodução de 1,3-propanodiol, inclusive a Citrobacter freundii, Clostridiumautobutylieum, Clostridium butylieum e a Klebsiella pneumoniae, éprejudicado pela presença de um doador de hidrogênio, tal como a frutose ouglicose. As linhagens de Lactobacillus brevis e Lactobacillus buehner, queproduzem 1,3-propanodiol em co-fermentações de glicefõl e frutose ouglicose, não crescem quando se fornece glicerol como a única fonte decarbono e, embora tenha sido demonstrado que células inertes podemmetabolizar a glicose ou frutose, elas não produzem 1,3-propanodiol (Veigada Cunha et al., J. Bacteriol 174, 1013 (1992)). De modo semelhante foidemonstrado que uma linhagem de Ilyobaeter polytropus, que produz 1,3-propanodiol quando se fornece glicerol e acetato, não irá produzir 1,3-propanodiol a partir de substratos de carbono que não sejam glicerol, nemsequer frutose e glicose (Steib et al., Areh. Microbiol. 140, 139 (1984)).

Finalmente Tong et al., (Appl. Bioehem. Bioteeh. 34, 149 (1992)) ensinou quea Eseherichia eoli recombinante transformada com o regulon de dha quecodifica a glicerol desidratase não produz 1,3-propanodiol tanto a partir deglicose como de xilose na ausência de glicerol exògeno.

Foram relatadas tentativas para melhorar o rendimento de 1,3-propanodiol a partir de glicerol, em que os co-substratos capazes de fornecerequivalentes de redução, tipicamente açúcares fermentáveis, estão incluídosno processo. As melhorias no rendimento foram atribuídas às células inertesde Citrobacter freundii e a Klebsiella pneumoniae DSM 4270 co-fermentando glicerol e glicose (Gottschalk et al., supra., e Tran-Dinh et al.,DE 3734 764); mas não foram atribuídas às células em crescimento deKlebsiella pneumoniae ATCC 25955 co-fermentando glicerol e glicose, quenão produziram nenhum 1,3-propanodiol ( I-T Tong, Teses de Doutorado,Universidade de Wisconsin-Madison (1992)). As melhoras nos rendimentosforam atribuídas à co-fermentação de glicerol e glicose ou frutose por umaEscheriehia eoli recombinante; contudo não se produziu nenhum 1,3-propanodiol na ausência de glicerol (Tong et al., supra.). Nestes sistemas,organismos simples buscam carboidratos como fonte de geração de NADH aomesmo tempo em que fornece energia e carbono para a manutenção oucrescimento da célula. Estas revelações sugerem que os açúcares não entramna linhagem de carbono que produz o 1,3-propanodiol. Em nenhum caso o1,3-propanodiol é produzido na ausência de uma fonte exógena de glicerol.Desta forma a literatura claramente sugere, com sua autoridade, que aprodução de 1,3-propanodiol a partir de uma fonte de carboidrato por umúnico organismo não é possível.

O problema a ser resolvido pela presente invenção, é aprodução biológica de 1,3-propanodiol por um único organismo recombinantea partir de um substrato de carbono que não seja caro, tal como a glicose ououtros açúcares. A produção biológica de 1,3-propanodiol requer o glicerolcomo substrato para uma reação seqüencial de duas fases em que a enzimadesidratase (tipicamente uma co-enzima desidratase dependente de B12)converte glicerol em um 3-hidroxipropionaldeido intermediário, que é entãoreduzido a 1,3-propanodiol por uma oxidoreductase dependente de NADH(ou NADPH). A complexidade dos requisitos de co-fator necessita do uso deum catalisador de célula inteira para um processo industrial que utiliza estaseqüência de reação para a produção de 1,3-propanodiol. Além disso, demodo a tornar o processo economicamente viável, precisa-se de umamatéria-prima menos cara que o glicerol ou a dihidroxiacetona. A glicose eoutros carboidratos são substratos apropriados, mas conforme discutidoacima, são conhecidos por interferir na produção de 1,3-propanodiol. Emresultado disso, ainda não se demonstrou nenhum organismo que convertasozinho a glicose em 1,3-propanodiol.

As requerentes solucionaram o problema apresentado, e apresente invenção proporciona a bioconversão de uma fonte de carbonofermentável diretamente em 1,3-propanodiol, usando um único organismorecombinante. A glicose é usada como um substrato modelo e a bioconversãose aplica a qualquer microorganismo existente. Os microorganismos queaceitam os genes que codificam a glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH),glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase), glicerol desidratase (dhaB), e 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT), são capazes de converter glicose e outrosaçúcares através do processo de degradação de glicerol em 1,3-propanodiolcom bons rendimentos e seleções. Além disso, a presente invenção pode seraplicada de modo geral para incluir qualquer substrato de carbono a serimediatamente convertido em 1) glicerol; 2) dihidroxiacetona; ou 3)compostos C3 no estado de oxidação de glicerol (por exemplo, glicerol-3-fosfato) ou 4) compostos C3 no estado de oxidação da dihidroxiacetona (porexemplo, fosfato de dihidroxiacetona ou 3-fosfato de gliceraldeído).

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção fornece um método para a produção de1,3-propanodiol a partir de um organismo recombinante que compreende:

(i) transformar um organismo hospedeiro apropriado comcassete de transformação compreendendo pelo menos um dos seguintes: (a)um gene que codifica uma atividade de glicerol-3-fosfatodesidrogenase; (b)um gene que codifica uma atividade de glicerol-3-fosfatase; (c) genes quecodificam uma atividade de desidratase; e (d) um gene que codifica umaatividade de 1,3-propanodiol oxidoreductase, ficando ressalvado que se ocassete de transformação compreende menos do que todos os genes de (a)-(d), então o organismo hospedeiro apropriado compreende genes endógenosmediante os quais o organismo hospedeiro transformado resultantecompreende pelo menos um de cada dos genes de (a)-(d);

(ii) cultivar o organismo hospedeiro transformado sob condiçõesapropriadas na presença de pelo menos uma fonte de carbono selecionada dogrupo, que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, ouum substrato de um carbono, mediante o qual se produz 1,3-propanodiol; e

(iii) recuperar o 1,3-propanodiol.A presente invenção fornece ainda hospedeiros transformadosque compreendem cassetes de expressão capazes de expressar atividadesglicerol-3-fosfato desidrogenase, glicerol-3-fosfatase, glicerol desidratase e1,3-propanodiol oxidoreductase para a produção de 1,3-propanodiol.

O organismo hospedeiro apropriado que é usado no método, éselecionado do grupo que consiste de bactérias, leveduras e fungosfilamentosos. O organismo hospedeiro apropriado é mais particularmenteselecionado do grupo de gêneros que consistem em Citrobacter, Enterobaeter,Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus,Saccharomyees, Sehizosaecharomyees, Zygosaceharomyees, Piehia.Kluyveromyces, Candida, Hansenulai Debaryomyees, Mueor, Torulopsis,Methy lobaeter, Eseheriehia, Salmonella, Baeillus, Streptomyees ePseudomonas. Mais particularmente o organismo hospedeiro apropriado éselecionado do grupo que consiste de E.eoli, Klebsiella spp. Organismoshospedeiros transformados específicos utilizados no método são: 1)Saccharomyees spp. transformada com um cassete de transformação quecompreende os genes dhaBl, dhaB2, dhaB3 e dhaT, em que os genes sãoestavelmente integrados no genoma Saceharomyces spp.; e 2) Klebsiella spp.transformada com um cassete de transformação que compreende os genesGPDl e GPD2;

A fonte de carbono preferida da presente invenção é glicose.

O método ainda utiliza o gene codificando uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase, selecionada do grupo que consiste de genescorrespondentes às seqüências de aminoácidos fornecidas na Identificaçãode Seqüência Nq 11, Identificação de Seqüência Ns 12 e na Identificação deSeqüência Na 13, as seqüências de aminoácidos que incluem substituições,deleções ou adições de aminoácidos, que não alteram a função da enzimaglicerol-3-fosfato desidrogenase. O método utiliza o gene codificando umaenzima glicerol-3-fosfatase, selecionada do grupo que consiste de genescorrespondentes às seqüências de aminoácidos dadas na Identificação de

Seqüência Na33 e na Identificação de Seqüência Ns 17, as seqüências deaminoácidos que incluem substituições, deleções ou adições de aminoácidos,que não alteram a função da enzima de glicerol-3-fosfatase. O métodotambém utiliza o gene codificando uma enzima de quinase de glicerol, quecorresponde a uma seqüência de aminoácidos fornecida na Identificação deSeqüência Na 18, a seqüência de aminoácidos que inclui substituições,deleções ou adições de aminoácidos, que não alteram a função da enzima dequinase de glicerol. O método também utiliza os genes codificando umaenzima desidratase que compreende dhaBl, dhaB2 e dhaB3, de genescorrespondentes respectivamente às seqüências de aminoácidos fornecidasna Identificação de Seqüência Na 34, Identificação de Seqüência Na 35,Identificação de Seqüência Na 36, as seqüências de aminoácidos que incluemsubstituições, deleções ou adições de aminoácidos, que não alteram a funçãoda enzima de desidratase. O método também utiliza um gene que codificauma enzima 1,3-propanodiol oxidoreductase que corresponde a umaseqüência de aminoácidos fornecida na Identificação de Seqüência Na 37, aseqüência de aminoácidos que inclui substituições, deleções ou adições deaminoácidos, que não alteram a função da 1,3-propanodiol oxidoreductase.

A presente invenção é também realizada em uma célulahospedeira transformada que compreende:

(a) um grupo de genes que inclui:

(1) um gene que codifica uma enzima de glicerol-3-fosfatodesidrogenase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naIdentificação de Seqüência Na 11;

(2) um gene que codifica uma enzima de glicerol-3-fosfatasecorrespondente à seqüência de aminoácidos fornecida na Identificação deSeqüência Ng 17;

(3) um gene que codifica uma subunidade da enzima de gliceroldesidratase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naIdentificação de Seqüência Na 34;

(4) um gene que codifica a subunidade β da enzima de gliceroldesidratase correspondente a seqüência de aminoácidos fornecida naIdentificação de Seqüência Na 35;

(5) um gene que codifica a subunidade γ da enzima de gliceroldesidratase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naIdentificação de Seqüência N2 36; e

(6) um gene que codifica a enzima de 1,3-propanodioloxidoreductase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naIdentificação de Seqüência Na 37,

as respectivas seqüências de aminoácidos de (a) (l)-(6) incluindosubstituições, deleções ou adições de aminoácidos, que não alteram a funçãoda enzimas de genes (l)-(6), e

(b) Uma célula hospedeira transformada com o grupo de genesde (a), pelos quais a célula hospedeira transformada produz 1,3-propanodiolcom base em pelo menos um substrato selecionado do grupo que consiste demonossacarídeos, oligossacarídeos, e polissacarídeos ou de um substrato deum carbono.

Breve Descrição dos Depósitos Biológicos ε Listagem deSeqüência

A E. coli W2042 transformada (que compreende o hospedeirode E.coli W1485 e os plasmídeos pDT20 e pAH42) contendo os genes quecodificam glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase(G3P fosfatase), glicerol desidratase (dhaB) e 1,3-propanodioloxidoreductase (dhaT), foi depositada em 26 de setembro de 1996 no ATCCsob os termos do Tratado de Budapeste sobre o ReconhecimentoInternacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimentode Patente, e é denominada de ATCC 98188.

A S. cerevisiae YPH500 que recebe plasmídeos pMCKlOpMCKl7, pMCK30, pMCK35, contendo genes que codificam glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase),glicerol desidratase (dhaB) e 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT), foidepositada em 26 de setembro de 1996 no ATCC sob os termos do Tratadode Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para Fins de Procedimento de Patente, e é denominada deATCC 74392.

"ATCC" refere-se ao centro depositário internacional AmericanType Culture Collection, com endereço em 12301 Parklawn Drive, Rockville,MD 20852 E.U.A. As denominações se referem ao número de acesso domaterial depositado.

As requerentes forneceram 49 seqüências de acordo com asRegras para a Representação Padrão de Seqüências de Nucleotídeos eAminoácidos em Pedidos de Patentes (Anexos I e II à Decisão do Presidenteda EPO, publicada no Suplemento N5 2 do OJ EPO, de dezembro de 1992) ecom 37 C.F.R. 1.821-1.825 e os Apêndices AeB (Requisitos para Descriçõesde Pedidos de Patente Contendo Seqüências de Nucleotídeos e/oAminoácidos).

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção diz respeito a um método para a produçãobiológica de 1,3-propanodiol a partir de uma fonte de carbono fermentávelem um único organismo recombinante. O método incorpora ummicroorganismo contendo genes que purificam glicerol-3-fosfatodesidrogenase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase), gliceroldesidratase (dhaB) e 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT). Omicroorganismo recombinante é contatado com um substrato de carbono, e o1,3-propanodiol é isolado do meio de crescimento.

O presente método fornece uma fonte de monômero de 1,3-propanodiol, que é rápida, barata e ambientalmente segura, útil na produçãode poliésteres e outros polímeros.

As seguintes definições devem ser usadas para interpretar asreivindicações e o relatório descritivo.

Os termos "glicerol desidratase" ou "enzima de desidratase" sereferem a polipeptídio ou polipeptídios, responsáveis por uma atividadeenzimática que é capaz de isomerizar ou converter uma molécula de glicerolno produto 3-hidroxipropionaldeído. Para efeitos da presente invenção, asenzimas de desidratase incluem uma glicerol desidratase (GenBank U30903)e a diol desidratase (GenBank D45071) que tem substratos preferidos deglicerol e 1,2-propanodiol, respectivamente. A glicerol desidratase de K.pneumoniae ATCC 25955 é codificada pelos genes dhaBl, dhaB2, e dhaB3,identificados como Identificações de Seqüência N2 1,2 e 3, respectivamente.

Os genes dhaBl, dhaB2, e dhaB3, codificam as subunidades α, β e γ daenzima glicerol desidratase, respectivamente.

Os termos "oxidoreductase" ou "1,3-propanodioloxidoreductase" se referem ao polipeptídio ou polipeptídios responsáveispela atividade de uma enzima que é capaz de catalisar a redução de 3-hidroxipropionaldeído em 1,3-propanodiol. A enzima 1,3-propanodioloxidoreductase inclui, por exemplo, o polipeptídio codificado pelo gene dhaT(GenBank U09771, U30903) e é identificada como Identificação deSeqüência N2 4.

Os termos "glicerol-3-fosfato desidrogenase" ou "G3PDH"referem-se ao polipeptídio ou polipeptídios responsáveis pela atividade deuma enzima que é capaz de catalisar a conversão do fosfato dedihidroxiacetona (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P). G3DPH in vivo, podeser dependente de NADH, NADPH, ou FAD. Exemplos desta atividadeenzimática incluem os seguintes: Enzimas NADH dependentes (ECl.1.1.8)são codificadas por vários genes inclusive GPDl (GenBank Z74071x2) ouGPD2 (GenBank Z35169xl) ou GPD3 (GenBank G984182) ou DARl(GenBank Z74071x2); uma enzima dependente de NADPH (EC 1.1.1.94) écodificada por gpsA (GenBank U32164, G466746 (cds. 197911-196892), eL45246); e enzimas dependentes de FAD (ECl. 1.99.5) são codificadas porGUT2 (GenBank Z47047x23) ou glpD (GenBank G147838) ou glpABC(GenBank M20938).

Os termos "glicerol-3-fosfatase" ou "sn-glicerol-3-fosfatase" ou"d.l glicerol fosfatase" ou "G3P fosfatase" se referem ao polipeptídio oupolipeptídios responsáveis por uma atividade enzimática que é capaz decatalisar a conversão de glicerol-3-fosfato em glicerol. A G3P fosfataseinclui, por exemplo, os polipeptídios codificados por GPPl (GenBankZ47047xl25) ou GPP2 (GenBank Ul8813xll).

O termo "glicerol quinase" se refere ao polipeptídio oupolipeptídios responsáveis por uma atividade enzimática que é capaz decatalisar a conversão de glicerol em glicerol-3-fosfato ou glicerol-3-fosfato emglicerol, dependendo das condições da reação. A glicerol quinase inclui, porexemplo, o polipeptídio codificado por GUTl (GenBank Ul 1583x19).

Os termos "GPDl", "DARI", "OSGl", "D2830", e "YDL022W",serão usados de modo intercambiado e referem-se a um gene que codificauma glicerol-3-fosfatase desidrogenase citosólica, caraterizada pelaseqüência de base fornecida na Identificação de Seqüência Na 5.

O termo "GPD2" refere-se a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfato desidrogenase citosólica e caracterizada pela seqüência de basefornecida na Id. Seq. n2 6.

Os termos "GUT2" e "YIL155C" são utilizados de um modointercambiado e referem-se a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfatodesidrogenase mitocondrial e caracterizada pela seqüência de base fornecidana Id. Seq. n2 7.

Os termos "GPPl", "RHR2" e "YIL053W" são utilizados de ummodo intercambiado e referem-se a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfatase citosólica e caracterizada pela seqüência de base fornecida na Id.Seq. n2 8.

Os termos "GPP2", "H0R2" e "YER062C" são utilizados de ummodo intercambiado e referem-se a um gene que codifica uma glicerol-3-fosfatase citosólica e caracterizada pela seqüência de base fornecida na Id.Seq. n2 9.

O termo "GUTl" refere-se a um gene que codifica uma glicerolquinase citosólica e é caracterizada pela seqüência de base fornecida na Id.Seq. n2 10.

Os termos "função" ou "função enzimática" referem-se àatividade catalítica de uma enzima ao alterar a energia necessária pararealizar uma reação química específica. Entende-se que uma atividadedessas pode se aplicar a uma reação em equilíbrio onde a produção tanto doproduto quanto do substrato pode ser realizada sob condições adequadas.

Os termos "polipeptídio" e "proteína" são utilizados de modoalternado.

Os termos "substrato de carbono" e "fonte de carbono" referem-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada por organismoshospedeiros da presente invenção e particularmente fontes de carbonoselecionadas do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos,polissacarídeos e substratos de um único carbono ou misturas dos mesmos.Os termos "célula hospedeira" ou "organismo hospedeiro"referem-se a um microorganismo capaz de receber genes estranhos ouheteròlogos e de expressar esses genes para produzir um produto de geneativo.

Os termos "gene estranho", "DNA estranho", "gene heterólogo"e "DNA heterólogo" referem-se ao material genético nativo de um organismoque foi colocado dentro de um organismo hospedeiro por diversos meios.

Os termos "organismo recombinante" e "hospedeirotransformado" referem-se a qualquer organismo que tenha sidotransformado com os genes heteròlogos ou estranhos. Os organismosrecombinantes da presente invenção expressam genes estranhos quecodificam glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) e glicerol-3-fosfatase(G3P-fosfatase), glicerol desidratase (dhaB), e 1,3-propanodioloxidoreductase (dhaT) para a produção de 1,3-propanodiol a partir desubstratos de carbono adequados.

"Gene" se refere a um fragmento de ácido nucléico que expressauma proteína específica, inclusive as seqüências de regulação anteriores (5'não codificadora) e posteriores (3' não codificadora) à região de codificação.Os termos "nativo" e "de tipo natural" referem-se a um gene conforme omesmo é encontrado na natureza com suas próprias seqüências reguladoras.

Os termos "codificador" e "codificação" referem-se ao processopelo qual um gene, mediante os mecanismos de transcrição e tradução,produz uma seqüência de aminoácido. Entende-se que o processo decodificação de uma seqüência de aminoácido específica inclui seqüências deDNA que podem envolver trocas de base que não causam uma mudança noaminoácido codificado, ou que envolve mudanças de base que podem alterarum ou mais aminoácidos, não afetam as propriedades funcionais da proteínacodificada pela seqüência de DNA. Entende-se portanto que a presenteinvenção abrange mais do que seqüências exemplares específicas.Modificações à seqüência tais como deleções, adições ou substituições naseqüência que produzem mudanças imperceptíveis que não afetamsubstancialmente as propriedades funcionais da molécula de proteínaresultante também são contempladas. Por exemplo, a alteração na seqüênciado gene que reflete a degeneração do código genético ou que resulta naprodução de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinadolocal são contemplados. Portanto, um còdon para a alanina de aminoácido,um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codificaoutro resíduo menos hidrofóbico, tal como a glicina, ou um resíduo maishidrofóbico, tal com a valina, a leucina, ou a isoleucina. De um modosemelhante, pode-se esperar que mudanças que resultam na substituição deum resíduo negativamente carregado por outro, tal como ácido aspártico porácido glutâmico, ou um resíduo positivamente carregado por outro, tal comolisina por arginina, produzam um produto biologicamente equivalente.Também não se esperaria que as mudanças em nucleotídeos que resultem naalteração das partes de N e C terminais da molécula de proteína alterem aatividade da proteína. Em alguns casos, pode de fato ser desejado fazermutantes da seqüência, de modo a estudar o efeito da alteração sobre aatividade biológica da proteína. Cada uma das modificações propostas estábem estabelecida dentro da rotina dos técnicos no assunto, do mesmo modoque a determinação de retenção da atividade biológica nos produtoscodificados. Além do mais, o técnico reconhece que as seqüências abrangidaspela presente invenção são também definidas pela sua capacidade dehibridizar sob condições severas (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65a C), com asseqüências aqui exemplificadas.

O termo "expressão" refere-se à transcrição e tradução para umproduto de gene de um gene de codificação para a seqüência do produto dogene.

Os termos "plasmídeo", "vetor", e "cassete" referem-se a umelemento cromossômico extra que freqüentemente transporta genes que nãofazem parte do metabolismo central da célula e habitualmente na forma demoléculas circulares de DNA com duplo filamento. Esses elementos podemser seqüências replicantes de um modo autônomo, seqüências de integraçãocom o genoma, seqüências bacteriòfagas ou nucleotídeos, lineares oucirculares, de um DNA ou RNA de filamento simples ou duplo, derivado dequalquer fonte, em que um certo número de seqüências de nucleotídeo foijuntado ou recombinado em uma única construção que é capaz de introduzirum fragmento de promotor ou de seqüência de DNA para um produto degene selecionado, juntamente com uma seqüência não traduzida 3'apropriada dentro de uma célula. "Cassete de transformação" refere-se a umvetor específico contendo um gene estranho e contendo elementos além dogene estranho que facilitam a transformação de uma célula hospedeiraespecífica. "Cassete de expressão" refere-se a um vetor específico contendoum gene estranho e contendo elementos além do gene estranho quepermitem a expressão aperfeiçoada daquele gene em um hospedeiroestranho.

Os termos "transformação" ou "transfecção" referem-se àaquisição de novos genes em uma célula após a incorporação de ácidonucléico. Os genes adquiridos podem ser integrados em DNA cromossômicosou introduzidos como seqüências replicantes extracromossômicas. O termo"transformante" refere-se ao produto de uma transformação.

O termo "geneticamente alterado" refere-se ao processo demudança de material hereditário mediante transformação ou mutação.Construção de Organismos Recombinantes:

Os organismos recombinantes que contém os genes necessáriosque codificarão a seqüência de reações enzimáticas para a conversão áe umsubstrato de carbono em 1,3-propanodiol podem ser construídos utilizando-se técnicas bem conhecidas na arte. Na presente invenção, os genes quecodificam a glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH), glicerol-3-fosfatase(G3P fosfatase), glicerol desidratase (.dhaB), e 1,3-propanodioloxidoreductase (dhaT) foram isolados de um hospedeiro nativo, tal como aKlebsiella ou a Saccharomyces e utilizados para transformar linhagens dohospedeiro tais como E. eoli DH5oc, ECL707, AA200, ou W1485; a linhagemde Saccharomyees eerevisiae YPH500; ou as linhagens de Klebsiellapneumoniae ATCC 25955 ou ECL 2106.

Isolamento de Genes

Métodos para se obter os genes desejados de um genomabacteriano são comuns e bem conhecidos na arte da biologia molecular. Porexemplo, se a seqüência do gene for conhecida, as bibliotecas genômicasapropriadas podem ser criadas mediante a digestão de endonuclease derestrição e podem ser submetidas à separação com sondas, de um modocomplementar à seqüência de genes desejada. Uma vez que a seqüênciaesteja isolada, o DNA pode ser amplificado utilizando-se métodos deamplificação dirigidos de iniciador padrão, tais como reação de cadeia depolimerase (PCR) (U.S. 4.683.202) para obter quantidades de DNAapropriadas para a transformação utilizando vetores apropriados.

De modo alternativo, as bibliotecas de cosmídeos podem sercriadas onde grandes segmentos de DNA genômico (35-45kb) podem serempacotados em vetores e utilizados para transformar hospedeirosapropriados. Os vetores de cosmídeos são os únicos capazes de acomodargrandes quantidades de DNA. De um modo geral, os vetores de cosmídeostêm pelo menos uma cópia da seqüência de DNA cos que é necessária paraempacotamento e a subseqüente circularização do DNA estranho. Além daseqüência de cos, estes vetores também conterão uma origem de replicaçãotal como ColEl e marcadores resistentes a drogas, tal como um generesistente à ampicilina ou neomicina. Os métodos para a utilização dosvetores de cosmídeos na transformação de hospedeiros bacterianosapropriados são bem descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 22 Edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbon, NY (1989).

Tipicamente para cosmídeos de clone, isola-se e liga-se DNAestranho, utilizando-se endonucleases de restrição apropriadas, adjacentes àregião cos do vetor de cosmídeo. Os vetores de cosmídeos contendo o DNAestranho linearizado é então feito reagir com um veículo de pacote de DNA,tal como o bacteriòfago L Durante o processo de empacotamento, abre-seuma fenda nos locais cos e o DNA estranho é empacotado dentro da parteprincipal da partícula viral bacteriana. Estas partículas são então utilizadaspara transfectar células hospedeiras apropriadas, tais como a de E. coli.Uma vez injetadas na célula, o DNA estranho circula, sob a influência dasextremidades pegajosas cos. Desta forma, grandes segmentos de DNAestranho podem ser introduzidos e expressados em células hospedeirasrecombinantes.

Isolamento e clonagem de genes que codificam glicerol desidratase (dhaB) e1.3-propanodiol oxidoreductase (dhaT)

Os vetores de cosmídeos e métodos de transformação decosmídeos foram utilizados no contexto da presente invenção para clonargrandes segmentos de DNA genômico a partir de gêneros de bactériaconhecidos por possuir genes capazes de processar glicerol resultando em1,3-propanodiol. Especificamente, o DNA genômico de K. pneumoniae ATCC25955 foi isolado por métodos bem conhecidos na arte e digeridos com aenzima de restrição Sau3A para a inserção dentro de um vetor de cosmídeoSupercos 1 e empacotado, utilizando-se extratos de empacotamentoGigapackII. Depois da construção do vetor, células de E. coli XL 1 - Blue MRforam transformadas com o DNA de cosmídeo. Os transformantes foramsubmetidos a separação para verificar a capacidade de converter glicerol em1,3-propanodiol, fazendo-se crescer as células na presença de glicerol eanalisando o meio para a formação de 1,3-propanodiol.

Dois dos transformantes positivos de 1,3-propanodiol foramanalisados e os cosmídeos foram denominados pKPl e pKP2. Oseqüenciamento de DNA revelou uma grande homologia com o gene deglicerol desidratase (dhaB) de C. freundii, demonstrando que estestransformantes continham DNA codificando o gene de glicerol desidratase.Outros transformantes positivos de 1,3-propanodiol foram analisados e oscosmídeos foram denominados pKP4 e pKP5. O seqüenciamento de DNArevelou que estes cosmídeos transportavam DNA codificando um gene dediol desidratase.

Embora a presente invenção utilize os genes isolados de dentrode um cosmídeo de Klebsiella, fontes alternativas de genes de desidrataseincluem, mas não estão limitados aos de Citrobacter, Clostridia, eSalmonella.

Genes que codificam G3PDH e G3P fosfatase

A presente invenção fornece genes apropriados para aexpressão de atividades G3PDH e G3P em uma célula hospedeira.

Os genes que codificam o G3PDH são conhecidos. Por exemplo,GPDl foi isolado da Saccharomyces e tem a seqüência de base fornecida pelaId. Seq. n2 5, codificando a seqüência de aminoácidos fornecida na Id. Seq. n211 (Wang et al., supra). De modo semelhante, a atividade de G3PDHtambém foi isolada da Saccharomyees codificada por GPD2, tendo aseqüência de base fornecida na Id. Seq. n2 6, codificando a seqüência deaminoácidos fornecida na Id. Seq. n2 12 (Eriksson et al., Mol. Microbiol, 17,95 (1995).

Considera-se que qualquer gene que codifique um polipeptídioresponsável por atividades G3PDH é apropriado para as finalidades dapresente invenção, em que esta atividade é capaz de catalisar a conversão defosfato de dihidroxiacetona (DHAP) em glicerol-3-fosfato (G3P). Além disso,considera-se que qualquer gene que codifique a seqüência de aminoácidos deG3PDH conforme fornecido por qualquer uma das Ids. Seqs. números 11, 12,13, 14, 15 e 16, correspondentes aos genes GPD1, GPD2, GUT2, gpsA, glpD,e à subunidade a de glpABC, respectivamente, serão funcionais na presenteinvenção, na medida em que aquela seqüência de aminoácidos abrangesubstituições, deleções ou adições de aminoácidos que não alteram a funçãoda enzima. Será apreciado pelo técnico no assunto que os genes quecodificam G3PDH isolados de outras fontes também sejam apropriados parauso na presente invenção. Por exemplo, os genes isolados de procariotasincluem aquisições de GenBank M34393, M20938, L06231, U12567, L45246,L45323, L45324, L45325, U32164 e U39682; os genes isolados de fungosincluem aquisições de GenBank U30625, U30876 e X56162; genes isoladosde insetos incluem aquisições de GenBank X61223 e X14179; e genesisolados de fontes mamíferas incluem aquisições de GenBank U12424,M25558 e X78593.

Os genes que codificam a G3P fosfatase são conhecidos. Porexemplo, o GPP2 foi isolado da Saccharomyces eerevisiae, e possui aseqüência de base fornecida pela Id. Seq. n2 9 que codifica a seqüência deaminoácidos fornecida na Id. Seq. n2 17 (Norbeck et al., J. Biol. Chem., 271,p. 13875, 1996.)

E considerado que qualquer gene que codifique uma atividadede fosfatase G3P é apropriada para as finalidades da presente invenção, nosentido de que aquela atividade é capaz de catalisar a conversão de glicerol-3-fosfato em glicerol. Além disso, considera-se que qualquer gene quecodifique a seqüência de aminoácidos de G3P fosfatase, conforme fornecidapelas Ids. Seqs. números 33 e 17, serão funcionais na presente invenção, nosentido de que aquela seqüência de aminoácidos abrange substituições,deleções ou adições de aminoácidos que não alteram a função da enzima.Será apreciado pelo técnico no assunto que os genes que codificam a G3Pfosfatase isolados de outras fontes são também apropriados para uso napresente invenção. Por exemplo, a defosforilação de glicerol-3-fosfato paraproduzir glicerol pode ser obtida com uma ou mais das seguintes fosfatasesgenéricas ou específicas: fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) [GenBank M19159,M29663, U02550 ou M33965]; fosfatase ácida (EC 3.1.3.2) [GenBankU51210, U19789, U28658 ou L20566]; ou glicerol-3-fosfatase (EC 3.1.3.-)[GenBank Z38060 ou Ul8813xll]; ou glicose-1-fosfatase (EC 3.1.3.10)[GenBank M33807]; ou glicose-6-fosfatase (EC 3.1.3.9) [GenBank U00445];frutose-l,6-bifosfatase (EC 3.1.3.11) [GenBank X12545 ou J03207] oufosfotidil glicerol-fosfatase fosfatase (EC 3.1.3.27) [GenBank M23546 eM23628].

Genes que codificam a glicerol quinase são conhecidos. Porexemplo, GUTl que codifica a glicerol quinase da Saccharaomyces foi isoladoe seqüenciado (Pavlik et al., Curr. Gent 24, 21, (1993)) e a seqüência de baseé fornecida pela Id. Seq. n2 10 que codifica a seqüência de aminoácido que éfornecida na Id. Seq. n2 18. Será apreciado pelo técnico no assunto queembora a glicerol quinase catalise a degradação de glicerol na natureza, amesma enzima será capaz de funcionar na síntese de glicerol para converterglicerol-3-fosfato em glicerol sob as condições de energia de reaçãoapropriadas. Há provas da produção de glicerol através de uma glicerolquinase. Sob condições anaeróbicas ou de inibição da respiração, aTrypanosoma brucei proporciona o aumento de glicerol na presença deGlicerol-3-P e ADP. A reação ocorre no compartimento de glicossoma (D.Hammond, J. Biol Chem. 260, 15646-15654, (1985)).

Células hospedeiras

Células hospedeiras apropriadas para a produção recombinantede glicerol pela expressão de G3PDH e G3P fosfatase podem ser tantoprocarióticas como eucarióticas, e serão limitadas somente pelas suascapacidades de expressarem enzimas ativas. Hospedeiros preferidos serãoaqueles tipicamente úteis para a produção de glicerol ou 1,3-propanodiol,tais como Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter,Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyees, Schizosaceharomyees,Zygosaeeharomyees, Piehia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula,Debaryomyees, Mueor, Torulopsis, Methylobaeter, Eseheriehia, Salmonella,Baeillus, Streptomyees e Pseudomonas. São mais preferidas na presenteinvenção as espécies de E. eoli, Klebsiellae as espécies de Saceharomyces.

A Adenosil-cobalamina (coenzima B12) é um cofator essencialpara a atividade de glicerol desidratase. A coenzima é o produto natural nãopolimérico mais complexo conhecido, e sua síntese in vivo é direcionadautilizando-se os produtos de aproximadamente 30 genes. A síntese dacoenzima B12 é encontrada em procariotas, alguns dos quais são capazes desintetizar os compostos de novo, enquanto outros podem realizar reaçõesparciais. A E. eoli, por exemplo, não consegue fabricar a estrutura de anel"corrin", mas consegue catalisar a conversão de cobinamida em corrinòide epode introduzir o grupo 5'-desoxiadenosil.

Os eucariotes não são capazes de sintetizar a coenzima B12 denovo e ao invés disso transportam a vitamina B12 do meio extracelular comsubseqüente conversão do composto em sua forma funcional do compostomediante enzimas celulares. Três atividades enzimáticas foram descritaspara esta série de reações:

1) aquacobalamina redutase (EC 1.6.99.8) reduz Co(III) a Co(II);

2) cob(II)alamina redutase (EC 1.6.99.9) reduz Co(II) a Co(I); e

3) cob(I)alamina adenosiltransferase (EC 2.5.1.17) transfereum componente 5'desoxiadenosina a partir de ATP para o corrinóidereduzido. Esta última atividade enzimática é a melhor caracterizada dastrês e é codificada por cobA em S. typhimurium, btuR em E. coli e cobO emP. denitrificans. Estes três genes de cob(I)alamina adenosiltransferaseforam clonados e seqüenciados. A atividade de cob(I)alaminaadenosiltransferase foi detectada em fibroblastos humanos e mitocôndriasde ratos isoladas (Fenton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98,283-9,(1981)). As duas enzimas envolvidas na redução de cobalto são pobrementecaracterizadas e as seqüências de genes não estão disponíveis. Há relatóriosde uma aquacobalamina redutase do Euglena graeilis (Watanabe et al.,Arch. Biochem. Biophys. 305, 421-7, (1993)) e uma cob(III)alamina redutasemicrossômica está presente nas membranas microssômicas e mitocondriaisinternas de fibroblastos de ratos (Pezacka, Biochim. Biophys, Acta, 1157,167-77, (1993)).

Meios de cultura complementares com vitaminas B12 podemsatisfazer as necessidades para se produzir a coenzima B12 para a atividadede glicerol desidratase em muitos microorganismos, mas em alguns casos,atividades catalíticas adicionais podem ter de ser acrescentadas ouaumentadas in vivo. A síntese melhorada da coenzima B12 em eucariotespode ser particularmente desejável. Dadas as seqüências publicadas para osgenes que codificam a cob(I)alamina adenosiltransferase, a clonagem e aexpressão deste gene poderia ser realizada por um técnico no assunto. Porexemplo, considera-se que o levedura, tal como Saccharomyces, pode serconstruído de modo que contenha genes que codifiquem a cob(í)alaminaadenosiltransferase além dos genes necessários para fazer a conversão deum substrato de carbono tal como a glicose em 1,3-propanodiol. A clonageme a expressão dos genes para a redução de cobalto requer uma abordagemdiferente. Esta pode ser baseada em uma seleção em E. coli para ocrescimento em etanolamina como a única fonte de N2. Na presença dacoenzima B12, a etanolamina amônia-liase permite o crescimento de célulasna ausência de outras fontes de N2. Se as células de E. coli contiverem umgene clonado que resulte em cob(I)alamina adenosiltransferase e DNAclonado aleatoriamente a partir de um outro organismo, o crescimento emetanolamina, na presença de aquacobalamina deve ser melhorado eselecionado para no caso em que o DNA clonado aleatório codifique aspropriedades de redução de cobalto para facilitar a adenosilação deaquacobalamina.

Além da E. coli e da Saccharomyces, a Klebsiella é umhospedeiro particularmente preferido. As linhagens de Klebsiellapneumoniae são conhecidas por produzir 1,3-propanodiol quando cultivadasem glicerol como o único carbono. Considera-se que a Klebsiella pode sergeneticamente alterada para produzir 1,3-propanodiol a partir de substratosde monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos ou substratos de umúnico carbono.

Para poder construir essas linhagens, será vantajosoproporcionar ao hospedeiro Klebsiella os genes que facilitem a conversão dofosfato de dihidroxiacetona em glicerol e a conversão de glicerol em 1,3-propanodiol, tanto separada, quanto conjuntamente, sob o controletranscricional de um ou mais promotores constitutivos ou induzíveis. Aintrodução dos genes DARl e GPP2 que codificam a glicerol-3-fosfatodesidrogenase e a glicerol-3-fosfatase, respectivamente, fornecerão àKlebsiella maquinaria genética para produzir o 1,3-propanodiol a partir deum substrato de carbono apropriado.

Os genes (por exemplo, G3PDH, G3P fosfatase, dhaB e/oudhaT) podem ser introduzidos em qualquer vetor de plasmídeo capaz dereplicação na K. pneumoniae ou eles podem ser integrados dentro do genomada K. pneumoniae. Por exemplo, a K. pneumoniae ATCC25955 e a Kpneumoniae ECL2106 são conhecidas por serem sensíveis à tetraciclina ouao cloranfenicol; desta forma, vetores de plasmídeo, que são tanto capazes dese replicar em K. pneumoniae e de codificar a resistência a um ou ambosdesses antibióticos, podem ser utilizados para introduzir estes genes na K.pneumoniae. Os métodos de se transformar a Klebsiella com genes deinteresse são comuns e bem conhecidos na arte, e pode-se encontrarprocedimentos apropriados, inclusive vetores apropriados e técnicas deexpressão em Sambrook, supra.

Vetores e cassetes de expressão

A presente invenção fornece uma grande variedade de vetorese cassetes de transformação e expressão apropriados para a clonagem,transformação e expressão de G3PDH e G3P fosfatase dentro de uma célulahospedeira apropriada. Vetores apropriados serão aqueles que sãocompatíveis com as bactérias empregadas. Vetores apropriados podemderivar, por exemplo, uma bactéria, um vírus (tal como T7 bacteriófago oubacteriófago derivado de M13), um cosmídeo, um levedura ou uma planta.Os procedimentos para se obter e usar esses vetores são conhecidos dostécnicos no assunto. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual I Volumes 1, 2, 3 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY, (1989)).

Tipicamente, o vetor ou cassete contém seqüências quedirecionam a transcrição e a tradução do gene importante, um marcadorselecionável e seqüências que permitem a replicação autônoma ou aintegração cromossômica. Os vetores apropriados compreendem uma região5' do gene que recebe os controles de iniciação transcricional e uma região 3'do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. É maispreferido quando ambas as regiões de controle são derivadas de geneshomólogos à célula hospedeira transformada, embora deva ser entendido quetais regiões de controle não precisam derivar de genes nativos das espéciesespecíficas escolhidas como um hospedeiro de produção.

As regiões ou promotores de controle da iniciação, que são úteispara dirigir a expressão dos genes G3PDH e G3P fosfatase na célulahospedeira desejada são numerosos e familiares aos técnicos no assunto.Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir esses genes é apropriadopara a presente invenção, incluindo, mas sem limitação: CYCl, HIS3, GAL1,GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADCl, TRP1, URA3, LEU2, ENO,TPI (úteis para a expressão em Saccharomyces)-, AOXl (úteis para aexpressão em Pieehia)-, e lac, trp, XPL> XPR, T7, tac, e trc (úteis para aexpressão E. eoli).

As regiões de controle de terminação podem também derivar devários genes nativos aos hospedeiros preferidos. Opcionalmente, um local determinação pode ser desnecessário; contudo, é preferível se estiver incluído.

Para a expressão eficaz das presentes enzimas, o DNA quecodifica as enzimas está operacionalmente ligado através de códons deiniciação a regiões de controle de expressão selecionadas, de modo que aexpressão resulte na formação do RNA mensageiro apropriado.Transformação dos hospedeiros apropriados e expressão de genes para aprodução de 1.3-propanodiol

Uma vez que os cassetes apropriados forem construídos, elesserão utilizados para transformar as células hospedeiras apropriadas. Aintrodução do cassete contendo os genes que codificam a glicerol-3-fosfatodesidrogenase (G3PDH) e a glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase), gliceroldesidratase (dhaB), e a 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT), sejaseparada ou conjuntamente dentro da célula hospedeira pode ser realizadamediante procedimentos conhecidos, tal como a transformação (por exemplo,utilizando células permeabilizadas por cálcio, eletroporação) ou mediantetransfecção, utilizando-se um vírus bacteriòfago recombinante. (Sambrook etal., supra.)

Na presente invenção, foram criados E. coli W2042 (ATCC98188) contendo os genes que codificam a glicerol-3-fosfato desidrogenase(G3PDH) e a glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase), glicerol desidratase {dhaB),e a 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT). Além disso, foram construídos S.cerevisiae YPH500 (ATCC 74392), plasmídeos portadores pMCKlO,pMCKl7, pMCK30 e pMCK35 contendo os genes que codificam glicerol-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) e a glicerol-3-fosfatase (G3P fosfatase),glicerol desidratase (dhaB), e a 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT).Tanto a E. coli, quanto a Saccharomyces transformados acima mencionadosrepresentam realizações preferidas da presente invenção.

Meios e Substratos de Carbono

Os meios de fermentação na presente invenção devem contersubstratos de carbono apropriados. Os substratos apropriados podem incluir,mas não se limitam a monossacarídeos, tais como glicose e frutose,oligossacarídeos, tais como lactose ou sacarose, polissacarídeos, como oamido ou celulose, ou misturas dos mesmos, ou misturas não purificadas dematérias primas renováveis, tais como soro de queijo permeado, licor demilho macerado, molassos de beterraba de açúcar, e malte de cevada. Alémdisso, o substrato de carbono pode também ser substrato de um únicocarbono, tais como diòxido de carbono, como metanol, dos quais já foidemonstrada a conversão metabólica em intermediários bioquímicos chave.A produção de glicerol a partir de fontes de carbono único (por exemplo,metanol, formaldeído, ou formato) foi relatada em leveduras metilotróficos(Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 53(2), 541-543, (1989)) e em bactérias(Hunter et al., Biochemistry, 24, 4148-4155, (1985)). Estes organismospodem assimilar compostos de carbono único que variam no estado deoxidação de metano a formato, e produzem glicerol. A seqüência de reaçõesda assimilação de carbono pode ser mediante monofosfato de ribulose,mediante serina, ou mediante xilulose-monofosfato (Gottschalk, BacterialMetabolism, 2a Edição, Springer-Verlag: New York (1986)). A seqüência dereações para monofosfato de ribulose envolve a condensação de formato comribulose-5-fosfato para formar um açúcar de 6 carbonos que se torna frutosee finalmente no produto de 3 carbonos gliceraldeído-3-fosfato. Da mesmaforma, a seqüência de reações de serina assimila o composto de um únicocarbono na seqüência de reações glicolíticas via metilenotetrahidrofolato.

Além da utilização de substratos de um e dois carbonos, osorganismos metilotróficos são também conhecidos por utilizar uma série deoutros compostos contendo carbono, tais como metilamina, glicosamina euma variedade de aminoácidos para atividade metabólica. Por exemplo, olevedura metilotrófico é conhecido por utilizar o carbono de metilamina paraformar trehalose ou glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. [Int.Symp.], 7a, (1993), 415-32. Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P.Publisher; Intercept, Andover, UK). De modo semelhante, várias espécies dacândida irão metabolizar alanina ou ácido oleico (Sulter et al., Arch.Microbiol., 153(5), 485-9 (1990)). Portanto, a fonte de carbono utilizada napresente invenção pode abranger uma grande variedade de substratoscontendo carbono, somente estarão limitadas pelos requisitos do organismohospedeiro.Embora se considere que todos os substratos de carbono acimamencionados e misturas dos mesmos são apropriados na presente invenção,os monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e substratos de umúnico carbono são substratos de carbono preferidos. Ainda mais preferidossão os açúcares como a glicose, frutose, sacarose e substratos de um únicocarbono, tais como o metanol e o diòxido de carbono. A glicose é o substratomais preferido.

Além de uma fonte de carbono apropriada, os meios defermentação devem conter minerais, sais, co-fatores, tampões e outroscomponentes adequados, conhecidos dos técnicos no assunto, adequadospara o crescimento das culturas e promoção das seqüências de reaçõesenzimáticas necessária para a produção de glicerol. Presta-se uma particularatenção aos sais Co(II) e/ou a vitamina B12 ou precursores dos mesmos.Condições de Cultura

Tipicamente, cultiva-se células em meios apropriados a 302 C.Os meios de cultivo preferidos são meios comuns preparadoscomercialmente, tais como o mosto Luria Bertani (LB), o mosto SabouraudDextrose (SD) ou o mosto de Extrato de Malte de Levedura (YM). Outrosmeios de crescimento sintéticos ou definidos também podem ser utilizados eo meio apropriado para o crescimento do microorganismo específico deve serconhecido por um técnico de microbiologia ou de ciência da fermentação. Autilização de agentes conhecidos por modular a repressão catabólita diretaou indiretamente, por exemplo, adenosina cíclica 2':3'-monofosfato ouadenosina cíclica 2':5'-monofosfato, podem também ser incorporados no meiode reação. De modo semelhante, a utilização de agentes conhecidos pormodular atividades enzimáticas (por exemplo, sulfitos, bisulfitos e álcalis)que levam à melhora da produção de glicerol podem ser utilizadosconjuntamente ou como alternativa às manipulações genéticas.Os níveis de pH adequados para a fermentação estão entre opH 5,0 a pH 9,0, sendo que o pH de 6,0 a 8,0 é preferido como a faixa parauma condição inicial.

As reações podem ser feitas sob condições aeróbicas ouanaeróbicas, sendo que as condições anaeróbicas ou microaeróbicas sãopreferidas.

Fermentações contínuas e em batelada

O presente processo utiliza um método de fermentação embatelada. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado emque a composição dos meios é ajustada no início da fermentação e não estásujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Desta forma, no inícioda fermentação, o meio é inoculado com o organismo ou organismosdesejados e permite-se que ocorra a fermentação não adicionando nada aosistema. Tipicamente, contudo, uma fermentação em batelada é "embatelada" no que diz respeito à adição da fonte de carbono e freqüentementese tenta fazer o controle de fatores, tais como pH e concentração de oxigênio.As composições de metabòlito e biomassa do sistema em batelada mudamconstantemente até o momento em que a fermentação é interrompida. Emculturas em batelada, as células moderam mediante uma fase de atrasoestático, há uma fase inerte de alto crescimento e finalmente há uma faseestacionária em que a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Senão forem tratadas, as células na fase estacionária acabarão morrendo. Ascélulas na fase inerte geralmente são responsáveis pela maior parte daprodução do produto final ou do intermediário.

Uma variação do sistema de batelada padrão é o sistema defermentação em batelada alimentada que também é apropriado na presenteinvenção. Nesta variação de um típico sistema de batelada, o substrato éacrescentado cada vez mais na medida em que a fermentação se desenvolve.Os sistemas alimentados por batelada são úteis quando a repressão decatabòlito e' capaz de inibir o metabolismo das células e quando se deseja terquantidades limitadas de substrato no meio. A medida da real concentraçãode substrato nos sistemas de batelada alimentada é difícil e portanto estima-se com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigêniodissolvido e a pressão parcial de gases eliminados, tais como CO2. Asfermentações de batelada e batelada alimentada são comuns e bemconhecidas na arte e pode-se encontrar exemplos em Brock, supra.

Considera-se também que o método seria adaptável a métodosde fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto emque um meio de fermentação definido é acrescentado continuamente a umbio-reator e uma quantidade igual ou equivalente de meio condicionado éretirada simultaneamente para processamento. A fermentação contínuageralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, sendoque as células estão essencialmente em um crescimento de fase inerte.

A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou dequalquer número de fatores que afetem o crescimento da célula, ou aconcentração do produto final. Por exemplo, um método manterá umnutriente limitador, tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio emuma taxa fixa e permitirá que todos os outros parâmetros sejam moderados.

Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode seralterada continuamente enquanto a concentração da célula medida pelaturbidez do meio é mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçamem manter as condições de crescimento em um estado constante e assim aperda de célula devido a que o meio está sendo drenado deve ser balanceada,contra a taxa de crescimento da célula na fermentação. Os métodos para amodulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos defermentação contínua, bem como técnicas para aumentar a taxa de formaçãode produtos são bem conhecidas na arte da microbiologia industrial e umasérie de métodos são detalhados por Brock, supra.

A presente invenção pode ser praticada utilizando-se processosde batelada, batelada alimentada ou contínuos, sendo que qualquer modo defermentação conhecido seria apropriado. Além disso, considera-se que ascélulas podem ser imobüizadas em um substrato em conjunto comcatalisadores de células e sujeitas a condições de fermentação para aprodução de 1,3-propanodiol.

Alterações na seqüência de reações para a produção de 1.3-propannriinl

Seqüência de reações de enzima representativa. A produção de1,3-propanodiol a partir de glicose pode ser realizada através da seguintesérie de etapas. Esta série representa várias seqüências de reaçõesconhecidas pelos técnicos no assunto. A glicose é convertida em uma série deetapas por enzimas da seqüência de reação glicolítica que resulta no fosfatode dihidroxiacetona (DHAP) e 3-fosfogliceroldeído (3-PG). Forma-se então oglicerol tanto por hidròlise de DHAP, resultando em dihidroxiacetona(DHA), seguido pela redução, ou por redução de DHP resultando em glicerol3-fosfato (G3P), seguido por hidròlise. A etapa de hidròlise pode sercatalisada por qualquer número de fosfatases celulares conhecidas porserem específicas ou não específicas com relação aos seus substratos ou aatividade pode ser introduzida em um hospedeiro por recombinação. A etapade redução pode ser catalisada mediante uma enzima hospedeira ligada porNAD+ (ou NADP+), ou a atividade pode ser introduzida no hospedeiro porrecombinação. É notável que o regulon dha contém uma gliceroldesidrogenase (E.C. 1.1.1.6) que catalisa a reação reversível da Equação 3.

Glicerol -> 3-HP + H2O (Equação 1)

3-HP + NADH + H+ ->• 1,3-Propanodiol + NAD+ (Equação 2)

Glicerol + NAD+ -» DHA + NADH + H+ (Equação 3)O glicerol é convertido em 1,3-propanodiol através dointermediário 3-hidroxi-propionaldeído (3-HP), conforme foi descritodetalhadamente acima. O intermediário 3-HP é produzido a partir doglicerol (Equação 1) mediante uma enzima desidratase que pode sercodificada pelo hospedeiro ou pode ser introduzida no hospedeiro porrecombinação. Esta desidratase pode ser glicerol desidratase (E.C. 4.2.1.30),diol desidratase (E.C. 4.2.1.28), ou qualquer outra enzima capaz de catalisaresta transformação. A glicerol desidratase, mas não a diol desidratase, écodificada pelo régulon dha. O 1,3-propanodiol é produzido a partir de 3-HP(Equação 2), por uma enzima de hospedeiro ligada em NAD+ (ou NADP+) oua atividade pode ser introduzida no hospedeiro por recombinação. Estareação final na produção de 1,3-propanodiol pode ser catalisada por 1,3-propanodiol desidrogenase (E.C. 1.1.1.202) ou outras desidrogenases deálcool.

Mutações e transformações que afetam a canalização de carbono. Uma sériede organismos mutantes compreendendo variações na seqüência de reaçõesde produção de 1,3-propanodiol será útil na presente invenção. A introduçãode uma mutação de triosefosfato isomerase (tpi-) no microorganismo é umexemplo do uso de uma mutação para melhorar o desempenho mediantecanalização de carbono. De modo alternativo, as mutações que diminuem aprodução de etanol (adh) ou lactato (Idh) aumentarão a disponibilidade deNADH para a produção de 1,3-propanodiol. Mutações adicionais em etapasde glicólise após a gliceraldeído-3-fosfato, tal como fosfoglicerato mutase(pgm) serão úteis para aumentar o fluxo de carbono para a seqüência dereações de produção de 1,3-propanodiol. As mutações que fazem o transportede glicose, tais como PTS que evitariam a perda de PEP também podemrevelar-se úteis. As mutações que bloqueiam as seqüências de reaçõesalternativas para intermediários da seqüência de reações de produção de1,3-propanodiol, tal como a seqüência de reações catafcòlicas (g/p) tambémseriam úteis à presente invenção. A mutação pode ser direcionada a umgene estrutural, de modo a prejudicar ou melhorar a atividade de umaatividade enzimática ou pode ser direcionada a um gene regulador de modoa modular o nível de expressão de uma atividade enzimática.

De modo alternativo, transformações e mutações podem sercombinadas para controlar atividades enzimáticas particulares para oaperfeiçoamento da produção de 1,3-propanodiol. Portanto, pretende-se noescopo da presente invenção antecipar as modificações de um conjunto decatalisador de célula que levam ao aumento de produção de 1,3-propanodiol.Identificação e purificação de 1.3-propanodiol:

Os métodos para a purificação de 1,3-propanodiol a partir demeios de fermentação são conhecidos na arte. Por exemplo, os propanodióispodem ser obtidos a partir de meios celulares submetendo a mistura dereação à extração com um solvente orgânico, destilação e cromatografia decoluna (U.S. 5.356.812). Um solvente particularmente bom para esseprocesso é o ciclohexano (U.S. 5.008.473).

O 1,3-propanodiol pode ser identificado diretamentesubmetendo o meio à análise de cromatografia líquida de alto desempenho(HPLC). Na presente invenção é preferido um método em que o meio defermentação é analisado em tuna coluna de troca iônica analítica utilizandouma fase móvel de ácido sulfúrico 0,01 N de um modo isocrático.Identificação e purificação de G3PDH e G3P fosfatase:

Os níveis de expressão das proteínas G3PDH e G3P fosfatasesão medidos por testes de enzimas, sendo que o teste de atividade de G3PDHé baseado nas propriedades espectrais do co-substrato, NAPD, na conversãode DHAP em G-3-P. O NADH tem absorção de UV/vis intrínseca, e seuconsumo pode ser controlado por espectrofotometria em 340 nm. A atividadeda G3P fosfatase pode ser medida por qualquer método de medição dofosfato inorgânico liberado na reação. O método de detecção maisfreqüentemente utilizado fazia uso da determinação espectroscòpica visívelde um complexo de amônia de fosfomolibdato de coloração azul.

Exemplos

Métodos Gerais

Os procedimentos para fosforilações, ligações e transformaçõessão bem conhecidos na arte. As técnicas apropriadas para uso nos seguintesexemplos podem ser encontradas em Sambrook, J. et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY (1989).

Os materiais e métodos adequados para a manutenção ecrescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos na arte. As técnicasadequadas para utilização nos exemplos a seguir podem ser encontradas emManual of Methods for General Bacteriologv (Phillipp Gerhardt, R. G. E.Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R.Krieg e G. Briggs Phillips,editores), American Society for Microbiology,Washington, DC. (1994)) ou por Thomas D. Brock in Biotechnology: ATextbook of Industrial Minrnbinlngy, 2a Edição, Sinauer Associates, Inc.,Sunderland, MA (1989). Todos os reagentes e materiais utilizados para ocrescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos da AldrichChemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) excetoquando estiver especificado de outra forma.

O significado das abreviações é conforme segue: "h" significahora ou horas; "min" significa minuto ou minutos, "s" significa segundo ousegundos, "d" significa dia ou dias, "ml" significa mililitros, "1" significalitros.Testes de Enzimas

A atividade da glicerol desidratase nos extratos isentos decélula foi determinada utilizando-se o 1,2-propanodiol como substrato. Oteste, com base na reação dos aldeídos com metilbenzo-2-tiazolonahidrazona, foi descrito por Forage e Foster (.Biochim. Biophys Acta. 569, 249(1979)). A atividade de 1,3-propanodiol oxidoreductase, algumas vezesreferida como 1,3-propanodiol desidrogenase, foi determinada em solução ouem géis em placas, utüizando 1,3-propanodiol e NAD+ como substratos,também foi descrita. Johnson e Lin, J. Bacteriol., 169, 2050 (1987). Aatividade do glicerol 3-fosfato desidrogenase (G3PDH) dependendo doNADH ou NADPH foi determinada por espectrofotometria, em seguida aodesaparecimento de NADH ou NADPH, conforme foi descrito. (R. M. Bell eJ. E. Cronan, Jr., J. Biol. Chem. 250:7153-8 (1975)).

Teste para o g1inprnl.3-fosfflt.flsP, fíPP

O teste para a atividade enzimática foi realizado incubando-seo extrato com um substrato de fosfato orgânico em um tampão bis-Tris ouMES e magnésio, com um pH de 6,5. 0 substrato utilizado foi 1-a-glicerolfosfato; d, 1-a-glicerol fosfato. As concentrações finais dos reagentes no testeforam: tampão (20mM, bis-Tris ou 50 mM MES, MgCl2 (10 mM); e substrato(20 mM). Se o conteúdo total de proteína na amostra era baixo e não tivesseocorrido nenhuma precipitação visível com uma interrupção por ácido, aamostra foi testada de modo conveniente na cuveta. Este método envolveu aincubação de uma amostra de enzima em uma cuveta que continha umtampão com substrato 20 mM (50nl, 200 mM), MES 50 mM, MgCl210 mM,com um pH de 6,5. 0 volume final do teste de fosfatase era de 0,5 ml. Aamostra contendo enzima foi acrescentada à mistura de reação; o conteúdoda cuveta foi misturado e então a cuveta foi colocada em um banho de águacom circulação em T - 37aC por 5 a 120 min □ dependendo se a atividade defosfatase na amostra da enzima variava de 2 a 0,02 U/ml. A reaçãoenzimática foi interrompida pela adição do reagente de molibdato ácido (0,4ml). Após acrescentar-se o reagente de Fiske SubbaRow (0,1 ml) e águadestilada (1,5 ml), a solução foi agitada e deixada desenvolver. Após 10minutos, a absorvância das amostras foi lida em 660 nm utüizando-se umespectrofotômetro Cary 219 UV/Vis. A quantidade de fosfato inorgânicoliberado foi comparada a uma curva padrão que foi preparada utilizando-seuma solução de fosfato inorgânico em estoque (0,65 mM) e preparando-se 6padrões com concentrações de fosfato inorgânico finais, que variavam de0,26 a 0,130 fimol/ml.

Isolamento e Identificação Hp 1,3-propanoHinl

A conversão de glicerol em 1,3-propanodiol foi monitorada porHPLC. Foram feitas análises utüizando-se técnicas padrões e materiaisdisponíveis aos técnicos de cromatografia. Um método apropriado utilizouum sistema Waters Maxima 820 HPLC utilizando detecção de UV (210 nm)e RI. As amostras foram injetadas em uma coluna Shodex SH-1011P (8 mmx 300 mm, comprada da Waters, em Milford, MA), equipada com uma pré-coluna Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), com a temperatura controlada a50SC, utilizando H2SO4 a 0,01 N como fase móvel, em uma taxa de fluxo de0,5 ml/min. Quando se desejava análise quantitativa, foram preparadasamostras com uma quantidade conhecida de ácido trimetilacético comopadrão externo. Tipicamente, os tempos de retenção de glicerol (detecção deRI), 1,3-propanodiol (detecção de RI), e ácido trimetilacético (detecção de UVe RI) foram de 20,67 minutos, 26,08 minutos, e 35,03 minutos,respectivamente.

A produção de 1,3-propanodiol foi confirmada por GC/MS.Foram feitas análises utilizando-se técnicas padrões e materiais disponíveisao técnico de GC/MS. Um método apropriado utilizou um cromatógrafo degás Hewlett Packard, Série II, 5890, acoplado a um detector seletivo demassa Hewlett Packard, Série 5971 (EI) e uma coluna HP-INNOWax (30 mde comprimento, 0,25 mm Ld., e com a espessura do filme 0,25 mícrons). Otempo de retenção e o espectro de massa de 1,3-propanodiol gerado foicomparado ao do 1,3-propanodiol autêntico (m/e: 57, 58).

Um método alternativo para GC/MS envolve a derivatização daamostra. Acrescentou-se a 1,0 ml de amostra (por exemplo, sobrenadante decultura) 30 jil de ácido perclórico concentrado (70% v/v). Após ser misturada,a amostra foi congelada e liofüizada. Uma mistura de 1:1 debis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina (300 nD foi acrescentada aomaterial liofilizado, agitada vigorosamente e colocada a 652C por uma hora.A amostra foi clarificada de material insolúvel, mediante centrifugação. Olíquido resultante se dividiu em duas fases, sendo que a fase superior fuiutilizada para análise. A amostra foi cromatografada em uma coluna DB-5(48 m, 0,25 mm I.D., e espessura do filme de 0,25 fim; da J&W Scientific) e otempo de retenção e o espectro de massa do derivado de 1,3-propanodiolobtido dos sobrenadantes da cultura foram comparados com os obtidos depadrões autênticos. O espectro de massa do 1,3-propanodiol derivado deTMS contém os íons característicos de 205, 177, 130 e 115 AMU.

Exemplo 1

Clonagem e Transformação dp Células Hospedeiras de E. c.nli romDNA de cosmídeo para a Expressão de 1.3-Propanodiol

Meios

Um meio sintético S12 foi utilizado na separação detransformantes bacterianos quanto a capacidade de fazer 1,3-propanodiol. Omeio S12 contém: sulfato de amônio 10 mM , tampão de sulfato de potássio50 mM, pH de 7,0, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,7 mM, MnCl2 50 ^iM, FeCl3 1 juM,ZnCl 1 nM, CuSO4 1,7 ^iM, CoCl2 2,5 ^iM, Na2MoO4 2,4 ^iM, e cloridrato detiamina 2 jj.M.

O meio A utilizado para o crescimento e fermentação consistiade: sulfato de amônio 10 mM; tampão de MOPS/KOH 50 mM, pH de 7,5;tampão de fosfato de potássio 5 mM, pH de 7,5, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,7 mM,MnCl2 50 nM, FeCl3 1 MM, ZnCl 1 jaM, CuSO4 1,72 ^M, CoCl2 2,53 MM,Na2MoO4 2,42 MM, e cloridrato de tiamina 2 (jM; extrato de levedura 0,01%;ácidos de casamino 0,01%; 0,8 ng/ml de vitamina B12; e 50 ^ig/ml amp. Omeio A foi complementado com glicerol 0,2% ou glicerol 0,2% mais D-glicose0,2%, conforme necessário.

Células

Klebsiellapneumoniae ECL2106 (Ruch et al, J. Bacteriol., 124,348 (1975)), também conhecida na literatura como K. aerogenes ouAerobacter aerogenes, foi obtida de E.C.C. Lin (Harvard Medicai School,Cambridge, MA) e foi mantida como uma cultura de laboratório.

Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi comprada da AmericanType Culture Collection (Rockville, MD).

A E. coli DH5cc foi comprada da Gibco/BRL e foi transformadacom o DNA de cosmídeo isolado a partir da Klebsiella pneumoniae ATCC25955 contendo um gene que codifica ou uma enzima de desidratase deglicerol ou de diol. Os cosmídeos que contém a glicerol desidratase foramidentificados como pKPl e pKP2 e o cosmídeo contendo a enzimadesidratase de diol foi identificado como pKP4. As células de DH5atransformadas foram identificadas como DH5a-pKPl, DH5a-pKP2, e DH5a-pKP4.

A E. coli ECL707 (Sprenger et al., J. Gen Microbiol., 135, 1255(1989)) foi obtida da E.C.C. Lin (Harvard Medicai School, Cambridge, MA) efoi transformada de modo semelhante com DNA de cosmídeo da Klebsiellapneumoniae. Estes transformantes foram identificados como ECL707-pKPle ECL707-pKP2, contendo o gene da glicerol desidratase e SCL707-pKP4contendo o gene da desidratase de diol.

A E. coli AA200 contendo uma mutação no gene tpi (Andersonet al., J. Gen Microbiol., 62, 329 (1970)) foi comprada da E. coli GeneticStock Center, Yale University (New Haven, CT) e foi transformada comDNA de cosmídeo de Klebsiella para resultar nos organismos recombinantesAA200-pKPl e AA200-pKP2, contendo o gene da glicerol desidratase eAA200-pKP4 contendo o gene da desidratase de diol.

DH5a:

Seis placas de transformação contendo aproximadamente 1.000colônias de E. coli XLl-Blue MR transfeccionadas com DNA de K.pneumoniae foram lavadas com 5 ml de meio LB e centrifugadas. Asbactérias foram pelotizadas e ressuspensas em 5 ml de meio LB + glicerol.

Uma alíquota (50 ^l) foi inoculada em um tubo de 15 ml contendo meiosintético S12 com glicerol 0,2%+ 400 ng por ml de vitamina B12 + extrato delevedura 0,001% + 50 amp. Preencheu-se o tubo com o meio até enchê-locompletamente e embalou-se o mesmo com parafilme e incubou-se a 30aC.Uma leve turbidez foi observada após 48 horas. Alíquotas analisadas quantoà distribuição do produto conforme descrito acima, em 78 horas e 132 horas,foram positivas para 1,3-propanodiol, sendo que a última hora de mediçãocontinha quantidades maiores de 1,3-propanodiol.

As bactérias cujo teste deu positivo para a produção de 1,3-propanodiol foram diluídas em série e colocadas em placas de LB-50 amppara isolar colônias individuais. 48 colônias individuais foram isoladas echecadas novamente quanto à produção de 1,3-propanodiol. O DNA decosmídeo foi isolado de 6 clones independentes e transformados emlinhagem de DH5a de E. coli. Os transformantes foram novamente checadosquanto à produção de 1,3-propanodiol. Dois transformantes foramcaracterizados além disso e designados como DH5a-pEPl e DH5,>-pKF2.

Um fragmento de 12,1 kb de EcoRI-SalI de pKPl, subclonadoem pIBISl (IBI Biosystem, New Haven, CT), foi seqüenciado e chamado dePHK28-26 (ID. SEQ. N=: 19). A seqüência revelou os locais das estruturas deleitura aberta relevantes do operon dha que codifica a glicerol desidratase eos genes necessários para a regulação. Fazendo referência à ID. SEQ. N8: 19,um fragmento da estrutura de leitura aberta para o dhaK que codifica adihidroxiacetona quinase é encontrado nas bases 1-399; a estrutura deleitura aberta para o dhaD que codifica a glicerol desidrogenase éencontrada nas bases 983-2107; a estrutura de leitura aberta para o dhaRque codifica o repressor é encontrada nas bases 2209-4134; a estrutura deleitura aberta para o dhaT que codifica a 1,3-propanodiol oxidoreductase éencontrada nas bases 5017-6180; a estrutura de leitura aberta para o dhaBlque codifica a glicerol desidratase da subunidade alfa é encontrada nasbases 7044-8711; a estrutura de leitura aberta para o dhaB2 que codifica aglicerol desidratase da subunidade beta é encontrada nas bases 8724-9308; aestrutura de leitura aberta para o dhaB3 que codifica a glicerol desidrataseda subunidade gama é encontrada nas bases 9311-9736; e a estrutura deleitura aberta para o dhaBX que codifica uma proteína de funçãodesconhecida é encontrada nas bases 9749-11572.

Colônias individuais de E.coli XLl-Blue ME transfectadas comDNA de cosmídeo embalado de K. pneumoniae, foram inoculadas emcavidades de microtitulação contendo 200 pi de meio S15 (sulfato de amônio10 mM; tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, 1 mM; tampão MOPS/KOH,pH 7,0, 50 mM; MgCl2, 2 mM; MaCl2, 0,7 mM; MnCl2, 50 uM; FeCl3, 1 uM;ZnCl 1 uM; CuSO4,1,72 uM; CoCl2,2,53 uM; Na2MoO4,2,42 uM; e cloridratode tiamina, 2 uM) + glicerol 0,2% + 400 ng/ml de vitamina B12 + extrato delevedura 0,001% + 50 ub/ml de ampicilina. Além das cavidades demicrotitulação, uma placa principal contendo LB-50 amp foi tambéminoculada. Após 96 h, 100 foi retirado e centrifugado em um tubo demicrocentrifuga Rainin, contendo um filtro de membrana de nylon de 0,2mícrons. As bactérias foram retidas e o produto da filtração foi processadopara análise HPLC. Os clones positivos que demonstravam uma produção de1,3-propanodiol, foram identificados depois de fazer a separação deaproximadamente 250 colônias. Três clones positivos foram identificados,dois dos quais tinham crescido em LB-50 amp e um dos quais não tinha.Uma colônia individual, isolada de um dos dois clones positivo quecresceram em LB-50 amp e constatados como produtores de 1,3-propanodiol,foi denominado pKp4. DNA de cosmídeo foi isolado de linhagens de E.colicontendo pKP4 e linhagem de E.coli DH5a foi transformada. Umtransformante independente, designado como DH5a-pKP4, foi constatadocomo produtor de 1,3-propanodiol.

ECL 707:

A linhagem de E.coli ECL 707 foi transformada com o DNA deK. pneumoniae de cosmídeo, correspondente a um de pKPl, pKP2, pKP4, ouo vetor Supercos sozinho, e designada ECL 707-pKPl, ECL 707-pKP2, ECL707-pKP4, e ECL 707-sc, respectivamente. O ECL 707 é defeituoso em glpK,gld e ptsD, que codificam a glicerol quinase dependente de ATP, gliceroldesidrogenase ligada a NAD+, e a enzima II para dihidroxiacetona dosistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato,respectivamente.

20 colônias individuais de cada transformação de cosmídeo, e 5das transformações de vetor Supercos sozinho (controle negativo), isoladasdas placas LB-50 amp, foram transferidas para uma placa principal LB-50amp. Estes itens isolados, foram também testados quanto a sua capacidadede converter glicerol em 1,3-propanodiol, para determinar se eles continhamatividade de desidratase. Os transformantes foram transferidos com umpaliteiro estéril para placas de microtitulador contendo 200 ^l de Meio Acomplementado ou com glicerol 0,2%, ou com glicerol 0,2% mais D-glucose0,2%. Após a incubação durante 48 h a 30 aC, os conteúdos das cavidades daplaca do microtitulador foram filtrados através de um filtro de nylon de 0,45mícrons, e cromatografados por HPLC. Os resultados destes testes sãoexpostos na tabela 1.

Tabela 1

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* (Número de isolados positivos/número de isolados testados)AA200:

A linhagem de AA200 E.coli foi transformada com o DNA de Kpneumoniae de cosmídeo, correspondente a um de pKPl, pKP2, pKP4, e ovetor Supercos sozinho e designado AA200-pKPl, AA200-pKP2, AA200-pKP4, e AA200-sc, respectivamente. A linhagem AA200 é defeituosa natriosefosfato isomerase (tpi).

Vinte colônias individuais de cada transformação de cosmídeo edas transformações vetor vazias, foram isoladas e testadas para verificarsuas capacidades de converter glicerol em 1,3-propanodiol, conforme descritopara a linhagem ECL707 da E. coli. Os resultados destes testes são expostosna tabela 2.

Tabela 2Conversão de Glicerol em 1,3-propanodiol por A A2G0 transformado

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* (Número de isolados positivos/número de isolados testados)

Exemplo 2

Conversão de D-glicose em 1.3-propanodiol por E.coli renomhinant^usando PARI. GPP2. dhaB e dhaT

Construção de plasmídeos de expressão para finalidades gerais para uso natransformação de Escherichia coli.O vetor de expressão pTacTQ

O vetor de expressão de E.coli pTacIQ, contém o gene IacIQ(Farabaugh, Nature 274, 5673 (1978)) e promotor tac (Amann et al., Gene25, 167 (1983)) inserido no EcoRI de pBR322 (Sutcliffe et al., Cold SpringHarb. Symp. Quant Biol. 43, 77 (1979). Um local de clonagem múltiplo eseqüência de terminador (ID SEQ. Na 20) substitui a seqüência pBR322 doEcoRl em SphI.

Subclonagem dos genes de glicerol desidratase (dhaR1.2.3)

A estrutura de leitura aberta para o gene dhaB3 (que incorporaum local EcoRI na extremidade 5' e um local XbaI na extremidade 3') foiamplificada de pHK28-26 por PCR usando iniciadores (ID. SEQ. N2 21 e 22).O produto foi subclonado em pLitmos29 (New England Biolab. Inc. Beverly,MA) para gerar o plasmídeo pDHAB3 contendo dhaB3.

A região contendo a totalidade da região codificadora para osquatro genes do operon dhaB de pHK28-26, foi clonada em pBluescriptIIKS+ (Stratagene, La Lolla, CA) usando as enzimas de restrição KpnI eEcoRI para criar o plasmídeo pM7.

O gene dhaBX foi retirado, digerindo-se o plasmídeo PM7 quecontém dhaB(l,2,3,4), com ApaI e XbaI (excluindo parte do dhaB3 e atotalidade do dhaBX). O fragmento de 5,9 kb resultante foi purificado eligado com o fragmento ApaI-XbaI de 325-bp a partir do plasmídeo pDHAB3(restaurando o gene dhaB3) para criar pMll que contém dhaB(1.2.3).

A estrutura de leitura aberta para o gene dhaBl (que incorporaum local HindIII e um local de ligação de ribossomo RBS de consenso naextremidade 5', e um local XbaI na extremidade 3') foi amplificada depHK28-26 mediante PCR usando iniciadores (ID. SEQ. N2 23 e ID. SEQ. N224). O produto foi subclonado em pLitmos28 (New England Biolab. Inc.,)para gerar o plasmídeo pDTl contendo dhaBl.

Um fragmento NotI-XbaI de pMll contendo parte do genedhaBl, do gene dhaB2,e do gene dhaB3, foi inserido no pDTl para criar oplasmídeo de expressão dhaB, pDT2. O fragmento HindIII-XbaI contendo osgenes dhaB(1.2.3) do pDT2 foi inserido no pTacIQ para criar pDT3.Subclonagem dos gene 1-3-propanodiol desidrogenase (dhaT).

O fragmento de KppnI-SacI de pHk28-26, contendo o gene1,3-propanodiol desidrogenase (dhaT) completo, foi subclonado empBluescriptII KS+, criando plasmídeo pAHl. O gene dhaT (que incorporaum local XbaI na extremidade 5' e um local BamHI na extremidade 3') foiamplificado por PCR a partir de pAHl como DNA padrão, usandoiniciadores sintéticos (ID. SEQ. N2 25 com ID. SEQ. N8 26). O produto foisubclonado em pCR-Script (Stratagene) no local SrfI para gerar osplasmídeos pAH4 e pAH5 contendo dhaT. O plasmídeo pAH4 contém o genedhaT na orientação correta para a expressão do promotor Iac no pCR-Scripte o pAH5 contém o gene dhaT na orientação oposta. O fragmento de XbaI-BamHI de pAH4 contendo o gene dhaT foi inserido nopTacIQ para ger*rplasmídeo pAH8. O fragmento de HindIII-BamHI de pAH8 contendo o RBSe o gene dhaT foi inserido em pBluescriptII KS+, para criar pAHll. Ofragmento de HindIII-SalI de pAH8 contendo o RBS, o gene dhaT e oterminador, foi inserido em pBluescriptII KS+, para criar pAHl2.

Construção de um cassete df> prpr-p.ssão para dhgB(1.2.3) p dhaT

Um cassete de expressão para dhaB(l,2,3) e dhaT foi montadoa partir de subclones dhaB(l,2,3) e dhaT individuais, descritos acima,usando métodos de biologia molecular padrões. O fragmento SpeI-KpnI depAH8 contendo o RBS, o gene de dhaT e o terminador, foi inserido noslocais XbaI-KpnI de pDT3 para criar pAH23. O fragmento SmaI-EcoRIentre o gene dhaB3 e dhaT de pAH23 foi retirado para criar o pAH26. Ofragmento SpeI-NotI contendo um local EcoRI de pDT2, foi usado parasubstituir o fragmento SpeI-NotI de pAH26 para criar o pAH27.

Construção do cassete de exprpssão para dhaTe dhaB (1.2.3).

Um cassete de expressão para dhaT e dhaB(l,2,3) foi montadoa partir de subclones dhaB(l,2,3) e dhaT individuais, descritos acima,usando métodos de biologia molecular padrões. Um fragmento SpeI-SacIcontendo os genes de dhaB(l,2,3) de pDT3, foi inserido em pAHll nos locaisSpeI-SacI para criar pAH24.

Clonagem e expressão de lirPrnI 3-fosfatase para aumentar a produção Hpglicerol em E. coli

O cromossomo Saccharomyces eerevisiae V lambda clone 6592(Gene Bank, N2 de acesso U18813xll), foi obtido da ATCC. O gene daglicerol 3-fosfato fosfatase (GPP2) (incorporando um local BamHI-RBS-Xbalna extremidade 5' um local SmaI na extremidade 3') foi clonado medianteclonagem PCR a partir do clone lambda, com o DNA meta, usandoiniciadores sintéticos (ID. SEQ. Na 27 com ID. SEQ. Ns 28). O produto foisubclonado no pCR-Script (Stratagene) no local Srfl para gerai osplasmídeos pAH15 contendo GPP2. O plasmídeo pAHlõ contém o geneGPP2 na orientação inativa para a expressão a partir do promotor Iac empCR-Script SK+. O fragmento BamHI-SmaI de pAHlõ contendo o geneGPP2, foi inserido em pBluescriptII SK+ para gerar o plasmídeo PAH19. Oplasmídeo PAH19 contém o gene GPP2 na orientação correta para aexpressão a partir do promotor lac. O fragmento XbaI-PstI de PAH19contendo o gene GPP2, foi inserido em pPH0X2 para criar o plasmídeopAH21.

Plasmídeos para a expressão Hp dhaT. dha.B(1.2.3) e genes GPP2

Um ligador SalI-EcoRI-XbaI (ID. SEQ. N2 29 e 30) foi inseridoem pAH5, o qual foi digerido com as enzimas de restrição SalI-XbaI paracriar pDT16. 0 ligador destrói o local XbaI. 0 fragmento Ikb SalI-MluI depDT16 foi inserido em pAH24 substituindo o fragmento SalI-MluI existentepara criar pDTl8.

O fragmento de 4,1 kb EcoRI-XbaI contendo o cassete deexpressão para dhaT e dhaB(l,2,3) de pDT18 e o fragmento 1,0 kb XbaI-SalIcontendo o gene GPP2 de pAH21 foi inserido no vetor pMMB66EH (Füste etal., GENE, 48, 119 (1986)) digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SalIpara criar pDT20.

Plasmídeos para a sobreexpressão de DARl em E. c.nl.L

O DARl foi isolado mediante clonagem de PCR a partir deDNA de S. cerevisiae genômico utilizando iniciadores sintéticos (ID. SEQ. Na46 com ID. SEQ. N2 47). A clonagem por PCR bem-sucedida coloca um localATcoI na extremidade 5' do DARl, onde o ATG dentro do Ncol é a metioninado iniciador de DARI. Na extremidade 3' do DARl, um local BamRl éintroduzido seguindo-se o terminador de tradução. Os fragmentos de PCRforam digeridos com iVcol + BamRl e clonados nos mesmos locais dentrodos plasmídeos de expressão pTrc99A (Pharmacia, Pi.caiaway. Nev, Jovsey)para fornecer pDARlA.

Para criar um melhor local de ligação de ribossomo naextremidade de 5' do DARl, um ligador SpeI-RBS-NcoI obtido pela têmperade iniciadores sintéticos (ID. SEQ. Na 48 com ID. SEQ. Na 49), foi inseridodentro do local NcoI do pDARlA para criar pAH40. O plasmídeo pAH40contém o novo gene RBS e DARl na orientação correta para a expressão apartir do promotor Trc99A (Pharmacia). O fragmento NcoI-BamHI depDARlA e um segundo conjunto de ligador SpeI-RBS-NcoI, obtido pelatêmpera de iniciadores sintéticos (ID. SEQ. N2 31 com ID. SEQ. N2 32), foiinserido no local SpeI-BamHI de pBluescriptII SK+ (Stratagene) para geraro plasmídeo pAH41. 0 produto construído pAH41, contém um gene deresistência à ampicüina. O fragmento NcoI-BamHI de pDARlA e umsegundo conjunto de ligador SpeI-RBS-NcoI, obtido pela têmpera deiniciadores sintéticos (ID. SEQ. Na 31 com ID. SEQ. N2 32), foi inserido nolocal SpeI-BamHI de pBC-SK+ (Stratagene) para gerar o plasmídeo pAH42.0 produto construído pAH42 contém um gene de resistência aocloranfenicol.

Construção do cassete rip expressão para DARl e GPP2

Um cassete de expressão para DARl e GPP2 foi montado apartir dos subclones individuais DARl e GPP2, descritos acima, usandométodos de biologia molecular padrões. 0 fragmento BamHI-PstI de paHl9,contendo os genes de RBS e de GPP2, foi inserido em pAH40 para criarpAH43. 0 fragmento BamHI-PstI de paH19, contendo os genes de RBS e deGPP2, foi inserido em pAH41 para criar pAH44. 0 mesmo fragmentoBamHI-PstI de paHl9, contendo os genes de RBS e de GPP2, foi tambéminserido em pAH42 para criar pAH45.

Construção de uma linhagem E. cnliA E.coli W1485 é uma Linhagem natural K-12 (ATCC 12435).Esta linhagem foi transformada com os plasmídeos pDT20 e pAH42 eselecionada em placas LA (Luria Agar, Difco) complementado com 50 Mg/mlde carbencilim e 10 pig/ml de cloranfenicol.

Produção de 1.3-nropanndinl q partir de glicose

A E.coli W1485/pDT20/pAH42 foi transferida para uma placade 50 ml de um meio contendo por litro: 22,5g de glicose, 6,85g K2HPO4, 6,3g(NH4)2SO4, 0,5g NaHCO3, 2,5g NaCl, 8g de extrato de levedura, 8g detriptona, 2,5 mg de vitamina B12, 2,5 ml de solução modificada de TraceElement de Balch, 50 mg de carbencilim e 10 mg de cloranfenicol, com pHfinal de 6,8 (HC1), e então esterilizado por fütro. A composição da soluçãomodificada de Trace Element de Balch, pode ser encontrada em Methnds forGeneral and Molecular fíacteriology (P. Gerhardt et al., eds, pg. 158,American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)). Após incubar a» 372C, a 300 rpm por 6 horas, foram adicionadas 0,5g de glicose e IPTG(concentração final = 0,2 mM) e a agitação foi reduzida a 100 rpm. Asamostras foram analisadas mediante GC/MS. Após 24 h a

W1485/pDT20/pAH42 produziu 1,1 g/l de glicerol e 195mg/l de 1,3-propanodiol.

Exemplo 3

Clonagem e expressão de dhafí p dhaT em Saceharnmyr^cerevisiae.

Plasmídeos de expressão que poderiam existir como elementosepissomais de replicação, foram construídos para cada um dos 4 genes dha.Para todos os plasmídeos de expressão, estava presente um levedura adhl,separado de um terminador de transcrição de levedura de ADHl porfragmentos de DNA contendo locais de reconhecimento para uma ou maisendonucleases de restrição. Cada plasmídeo de expressão também continhao gene para a p-lactamase para a seleção em E.coli em meio contendoampicilina, uma origem da replicação para a manutenção de plasmídeo emE.coli, e uma origem de 2 mícrons de replicação para manutenção de Scerevisiae. Os marcadores nutricionais selecionáveis usados para leveduras epresentes nos plasmídeos de expressão, eram um dos seguintes: gene HIS3codificando a emidazoleglicerolfosfato desidratase, o gene URA3 codificandoa orotidina 5'-fosfatato decarboxüase, o gene TRPl codificando N-(5'-fosforibosil)-antranilato isomerase, e LEU2 codificando a P-isopropilamatodesidrogenase.

As estruturas de leitura aberta para dhaT, dhaB3, dhaB2 edhaBl, foram amplificadas a partir de pHK28-26 (ID. SEQ. Na 19) por PCR,usando iniciadores (ID. SEQ. Ne 38 com ID. SEQ. N2 39; ID. SEQ. Na 40 comID. SEQ. N2 41; ID. SEQ. Na 42 com ID. SEQ. Nfl 43, e ID. SEQ. N2 44 comID. SEQ. N2 45; para dhaT, dhaB3, dhaB2 e dhaBl, respectivamente),incorporando locais EcoRI nas extremidades 5' (Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50mM, MgCl21,5 mM, gelatina 0,0001%, dATP 200 ^M, dCTP 200 ^M, dGTPiM, dTTP 200 ^iM, cada iniciador 1 pM, 1-10 ng de DNA alvo, 25unidades/ml de polimerase DNA de Amplitaq™ (Perkin-Elmer Cetus,Norwalk CT)). Os parâmetros de PCR foram 1 minuto a 94fiC, 1 minuto a55aC, 1 minuto a 72aC, 35 ciclos. Os produtos foram subclonados no localEcoRI de pHIL-D4 (Phillips Petroleum, Bartleville, OK) para gerar osplasmídeos pMPl3, PMP14, pMP20 e PMP15, contendo dhaT, dhaB3, dhaB2e dhaBl, respectivamente.

Construção de dhaBl. plasmfHpp de expressão pMCKlO

O plasmídeo de replicação 7,8 kb pGADGH (Clontech. PaloAlto, CA) foi digerido com HindIII, desfosforilado, e ligado ao fragmentodhaBl HindIII a partir de pMPlõ. 0 plasmídeo resultante (pMCKlO) tinhao dhaBl corretamente orientado para a transcrição a partir do promotorADH1, e continha um marcador LEU2.

Construção de dhaB2 plasmiHpn de expressão pMCKn 7

O plasmídeo pGADGH (Clontech. Palo Alto, CA) foi digeridocom HindIII e as extremidades de filamento único foram convertidas emextremidades EcoRI mediante ligação com adaptadores com HindIII-XmnI eEcoRI-XmnI (New England Biolabs, Beverly, MA). Foi realizada a seleçãodos plasmídeos com extremidades EcoRI corretas mediante ligação a umgene de resistência à canamicina em um fragmento de EcoRI a partir deplasmídeo pUC4K (Pharmacia Biotech, Uppsala), a transformação em DH5ccde linhagem E.coli, e a seleção em placas de LB, contendo 25 ^g/ml decanamicina. O plasmídeo resultante (pGAD/KAN2) foi digerido com SnaBI eEcoRI e um fragmento de 1,8 kb com o promotor de ADHl, foi isolado. Oplasmídeo pGBT9 (Clontech. Palo Alto, CA) foi digerido com SnaBI e EcoRI,e um fragmento de 1,5 kb ADH1/GAL4, foi substituído pelo fragmento depromotor de 1,8 kb ADHl, isolado a partir de pGAD/KAN2, mediantedigestão com SnaBI e EcoRI. O vetor resultante (pMCKll) é um plasmídeoreplicação em levedura com um promotor ADHl e terminador, e ummarcador TRPl. O plasmídeo pMCKll foi digerido com EcoRI,desfosforilado e ligado ao fragmento dhaB2 EcoRI, a partir, de pMP20. Oplasmídeo resultante (pMCKl7) tinha o dhaB2 corretamente orientado paraa transcrição a partir do promotor ADHl, e continha um marcador TRPl.Construção de dhafíS. plasmídpn de expressão pMCKSO

O plasmídeo pGBT9 (Clontech. Palo Alto, CA) foi digerido comNaeI e PvuII, e o gene de 1 kb TRPl foi retirado deste vetor. O gene TRPIfoi substituído por um gene URA3 doado como um fragmento de 1,7 kbAatll/Nael a partir do plasmídeo pRS406 (Stratagene) para dar o vetorintermediário pMCK32. O promotor ADHl truncado presente no pMCK32,foi retirado em um fragmento de 1,5 kb SnaBI/EcoRI e substituído com umpromotor ADHl de comprimento total, em um fragmento de 1,8 kbSnaBI/EcoRI a partir do plasmídeo pGAD/KAN2, resultando o vetorPMCK26. O local EcoRI único em pMCK26 foi utilizado para inserir umfragmento de EcoRI com dhaBS a partir do plasmídeo PMP14, resultandoem pMCK30. O plasmídeo de expressão de replicação pMCKSO tem o dhaBSorientado para a expressão a partir do promotor ADH1, e tem um marcadorURA3.

Construção de dhaT, plasmídeo de evprpggân pA/rr

O plasmídeo pGBT9 (Clontech. Palo Alto, CA) foi digerido comNaeI e PvuII, e o gene de 1 kb TRPl foi retirado deste vetor. 0 gene TRPIfoi substituído por um gene HIS3, doado como um fragmento de XmnI/Naela partir do plasmídeo pRS403 (Stratagene) fornecendo assim o vetorintermediário PMCK33. O promotor ADHl truncado presente no pMCK33,foi retirado em um fragmento de 1,5 kb SnaBI/EcoRI e substituído com umpromotor ADHl de comprimento total, em um fragmento de 1,8 kbSnaBI/EcoRI a partir do plasmídeo pGAD/KAN2, resultando o vetorPMCK31. O local EcoRI único em pMCK31 foi utüizado para inserir umfragmento de EcoRI com dhaT a partir do plasmídeo PMP13, resultando empMCK35. 0 plasmídeo de expressão replicação pMCK35, tem o dhaTorientado para a expressão a partir do promotor ADHl, e tem um marcadorHIS3.

Transformação Hp ,9. cerevisiae com plasrmdpns de evprpsggn

A linhagem de S cerevisiae YPH500 (ura3-52 lys2-801 ade2-101trpl-A63 his-A200 Ieu2-Al) (Sikorski R. S. e Hieter P., Genetics 122, 19-27(1989)) comprada da Stratagene (La Jolla, CA), foi transformada com 1 a 2jig de DNA de plasmídeo, usando um Kit de Transformação de Levedura EZCongelado (Catálogo N2 T2001) (Zymo Research, Orange, CA). Colôniascresceram em um Meio Mínimo Complementado (SMM □ 0,67% de base denitrogênio de levedura sem aminoácidos, glicose 2%) por 3 a 4 dias a 252C,acrescentado-se um ou mais dos seguintes itens: sulfato de adenina (20mg/l), uracil (20 mg/l), L-triptofano (20mg/l), L-histidina (20 mg/l), L-Ieucina(30 mg/l), L-Iisina (30 mg/l). As colônias foram riscadas em placas de seleçãoe utilizadas para inocular meio líquido.

Separação de transformantes de S. ceremsirw.. quanto a ^nss dhn

DNA cromossômico de transformantes URA+, HIS+, TRP+,LEU+ foi analisado mediante PCR utilizando iniciadores específicos paracada gene (Id. Seq. Números 38-45). Foi confirmada a presença de todas asquatro estruturas de leitura aberta.

Expressão de atividade de dh.a.fí p dhaT em S. cerevisiae transformada

A presença de glicerol desidratase ativa (dhaB) e 1,3-propanodiol oxidoreductase (dhaT) foi demonstrada utüizando-se testes deenzima in vitro. Além disso, a análise de borrão western confirmou aexpressão de proteína das quatro estruturas de leitura aberta.

A linhagem YPH500, transformada com o grupo de plasmídeospMCKlO, pMCK17, pMCK30 e pMCK35 cresceu em um Meio Mínimocomplementado contendo uma base de nitrogênio de levedura 0,67% semaminoácidos, glicose 2%, 20 mg/l de sulfato de adenina, e 30 mg/l de L-lisina.As células foram homogeneizadas e os extratos foram submetidos a testespara verificar a atividade dhaB. Uma atividade específica de 0,12 unidadespor mg de proteína foi obtida para a glicerol desidratase, e 0,024 unidadespor mg de proteína para 1,3-propanodiol oxidoreductase.

Exemplo 4

Produção de 1.3-Propanodiol a partir da D-Olicose UsandoSaccharnmyces cerevisiae Rftcomhiriante

A S. cerevisiae YPH500, aceitando os grupos de plasmídeospMCKlO, pMCKl7, pMCK30 e pMCK35 cresceu em um fermentadorBiostatB (B Braun Biotech, Inc.) em 1,0 1 de meie mínimo contendoinicialmente 20 g/l de glicose, 6,7 g/l de base de nitrogênio de levedura semaminoácidos, 40 mg/l de sulfato de adenina e 60 mg/l de HCl de L-lisina.Durante a fase de crescimento, acrescentou-se um equivalente adicional debase de nitrogênio de levedura adenina e lisina. O fermentador foicontrolado a um pH de 5,5 com a adição de ácido fosfdrico 10% e NaOH 2 M,30°C e tensão de oxigênio dissolvido 40% mediante controle da agitação.Após 38 horas, as células (OD600 = 5,8 AU) foram colhidas mediantecentrifugação e ressuspensas em meio de base (6,7 g/l de base de nitrogêniode levedura sem aminoácidos, 20 mg/l de sulfato de adenina, 30 mg/l de HClde L-lisina e tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH de 7,0).

Foram preparadas misturas de reação contendo células (OD600= 20 AU) em um volume total de 4 ml de um meio de base complementadocom glicose 0,5%, 5 ng/ml de coenzima B12 e cloroquina 0, 10, 20, ou 40 mM,na ausência de luz e oxigênio (com borrifamento de nitrogênio) em garrafasde soro de 10 ml vedadas hermeticamente mediante plissagem e incubadas a30°C com agitação. Após 30 horas, as alíquotas foram retiradas e analisadasmediante HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Exemplo 5Usode um TransformanteJDuplo de S. ™re„iMae oaya ade 1,3-propanodiol a partir de fí-^lirose em HhaB * HhnT

Integrados no Gennma

0 Exemplo 5 antecipadamente demonstra a transformação deS. cerevisiae com dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT e a integração estável dosgenes no genoma de levedura para a produção de 1,3-propanodiol a partir daglicose.

Construção de cassetes de PYpvpgg^

Quatro cassetes de expressão (dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT)foram construídos para a expressão de constituição induzida por glicose e denível elevado destes genes no levedura, Saccharomyces cerevisiae. Estescassetes consistem: (i) do promotor da fosfoglicerato quinase (PGK) dalinhagem de S. cerevisiae S288C; (ii) de um dos genes dhaBl, dhaB2, dhaB3,e dhaT; e (iii) do terminador de PGK da linhagem de S. cerevisiae S288C. Atécnica com base em PCR de se fazer a divisão do gene mediante extensãosobreposta (Horton et al., Biotechniques, 8:528-535, (1990)) é usada pararecombinar seqüências de DNA para gerar estes cassetes com juntasperfeitas (sem marcas de junção) para uma expressão ótima de cada gene.

Estes cassetes são clonados individualmente em um vetor adequado(pLITMUS 39) com locais de restrição capazes de receber clonagem demulticassetes em plasmídeos de expressão de levedura.

Construção de vetores de integração dg Wftrinrn

São construídos vetores utilizados para fazer a integração decassetes de expressão dentro do genoma da levedura. Estes vetores contêmos seguintes elementos: (i) uma região de policlonagem dentro dos quais sãosubclonados cassetes de expressão, (ii) um marcador exclusivo utilizado paraselecionar transformantes de levedura estáveis; (iii) a origem de replicação eo marcador selecionável permitem a manipulação do gene na E. coli antes detransformar o levedura. Um vetor de integração contém J marcadorauxotrófico VRA3 (YIp352b), e um segundo vetor de integração contém omarcador auxotrófico L YS2 (pKP7).

Construção de plasmídens Hp opressão ri*

Cassetes de expressão para dhaBl e dhaB2 são subclonados naregião de policlonagem do YIp352b (plasmídeo de expressão n° 1), e cassetesde expressão para dhaBS e dhaT são subclonados na região de policlonagemde pKP7 (plasmídeo de expressão na 2).

Transformação de WeHnra com P1asmf,W rio exprfissan

A S. cerevisiae (uraB, IysS) é transformada com o plasmídeo deexpressão na 1 utilizando-se o kit de Transformação de Levedura Frozen-EZ(Zymo Research, Orange, CA), e os transformantes são selecionados emplacas isentas de uracil. A integração dos cassetes de expressão para dhaBle dhaB2 é confirmada mediante análise de PCR de DNA cromossômico. Ostransformantes selecionados são retransformados com o plasmídeo deexpressão n2 2, utüizando o kit de Transformação de Levedura Frozen-EZ, eos transformantes duplos são selecionados em placas isentas de lisina. Aintegração dos cassetes de expressão para bhaB3 e dhaT é confirmadamediante a análise de PCR em DNA cromossômico. A presença de todos osquatro cassetes de expressão {dhaBl, dhaB2, dhaB3, e dhaT) emtransformantes duplos é confirmada pela análise do PCR de DNAcromossômico.

Produção de proteína a partir de levedura duplamente transformaria

A produção de proteínas codificadas por dhaBl, dhaB2, dhaB3,e dhaTa partir de levedura duplamente transformada é confirmada pelaanálise de borrão western.

A atividade enzimática a partir da levedura riiTPIamente transformariaativa a partir de levedura duplamente transformada é con boiada por tejtode enzima conforme descrito nos Métodos Gerais acima.

Produção de 1 ,,3-propãnodiol a partir de levedura duplamente ^nsfnvmadfl

A produção de 1,3-propanodiol a partir de glicose em leveduraduplamente transformado é demonstrada essencialmente conforme descritono Exemplo 4.

Exemplo 6

Construção de PTasmfdeog Contendo DAR1/OPP9 ou dhnT/dhnRi-ge Transformarão em espantes de KltthMIn

K. pneumoniae (ATCC 25955), K pneumoniae (ECL2106) e K.oxytoca (ATCC 8724) são naturalmente resistentes à ampicüina (até 150Hg/ml) e kanamicina (até 50 ^g/ml), mas sensíveis à tetraciclina (10 ng/ml) eao cloranfenicol (25 pg/ml). Conseqüentemente, os plasmídeos que codificama resistência a estes últimos dois antibióticos são potencialmente úteis comovetores de clonagem para estas linhagens de Klebsiella. A K. pneumoniae(ATCC 25955) natural, a K pneumonia (ECL2106) depreciada por glicose, ea K oxytoca (ATCC 8724) foram transformadas com sucesso em resistênciaà tetraciclina mediante eletroporação com o plasmídeo de número de cópiasmoderadas pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA). Isto foi realizadopelo seguinte procedimento: dez ml de uma cultura deixada durante a noitefoi inoculada em um litro de LB (1% (p/v) Bactotriptona (Difco. Detroit, MI),extrato de Bactolevedura 0,5% (p/v) (Difco) e NaCl 0,5% (p/v) (Sima, St.Louis, MO) e a cultura foi incubada a 37aC rendendo um OD600 de 0,5 a 0,7.As células foram resfriadas em gelo, colhidas mediante centrifugação a 4000x g por 15 minutos, e ressuspensas em um 11 de glicerol 10% estéril gelado.As células foram colhidas repetidamente mediante centrifugação eprogressivamente ressuspensas em 500 ml, 20 ml e, finalmente, em 2 ml deglicerol a 10% estéril gelado. Para a eletroporação, 40 jal de células forammisturadas com 1 a 2 de DNA em uma cubeta de «tf-çm s recaiamimpulsos de 200 Q, 2,5 kV durante 4 a 5 milissegundos, utilizando umPulsador de Gene BioRad (BioRad, Richmond, CA). Um M1 de meio SOC (2%(P/v) de Bactotriptona (Difco), extrato de Bactolevedura 0,5% (p/v) (Difco)fNaCl 10 MM, MgCl2 10 ^iM, MgSO4 10 ,M, KCl 2,5 MMe glicose 20 ,M foiacrescentado às células e após a suspensão ter sido transferida a um tubo depolipropileno estéril de 17 x 1000 mm, a cultura foi incubada durante umahora a 37°C, e 225 rpm. As alíquotas foram colocadas em placas em meioseletivo, conforme indicado. Análises do DNA de plasmídeos a partir detransformantes independentes resistentes a tetraciclina mostraram padrõesde digestão de endonuclease de restrição típicos de pBR322, indicando que ovetor era mantido de modo estável após a cultura durante a noite a 3TC emLB contendo a tetraciclina (10 ^g/ml). Desta forma, este vetor e derivadostais como pBR329 (ATCC 37264) que codificam resistência à ampicilina,tetraciclina e cloranfenicol, podem ser utilizados para introduzir os cassetesde expressão DARl/GPP2 e dhaT/dhaBl-3 na K pneumonia e K oxytoca.

Os genes DAEl e GPP2 podem ser obtidos medianteamplificação mediada por PCR a partir do genoma de Saccharomyceseereuisiae, com base em sua seqüência de DNA conhecida. Os genes sãoentão transformados em K pneumonia ou K oxytoca sob controle de um oumais promotores que podem ser utilizados para adicionar sua expressão nomeio contendo glicose. Para efeitos de conveniência, os genes foram obtidosem um fragmento de DNA de 2,4 kb obtido mediante digestão do plasmídeopAH44 com a endonuclease de restrição PvuII, mediante a qual os genes jásão dispostos em um cassete de expressão sob o controle do promotor Iae deE. eoli. Este fragmento de DNA foi ligado a um pBR329, digerido por PvuII,produzindo a inativação de inserção de seu gene de resistência aocloranfenicol. 0 DNA ligado foi utilizado para transformar o DH5a de E. eoli(Gibco, Gaithersberg, MD). Os transformantes foram selecionados pela suaresistência à tetraciclina (10 ng/ml) e foram submetidos a separação paraverificar sua sensibüidade ao cloranfenicol (25 ^ig/ml). A análise do DNA deplasmídeo de transformantes resistentes à tetraciclina e sensíveis aocloranfenicol confirmou a presença dos plasmídeos esperados, em que ocassete de expressão Piac-darl-gpp2 foi subclonado nos dois sentidos deorientação no local PvuII de pBR329. Estes plasmídeos, designados pJSPlA(orientação no sentido horário) e pJSPlB (orientação no sentido anti-horário), foram separadamente transformados mediante eletroporação emK pneumonia (ATCC 25955), K. pneumonia (ECL2106) e K. oxytoca (ATCC8724) conforme descrito. Os transformantes foram selecionados pela suaresistência à tetraciclina (10 ng/ml) e foram submetidos a separação paraverificar sua sensibüidade ao cloranfenicol (25 |ig/ml). A análise de restriçãodos plasmídeos isolados de transformantes independentes mostraramsomente os padrões de digestão esperados e confirmaram que eles eramestavelmente mantidos a 37flC com seleção de antibiótico. A expressão dosgenes DARl e GPP2 pode ser aperfeiçoada pela adição de IPTG (0,2 a 2,0mM) ao meio de crescimento.

Os quatro genes de K pneumonia dhaB(l-3) e dhaT podem serobtidos mediante amplificação mediada por PCR a partir do genoma de K.pneumonia com base em sua seqüência de DNA conhecida. Estes genes sãoentão transformados em K. pneumonia sob controle de um ou maispromotores que podem ser utilizados para adicionar sua expressão no meiocontendo glicose. Para efeitos de conveniência, os genes foram obtidos emum fragmento de DNA de aproximadamente 4,0 kb, obtido mediantedigestão do plasmídeo pAH24 com as endonucleases de restrição KpnI/Saci,mediante as quais os genes já estão dispostos em um cassete de expressãosob o controle do promotor Iac de E. coli. Este fragmento de DNA foi ligado aum pBC-KS+ digerido de forma semelhante (Stracagene, LaJollar CA) eutilizado para transformar o DH5a de E coli. Os transformantes foramselecionados pela sua resistência ao cloranfenicol (25 ^g/ml) e foramsubmetidos a separação para verificar um fenótipo de colônia branca emágar LB contendo X-gal. Análise de restrição do DNA de plasmídeo a partirde transformantes resistentes ao cloranfenicol demonstrando o fenótipo decolônia branca confirmou a presença do plasmídeo esperado, chamado depJSP2, em que os genes dhaT-dhaB(l-3) foram subclonados sob o controledo promotor Iac do E. coli.

Para melhorar a conversão de glicose em 3G, este plasmídeo foiseparadamente transformado mediante eletroporação em K. pneumoniae(ATCC 25955) (pJSPlA), K. pneumoniae (ECL2106) (pJSPlA) e K. oxytoea(ATCC 8724) (pJSPlA) já contendo o cassete de expressão Pl&c-darl-gpp2.Foram selecionados co-transformantes pela sua resistência tanto àtetraciclina (10 ng/ml) como ao cloranfenicol (25 (ag/ml). A análise derestrição dos plasmídeos isolados a partir de co-transformantesindependentes mostraram os padrões de digestão esperados tanto para opJSPIA quanto para o pJSP2. A expressão dos genes DARl, GPP2, dhaB(l-3) e dhaT pode ser melhorada pela adição de IPTG (0,2 a 2,0 mM) ao meio.

Exemplo 7

Produção de 1,3-propanodiol a partir de glirose pela IC pnei.nnnino

Linhagens da Klebsiella pneumoniae ECL 2106 e 2106-47,ambas transformadas com pJSPlA e ATCC 25955, transformados compJSPIA e pJSP2, cresceram em um fermentador de 51 Applikon sob váriascondições (ver Tabela 4) para fazer a produção de 1,3-propanodiol a partir deglicose. A linhagem 2104-47 é um derivado de ECL 2106 tolerante aofluoroacetato que foi obtido a partir de uma seleção de fluoroacetato/lactato,conforme descrito em Bauer et al., Appl. Environ. Microbiol. 56, 1296(1990). Em cada caso, o meio utilizado continha de tampão de fosfato depotássio 50 a 100 mM, com pH de 7,5, (NH4)2SO4 10 mM, extrato de levedura0,1% (P/v), CoCl210 μΜ, CuCl2 6,5 μΜ, FeCl3100 μΜ, FeSO418 μΜ, H3BO3 5μΜ, MnCl2 50 μΜ, Na2MoO4 0,1 μΜ, ZnCl2 25 μΜ, MgSO4 0,82 mM, CaCl2 0,9mM, e 10 a 20 g/l de glicose. Acrescentou-se mais glicose, sendo que a glicoseresidual foi mantida em excesso. A temperatura foi controlada em 37°C e oPH foi controlado em 7,5 com KOH ou NaOH 5N. Foram incluídosantibióticos para a manutenção de plasmídeo; também foi acrescentadoIPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosida) nas concentrações indicadas. Paraas fermentações anaeròbicas, foi borrifado nitrogênio 0,1 wm no reator;quando o ponto de ajuste desejado dO estava em 5%, ar 1 wm de foi injetadodentro do reator e o meio foi complementado com vitamina B12. Asconcentrações finais e os rendimentos totais (g/g) são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Exemplo 8

Conversão de Substrato de Carhnno em 1.3-propanoHinT MedianteK. pneumoniae Recomhinflntp Contendo darl. gpp2. dhaR ρ HhnTA. Conversão de D-frutose em 1,3-propanodiol por váriaslinhagens de K pneumoniae recombinante:

Colônias únicas de K pneumoniae (ATCC 2599 pJSPlA) K.pneumoniae (ATCC 25955 PJSPlA/pJSP2),

pJSPlA), e K pneumoniae (ATCC 2106 PJSP1A/PJSP2) foram transferidasde placas de ágar e, em tubos de cultura separados foram subcultivadasdurante a noite em mosto de Luria-Bertani (LB) contendo o agente ouagentes antibióticos apropriados. Um frasco de 50 ml contendo 45 ml de ummeio mínimo filtrado estéril, definido como LLMM/F que contém por litro:g de frutose; Ig de extrato de levedura; 50 mmoles de fosfato de potássio,com pH de 7,5; 40 mmoles de (NH4)2SO4; 0,09 mmoles de cloreto de cálcio;

2,38 mg de CoC12.6H20; 0,88 mg de CuCl2.2H20; 27 mg de FeCL,6H20; 5 mgde FeSO4-7H20; 0,31 mg de H3BO3; 10 mg de MnCL,4H20; 0,023 mg deNa2Mo04-2H20; 3,4 mg de ZnCl2; 0,2 g de MgS04.7H20. Foi acrescentadatetraciclina a 10 pg/ml ao meio para fazer reações utilizando todos osrecombinantes de plasmídeo único; 10 pg/ml de tetraciclina e 25 Mg/ml decloranfenicol para realizar as reações utilizando todos os recombinantes deplasmídeo duplo. O meio foi completamente borrifado com nitrogênio antesda inoculação com 2 ml da subcultura. Foi acrescentado IPTG (I) naconcentração final de 0,5 mM a alguns frascos. Os frascos foram tampados eentão incubados a 37°C, a 100 rpm, em um incubador/agitador Série 25 daNew Brunswick. As reações foram deixadas acontecer por pelomenos 24 horas até que a maior parte do substrato de carbonotivesse sido convertida em produtos. As amostras foramanalisadas mediante HPLC. ATabela 5 descreve os rendimentosde 1,3-propanodiol produzidos a partir da frutose por váriasKlebsiella recombinantes.

Tabela 5Produção de 1,3 propanodiol a partir de D-fructose , utilizado Klebsiellarecombinante

<table>table see original document page 66</column></row><table>

B. Conversão de vários substratos de carbono em 1,3-propanodiol por Kpneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA/pJSP2):

Uma alíquota (0,1 ml) de culturas de estoque congeladas de K.pneumoniae (ATCC 25955 pJSPlA/pJSP2) foi transferida para um meio deSemente de 50 ml em um frasco deflector de 250 ml. 0 meio de Sementecontinha por litro: 0,1 de tampão de NaK/P04 molar, pH de 7,03; 3 g de(NH4)2SO4; 5 g de MgSO4-7H20, 10 ml de solução de Trace Element 100X, 25mg de cloranfenicol, 10 mg de tetraciclina, e 1 g de extrato de levedura. OTrace Element 100X continha por litro: 10 g de ácido cítrico, 1,5 g deCaCl2-2H20, 2,8 g de FeS04-7H20, 0,39 g de ZnS04-7H20, 0,38 g deCuSO4 SH2O, 0,2 g de CoC12-6H20, e 0,3 g de MnCl2-4H20. A soluçãoresultante foi titulada obtendo-se pH de 7,0 ou com KOH ou com H2SO4. Aglicose, o Trace Element, os antibióticos e os extratos de leveduras foramesterilizados separadamente. Deixou-se crescer o inóculo de sementedurante a noite a 352C e 250 rpm.O projeto da reação era semiaeróbico. 0 sistema consistia de130 ml de meio de Reação em frascos herméticos de 125 ml que foramdeixados parcialmente herméticos com uma· folha de alumínio. O Meio deReação continha por litro: 3 g de (NH4)2SO4; 20 g de substrato de carbono;tampão de NaKZPO4 0,15 molar; pH de 7,5; 1 g de extrato de levedura; 0,15 gde MgSO4-TH2O; IPTG 0,5 mmoles; 10 ml de solução de Trace Element 100X;25 mg de cloranfenicol; e 10 mg de tetraciclina. A solução resultante foititulada resultando em pH de 7,5 com KOH ou H2SO4. As fontes de carbonoeram: D-glicose (Glc); D-frutose (Frc); D-Iactose (Lac); D-sacarose (Sue); D-maltose (Mal); e D-manitol (Man). Algumas bolinhas de vidro foramincluídas no meio para melhorar a mistura. As reações foram iniciadas pelaadição de inòculo de semente de modo que a densidade ótica da suspensãoda célula começava em 0,1 AU conforme medido em λ600 nm. Os frascosforam incubados a 35SC, 250 rpm. A produção de 3G foi medida por HPLCapós 24 horas. A Tabela 6 descreve os rendimentos de 1,3-propanodiolproduzido a partir dos vários substratos de carbono.

Tabela β

Produção de 1,3-propanodiol a partir de vários substratos de carbonoutilizando Klebsiella 25955 pJSPlA/pJSP2 recombinante

<table>table see original document page 67</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE:

(A) NOME: Ε. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

(B) RUA: 1007 Market Street

(C) CIDADE: Wilmington

(D) ESTADO: Delaware

(E) PAÍS: Estados Unidos da América

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19898

(G) TELEFONE: 302-892-8112

(H) TELEFAX: 302-773-0164

(I) TELEX: 6717325

(A) NOME: GENENCOR INTERNATIONAL INC

(B) RUA: 4 Cambridge Place □ 1870 South Winton Road

(C) CIDADE: Rochester

(D) ESTADO: New York

(E) PAÍS: Estados Unidos da América

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 14618

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODO PARA A PRODUÇÃO

RECOMBINANTE DE 1,3-PROPANODIOL

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 49

(iv) FORMATO PARA LEITURA EM COMPUTADOR:

(A) MEIO: disquete 3,5 polegadas

(B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: Microsoft Word for Windows

5.0

(D) SOFTWARE: Microsoft Word 7.0(ν) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DE DEPÓSITO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: 60/030,601

(B) DATA DO DEPÓSITO: 13 de novembro de 1996(viii) INFORMAÇÃO SOBRE AGENTE/PROCURADOR:

(A) NOME: Floyd, Linda Axamethy

(B) NÚMERO DE REGISTRO: 33,692

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: CR-9982(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1668 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(iii) HIPOTÉTICO: não

(iv) SENTIDO CONTRÁRIO: não

(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: DHABl(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

ATGAAAAGAT TAAAACTATT TGCAGTACTG GCCCAGCGCC CCGTCAATCA GGACGGGCTG 60

ATTGGCGAGT GGCCTGAAGA C-GGGCTGATC GCCATGGACA GCCCCTTTGA CCCGGTCTCT 120

TCAGTAAAAG TGGACAACGG TCTGATCGTC GAACTGGACG GCAAACGCCG GGACCAGTTT 1=0

GACATGATTG ACCGATTTAT CGCCGATTAC GCGATCAACG TTGAGCGCAC AGAGCAGGCA 24 0

ATGCGCC73G AGGCGGTGGA AATAGCCCGT ATGCTGGTGG ATATTCACGT CAGCCGGGAG 200GAGATCATTG CCATCACTAT CGCCATTACG CCGGCCAAAG CGGTCGAGGT GATGGCGCAGATGAACG7GG TGGAG.-.7GA7 GATGGCGCTG CAGAAGATGC GTCCCCGCCG GACCCCCTCC 420

AACCAGTGCC AGG7CA7GA-A 7C7CAAAGA7 AATCCGGTGC AGATTGCCGC TGACGCCGCC

GAGGCCGGGA 7CGGGGGG77 CTCAGAACAG GAGACCACGG TCGGTATGGC GCGCTACGCG

CCGT7TAACG CCCTGGCGC7 G77GG7CGG7 7CGGAGTGCG GCCGCCCCGG CG7G7TGACG

CAGTGCTCGG 7GGA-AGAGGC CACCGAGCTG GAGCTGGGCA TGCGTGGC7T AACGAGC7AC

GCCGAGACGG 7G7GGG7G7A CGGGAGGGAA GCGGTATTTA CCGACGGCGA TGA7ACGCGG

TGG7CAAAGG GG77GG7GG7 G7GGGGG7AC GGCTCCCGGG GGTTGAAAA7 GCGCTACACC

TCCGGCAGGG GATCCGA.AGC GG7GA7GGGG TATTCGGAGA GCAAGTCGAT GC7GTACC7G

•oAATCGCGCT GCATCTTCA7 7ACTAAAGGC GCCGGGGTTC AGGGACTGCA AAACGGCGCG 90C

GTGAGCTGTA TCGGCA7GAC CGGCGCTG7G CCGTCGGGCA TTCGGGCGGT GCTGGCGGAA 960

AACCTGATCG CCTCTATGCT CGACCTCGAA GTGGCGTCCG CCAACGACCA GACTTTCTCC 1020

CACTCGGATA TTCGCCGCAC CGCGCGCACC CTGATGCAGA TGCTGCCGGG CACCGACTTT 108 0

ATTTTCTCCG GCTACAGCGC GGTGCCGAAC TACGACAACA TGTTCGCCGG CTCGAACTTC 114 0

GATGCGGAAG AT777GATGA 7TACAACATC CTGCAGCGTG ACCTGATGGT TGACGGCGGC 1200

CTGCGTCCGG TGACCGAGGC GGAAACCATT GCCATTCGCC AGAAAGCGGC GCGGC-CGATC 12 60

CAGGCGGTT7 TCCGCGAGCT GGGGCTGCCG CCAATCGCCG ACGAGGAGGT GGAGGCCGCC 1320

ACCTACGCGC ACGGCAGCAA CGAGATGCCG CCGCGTAACG TGGTGGAGGA TCTGAGTGCG 1380

GTGGAAGAGA TGATGAAGCG CAACATCACC GGCCTCGATA TTGTCGGCGC GCTGAGCCGC 144 0AGCGGCTTTG AGGATATCGC CAGCA.ATATT CTCAATATGC TGCGCCAGCG GGTCACCGGC 1500

GATTACCTGC AGACCTCGGC CATTCTCGAT CGGCAGTTCG AGGTGGTGAG TGCGGTCAAC 156G

GACATCAA.TG ACTATCAGGG GCCGGGCACC GGCTATCGCA TCTCTGCCGA ACGCTGGGCG 1620

GAGA7CAAAA ATATTCCGGG CG7GG77CAG CCCGACACCA TTGAATAA 16g£

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 585 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: DHAB2(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

TCGAAGGGGA CCACGGTCAT CCATCAGCGC GATCTGCTGC CGCTCAGCAA CCTGGAGCTG.--.v. ,.-CCGCTGCT GACGCTGGAG ACCTACCGGC AGATTGGCAA AAACGCTGCG

t^n.n.-unO., ivo-w GTGCCGGTGG TGAACGATCA GATGGTGCGC--v—TGGCCAAAGC CGCGCTATTT CATATCAAAG AGACCAAACA TGTGGTGCAG

-CGTCACCC7 GCACATCGAC TTAGTAAGGG AGTGA

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 426 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: DHAB3(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

ATGAGCGAGA AAACCATGCG CGTGCAGGAT TATCCGTTAG C.CACCCGCTG CCCGGAGCATATCCTGACGC CTACCGGCAA ACCATTGACC GATATTACCC TCGAGAAGGT GCTCTCTGGCGAGGTGGGCC CGCAGGATGT GCGGATCTCC CGCCAGACCC TTGAGTACCA GGCGCAGATTGCCGAGCAGA TGCAGCGCCA TGCGGTGGCG CGCAATTTCC GCCGCGCGGC GGAGCTTATCGCCATTCCTG ACGAGCGCAT TCTGGCTATC TATAACGCGC TGCGCCCGTT CCGCTCCTCG 300CAGGCGGnGC 7GCTGGCGAT CGCCGACGAG CTGGAGCACA CCTGGCATGC GACAGTGAAT 3 60GGGAGTC GGCGGAAGTG TATCAGCAGC GGCATAAGCT GCGTAAAGGAAGCTAA

60120180240

423

4c

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1164 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: DHAT

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4:ATGAGCTATC GTATGTTT^í

lUjA -íAI^.GG.G CCAAACGTTA ACTTT-^TG-G

ATTTCCGTAG TCGGCGAACG CTGCCAGCTG CTGGGGGGGA AAAAAGCCCT GCTGGTCACC 12CGACAAAGGCC TGCGGGCAAT TAAAGATGGC GCGGTGGACA AAACCCTGCA TTATCTGCGG IBCGAGGCCGGGA TCGAGGTGGC GATCTTTGAC GGCGTCGAGC CGAACCCGAA AGACACCAA.C 24 0GTGCGCGACG GCCTCGCCG7 GTTTCGCCGC GAACAGTGCG ACATCATCGT CACCGTGGGC 30 0GGCGGCAGCC CGCACGATTG CGGCAAAGGC ATCGGCATCG CCGCCACCCA TGAGGGCGAT 360CTGTACCAG7 A7GCCGGAAT CGAGACCCTG ACCAACCCGC TGCCGCCTAT CGTCGCGGTC 42CAATACCACCG CCGGCACCGC .CAGCGAGGTC ACCCGCCACT GCGTCCTGAC CAACACCGAA 4S0LnA^iuft ..,...,,Gft. ι v. AGCTGG CGCAAACTGC CGTCGGTCTC TATCAACGAT 54CCCACTGCTGA TGATCGGTAA ACCGGCCGCC CTGACCGCGG CGACCGGGAT GGATGCCCTG 600CCCACGCCG TAGAGGCCTA TATCTCCAAA GACGCTAACC CGGTGACGGA CGCCGCCGCC 66CATGCAGGCGA TCCGCCTCAT CGCCCGCAAC CTGCGCCAGG CCGTGGCCCT CGGCAGCAAT 720CTGCAGGCGC GGGAAAACAT GGCCTATGCT TCTCTGCTGG CCGGGATGGC TTTCAATAAC 780GCCAACCTCG GCTACGTGCA CGCCATGGCG CACCAGCTGG GCGGCCTGTA CGACATGCCG 84 0CACGGCGTGG CCAACGCTGT CCTGCTGCCG CATGTGGCGC GCTACAACCT GATCGCCAAC 900CCGGAGAAA7 TCGCCGATAT CGCTGAACTG ATGGGCGAAA ATATCACCGG ACTGTCCACT 960CTCGACGCGG CGGAAAAAGC CATCGCCGCT ATCACGCGTC TGTCGATGGA TATCGGTATT 1020CCGCAGCATC TGCGCGATCT GGGGG7AAAA GAGGCCGACT TCCCCTACAT GGCGGAGATG 1080GCTCTAAAAG ACGGCAATGC GTTCTCGAAC CCGCGTAAAG GCAACGAGCA GGAGATTGCC 114 0GCGATTTTCC GCCAGGCATT C~GA

1164

(2) INFORMAÇÃO PAEA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1380 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: GPDl

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 2964 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: GPD2(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

GAATTCGAGC CTGAAGTGCT GATTACCTTC AGGTAGACTT CATCTTGACC CATCAACCCCAGCGT .".AATC CTGCAAATAC ACCACCCAGC AGCACTAGGA TGATAGAGAT AATATAGTACGTGGTAACGC TTGCCTCATC ACCTACGCTA TGGCCGGAAT CGGCAACATC CCTAGAATTGAGTACGTGTG ATCCGGATAA CAACGGCAGT GAATATATCT TCGGTATCGT AAAGATGTGA

TATAAGATGA TGTATACCCA ATGAGGAGCG CCTGATCGTG ACCTAGACCT TAGTGGCAAA 300

AACGACA CTATTATAGT GGGGAGAGTT TCGTGCAAAT AACAGACGCA GCAGCAAGTA 3 60

ACTGTGACGA TATCAACTCT TTTTTTATTA TGTAATAAGC AAACAAGCAC GAATGGGGAA 4 20

HG--CTAT=TG CAATCACCAA GGTCGTCCCT TTTTTCCCAT TTGCTAATTT AGAATTTAAA 4 80

GAAACCAAAA GAATGAAGAA AGAAAACAAA TACTAGCCCT AACCCTGACT TCGTTTCTAT 5 4 0

TGCTTTAATG AACGGTATGC CCTAGGGTAT ATCTCACTCT GTACGTTACA 600

AACTCCGGTT ATTTTATCGG AACATCCGAG CACCCGCGCC TTCCTCAACC CAGGCACCGC 660

60120180240

AC CGTGCGCGAT GAGCTAATCC TGAGCCATCA CCCACCCCAC CCGTTGATGA

720

CrtGCr·--. _ TCG GGAGGGCGAA AATAAAACTG GAGCAAGGAA TTACCATCAC CGTCACCATC 7SC

ACCATCATAT CGCCTTAGCC TCTAGCCATA GCCATCATGC AAGCGTGTAT CTTCTAAGAT 34C

.CATT.-.CCGA GTTTGTTTTC CTTCACATGA TGAAGAAGGT TTGAGTATGC 900

-CGrtrtAO--AT AAGACGACGA TGGCTCTGCC ATTGGTTATA TTACGCTTTT GCGGCGAGGT 560

GC._oATGoGT TGCTGAGGGG .AAGAGTGTTT AGCTTACGGA CCTATTGCCA TTGTTATTCC 102 0

«/-.,irtrt.^TA TTGTTCAGCA GCTCTTCTCT ACCCTGTCAT TCTAGTATTT TTTTTTTTTT 1080

TTACTTTTTTT TCTTCTTGCC TTTTTTTCTT GTTACTTTTT TTCTAGTTTT 114G

...T> Cw ACTAAGCTTT TTCCTTGATT TATCCTTGGG TTCTTCTTTC TACTCCTTTA 1200

GAT.TT-TTT TTATATATTA ATTTTTAAGT TTATGTATTT TGGTAGATTC AATTCTCTTT 12 60

CCw..^w.. TTCCTTCGCT CCCCTTCCTT ATCAATGCTT GCTGTCAGAA GATTAACAAG 1320

ATMrifimfr^ /-'mmw*^^,^,,..

-aa^"* '-o^ATCCGGT GTTATATACT CGTCGTGCAT ATAAAATTTT 138 0

W-W.,. I wrtrtGrt TCTACTTTCC TAAGAAGATC ATTATTACAA ACACAACTGC ACTCAAAGAT 144 0

GACTGCTCAT ACTAATATCA AACAGCACAA ACACTGTCAT GAGGACCATC CTATCAGAAG 1500

ATCGGACTCT GCCGTGTCAA TTGTACATTT GAAACGTGCG CCCTTCAAGG TTACAGTGAT 1560

TGGTTCTGGT AACTGGGGGA CCACCATCGC CAAAGTCATT GCGGAAAACA CAGAATTGCA 162 0

TTCCCATATC TTCGAGCCAG AGGTGAGAAT GTGGGTTTTT GATGAAAAGA TCGGCGACGA 168CAAATCTGACG GATATCATAA ATACAAGACA CCAGAACGTT AAATATCTAC CCAATATTGA 1740

CCTGCCCCAT AATCTAGTGG CCGATCCTGA TCTTTTACAC TCCATCAAGG GTGCTGACAT ISOO

CCTTGTT7TC AACATCCCTC ATCAATTTTT ACCAAACATA GTCAAACAAT TGCAAGGCCA 13 60

CGTGGCCCCT CATGTAAGGG CCATCTCGTG TCTAAAAGGG TTCGAGTTGG GCTCCAAGGG 1920

TG7GCAA7TC- CTATCCTCCT ATGTTACTGA TGAGTTAGGA ATCCAATGTG GCGCACTATC 198G

TGGTGCAAAC TTGGCACCGG AAGTGGCCAA GGAGCATTGG TCCGAAACCA CCGTGGCTTA 204 0

CCAACTACCA .-.-.GGATTATC AAGGTGATGG CAAGGATGTA GATCATAAGA TTTTGAAATT 2100

GCTGTTCCAC AGACCTTACT TCCACGTCAA TGTCATCGAT GATGTTGCTG GTATATCCAT 2160

TGCCGGTGCC TTGAAGAACG TCGTGGCACT TGCATGTGGT TTCGTAGAAG GTATGGGATG 2220

GGGTAACAAT GCCTCCGCAG CCATTCAAAG GCTGGGTTTA GGTGAAATTA TCAAGTTCGG 22BO

TAGAATGTTT TTCCCAGAAT CCAAAGTCGA GACCTACTAT CAAGAATCCG CTGGTGTTGC 234 0

:TGC7 CAGGCGGTAG AAACGTCAAG GTTGCCACAT ACATGGCCAA 24 00

:TTGG AAGCAGAAAA GGAATTGCTT AACGGTCAAT CCGCCCAAGG 24 60

-nCGAGTG GCTACAAACA TGTGAGTTGA CCCAAGAATT 252 0

TACCAGATAG TCTACAACAA CGTCCGCATG GAAGACCTAC 25 5 0

o.n^AT^G.-.TG ACGA.ATAGAC ACTCTCCCCC CCCCTCCCCC 2 64 C

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 3178 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)<table>table see original document page 77</column></row><table>AA7GGAC7AC TTACAGACAA A7GGC7GAGG AAACAGTCGA CAAAG7TG7C GAAGrtCGCG I8CO

GA77CCACAA CC7GAAACC7 TGTCACACAA GAGATATTAA GCTTGCTGGT GCAGAAGAAT 1860

GGACGCAAAA C7A7G7GGC7 TTATTGGCTC AAAACTACCA TTTATCATCA AAAATGTCCA 192 0

AC7AC77GG7 7CAAAAC7AC GGAACCCGTT CCTCTATCAT TTGCGAATTT TTCAAAGAAT 19S0

CCATGGAAAA 7AAAC7GCC7 77G7CC77AG CCGACAAGGA AAATAACG7A ATCTACTCTA 204 0

GCGAGGAGAA CAAC77GG7C AA7777GA7A C77TCAGA7A TCCATTCACA ATCGG7GAG7 2100

TAAAG7A77C CA7GCAG7AC GAA7A77G7A GAAC7CCC77 GGAC77CC77 7TAAGAAGAA 2160

CAAGAT7CGC C77C77GGAC GCCAAGGAAG C777GAATGC CGTGCATGCC ACCGTCAAAG 2220TTATGGG7GA TGAGTTCAAT TGGTCGGAGA AAAAGAGGCA GTGGGAAC77 GAAAAAACTG 22 80

7GAAC77CA7 CCAAGGACG7 77CGGTG7C7 AAA7CGA7CA 7GA7AG77AA GGG7GACAAA 2340

GA7AACA77C ACAAGAG7AA 7AA7AA7GG7 AA7GA7GA7A ΑΤΑΑ7ΑΑΤΑΑ 7GA7AG7AAT 24CO

AACAA7AA7A ATAA7GG7GG 7AA7GGCAA7 GAAA7CGC7A TTATTACCTA TTTTCCTTAA 24 60

7GGAAGAG77 AAAG7AAAC7 AAAAAAAC7A CAAAAATATA 7GAAGAAAAA AAAAAAAAC-A 2520

GG7AA7AGAC 7C7AC7AC7A CAA77GA7C7 7CAAA7TATG ACC77CC7AG 7G777ATA77 2580

C7A777CCAA TACATAATAT AA7C7A.7A7A A7CAT7GC7G G7AGAC7TCC GTTTTAATAT 2640

^--T77*A77 A7CCCC777A 7C7C7AG7C7 AG7777A7CA 7AAAA7ATAG AAACAC7AAA 2700

7AA7A77C77 CAAACGG7CC 7GG7GCA7AC GCAA7ACA7A 777A7GG7GC AAAAAAAAAA 27 60

A7GGAAAA77- 77GC7AG7CA 7AAACCC777 CATAAAACAA TACGTAGACA 7CGC7AC77G 2820

üi.wift^ .CC7A7C7GC C77GACAACC TCA7CG7CGA 28S0

AA7rtG7ACCA 7T7AGAACGC CCAA7A77CA CA77G7G77C AAGG7C777A 7TCACCAG7G 2940

ACG7Gi.-_-.73 GCCA7GA77A A7G7GCC7G7 A7GG77AACC AC7CCAAA7A GC77A7A777 2000

CA7AG7G7CA 77G77777CA .

------------- . ΛΙ-1i ^.Λί-ι i ih lurtL^uic. . J 0 fc 0

.-.77777C773 G7CAAA77G7 AA7.-- --r^"-* r^A^iü"""" . „ . -..,„

----------W. .-_-_<-.i ou .-i . rtrtur. ι 1 i i i UO J U 0

. . λ. ....... - ^. CA.-.Í.7777G 77C77G7AA7 CAC7CGAG 21";

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 816 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 339 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: desconhecida

(D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(vi) FONTE ORIGINAL:

A) ORGANISMO: GPSA<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table>(A) COMPRIMENTO: 18 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 30:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 31:

--"v^ -----.GGA GGA.CAA7TC

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 32:

CATGGAATTG TCCTCC7TA

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 33:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 271 aminoácidos<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table>

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table>(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 47:

GTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 48:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 48:CATGACTAGT AAGGAGGACA ATTC

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 49:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CONFORMAÇÃO DA FITA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 49:

Claims

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 1,3-PROPANODIOL, a partir de um microrganismo recombinante,caracterizado pelo fato de que compreende:(i) transformar um microrganismo hospedeiro apropriado comum ou mais cassetes de transformação cada qual compreendendo pelo menosum de.(a) um gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfatodesidrogenase selecionado dentre os genes das SEQ ID N0 5 a 7;(b) um gene que codifica uma enzima glicerol-3-fosfataseselecionado dentre os genes das SEQ ID N0 8 e 9;(c) genes que codificam as subunidades alfa, beta e gama deuma enzima glicerol ou diol desidratase são as SEQ ID N0 1 a 3,respectivamente; e(d) um gene que codifica uma enzima 1,3-propanodioloxidoreductase, dita enzima sendo de SEQ ID N0 4,em que todos os genes (a) a (d) são introduzidos nomicrorganismo hospedeiro,(ii) cultivar o microrganismo hospedeiro transformado sobcondições apropriadas na presença de pelo menos uma fonte de carbonoselecionada do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos,polissacarídeos, ou um substrato de um único carbono, mediante o qual seproduz 1,3-propanodioL' e(iii) recuperar o 1,3-propanodiol.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro apropriado éselecionado do grupo que consiste de bactérias, leveduras e fungosfilamentosos.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro apropriado éselecionado do grupo de gêneros que consistem em Citrobacter,Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus,Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces,Pichia, Kluy^/eroniyces, Candida, Hanseii ula, Debaryomyces, MucorjTorulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomycese Pseudomonas.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro apropriado éselecionado do grupo que consiste de E coli, Klebsiella spp, e Saccharomycesspp.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o microrganismo hospedeiro transformado éuma Klebsiella spp transformada com um cassete de transformação quecompreende os genes GPDl e GPD2 que codificam uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase de SEQ ID N0 5 e 6, respectivamente.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é glicose.

7. MICROORGANISMO HOSPEDEIRO TRANSFORMADO,conforme definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que étransformado com um grupo de genes que compreende;(1) um gene que codifica uma enzima de glicerol-3-fosfatodesidrogenase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naSEQ ID N0 5;(2) um gene que codifica uma enzima de glicerol"3-fosfatasecorrespondente à seqüência de aminoácidos fornecida na SEQ ID N0 9;(3) um gene que codifica uma subunidade a da enzima deglicerol desidratase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naSEQ ID N01;(4) um gene que codifica a subunidade β da enzima de gliceroldesidratase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida na SEQID N'2';(5) um gene que codifica a subunidade γ da enzima de gliceroldesidratase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida na SEQID Nd 3; e(6) um gene que codifica a enzima de 1,3-propanodioloxidoreductase correspondente à seqüência de aminoácidos fornecida naSEQ ID N° 4,em que todos os genes (I) a (6) são introduzidos nomicroorganismo, eem que o microorganismo hospedeiro transformado produz 1,3-propanodiol em pelo menos um substrato selecionado do grupo que consistede monossacarideos, oligossacarídeos e polissacarídeos ou de um substratode um único carbono.