DE69938105T2

DE69938105T2 - Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen

Info

Publication number: DE69938105T2
Application number: DE69938105T
Authority: DE
Inventors: Frank Skraly; Oliver P. Arlington PEOPLES
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 1998-08-04
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: DE69938105D1; ES2302386T3; EP1975236A2; EP1975236A3; US6576450B2; WO2000008198A1; AU5337299A; US8609378B2; JP5042407B2; EP1105514A1; CA2339351A1; ATE385521T1; EP1105514B1; JP2002522043A; US20020142406A1; MXPA01001111A; US20120129232A1; US20050239179A1; EP1975236B1; CA2339351C

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Folgende betrifft generell das Gebiet der Produktion von Polyhydroxyalkanoaten über die Genmanipulation bakterieller Enzyme.
Zahlreiche Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit zur Akkumulation intrazellulärer Reserven aus Poly[(R)-3-hydroxyalkanoat] (PHA)-Polymeren. PHAs sind biologisch abbaubare und biokompatible thermoplastische Materialien mit einem breiten Spektrum industrieller und biomedizinischer Anwendungen (Williams und Peoples, 1996, CHEMTECH 26: 38–44). PHAs können mittels mehrerer verschiedener Fermentationsprozesse erzeugt werden und mittels unterschiedlicher Extraktionstechniken gewonnen werden (Übersichtsartikel siehe Braunegg et al., 1998, J. Biotechnol. 65: 127–161, Choi und Lee, 1999). Nutzpflanzen werden zur Erzeugung dieser Polymere auch gentechnisch manipuliert, und sie bieten eine Kostenstruktur, die mit der der Pflanzenöle auf einer Linie liegt, sowie die Fähigkeit zum direkten preislichen Wettbewerb mit Polymeren auf Mineralölbasis (Williams und Peoples 1996, CHEMTECH 26: 38–44, Poirier, Y. 1999, Plant Biotechnology S. 181–185). PHAs werden durch ein PHA-Synthase-Enzym gebildet. Beim Wachsen der Polymerketten bilden diese unlösliche Körnchen. Die PHAs können dann gewonnen und anschließend in Chemikalien überführt werden oder während des Gewinnungsprozesses in Chemikalien überführt werden (Martin et al., PCT WO 97/15681 ). Deshalb repräsentieren die PHAs, zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit als Polymere, einen einzigartigen Mechanismus zur Speicherung neuer Chemismen sowohl in mikrobiellen Systemen als auch in Nutzpflanzensystemen.
PHA-Copolymere, die 3-Hydroxyvalerat (3HV) enthalten, insbesondere PHBV, sind ausgiebig beschrieben worden. Viele Mikroorganismen vom Wildtyp sind in der Lage, 3HV-haltige PHAs zu erzeugen. PHBV ist kommerziell mittels Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus) aus Glucose und Propionat und aus Glucose und Isobutyrat produziert worden ( US-Patent 4 477 654 an Holmes et al.). Verschiedene andere Mikroorganismen und Prozesse sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt (Braunegg et al., 1998, Journal of Biotechnology 65: 127–161). Ein Poly(3HV)-Homopolymer ist mittels Chromobacterium violaceum aus Valerat erzeugt worden (Steinbüchel et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 443–449). PHAs, die 3HV-Einheiten enthalten, sind auch mittels rekombinanter Mikroorganismen synthetisiert worden. Escherichia coli, das die Gene von R. eutropha für die PHA-Biosynthese enthält, ist zur Erzeugung von PHBV aus Glucose und entweder Propionat oder Valerat (Slater et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58: 1089–1094) und aus Glucose und entweder Valin oder Threonin (Eschenlauer et al., 1996, Int. J. Biol. Macromol. 19: 121–130) eingesetzt worden. Klebsiella oxytoca, das die Gene von R. eutropha für die PHA-Biosynthese enthält, ist zur Erzeugung von PHBV aus Glucose und Propionat eingesetzt worden (Zhang et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60: 1198–1205). R. eutropha, das die Gene von Aeromonas caviae für die PHA-Biosynthese enthält, wurde zur Erzeugung von Poly(3HV-co-3HB-co-3HHp) aus Alkansäuren mit einer ungeraden Zahl von Kohlenstoffatomen eingesetzt (Fukui et al., 1997, Biotechnol. Lett. 19: 1093–1097).
PHA-Copolymere, die 3-Hydroxypropionat-Einheiten enthalten, sind ebenfalls beschrieben worden. Holmes et al. ( US-Patent 4 477 654 ) setzten R. eutropha zur Synthese von Poly(3HP-co-3HB-co-3HV) aus Glucose und entweder 3-Chlorpropionat oder Acrylat ein. Doi et al. (1990, in E. A. Dawes (Hrsg.), Novel Biodegradable Microbial Polymers, Kluwer Academic Publishers, Die Niederlande, S. 37–48) setzten R. eutropha zur Synthese von Poly(3HP-co-3HB) aus 3-Hydroxypropionat, 1,5-Pentandiol, 1,7-Heptandiol oder 1,9-Nonandiol ein. Hiramitsu und Doi (1993, Polymer 34: 4782–4786) setzten Alcaligenes latus zur Synthese von Poly(3HP-co-3HB) aus Saccharose und 3-Hydroxypropionat ein. Shimamura et al. (1994, Macromolecules 27: 4429–4435) setzten A. latus zur Synthese von Poly(3HP-co-3HB) aus 3-Hydroxypropionat und entweder 3-Hydroxybutyrat oder Saccharose ein. Der höchste Anteil an 3-Hydroxypropionat, der in diese Copolymere inkorporiert wurde, lag bei 88 Mol-% (Shimamura et al., 1994, ebenda). Es sind keine rekombinanten Produzenten von 3HP-haltigem PHA in diesem Fachgebiet beschrieben worden.
Es ist unter ökonomischen Gesichtspunkten wünschenswert, diese Polymere in transgenen Nutzpflanzenspezies produzieren zu können. Verfahren zur Produktion von Pflanzen wurden beschrieben im US-Patent Nr. 5 245 023 und im US-Patent Nr. 5 250 430 , im US-Patent Nr. 5 502 273 , im US-Patent Nr. 5 534 432 , im US-Patent Nr. 5 602 321 , im US-Patent Nr. 5 610 041 , im US-Patent Nr. 5 650 555 , im US-Patent Nr. 5 663 063 , in WO 9100917 , WO 9219747 , WO 9302187 , WO 9302194 und WO 9412014 , bei Poirier et al., 1992, Science 256: 520–523 und bei Williams und Peoples, 1996, Chemtech 26: 38–44). Zur Erreichung dieses Ziels ist es erforderlich, ein Gen, oder Gene im Falle einer PHA-Polymerase mit mehr als einer Untereinheit, das bzw. die für eine PHA-Polymerase eines Mikroorganismus codiert bzw. codieren, in Pflanzenzellen zu transferieren und das geeignete Ausmaß der Erzeugung des PHA-Polymerase-Enzyms zu erzielen. Außerdem kann es erforderlich sein, zusätzliche Gene für die PHA-Biosynthese bereitzustellen, z. B. ein Gen für die Ketoacyl-CoA-Thiolase, ein Gen für die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, ein Gen für 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase oder andere Gene, die für Enzyme codieren, die für die Synthese der Substrate für die PHA-Polymerase-Enzyme erforderlich sind. In vielen Fällen ist es erwünscht, die Expression in verschiedenen Pflanzengeweben oder -organellen steuern zu können. Verfahren zur Steuerung der Expression in Pflanzengeweben oder -organellen sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244: 1293–1299, Gene Transfer to Plants, 1995, Potrykus, I. und Spangenberg, O., Hrsg., Springer Verlag Berlin Heidelberg New York, und „Transgenic Plants: A Produktion System for Industrial and Pharmaceutical Proteins", 1996, Owen, M. R. L. und Pen, J., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., England).
Zwar kennt man Verfahren zur Produktion mehrerer verschiedener Copolymere in bakteriellen Fermentationssystemen, und es ist die Produktion von PHAs in Pflanzen erreicht worden, aber das Spektrum an Copolymeren, das in Bakterien möglich ist, ist in Pflanzen nicht erreicht worden. Es wäre deshalb vorteilhaft, zur Erzeugung verschiedener Copolymere in transgenen Pflanzen in der Lage zu sein und über mehr Optionen bezüglich der Substrate, die von den transgenen Pflanzen verwertet werden sollen, verfügen zu können.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Reagenzien zur Produktion von PHAs in Pflanzen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Reagenzien zur Produktion von PHAs unter Verwendung einfacher Zucker und Alkohole als Substrate bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Reagenzien zur Produktion anderer Copolymere als PHB und PHVB bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat bereit, das umfasst:

a) Bereitstellen gentechnisch manipulierter, nicht-humaner Organismen, die rekombinant Enzyme exprimieren, die aus der Dehydratase für vicinale Diole und der Aldehyddehydrogenase ausgewählt sind,
b) Bereitstellen von Diolen, die durch von den Organismen exprimierte Enzyme in 3-Hydroxypropionat- oder 3-Hydroxyvalerat-Monomere überführt werden können, und
c) Kultivieren der Organismen unter Bedingungen, unter denen 3-Hydroxypropionat oder 3-Hydroxyvalerat in Monomere überführt wird, die unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden.

Die Organismen können Bakterien oder Pflanzen sein. Die Organismen können mit Plasmiden genmanipuliert sein, die für die Dehydratase für vicinale Diole oder die Aldehyddehydrogenase oder für beide codieren, oder sie können so genmanipuliert sein, dass sie Gene, die für die Dehydratase für vicinale Diole oder die Aldehyddehydrogenase oder für beide codieren, in das Chromosom inkorporiert enthaften. Die Dehydratase für vicinale Diole kann die Dioldehydratase sein, und zusätzlich kann der Organismus rekombinant wenigstens ein Enzym exprimieren, das aus der Aldosereduktase der Rattenlinse, der Glyceroldehydrogenase von E. coli und der Methylglyoxalsynthase ausgewählt ist.
Die Dehydratase für vicinale Diole kann de Glyceroldehydratase sein, und der Organismus kann auch Enzyme exprimieren, die aus der Glycerol-3-phosphatase und der Glycerol-3-phosphatdehydrogenase und/oder der Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase und der Glyerol-3-phosphatase ausgewählt sind. Das Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase-Enzym kann DAR1 sein. Das Glycerol-3-phosphatase-Enzym kann GPP2 sein. Die rekombinanten, für die Enzyme Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase und Glycerol-3-phosphatase codierenden Gene können beide in das Chromosom integriert sein.
Der Organismus kann auch das Enzym 1,3-Propandioloxidoreduktase exprimieren.
Der Organismus kann auch rekombinant wenigstens ein Enzym exprimieren, das aus der Acyl-CoA-Transferase, der Acyl-CoA-Synthetase, der β-Ketothiolase, der Acetoacyl-CoA-Reduktase und der PHA-Synthase ausgewählt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann Diole einsetzen, die aus 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und Glycerol ausgewählt sind.
Die eingesetzten Diole können in Monomere überführt werden, die aus 3-Hydroxypropionat- oder 3-Hydroxyvaleratmonomeren ausgewählt sind.
Das Verfahren kann ferner die Zugabe von Coenzym B-12 oder dessen Vorläufer zur Kultur umfassen, zum Beispiel in einer Konzentration von bis zu 1 μM oder bis zu 20 nM.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen genmanipulierten, nicht-humanen Organismus, wie er oben definiert wurde, bereit.
Es werden erfindungsgemäße Organismen bereitgestellt, die Enzyme wie die Glyceroldehydratase, die Dioldehydratase, die Acyl-CoA-Transferase, die Acyl-CoA-Synthetase, die β-Ketothiolase, die Acetoacetyl-CoA-Reduktase, die PHA-Synthase, die Glycerol-3-phosphatdehydrogenase und die Glycerol-3-phosphatase exprimieren, die für die Produktion von PHAs nützlich sind. In einigen Fällen stammt eines oder stammen mehrere dieser Gene aus dem Wirtsorganismus, und die restlichen werden vom Transgen bereitgestellt. Diese Organismen produzieren Poly(3-hydroxyalkanoat)-Homopolymere oder -Copolymere, die 3-Hydroxypropionat- oder 3-Hydroxyvaleratmonomere inkorporiert enthalten, wobei die 3-Hydroxypropionat- und die 3-Hydroxyvalerat-Einheiten über die enzymkatalysierte Umwandlung von Diolen erhalten werden. Zu geeigneten Diolen, die eingesetzt werden können, gehören 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und Glycerol. Es werden auch biochemische Wege zur Gewinnung des Glycerols aus normalen Zellmetaboliten beschrieben. Die PHA-Polymere können leicht gewonnen werden und sind industriell als Polymere oder als Ausgangsmaterialien für verschiedene chemische Zwischenprodukte, zu denen 1,3-Propandiol, 3-Hydroxypropionaldehyd, Acrylverbindungen, Malonsäure, Ester und Amine gehören, nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Ablaufdiagramm der Produktion von 3-Hydroxyvaleryl-CoA aus Glycerol-3-P.
2 ist eine schematische Darstellung des für die Glyceroldehydratase (dhaB) und die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase (hbcT) codierenden Plasmidkonstrukts pFS44C.
3 ist eine schematische Darstellung des für dhaB, hbcT und phaC codierenden Plasmidkonstrukts pFS45.
4 ist eine schematische Darstellung des für dhaT, dhaB und hbcT codierenden Plasmidkonstrukts pFS47A.
5 ist eine schematische Darstellung des für dhaT, dhaB, hbcT und phaC codierenden Plasmidkonstrukts pFS48B.
6 ist eine schematische Darstellung des für dhaT, DAR1-GPP2 (DAR1, Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase, und GPP2, sn-Glycerol-3-phosphatphosphatase), dhaB, hbcT und phaC codierenden Plasmidkonstrukts pMS15.
7 ist eine schematische Darstellung des für GPP2 und DAR1 codierenden Plasmidkonstrukts pFS51.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es sind neue Metabolismuswege zur Produktion von 3-Hydroxyvalerat-Einheiten enthaltenden PHAs aus 1,2-Propandiol und von 3-Hydroxypropionat-Einheiten enthaltenden PHAs aus 1,3-Propandiol oder Glycerol entwickelt worden. Im Falle des Glycerols kann das Glycerol entweder dem Mikroorganismus verfüttert werden, oder es kann aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten erzeugt werden. Die Schlüsselenzymkomponenten dieser neuartigen Metabolismuswege, die zu diesen Monomeren führen, und ihre Polymerisation sind in der 1 veranschaulicht.
1,2-Propandiol und Glycerol sind kostengünstige Substrate, die für viele Mikroorganismen selbst in hohen Konzentrationen nicht toxisch sind. 1,3-Propandiol kann aus erneuerbaren Rohstoffen erzeugt werden (Anton, D., „Biological produktion of 1,3-propanediol", präsentiert auf der United Engineering Foundation Metabolic Engineering II Conference, Elmau, Deutschland, 27. Okt. 1998). 1,2-Propandiol kommt in industriellen Abfallströmen aus der Produktion von Propylenglycol vor. Glycerol kann auch aus dem Metabolismus verschiedener Mikroorganismen und Nutzpflanzen erhalten werden. In vielen Fällen sind diese Substanzen bessere Ausgangsmaterialien für eine Fermentation als organischen Säuren, die im Allgemeinen bei niedrigen Konzentrationen für viele Mikroorganismen toxisch werden. 3-Hydroxypropionsäure ist chemisch nicht stabil und deshalb nicht kommerziell erhältlich.
Organismen, die gentechnisch verändert werden sollen
Bei einer Ausführungsform werden die Gene für den kompletten in der 1 veranschaulichten Weg in den Organismus für die Produktion eingeführt. Es kann ein Organismus, der nicht natürlicherweise PHAs produziert, wie Escherichia coli, eingesetzt werden. Verschiedene rekombinante E.-coli-Systeme zur Produktion von PHB sind beschrieben worden (Madison und Huisman, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: 21–53). Die Gene, die für eine Dehydratase für vicinale Diole codieren, von einem Organismus, der Glycerol natürlicherweise in 3-Hydroxypropionaldehyd überführen kann (z. B. Klebsiella pneumoniae), werden in diesen Wirt eingeführt. Im Falle des 1,2-Propandiols überführt die Dehydratase für vicinale Diole das Substrat in Propionaldehyd, der durch den endogenen Metabolismus des Mikroorganismus in Propionyl-CoA überführt werden kann, gegebenenfalls mit der Unterstützung durch eine exogene Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase. Es kann nützlich sein, Stämme mit erhöhter Resistenz gegen Propionaldehyd zu mutieren und zu selektieren. Propionyl-CoA kann dann von der Ketoacyl-CoA-Thiolase für eine Kondensation mit Acetyl-CoA akzeptiert werden, wodurch 3-Hydroxyvaleryl-CoA gebildet wird. Die Ketoacyl-CoA-Thiolase kondensiert auch Acetyl-CoA mit Acetyl-CoA, wodurch 3-Hydroxybutyryl-CoA gebildet wird. Sowohl 3-Hydroxyvaleryl-CoA als auch 3-Hydroxybutyryl-CoA können von verschiedenen PHA-Synthasen akzeptiert werden, wie von derjenigen, die im rekombinanten Wirt exprimiert wird, und deshalb wird PHBV vom rekombinanten Wirt synthetisiert.
Dem oben beschriebenen Wirt kann auch 1,3-Propandiol oder Glycerol entweder während des Wachstums oder nach einer separaten Wachstumsphase verfüttert werden, und es wird ein 3HP-Polymer in den Zellen akkumuliert. E. coli synthetisiert Coenzym B-12 nicht de novo, und deshalb muss auch Coenzym B-12 oder ein Vorläufer, den E. coli in Coenzym B-12 überführen kann, wie Vitamin B-12, verfüttert werden. Im Falle von Glycerol überführt die Dehydratase für vicinale Diole das Substrat in 3-Hydroxypropionaldehyd, der durch den endogenen Metabolismus des Mikroorganismus in 3-Hydroxypropionyl-CoA überführt werden kann, gegebenenfalls mit Unterstützung durch eine exogene Acyl-CoA-Transferase oder eine Acyl-CoA-Synthetase. 3-Hydroxypropionyl-CoA kann dann von der PHA-Synthase zu P3HP polymerisiert werden. Es können auch Hydroxyacyl-CoA-Monomereinheiten zusätzlich zu 3HP in das Polymer inkorporiert werden. Wenn zum Beispiel die Ketoacyl-CoA-Thiolase und die Reduktase exprimiert werden, dann kann ein Copolymer von 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxypropionat gebildet werden.
Zur Erzeugung der 3HP-Polymere direkt aus Kohlenhydrat-Ausgangsmaterialien wird E. coli zur Expression der Glycerol-3-phosphatdehydrogenase und der Glycerol-3-phosphatase weiter genmanipuliert. Solche rekombinanten E.-coli-Stämme und Verfahren zu ihrer Konstruktion sind in diesem Fachgebiet bekannt (Anton, D., „Biological production of 1,3-propanediol", präsentiert auf der United Engineering Foundation Metabolic Engineering II Conference, Elmau, Deutschland, 27. Okt. 1998; PCT WO 98/21339 ).
Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein rekombinanter Organismus, der natürlicherweise eine Dehydratase für vicinale Diole enthält, eingesetzt werden. Ein Beispiel für einen derartigen Organismus ist Klebsiella oxytoca, auch wenn, wie oben diskutiert wurde, weitere existieren. Bei dieser Ausführungsform braucht keine exogene Dehydratase für vicinale Diole aus einem anderen Organismus importiert zu werden. Es kann jedoch nützlich sein, diesen Organismus zu mutieren und Mutanten zu selektieren, die die Dehydratase während des aeroben Wachstums exprimieren, oder er kann zur Expression des Gens unter aeroben Bedingungen genmanipuliert werden. Es ist allgemein der Fall, dass Organismen, die eine oder mehrere Coenzym-B-12-abhängige Dehydratase(n) für vicinale Diole exprimieren, Coenzym B-12 de novo synthetisieren können, und in diesen Fällen ist es nicht erforderlich, Coenzym B-12 oder eng verwandte Vorläufer von diesem an irgendeinem Punkt der Kultivierung zuzugeben. In diesem Falle wird die PHA-Synthase oder ein vollständiger Weg für die Biosynthese von PHB und gegebenenfalls eine exogene Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase in diesen Organismus eingeführt. Techniken dafür sind auf diesem Gebiet gut bekannt (zum Beispiel Dennis et al., 1998, Journal of Biotechnology 64: 177–186). Zur Erzeugung der 3HP-Polymere direkt aus Kohlenhydrat-Ausgangsmaterialien wird der Stamm weiter genmanipuliert, so dass er wie oben beschrieben die Glycerol-3-phosphatdehydrogenase und die Glycerol-3-phosphatase exprimiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein Organismus, der natürlicherweise PHAs produziert, eingesetzt werden. Beispiele für solche Organismen sind Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus und Azotobacter, aber viele andere sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt (Braunegg et al., 1998, Journal of Biotechnology 68: 127–161). Die Einführung der Dioldehydratase wird mittels Standardtechniken erreicht, wie sie bei Peoples und Sinskey (1989, J. Biol. Chem. 164: 15298–15303) beschrieben werden. In diesen Fällen kann es nützlich sein, den Organismus zu mutieren und auf eine erhöhte Resistenz gegen 3-Hydroxypropionaldehyd zu selektieren. PHA-erzeugende Organismen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit zur Synthese von Coenzym B-12 de novo, und deshalb würde Coenzym B-12 oder ein Vorläufer, den der Organismus in Coenzym B-12 überführen kann, bei Bedarf zugesetzt werden. PHBV wird dann durch das Zuführen von 1,2-Propandiol und wenigstens eines anderen Ausgangsmaterials erzeugt. PHBP wird durch das Zuführen von 1,3-Propandiol oder Glycerol und eines anderen Ausgangsmaterials, zum Beispiel Glucose, erzeugt. Zur Erzeugung der 3HP-Polymere direkt aus Kohlenhydrat-Ausgangsmaterialien wird der Stamm weiter genmanipuliert, so dass er wie oben beschrieben die Glycerol-3-phosphatdehydrogenase und die Glycerol-3-phosphatase exprimiert. Es kann nützlich sein, Mutationen einzusetzen, die für die Produktion der P3HP-Homopolymere in diesen Organismen von Vorteil sind. Zu spezifischen Mutationen gehören die Inaktivierung der Gene der β-Ketothiolase und/oder der Acetoacetyl-CoA-Reduktase. Da diese Gene allgemein gut bekannt und erhältlich oder isolierbar sind, kann die Zerstörung dieser Gene leicht durchgeführt werden, zum Beispiel wie es von Slater et. al, 1998 (J. Bacteriol.) beschrieben wurde.
Die Implementierung der Produktion von Poly(3-hydroxypropionat) und seiner Copolymere ist auch nicht auf Bakterien beschränkt, wie in den Beispielen beschrieben wird. Die gleichen Gene können in eukaryotische Zellen eingeführt werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf, Hefen und Pflanzen, die, wie Bakterien, ebenfalls Zwischenprodukte der Glykolyse wie Dihydroxyacetonphosphat produzieren, aus denen Glycerol und letztlich Poly(3-hydroxypropionat) gewonnen werden können.
Gene für die Verwertung von Substraten
Gene und Techniken zur Entwicklung rekombinanter PHA-Produzenten, die für einen Einsatz, wie er hier beschrieben wird, geeignet sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet allgemein bekannt (Madison und Huisman, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: 21–53, PCT WO 99/14313 ). Da alle Gene, die für die Implementierung der Produktion von Poly(3-hydroxypropionat) aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten über Glycerol erforderlich sind, kloniert worden sind und in gentechnisch manipulierbarer Form erhalten werden können, kann jede beliebige Kombination plasmidgetragener und integrierter Gene eingesetzt werden, und die Implementierung dieses Wegs ist deshalb nicht auf die hier umrissenen Schemata beschränkt. Viele verschiedene Implementierungen dürften für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein.
Die Glyceroldehydratase (EC 4.2.1.30) und die Dioldehydratase (EC 4.2.1.28) sind verschiedene Coenzym-B-12-abhängige Enzyme, die in verschiedenen Bakterienspezies vorkommen. Häufig wird die Glyceroldehydratase während des anaeroben Wachstums auf Glycerol induziert, und die Dioldehydratase wird während des anaeroben Wachstums auf entweder Glycerol oder 1,2-Propandiol induziert (Forage und Foster, 1979, Biochim. Biophys. Acta 569: 249–258). Diese Dehydratasen katalysieren die Bildung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerol und von Propionaldehyd aus 1,2-Propandiol. Diese Aldehyde werden üblicherweise durch eine Dehydrogenase in die entsprechenden Alkohole überführt. Organismen, die eine oder beide Dehydratase(n) enthalten, sind typischerweise in der Lage, Glycerol in 3-Hydroxypropionaldehyd oder 1,3-Propandiol zu überführen. Zu Bakterienspezies, die für diese Fähigkeit bekannt sind, gehören Klebsiella pneumoniae (Streekstra et al., 1987, Arch. Microbiol. 147: 268–275), Klebsiella oxytoca (Homann et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 121–126), Klebsiella planticola (Homann et al., 1990, ebenda) und Citrobacter freundii (Boenigk et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 453–457), auch wenn viele andere Beispiele allgemein bekannt sind. Beide Dehydratasen bestehen aus drei Untereinheiten, von jede zu ihrem Gegenstück im anderen Enzym homolog ist.
Das Substratspektrum der Glycerol- und Dioldehydratasen (die von jetzt an auch generell als „Dehydratasen für vicinale Diole" bezeichnet werden) ist nicht auf Glycerol und 1,2-Propandiol beschränkt. Bachovchin et al. (1977, Biochemistry 16: 1082–1092) zum Beispiel zeigten, dass zu den vom Enzym von K. pneumoniae akzeptierten Substraten Glycerol, (R)-1,2-Propandiol, (S)-1,2-Propandiol, Ethylenglycol, Thioglycerol, 3-Chlor-1,2-propandiol, 1,2-Butandiol, 2,3-Butandiol, Isobutylenglycol und 3,3,3-Trifluor-1,2-propandiol gehören. In allen Fällen ist das Reaktionsprodukt der Aldehyd oder das Keton, der bzw. das durch die Entfernung eines Wassermoleküls vom Substrat gebildet wird.
Zu Organismen, die natürlicherweise Glycerol aus Zucker über Phosphoglycerat produzieren, gehören Bacillus licheniformis (Neish et al., 1945, Can. J. Res. 23B: 290–296), Lactobacillus sp. (Nelson und Werkman, 1935, J. Bacteriol. 30: 547–557), Halobacterium cutirubrum (Wassef et al., 1970, Can. J. Biochem. 48: 63–67), Microcoleus chthonoplastes (Moezelaar et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol. 62: 1752–1758), Zymomonas mobilis (Viikari, 1988, CRC Crit. Rev. Biotechnol. 7: 237–261), Phycomyces blakesleeanus (Van Schaftigen und Van Laere, 1985, Eur. J. Biochem. 148: 399–405), Saccharomyces cerevisiae (Tsuboi und Hudson, 1956, Arch. Biochem. Biophys. 61: 197–210), Saccharomyces carisbergensis (Tonino und Steyn-Parvé, 1963, Biochim. Biophys. Acta 67: 453–469), Rhizopus javanicus (Lu et al., 1995, Appl. Biochem. Biotechnol. 51/52: 83–95), Candida magnoliae (Sahoo, D. K., 1991, Ph. D. Thesis, Indian Institute of Technology, Delhi), Candida utilis (Gancedo et al., 1968, Eur. J. Biochem. 5: 165–172), Aspergillus niger (Legisa und Mattey, 1986, Enzyme Microb. Technol. 8: 607–609), Trichomonas vaginalis (Steinbüchel und Müller, 1986, Molec. Biochem. Parasitol. 20: 45–55), Dunaliella salina (Sussman und Avron, 1981, Biochim. Biophys. Acta 661: 199–204, Ben-Amotz et al., 1982, Experientia 38: 49–52), Asteromonas gracilis (Ben-Amotz et al., ebenda), Leishmania mexicana (Cazzulo et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett. 51. 187–192) und Crithidia fasciculata (Cazzulo et al., ebenda). Für viele dieser Organismen weiß man, dass das Glycerol vom Dihydroxyacetonphosphat abstammt, einem Zwischenprodukt des Glycolysewegs. Escherichia coli synthetisiert normalerweise Glycerol nicht in signifikanten Mengen, wenn man es auf den meisten Zuckern wachsen lässt (Baldomà und Aguilar, 1988, J. Bacteriol. 170: 416). Es sind jedoch transgene E.-coli-Stämme, die Glycerol aus den üblichen Zuckern wie Glucose bilden können, beschrieben worden, zum Beispiel in PCT WO 97/20292 .
Genmanipulierte Systeme zur Produktion von Glycerol aus Zuckern ( WO 98/21339 ), die Produktion von 1,3-Propandiol aus Glycerol ( WO 96/35796 , WO 98/21339 ) und die Produktion von 1,3-Propandiol aus Zuckern sind beschrieben worden. Für E. coli, das die Gene DAR1 (Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase) und GPP2 (sn-Glycerol-3-phosphatphosphatase) von Saccharomyces cerevisiae exprimiert, wurde gezeigt, dass es hohe Konzentrationen von Glycerol im Medium akkumuliert, wenn man es auf Glucose wachsen lässt (Anton, D., „Biological production of 1,3-propanediol", präsentiert auf der United Engineering Foundation Metabolic Engineering II Conference, Elmau, Deutschland, 27. Okt. 1998).
Regulation der Expression
Bei allen der zuvor erwähnten Ausführungsformen ist es möglich, die Zusammensetzung des erzeugten Polymers durch das Steuern der Expression der Dehydratase für vicinale Diole oder durch das Steuern der Verfügbarkeit von Coenzym B-12 zu kontrollieren. Je höher die Dehydrataseaktivität ist, desto mehr an aktiviertem Monomer wird als Ergebnis ihrer Aktivität erhalten, und zwar bis zu dem Punkt, an dem ein anderer Faktor, wie die Verfügbarkeit des Substrats oder eine Enzymaktivität stromabwärts der Dehydratase, limitierend wird. Verfahren zur Modulation der Genexpression (und somit der Enzymaktivität) in verschiedenen Organismen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Ein zusätzliches Verfahren zur Kontrolle der Aktivität der Dehydratase für vicinale Diole ist die Modulation der Verfügbarkeit von Coenzym B-12 für den Mikroorganismus. Viele Stämme von Escherichia coli zum Beispiel sind nicht in der Lage, Coenzym-B-12 de novo zu synthetisieren, und deshalb ist die rekombinante Dehydratase für vicinale Diole, deren Aktivität von Coenzym B-12 abhängig ist, in diesen Stämmen nicht aktiv, es sei denn, Coenzym B-12 oder ein geeigneter Vorläufer, wie Vitamin B-12, wird zum Medium gegeben. Für die Escherichia-coli-Stämme, die Gene für die PHA-Synthese und eine Dehydratase für vicinale Diole aufweisen, wurde gefunden, dass ohne den Zusatz von Coenzym B-12 nur PHB synthetisiert wird, sogar wenn 1,2-Propandiol im Medium vorhanden ist. Die Zugabe von 1 μM Coenzym B-12 zu einer Kultur des gleichen Stammes im gleichen Medium führt zur Bildung von PHBV, wie in den Beispielen diskutiert wird. Skraly et al. (1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 98–105) fanden, dass transgene Escherichia coli steigende Mengen an 1,3-Propandiol aus Glycerol synthetisierten, wenn steigende Konzentrationen an Coenzym B-12 im Medium bereitgestellt wurden, und zwar bis zu einer Konzentration von ungefähr 20 nM, danach stieg das 1,3-Propandiol nicht weiter an. Deshalb können Coenzym-B-12-Konzentrationen von 0 bis 20 nM zur Steuerung der PHBV-Zusammensetzung in Escherichia coli, die Gene für die PHA-Synthese und ein Gen für die Dehydratase für vicinale Diole enthalten, und die in einem 1,2-Propandiol-haltigen Medium kultiviert werden, eingesetzt werden. Die gleiche Grundvoraussetzung gilt für die Gewinnung von Poly(3-hydroxypropionat) aus Glycerol. Die Zellen sind in der Lage, ein PHA (wie PHB) in Gegenwart eines Comonomers zu erzeugen, wenn keine Dehydratase für vicinale Diole vorhanden ist. Der Einsatz von Coenzym B-12 zur Steuerung der Polymerzusammensetzung kann bei jedem beliebigen Mikroorganismus durchgeführt werden, der nicht zur De-novo-Synthese von Coenzym B-12 in der Lage ist. Zu derartigen Organismen gehören diejenigen, denen natürlicherweise diese Fähigkeit fehlt (wie Escherichia coli), sowie diejenigen, die natürlicherweise über diese Fähigkeit verfügen (wie Klebsiella pneumoniae), aber über den Einsatz einer chemischen Mutagenese oder mittels genetischer Verfahren, wie einer Transposon-Mutagenese, mutiert wurden, damit sie diese Fähigkeit verlieren.
Bei einigen Mikroorganismen können einige der Gene in das Wirtschromosom integriert werden, und andere können auf einem Plasmid bereitgestellt werden. In einigen Fällen können zum Beispiel kompatible Plasmidsysteme eingesetzt werden, wobei einige Schritte des Wegs auf dem einen Plasmid codiert sind und die anderen Schritte auf dem zweiten Plasmid codiert sind. Es kann auch eine Kombination der beiden Ansätze eingesetzt werden.
Substrate
Wie oben diskutiert wurde gehören zu Substraten, die zur Herstellung von PHAs eingesetzt werden können, Glycerol und Glucose. Verschiedene andere Substrate können, zusätzlich zu Glycerol oder Glucose, erfolgreich eingesetzt werden. Beispiele für andere Substrate sind Stärke, Saccharose, Lactose, Fructose, Xylose, Galactose, Maisöl, Sojaöl, Tallöl, Fettsäuren oder Kombinationen von diesen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Bezugnahme auf die folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele noch besser verstanden werden.
BEISPIEL 1 Produktion von PHBV aus Glucose und 1,2-Propandiol
Der Escherichia-coli-Stamm MBX769 (Huisman et. al., PCT WO 99/14313 ), der die Gene für die PHA-Synthese (Acetoacetyl-CoA-Thiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase und PHA-Synthase) von Zoogloea ramigera exprimiert und das Plasmid pFS44C enthält, wurde für die Synthese von PHBV aus Glucose und 1,2-Propandiol eingesetzt. Das Plasmid pFS44C (schematisch in der 2 gezeigt) enthält die Gene, die für die Glyceroldehydratase (dhaB) von Klebsiella pneumoniae, isoliert aus pTC53 (Skraly et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 98–105), und die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase (hbcT) von Clostridium kluyveri, isoliert aus pCK3 (Söhling und Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871–880) codieren, beide in einem Operon unter der Kontrolle des trc-Promotors. pFS44C enthält auch das Gen des lac-Repressors (lacI), ein Ampicillinresistenz-Gen (ampR) und einen Replikationsursprung (ORI), die alle vom Vektor pSE380 (Invitrogen, La Jolla, Kalifornien) stammen.
Die Zellen wurden in 100 mL eines Medium vorkultiviert, das 25 g/L LB-Bouillon-Pulver (Difco, Detroit, Michigan) und 100 mg/L Ampicillin enthielt. Sie wurden von diesem Medium durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt und in 100 mL eines Mediums resuspendiert, dass pro Liter 5 g LB-Bouillon-Pulver, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7, 10 g 1,2-Propandiol, 2 g Glucose, 1 μmol Coenzym B-12, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthielt. Die Zellen wurden in diesem Medium unter Schütteln mit 225 Upm 48 Stunden bei 30°C inkubiert. Sie wurden dann durch Zentrifugieren wie oben entfernt, einmal mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.
Das gleiche Experiment wurde parallel noch einmal durchgeführt, wobei jedoch kein Coenzym B-12 zugesetzt wurde. Ungefähr 25 mg der lyophilisierten Zellmasse aus jedem Kolben wurden einer gleichzeitigen Extraktion und Butanolyse bei 110°C für 3 Stunden in 2 mL einer Mischung unterzogen, die 90 Vol.-% 1-Butanol und 10 Vol.-% konzentrierte Salzsäure enthielt, wobei 2 mg/mL Benzoesäure als interner Standard zugesetzt waren. Die wasserlöslichen Komponenten der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1: 50 bei einer Gesamtflussgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einer SPB-1-Kapillar-GC-Säule aus verschmolzenem Siliciumdioxid (30 m, 0,32 mm ID, 0,25 μm Film, Supelco, Bellefonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 80°C für 2 min, mit 10°C pro min auf 250°C, 250°C für 2 min. Der zur Testung auf die Gegenwart von 3-Hydroxybutyrat- und 3-Hydroxyvalerat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war PHBV (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin). Das Polymer machte in dem Experiment mit zugesetztem Coenzym B-12 60,9% des Trockenzellgewichts aus, und es bestand aus 97,4% 3-Hydroxybutyrat-Einheiten und 2,6% 3-Hydroxyvalerat-Einheiten.
Für den Überstand wurde nach dem Abschluss dieses Experiments durch eine Analyse mittels Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC) gefunden, dass er 0,41 g/L Propanol enthielt, was anzeigte, dass die Glyceroldehydratase funktional war. Das Polymer machte in dem Experiment ohne zugesetztes Coenzym B-12 56,7% des Trockenzellgewichts aus, und es war ein PHB-Homopolymer. Der Überstand enthielt am Ende des Experiments kein Propanol. Die HPLC-Analyse erfolgte mit einer Aminex-HPX-87H-Säule mit Schwefelsäure (pH 2) als mobiler Phase bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,6 mL/min und einer Säulentemperatur von 50°C. Die Detektion erfolgte sowohl über den Brechungsindex als auch über die UV-Absorption.
BEISPIEL 2 PHBV und Wachstum mit 1,2-Propandiol als einziger Kohlenstoffquelle
MBX 184 wurde für ein Wachstum auf 1,2-PD selektiert, wodurch der E.-coli-Stamm MBX 1327 erhalten wurde. MBX1327 wurde mit den PHB-Genen ABC5KAN von MBX1164 transduziert, wodurch der E.-coli-Stamm MBX 1329 erhalten wurde. MBX1164 ist MBX247::ABC5KAN. MBX247 ist LJ5218 (Jenkins und Nunn, J. Bact. 1984, E. coli Genetic Stock Center CGSC 6966), mutiert mit 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin (NTG) mittels eines Standardverfahrens (Miller, J., A short course in bacterial genetics, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) und gescreent auf die Fähigkeit zum Wachstum mit 1,2-Propandiol als einziger Kohlenstoffquelle. Stämme von E. coli mit dieser Fähigkeit und Verfahren zur Generierung solcher Stämme sind beschrieben worden (Sridhara et al., 1969, J. Bacteriol. 93: 87). Der E.-coli-Stamm MBX1329 hat sowohl die Fähigkeit, mit 1,2-Propandiol als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, als auch PHB aus Kohlenstoffquellen zu synthetisieren, die Acetyl-CoA generieren.
Man ließ MBX1329 mit dem Plasmid pFS44C (in der 2 gezeigt) in einem Medium wachsen, das pro Liter enthielt: 6,25 g LB-Bouillon-Pulver, 3,5 g Natriumammoniumphosphat, 7,5 g dibasisches Kaliumphosphattrihydrat, 3,7 g monobasisches Kaliumphosphat, 0,12 g Magnesiumsulfat, 2,78 mg Eisen(II)sulfatheptahydrat, 1,98 mg Mangan(II)chloridtetrahydrat, 2,81 mg Cobalt(II)sulfatheptahydrat, 1,47 mg Calciumchloriddihydrat, 0,17 mg Kupfer(II)chloriddihydrat, 0,29 mg Zink(II)chloridheptahydrat, 10 mg Thiamin, 10 g 1,2-Propandiol, 50 nmol Coenzym B-12, 100 μg Ampicillin und 0,05 mmol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Das Gesamtvolumen in einem 250-mL-Erlenmeyerkolben lag bei 50 mL, das Inokulum bestand aus 0,5 mL einer Übernachtkultur in 25 g/L LB-Bouillon-Pulver und 100 μg/mL Ampicillin. Die Zellen wurden in diesem Medium 3 Tage bei 37°C unter Schütteln mit 200 Upm inkubiert. Sie wurden von diesem Medium durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert.
Der intrazelluläre Polymergehalt wurde über eine Butanolyse wie im Beispiel 1 analysiert. Die Zellen wuchsen bis zu einer Extinktion (bei 600 nm) von 9,8 und enthielten 6% des Trockenzellgewichts in Form von PHBV. Das Polymer selbst bestand aus 2,5% 3-Hydroxyvalerat-Einheiten und 97,5% 3-Hydroxybutyrat-Einheiten.
BEISPIEL 3 Poly(3-hydroxypropionat) aus 1,3-Propandiol und 1,3-Propandiol aus Glycerol
Der Escherichia-coli-Stamm MBX184, dem das fadR-Gen fehlt und der das atoC-Gen konstitutiv exprimiert, wurde zur Synthese von 1,3-Propandiol aus Glycerol und Poly(3-hydroxypropionat) aus 1,3-Propandiol eingesetzt. In beiden Fällen enthielten die Zellen das Plasmid pFS45 (schematisch in der 3 gezeigt), das Gene enthält, die für die Glyceroldehydratase von Klebsiella pneumoniae, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri und die PHA-Synthase von Ralstonia eutropha codieren, die alle in einem Operon unter der Kontrolle des trc-Promotors vorliegen. Die Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben kultiviert, außer dass Glycerol anstelle von 1,2-Propandiol vorhanden war.
Eine HPLC-Analyse zeigte, dass die Zellen im Coenzym-B12-haltigen Medium 1,3 g/L 1,3-Propandiol synthetisierten, während die Zellen im Medium ohne Coenzym B-12 überhaupt kein 1,3-Propandiol synthetisierten. Der gleiche Stamm wurde auch mittels des Verfahrens aus Beispiel 1 kultiviert, außer dass 1,3-Propandiol anstelle von 1,2-Propandiol vorhanden war und kein Coenzym B-12 zugesetzt wurde.
Die lyophilisierte Zellmasse wurde mittels GC wie im Beispiel 1 analysiert, und zwar mit einem zusätzlichen Beta-Propiolacton-Standard zur Quantifizierung von Poly(3-hydroxypropionat). Für diese Zellen wurde über eine GC-Analyse gezeigt, dass sie ein Poly(3-hydroxypropionat)-Homopolymer in einem Anteil von 7,8% des Trockenzellgewichts enthielten. Die Synthese von Poly(3-hydroxypropionat) aus Glycerol erfolgte wahrscheinlich aufgrund der Akkumulation von 3-Hydroxypropionaldehyd nicht, der für viele Mikroorganismen sehr toxisch ist (Dobrogosz et al., 1989, Wenner-Gren Int. Symp. Ser. 52: 283–292). Dieser Toxizität kann man entgegenwirken, indem man die Akkumulation von 3-Hydroxypropionaldehyd auf wenigstens zwei Arten unterbindet: 1) Es kann auch eine 1,3-Propandioloxidoreduktase eines 1,3-Propandiol-erzeugenden Organismus, wie der oben erwähnten, exprimiert werden, und 2) es kann die Aktivität der nicht identifizierten endogenen Dehydrogenase von Escherichia coli, die für die beobachtete Bildung von 1,3-Propandiol beim Vorliegen der Glyceroldehydratase verantwortlich ist, durch das Screenen auf Glyceroldehydratase-exprimierende Escherichia-coli-Zellen, die in Gegenwart von sowohl Glycerol als auch Coenzym B-12 gut wachsen, erhöht werden. Der zweite Ansatz kann, zum Beispiel, durch das Transformieren von mutierten Escherichia coli mit einem Plasmid wie pFS45, so dass das Glyceroldehydratase-Gen durch die Mutagenese nicht beeinflusst wird, gefolgt von einer Anreicherung in einem Medium, das Glycerol und Coenzym B-12 enthält, verwirklicht werden.
BEISPIEL 4 Poly(3-hydroxypropionat) aus Glycerol
Die beiden Wege im Beispiel 3 (Glycerol zu 1,3-Propandiol und 1,3-Propandiol zu Poly(3-hydroxypropionat)) wurden in den gleichen rekombinanten Escherichia coli aktiviert. Der E.-coli-Stamm MBX820, der die Gene phaA, phaB und phaC von Zoogloea ramigera für die PHA-Biosynthese stabil exprimiert, wurde mit dem Plasmid pFS47A (schematisch in der 4 gezeigt) transformiert, das, unter der Kontrolle des trc-Promotors, die für die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri und die Glyceroldehydratase und die 1,3-Propandioloxidoreduktase von Klebsiella pneumoniae codierenden Gene enthält. PFS47A wurde aus dem Plasmid pFS16, einem Vorläufer von pFS47A, wie folgt konstruiert: Das orfZ-Gen von Clostridium kluyveri wurde mittels PCR vom Plasmid pCK3 (Söhling und Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871–880) mithilfe der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert:
Das orfZ-PCR-Produkt wurde an pTrcN ligiert, das mit XbaI (das mit AvrII kompatibel ist) und Sa verdaut worden war.
Die Zellen wurden in 100 mL eines Mediums vorkultiviert, das 25 g/L LB-Bouillon-Pulver (Difco, Detroit, Michigan) und 100 mg/L Ampicillin enthielt. Sie wurden von diesem Medium durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt und in 100 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter 2,5 g LB-Bouillon Pulver, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7, 5 g Substrat (Glycerol, 1,2-Propandiol oder 1,3-Propandiol), 2 g Glucose, 5 nmol Coenzym B-12, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthielt. Die Zellen wurden in diesem Medium unter Schütteln mit 225 Upm bei 30°C 48 Stunden inkubiert. Sie wurden dann durch Zentrifugieren wie oben entfernt, einmal mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.

Die lyophilisierte Zellmasse wurde über eine GC-Analyse wie im Beispiel 1 analysiert, wobei ein zusätzlicher Beta-Propiolacton-Standard zur Quantifizierung von Poly(3-hydroxypropionat) eingesetzt wurde. Die in Glycerol und 1,3-Propandiol kultivierten Zellen enthielten jeweils ein Copolymer aus 3-Hydroxybutyrat- und 3-Hydroxypropionat-Einheiten, und die in 1,2-Propandiol kultivierten Zellen enthielten ein Copolymer aus 3-Hydroxybutyrat- und 3-Hydroxyvalerat-Einheiten. Die Polymerzusammensetzungen und die als prozentualer Anteil des Trockenzellgewichts angegebenen Mengen sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Die mit Glycerol kultivierten Zellen synthetisierten mehr Polymer als die mit 1,3-Propandiol kultivierten Zellen, aber der prozentuale Anteil der 3-Hydroxypropionat-Einheiten war in den mit Glycerol kultivierten Zellen geringer. Diese Unterschiede könnten dadurch erklärt werden, dass der 3-Hydroxypropionaldehyd toxisch ist und er wahrscheinlich schneller durch die 1,3-Propandioloxidoreduktase aus 1,3-Propandiol generiert wird als durch die Glyceroldehydratase aus Glycerol. Die Toxizität von 3-Hydroxypropionaldehyd kann die Vitalität der Zellen und damit den Gesamtpolymergehalt negativ beeinflussen, aber seine Bildung aus Glycerol ist für die Bildung von 3-Hydroxypropionyl-CoA erforderlich, und zwar unabhängig davon, ob das erforderliche Zwischenprodukt 3-Hydroxypropionaldehyd oder 1,3-Propandiol ist. Tabelle 1 Polymere, die von MBX820/pFS47A erzeugt wurden, die in verschiedenen Substraten kultiviert wurden

Substrat	Gesamtpolymer (% des TZG^a)	3H6-Einheiten (% des Polymers)	3HP-Einheiten (% des Polymers)	3HV-Einheiten (% des Polymers)
Glycerol	55,8	98,2	1,8	0,0
1,2-Propandiol	41,3	97,1	0,0	2,9
1,3-Propandiol	26,7	95,1	4,9	0,0

^aProzent des Trockenzellgewichts

BEISPIEL 5 Steuerung der Polymerzusammensetzung durch das Variieren der Konzentration von Coenzym B-12
Da die Aktivität der vicinalen Dioldehydratasen von Coenzym B-12 abhängig ist, und da die Bildung von 3-Hydroxypropionyl-CoA aus Glycerol oder von Propionyl-CoA aus 1,2-Propandiol von der Dehydrataseaktivität abhängt, kann die Zusammensetzung des Copolymers für beide Fälle durch das Variieren der Verfügbarkeit von Coenzym B-12 für die Dehydratase gesteuert werden. In diesem Beispiel wurde das durch das Variieren der zu dem Medium, in dem der E.-coli-Stamm MBX820 mit dem Plasmid pFS47A PHA produzierte, gegebenen Konzentration von Coenzym B-12 erreicht.
Die Zellen wurden in 100 mL eines Medium vorkultiviert, das 25 g/L LB-Bouillon-Pulver (Difco, Detroit, Michigan) und 100 mg/L Ampicillin enthielt. Sie wurden von diesem Medium durch Zentrifugieren (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt und in 100 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter 2,5 g LB-Bouillon-Pulver, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7, 10 g Substrat (Glycerol oder 1,2-Propandiol), 2 g Glucose, 100 μg Ampicillin, 0,1 mmol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und 0,5, 20 oder 50 nmol Coenzym B-12 enthielt, Die Zellen wurden in diesem Medium unter Schütteln mit 225 Upm bei 30°C 72 Stunden inkubiert. Sie wurden dann durch Zentrifugieren wie oben entfernt, einmal mit Wasser gewaschen und lyophilisiert. Die lyophilisierte Zellmasse wurde über eine GC-Analyse wie im Beispiel 4 analysiert.
Die Tabelle 2 zeigt die Mengen und Zusammensetzungen der auf diese Weise erzeugten PHAs. Das Fehlen von Coenzym B-12 führte, wenn das Substrat Glycerol oder 1,2-Propandiol war, zur Synthese von lediglich PHB. Glycerol förderte die Bildung von PHA in Abwesenheit von Dehydrataseaktivität, wie es die letztendliche Extinktion und der Polymergehalt anzeigen, vermutlich weil E. coli Glycerol unter aeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle verwenden kann (Lin, Ann. Rev. Microbiol. 30: 535, 1976), während das für 1,2-Propandiol im Allgemeinen nicht der Fall ist (Baldomà und Aguilar, ebenda). Wenn Coenzym B-12 in erhöhen Mengen zu Zellen gegeben wird, die mit Glycerol kultiviert werden, steigt der prozentuale Anteil von 3-Hydroxypropionat-Einheiten im Polymer an, während der Gesamtpolymergehalt abnimmt. Diese Abnahme beruht wahrscheinlich auf der Toxizität von 3-Hydroxypropionaldehyd, die zu einer verringerten Vitalität der Zellen führt. Wenn Coenzym B-12 in erhöhen Mengen zu Zellen gegeben wird, die mit 1,2-Propandiol kultiviert werden, werden 3-Hydroxyvalerat-Einheiten in das Polymer inkorporiert, aber der prozentuale Anteil von 3-Hydroxyvalerat im Polymer erhöht sich nicht im gleichen Ausmaß wie der prozentuale Anteil von 3-Hydroxypropionat-Einheiten im Glycerol-Experiment. Das zeigt an, dass die Konzentration von Coenzym B-12 die 3-Hydroxyvaleryl-CoA-Synthese nicht limitiert, sogar wenn seine Konzentration nur einige nmol/L beträgt, und dass ein anderer Faktor limitierend wird.

Dieses Beispiel zeigt, dass die Zusammensetzung von PHAs, die über den Einsatz Coenzym-B-12-abhängiger Dehydratasen erhalten werden, durch das Variieren der Konzentration des für die Dehydratase verfügbar gemachten Coenzyms B-12 gesteuert werden kann. Der Umfang, in dem die Steuerung erfolgen kann, ist vom eingesetzten Diolsubstrat abhängig. Das kann auf der Präferenz des vicinalen Diols für bestimmte Substrate im Vergleich zu anderen und dem sonstigen Metabolismus des Wirts beruhen, der von dem aus dem Diol gewonnenen Aldehyd zum Acyl-CoA führt, das als das aktivierte Monomer für die Bildung von PHA dient. Tabelle 2 Zusammensetzung von Polymeren, die von MBX820/pFS47A in Medien mit verschiedenen Coenzym-B-12-Konzentrationen aus Glycerol und 1,2-Propandiol erzeugt werden

Substrat	[CoB12], nM	Extinktion^a (600 nm)	3HB^b, % des PHA	3HV^c, % des PHA	3HP^d, % des PHA	Polymer, % des TZG^e
Glycerol	0	19,3	100	0	0	65,4
	5	17,7	81,4	0	18,6	56,6
	20	10,0	79,6	0	20,4	45,9
	50	3,9	54,4	0	45,6	12,0
1,2-Propandiol
	0	4,4	100	0	0	34,1
	5	4,8	98,6	1,4	0	32,4
	20	3,9	97,6	2,4	0	19,5
	50	4,2	98,5	1,5	0	21,2

^aExtinktion
^b3-Hydroxybutyrat-Einheiten
^c3-Hydroxyvalerat-Einheiten
^d3-Hydroxypropionat-Einheiten
^eProzent des Trockenzellgewichts

BEISPIEL 6 Produktion von Poly(3-hydroxypropionat) aus zentralen metabolischen
Zwischenprodukten
Die Beispiele 1–5 zeigen, dass es möglich ist, Poly(3-hydroxypropionat) aus Glycerol zu erhalten, und dass es, wie oben diskutiert wurde, sowohl in transgenen als auch in nicht-transgenen Organismen möglich ist, Glycerol aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten zu erzeugen. Deshalb erlaubt eine Kombination der beiden Wege die Synthese von Poly(3-hydroxypropionat) aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten. Diese Wege können entweder durch das Einführen der Gene für die Synthese von Poly(3-hydroxypropionat) in einen Glycerol-erzeugenden Wirt oder durch das Einführen der Gene für die Synthese von Glycerol in einen Wirt, der bereits zur Synthese von Poly(3-hydroxypropionat) aus Glycerol fähig ist, wie es in den obigen Beispielen beschrieben wurde, kombiniert werden.
Im ersteren Falle werden Gene, die für eine Dehydratase für vicinale Diole, eine PHA-Synthase und, gegebenenfalls, eine Aldehyddehydrogenase, eine 1,3-Propandioloxidoreduktase und eine Hydroxyacyl-CoA-Transferase codieren, in einem Wirt exprimiert, der zur Erzeugung von Glycerol aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten fähig ist. Ein Beispiel für einen derartigen Wirt ist ein Escherichia coli, das die Gene der DAR1 (Dihydroxyacetonphosphatdehydrogenase) und der GPP2 (sn-Glycerol-3-phosphatphosphatase) von Saccharomyces cerevisiae exprimiert (Anton, D., „Biological production of 1,3-propanediol", präsentiert auf der United Engineering Foundation Metabolic Engineering II Conference, Elmau, Deutschland, 27. Okt. 1998, PCT WO 98/21339 ), wie es oben beschrieben wurde. Viele Stämme von E. coli exprimieren natürlicherweise Enzymaktivitäten der 1,3-Propandioloxidoreduktase und der Aldehyddehydrogenase, aber ihre Spiegel können gegebenenfalls über eine Mutagenese oder eine zielgerichtete Überexpression von Enzymen aufgestockt werden, die diese Funktionen durchführen können. Die erforderlichen zusätzlichen Gene können auf einem Plasmid, wie pFS48B, eingeführt werden, das, unter der Kontrolle des trc-Promotors, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri, die PHA-Synthase von Zoogloea ramigera und die Glyceroldehydratase und die 1,3-Propandioloxidoreduktase von Klebsiella pneumoniae enthält. Beliebige oder alle dieser Gene können auch über eine Integration in das Chromosom mittels Standardtechniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, eingeführt werden.
Ähnlich können die Gene DAR1 und GPP2 in einen Wirt eingeführt werden, der bereits zur Synthese von Poly(3-hydroxypropionat) fähig ist, wie den oben beschriebenen MBX820/pFS47A. Die Gene DAR1 und GPP2 können auf einem Plasmid eingeführt werden, das mit pFS47A kompatibel ist (einem Plasmid, das gleichzeitig mit pFS47A beibehalten werden kann), oder sie können in das Chromosom integriert werden. MBX820 exprimiert stabil die Acetoacetyl-CoA-Thiolase, die 3-Hydroxybutyryl-CoA-Reduktase und die PHA-Synthase, und deshalb ist er zur Synthese von Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxypropionat) fähig. Wenn das Homopolymer Poly(3-hydroxypropionat) gewünscht wird, kann ein Stamm, der nur die PHA-Synthase und nicht alle drei Gene für die Biosynthese von PHB exprimiert, eingesetzt werden.
Zur Demonstration des Weges für die Biosynthese von PHP aus Glucose wurde das Plasmid pMS15 (schematisch in der 6 gezeigt) so konstruiert, dass es die folgenden Gene als ein Operon vom trc-Promotor exprimiert: die PHB-Synthase von A. eutrophus, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von C. kluyveri, die Glyceroldehydratase von Klebsiella, das DAR1-Gen von S. cerevisae, das GPP2-Gen von S. cerevisae und die 1,3-Propandioloxidoreduktase von K. pneumoniae.
Das Plasmid pFS51 wurde konstruiert, indem die PCR-Produkte von DAR1 und GPP2 eines nach dem anderen an pTrcN ligiert wurden. Das DAR1-Gen wurde mittels PCR von der genomischen DNA von S. cerevisiae mittels der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert:
Das GPP2-Gen wurde auf die gleiche Weise mittels der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert:
Die PCR wurde für jedes Gen mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) in einem Reaktionsvolumen von 50 μL durchgeführt, das die folgenden Komponenten enthielt: 10 Einheiten Pfu-Polymerase, vom Hersteller mitgelieferter 1 × Reaktionspuffer, 50 pmol der einzelnen Primer, ungefähr 200 ng genomische DNA von S. cerevisiae und 200 μM der einzelnen dNTP. Das Heizschema der Reaktionen sah folgendermaßen aus: 27 Zyklen von (94°C für 1 min, 55°C für 2 min, 72°C für 3 min), dann 7 min bei 72°C. Die Pfu-Polymerase wurde erst zugesetzt, wenn die Reaktionsmischung 94°C erreicht hatte.
Die PCR-Produkte wurden über ein Gel aus 1%-iger niedrigschmelzender Agarose gereinigt und mit den Restriktionsenzymen verdaut, deren jeweilige Stellen in die 5'-Enden der Primer eingefügt worden waren (BamHI und NotI für DAR1, NotI und XhoI für GPP2). Der Vektor pTrcN ist eine Version von pTrc99a (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die so modifiziert ist, dass ihr eine NcoI-Stelle fehlt. pTrcN wurde mit BamHI, NotI und der alkalischen Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIAP, Promega, Madison, Wisconsin) für die Insertion von DAR1 und mit NotI, XhoI und CIAP für die Insertion von GPP2 geschnitten. Die Ligationen wurden mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) gemäß den vom Hersteller mitgelieferten Instruktionen durchgeführt. Die Produkte der Ligationen waren pFS49 (DAR1) und pFS50 (GPP2). Zur Zusammenfügung beider Gene auf einem Plasmid wurde pFS49 mit MluI und NotI geschnitten, und das Fragment von 2,3 kb, das den trc-Promotor und DAR1 enthielt, wurde an pFS50 ligiert, das mit den gleichen beiden Enzymen und CIAP verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, das das Operon DAR1-GPP2 unter der Kontrolle des trc-Promotors enthielt, wurde pFS51 genannt.
Man ließ den das Plasmid pMS15 (schematisch in der 6 gezeigt) enthaltenden E.-coli-Stamm MBX184 über Nacht in einer Rechteckflasche von 200 mL bei 37°C in 50 mL LB-Medium, das auch 100 μg/mL Ampicillin enthielt, wachsen. Die Zellen wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 2000 × g von dieser Kultur abgetrennt, und die Zellen wurden in 50 mL eines Glucosemediums resuspendiert und 72 Stunden bei 30°C unter Schütteln mit 200 Upm inkubiert. Das Glucosemedium enthielt pro Liter 6,25 g LB-Pulver, 100 μg Ampicillin, 20 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7, 10 μmol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und 0, 10 oder 100 nmol Coenzym B-12. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 2000 × g vom Medium abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und dann lyophilisiert.
Die Analyse der lyophilisierten Zellmasse mittels Gaschromatografie (GC) zeigte, dass im Experiment mit 10 nM Coenzym B-12 das Poly(3HP) 0,11% des Trockenzellgewichts ausmachte, im Experiment mit 100 nM Coenzym B-12 das Poly(3HP) 0,13% des Trockenzellgewichts ausmachte, und im Experiment ohne Coenzym B-12 war kein Poly(3HP) nachweisbar. In keinem Fall wurden andere Polymerbestandteile als 3HP gefunden. Eine GC-Analyse wurde wie folgt durchgeführt: 15 bis 20 mg der lyophilisierten Zellmasse wurden bei 100°C 3 Stunden einer gleichzeitigen Extraktion und Propanolyse in 2 mL einer Mischung unterzogen, die (in Volumeneinheiten) 50% 1,2-Dichlorethan, 40% 1-Propanol und 10% konzentrierte Salzsäure enthielt, wobei 2 mg/mL Benzoesäure als interner Standard zugesetzt waren. Die wasserlöslichen Komponenten der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1: 50 bei einer Gesamtflussgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einer SPB-1-Kapillar-GC-Säule aus verschmolzenem Siliciumdioxid (30 m, 0,32 mm ID, 0,25 μm Film, Supelco, Bellefonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 80°C für 2 min, mit 10°C pro min auf 250°C, 250°C für 2 min. Der zur Testung auf das Vorhandensein von 3HP-Resten verwendete Standard war β-Propiolacton. Sowohl Poly(3HP) als auch β-Propiolacton ergeben, wenn sie einer Propanolyse unterzogen werden, den 1-Propylester von 3-Hydroxypropionat.
BEISPIEL 7 PHBV aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten
Wie oben gezeigt wurde, ist es möglich, PHBV aus 1,2-Propandiol mit der optionalen Zugabe anderer Kohlenstoffquellen, wie Glucose, zu erhalten, und es ist möglich, sowohl in transgenen als auch in nicht-transgenen Organismen 1,2-Propandiol aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten zu erzeugen (Cameron et al., 1998, Biotechnol. Prog. 14: 116–125). Deshalb ermöglicht eine Kombination der beiden Wege die Synthese von PHBV aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten. Diese Wege können entweder durch das Einführen der Gene für die Synthese von PHBV in einen 1,2-Propandiol-erzeugenden Wirt oder durch das Einführen der Gene für die Synthese von 1,2-Propandiol in einen Wirt, der bereits zur Synthese von PHBV aus 1,2-Propandiol fähig ist, wie es in den obigen Beispielen beschrieben wurde, kombiniert werden.
Im ersteren Falle werden die Gene, die für eine Dehydratase für vicinale Diole, eine PHA-Synthase, eine 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase und eine Reduktase und, gegebenenfalls, eine Aldehyddehydrogenase, eine 1-Propanoloxidoreduktase und eine Hydroxyacyl-CoA-Transferase codieren, in einem Wirt exprimiert, der zur Erzeugung von 1,2-Propandiol aus zentralen metabolischen Zwischenprodukten fähig ist. Ein Beispiel für einen derartigen Wirt ist ein Escherichia coli, das die Aldosereduktase der Rattenlinse exprimiert oder die Glyceroldehydrogenase von E. coli überexprimiert, wie es oben beschrieben wurde. Viele E.-coli-Stamme exprimieren natürlicherweise Enzymaktivitäten der 1-Propanoloxidoreduktase, der Aldehyddehydrogenase und der Propionyl-CoA-Transferase, aber ihre Spiegel können gegebenenfalls über eine Mutagenese oder eine zielgerichtete Überexpression von Enzymen, die diese Funktionen ausüben, erhöht werden. Die zusätzlich erforderlichen Gene könnten als plasmidgetragene Gen eingeführt werden, oder sie können in das Chromosom integriert werden, oder es kann eine Kombination der beiden Ansätze eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Plasmid wie pFS48B, das, unter der Kontrolle des trc-Promotors, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase von Clostridium kluyveri, die PHA-Synthase von Zoogloea ramigera und die Glyceroldehydratase und die 1,3-Propandioloxidoreduktase von Klebsiella pneumoniae enthält, in Kombination mit der Integration der Gene für die PHB-Synthese in das Chromosom mittels Standardtechniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, eingesetzt werden.
Ähnlich kann das Gen der Aldosereduktase der Rattenlinse oder der Glyceroldehydrogenase von E. coli in einen Wirt eingeführt werden, der bereits zur Synthese von PHBV fähig ist, wie MBX769/pFS44C, der oben beschrieben wurde. Eine zusätzliche Verbesserung kann aus der Überexpression eines Gens für die Methylglyoxalsynthase resultieren, wie von Cameron et al., 1998 (Biotechnol. Prog. 14: 116–125) vorgeschlagen wurde. Das Gen der Aldosereduktase der Rattenlinse oder der Glyceroldehydrogenase von E. coli kann auf einem Plasmid, das mit pFS44C kompatibel ist (einem Plasmid, das gleichzeitig mit pFS44C beibehalten werden kann), eingeführt werden, oder es kann in das Chromosom integriert werden.
BEISPIEL 8 Identifizierung von 3-Hydroxypropionaldehyddehydrogenase-Aktivität
Die Sequenz des aldH-Gens von E. coli ist von GENBANK erhältlich. Dieses Gen wurde nach der PCR-Amplifizierung mittels des im Beispiel 6 beschriebenen Ansatzes und der folgenden Primer in die Acc65I- und NotI-Stellen des Klonierungsvektors pSE380 kloniert:
Das resultierende rekombinante Plasmid pALDH wurde in E. coli DH5 alpha eingeführt, und dann ließ man die Zellen in 5 mL LB-Medium mit 100 μg/mL Ampicillin bei 37°C wachsen. Am nächsten Tag wurden 100 mL, die 100 µg/mL Ampicillin enthielten, mit 100 µL der Übernachtkultur inokuliert, und man ließ das Ganze wachsen, bis die Extinktion bei 600 nm 0,5 erreichte, und zu diesem Zeitpunkt wurde der trc-Promotor mit 1 mM IPTG induziert, und es wurde weitere 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen, in 0,1 M Tris·HCl, pH 8,0, resuspendiert und durch Sonifizieren lysiert. Das Zelllysat wurde mithilfe von 3-Hydroxypropionaldehyd sowohl mit NAD als auch mit NADP als Kofaktor auf Aldehyddehydrogenase-Aktivität getestet. Die Assays wurden mittels eines Diodenarray-Spektralphotometers von Hewlett Packard durchgeführt. Die Enzymreaktionen wurden in UV-Küvetten von 1,5 mL in einer Lösung durchgeführt, die die folgenden Komponenten enthielt:
0,1 M Tris·HCl, pH 8,0, 1 mM NAD oder NADP, 6 mM Dithiothreitol und rohen Zellextrakt bis zu einem Volumen von 1 mL. Die Mischung wurde 20 Sekunden inkubiert, ehe die Reaktion durch die Zugabe von 1 mM 3-Hydroxypropionaldehyd gestartet und bei 340 nm verfolgt wurde. Das Lysat zeigte, wenn NAD der Kofaktor war, eine signifikante 3-Hydroxypropionaldehyddehydrogenase-Aktivität (1,35 µmol/min/mg Protein), die nicht in der mittels des Vektors allein hergestellten Kontrollprobe vorhanden war. Somit kann das aldH-Gen zur Erhöhung der 3-Hydroxypropionaldehyddehydrogenase-Aktivität in den in den vorherigen Beispielen beschriebenen Stämmen eingesetzt werden. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoat, das umfasst: a) Bereitstellen gentechnisch manipulierter, nicht-humaner Organismen, die rekombinant Enzyme exprimieren, die aus der Dehydratase für vicinale Diole und der Aldehyddehydrogenase ausgewählt sind, b) Bereitstellen von Diolen, die durch von den Organismen exprimierte Enzyme in 3-Hydroxypropionat- oder 3-Hydroxyvalerat-Monomere überführt werden können, und c) Kultivieren der Organismen unter Bedingungen, unter denen 3-Hydroxypropionat oder 3-Hydroxyvalerat in Monomere überführt wird, die unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Organismen Bakterien oder Pflanzen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Organismen gentechnisch mit Plasmiden manipuliert sind, die für die Dehydratase für vicinale Diole oder die Aldehyddehydrogenase oder für beide codieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Organismen gentechnisch so manipuliert sind, dass sie Gene, die für die Dehydratase für vicinale Diole oder die Aldehyddehydrogenase oder für beide codieren, in das Chromosom inkorporiert enthalten.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Dehydratase für vicinale Diole die Dioldehydratase ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Organismus zusätzlich wenigstens ein Enzym rekombinant exprimiert, das aus der Aldosereduktase der Rattenlinse, der Glyceroldehydrogenase von E. coli und der Methylglyoxalsynthase ausgewählt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Dehydratase für vicinale Diole die Glyceroldehydratase ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Organismus auch Enzyme exprimiert, die aus der Glycerol-3-Phosphatase und der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Organismus die Enzyme Dihydroxyacetonphosphat-Dehydrogenase und Glycerol-3-Phosphatase rekombinant coexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Dihydroxyacetonphosphat-Dehydrogenase-Enzym DAR1 ist und/oder das Glycerol-3-Phosphatase-Enzym GPP2 ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die rekombinanten Gene, die für die Enzyme Dihydroxyacetonphosphat-Dehydrogenase und Glycerol-3-Phosphatase codieren, beide chromosomal integriert sind.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Organismus auch das Enzym 1,3-Propandiol-Oxidoreduktase exprimiert.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Organismus zusätzlich wenigstens ein Enzym rekombinant exprimiert, das aus der Acyl-CoA-Transferase, der Acyl-CoA-Synthetase, der β-Ketothiolase, der Acetoacyl-CoA-Reduktase und der PHA-Synthase ausgewählt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Diole aus 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und Glycerol ausgewählt sind.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Diole in Monomere überführt werden, die aus 3-Hydroxypropionat- oder 3-Hydroxyvalerat-Monomeren ausgewählt sind.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, das ferner das Zusetzen von Coenzym B-12 oder dessen Vorläufer zu der Kultur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Coenzym 8–12 oder dessen Vorläufer der Kultur in einer Konzentration von bis zu 1 µM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Coenzym B-12 oder dessen Vorläufer der Kultur in einer Konzentration von bis zu 20 nM zugesetzt wird.
Gentechnisch manipulierter, nicht-humaner Organismus, wie er in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13 definiert ist.