MX2008011704A

MX2008011704A - Métodos para el tratamiento de enfermedades asociadas con la activación del complemento dependiente de la masp-2.

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Publication number: MX2008011704A
Application number: MX2008011704A
Authority: MX
Inventors: Hans-Wilhelm Schwaeble; Cordula Margaret Stover; Clark E Tedford; James B Parent; Teizo Fujita
Original assignee: Univ Leicester
Priority date: 2006-04-03
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2009-01-19
Also published as: KR101522258B1; PL2007425T3; US20100074899A1; US20110020337A1; CN101460195B; WO2007117996A2; CN103705921B; RU2484097C2; JP2009532493A; DK2007425T3; SI3067067T1; ES2781687T3; MX366119B; EP3067067B1; US20070172483A1; JP5567328B2; HUE028834T2; AU2007234982A1; US7919094B2; PT3067067T

Abstract

Un aspecto, la invención presenta métodos para inhibir los efectos de la activación del complemento, dependiente de la MASP-2, en seres vivos. Los métodos incluyen el paso de administrarle a un sujeto que lo necesite, una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2, eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2. En algunas modalidades, el agente inhibidor de la MASP-2 inhibe la lesión celular asociada a la activación de la vía alternativa del complemento medada por la MASP-2, al tiempo que deja intacto al componente de la vía clásica (dependiente del Clq) del sistema inmunitario. En otro aspecto, la invención presenta composiciones para inhibir los efectos de la activación del complemento dependiente de la lectina, mismas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.<ibit

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS CON LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO DEPENDIENTE DE LA MASP-2 REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es la continuación parcial de la solicitud de patente de Estados Unidos número 11/150,883, presentada el 9 de junio de 2005, cuya prioridad se reivindica de conformidad con el 35 del U. S. C. § 120, la cual reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente- de Estados Unidos número 60/578,847, presentada el 10 de junio de 2004, de conformidad con el 35 del U. S. C. 119(e) y que también reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente número 60/788,876, presentada el 3 de abril de 2006, de conformidad con el 35 del U. S. C. § 119(e) .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento, dependiente de la MASP-2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema de complemento proporciona un mecanismo de acción temprana para iniciar y amplificar la respuesta inflamatoria frente a una infección microbiana y a otros ataques agudos (M. K. Liszewski y J. P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, tercera edición, publicado por W. E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York). Si bien la activación del complemento constituye una primera linea de defensa valiosa en contra de potenciales agentes patógenos, las actividades del complemento que promueven una respuesta inflamatoria protectora también pueden representar una amenaza potencial para el hospedero (K. R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol . 15:417-431, 1994; B. P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteoliticos C3 y C5 incorporan a los neutrófilos y los activan. Estas células activadas no discriminan al liberar enzimas destructoras y pueden causar daños a los órganos. Adicionalmente, la activación del complemento puede provocar la precipitación de los componentes liticos del complemento tanto cerca de las células hospederas como en los objetivos microbianos, lo que produce la lisis de la célula hospedadora. El sistema de complemento ha estado implicado como un elemento que contribuye a la patogenia de numerosos estados patológicos crónicos y agudos, incluyendo: infarto del miocardio, revascularización posterior al accidente cerebrovascular, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS,por sus siglas en inglés), lesiones por revascularización, choque séptico, derrames capilares posteriores a quemaduras por alta temperatura, inflamación por anastomosis quirúrgica post-cardiopulmonar, rechazo al transplante, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia grave y enfermedad de Alzheimer. En casi todas estas enfermedades, el complemento no es la causa sino uno de los diferentes factores implicados en la patogenia. No obstante, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico importante y representa un elemento eficaz en el control clínico de muchos de estos estados patológicos.

El reconocimiento cada vez mayor de la importancia de las lesiones tisulares mediadas por el complemento en una variedad de estados patológicos resalta la necesidad de contar con fármacos inhibidores del complemento que sean eficaces. No se han aprobado fármacos para usarlos en seres humanos cuyo objetivo sea específico e inhiban la activación del complemento. Actualmente, ya está plenamente aceptado que el sistema de complemento puede activarse por tres vías diferentes: la vía clásica, la vía de la lectina y la vía alternativa. La vía clásica es activada normalmente por un anticuerpo ligado a una partícula extraña (es decir, un antígeno) y, de este modo, necesita de la exposición previa a dicho antígeno para generar el anticuerpo específico. Ya que la activación de la vía clásica está asociada al desarrollo de una respuesta inmune, la vía clásica es parte del sistema inmunitario adquirido. En contraste, tanto la vía de la lectina como las vías alternativas son independientes de la inmunidad clónica y forman parte del sistema inmunitario innato. El primer paso en la activación de la vía clásica es la unión de una molécula de reconocimiento especifica, Clq, a una IgM e IgG ligada a antigeno. La activación del sistema de complemento deriva en la activación secuencial de los cimógenos de serina proteasa. La Clq está asociada a las proenzimas serina proteasas Clr y Cls en un complejo denominado Cl y, cuando la Clq se une a un inmunocomplej o, a la escisión autoproteolitica del sitio Arg-Ile del Clr le sigue la activación Clr del Cls, el cual adquiere la capacidad para escindir C4 y C2. La escisión de C4 en dos fragmentos, denominados C4a y C4b, permite que los fragmentos C4b formen enlaces covalentes con los grupos hidroxilo o amino adyacentes y la posterior generación de la C3 convertasa (C4b2b) por medio de la interacción no covalente con el fragmento C2b del C2 activado. La C3 convertasa (C4b2b) activa al C3, lo que lleva a la generación de la C5 convertasa (C4b2b3b) y a la formación del complejo de ataque a la membrana (C5b-9) que puede provocar la lisis microbiana. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) están covalentemente depositadas en las superficies objetivo extrañas, mismas que son reconocidas por los receptores del complemento en múltiples fagocitos. Independientemente, el primer paso en la activación del sistema de complemento por la via de la lectina es también la unión de moléculas de reconocimiento especificas, a lo que le sigue la activación de las serina proteasas asociadas. Sin embargo, en vez de la unión de los inmunocomplej os por medio del Clq, las moléculas de reconocimiento de la via de la lectina son proteínas de unión a carbohidratos (lectina de unión a mañana o MBL, por sus siglas en inglés), H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina (J. Lu et al., Biochim. Biophys . Acta 2572:387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol . 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)) . Ikeda et al. demostraron primero que, al igual que el Clq, la MBL podía activar al sistema de complemento al unirse a eritrocitos recubiertos con mañana de levadura en una forma que depende de C4 (K. Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454 , 1987). La MBL, un miembro de la familia de proteínas colectina, es una lectina dependiente del calcio que se une a carbohidratos que tienen grupos 3- y 4-hidroxilo orientados en el plano ecuatorial del anillo de piranosa. Los ligandos importantes para la MBL son, de este modo, la D-manosa y la N-acetil-D-glucosamina , en tanto que los carbohidratos que no se ajustan a este requisito esférico tienen una afinidad indetectable por la MBL (Weis, W. I., et al., Nature 360:127-134, 1992) . La interacción entre la MBL y los azúcares monovalentes es extremadamente débil, sus constantes de disociación están, por lo general, son del orden de 2 mM. La MBL logra una fuerte unión especifica con los ligandos del glucano por interacción simultánea con múltiples residuos monosacáridos (Lee, R. T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, 1992). La MBL reconoce los patrones de carbohidrato que normalmente adornan a los microorganismos, tales como bacterias, levaduras, parásitos y ciertos virus. En contraste, la MBL no reconoce a la D-galactosa ni al ácido siálico, los azúcares penúltimo y último que normalmente adornan a los glucoconj ugados complejos "maduros" presentes en el plasma de mamíferos y a las glucoproteínas de la superficie célular. Se cree que la especificidad de unión ayuda a proteger contra la autoactivación . Sin embargo, la MBL se une con gran afinidad a los agrupamientos de glucanos "precursores" de alta mañosa en glucoproteínas ligadas a N y en glucolípidos secuestrados en el retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi de células de mamífero (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). Por lo tanto, las células dañadas son objetivos potenciales para la activación de la vía de la lectina a través de la unión a la MBL. Las ficolinas poseen un tipo de dominio de lectina distinto al de la MBL, denominado dominio de tipo fibrinógeno. Las ficolinas se unen a residuos de azúcar de manera independiente al Ca++. En los seres humanos se han identificado tres tipos de ficolinas, la L-ficolina, la M-ficolina y la H-ficolina. Las dos ficolinas del suero, la L-ficolina y la H-ficolina, tienen en común una especificidad por la N-acetil-D-glucosamina; no obstante, la H-ficolina también se une a la N-acetil-D-galactosamina . La diferencia en la especificidad de la L-ficolina, la H-ficolina y la MBL por el azúcar significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y dirigirse mediante traslape, hacia diferentes glucoconj ugados . Este concepto tiene su sustento en el reciente informe de que, de las lectinas conocidas en la via de la lectina, sólo la L-ficolina se une específicamente al ácido lipoteicoico, un glucoconj ugado de la pared celular que se encuentra en todas las bacterias grampositivas (Lynch, N. J., et al . , J. Immunol. 172:1198-1202, 2004). Las colectinas (es decir, la MBL) y las ficolinas no tienen una similitud significativa en su secuencia de aminoácidos. Sin embargo, los dos grupos de proteínas tienen organizaciones de dominio semejantes y, al igual que el Clq, se ensamblan en estructuras oligoméricas , que maximizan la posibilidad de la unión en múltiples sitios. Las concentraciones séricas de la MBL son muy variables en poblaciones sanas y ésto es genéticamente controlado por el polimorfismo/mutaciones tanto en la región promotora como en la codificadora del gen de la MBL. Como una proteina de fase aguda, la expresión de la MBL está además sobrerregulada durante la inflamación. La L-ficolina está presente en el suero en concentraciones semejantes a las de la MBL. Por lo tanto, en cuanto a intensidad, la rama de la L-ficolina de la vía de la lectina es potencialmente compararble con la rama de la MBL. La MBL y las ficolinas también pueden funcionar como opsoninas, lo que necesita la interacción de éstas proteínas con los receptores del fagocito (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Med. 169:1733, 1989; Matsushita, . , et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996). No obstante, las identidades del o de los receptores en las células fagocíticas no han sido establecidas. La MBL de humanos interactúa específicamente y con gran afinidad por medio de su dominio de tipo colágeno con las serina proteasas singulares de tipo Clr/Cls, denominadas serina proteasas asociadas a la MBL o MASP, por sus siglas en inglés. Hasta ahora, se han descrito tres MASP. Primero, solo una enzima "MASP" fue identificada y caracterizada como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento (es decir, de la escisión de C2 y C4) (Ji, Y. H., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Resultó luego que esta MASP era de hecho una mezcla de dos proteasas: la MASP-1 y la MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). Sin embargo, se demostró que el complejo MBL-MASP-2 , por si solo, es suficiente para la activación del complemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100, 2000) . Lo que es más, sólo la MASP-2 escindió a C2 y C4 a tasas elevadas (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 170:1374-1382, 2003) . Por lo tanto, la MASP-2 es la proteasa responsable de activar a C4 y C2 para la generación de la C3 convertasa, C4b2b. Esta es una diferencia significativa con el complejo Cl, donde la acción coordinada de dos serina proteasas especificas (Clr y Cls) deriva en la activación del sistema de complemento. Recientemente, se ha aislado una tercera proteasa novedosa, la MASP-3 (Dahl, M. R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). La MASP-1 y la MASP-3 son productos empalmados en forma alternativa del mismo gen. Está pendiente aún el establecimiento de las funciones biológicas de la MASP-1 y la MASP-3. Las MASP comparten organizaciones de dominio idénticas a las de Clr y Cls, los componentes enzimáticos del complejo Cl (Sim, R. B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000). Estos dominios incluyen un dominio de proteina Clr/Cls/Vegf de erizo de mar/morfogénica ósea N terminal (CUB) , un dominio de tipo factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio CUB, una serie de dominios de proteina de control del complemento, y un dominio de serina proteasa. Al igual que en las Cl proteasas, la activación de la MASP-2 se realiza por medio de la escisión de un enlace Arg-Ile adyacente al dominio de la serina proteasa, que separa a la enzima en las cadenas A y B ligadas por disulfuro, ésta última está formada por el dominio de la serina proteasa. Recientemente, se describió una deficiencia genéticamente determinada de la MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K., et al . , New Eng. J. Med. 349:554-560, 2003). La mutación de un solo nucleótido deriva en un intercambio de Asp-Gly en el dominio CUB1 y provoca que la MASP-2 sea incapaz de ligarse a la MBL. La MBL también está asociada a una proteina no enzimática denominada proteina de 19 kDa asociada a la MBL, (MApl9) (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) o pequeña proteina asociada a la MBL (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999). La MApl9 se forma mediante el empalme alternativo del producto génico MASP-2 y contiene los dos primeros dominios de la MASP-2, seguido de una secuencia adicional de cuatro aminoácidos únicos. Los genes MASP 1 y MASP 2 están ubicados en los cromosomas 3 y 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205: 455-466, 2002). Varias lineas de evidencias sugieren que existen diferentes complejos MBL-MASP y una fracción importante de las MASP séricas totales no está complejada con la MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). Tanto la H-ficolina como la L-ficolina están asociadas con la MASP y activan la vía del complemento de la lectina, como lo hace la MBL (Dahl, M . R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M . , et al., J. Immunol . 168:3502-3506, 2002) . Tanto la vía de la lectina como la vía clásica forman una C3 convertasa común (C4b2b) y las dos vías convergen en este paso. Está muy difundida la creencia de que la vía de la lectina realiza una función importante en la defensa del hospedero en contra de infecciones. La sólida evidencia de la participación de la MBL en la defensa del hospedero proviene del análisis de pacientes con bajos niveles séricos de la MBL funcional (Kilpatrick, D. C, Biochim. Biophys. Acta 1572:401- 13, 2002). Estos pacientes presentan susceptibilidad a infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes. Estos síntomas se observan, normalmente, en etapas tempranas de la vida, durante una ventana aparente de vulnerabilidad como cuando hay reducciones en la concentración de los anticuerpos derivados por la vía maternal, pero antes de que se desarrolle un repertorio completo de respuestas a los anticuerpos. Este síndrome se deriva, con frecuencia, de mutaciones en varios sitios de la porción de colágeno de la MBL, que interfieren con la formación apropiada de oligómeros de la MBL. Sin embargo, debido a que la MBL puede funcionar como una opsonina independiente del complemento, no se sabe hasta que grado el aumento en la susceptibilidad a las infecciones se debe a la alteración en la activación del complemento. Aunque existe una gran cantidad de pruebas que implican tanto a la vía clásica como a la via alternativa del complemento en la patogenia de enfermedades humanas no infecciosas, la función de la via de la lectina apenas está empezando a ser evaluada. Estudios recientes aportan pruebas de que la activación de la via de la lectina puede ser responsable de la activación del complemento y de la inflamación asociada en la lesión por isquemia/revascularización. Collard et al. (2000) informó que las células endoteliales cultivadas sometidas a tensión oxidante se ligan a la BL y presentan precipitación de C3 al exponerlas al suero humano (Collard, C. D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). Adicionalmente, el tratamiento de sueros humanos con anticuerpos monoclonales anti- BL bloqueadores inhibieron la unión de la MBL y complementan la activación. Estos hallazgos se llevaron a un modelo de isquemia-revascularización del miocardio en rata, en el cual las ratas tratadas con un anticuerpo bloqueador dirigido contra la MBL de la rata mostró significativamente un menor daño del miocardio con la oclusión de una arteria coronaria que el de las ratas tratadas con un anticuerpo de control (Jordán, J. E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). No está claro el mecanismo molecular de la MBL que se une al endotelio vascular después de la tensión oxidante; un estudio reciente sugiere que la activación de la vía de la lectina después de la tensión oxidante puede ser controlada por la MBL que se une a las citoqueratinas del endotelio vascular, y no a los glucoconj ugados (Collard, C.D., et al., Mi . J. Pa thol . 159:1045-1054, 2001). Otros estudios han implicado a las vías clásica y alternativa en la patogenia de lesión por isquemia/revascularización y la función de la vía de la lectina en esta enfermedad sigue siendo un tema controvertido (Riedermann, N. C, et al., Mi . J. Pa thol . 162:363-367, 2003). En contraste a las vías clásica y de la lectina, no se han encontrado iniciadores de la vía alternativa que cumplan con las funciones de reconocimiento que la Clq y las lectinas realizan en las otras dos vías. En la actualidad es muy aceptado que la via alternativa es espontáneamente activada por superficies extrañas u otras superficies anormales (bacterias, levaduras, células con infección viral, o tejido dañado) . Son cuatro las proteínas plasmáticas directamente involucradas en la vía alternativa: C3, factores B y D, y properdina . Es necesaria la generación proteolitica de C3b a partir de C3 nativo para que la vía alternativa funcione. Debido a que la C3 convertasa (C3bBb) de la vía alternativa contiene C3b como la subunidad esencial, la cuestión referente al origen del primer C3b a través de la vía alternativa ha planteado un problema complicado y ha estimulado la realización de una exhaustiva investigación. El C3 pertenece a una familia de proteínas (junto con C4 y a-2-macroglobulina ) que contienen una rara modificación postraslacional conocida como enlace tioéster. El grupo tioéster está formado por una glutamina cuyo grupo carbonilo terminal está unido al grupo sulfhidrilo de una cisteína a tres aminoácidos de distancia. Este enlace es inestable y el grupo carbonilo electrofílico de la glutamina puede formar un enlace covalente con otras moléculas a través de grupos hidroxilo o amino. El enlace tioéster es razonablemente estable cuando está secuestrado en una cavidad hidrofóbica de C3 intacto. No obstante, la escisión proteolítica del C3 en C3a y C3b deriva en la exposición del enlace tioéster altamente reactivo en C3b y, por este mecanismo, el C3b se une covalentemente a un objetivo. Además de su bien documentada función en la unión covalente del C3b con objetivos del complemento, se cree que el tioéster del C3 también desempeña un papel fundamental en la activación de la vía alternativa. De conformidad con la muy aceptada "teoría de la marcha lenta", la vía alternativa inicia con la generación de una convertasa en fase fluida, la iC3Bb, que se forma a partir de C3, que tiene hidrolizado su enlace tioéster (iC3; C3(H20)), y el factor B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol . 7:143-162, 1984). El iC3 de tipo C3b se genera a partir del C3 nativo por medio de la hidrólisis lenta y espontánea del tioéster interno de la proteina (Pangburn, M. K. , et al., J. Exp. Med. 754:856-867, 1981) . Mediante la actividad de la iC3Bb convertasa, las moléculas de C3b se precipitan o depositan en la superficie objetivo iniciando asi la vía alternativa . Se sabe muy poco de los iniciadores de la activación de la vía alternativa. Se piensa que los activadores incluyen paredes celulares de levaduras (cimosán) , muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, ciertas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, células de tumores de animales, parásitos y células dañadas. La única característica común en estos activadores es la presencia de carbohidrato, pero, la complejidad y variedad de las estructuras de carbohidrato ha dificultado el establecimiento de los determinantes moleculares compartidos, que son reconocidos. La vía alternativa también puede proporcionar un poderoso ciclo de amplificación para la C3 convertasa (C4b2b) de la vía de la lectina/vía clásica, ya que cualquier C3b generado puede participar con factor B en la formación adicional de la C3 convertasa (C3bBb) de la vía alternativa. La C3 convertasa de la vía alternativa es estabilizada por la unión de la properdina. La properdina extiende la vida media de la C3 convertasa de la vía alternativa de 6 a 10 veces. La adición de C3b a la C3 convertasa conduce a la formación de la C5 convertasa de la vía alternativa. Se ha pensado que estas tres vías (es decir, la clásica, la de la lectina y la alternativa) convergen en C5, que es escindido para formar productos con múltiples efectos proinflamatios . La vía a la que se converge ha sido denominada vía del complemento terminal. La C5a es la anafilatoxina más potente, que induce alteraciones en el músculo liso y en el tono vascular, asi como en la permeabilidad vascular. También es una poderosa quimiotaxina y un activador tanto de neutrófilos como de monocitos. La activación celular mediada por C5a puede amplificar de manera significativa las respuestas inflamatorias al inducir la liberación de múltiples mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo citocinas, enzimas hidrolit icas , metabolitos del ácido araquidónico y especies de oxigeno reactivas. La escisión de C5 deriva en la formación de la C5b-9, también conocido como el complejo de ataque a. la membrana o MAC, por sus siglas en inglés. En la actualidad hay sólidas pruebas de que la precipitación del MAC sublitico puede desempeñar una función importante en la inflamación además de su función como un complejo Utico formador de poros.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención presenta un método para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento, dependiente de la MASP-2, en un ser vivo. El método incluye el paso de administrarle a un sujeto que lo necesite, una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2, efectiva para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2. En este contexto, la frase "activación del complemento dependiente de la MASP-2" se refiere a la activación del complemento por la vía alternativa que ocurre a través del sistema de la MASP-2 dependiente de la lectina. En otro aspecto de la invención, el agente inhibidor de la MASP-2 inhibe la activación del complemento a través del sistema de la MASP-2 dependiente de la lectina sin inhibir considerablemente la activación del complemento a través del sistema clásico o del que depende de la Clq, de tal modo que el sistema dependiente de la Clq mantiene su funcionalidad . En algunas modalidades de estos aspectos de la invención, el agente inhibidor de la MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 o un fragmento del mismo. En modalidades adicionales, el anticuerpo anti-MASP-2 tiene una función efectora reducida. En algunas modalidades, el agente inhibidor de la MASP-2 es un péptido inhibidor de la MASP-2 o un inhibidor de la MASP-2 no peptidico.

En otro aspecto, la presente invención describe composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2, que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describen métodos para fabricar un medicamento que se usará para inhibir, en aquellos sujetos que lo necesiten, los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2, el medicamento contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. También se presentan métodos para la fabricación de los medicamentos que se usarán para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en el tratamiento de cada una de las condiciones, enfermedades y trastornos que se describirán a continuación . Los métodos, composiciones y medicamentos de la invención son útiles para inhibir los efectos adversos de la activación in vivo del complemento dependiente de la MASP-2 en mamíferos, incluyendo humanos que padecen una lesión o enfermedad patológica aguda o crónica, como se describirá más adelante en este documento. Estas enfermedades y lesiones incluyen, pero no se limitan a, la activación del complemento mediada por la MASP-2 en trastornos autoinmunitarios y/o enfermedades inflamatorias asociadas . En un aspecto de la invención, se presentan los métodos para el tratamiento de lesiones por revascularización isquémica al tratar a un sujeto sometido a revascularización isquémica, que incluye, pero sin limitarse a, posreparación del aneurisma aórtico, anastomosis quirúrgica cardiopulmonar, reanastomosis vascular relacionada, por ejemplo, el transplante de órganos (por ejemplo, de corazón, pulmón, hígado, riñon) y/o la reimplantación de extremidades/dedos, el accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, reanimación hemodinámica posterior a procedimientos de choque y/o quirúrgicos, con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. En un aspecto de la invención, se presentan los métodos para inhibir la aterosclerosis al tratar a un sujeto que padece o es proclive a la aterosclerosis, con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. En un aspecto de la invención, se presentan los métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece de enfermedades vasculares, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cerebrovasculares , enfermedades vasculares periféricas (por ejemplo, las músculo esqueléticas), enfermedades renovasculares , vasculares mesentéricas/entéricas, y la revascularización en transplantes y/o reimplantes, al tratar al paciente con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan al tratamiento de: vasculitis, que incluye nefritis púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a la artritis reumatoide (también llamada artritis reumatoide maligna), vasculitis inmunocomplej a , y enfermedad de Takayasu; cardiomiopatia dilatada; angiopatia diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis) ; émbolo de gas venoso (VGE, por sus siglas en inglés); y/o restenosis posterior a la colocación de una endoprótesis , aterectomia giratoria y/o angioplastia coronaria transluminal percutánea o PTCA, por sus siglas en inglés. En otro aspecto de la invención, se presentan los métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece trastornos gastrointestinales inflamatorios, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, pancreatitis, diverticulitis y trastornos intestinales que incluyen a la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, y síndrome del colon irritable. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la ASP-2 en un sujeto que padece alguna enfermedad pulmonar, entre las que se incluyen, pero que no se limitan a, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión, lesión pulmonar aguda por isquemia/revascularización, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad de la membrana basal antiglomerular (enfermedad de Goodpasture) , síndrome de aspiración de meconio, síndrome de la bronquilitis oblliterans, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria por quemaduras, edema pulmonar no cardiogénica, depresión respiratoria relacionada con la transfusión, y enfisema. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, que se está sometiendo o que se someterá a un procedimiento de revascularización extracorporal , entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, hemodiálisis , plasmaféresis , leucoféresis , oxigenación de membrana extracorporal o ECMO, por sus siglas en inglés, precipitación de LDL por oxigenación de membrana extracorporal inducida por heparina o HELP, por sus siglas en inglés, y anastomosis quirúrgica cardiopulmonar o CPB, por sus siglas en inglés.

En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece alguna enfermedad músculo esquelética, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, osteoartritis , artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, gota, artropatia neuropática, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante u otras espondiloartropatias y artropatias cristalinas, distrofia muscular o lupus eritematoso sistémico o SLE, por sus siglas en inglés. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece enfermedades renales, entre las que se incluyen, pero que no se limitan a, glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa ( glomerulonefritis mesangiocapilar) , glomerulonefritis post-infecciosa aguda ( glomerulonefritis post-estreptocócica ) , glomerulonefritis crioglobulinémica, nefritis por lupus, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein o nefropatia por IgA. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece alguna enfermedad de la piel, entre las que se incluyen, pero que no se limitan a, psoriasis, dermatosis ampulosa autoinmunitaria, espongiosis eosinofilica, pénfigo ampuloso, epidermólisis ampulosa adquirida y herpes gestacional y otros trastornos de la piel, o de una lesión por quemadura térmica o química que involucra a los derrames capilares. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la ASP-2 en un sujeto que ha recibido un órgano u otro transplante de tejido, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, alotransplantes o xenotransplantes de órganos completos (por ejemplo, de riñon, corazón, hígado, páncreas, pulmones, córnea, etc.) o injertos (por ejemplo, de válvulas, tendones, médula ósea, etc . ) . En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece de un trastorno o lesión en el sistema nervioso central o un trastorno o lesión en el sistema nervioso periférico, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, esclerosis múltiple o MS, miastenia grave o MG, enfermedad de Huntington o HD, esclerosis lateral amiotrófica o ALS, síndrome de Guillain Barre, revascularización posterior al accidente cerebrovascular, degeneración de discos, traumatismo encefálico, enfermedad de Parkinson o PD, enfermedad de Alzheimer o AD, síndrome de Miller-Fisher, traumatismo y/o hemorragia encefálica, desmielinización y meningitis . En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece algún trastorno sanguíneo, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, septicemia o alguna de sus enfermedades derivadas, que incluyen, sin limitarse a, septicemia grave, choque séptico, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda derivado de la septicemia, y síndrome de respuesta inflamatoria generalizada. Se presentan métodos relacionados para el tratamiento de otras hemopatías, entre las que se incluyen, choque hemorrágico, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica trombótica autoinmunitaria o TTP, síndrome urémico hemolítico o HUS, u otros trastornos que destruyen la sangre o la médula ósea . En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece alguna enfermedad urogenital, entre las que se incluyen, aunque no se limitan a, enfermedad de la vejiga dolorosa, enfermedad de la vejiga sensible, cistitis abacteriana crónica y cistitis intersticial, infertilidad masculina o femenina, disfunción placentaria y aborto natural y preeclampsia .

En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la ASP-2 en un sujeto que padece diabetes no obesa (diabetes tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente ) o de complicaciones angiopáticas , neuropáticas o retinopáticas por diabetes de tipo 1 o de tipo 2 (de inicio en la etapa adulta) . En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto bajo tratamiento quimioterapéutico y/o a terapia con radiaciones, entre los que se incluyen, sin limitarse, al tratamiento de enfermedades cancerosas, mediante la administración de un inhibidor de la MASP-2 a dicho paciente periquimioterapéuticamente o con terapia perirradiológica, es decir, antes y/o durante y/o después de la administración de los agentes quimioterapéuticos y/o de la radioterapia. La administración de los inhibidores de la MASP-2 en la terapia periquimioterapéutica o periradiológica puede ser útil para reducir los efectos secundarios de la terapia quimioterapéutica o con radiaciones. En un aspecto adicional de la invención, se presentan métodos para el tratamiento de neoplasias malignas mediante la administración de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente que tiene un padecimiento.

En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece algún trastorno endocrino, al administrarle a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Los padecimientos sujetos a tratamiento de conformidad con la presente invención incluyen, a manera de ejemplo no limitante, tiroiditis de Hashimoto, tensión o estrés, ansiedad y otros potenciales trastornos hormonales que incluyen la liberación regulada de prolactina, del factor de crecimiento o de crecimiento tipo insulina y de la adrenocorticotropina de la pituitaria. En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece alguna degeneración macular relacionada con la edad u otro padecimiento oftalmológico mediado por el complemento al administrarle al sujeto que padece dicho padecimiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los anteriores aspectos de la invención, así como muchas de las ventajas concomitantes a esta invención podrán ser fácilmente apreciadas conforme ésta se comprenda mejor con referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere conjuntamente con los dibujos anexos, en los cuales: La figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra al nuevo descubrimiento de que la vía alternativa del complemento necesita, para la activación del complemento, la activación de la MASP-2 dependiente de la vía de la lectina . La figura 2 es un diagrama que ilustra la estructura genómica de la MASP-2 humana. La figura 3A es un diagrama esquemático que ilustra la estructura del dominio de la proteina MASP-2 humana . La figura 3B es un diagrama esquemático que ilustra la estructura del dominio de la proteina MAp 19 humana . La figura 4 es un diagrama que ilustra la estrategia de desactivación génica de la MASP-2 de múrido. La figura 5 es un diagrama que ilustra la construcción minigénica de la MASP-2 humana. La figura 6A presenta resultados que muestran que la deficiencia de MASP-2 lleva a la pérdida de activación de C4 mediada por la vía de la lectina, determinada por la falta de precipitación de C4b en mañana. La figura 6B presenta resultados que muestran que la deficiencia de MASP-2 lleva a la pérdida de activación de C4 mediada por la vía de la lectina, determinada por la falta de precipitación de C4b en cimosán. La figura 6C presenta resultados que demuestran los niveles relativos de activación de C4 en muestras de suero obtenidas de cepas tipo MASP-2+/-; MASP-2-/- y silvestre, medidas por la precipitación de C4b en mañana o en cimosán. La figura 7A presenta los resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 lleva a la pérdida tanto de la activación de C3 mediada por la vía de lectina como la mediada por la vía alternativa, mediada por la falta de precipitación de C3b en mañana. La figura 7B presenta los resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 lleva a la pérdida tanto de la activación de C3 mediada por la via de lectina como la mediada por la via alternativa, mediada por la falta de precipitación de C3b en cimosán. La figura 8 presenta resultados que demuestran que la adición de MASP-2 recombinante de múrido a muestras séricas de MASP-2-/- recupera la activación de C4 mediada por la via de la lectina en una forma que depende de la concentración de proteina, determinada por la precipitación de C4b en mañana. La figura 9 presenta resultados que demuestran que la via clásica funciona en la cepa MASP-2-/-. La figura 10 presenta los resultados que demuestran que el sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2 se activa en la fase isquémica/de revascularización posterior a la reparación del aneurisma aórtico abdominal. La figura 11A presenta resultados que muestran que el anticuerpo anti-MASP-2 Fab2 #11 inhibe la formación de C3 convertasa, como se describe en el Ejemplo 24. La figura 11B presenta resultados que muestran que el anticuerpo anti-MASP-2 Fab2 #11 se liga a la MASP-2 nativa de rata, como se describe en el Ejemplo 24. La figura 11C presenta resultados que demuestran que el anticuerpo anti-MASP-2 Fab2 #41 inhibe la escisión de C4, como se describe en el Ejemplo 24. La figura 12 presenta los resultados que demuestran que se encontró que todos los anticuerpos anti-MASP-2 Fab2 probados que inhibían la formación de C3 convertasa también inhibían la escisión de C4, como se describe en el Ejemplo 24. La figura 13 es un diagrama que ilustra los polipéptidos recombinantes derivados de la MASP-2 de rata que se utilizaron para la localización del epítopo de la anti-MASP-2 que bloquea los anticuerpos Fab2, como se describe en el Ejemplo 25. La figura 14 presenta los resultados que demuestran la unión del anti-MASP-2 Fab2 #40 y #60 a los polipéptidos MASP-2 de rata, como se describe en el Ejemplo 25. La figura 15 presenta los resultados que demuestran la depuración del nitrógeno de la urea en sangre de ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 a las 24 y 48 horas después de la revascularización en un modelo de lesión isquémica/revascularización renal, como se describe en el Ejemplo 26. La figura 16A presenta los resultados que demuestran la magnitud del infarto de ratones de tipo silvestre (+/+) y la menor magnitud del infarto de ratones MASP-2 (-/-) después de la lesión en un modelo de oclusión de arteria coronaria y revascularización, como se describe en el Ejemplo 27. La figura 16B presenta los resultados que muestran la distribución de los animales individuales tratados en el modelo de oclusión de la arteria coronaria y revascularización, como se describe en el Ejemplo 27. La figura 17A presenta los resultados que muestran los niveles de la proteina VEGF de la linea basal en el complejo RPE-coroide aislado de ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-) , como se describe en el Ejemplo 28. La figura 17B presenta resultados que muestran los niveles de proteina VEGF en el complejo RPE-coroide a los 3 días en ratones de tipo silvestre ( +/+) y MASP-2 (-/-) después de una lesión inducida con láser en un modelo de degeneración macular, como se describe en el Ejemplo 28. La figura 18 presenta resultados que muestran el volumen medio de la neovascularización coroidal (CNV, por sus siglas en inglés) siete días después de la lesión inducida con láser en ratones de tipo silvestre (+/+) y MASP-2 (-/-), como se describe en el Ejemplo 28. La figura 19 presenta los resultados que muestran el índice medio de artritis clínica de ratones de tipo silvestre (+/+) MASP-2 (-/-) al paso del tiempo, posterior a la artritis reumatoide inducida con Col2 mAb, como se describe en el Ejemplo 29. La figura 20A es un diagrama que muestra la alteración dirigida del gen sMAP (MAp 19) , como se describe en el Ejemplo 30. La figura 20B presenta el análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de la descendencia generada por el acoplamiento de ratones macho híbridos sMAP (-/-) con ratones hembras C57BL/6, como se describe en el Ejemplo 30. La figura 20C presenta el análisis genotípico por PCR de ratones de tipo silvestre ( +/+ ) y sMAP (-/-), como se describe en el Ejemplo 30. La figura 21A presenta el análisis por transferencia Northern de ARNm de sMAP y MASP-2 en ratones sMAP (-/-), como se describe en el Ejemplo 30.

La figura 21B presenta el análisis cuantitativo por RT-PCR del ADNc que codifica para la cadena H de MASP-2, la cadena L de MASP-2 y la sMAP, en ratones de tipo silvestre ( +/+) y sMAP (-/-) , como se describe en el Ejemplo 30. La figura 22A presenta la inmunotransferencia de sMAP (-/-), es decir, de Apl9 (-/-), que demuestra la deficiencia de MASP-2 y sMAP en suero de ratón, como se describe en el Ejemplo 30. La figura 22B presenta resultados que demuestran que fueron detectados MASP-2 y sMAP en el complejo MBL-MASP-sMAP, que se describe en el Ejemplo 30. La figura 23A presenta resultados que muestran la precipitación de C4 en pozos recubiertos con mañana de suero de ratón de tipo silvestre ( +/+) y sMAP (-/-) , como se describe en el Ejemplo 30. La figura 23B presenta resultados que muestran la precipitación de C3 en pozos recubiertos con mañana de suero de ratón de tipo silvestre ( +/+) y sMAP (-/-) , como se describe en el Ejemplo 30. La figura 24A presenta resultados que muestran la reconstitución del complejo MBL-MASP-sMAP en el suero sMAP (-/-), como se describe en el Ejemplo 30. Las figuras 24B a 24D presentan los resultados que muestran la unión competitiva de rsMAP y MASP-2Í a MBL, como se describe en el Ejemplo 30.

Las figuras 25A a 25B presentan los resultados que muestran la restauración de la actividad precipitante de C4 mediante la adición de rMASP-2, pero no de rsMAP, como se describe en el Ejemplo 30. Las figuras 26A a 26B presentan resultados que muestran la reducción de la actividad precipitante de C4 mediante la adición de rsMAP, como se describe en el Ejemplo 30; y Las figuras 27A a 27C presentan resultados que muestran que la MASP-2 es responsable de la activación de C3 evitando C4, como se describe en el Ejemplo 31.

DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS SEQ ID NO:l MApl9 de ADNc humano SEQ ID NO: 2 proteina MApl9 de humano (con guia) SEQ ID NO: 3 proteina MApl9 de humano (madura) SEQ ID NO: 4 MASP-2 de ADNc de humano SEQ ID NO: 5 proteina MASP-2 de humano (con guia) SEQ ID NO: 6 proteina MASP-2 de humano (madura) SEQ ID NO: 7 MASP-2 de ADNg de humano (exones 1 a 6) ANTÍGENOS: (CON REFERENCIA A LA PROTEÍNA MASP-2 MADURA) SEQ ID NO: 8 secuencia CUBI (aa 1-121) SEQ ID NO: 9 secuencia CUBEGF (aa 1-166) SEQ ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aa 1-293) SEQ ID NO: 11 región EGF (aa 122-166) SEQ ID NO: 12 dominio de la serina proteasa (aa 429-671) SEQ ID NO: 13 dominio de la serina proteasa inactiva (aa 610-625 con la mutación de Ser618 a Ala) SEQ ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (péptido CUB1) SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLC GQ (péptido CUBI) SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (núcleo de la región de unión con la MBL) SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (región de unión con MBL) SEQ ID NO: 18 IDECQVAPG (péptido EGF) SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (núcleo de unión con la proteasa) Descripción detallada INHIBIDORES DE PÉPTIDOS: SEQ ID NO: 20 MBL de ADNc de longitud completa SEQ ID NO: 21 proteína de longitud completa MBL SEQ ID NO: 22 OGK-X-GP (unión consensual) SEQ ID NO: 23 OGKLG SEQ ID NO: 24 GLR GLQ GPO GKL GPO G SEQ ID NO: 25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO SEQ ID NO: 26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG SEQ ID NO: 27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (H-ficolina humana) SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (ficolina p35 humana) SEQ ID NO: 29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sitio de escisión de C4) INHIBIDORES DE EXPRESIÓN: SEQ ID NO: 30 ADNc del dominio CUBI-EGF (nucleótidos 22-680 de la SEQ ID NO: ) SEQ ID NO:31 5 ' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3 ' Nucleótidos 12-45 de la SEQ ID NO: 4 que incluye al sitio de inicio de la traducción de la ASP-2 (sentido) SEQ ID NO: 32 5 ' GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3 ' Nucleótidos 361-396 de la SEQ ID NO: 4 que codifican para una región que contiene el sitio de unión MASP-2 de la MBL (sentido) SEQ ID NO:33 5 ' AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3 ' Nucleótidos 610-642 de la SEQ ID NO: 4 que codifican para una región que contiene al dominio CUBII CEBADORES DE CLONACIÓN: SEQ ID NO: 34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (PCR de 5" para CUB) SEQ ID NO: 35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (PCR de 3' para CUB) SEQ ID NO: 36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (PCR de 3' para CUBIEGF) SEQ ID NO: 37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (PCR 3' para CUBIEGFCUBII) SEQ ID NOS: 38-47 son cebadores de clonación para anticuerpo humanizado SEQ ID NO: 48 es un enlace peptidico de 9 aa VECTOR DE EXPRESIÓN: SEQ ID NO: 9 es el inserto minigénico de MASP-2 SEQ ID NO: 50 es el ADNc de MASP-2 de múrido SEQ ID NO: 51 es la proteina de MASP-2 de múrido (c/lider) SEQ ID NO: 52 es la proteina de MASP-2 madura de múrido SEQ ID NO: 53 es el ADNc de MASP-2 de rata SEQ ID NO: 54 es la proteina de MASP-2 de rata c/lider) SEQ ID NO: 55 es la proteina MASP-2 madura de rata SEQ ID NO: 56-59 son los oligonucleótidos para mutagénesis dirigida al sitio de la MASP-2 humana utilizada para generar la MASP-2A humana SEQ ID NO: 60-63 son los oligonucleótidos para mutagénesis dirigida al sitio de la MASP-2 de múrido utilizada para generar la MASP-2A de múrido SEQ ID NO: 64-65 son los oligonucleótidos para mutagénesis dirigida al sitio de la MASP-2 de rata utilizada para generar la MASP-2A de rata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como base el sorprendente descubrimiento realizado por los inventores de la misma de que es necesaria la MASP-2 para iniciar la activación de la vía alternativa del complemento- Mediante el uso de un modelo de ratón con desactivación génica de MASP-2-/-, los inventores de la presente han mostrado que es posible inhibir la activación de la vía alternativa del complemento a través de la via de la MASP-2 mediada por lectina, al tiempo que deja intacta a la via clásica, estableciendo asi la activación de la MASP-2 dependiente de la lectina como un requisito para la activación alternativa del complemento en ausencia de la via clásica. La presente invención también describe el uso de la MASP-2 como un objetivo terapéutico para inhibir la lesión celular asociada con la activación de la via alternativa del complemento mediada por la lectina, al tiempo que deja intacto al componente de la via clásica (dependiente del Clq) del sistema inmunitario.

I . DEFINICIONES A menos que se definan específicamente en la presente, todos los términos aquí utilizados tienen el mismo significado que entenderían quienes tienen experiencia ordinaria en la técnica de la presente invención. Las siguientes definiciones se presentan con la finalidad de aclarar los términos, dado que éstos son utilizados en la especificación y en las reivindicaciones para describir la presente invención. Como se utiliza en la presente, la expresión "activación del complemento dependiente de la MASP-2" se refiere a la activación del complemento por la vía alternativa que se lleva a cabo a través de la activación de la MASP-2 dependiente de la lectina. Como se utiliza en la presente, la expresión "vía alternativa" se refiere a la activación del complemento que es iniciada, por ejemplo, por el cimosán de paredes celulares de hongos y levaduras, por el lipopolisacárido o LPS, por su acrónimo en inglés, de membranas externas gramnegativas y eritrocitos de conejo, asi como de muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, virus, bacterias, células de tumores de animales, parásitos y células dañadas, y que tradicionalmente se ha creído que se origina por la generación proteolítica espontánea del C3b del factor C3 del complemento. Como se utiliza en la presente, la expresión "vía de la lectina" se refiere a la activación del complemento que ocurre a través de la unión específica de las proteínas séricas y no séricas que se unen al carbohidrato, incluyendo la lectina de unión con la mañana o MBL y las ficolinas.

Como se utiliza en la presente, la expresión "vía clásica" se refiere a la activación del complemento que es iniciada por un anticuerpo que se une a una partícula extraña y necesita la unión de la molécula de reconocimiento Clq. Como se utiliza en la presente, la expresión "agente inhibidor de la MASP-2" se refiere a cualquier agente que se une a o que interactúa directamente con la MASP-2 y que de manera eficaz inhibe la activación del complemento dependiente de la MASP-2, entre los que se incluyen, anticuerpos anti-MASP-2 y los fragmentos de los mismos que se unen a la MASP-2, péptidos naturales y sintéticos, moléculas pequeñas, receptores de la MASP-2 solubles, inhibidores de expresión e inhibidores naturales aislados, y también incluyen a los péptidos que compiten con la MASP-2 por unirse a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina) en la vía de la lectina, pero no incluye a los anticuerpos que se unen a estas otras moléculas de reconocimiento. Los agentes inhibidores de la MASP-2 que son útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en más de 20%, por ejemplo, en más de 50% o en más de 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de la MASP-2 reduce la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en más de 90% (es decir, provoca que la activación del complemento por MASP- 2 sea únicamente del 10% o menor) . Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, derivados de cualquier mamífero que produzca anticuerpos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos y primates, incluido el ser humano) , que específicamente se unan a polipéptidos de MASP-2 o a porciones de los mismos. Los anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales y recombinantes ; anticuerpos multiespecí fieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) ; anticuerpos humanizados; anticuerpos de múrido; anticuerpos quiméricos o híbridos, de humano-ratón, de primate-ratón, de humano-primate; y anticuerpos anti-idiotipo, y puede ser cualquier molécula intacta o fragmento de la misma. Como se utiliza en la presente, la expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción derivada de o relacionada con un anticuerpo anti-MASP-2 de longitud completa, que por lo general incluye el la unión del antígeno o una región variable del mismo. Algunos ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpos incluyen a los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab)2, F(ab')2 y Fv, fragmentos scFv, anticuerpos divalentes o diacuerpos (diabodies) , anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecí fieos formados a partir de fragmentos de anticuerpo . Como se utiliza en la presente, un fragmento de anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" (donde "se" es "single chain") incluye los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Por lo general, el polipéptido Fv incluye además un conector de polipéptidos entre los dominios VH y VL, el cual permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión con el antigeno. Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo quimérico o híbrido" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones que determinan la complementariedad derivadas de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, de roedor), en tanto que el resto de la molécula de anticuerpo se deriva de un anticuerpo de humano. Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo híbrido que contiene una secuencia mínima que cumple con las regiones específicas que determinan la complementariedad derivadas de una inmunoglobulina no humana que se transplantó en un armazón de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son, normalmente, proteínas recombinantes en las que sólo las regiones que determinan la complementariedad del anticuerpo no son de origen humano. Como se utiliza en la presente, la expresión "lectina de unión a mañana" o MBL es equivalente a "proteína de unión a mañana" o MBP, por las siglas en inglés de ambas expresiones. Como se utiliza en la presente, la expresión "complejo de ataque a la membrana", o MAC, por sus siglas en inglés, se refiere a un complejo de los cinco componentes terminales (C5 a C9) del complemento, que se inserta en las membranas y las altera. También se le denomina C5b-9. Como se utiliza en la presente, el término "un sujeto o individuo" incluye a todos los mamíferos, entre los que se incluyen, pero sin limitarse a, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, borregos, chivos, vacas, conejos, cerdos y roedores. Como se utiliza en la presente, los residuos de aminoácidos se abrevian de la siguiente forma: alanina (Ala ; A) , asparagina (Asn; N) , ácido aspártico (Asp;D), arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido glutámico (Glu;E), glutamina (Gln; Q) , glicina (Gly; G) , histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), leucina (Leu; L) , lisina ( Lys ; K) , metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptófano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y) y valina (Val;V). En su sentido más amplio, los aminoácidos naturales pueden dividirse en grupos, con base en la característica química de la cadena lateral de los aminoácidos respectivos. Con la expresión aminoácido "hidrofóbico" se hace referencia a lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Con la expresión aminoácido "hidrofilico" se hace referencia a cualquiera de Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este agrupamiento de aminoácidos puede subclasificarse todavía más como se indica enseguida. Con la expresión aminoácido "hidrofílico sin carga" se hace referencia a alguno de Ser, Thr, Asn o Gln. Con la expresión aminoácido "ácido" se hace referencia a cualquiera de Glu o Asp. Con la expresión aminoácido "básico" se hace referencia a alguno de Lys, Arg o His. Como se utiliza en la presente, la expresión "sustitución conservadora de aminoácido" se ilustra mediante una sustitución entre los aminoácidos que están dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina y isoleucina; (2) fenilalanina , tirosina y triptófano; (3) serina y treonina; (4) aspartato y glutamato; (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. El término "oligonucleótido" , como se utiliza en la presente, se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN) o imitaciones de los mismos. Este término abarca también a aquellas oligonucleobases constituidas por nucleótidos, azúcares y enlaces internucleósidos (cadena principal) covalentes, así como oligonucleótidos que tienen modificaciones que no son naturales.

II. LA VÍA ALTERNATIVA: UNA NUEVA INTERPRETACIÓN Fueron Louis Pillemer y sus colegas quienes por primera vez describieron a principios de la década de 1950 la vía alternativa del complemento, con base en estudios en los que para activar al complemento se utilizó cimosán preparado a partir de paredes celulares de levadura (Pillemer, L. et al., J. Exp . Med. 103:1-13, 1956; Lepow, LH. , J. Immunol. 125:471-478, 1980). Desde entonces, se considera que el cimosán es el ejemplo canónico de un activador específico de la vía alternativa en el suero de humano y de roedor (Lachmann, PJ. , et al., Springer Semin. Immunopathol . 7: 143-162, 1984; Van Dijk, H., et al., J. Immunol. Methods 85:233-243, 1985; Pangburn, M. K., Methods in Enzymol. 162:639-653, 1988). Un análisis adecuado y muy utilizado para activar la vía alternativa es incubar suero con cimosán aplicado como recubrimiento en pozos de plástico y determinar la cantidad del C3b depositado o precipitado sobre la fase sólida en forma posterior a la incubación. Como se esperaba, hay un depósito importante de C3b sobre los pozos recubiertos con cimosán después de la incubación con suero normal de ratón (figura 7B) . No obstante, la incubación de suero proveniente de ratones homocigotos deficientes en MASP-2 en pozos recubiertos con cimosán produce una gran reducción en la precipitación de C3b cuando se le compara con la del suero normal. Por otra parte, el uso en este análisis del suero de ratones heterocigotos por la deficiencia del gen MASP-2 deriva en niveles de precipitación de C3b que están intermedios entre los que se obtienen con suero de ratones homocigotos deficientes en MASP-2 y con suero de ratones normales. También se obtienen resultados paralelos utilizando pozos recubiertos con mañana, otro polisacárido que se sabe activa la vía alternativa (figura 7A) . Debido a que los ratones normales y con deficiencia de MASP-2 comparten los mismos antecedentes genéticos, con la excepción del gen de la MASP-2, estos resultados inesperados demuestran que la MASP-2 desempeña una función esencial en la activación de la via alternativa. Estos resultados aportan indicios sólidos de que la via alternativa no es una via independiente y autónoma de la activación del complemento como se describió esencialmente en todos los libros de medicina de la actualidad y en la revisión de artículos recientes acerca del complemento. La opinión científica actual y muy sostenida es que la vía alternativa se activa en la superficie de ciertos objetivos particulados (mibrobios, cimosán, eritrocitos de conejo) mediante la amplificación de la activación espontánea y "de marcha lenta" del C3.

Sin embargo, la ausencia de una importante activación de la vía alternativa en el suero de ratones con desactivación de la MASP-2 con dos "activadores" de la vía alternativa bien conocidos hace improbable que la "teoría de la marcha lenta" describa un importante mecanismo fisiológico para la activación del complemento. Puesto que se sabe que la MASP-2 proteasa tiene una función específica y bien definida como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento por la lectina, estos resultados implican la activación de la vía de la lectina por medio de cimosán y mañana como un primer paso crítico para la posterior activación de la vía alternativa. El C4b es un producto de la activación generado por la vía de la lectina, pero no por la vía alternativa. De manera coherente con este concepto, la incubación del suero de ratones normales en pozos recubiertos con cimosán o mañana deriva en la precipitación de C4b sobre los pozos y esta precipitación de C4b se reduce en forma importante cuando los pozos recubiertos se incuban con suero de ratones deficientes en MASP-2 (figuras 6A, 6B y 6C) . La vía alternativa, además de su función ampliamente aceptada como vía independiente para la activación del complemento, también puede aportar un bucle de amplificación para la activación del complemento disparada inicialmente por las vías clásica y de la lectina (Liszewski, M. K. and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W. E. Paul, Raven Press, Ltd., New York; Schweinie, J. E . , et al., J. Clin. Invest. 84:1821-1829, 1989). En este mecanismo de amplificación mediada por la vía alternativa, la C3 convertasa (C4b2b) generada por la activación del complemento con cualquiera de las cascadas clásica o de la lectina escinde a C3 en C3a y C3b y, de esta manera, suministra el C3b que puede participar en la formación de C3bBb, la C3 convertasa de la vía alternativa. La probable explicación de la ausencia de la activación de la vía alternativa en el suero con desactivación de la ASP-2 es que la via de la lectina es necesaria para la activación inicial de complemento por cimosán, mañana y otros supuestos "activadores" de la via alternativa, en tanto que la via alternativa desempeña una función crucial para amplificar la activación del complemento. En otras palabras, la via alternativa es un bucle de amplificación de alimentación avanzada que para la activación depende de las vías del complemento clásica y de la lectina, en vez de una cascada lineal independiente. En vez de que la cascada del complemento sea activada por tres vias diferentes (la clásica, la alternativa y la de la lectina), como se pensó con anterioridad, nuestros resultados indican que es más preciso considerar que el complemento está constituido por dos sistemas principales que corresponden, en una primera aproximación, a las ramas innata (lectina) y adquirida (clásica) del sistema de defensa inmunitario por el complemento. Las lectinas ( BP, M-ficolina, H-ficolina y L-ficolina) son las moléculas de reconocimiento especifico que disparan al sistema del complemento innato y el sistema incluye la via de la lectina y el bucle de amplificación de la via alternativa asociado. Clq es la molécula de reconocimiento especifico que dispara al sistema de complemento adquirido y el sistema incluye la via clásica y el bucle de amplificación de la via alternativa asociado. Nos referiremos a estos dos sistemas principales de activación del complemento como el sistema de complemento dependiente de la lectina y el sistema de complemento dependiente del Clq, respectivamente. Además de su función esencial en el sistema inmunitario, el sistema de complemento contribuye a dañar tejidos en muchos padecimientos clínicos. De este modo, existe la necesidad apremiante de generar inhibidores del complemento que sean terapéuticamente eficaces para evitar estos efectos adversos. Con el reconocimiento de que el complemento está formado por dos principales sistemas de activación del complemento llega la comprensión de que sería muy deseable inhibir específicamente sólo aquel sistema de activación del complemento que provoca una patología particular sin "apagar" por completo las capacidades de defensa inmunitaria del complemento. Por ejemplo, en aquellos estados patológicos en los que la activación del complemento está mediada preponderantemente por el sistema de complemento dependiente de la lectina, seria ventajoso inhibir específicamente sólo este sistema. Lo anterior llevaría a dejar intacto el sistema de activación del complemento dependiente de la Clq para manejar el procesamiento del complejo inmunitario o inmunocomplej o y ayudar en la defensa del hospedero contra la infección. El componente proteínico preferido para enfocarse en el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir específicamente al sistema de complemento dependiente de la lectina es la MASP-2. De todos los componentes proteínicos del sistema de complemento dependiente de la lectina (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2-C9, factor B, factor D y properdina) , sólo la MASP-2 es, a la vez, única en el sistema de complemento dependiente de la lectina y necesaria para que el sistema funcione. Las lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina) son también componentes únicos en el sistema de complemento dependiente de la lectina. Sin embargo, la pérdida de cualquiera de los componentes de la lectina no inhibiría necesariamente la activación del sistema debido a la redundancia de la lectina. Sería necesario inhibir a las cuatro lectinas para garantizar la inhibición del sistema de activación del complemento dependiente de la lectina. Por otra parte, debido a que se sabe que también la MBL y las ficolinas tienen actividad opsonizante independiente del complemento, la inhibición de la función de la lectina daría como resultado la pérdida de este benéfico mecanismo de defensa del hospedero en contra de la infección. En contraste, esta actividad opsonizante de la lectina independiente del complemento se mantendría intacta si la MASP-2 fuera el objetivo de la inhibición. Un beneficio adicional de la MASP-2, como el objetivo terapéutico para inhibir al sistema de activación del complemento dependiente de la lectina es que la concentración en el plasma de la MASP-2 está entre la más baja de cualquiera de las proteínas del complemento (~500 ng/ml); por lo tanto, para lograr su inhibición completa podrían necesitarse concentraciones correspondientemente bajas de inhibidores de la MASP-2 de gran afinidad (Moller-Kristensen, M., et al., <J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. FUNCIÓN DE LA MASP-2 EN VARIAS ENFERMEDADES Y PADECIMIENTOS Y MÉTODOS TERAPÉUTICOS QUE UTILIZAN AGENTES INHIBIDORES DE LA MASP-2 LESIÓN POR REVASCULARIZACIÓN POR ISQUEMIA La lesión por revascularización por isquemia o I/R, por " Ischemia/Reperfusion" , se presenta cuando se reestablece al flujo sanguíneo después de un periodo prolongado de isquemia. Es una fuente común de morbilidad y mortalidad en una amplia gama de enfermedades. Los pacientes de cirugía quedan vulnerables después de la reparación de un aneurisma aórtico, de una revascularización cardiopulmonar o de una reanastomosis vascular relacionada, por ejemplo, con el transplante de órganos (por ejemplo, de corazón, pulmón, hígado y riñon) y la replantación de dedos/extremidades, ataque cerebrovascular, infarto del miocardio y reanimación hemodinámica posterior a procedimientos quirúrgicos y/o de choque. Los pacientes con enfermedades ateroscleróticas son proclives a los infartos del miocardio, los ataques cerebrovasculares y la isquemia intestinal y de las extremidades inferiores inducida por émbolos. Los pacientes con traumatismos padecen, con frecuencia, de isquemia en las extremidades Además, cualquier causa de una pérdida masiva de sangre provoca una reacción de I/R en todo el cuerpo. La fisiopatología de una lesión por I/R es compleja y tiene al menos dos factores principales que contribuyen al proceso: la activación del complemento y la estimulación de neutrófilos con la concomitante lesión mediada por el radical oxígeno. En la lesión por I/R, la activación del complemento fue descrita por primera vez durante un infarto de miocardio hace más de 30 años y ha desembocado en numerosas investigaciones relacionadas con la contribución del sistema de complemento a la lesión del tejido por I/R (Hill, J. H., et al., J. Exp. Med. 133:885-900, 1971). La acumulación de evidencia apunta ahora al complemento como un mediador importante en la lesión por I/R. La inhibición del complemento ha sido exitosa en la limitación de la lesión en varios modelos animales de I/R. En los primeros estudios, se logró el agotamiento del C3 después de la infusión del factor veneno de cobra, que se informó fue benéfico durante la I/R en riñon y corazón (Maroko, P. R. , et al., 1978, J. Clin Invest. 61:661-670, 1978; Stein, S. H., et al., Miner Electrolyte Metab. 11:256-61, 1985). Sin embargo, la forma soluble del receptor 1 del complemento (sCRl) fue el primer inhibidor especifico del complemento en la prevención de la lesión por I/R del miocardio (Weisman, H. F., et al., Science 249:146-51, 1990). El tratamiento con sCRl durante la I/R del miocardio atenúa el infarto asociado con la reducción en el depósito o precipitación de los complejos C5b-9 a lo largo del endotelio coronario y la reducción de la infiltración de leucocitos después de la revasculari zación . En una I/R experimental de miocardio, el inhibidor de la Cl esterasa (Cl INH) administrado antes de la revascularización evita la precipitación de Clq y reduce de manera significativa el área necrótica del músculo cardiaco (Buerke, M., et al., 1995, Circulation 91:393-402, 1995). Los animales con deficiencia genética de C3 tienen una menor necrosis tisular local después de la isquemia músculo esquelética o intestinal (Weiser, M. R., et al., J. Exp. ed. 183:2343-48, 1996). El complejo de ataque a la membrana es el vehículo final de la lesión dirigida por el complemento y los estudios en animales con deficiencia en C5 han mostrado una menor lesión local y remota en modelos de lesión por I/R (Austen, W. G. Jr . , et al., Surgery 126:343-48, 1999). Se ha demostrado que un inhibidor de la activación del complemento, el Crry (gen Y relacionado con el receptor del complemento) es eficaz contra la lesión cuando se suministra tanto antes como 'después del inicio de la revascularización intestinal de múrido (Rehrig, S., et al., J. Immunol. 167:5921-27, 2001). En un modelo de isquemia músculo esquelético, el uso del receptor 1 soluble del complemento, o sCRl, también redujo la lesión muscular cuando se suministró después del inicio de la revascularización Kyriakides, C, et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281:C244-30, 2001). En un modelo porcino de I/R de miocardio, los animales tratados con anticuerpos monoclonales o MoAb, por su acrónimo en inglés, para la anafilatoxina C5a antes de la revascularización mostró que atenuó el infarto (Amsterdam, E. A., et al., Am. J.

Physiol. Heart Circ. Physiol. 268:H448-57, 1995). Las ratas tratadas con el oAb de C5 presentaron una atenuación en la magnitud del infarto, en la infiltración de neutrófilos y en la apoptosis del miocardio (Vakeva, A., et al., Circulation 97:2259-67, 1998). Estos resultados experimentales resaltan la importancia de la activación del complemento en la patogenia de la lesión por I/R. No está claro cuál es la vía del complemento (la clasica, la de la lectina o la alternativa) que está preponderantemente involucrada en la activación del complemento en la lesión por I/R. Weiser et al I demostraron la importante función de las vías de la lectina y/o la clásica durante la I/R ósea al mostrar que los ratones con desactivación del C3 o el C4 estuvieron protegidos contra la lesión por I/R, esto con base en una importante reducción de la permeabilidad vascular Weiser, M. R., et al., J. Exp. Med. 183:2343-48, 1996) En contraste, los experimentos de I/R renal en ratones con desactivación de C4 no demuestran una protección tisular importante, en tanto que los ratones con desactivación de C3, de C5 y de C6 estuvieron protegidos contra la lesión, lo que sugiere que la activación del complemento durante la lesión por I/R renal ocurre a través de la vía alternativa (Zhou, W., et al., J. Clin. Invest. 105:1363-71, 2000) . Al usar ratones con deficiencia del factor D, Stahl et al. presentó recientemente pruebas de la importante función de la vía alternativa en la I/R intestinal en ratones (Stahl, G., et al., Mi. J. Pathol . 162:449-55, 2003). En contraste, Williams et al. sugirió una función predominante de la vía clásica en el inicio de la lesión por I/R en el intestino de ratones al mostrar una menor tinción por C3 del órgano y la protección contra la lesión en ratones con deficiencia de C4 e IgM (Ragl-/-) (Williams, J. P., et al., J. Appl. Physiol. 86:938-42, 1999) . El tratamiento de ratas, en un modelo de I/R de miocardio, con anticuerpos monoclonales contra la lectina de unión a mañana o MBL derivó en una menor lesión por revascularización posisquémica (Jordán, J. E., et al., Circulation 104:1413-18, 2001) . Los anticuerpos para la MBL también redujeron la precipitación de complemento en las células endoteliales in vitro después de la tensión oxidante, lo que señala la función de la vía de la lectina en la lesión por I/R de miocardio' (Collard, C. D., et al., Am . J. Pathol. 156:1549-56, 2000). También existe evidencia de que la lesión por I/R en algunos órganos puede estar mediada por una categoría específica de IgM, denominados anticuerpos naturales, y por la activación de la vía clásica (Fleming, S. D., et al., J. Immunol . 169:2126-33, 2002; Reid, R. R., et al., J. Immunol. 169: 5433-40, 2002) .

Varios inhibidores de la activación del complemento han sido desarrollados como agentes terapéuticos potenciales para evitar la morbilidad y mortalidad derivadas de las complicaciones por la I/R de miocardio. Dos de estos inhibidores, el sCRl (TP10) y el scFv anti-C5 humanizado ( Pexelizumab) , han completado la fase II de las pruebas clínicas. El Pexelizumab ha concluido además la fase III de las pruebas clínicas. Aunque el TP10 fue bien tolerado y benéfico para los pacientes en las pruebas tempranas de fase I/II, los resultados de una prueba de fase II que termina en febrero de 2002 no logró cumplir su punto final primario. Sin embargo, el análisis por subgrupos de los datos provenientes de pacientes masculinos en una población de alto riesgo que se somete a procedimientos a corazón abierto demostró una importante reducción de la mortalidad y la magnitud del infarto. La administración de un scFv anti-C5 humanizado redujo la mortalidad general de pacientes asociada al infarto del miocardio en las pruebas de fase II COMA y COMPLY, pero no lograron cumplir con su punto final primario (Mahaffey, . ., et al . , Circulation 108:1176-83, 2003). En fechas recientes se difundieron resultados de una prueba clínica con scFv anti-C5 de fase III ( PRIMO-CABG) para el mejoramiento de desenlaces clínicos quirúrgicamente inducidos después de la revascularización de la arteria coronaria. Aunque no se alcanzó el punto final primario de este estudio, el mismo demostró una reducción general en la morbilidad y mortalidad posoperativa de pacientes. El Dr. Walsh y sus colegas han demostrado que los ratones que carecen de MBL y, por tanto, desprovistos de la activación por la via de la lectina dependiente de la MBL, pero donde la via clásica del complemento está totalmente activa, están protegidos contra la lesión por revascularización cardiaca con la resultante conservación de la función cardiaca (Walsh et al., J. Immunol. 775:541-46, 2005) . En forma significativa, los ratones que carecen de Clq, el componente de reconocimiento de la via clásica del complemento, pero que tienen intacta la via MBL del complemento, no están protegidos contra la lesión. Estos resultados indican que la via de la lectina tiene una función principal en la patogenia de la lesión isquémica por revascularización del miocardio. Se sabe que la activación del complemento desempeña una función importante en la lesión tisular asociada a la isquemia-revascularización (I/R) gastrointestinal. En un estudio reciente de Hart y colegas en el que utilizó un modelo de múrido de GI/R, reportó que ratones con deficiencia genética de MBL están protegidos contra la lesión intestinal después de la I/R gastrointestinal (Hart et al., J. Immunol. 774:6373-80, 2005) . Después de la I/R gastrointestinal, la adición de BL recombinante en ratones con deficiencia de MBL aumentó significativamente la lesión en comparación con ratones con deficiencia de MBL que no fueron tratados. En contraste, los ratones con carencia genética de Clq, el componente de reconocimiento de la vía clásica, no están protegidos contra la lesión tisular después de la I/R gastrointestinal . La I/R de riñon es una de las causas importantes de la insuficiencia renal aguda. Parece que el sistema de complemento está esencialmente involucrado en la lesión por I/R renal. En un estudio reciente, de Vries y colegas informan que la vía de la lectina es activada en el transcurso de una lesión por I/R renal tanto experimental como clínica (de Vries et al., Am. J. Path. 7(55:1677-88, 2004) . Por otra parte, la vía de la lectina precede y se localiza conjuntamente con la precipitación del C3, C6 y C9 del complemento en el transcurso de la I/R renal. Estos resultados indican que la vía de la lectina de la activación del complemento está implicada en la lesión por I/R renal. Un aspecto de la invención es así dirigido al tratamiento de las lesiones por revascularización por isquemia al tratar a un sujeto sometido a revascularización isquémica con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al individuo por las vías intraarterial , intravenosa, intracraneana, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral y, potencialmente, en forma oral en caso de inhibidores no peptidérgicos , donde, lo más adecuado es la administración intraarterial o intravenosa. La administración de las composiciones inhibidoras de la MASP-2 de la presente invención comienza, de la manera más adecuada, inmediatamente después o tan pronto como sea posible después de un evento de revascularización por isquemia. En aquellos casos donde la revascularización ocurra en un entorno controlado (por ejemplo, después de una reparación de aneurisma aórtico, de un transplante de órgano o de la recolocación de dedos o extremidades cercenadas o traumatizadas), el agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse antes de y/o durante y/o después de la revascularización. La administración puede repetirse periódicamente según lo determine el médico para un óptimo efecto terapéutico.

ATEROSCLEROSIS Hay evidencia considerable de que la activación del complemento está implicada en la aterogénesis en humanos. Varios estudios han mostrado de manera convincente que, aunque no ocurre una importante activación del complemento en las arterias normales, el complemento se activa ampliamente en lesiones ateroscleróticas y es especialmente intensa en placas vulnerables y quebradas. En los ateromas humanos se encuentran, con frecuencia, componentes de la vía del complemento terminal (Niculescu, F., et al . , Mol. Immunol. 36:949-55.10-12, 1999; Rus, H. G., et al., Immunol. Lett . 20:305-310, 1989; Torzewski, M . , et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:369-378, 1998). También se ha demostrado la precipitación de C3 y C4 en las lesiones arteriales (Hansson, G. K., et al., Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. (A) 92:429-35, 1984). Se encontró que el grado de precipitación del C5b-9 se correlaciona con la gravedad de la lesión (Vlaicu, R., et al., ñtherosclerosis 57:163-77, 1985). La precipitación del iC3b del complemento, pero no del C5b-9, fue especialmente intensa en placas rajadas y vulnerables, lo que sugiere que la activación del complemento puede ser un factor en síndromes coronarios agudos (Taskinen S., et al., Biochem. J. 367:403-12, 2002). En ateromas de laboratorio en conejos, se halló que la activación del complemento precede al desarrollo de lesiones (Seifer, P. S., et al., Lab Invest. 60:747-54, 1989). En las lesiones ateroscleróticas, el complemento es activado' por las vías clásica y alternativa, pero aún hay poca evidencia de la activación del complemento por la vía de la lectina. Varios componentes de la pared arterial pueden disparar la activación del complemento. La vía clásica del complemento puede ser activada por la proteina reactiva con C o CRP, por sus siglas en inglés, unida a LDL enzimáticamente degradado (Bhakdi, S., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:2348-54, 1999). De manera congruente con esta visión está el hallazgo de que las proteínas terminales del complemento se colocalizan con la CRP en la capa íntima de lesiones humanas tempranas (Torzewski, J., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1386-92, 1998). Del mismo modo, la inmunoglobulina M o los anticuerpos IgG específicos para LDL oxidadas dentro de lesiones pueden activar la vía clásica ( itztum, J. L., Lancet 344:793-95, 1994). Los lipidos aislados de lesiones ateroscleróticas tienen un elevado contenido de colesterol no esterificado y pueden activar la vía alternativa (Seifert P. S., et al., J. Exp. Med. 172:547-57, 1990). La Chlamydia pneumoniae, una bacteria gramnegativa frecuentemente asociada a lesiones ateroscleróticas, también pueden activar la vía alternativa del complemento (Campbell L. A., et al., J. Infect. Dis. 172:585-8, 1995). Otros potenciales activadores del complemento presentes en lesiones ateroscleróticas incluyen cristales de colesterol y residuos celulares, mismos que pueden activar la vía alternativa (Seifert, P. S., et al., Mol. Immunol . 2 : 1303-08, 1987) . Se sabe que los subproductos de la activación del complemento tienen muchas propiedades biológicas que podrían influir en el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas . La activación local del complemento puede inducir la lisis celular y generar al menos algunos de los residuos celulares hallados en el centro necrótico de lesiones avanzadas (Niculescu, F. et al., Mol. Immunol. 36:949-55.10-12, 1999). La activación sublitica del complemento podría ser un factor importante que contribuye a la proliferación celular del músculo liso y a la infiltración de monocitos en la capa íntima arterial durante la aterogénesis (Torzewski J. , et al., Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 18:673-77, 1996). La activación persistente del complemento puede ser perjudicial debido a que puede disparar y mantener la inflamación. Además de la infiltración de los componentes del complemento del plasma sanguíneo, las células arteriales expresan al ARN mensajero para las proteínas del complemento y la expresión de varios componentes del complemento aumenta en las lesiones ateroscleróticas (Yasojima, K., et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21: 1214-19, 2001) . Se ha reportado un número limitado de estudios sobre la influencia de las deficiencias de proteína del complemento en la aterogénesis. Los resultados en modelos animales de laboratorio han sido contradictorios. En ratas, la formación de lesiones de tipo aterosclerótico inducidas por dosis tóxicas de vitamina D se redujo en animales cuyo complemento está agotado (Geertinger P., et al., Acta. Pathol. Microbiol. Scand. (A) 78:284-88, 1970). Por otra parte, en conejos alimentados con colesterol, la inhibición del complemento ya sea por deficiencia genética de C6 (Geertinger, P., et al., Artery 1:177-84, 1977; Schmiedt, W., et al., Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol.' 18:1790-1795, 1998) o por el agente anticomplemento K-76 COONa (Saito, E . , et al., J. Drug Dev. 3:147-54, 1990) suprimió el desarrollo de la aterosclerosis sin afectar los niveles de colesterol sérico. En contraste, un estudio reciente informó que la deficiencia de C5 no reduce el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones con deficiencia de apolipoproteina E (ApoE) (Patel, S., et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 286:164-70, 2001). Sin embargo, en otro estudio, se evaluó el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones con deficiencia de LDLR (ldlr-) con o sin deficiencia de C3 (Buono, C, et al., Circulation 105:3025-31, 2002). Encontraron que la maduración de ateromas en lesiones de tipo aterosclerótico depende, en parte, de la presencia de un sistema de complemento intacto. Un aspecto de la invención se dirige asi al tratamiento o prevención de la aterosclerosis al tratar a un sujeto que padece o es proclive a la aterosclerosis con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un ' vehículo farmacéutico. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al paciente por las vías intraarterial , intravenosa, intratecal, intracraneana, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral y, potencialmente, en forma oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . La administración de la composición inhibidora de la MASP-2 puede comenzar después de diagnosticarle aterosclerosis a un sujeto o en forma profiláctica a un sujeto cuyo riesgo de desarrollar este padecimiento sea muy grande. La administración puede repetirse periódicamente según lo determine el médico para un óptimo efecto terapéutico.

OTROS PADECIMIENTOS Y ENFERMEDADES VASCULARES El endotelio está muy expuesto al sistema inmunitario y es particularmente vulnerable a las proteínas del complemento que están presentes en el plasma. Se ha demostrado que la lesión vascular mediada por el complemento contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades del sistema cardiovascular, entre las que se incluye a la aterosclerosis (Seifert, P. S., et al., Atherosclerosis 73:91-104, 1988), la lesión por isquemia-revascularización (Weisman, H. F., Science 249:146-51, 1990) e infarto de miocardio (Tada, T., et al., Virchows Arch 430:327-332, 1997). Las pruebas sugieren que la activación del complemento puede extenderse a otras enfermedades vasculares. Por ejemplo, hay evidencia de que la activación del complemento contribuye a la patogenia de muchas formas de vasculitis, entre las que se incluyen: nefritis púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoide (también llamada artritis reumatoide maligna) , vasculitis inmunocomplej a y enfermedad de Takayasu. La nefritis púrpura de Henoch-Schonlein es una forma de vasculitis generalizada de los vasos pequeños con patogenia inmunitaria, en la cual, se reconoce que la activación del complemento por la via de la lectina, que deriva en daños endoteliales inducidos por C5b-9, es un mecanismo importante (Kawana, S., et al., Arch. Dermatol . Res. 282:183-7, 1990; Endo, M . , et al., Am J. Kidney Dis. 35:401-7, 2000). El lupus eritematoso sistémico o SLE, por sus siglas en inglés, es un ejemplo de enfermedad autoinmunitaria generalizada o sistémica que afecta a múltiples órganos, entre los que se incluye a la piel, los ríñones, las articulaciones, las superficies de la serosa y el sistema nervioso central, y está frecuentemente asociada a la vasculitis grave. Los anticuerpos antiendoteliales IgG y los complejos de la IgG capaces de unirse a células endoteliales están presentes en el suero de pacientes que tienen SLE activo, y en las paredes de los vasos sanguíneos de pacientes con vasculitis asociada a SLE se encontraron depósitos de complejos inmunes de IgG (Cines, D. B., et al., J. Clin. Invest. 73:611-25, 1984). La artritis reumatoide asociada a vasculitis, también llamada artritis reumatoide maligna (Tomooka, K., Fukuoka Igaku Zasshi 80:456-66, 1989), la vasculitis inmunocomplej a , la vasculitis asociada a la hepatitis A, la vasculitis leucocitoclástica y la arteritis, conocida como enfermedad de Takayasu, forman otro grupo pleomórfico de enfermedades humanas en el que la citotoxicidad dependiente del complemento contra los tipos de células endoteliales y de otros tipos tienen una función documentada (Tripathy, N. K., et al., J. Rheumatol. 28 : 805-8, 2001) . Las evidencias también sugieren que la activación del complemento realiza alguna función en la miocardiopatia dilatada. La miocardiopatia dilatada es un síndrome caracterizado por el crecimiento cardiaco y la disfunción sistólica del corazón. La información reciente sugiere que la inflamación continua del miocardio puede contribuir a la generación de enfermedades. Se sabe que el C5b-9, el complejo terminal del complemento que ataca a la membrana, tiene una correlación significativa con la precipitación de inmunoglobulina y la expresión en el miocardio de la TNF-alfa. En las biopsias del miocardio de 28 pacientes con miocardiopatia dilatada, se demostró la acumulación de C5b-9 en el miocardio, lo que sugiere que la activación crónica del complemento en el miocardio mediada por inmunoglobulina puede contribuir, parcialmente, al avance de la miocardipatia dilatada (Zwaka, T. P., et al., Am. J. Pathol. 161 ( 2 ) : 9-57 , 2002) . Un aspecto de la invención se dirige asi al tratamiento de una enfermedad vascular, entre los que se incluyen padecimientos cardiovasculares, enfermedades cerebrovasculares, enfermedades vasculares periféricas (por ejemplo, músculo esqueléticas), padecimientos renovasculares , y enfermedades vasculares mesentéricas/entéricas, por medio de la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Las enfermedades en las que se cree que la invención es idónea incluyen, aunque no se limitan a: vasculitis, que incluye nefritis púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoide (también llamada artritis reumatoide maligna) , vasculitis inmunocomplej a y enfermedad de Takayasu; miocardiopatía dilatada; angiopatía diabética; enfermedad de Kawasaki (arteritis); y émbolo de gas venoso o VGE, por sus siglas en inglés. También, dado que la activación del complemento ocurre como resultado de un trauma luminal y la respuesta inflamatoria ante un cuerpo extraño asociada a procedimientos de intervención cardiovascular, se cree que las composiciones inhibidoras de la MASP-2 de la presente invención también pueden utilizarse para inhibir la restenosis posterior a la colocación de una endoprótesis, la aterectomia rotacional y/o la angioplastia coronaria transluminal percutánea o PTCA, por sus siglas en inglés, ya sean solas o combinadas con otros agentes inhibidores de la restenosis, tales como se describen en la patente de EE . UU. Núm. 6,492,332 de Demopulos. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al paciente por las vias intraarterial , intravenosa, intramuscular, intratecal, intracraneana, subcutánea u otra vía de administración parenteral y, potencialmente, en forma oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . La administración puede repetirse periódicamente según lo determine el médico para un óptimo efecto terapéutico. Para inhibir la restenosis, la composición inhibidora de la MASP-2 puede administrarse antes y/o durante y/o después de la colocación de una endoprótesis o de la aterectomia o un procedimiento angioplástico . En forma alternativa, la composición inhibidora de la MASP-2 puede recubrir la endoprótesis o incorporarse en la misma.

TRASTORNOS GASTROINTESTINALES La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son trastornos inflamatorios crónicos del intestino que pertenecen a la enteropatia inflamatoria o IBD, por sus siglas en inglés. La IBD se caracteriza por una inflamación crónica recurrente que se presenta espontáneamente y es de origen desconocido. A pesar de toda la investigación realizada sobre la enfermedad tanto en humanos como en animales de laboratorio, falta aún dilucidar el mecanismo preciso de esta patología. No obstante, se cree que el sistema de complemento se activará en pacientes con IBD, también se cree que desempeña una función importante en la patogénesis de al enfermedad (Kolios, G., et al., Hepato-Gastroenterology 45:1601-9, 1998; Elmgreen, J. , Dan. Med. Bull. 33:222, 1986) . Se ha mostrado que el C3b y otros productos del complemento activado se encuentran en la cara luminal de células epiteliales superficiales, tanto como en los vasos sanguíneos de la capa muscular de la mucosa y submucosal en pacientes con IBD (Halstensen, T. S., et al., Immunol . Res. 10:485-92, 1991; Halstensen, T. S., et al., Gastroenterology 98:1264, 1990). Por otra parte, la infiltración celular polimorfonuclear, normalmente el resultado de la generación de C5a, se observa característicamente en la enteropatia inflamatoria (Kohl, J., Mol. Immunol. 38:175, 2001). También se ha informado que el inhibidor multifuncional K-76 del complemento produjo una mejora sintomática en la colitis ulcerosa en un breve estudio clínico (Kitano, A., et al., Dis. Colon Rectum 35:560, 1992), tanto como en un modelo de colitis inducida con carragenina en conejos (Kitano, A., et al., Clin. Exp. Immunol. 94:348-53, 1993). Se ha mostrado que un novedoso antagonista del receptor de C5a humano protege contra la patología de la enfermedad en un modelo de rata de la IBD (Woodruff, T. M . , et al., J. Immunol. 171:5514-20, 2003). En un modelo de IBD se usaron ratones que eran genéticamente deficientes en el factor acelerador de la descomposición o DAF, por sus siglas en inglés, una proteína reguladora del complemento en la membrana, para demostrar que la deficiencia del DAF deriva en un daño tisular marcadamente mayor y en un aumento en la producción de citocina proinflamatoria (Lin, F., et al., J. Immunol. 172:3836-41, 2004) . Por lo tanto, el control del complemento es importante en la regulación de la homeostasis intestinal y puede ser un mecanismo patógeno clave implicado en la generación de la IBD. La presente invención presenta así métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en sujetos que padecen trastornos inflamatorios gastrointestinales, entre los que se incluyen, pero que no se limitan a, pancreatitis, diverticulitis y trastornos intestinales, incluida la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y el síndrome del colon irritable, al administrarle a un paciente que padece de alguno de estos trastornos una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al paciente por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intracraneana u otra vía de administración parenteral y, potencialmente, en forma oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . La administración puede, en forma adecuada, repetirse periódicamente según lo determine el médico con la finalidad de controlar los síntomas del trastorno que sereá tratado.

ENFERMEDADES PULMONARES Al complemento se le ha implicado en la patogenia de muchos trastornos inflamatorios del pulmón, incluyendo: síndrome de insuficiencia respiratoria aguda o ARDS (Ware, L., et al., N. Engl . J. Med. 342:1334-49, 2000); lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión o TRALI (Seeger, W., et al., Blood 76:1438-44, 1990) ; lesión pulmonar aguda por isquemia/revascularización (Xiao, F . , et al., J. Appl . Physiol. 82:1459-65, 1997); enfermedad pulmonar obstructiva crónica o COPD (Marc, M. M . , et al., Ara. J.

Respir. Cell Mol. Biol . (publicación electrónica previa a su impresión), 23 de marzo de 2004); asma (Krug, N., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164:1841-43, 2001); granulomatosis de Wegener (Kalluri, R., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 8:1795-800, 1997); y enfermedad de la membrana basal antiglomerular o enfermedad de Goodpasture (Kondo, C, et al., Clin. Exp. Immunol . 124:323-9, 2001). En la actualidad está plenamente aceptado que una buena parte de la fisiopatología de la ARDS implica una cascada inflamatoria mal regulada que inicia como una respuesta normal ante una infección u otro evento incitador, aunque, finalmente genera una . importante autolesión hacia el hospedador (Stanley, T. P., Emerging Therapeutic Targets 2:1-16, 1998). Los pacientes que tienen ARDS presentan, en la gran mayoría, indicios de una amplia activación del complemento (aumento en los niveles plasmáticos de los componentes C3a y C5a del complemento) y la extensión de la activación del complemento ha sido correlacionada con el desarrollo y desenlace clínico de la ARDS (Hammerschmidt, D. F . , et al., Lancet 1:947-49, 1980; Solomkin, J. S., et al., J. Surgery 97:668-78, 1985). Información diversa tanto de laboratorio como clínica sugiere que la activación del complemento realiza una función en la fisiopatología de la ARDS. En modelos animales, la activación generalizada del complemento deriva en una lesión pulmonar aguda con una histopatología similar a la observada en el ARDS en humanos (Till, G. O., et al. , ' Am. J. Pathol. 129:44-53, 1987; Ward, P. A. , Am. J. Pathol. 149:1081-86, 1996). La inhibición de la cascada del complemento por el agotamiento general del mismo o por la inhibición especifica del C5a confiere protección en modelos animales de lesión pulmonar aguda ( ulligan, M. S., et al., J. Clin. Invest. 98:503-512, 1996). En modelos de rata, el sCRl tiene un efecto protector en la lesión pulmonar mediada por el complemento o por neutrófilos (Mulligan, M. S., Yeh, et al., J. Immunol. 148:1479-85, 1992). Además, prácticamente todos los componentes del complemento pueden ser producidos localmente en el pulmón por las células alveolares de tipo II, por macrófagos alveolares y por fibroblastos de pulmón Hetland, G., et al., Scand. J. Immunol. 24:603-8, 1986; Rothman, B. L, et al., J. Immunol. 145:592-98, 1990). De este modo, la cascada del complemento está bien ubicada para contribuir significativamente a la inflamación pulmonar y, en consecuencia, a la lesión pulmonar en la ARDS . El asma es, en esencia, una enfermedad inflamatoria. Las características principales del asma alérgico incluyen hiperreactividad de las vías aéreas ante una variedad de estímulos específicos y no específicos, una excesiva producción de mucosidad en las vías aéreas, la eosinofilia pulmonar y una elevada concentración de IgE sérica. Aunque el origen del asma es multifactorial , en general se acepta que surge como resultado de respuestas inmunológicas inadecuadas frente a antígenos ambientales comunes en indivuduos genéticamente susceptibles. Está bien documentado el hecho de que el sistema de complemento se activa en gran medida en el pulmón asmático humano (Humbles, A. A., et al., Nature 406:998-01, 2002; van de Graf, E. A., et al., J. Immunol . Methods 147:241-50, 1992). Además, datos recientes de modelos animales y humanos aportan evidencia de que la activación del complemento es un importante mecanismo que contribuye a la patogenia de la enfermedad (Karp, C. L., et al., Nat. Immunol. 1:221-26, 2000; Bautsch, W., et al., J. Immunol . 165:5401-5, 2000; Drouin, S. M . , et al., J. Immunol. 169:5926-33, 2002; Walters, D. M . , et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:413-18, 2002) . Una de las funciones de la vía de la lectina en el asma está sustentada en estudios que usan un modelo de múrido de asma fúngica crónica. Un grupo de ratones con deficiencia genética de lectina de unión a mañana desarrollaron una alterada hiperreactividad de las vías aéreas en comparación con animales normales en este modelo de asma (Hogaboam, C. M., et al., J. Leukoc. Biol. 75:805-14, 2004). En situación de asma, el complemento puede activarse a través de varias vías, entre las que se incluyen: (a) activación por la via clásica, como resultado de la formación del complejo alérgeno-anticuerpo; (b) activación de la via alternativa en superficies de alérgeno; (c) activación de la vía de la lectina por el acoplamiento de estructuras de carbohidratos en alérgenos, y (d) escisión de C3 y C5 por proteasas liberadas por las células inflamatorias. Aunque falta mucho por aprender sobre la compleja función que realiza el complemento en el asma, la identificación de las vías de activación del complemento implicadas en el desarrollo del asma alérgico puede aportar un foco para la generación de estrategias terapéuticas novedosas hacia esta cada vez más importante enfermedad. Varios estudios que usaron modelos animales han demostrado la critica función del C3 y su producto de escisión, el C3a, en el desarrollo del fenotipo alérgico. Drouin y sus colegas utilizaron ratones con deficiencia de C3 en un modelo de asma por ovoalbúmina (OVA) /Aspergillus fumigatus (Drouin et al., J. Immunol. 167:4141-45, 2001). Encontraron que, cuando se exponen al alérgeno, los ratones deficientes en C3 muestran una sorprendente reducción de la AHR y la eosinofilia pulmonar en comparación con ratones de control silvestres equiparables. De manera adicional, en estos ratones con deficiencia de C3 se había reducido significativamente el número de células productoras de IL-4 y atenuado las respuestas de IgE y IgGl específicas a antígeno. Taube y colaboradores obtuvieron resultados semejantes en el modelo OVA de asma al bloquear la activación del complemento en el nivel de C3 y C4, utilizando una forma recombinante soluble del receptor Crry del complemento de ratón (Taube et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 168:1333-41, 2003). Humbles y sus colegas suprimieron el C3aR en ratones para estudiar la función del C3a en la función del eosinófilo (Humbles et al., Nature 406:998-1001, 2000) . Utilizando el modelo OVA del asma, observaron una protección casi completa contra la generación de la AHR frente a la metacolina en aerosol. Drouin y sus colegas (2002) han utilizado ratones con deficiencia de C3aR en el modelo de asma por OVA/A. fumigatus y demostraron una atenuación en la respuesta alérgica, muy semejante a los animales deficientes en C3 con una ARH disminuida, incorporación de eosinófilos, producción de citocina TH2, y secreción mucosa en el pulmón, asi como una reducción en las respuestas de IgE e IgGl especificas de antigeno (Drouin et al., J. Immunol . 169:5926-33, 2002). Bautsch y sus colegas realizaron investigaciones utilizando una cepa de cobayos en los que, de manera natural, se había suprimido el C3aR (Bautsch et al., J. Immunol. 165:5401-05, 2000). Utilizando un modelo OVA de asma alérgico, observaron una importante protección contra la broncoconstriccion de las vías aéreas después de la exposición al antígeno. Varios estudios recientes usando modelos animales han demostrado la crítica función del C5 y su producto de escisión, el C5a, en el desarrollo del fenotipo alérgico. Abe y sus colegas han informado de evidencias que vinculan la activación del C5aR con la inflamación de las vías aéreas, la producción de citocinas y las reactividad de las vias aéreas (Abe et al., J. Immunol . 167:4651-60, 2001). En sus estudios, la inhibición de la activación del complemento con CR1 soluble, fután (un inhibidor de la activación del complemento) o el antagonista C5a hexapéptido sintético, bloqueó la respuesta inflamatoria y la reactividad de las vias aéreas a la metacolina. En estudios que usaron un anticuerpo monoclonal anti-C5 de bloqueo, Peng y sus colegas encontraron que la activación de C5 contribuyó sustancialmente tanto a la inflamación de las vias aéreas como a la AHR en el modelo OVA de asma (Peng et al., J. Clin. Invest. 115:1590-1600, 2005). También Baelder y sus colegas informaron que el bloqueo del C5aR redujo significativamente la AHR en el modelo A. fumigatus del asma (Baelder et al., J. Immunol. 774:783-89, 2005). Adicionalmente, el bloqueo tanto del C3aR como del C5aR redujo significativamente la inflamación de las vias aéreas como se demostró por medio del reducido número de neutrófilos y de neutrófilos en BAL. Aunque los estudios mencionados anteriormente resaltan la importancia de los factores C3 y C5 del complemento y sus productos de escisión en la patogenia del asma alérgica en el laboratorio, estos estudios no aportaron información sobre la contribución de cada una de las tres vías de activación del complemento, ya que C3 y C5 son comunes en estas tres vías de activación. Sin embargo, un estudio reciente de Hogaboam y sus colegas señala que la vía de la lectina puede tener un papel principal en la patogenia del asma (Hogaboam et al., J. Leukocytye Biol . 75:805-814, 2004). Estos estudios utilizaron ratones genéticamente deficientes en lectina-A de unión a mañana o MBL-A, una proteína que se une a carbohidrato y que funciona como el componente de reconocimiento para la activación de la vía de la lectina del complemento. En un modelo de asma fúngica crónica, ratones sensibilizados con A. fumigatus MBL-A(+/+) y BL-A(-/-) se analizaron a los días 4o. y 28o. después de la exposición i.t., a conidiosporas de A. fumigatus. La AHR en ratones MBL-A(-/-) sensibilizados se atenuó en forma significativa en esos dos tiempos después de la exposición a las conidiosporas en comparación con el grupo MBL-A (+/+) sensibilizado. Estos investigadores encontraron que los niveles de citocina TH2 en pulmón (IL-4, IL-5 y IL- 13) fueron significativamente menores en ratones MBL-A(-/-) sensibilizados con A. fumigatus en comparación con el grupo de tipo silvestre en el día 4 después de las conidiosporas. Sus resultados indican que la MBL-A y la vía de la lectina tienen un papel principal en el desarrollo y el mantenimiento de la AHR durante el asma fúngica crónica. Los resultados de un estudio clínico reciente -en el que la asociación entre un polimorfismo MBL específico y la evolución del asma aporta evidencia adicional de que la vía de la lectina puede tener una importante función patológica en esta enfermedad (Kaur et al., Clin. Experimental Immunol . 143:414-19, 2006). Las concentraciones en plasma de la MBL varían ampliamente entre personas diferentes, lo cual puede atribuirse, principalmente, a los polimorfismos genéticos en el interior del gen de la MBL. Encontraron que las personas que portan al menos una copia de un polimorfismo MBL específico que aumenta la expresión de MBL de dos a cuatro veces tienen un mayor riesgo, casi de cinco veces, de padecer asma bronquial. También se presentó una mayor gravedad de los marcadores de la enfermedad en pacientes con asma bronquial que son portadores de este polimorfismo de la MBL. Un aspecto de la invención presenta así un método para tratar trastornos pulmonares al administrar una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece de estos trastornos pulmonares, que incluyen, pero que no se limitan a, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesiones pulmonares agudas relacionadas con transfusión, lesiones pulmonares agudas por isquemia/revascularización, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad de la membrana basal antiglomerular (enfermedad de Goodpasture) , síndrome de aspiración de meconio, síndrome de la bronquilitis obliterans, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria por quemaduras, edema pulmonar no cardiogénico, abatimiento respiratorio relacionado con la transfusión, y enfisema. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al sujeto, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, nasal, por inhalación, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente, por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . La composición del agente inhibidor de la MASP-2 puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales, entre los que se incluyen: agentes antiinflamatorios, antihistamínicos , corticosteroides o antimicrobianos. La administración puede repetirse según lo determine el médico hasta que la enfermedad haya desaparecido.

CIRCULACIÓN EXTRACORPORAL Existen numerosos procedimientos médicos durante los cuales la sangre es desviada del sistema circulatorio del paciente (sistemas de circulación extracorporales o ECC, por sus siglas en inglés) . Estos procedimientos incluyen hemodiálisis , plasmaféresis, leucoféresis , oxigenación extracorporal en membrana o ECMO, la precipitación de LDL por oxigenación extracoporal en membrana inducida por heparina o HELP y anastomosis quirúrgica cardiopulmonar o CPB, las siglas de éstos últimos vienen de su nombre en inglés. Estos procedimientos exponen a la sangre o a los productos sanguíneos ante superficies extrañas que pueden alterar la función celular normal y la hemostasis. En los primeros estudios de su tipo, Craddock et al. identificaron que la activación del complemento es la causa probable de la granulocitopenia durante la hemodiálisis (Craddock, P. R., et al., N. Engl. J. Med. 296:769-74, 1977). Los resultados de numerosos estudios desde 1977 hasta la fecha indican que muchos de los efectos adversos que padecen los pacientes sometidos a hemodiálisis o a CPB son provocados por la activación del sistema de complemento (Chenoweth, D. E., Ann. N. Y. Acad. Sci . 516:306-313, 1987; Hugli, T. E., Complement 3:111-127, 1986; Cheung, A. K., J. Am. Soc. Nephrol. 1:150-161, 1990; Johnson, R. J. , Nephrol . Dial. Transplant 9:36-45 1994). Por ejemplo, se ha demostrado que la potencial activación del complemento es un criterio importante en la determinación de la biocompatibilidad de los aparatos de hemodiálisis con respecto a la recuperación de la función renal, la susceptibilidad a las infecciones, la disfunción pulmonar, la morbilidad y la tasa de sobrevivencia de los pacientes con insuficiencia renal (Hakim, R. M . , Kidney Int. 44:484-4946, 1993). Es una creencia muy extendida que la activación del complemento en las membranas de hemodiálisis se realiza a través de mecanismos de la vía alternativa, debido a la escasa generación de C4a (Kirklin, J. K. , et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86:845-57, 1983; Vallhonrat, H., et al., ASAIO J. 45:113-4, 1999), sin embargo, un estudio reciente sugiere que la vía clásica también puede estar implicada ( achtfogel, Y. T . , et al., Blood 73:468-471, 1989). No obstante, los factores que inician y controlan la activación del complemento en superficies artificiales, que incluyen a los polímeros biomédicos, aún no se conocen en forma debida. Por ejemplo, a la membrana Cuprophan, utilizada en la hemodiálisis, se le ha clasificado como un potente elemento activador del complemento. Si bien no se desea estar limitados por la teoría, los inventores tienen la hipótesis de que lo anterior quizá podría ser parcialmente explicado debido a su naturaleza polisacárida . El sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2, identificado en estos pacientes, proporciona un mecanismo con el cual la activación de la vía de la lectina dispara la activación de la vía alternativa. Los pacientes que son tratados con ECC durante la CPB padecen una reacción inflamatoria generalizada, que es provocada parcialmente por la exposición de la sangre a las superficies artificiales del circuito extracorporal, aunque también es provocada por factores independientes a la superficie, tales como el trauma quirúrgico y la lesión por isquemia-revascularización (Butler, J., et al., Ann. Thorac. Surg. 55:552-9, 1993; Edmunds, L. H., Ann . Thorac. Surg. 66 ( Suppl ) : S12-6, 1998; Asimakopoulos , G., Perfusión 14:269-77, 1999). La reacción inflamatoria disparada por la CPB puede derivar en complicaciones posquirúrgicas , denominadas en general, "síndrome postinfusión". Entre estos acontecimientos post-operatorios están los déficits cognitivos (Fitch, J., et al., Circulation 100 (25) : 2499-2506, 1999) , la insuficiencia respiratoria, los trastornos por sangrado, la disfunción renal y, en los casos más graves, la insuficiencia orgánica múltiple (Wan, S., et al., Chest 112:676-692, 1997) . La cirugía de revascularización coronaria con CPB conduce a una pronunciada activación del complemento, en contraste con la cirugía sin CPB, aunque con un grado comparable de traumatismo quirúrgico (E. Fosse, 1987) . Por lo tanto, la causa principal que se sospecha genera estos problemas relacionados con la CPB es la inadecuada activación del complemento durante el procedimiento de la revascularización (Chenoweth, K., et al., N. Engl . J. Med. 304:497-503, 1981; P. Haslam, et al., Anaesthesia 25:22- 26, 1980; J. K. Kirklin, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86:845-857, 1983; Moore, F. D . , et al . , Ann . Surg. 208:95-103, 1988; J. Steinberg, et al . , J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106:1901-1918, 1993) . En los circuitos de la CPB, la vía alternativa del complemento tiene un papel preponderante en la activación del complemento, que se produce por la interacción de la sangre con las superficies artificiales de los circuitos de CPB (Kirklin, J. K., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 86:845-57, 1983; Kirklin, J. K., et al., Ann. Thorac. Surg. 41:193-199, 1986; Vallhonrat H., et al., ASAIO J. 45:113-4, 1999) . No obstante, también hay indicios de que durante la CPB se activa la vía clásica del complemento (Wachtfogel, Y. T., et al., Blood 73:468-471, 1989). Las principales sustancias inflamatorias se generan después de la activación del sistema de complemento y éstas incluyen anafilatoxinas C3a y C5a, la opsonina C3b, y el complejo de ataque a la membrana C5b-9. La C3a y C5a son potentes estimuladores de neutrófilos, monocitos y plaquetas (Haeffner-Cavaillon, N., et al., J. Immunol. ,139:794-9, 1987; Fletcher, . P., et al., Am. J. Physiol. 265 : H1750-61, 1993; Rinder, C. S., et al., J. Clin. Invest. 96:1564-72, 1995; Rinder, C. S., et al., Circulation 100:553-8, 1999) . La activación de estas células deriva en la liberación de citocinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-8, TNF alfa), radicales libres oxidantes y proteasas (Schindler, R., et al., Blood 76:1631-8, 1990; Cruickshank, A. M . , et al., Clin Sci. (Lond) 79:161-5, 1990; Kawamura, T., et al., Can. J. Anaesth. 40:1016-21, 1993; Steinberg, J. B., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106:1008-1, 1993; Finn, A., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 105:234-41, 1993; Ashraf, S. S., et al., J. Cardiothorac . Vasc. Anesth. 11:718-22, 1997) . Se ha demostrado que el C5a sobrerregula las moléculas de adhesión CDllb y CD18 de Mac-1 en células polimorfonucleares o PMN y que induce la desgranulación de las PMN para liberar enzimas proinflamatorias . Rinder, C, et al., Cardiovasc Pharmacol. 27(Suppl. 1):S6-12, 1996; Evangelista, V., et al., Blood 93:876-85, 1999; Kinkade, J. M., Jr . , et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 114:296-303, 1983; Lamb, N. J. , et al., Crit. Care Med. 27:1738-44, 1999; Fujie, K. , et al., Eur . J. Pharmacol. 314:111-25, 1999. El C5b-9 induce la expresión de la molécula de adhesión P-selectina (CD62P) en las plaquetas (Rinder, C. S., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:460-6, 1999), en tanto que C5a y C5b-9 inducen la expresión superficial de la P-selectina en células endoteliales (Foreman, K. E . , et al., J. Clin. Invest. 94:1147-55, 1994). Estas moléculas de adhesión están implicadas en la interacción entre leucocitos, plaquetas y células endoteliales. La expresión de las moléculas de adhesión en las células endoteliales es la responsable del secuestro de los leucocitos activados, lo cual media entonces la inflamación tisular y la lesión (Evangelista, V., Blood 1999; Foreman, K. E . , J. Clin. Invest. 1994 ; Lentsch, A. B., et al., J. Pathol . 190:343-8, 2000). Son las acciones de estos productos de la activación del complemento sobre los neutrófilos, monocitos, plaquetas y otras células del sistema circulatorio, las que probablemente deriven en diversos problemas que surgen después de la CPB. Se están estudiando varios inhibidores del complemento para posibles aplicaciones en la CPB. Éstos incluyen un receptor 1 del complemento soluble y recombinante (sCRl) (Chai, P. J., et al., Circulation 101:541-6, 2000), un anticuerpo anti-C5 de una sola cadena humanizado (h5Gl.l-scFv o Pexelizumab) (Fitch, J. C. K., et al., Circulation 100:3499-506, 1999), un híbrido de fusión recombinante (CAB-2) del cofactor de membrana humana y del factor acelerador de la declinación humana (Rinder, C. S. , et al., Circulation 100:553-8, 1999), un péptido cíclico de unión a C3 de 13 residuos (Compstatin) (Nilsson, B., et al., Blood 92:1661-7, 1998) y un MoAb anti-factor D (Fung, M., et al., J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 122:113-22, 2001). El sCRl y el CAB-2 inhiben las vías clásica y alternativa del complemento en los pasos de la activación de C3 y C5. El Compstatin inhibe las dos vías del complemento en el paso de la activación C3, en tanto que el h5Gl.l-scFv sólo lo hace en el paso de la activación del C5. El MoAb antifactor D inhibe la vía alternativa en los pasos de la activación de C3 y C5. Sin embargo, ninguno de estos inhibidores del complemento inhibiría específicamente al sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2 identificado en esta patente . Se han reportado resultados de un gran estudio clínico prospectivo de fase 3 que investiga la eficacia y seguridad del anticuerpo anti-C5 de una sola cadena humanizado ( h5Gl .1-scFv, pexelizu mab) para reducir la MI perioperatoria y la mortalidad en la cirugía del injerto de revascularización de la arteria coronaria o CABG, por sus siglas en inglés, (Verrier, E. D., et al., JAMA 291:2319-27, 2004). En comparación con el placebo, el pexelizu mab no estuvo asociado con una importante reducción en el riesgo del punto final compuesto de muerte o MI en 2,746 pacientes que se habían sometido a la cirugía de CABG. Sin embargo, 30 días después del procedimiento hubo entre los 3,099 pacientes sometidos a la cirugía de CABG con o sin cirugía valvular una reducción estadísticamente significativa. Dado que el pexelizu mab inhibe en el paso de la activación del C5, inhibe la generación del C5a y del sC5b-9, pero no tiene efecto sobre la generación de las otras dos potentes sustancias inflamatorias del complemento, la C3a y la C3b opsonizante, de las que también se sabe que contribuyen a la reacción inflamatoria disparada por la CPB. Un aspecto de la invención está asi dirigido a la prevención o el tratamiento de la reacción inflamatoria activada por la exposición extracorporal al tratar con una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico, a un sujeto que se someterá al procedimiento de circulación extracorporal, entre estos pacientes se incluyen a los que se someten a hemodiálisis, plasmaféresis , leucoféresis , oxigenación en membrana extracorporal o ECMO, precipitación de LDL por oxigenación en membrana extracorporal inducida por heparina o HELP y anastomosis quirúrgica cardiopulmonar o CPB, las siglas de éstas últimas vienen de su nombre en inglés. Se cree que el tratamiento con el agente inhibidor de la MASP-2 de conformidad con los métodos de la presente invención es útil para reducir o prevenir la disfunción cognitiva que en ocasiones se deriva de procedimientos de CPB. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrársele al sujeto antes y/o durante y/o después del procedimiento, por alguna de las vías intraarterial, intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía parenteral. En forma alternativa, el agente inhibidor de la MASP-2 puede ser introducido en el torrente sanguíneo del paciente durante la circulación extracorporal, como por ejemplo, inyectando el agente inhibidor de la MASP-2 a través de la tubería flexible o de una membrana o más allá de los cuales circula la sangre o poniendo en contacto la sangre con una superficie que ha sido recubierta con el agente inhibidor de la MASP-2, tal como una pared interna de la tubería, de la membrana u otra superficie, por ejemplo, un dispositivo para la CPB.

ARTRITIS INFLAMATORIA Y NO INFLAMATORIA Y OTRAS ENFERMEDADES OSTEOMUSCULARES La activación del sistema de complemento ha estado implicado en la patogenia de una gran variedad de enfermedades reumatológicas , entre los que se incluyen: la artritis reumatoide (Linton, S. M., et al., Molec . Immunol. 36:905-14, 1999), la artritis reumatoide juvenil (Mollnes, T. E . , et al., Art ritis Rheum. 29:1359-64, 1986), la osteoartritis (Kemp, P. A., et al., J. Clin. Lab. Immunol. 37:147-62, 1992), el lupus eritematoso sistémico o SLE (Molina, H., Current Opinión in Rheumatol. 14:492-497, 2002), el síndrome de Behcet (Rumfeld, W. R. , et al., Br. J. Rheumatol. 25:266-70, 1986) y el síndrome de Sjogren (Sanders, M. E., et al., J. Immunol. 138:2095-9, 1987) . Existen pruebas convincentes de que la activación del complemento disparada por inmunocomplej os es un mecanismo patológico importante que contribuye al daño tisular en la artritis reumatoide o RA, por sus siglas en inglés. Hay muchas publicaciones que documentan que la concentración de los productos de la activación del complemento son elevadas en el plasma de pacientes de RA (Morgan, B. P., et al., Clin. Exp . Immunol, 73:473-478, 1988; Auda, G., et al., Rheumatol . Int. 10:185-189, 1990; Rumfeld, W. R. , et al., Br . J. Rheumatol. 25:266-270, 1986) . Los productos de la activación del complemento, tales como C3a, C5a y sC5b-9, también han sido encontrados en articulaciones reumáticas inflamadas y se han establecido correlaciones positivas entre el grado de activación del complemento y la gravedad de la RA (Makinde, V. A., et al., Ann . Rheum. Dis . 48:302-306, 1989; Brodeur, J. P., et al., Arthritis Rheumatism 34:1531-1537, 1991). Tanto en la artritis reumatoide juvenil como en la de adultos, los elevados niveles de suero y liquido sinovial del producto de activación del complemento Bb de la via alternativa, comparados con el C4d (un marcador de la activación por la via clásica) , indican que la activación del complemento está mediada preponderantemente por la via alternativa ( El-Ghobarey, A. F. et al., J. Rheumatology 7:453-460, 1980; Agarwal, A., et al., Rheumatology 39:189-192, 2000). Los productos de la activación del complemento pueden dañar, directamente, al tejido (por medio del C5b-9) o mediar, indirectamente, la inflamación a través de incorporación de células inflamatorias por las anafilotoxinas C3a y C5a. Los modelos animales de la artritis de laboratorio han sido ampliamente utilizados para investigar el papel del complemento en la patogenia de la RA. El agotamiento del complemento debido al factor veneno de cobra en modelos animales de RA evita el inicio de la artritis (Morgan, K., et al., Arthritis Rheumat. 24:1356-1362, 1981; Van Lent, P. L., et al., Am. J. Pathol. 140:1451-1461, 1992). La inyección intraarticular de la forma soluble del receptor 1 del complemento o sCRl, un inhibidor del complemento, suprimió la inflamación en un modelo de ratas de la RA (Goodfellow, R. M., et al., Clin. Exp. Immunol. 110:45-52, 1997) . Por otra parte, el sCRl inhibe la generación y el avance de la artritis inducida por colágeno en ratas (Goodfellow, R. M., et al., Clin Exp. Immunol. 119:210-216, 2000). El CR1 soluble inhibe las vías clásica y alternativa del complemento en los pasos de la activación del C3 y del C5 tanto en la vía alternativa como en la vía clásica, inhibiendo, de esta manera, la generación de C3a, C5a y sC5b-9. A finales de la década de 1970 se reconoció que la inmunización de roedores con el colágeno heterólogo tipo II (o CII, el principal componente colágeno del cartílago de las articulaciones humanas) condujo a la creación de una artritis autoinmunitaria (artritis inducida con colágeno o CIA, por sus siglas en inglés) con importantes similitudes con la RA humana (Courtenay, J. S., et al., Nature 283:666-68 (1980), Banda et al., J. of Immunol. 171:2109-2115 (2003)). La respuesta autoinmunitaria en animales susceptibles implica una compleja combinación de factores que incluyen moléculas especificas del complejo principal de histocompatibilidad o MHC, por sus siglas en inglés, citocinas y respuestas a las células B y T especificas de CII (revisada por yers, L. K., et al., Life Sciences 61:1861-78, 1997) . La observación de que casi el 40% de las cepas de ratón endogámico tienen una total deficiencia en el componente C5 del complemento (Cinader, B., et al., J. Exp. Med. 72(9:897-902, 1964) ha provisto una oportunidad indirecta de explorar el papel del complemento en este modelo artrítico al comparar la CIA entre cepas con suficiencia y con deficiencia de C5. Los resultados de estos estudios indican que la suficiencia de C5 es un requisito indispensable para la generación de la CIA ( atson et al., 1987; Wang, Y., et al., J. Immunol. 7(54: 340-4347, 2000). El uso de anticuerpos monoclonales (MoAbs) anti-C5 ha suministrado evidencia adicional de la importancia del C5 y del complemento en la RA. La administración intraperitoneal profiláctica de MoAbs anti-C5 en un modelo de múrido de CIA casi evitó por completo el inicio de la enfermedad, en tanto que durante la artritis activa derivó tanto en un importante beneficio clínico como en una alteración histológica más moderada (Wang, Y., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:8955-59, 1995). De estudios que usaron ratones transgénicos con receptor de la célula T K/BxN, un modelo de reciente creación de la artritis inflamatoria, se han obtenido conocimientos adicionales acerca de la función potencial de la activación del complemento en la patogenia de enfermedades (Korganow, A. S., et al., Immunity 7(9:451-461, 1999). Todos los animales K/BxN presentaron, en forma espontánea, una enfermedad autoinmunitaria con la mayor parte de (aunque no todas) las características clínicas, histológicas e inmunológicas de la RA de los humanos. Además, la transferencia de suero de ratones K/BxN artríticos a animales sanos produjo artritis en unos cuantos días por la transferencia de inmunoglobulinas artritógenas . Para identificar los pasos específicos de activación del complemento necesarios para la generación de la enfd, el suero de ratones K/BxN artríticos se transfirió a varios ratones genéticamente deficientes de un producto de la vía del complemento particular (Ji, H., et al., Immunity 7(5:157-68, 2002). En forma por demás interesante, los resultados del estudio demostraron que la activación de la vía alternativa es crítica, en tanto que la activación por la vía clásica es indispensable. Adicionalmente, la generación del C5a es crítica, dado que tanto los ratones con deficiencia de C5 como los ratones con deficiencia de C5aR estuvieron protegidos contra la generación de la enfermedad. De manera congruente con estos resultados, un estudio anterior informó que la ablación genética de la expresión del receptor C5a protege a los ratones contra la artritis (Grant, E. P., et al., J. Exp. Med. 796:1461-1471, 2002). Un MoAb anti-C5 humanizado (5G1.1) que evita la escisión del componente C5 del complemento humano en sus componentes proinflamatorios está en proceso de desarrollo a cargo de Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, como un posible tratamiento de la RA. Dos grupos de investigadores han propuesto, en forma independiente, que la vía de la lectina promueve la inflamación en pacientes con RA mediante la interacción de la MBL con glucoformas de la IgG especificas (Malhotra et al., Wat. Med. 7:237-243, 1995; Cuchacovich et al., J. R eumatol . 23:44-51, 1996). La RA está asociada con un marcado incremento en las glucoformas de la IgG que carecen de galactosa (a las que se les denomina glucoformas IgGO) en la región Fe de la molécula (Rudd et al., Trends Biotechnology 22:524-30, 2004). El porcentaje de las glucoformas IgGO aumenta al avanzar la enfermedad y regresa al nivel normal cuando los pacientes entran en remisión. In vivo, la IgGO se deposita en el tejido sinovial y la MBL está presente en niveles elevados en el liquido sinovial de sujetos con RA. La agalactosil IgG agregada (IgGO) en la IgG arracimada asociada con la RA puede ligarse a la lectina de unión a mañana o MBL y activar la vía de la lectina del complemento. Adicionalmente, los resultados de un estudio clínico reciente que observaron variantes alélicas de la MBL en pacientes sugieren que la MBL pueda tener, en la enfermedad, una función promotora de la inflamación (Garred et al., J. Rheumatol. 27:26-34, 2000). Por lo tanto, la vía de la lectina puede tener un importante papel en la patogenia de la RA. El lupus eritematoso sistémico o SLE es una enfermedad autoinmunitaria de etiología indefinida que deriva en la producción de autoanticuerpos , la generación de inmunocomplej os circulantes, y la activación descontrolada y por episodios del sistema de complemento. Aunque los orígenes de la autoinmunidad en el SLE sigue siendo una incógnita, en la actualidad se cuenta con una gran cantidad de información sobre la activación del complemento como un mecanismo importante que contribuye a las lesiones vasculares en esta enfermedad (Abramson, S.

B., et al., Hospital Practice 33: 107-122, 1998). La activación del complemento tanto por la vía clásica como por la vía alternativa está implicada en la enfermedad y tanto el C4d como el Bb son marcadores sensibles de la actividad moderada a grave del lupus (Manzi, S., et al., Arthrit. Rheumat. 39:1178-1188, 1996) . La activación del complemento por la vía alternativa acompaña las exacerbaciones de la enfermedad en el lupus eritematoso sistémico durante el embarazo (Buyon, J. P., et al., Arthritis Rheum. 35:55-61, 1992). Además, la vía de la lectina puede contribuir al desarrollo de la enfermedad, debido a que en el suero de pacientes con SLE se han identificado recientemente autoanticuerpos contra la MBL (Seelen, M. A., et al., Clin Exp. Immunol. 734:335-343, 2003) . Se cree que la activación del complemento mediada por el inmunocomplej o mediante la vía clásica es un mecanismo a través del cual se provocan lesiones tisulares en los pacientes de SLE. No obstante, las deficiencias hereditarias en componentes del complemento por la vía clásica aumentan el riesgo de padecer lupus o una enfermedad de tipo lupus (Pickering, M. C, et al., Adv. Immunol. 7(5:227-324, 2000). Más del 80% de los sujetos que tienen una deficiencia total de Clq, Clr/Cls, C4 o C3 padecen SLE o algún síndrome relacionado. Lo anterior plantea una aparente paradoja cuando efectos dañinos se comparan con los efectos protectores del complemento en el lupus. Parece que una importante actividad de la vía clásica es la de promover la eliminación de los inmunocomplej os de la circulación y los tejidos por medio del sistema fagocítico mónonuclear (Kohler, P. F. , et al., Am. J. Med. 5(5:406-11, 1974). Adicionalmente, en fechas recientes se ha encontrado que el complemento tiene una importante función en la eliminación y desecho de los cuerpos apoptósicos (Mevorarch, D., et al., J. Exp. Med. 188:2313-2320, 1998). La deficiencia de la función de la vía clásica puede generar predisposición en las personas para que padezcan SLE al permitir que se desarrolle un ciclo en el que los inmunocomplej os o las células apoptósicas se acumulen en los tejidos, provoquen inflamación y liberen autoantigenos , lo que a su vez estimulará la producción de autoanticuerpos y más inmunocomplej os y, de esta manera, evocar una respuesta autoinmunitaria (Botto, M., et al., Nat. Genet. 19:56-59, 1998; Botto, M . , Arthritis Res. 3:201-10, 2001). Sin embargo, estos estados de deficiencia "completa" o "total" de los componentes de la vía clásica están presentes en aproximadamente uno de cada 100 pacientes con SLE. Por lo tanto, en la gran mayoría de los pacientes con SLE, la deficiencia de los componentes del complemento por la vía clásica no contribuye a la etiología de la enfermedad y la activación del complemento puede ser un mecanismo importante que contribuya a la patogenia del SLE. El hecho de que sean poquísimos los sujetos que genéticamente tengan una deficiencia permanente de componentes por la vía clásica padezcan con frecuencia SLE en diversos momentos de su vida, da testimonio de la redundancia de los mecanismos capaces de disparar la enfermedad. Los resultados obtenidos de modelos animales del SLE sustentan la importante función de la activación del complemento en la patogenia de la enfermedad. La inhibición de la activación del C5 utilizando un MoAb anti-C5 bloqueador redujo la proteinuria y la nefropatia en ratones NZB/NZW Fl, un modelo del SLE en ratón (Wang Y., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8563-8, 1996). Por otra parte, el tratamiento con MoAb anti-C5 de ratones con una grave enfermedad por inmunodeficiencia combinada implantada con células que secretan anticuerpos anti-ADN deriva en la mejora de la proteinuria y el panorama histológico del riñon con el beneficio asociado de la sobrevivencia en comparación con los animales de control no tratados (Ravirajan, C. T., et al., Rheumatology 43:442-1, 2004). La vía alternativa también realiza una función importante en las manifestaciones de la enfermedad autoinmunitaria del SLE debido a que el retrocruzamiento de ratones con deficiencia del factor B en el modelo de MRL/lpr de SLE reveló que la falta del factor B disminuyó la vasculitis, la glomerulopatía, el consumo del C3 y los niveles de IgG3 RF encontrados normalmente en este modelo sin alterar los niveles de otros autoanticuerpos (Watanabe, H., et al., J. Immunol. 7(54:786-794, 2000). Como un tratamiento potencial del SLE se está investigando un MoAb anti-C5 humanizado. Este anticuerpo evita la escisión del C5 en C5a y C5b. No se observaron efectos adversos graves en pruebas clínicas de fase I y se están realizando más pruebas en seres humanos para determinar la eficacia en el SLE (Strand, V., Lupus 70:216-221, 2001). Los resultados tanto de estudios en animales como en seres humanos sustentan la posibilidad de que el sistema de complemento contribuya directamente a la patogenia de la distrofia muscular. Los estudios realizados en biopsias de distrofia humana han mostrado que el C3 y el C9 se depositan tanto en fibras necrosadas como no necrosadas del músculo distrófico (Cornelio and Dones, Ann . Neurol. 76:694-701, 1984; Spuler and Engel, A. G. , Neurology 50:41-46, 1998). Al utilizar métodos de microarreglos de ADN, Porter y sus colegas hallaron un marcado aumento en la expresión génica de numerosos ARNm relacionados con el complemento en ratones (mdx) con deficiencia de distrofina que coincide con el avance de la distrofia (Porter et al., Huía. Mol. Genet. 77:263-72, 2002) . Se ha identificado que las mutaciones en el gen humano que codifica la disferlina, una proteína muscular transmembrana, son los principales factores de riesgo de dos formas de la osteopatía, a saber, la distrofia muscular de cintura o LGMD, por sus siglas en inglés, y la miopatía de Miyoshi (Liu et al., Nat. Genet. 20:31-6, 1998) . Se han diseñado varios modelos de ratón con mutaciones en la disferlina y también presentan distrofia muscular progresiva. En la superficie de fibras musculares no necrosadas de algunos pacientes con LGMD se ha identificado la activación de la cascada del complemento (Spuler and Engel., Neurology 50:41-46, 1998). En un estudio reciente, Wenzel y sus colegas mostraron que las fibras musculares con deficiencia de disferlina tanto en múridos como en seres humanos carecían del factor inhibidor del complemento, CD33/DAF, un inhibidor específico del MAC (complejo de ataque a la membrana), el C5b-9 (Wenzel et al., J. Immunol. 775:6219-25, 2005). En consecuencia, las células musculares no necrosadas deficientes en disferlina son más susceptibles a la lisis celular mediada por el complemento. Wenzel y sus colegas sugieren que la lisis de las células músculo esqueléticas, mediada por el complemento, puede ser un mecanismo patológico importante implicado en la generación de la LGMD y la miopatía de Miyoshi en pacientes. Connolly y sus colegas estudiaron el papel del C3 del complemento en la patogenia de un modelo de distrofia congénita grave, el de ratón dy-/- , que es deficiente en laminina-a2 (Connolly et al., J. Neuroimmunol . 127:80-7, 2002). Criaron animales con deficiencia genética tanto en C3 como en laminina a.2 y encontraron que la ausencia de C3 prolongó la sobrevivencia en el modelo dy-/- de distrofia muscular.

Por otra parte, los ratones con doble desactivación (C3-/- , dy-/-) mostraron mayor vigor muscular que los ratones dy-/-. Este trabajo sugiere que el sistema de complemento puede contribuir directamente a la patogenia de esta forma de distrofia congénita. Un aspecto de la invención está asi dirigido a la prevención o el tratamiento de las artritis inflamatoria y no inflamatoria, asi como de otros trastornos osteomusculares , entre los que se incluyen, aunque no se limitan a, osteoartitis , artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, gota, artropatia neuropática, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante u otras espondiloartropatias y artropatias cristalinas, distrofia muscular o lupus eritematoso sistémico (SLE), mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece dicho trastorno. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al paciente, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente , por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . De manera alternativa, la administración puede ser mediante suministro local, como por ejemplo, una inyección intraarticular . El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse periódicamente durante un lapso de tiempo prolongado para el tratamiento o control de una enfermedad crónica, o puede administrarse en una sola dosis o en dosis repetidas en el periodo antes, durante y/o después de una lesión o traumatismo agudo, entre los que se incluye a los procedimientos quirúrgicos realizados en la articulación.

ENFERMEDADES RENALES A la activación del sistema de complemento se le ha implicado en la patogenia de una amplia variedad de nefropatias, entre las que se incluye a la glomerulonefritis mesangioproli ferativa (nefropatia por IgA, enfermedad de Berger) (Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), glomerulonefritis membranosa (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58:253-71, 1990; Brenchley, P. E . , et al., Kidney Int., 41:933-1, 1992; Salant, D. J., et al., Kidney Int. 35:976-84, 1989), glomerulonefritis membranoproliferativa ( glomerulonefritis mesangiocapilar) (Bartlow, B. G., et al., Kidney Int. 75:294-300, 1979; eri, S., et al., J. Exp. Med. 775:939-50, 1992), glomerulonefritis posinfecciosa aguda ( glomerulonefritis posestreptocócica ) , glomerulonefritis crioglobulinémica (Ohsawa, L., et al., Clin Immunol. 101:59-66, 2001), nefritis lúpica (Gatenby, P. A., Autoimmunity 11:61-6, 1991), y nefritis púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M . , et al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000) . Desde hace varias décadas se ha observado la participación del complemento en las nefropatías, sin embargo, hay una gran controversia sobre su función exacta en el inicio, desarrollo y la fase de resolución del padecimiento renal. En condiciones normales, la contribución del complemento es benéfica para el hospedador, pero la inadecuada activación y depósito del complemento puede contribuir a la lesión tisular. Existen muchos indicios de que la glomerulonefritis , la inflamación de los glomérulos, se inicia con frecuencia por el depósito o la precipitación de los inmunocomplej os sobre las estructuras glomerulares o tubulares, lo que dispara la activación del complemento, la inflamación y la lesión tisular. Kahn y Sinniah demostraron un aumento en la precipitación del C5b-9 en las membranas básales tubulares en biopsias tomadas de pacientes con diversas formas de glomerulonefritis (Kahn, T. N., et al., Histopath. 26:351-6, 1995). En un estudio de pacientes con nefrologia por IgA (Alexopoulos, A., et al., Nephrol. Dial. Transplant 70:1166-1172, 1995), la precipitación de C5b-9 en las estructuras de membrana epitelial tubular/basal se correlaciona con los niveles de creatinina en plasma. Otro estudio sobre la nefropatia membranosa demostró la relación entre el desenlace clínico y los niveles de sC5b-9 en la orina (Kon, S. P., et al., Kidney Int. 48:1953-58, 1995). Los elevados niveles de sC5b-9 se correlacionaron positivamente con un mal pronóstico. Lehto et al., midieron niveles elevados de CD59, un factor regulador del complemento que inhibe al complejo de ataque a la membrana en membranas plasmáticas, asi como de C5b-9 en la orina de pacientes con glomerulonefritis membranosa (Lehto, T., et al., Kidney Int. 47:1403-11, 1995). El análisis histopatológico de muestras de biopsia tomadas de estos mismos pacientes demostró la precipitación de las proteínas C3 y C9 en los glomérulos, mientras que la expresión del CD59" en estos tejidos se redujo en comparación con la del tejido del riñon normal. Todos estos estudios sugieren que la glomerulonefritis continua mediada por el complemento deriva en la emisión urinaria de las proteínas del complemento que se correlaciona con el grado de lesión tisular y el pronóstico de la enfermedad. La inhibición de la activación del complemento en varios modelos animales de la glomerulonefritis también ha demostrado la importancia de activación del complemento en la etiología de la enfermedad. En un modelo de glomerulonefritis membranoproliferativa o PGN, por sus siglas en inglés, la infusión de antisuero anti-Thyl en ratas deficientes en C6 (que no pueden formar C5b-9) derivó en una proliferación celular glomerular 90% menor, en una reducción del 80% en la infiltración de plaquetas y macrófagos, en una menor síntesis de colágeno de tipo IV (un marcador de la expansión de la matriz mesangial) y en 50% menos proteinuria que en ratas C6+ normales (Brandt, J., et al., Kidney Int. 49:335-343, 1996). Estos resultados implican que el C5b-9 es un mediador principal de la lesión tisular debida al complemento en este modelo de suero anti-timocitico de rata. En otro modelo de glomerulonefritis , la infusión de dosis graduadas de membranas básales glomerulares anti-rata de conejo produjo un influjo de leucocitos polimorfonucleares (PMN) que depende de la dosis que fue atenuado por el tratamiento previo con el factor de veneno de cobre (para consumir el complemento) (Scandrett, A. L., et al., Am. J. Physiol. 268 : F256-F265, 1995). Las ratas tratadas con el factor de veneno de cobra también tuvieron una menor histopatología, una reducción en la proteinuria de largo plazo y menores niveles de creatinina que los de las ratas de control. Al emplear tres modelos de GN en ratas (suero anti-timocitico, anti-Con A de Con A y nefritis pasiva de Heymann) , Couser et al., demostraron la potencial eficacia terapéutica de las estrategias para inhibir al complemento utilizando la proteina sCRl recombinante (Couser, W. G., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 5:1888-94, 1995) . Las ratas tratadas con el sCRl tuvieron un menor influjo de plaquetas y macrófagos PMN, una reducción en la mesangiolisis y la proteinuria en comparación con las ratas de control. El uso de un MoAb anti-C5 en el modelo de ratón NZB/W Fl ha aportado más indicios sobre la importancia de la activación del complemento en la glomerulonefritis . El MoAb anti-C5 inhibe la escisión del C5, bloqueando asi la generación del C5a y del C5b-9. La terapia continua con MoAb anti-C5 durante 6 meses arrojó como resultado una mejora significativa en la evolución de la glomerulonefritis . Un anticuerpo monoclonal (5G1.1) MoAb anti-C5 humanizado que evita la escisión del componente C5 del complemento humano en sus componentes proinflamatorios está en proceso de desarrollo a cargo de Alexion Pharmaceuticals , Inc., New Haven, Connecticut, como un posible tratamiento de la glomerulonefritis . La evidencia directa de la función patológica del complemento en la lesión renal se obtiene mediante estudios de los pacientes con deficiencias genéticas en componentes específicos del complemento. Una serie de informes han documentado la asociación de las nefropatías con las deficiencias del factor H regulador del complemento (Ault, B. H., Nephrol. 74:1045-1053, 2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M. C, et al., Nat. Genet. 31:424-8, 2002) . La deficiencia del factor H deriva en bajos niveles en plasma del factor B y C3 y en el consumo del C5b-9. Tanto la glomerulonefritis membranoproliferativa atípica o MPGN, como el síndrome uremohemolítico idiopático o HUS, están asociados a la deficiencia del factor H. Los cerdos con deficiencia del factor H (Jansen, J. H., et al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) y los ratones con desactivación del factor H (Pickering, M. C, 2002) presentan síntomas semejantes a la MPGN, lo que confirma la importancia del factor H en la regulación del complemento. Las deficiencias de otros componentes del complemento están asociadas a nefropatías, secundarias a la aparición de lupus eritematoso sistémico o SLE (Walport, . J. , Davies, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 815:261-81, 1997). La deficiencia de Clq, C4 y C2 predispone fuertemente a la aparición de SLE a través de mecanismos relacionados con la depuración defectuosa de inmunocomplej os y de material apoptósico. En muchos de estos pacientes con SLE, se presentó la nefritis lúpica caracterizada por el depósito de inmunocomplej os en el glomérulo. La identificación en pacientes de autoanticuerpos dirigidos contra los componentes del complemento, algunos de los cuales han estado relacionados directamente con las neuropatías, ha proporcionado pruebas adicionales que vinculan la activación del complemento con las afecciones renales (Trouw, L. A., et al., Mol.

Immunol. 38: 199-206, 2001). Varios de estos autoanticuerpos muestran un grado tal elevado de correlación con la nefropatía que para indicar esta actividad se introdujo el término factor nefrítico o NeF. En estudios clínicos, aproximadamente el 50% de los pacientes que fueron positivos en cuanto a estos factores nefríticos, tuvieron PGN (Spitzer, R. E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol . 64:177-83, 1992). El C3NeF es un autoanticuerpo dirigido contra la C3 convertasa de la vía alternativa (C3bBb) y la estabiliza, promoviendo de esta manera, la activación de la vía alternativa (Daha, M. R., et al., J. Immunol. 116:1-7, 1976). Del mismo modo, un autoanticuerpo con una especificidad por la C3 convertasa de la vía clásica (C4b2a) , llamado C4NeF, la estabiliza y, de esta manera, promueve la activación de la vía clásica (Daha, M . R. et al., J. Immunol. 125:2051-2054, 1980; Halbwachs, L., et al., J. Clin. Invest. 65:1249-56, 1980). Se ha mencionado que los autoanticuerpos anti-Clq están relacionados con la nefritis en pacientes con SLE (Hovath, L., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 19:667-72, 2001; Siegert, C, et al., J. Rheumatol. 18:230-34, 1991; Siegert, C, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:19-23, 1992), y para predecir la exacerbación de la nefritis se informó de un aumento en la concentración de estos autoanticuerpos anti-Clq (Coremans, I. E., et al., Am. J. Kidney Dis. 26:595-601, 1995). En los inmunodepósitos eluidos posmortem de ríñones de pacientes con SLE se descubrió la acumulación de estos autoanticuerpos anti-Clq (Mannick, M . , et al., Arthritis Rheumatol. 4(9:1504-11, 1997) . Todos estos factores apuntan hacia la función patológica de estos autoanticuerpos. Sin embargo, no todos los pacientes con autoanticuerpos anti-Clq presentaron la nefropatía y, del mismo modo, algunas personas sanas tuvieron una baja concentración de autoanticuerpos anti-Clq (Siegert, C. E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol . (57 : 204-9, 1993) . Además de las vías clásica y alternativa para la activación del complemento, la vía de la lectina también puede tener una importante función patológica en las nefropatías. En muestras de biopsias renales obtenidas de pacientes a quienes se les diagnosticaron diferentes padecimientos renales, entre las que se incluyen la nefritis púrpura de Henoch-Schonlein (Endo, M . , et al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000), glomerulonefritis crioglobulinémica (Ohsawa, L., et al., Clin. Immunol. 101:59-66, 2001) y neuropatía por IgA (Endo, M . , et al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), se han detectado, utilizando técnicas inmunohistológicas , elevados niveles de la MBL, serina proteasa asociada a la MBL y productos de la activación del complemento. Por lo tanto, a pesar del hecho de que por décadas se ha sabido de una asociación entre el complemento y las nefropatías, la información acerca de cómo el complemento influye exactamente sobre estas afecciones renales está muy lejos de estar completa. Un aspecto de la invención está así dirigido al tratamiento de enfermedades renales, incluyendo, pero sin limitarse, a glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar ) , glomerulonefritis posinfecciosa aguda (glomerulonefritis posestreptocócica) , glomerulonefritis crioglobulinémica, nefritis lúpica, nefritis púrpura de Henoch-Schonlein o nefropatia por IgA, al administrar una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece dicho trastorno. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al paciente, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente, por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse periódicamente durante un lapso de tiempo prolongado para el tratamiento o control de una enfermedad crónica o puede administrarse en una sola dosis o en dosis repetidas en el periodo antes, durante o después de una lesión o traumatismo agudo.

DERMATOPATÍAS La psoriasis es una enfermedad crónica y debilitante de la piel que afecta a millones de personas y que se atribuye tanto a factores genéticos como ambientales. Se considera en general que los agentes tópicos así como la fototerapia con UVB y PUVA son la primera linea de tratamiento de la psoriasis. Sin embargo, en el caso de una enfermedad generalizada o más extendida, la terapia sistémica es la que está indicada como el tratamiento primario o, en algunos casos, para potenciar la terapia con UVB y PUVA. La etiología subyacente a varias enfermedades de la piel, tal como la psoriasis, sustenta la función de los procesos inmunitarios y proinflamatorios que incluyen la participación del sistema de complemento. Además, se ha determinado que la función del sistema de complemento es un importante mecanismo no específico de defensa de la piel. Su activación deriva en la generación de productos que no solo ayuda a mantener las defensas normales del hospedador, sino que también median la inflamación y la lesión tisular. Los productos proinflamatorios del complemento incluyen fragmentos grandes de C3 con actividades opsonizantes y estimuladora de células (C3b y C3bi), anafilatoxinas de bajo peso molecular (C3a, C4a y C5a) y complejos de ataque a la membrana. Entre éstos, el C5a o su producto de degradación, el C5a desArg, parece ser el mediador más importante debido a que ejerce un potente efecto quimiotáctico sobre las células inflamatorias. La administración intradérmica de la anafilatoxina C5a induce cambios en la piel, muy similares a los que se observan en la vasculitis por hipersensibilidad cutánea que se presenta por medio de la activación del complemento mediada por inmunocomplej os . La activación del complemento está implicada en la patogenia de estos cambios inflamatorios en las dermatosis ampulosas autoinmunitarias . La activación del complemento por el anticuerpo del pénfigo en la epidermis parece ser el responsable de la aparición de los cambios inflamatorios característicos denominados espongiosis eosinófilica . En el pénfigo ampuloso o BP, por sus siglas en inglés, la interacción del antígeno de la zona de la membrana basal con el anticuerpo del BP desemboca en la activación del complemento que parece estar relacionada con los leucocitos que recubren la unión dermoepidérmica . Las anafilatoxinas resultantes no solo activan la infiltración de leucocitos sino que también inducen la desgranulación de los mastocitos, lo que facilita la separación dermoepidérmica y la infiltración de eosinófilos. De manera semejante, la activación del complemento parece desempeñar una función más directa en la separación dermoepidérmica observada en la epidermólisis ampular adquirida y el herpes gestacional . Las pruebas de la participación del complemento en la psoriasis proviene de recientes hallazgos experimentales descritos en la literatura y que se relacionan con los mecanismos fisiopatológicos de los cambios inflamatorios en la psoriasis y en enfermedades relacionadas . La creciente acumulación de pruebas ha indicado que la inmunidad mediada por células T tiene una función importante en el inicio y el mantenimiento de las lesiones psoriásicas. Se ha descubierto que las linfocinas producidas por las células T activadas en el caso de lesiones psoriásicas tienen una gran influencia sobre la proliferación de la epidermis. La característica acumulación de neutrófilos bajo el estrato córneo puede ser observada en zonas muy inflamadas de las lesiones psoriásicas. Los neutrófilos son quimiotácticamente atraídos y activados hacia esas zonas por la acción sinérgica de las quimiocinas, la IL-8 y la Gro-alfa liberadas por los queratinocitos estimulados y, en particular, por el C5a/C5a des-Arg producido por la activación del complemento a través de la vía alternativa (Terui, T., Tahoku J. Exp. Med. 190:239-248, 2000; Terui, T., Exp. Dermatol. 9:1-10, 2000). Los extractos de escamas psoriásicas contienen una singular fracción peptídica quimiotáctica que probablemente participe en la inducción de la quimiotaxis leucocítica transepidérmica rítmica. Los estudios recientes han identificado en esta fracción la presencia de dos péptidos quimiotácticos no relacionados, es decir, el C5a/C5a desArg y la interleucina 8 o IL-8 y sus citocinas relacionadas. Para investigar su contribución relativa en la migración leucocitíca transdérmica, tanto como su interrelación en lesiones psoriásicas, se determinaron las concentraciones de los C5a/C5a desArg e IL-8 inmunoreactivos en los extractos de escamas de lesiones psoriásicas y de los que se relacionan con las dermatosis pustulares estériles. Se encontró que las concentraciones de C5a/C5a desArg e IL-8 aumentaban de manera más significativa en los extractos de tejido córneo de la piel lesionada que en los de la piel ortoqueratósica no inflamatoria. El aumento en la concentración de C5a/C5a desArg fue especifico de los extractos de escamas de la lesión. Con base en los resultados, parece que el C5a/C5a desArg se genera únicamente en la piel lesionada e inflamada en circunstancias especificas que preferentemente favorecen la activación del complemento. Esto brinda la justificación del uso de un inhibidor de la activación del complemento para mejorar las lesiones psoriásicas . Si bien se ha mostrado que la vía clásica del sistema de complemento será activada en la psoriasis, hay un menor número de estudios sobre la participación dieléctrica vía alternativa en las reacciones inflamatorias de la psoriasis. En la visión convencional de las vías de activación del complemento, los fragmentos C3d y Bb del complemento se liberan, respectivamente, en el momento de la activación por la via clásica y por la via alternativa. Por lo tanto, la presencia de los fragmentos C4d y Bb indica que la activación del complemento se realiza por la vía clásica y/o por la vía alternativa. Un estudio determinó, utilizando técnicas de enzimoinmunoanálisis , los niveles de C4d y Bb en extractos de escamas psoriásicas. Las escalas de estas dermatosis contenían mayores niveles de C4d y Bb, detectables por medio de enzimoinmunoanálisis, que las del estrato córneo de piel no inflamada (Takematsu, H., et al., Dermatológica 787:289-292, 1990). Estos resultados sugieren que la vía alternativa del complemento se activa adicionalmente a la vía clásica en piel con lesiones por la psoriasis. Se han obtenido pruebas adicionales de la participación del complemento en la psoriasis y la dermatitis atópica al determinar los componentes del complemento normal y los productos de la activación en la sangre periférica de 35 pacientes con dermatitis atópica o AD, por sus siglas en inglés, y de 24 pacientes con psoriasis en etapa de moderada a intermedia. Los niveles de C3, C4 y de Cl-inhibidor (Cl INA) se determinaron en suero por medio de inmunodifusión radial, en tanto que los niveles de C3a y C5a se determinaron mediante radioinmunoensayo . En comparación con los pacientes del grupo de control sanos y no atópicos, se encontró que los niveles de C3, C4 y Cl INA habían aumentado de manera significativa en las dos enfermedades. En la AD, se observó la tendencia hacia un aumento en los niveles de C3a, mientras que en la psoriasis, los niveles de C3a aumentaron en forma significativa. Los resultados indican que, tanto en la AD como en la psoriasis, el sistema de complemento participa en el proceso inflamatorio (Ohkonohchi, K., et al., Dermatológica 179:30-34, 1989). La activación del complemento en la piel con lesiones por psoriasis también deriva en el depósito de complejos terminales del complemento en el interior de la epidermis, como quedó definido al determinar los niveles de sC5b-9 en el plasma y en los tejidos córneos de pacientes con psoriasis. Se ha encontrado que los niveles de sC5b-9 en el plasma psoriásico son significativamente mayores que los del grupo de control o los de pacientes con dermatitis atópica. Los estudios de los extractos de proteina total provenientes de piel lesionada han mostrado que mientras que en los tejidos córneos no inflamatorios el sC5b-9 no pueda ser detectado, habrá elevados niveles de sC5b-9 en los tejidos córneos de la lesión por psoriasis. Por medio de inmunofluorescencia y utilizando un anticuerpo monoclonal para el neoantigeno C5b-9, el depósito de C5b-9 sólo se ha observado en el estrato córneo de la piel con psoriasis. En resumen, en la piel con lesiones por psoriasis, el sistema de complemento se activa y esta activación del complemento recorre todo el camino hasta el paso terminal, generando el complejo de ataque a la membrana. Recientemente se han dado a conocer nuevos fármacos biológicos que se dirigen selectivamente al sistema inmunitario para el tratamiento de la psoriasis. Cuatro fármacos biológicos que la FDA ya ha aprobado o que están actualmente en estudios de fase 3 son: alefacept (Amevive®) y efalizuMoAb (Raptiva®) , que son moduladores de las células T; etanercept (Enebrel®) , un receptor de TNF soluble, e inflixiMoAb (Remicade®) un anticuerpo monoclonal anti-TNF. Raptiva es un modificador de la respuesta inmunitaria, donde el mecanismo de acción pretendido es el bloqueo de la interacción entre LFA-1 en los linfocitos e ICAM-1 en las células que presentan antigenos y en células endoteliales vasculares. La unión de CDlla por parte de Raptiva da como resultado la saturación de los sitios de unión de CDlla en los linfocitos y la submodulación de la expresión del CDlla de la superficie celular en los linfocitos. Este mecanismo de acción inhibe la activación de las células T, el tránsito celular hacia la dermis y la epidermis y la reactivación de las células T. De este modo, las numerosas pruebas científicas indican que el complemento tiene una función en los estados patológicos inflamatorios de la piel y los tratamientos farmacéuticos recientes se han dirigido al sistema inmunitario o a procesos inflamatorios específicos. Sin embargo, ninguno ha identificado a la MASP-2 como un tratamiento enfocado Con base en los nuevos conocimientos que los inventores han aprendido sobre la función de la MASP-2 en la activación del complemento, creen que la MASP-2 es un objetivo eficaz para el tratamiento de la psoriasis y otras enfermedades de la piel . Un aspecto de la invención se dirige asi al tratamiento de la psoriasis, las dermatosis ampulosas autoinmunitarias, la espongiosis eosinofilica, el pénfigo ampuloso, la epidermólisis ampulosa adquirida, la dermatitis atópica, el herpes gestacional y de otros trastornos de la piel, asi como al tratamiento de quemaduras térmicas y químicas, incluido el derrame capilar provocado por las mismas, mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece estos trastornos de la piel. El agente inhibidor de la MASP-2 se le puede administrar tópicamente al sujeto en forma de rocío, loción, gel, pasta, bálsamo o solución de irrigación que contiene el agente inhibidor de la MASP-2, o en forma generalizada, por ejemplo, por la vía intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea o por otra vía de administración parenteral, o potencialmente, por la vía oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . El tratamiento puede implicar una sola administración o varias aplicaciones o dosificaciones en caso de un padecimiento agudo, o aplicaciones o dosificaciones periódicas para controlar un padecimiento crónico .

TRANSPLANTE La activación del sistema de complemento contribuye de manera significativa a la reacción inflamatoria después de un transplante de viscera maciza. En un alotransplante, el sistema de complemento puede activarse por la isquemia o la revascularización y, posiblemente, por los anticuerpos dirigidos contra el injerto (Baldwin, W. M. , et al., Springer Seminol Immunopathol . 25:181-197, 2003). En xenotransplantes de no primates a primates, los principales activadores del complemento son los anticuerpos preexistentes. Los estudios en modelos animales han mostrado que el uso de inhibidores de complemento pueden prolongar en forma significativa la sobrevida del injerto (ver más adelante). De este modo, hay una función establecida para el sistema de complemento en las lesiones orgánicas después de un transplante de órgano y, por lo tanto, los inventores creen que el uso de inhibidores de complemento dirigidos hacia la MASP-2 puede evitar los daños en el injerto después de un alotransplante o un xenotransplante . Los mecanismos inmunitarios innatos, el complemento en particular, tienen una función mayor en las respuestas inflamatoria e inmunitaria en contra del injerto que ya había sido previamente reconocida. Por ejemplo, parece que la activación del complemento por la vía alternativa media la lesión por isquemia/revascularización renal y las células tubulares proximales pueden, en este escenario, ser a la vez el origen y el sitio de ataque de los componentes del complemento. El complemento producido localmente en el riñon también desempeña una función en la generación de respuestas inmunitarias tanto celulares como mediadas por anticuerpos en contra del injerto. El C4d es el producto de la degradación del factor C4 del complemento activado, un componente de las vías clásica y de la lectina. La tinción del C4d ha aparecido como un marcador útil del rechazo humoral tanto en el cuadro agudo como en el crónico y ha desembocado en un renovado interés en el significado de la formación del anticuerpo antidonador. La asociación entre el C4d y los signos morfológicos del rechazo celular agudo es estadísticamente significativa. El C4d se encuentra entre el 24 y el 43% de los episodios de tipo I, en el 45% del rechazo tipo II y el 50% del rechazo de tipo III (Nickeleit, V., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 73:242-251, 2002; Nickeleit, V., et al., Nephrol. Dial. Transplant 78:2232-2239, 2003). Son varias las terapias que están en proceso de desarrollo y que inhiben o reducen la síntesis local como el medio para obtener una mejor evolución clínica después del transplante. La activación de la cascada del complemento ocurre como resultado de varios procesos durante el transplante. Esta terapia, aunque eficaz para limitar el rechazo celular, no se ocupa por completo de todas las barreras con las que se enfrenta. Entre éstas se incluye al rechazo humoral y la disfunción o nefropatía crónica por aloinjerto. Aunque la respuesta general al órgano transplantado es el resultado de varios mecanismos efectores del lado del hospedador, el complemento puede tener un papel clave en algunos de ellos. En el ámbito del transplante renal, la síntesis local del complemento por parte de las células tubulares proximales parece tener una importancia particular. La disponibilidad de inhibidores del complemento específicos pueden brindar la oportunidad de una mejor evolución clínica después del transplante de órganos. Los inhibidores que actúan a través de un mecanismo que bloquea el ataque del complemento pueden ser particularmente útiles, debido a que mantienen la promesa de una mayor eficacia y evitan el agotamiento generalizado del complemento en un receptor inmunitariamente comprometido . El complemento también tiene una función crítica en el rechazo del xenoinjerto. Por lo tanto, los inhibidores eficaces del complemento son muy interesantes como agentes terapéuticos potenciales. En el transplante orgánico de cerdo a primate, el rechazo hiperagudo o HAR, por sus siglas en inglés, se origina por los depósitos de anticuerpos y la activación del complemento. Se han probado muchas estrategias y objetivos para evitar el rechazo hiperagudo al aloinjerto en la combinación de cerdo a primate. Estas estrategias se han concretado gracias a la eliminación de los anticuerpos naturales, al agotamiento del complemento con factor de veneno de cobra o al evitar la activación del C3 con los inhibidores' solubles del complemento Además, el bloqueador-2 de activación del complemento o CAB-2, por sus siglas en inglés, una proteina híbrida soluble recombinante derivada del factor acelerador de la declinación humana o DAF, también por sus siglas en inglés, y de la proteína cofactor de membrana inhibe las convertasas C3 y C5 tanto de las vía clásica como de la vía alternativa. El CAB-2 reduce el daño tisular mediado por el complemento en corazón de cerdo revascularizado ex vivo con sangre humana. Un estudio de la eficacia del CAB-2 cuando el corazón del cerdo fue transplantado heterotópicamente en monos Rhesus sin recibir inmunosupresión mostró que la sobrevivencia del injerto se prolongó notablemente en monos que recibieron el CAB-2 (Salerno, C. T., et al., Xenotransplantation 9:125-134, 2002). El CAB-2 inhibió notablemente la activación del complemento, como lo muestra la fuerte reducción en la generación de C3a y sC5b-9. En el rechazo al injerto, la precipitación tisular de iC3b, C4 y C9 fue similar o ligeramente menor que la del grupo de control, y no hubo cambios en el depósito de IgG, IgM, Clq y fibrina. Asi, esta estrategia para inhibir al complemento eliminó el rechazo hiperagudo de corazones de cerdo transplantados en monos Rhesus. Estos estudios demuestran los efectos benéficos de la inhibición del complemento en la sobrevivencia y los inventores creen que la inhibición de la MASP-2 también puede ser útil en el xenotransplante . Otra estrategia se ha concentrado en determinar si los anticuerpos monoclonales anticomplemento 5 (C5) podrían evitar el rechazo hipereagudo o HAR en un modelo de transplante de corazón de rata a un ratón presensibili zado y en si estos MoAb, combinados con ciclosporina y ciclofosfamida, pudieran alcanzar una sobrevivencia de largo plazo al injerto. Se encontró que el MoAb anti-C5 evita el HAR (Wang, H., et al., Transplantation (58:1643-1651, 1999). De este modo, los inventores creen que otros objetivos en la cascada del complemento, por ejemplo, la MASP-2, también podrían ser valiosos para evitar el HAR y el rechazo vascular agudo en futuros xenotransplantes clínicos. Si bien el papel fundamental del complemento en el rechazo hiperagudo observado en los xenoinjertos está bien establecido, está surgiendo una función sutil en el transplante alógeno. Desde hace mucho tiempo se ha sabido del vinculo entre el complemento y la respuesta inmunitaria adquirida, con el hallazgo de que en animales con complemento agotado presentaban respuestas de anticuerpos por debajo de lo normal después de la estimulación antigénica. Se ha demostrado que la opsonización del antigeno con el producto C3d fragmentado del complemento aumenta en gran medida la efectividad de la presentación del antigeno ante las células B y se ha demostrado que actúan por medio del acoplamiento del receptor tipo 2 del complemento en ciertas células B. Este trabajo se ha extendido al ámbito de los transplantes en un modelo de injerto de piel en ratones, donde los ratones con deficiencia de C3 y C4 tenían un marcado efecto en la producción de aloanticuerpos , debido a que la clase no puede cambia a IgG de gran afinidad. La importancia de estos mecanismos en el transplante renal aumenta debido a la significancia de anticuerpos antidonador y del rechazo humoral. El trabajo anterior ya ha demostrado la sobrerregulacion en la síntesis de C3 por las células tubulares proximales durante el rechazo al aloinjerto después del transplante renal. Se ha examinado la función del complemento localmente sintetizado en un modelo de transplante renal de ratón. Los injertos de donadores que no tienen C3 transplantados a receptores con suficiente C3 demostraron una sobrevivencia prolongada (> 100 días) en comparación don los injertos de control de donadores que tienen C3, que fueron rechazados antes de los 14 días. Por otra parte, la respuesta proliferativa de células T antidonador en receptores de injertos que no tienen C3 se redujo notablemente en comparación con la del grupo de control, lo que señala el efecto del C3 localmente sintetizado en el cebado de las células T. Estas observaciones sugieren la posibilidad de que la exposición del antigeno del donador ante las células T ocurra primero en el injerto y que el complemento localmente sintetizado aumenta la presentación del antigeno, ya sea mediante la opsonización del antigeno del donador o al suministrar señales adicionales tanto a las células presentadoras de antigeno como a las células T. En el ámbito del transplante renal, las células tubulares que producen complemento también presentan depósitos de complemento en su superficie celular. Un aspecto de la invención está asi dirigida a la prevención o tratamiento de la reacción inflamatoria que se produce por el transplante de tejido o de un órgano sólido mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico al receptor del transplante, que incluye sujetos que han recibido un alotransplante o un xenotransplante de órganos completos (por ejemplo, riñon, corazón, hígado, páncreas, pulmón, córnea, etc.) o injertos (por ejemplo, válvulas, tendones, hueso, médula ósea, etc.). El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al paciente por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente , por la vía oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . La administración puede efectuarse durante el periodo agudo posterior al transplante y/o como una terapia postransplante de largo plazo. Además de o en vez de la administración postransplante, el individuo puede ser tratado con el agente inhibidor de la MASP-2 antes del transplante y/o durante el proceso del transplante y/o pretratando con el agente inhibidor de la MASP-2 el órgano o tejido que será transplantado. El pretratamiento del órgano o tejido puede implicar la aplicación de una solución, gel o pasta que contiene el agente inhibidor de la MASP-2 a la superficie del órgano o tejido por rociado o irrigando la superficie, el órgano o tejido también puede sumergirse en una solución que contiene al inhibidor de la MASP-2.

TRASTORNOS Y LESIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y PERIFÉRICO A la activación del sistema de complemento se le ha implicado en la patogenia de una variedad de enfermedades o lesiones del sistema nervioso central o SNC, o del sistema nervioso periférico o SNP, ambas siglas en español, que incluyen, pero que no se limitan a, esclerosis múltiple o MS, miastenia grave o MG, enfermedad de Huntington o HD, esclerosis lateral amiotrófica o ALS, síndrome de Guillain Barre, revascularización posterior al ataque cerebrovascular, degeneración discal, traumatismo encefálico, enfermedad de Parkinson o PD y la enfermedad de Alzheimer o AD, las siglas de éstos últimos están en inglés. La determinación inicial de que las proteínas del complemento se sintetizan en las células del SNC, que incluye a las neuronas, astrocitos y la microglia, así como la comprensión de que las anafilatoxinas generadas en el SNC después de la activación del complemento puede alterar la función neuronal, ha revelado la potencial función del complemento en los trastornos del SNC (Morgan, B. P., et al., Immunology Today 17:10: 461-466, 1996). Ahora se ha demostrado que los receptores del C3a y los receptores del C5a se encuentran en las neuronas y muestran una amplia distribución en diferentes porciones de los sistemas sensorial, motor y límbico (Barum, S. R., Immunologic Research 2(5:7-13, 2002). Por otra parte, se ha mostrado que las anafilatoxinas C5a y C3a alteran los comportamientos frente a la comida y a la bebida de roedores y pueden inducir la señalización con calcio en la microglia y en las neuronas. Estos descubrimientos aumentan las posibilidades con respecto a la utilidad terapéutica de inhibir la activación del complemento en una variedad de enfermedades inflamatorias del SNC, entre las que se incluyen el traumatismo encefálico, la desmielinización, la meningitis, el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Alzheimer. El traumatismo encefálico o la hemorragia cerabral es un problema clínico común y puede presentarse la activación del complemento y exacerbar la inflamación y edema resultantes. Los efectos de la inhibición del complemento han sido estudiados en un modelo de traumatismo encefálico en ratas (Kaczorowski et al., J. Cereb. Blood Flow Metab . 75:860-864, 1995) . La administración del sCRl inmediatamente antes de la lesión cerebral inhibió notablemente la infiltración de neutrófilos hacia el área lesionada, lo que indica que el complemento fue importante para la incorporación de células fagocíticas . Del mismo modo, la activación del complemento en pacientes después de una hemorragia cerebral está claramente implicado por la presencia de elevados niveles de múltiples productos de activación del complemento tanto en plasma con en el líquido cerebroespinal o CSF, por sus siglas en inglés. La activación del complemento y el aumento en la tinción de complejos C5b-9 ha sido demostrada en el tejido del disco lumbar secuestrado y podría sugerir una función en la ciática inducida por el tejido de la hernia discal (Gronblad, M . , et al., Spine 28(2): 114-118, 2003). La MS se caracteriza por la pérdida progresiva del recubrimiento de mielina y del aislamiento de los axones en el SNC. Aunque la causa inicial se desconoce, existe una gran cantidad de pruebas que implican al sistema inmunitario (Prineas, J. W., et al., Lab Invest. 38:409-421, 1978; Ryberg, B., J. Neurol . Sci. 54:239-261, 1982) . También hay pruebas claras de que el complemento realiza una función prominente en la fisiopatología de las enfermedades desmielinizantes del SNC o del SNP, entre las que se incluye la MS, el síndrome de Guillain-Barre y al síndrome de Miller-Fisher (Gasque, P., et al., Immunophar acology 49:171-186, 2000; Barnum, S. R. en Bondy S. et al. (eds.) Inflammatory events ín neurodegeneration, Prominent Press 139-156, 2001). El complemento contribuye a la destrucción tisular, a la inflamación, a la depuración de los residuos de mielina e incluso a la remielinización de los axones. A pesar de los claros indicios de la participación del complemento, la identificación de los objetivos terapéuticos del complemento está siendo evaluada en la actualidad en la encefalomielitis alérgica de laboratorio o EAE, por sus siglas en inglés, un modelo animal de la esclerosis múltiple. Los estudios han establecido que los ratones con EAE deficientes en C3 o en el factor B presentan una atenuación en la desmielinización en comparación con los ratones de control con AEA (Barnum, Immunologic Research 2(5:7-13, 2002). Los estudios en ratones con EAE en los que se utilizó una forma soluble de un inhibidor del complemento denominado "sCrry" y C3(-/-) y factor B(-/-) demostraron que el complemento contribuye a la generación y el desarrollo del modelo de enfermedad en varios niveles. Además, la marcada reducción en la gravedad de la EAE en ratones con el factor B(-/-) aporta pruebas adicionales en cuanto a la función de la via alternativa del complemento en la EAE (Nataf et al., J. Immunology 765:5867-5873, 2000) . La MG es una enfermedad de la unión neuromuscular con pérdida de receptores de la acetilcolina y destrucción de la placa motora terminal. El sCRl es muy eficaz en un modelo animal de la MG, que además da indicios de la función del complemento en la enfermedad (Piddelesden et al., J. Neuroimmunol . 1997). Las características histológicas de la AD, una enfermedad neurodegenerativa, son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares (McGeer et al., Res. Immunol. 143:621-630, 1992). Estos marcadores patológicos también tiñen intensamente los componentes del sistema de complemento. Las evidencias apuntan hacia una situación neuroinflamatoria local que deriva en la muerte neuronal y en la disfunción cognitiva. Las placas seniles contienen al péptido amiloide-ß anormal (?ß, un péptido derivado de la proteina precursora de amiloide) . Se ha demostrado que el ?ß se une al Cl y puede disparar la activación del complemento (Rogers et al., Res. Immunol. 143:624-630, 1992). Por otra parte, una característica principal de la AD es la asociación de proteínas activadas de la vía clásica del complemento de Clq a C5b-9, que se ha determinado está muy localizada en las placas neuríticas (Shen, Y., et al., Brain Research 769:391-395, 1997; Shen, Y., et al., Neurosci. Letters 305(3) :165- 168, 2001). De este modo, el ?ß no solo inicia la vía clásica, sino que el estado inflamatorio continuo resultante puede contribuir a la muerte de las neuronas. Además, el hecho de que la activación del complemento en la AD ha avanzado a la fase terminal del C5b-9 indica que los mecanismos reguladores del sistema de complemento no han podido detener el proceso de la activación del complemento. Se han propuesto varios inhibidores de la vía del complemento como posibles estrategias terapéuticas contra la AD, incluyendo al proteoglucano como inhibidor de la unión Clq, Nafamstat como inhibidor de la C3 convertasa, y los bloqueadores de la activación del C5 o los inhibidores de los receptores de C5a (Shen, Y., et al., Progress in Neurobiology 70:463-472, 2003). El papel de la MASP-2 como el paso inicial de la vía innata del complemento, así como en la activación por la vía' alternativa, brinda una estrategia terapéutica potencial nueva y está soportada por abundantes datos que sugieren la participación de la vía del complemento en AD. En regiones dañadas del cerebro de pacientes con PD, al igual que en otras enfermedades degenerativas del SNC, existen pruebas de la inflamación caracterizada por la respuesta glial (en especial, de la microglia) , así como del aumento en la expresión de antígenos HLA-DR, citocinas y componentes del complemento. Estas observaciones sugieren la participación de mecanismos del sistema inmunitario en la patogenia de daño neuronal en la PD. No obstante, que los mecanismos celulares de la lesión primaria en la PD no han sido aclarados, es probable que las mutaciones mitocondriales , la tensión oxidante y la apoptosis tengan alguna función. Por otra parte, la inflamación iniciada por el daño neuronal en el cuerpo estriado y la sustancia negra en la PD pueden agravar la evolución de la enfermedad. Estas observaciones sugieren que el tratamiento con los fármacos inhibidores del complemento pueden actuar para desacelerar el avance de la PD (Czlonkowska, A., et al., ed. Sci. Monit. 8:165-177, 2002) . Un aspecto de la invención está así dirigido hacia el tratamiento de trastornos o lesiones en el sistema nervioso periférico (SNP) y/o en el sistema nervioso central (SNC) mediante el tratamiento de un sujeto que padece dicho trastorno o lesión con una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Se cree que los trastornos y lesiones en el SNC o en el SNP que pueden ser tratados de conformidad con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple ( S), miastenia grave (MG) , enfermedad de Huntington (HD) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , síndrome de Guillain Barre, revascularización posterior al accidente cerebrovascular, degeneración discal, traumatismo encefálico, enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD) , síndrome de Miller-Fisher, traumatismo y/o hemorragia encefálicos, desmielinización y, posiblemente, meningitis. Para el tratamiento de enfermedades del SNC y de traumatismos encefálicos, el agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse al sujeto por vía intratecal, intracraneana, intraventricular, intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral y, potencialmente, en forma oral en caso de inhibidores no peptidérgicos . Las enfermedades del SNP y el traumatismo encefálico pueden ser tratadas a través de una vía de administración sistémica o, de manera alternativa, mediante la administración local en el sitio de la disfunción o traumatismo. La administración de las composiciones inhibidoras de la MASP-2 de la presente invención puede repetirse periódicamente según lo determine el médico hasta que se consiga el alivio o control eficaz de los síntomas.

HEMOPATÍAS La septicemia es provocada por una reacción abrumadora que el paciente presenta ante microorganismos invasores. Una de las funciones principales del sistema de complemento es organizar la respuesta inflamatoria ante bacterias invasoras y otros patógenos. En forma congruente con esta función fisiológica, en numerosos estudios se ha demostrado que la activación del complemento desempeña una función principal en la patogenia de la septicemia (Bone, R. C, Annals. Internal. Med. 775:457-469, 1991). La definición de las manifestaciones clínicas de la septicemia está en constante evolución. A la septicemia se le define, normalmente, como la respuesta generalizada del hospedador ante una infección. Sin embargo, en muchas ocasiones, no se hallan pruebas clínicas (por ejemplo, en hemocultivos que son positivos en bacterias) de la infección en pacientes que presentan síntomas -de septicemia. Esta discordancia fue considerada por primera vez en una Conferencia de consenso en el año de 1992 cuando se estableció el término "síndrome de respuesta inflamatoria generalizada o sistémica" (SIRS, por sus siglas en inglés) y para el cual no se necesitaba la presencia definida de infección bacteriana (Bone, R. C, et al., Crit. Care Med. 20:724-726, 1992). Actualmente existe un consenso general de que la septicemia y la SIRS están acompañadas por la incapacidad para regular la respuesta inflamatoria. Para los fines de este breve revisión, consideraremos que la definición clínica de septicemia incluye también a la septicemia grave, al choque septicémico y a la SIRS. El origen principal de la infección en pacientes septicémicos antes de los últimos años de la década de 1980 eran las bacterias gramnegativas . Se sabe que el lipopolisacárido o LPS, el principal componente de la pared celular de las bacterias gramnegativas, estimula la liberación de mediadores de la inflamación desde varios tipos de células e inducen síntomas infecciosos agudos cuando se inyectan en animales (Haeney, M. R. , et al., Antimicrobial Chemotherapy 47(Suppl. A): 41-6, 1998). Es interesante observar que el espectro de los microorganismos responsables parece haberse desplazado de bacterias preponderantemente gramnegativas a finales de las décadas de 1970 y 1980 ha bacterias preponderantemente grampositivas en el presente, por razones que no son claras en la actualidad (Martin, G. S., et al., N. Eng. J. Med. 348:1546-54, 2003). Muchos estudios han mostrado la importancia de la activación del complemento en la mediación de la inflamación y en la contribución a las características del choque, en particular, el choque séptico o septicémico y hemorrágico. Tanto los organismos gramnegativos como los grampositivos aceleran, comúnmente, el choque septicémico. El LPS es un potente activador del complemento, preponderantemente, a través de la vía alternativa, aunque también se presenta la activación de la vía clásica mediada por anticuerpos (Fearon, D. T., et al., N. Engl . J. Med. 292:937-400, 1975). Los componentes principales de la pared celular de bacterias grampositivas son el peptidoglucano y el ácido lipoteicoico y ambos componentes son potentes activadores de la vía alternativa del complemento, aunque la presencia de anticuerpos específicos también puede activar la vía clásica del complemento (Joiner, K. A., et al., Ann. Rev. Immunol. 2 : 461-2, 198 ) . El sistema de complemento estuvo inicialmente implicado en la patogenia de la septicemia cuando los investigadores observaron que las anafilatoxinas C3a y C5a median una variedad de respuestas inflamatorias que también pueden presentarse durante la septicemia. Estas anafilatoxinas provocan la vasodilatación y un aumento en la permeabilidad microvascular, acontecimientos que tienen un papel central en el choque septicémico (Schumacher, W. A., et al., Agents Actions 34:345-349, 1991). Además, las anafilatoxinas inducen el broncoespasmo, la liberación de histamina desde los mastocitos y la agregación de trombocitos . Por otra parte, tienen muchos efectos sobre los granulocitos, como por ejemplo, la quimiotaxis, la agregación, la adhesión, la liberación de enzimas lisosomales, la generación del anión superóxido tóxico y la formación de leucotrienos (Shin, H. S., et al . , Science 162:361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3:177-86, 1986). Se cree que estos efectos biológicos desempeñan un papel en la aparición de complicaciones de la septicemia tales como choque o síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS) (Hammerschmidt, D. E . , et al., Lancet 7:947-949, 1980; Slotman, G. T., et al., Surgery 99:744-50, 1986). Además, los elevados niveles de la anafilatoxina C3a están asociados al desenlace mortal en la septicemia (Hack, C E . , et al., Am. J. Med. 86:20-26, 1989). En algunos modelos animales de choque, ciertas cepas con deficiencia en el complemento (por ejemplo, deficientes en C5) son más resistentes a los efectos de las infusiones de LPS (Hseuh, W., et al., Immunol . 70:309-14, 1990). Se ha demostrado que el bloqueo de la generación de C5a con anticuerpos durante el inicio de la septicemia en roedores ha mejorado su sobrevivencia (Czermak, B. J., et al., Nat. Med. 5:788-792, 1999). Se han hecho hallazgos semejantes cuando se bloqueó al receptor de C5a (C5aR) , ya sea con anticuerpos o con un inhibidor de molécula pequeña (Huber-Lang, M . S., et al . , FASEB J. 16:1561-14, 2002; Riedemann, N. C. et al., J. Clin. Invest. 770:101-8, 2002). Anteriores estudios de laboratorio en monos han sugerido que el bloqueo de C5a con anticuerpos atenuó el choque septicémico inducido por E. coli y el síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (Hangen, D. H., et al., J. Surg. Res. 46:195-9, 1989; Stevens, J. H., et al., J. Clin. Invest. 77:1812-16, 1986). En seres humanos con septicemia, los niveles de C5a se elevaron y se asociaron con una importante reducción en las tasas de sobrevivencia junto con la falla multiorgánica, cuando se compararon con las de sobrevivientes y pacientes septicémicos menos graves (Nakae, H., et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 84:189-95, 1994; Nakae, et al., Surg. Today 26:225-29, 1996; Bengtson, A., et al., Arch. Surg. 123:645-649, 1988). Los mecanismos por los cuales el C5a ejerce sus efectos perjudiciales durante la septicemia todavía no se investigan con gran detalle, pero la información reciente sugiere que la generación del C5a durante la septicemia compromete de manera importante las funciones inmunitarias innatas de los neutrófilos (Huber-Lang, M. S., et al., J. Immunol. 169:3223-31, 2002), su capacidad para expresar un estallido respiratorio y su capacidad para generar citocinas (Riedemann, N. C, et al., Immunity 79:193-202, 2003). Además, parece que la generación del C5a durante la septicemia tiene efectos procoagulantes (Laudes, I. J. , et al., Am. J. Pathol. 7(50:1867-75, 2002) . La proteína que modula el complemento, CI INH, también ha mostrado ser eficaz en modelos animales de septicemia y ARDS (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt. 93:299-305, 1993) . La vía de la lectina también puede tener alguna función en la patogenia de la septicemia. Se ha mostrado que la MBL se une a una gama de microorganismos clínicamente importante que contienen tanto bacterias gramnegativa y grampositiva y activa la vía de la lectina (Neth, 0., et al., Infect. Immun. 68:688, 2000). La opinión que considera al ácido lipoteicoico o LTA, por sus siglas en inglés, como el equivalente grampositivo de la LPS va en aumento. Es un potente estimulante inmunitario que induce la liberación de citocina desde fagocitos mononucleares y sangre (Morath, S. et al., J. Exp. Med. 795:1635, 2002; Morath, S. et al., Infect. Immun. 70:938, 2002). Se demostró, recientemente, que la L-ficolina se une específicamente con el LTA de un gran número de bacterias grampositivas , incluido el Staphylococcus aureus y activa la vía de la lectina (Lynch, N. J. , et al . , J. Immunol. 772:1198-02, 2004). Se ha observado que la MBL también se une al LTA del Enterococcus spp en el que la cadena de poliglicerofosfato es sustituida por grupos glicosilo, pero no con el LTA de otras nueve especies, entre las que se incluye al S. aureus (Polotsky, V. Y., et al., Infect. Immun. 64:380, 1996) . Un aspecto de la invención presenta, de este modo, un método para tratar la septicemia o una enfermedad derivada de la septicemia mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece septicemia o una enfermedad derivada de la septicemia incluyendo, sin limitarse, a la septicemia grave, el choque septicémico, el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda derivado de la septicemia y el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Se presentan métodos relacionados para el tratamiento de otras hemopatías, entre las que se incluyen el choque hemorrágico, la anemia hemolítica, el púrpura trombocitopénico trombótico autoinmunitario o TTP, el síndrome urémico hemolítico o HUS (éstas últimas por sus siglas en inglés) u otras enfermedades que destruyen la médula ósea o la sangre, mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece dicha enfermedad. El agente inhibidor de la MASP-2 se administra sistémicamente al paciente, por ejemplo, por vía intraarterial , intravenosa, intramuscular, por inhalación (particularmente en el caso de la ARDS) , subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . La composición del agente inhibidor de la MASP-2 puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales para combatir las secuelas de la septicemia y/o del choque. En el caso de septicemia o choque avanzados o de una situación aflictiva derivada de aquellos, la composición inhibidora de la MASP-2 puede ser adecuadamente administrada en una presentación de acción rápida, por ejemplo mediante la inyección intravenosa o intraarterial de una solución que contiene la composición del agente inhibidor de la MASP-2. Puede efectuarse la administración repetida según lo determine el médico hasta que la enfermedad haya desaparecido.

ENFERMEDADES UROGENITALES Al sistema de complemento se le ha implicado en varios trastornos urogenitales diferentes, entre los que se incluyen, enfermedad de la vejiga dolorosa, enfermedad de la vejiga sensible, cistitis abacteriana crónica y cistitis intersticial ( Holm-Bent zen, M., et al., J. Urol. 138:503-501, 1987), infertilidad (Cruz, et al., Biol . Reprod. 54:1217-1228, 1996), embarazo (Xu, C, et al., Science 287:498-507, 2000), tolerancia feto-materna (Xu, C, et al., Science 287:498-507, 2000) y preeclampsia (Haeger, . , Int. J. Gynecol . Obstet. 43:113-121, 1993) . La enfermedad de la vejiga dolorosa, la enfermedad de la vejiga sensible, la cistitis abacteriana crónica y la cistitis intersticial son enfermedades más definidas de etiología y patogenia desconocida y, por lo tanto, carecen de una terapia adecuada. Predominan las teorías patógenéticas que tienen que ver con los defectos en el epitelio y/o en el recubrimiento de la superficie mucosa de la vejiga, así como las teorías que tienen que ver con las alteraciones inmunológicas ( Holm-Bentzen, . , et al., J. Urol. 138:503-501, 1987). Se informó que a los pacientes con cistitis intersticial se les habían determinado las inmunoglobulinas (IgA, IgG e IgM) , los componentes del complemento (Clq, C3 y C4) y el inhibidor de Cl-esterasa. Tenían una baja muy importante en los niveles séricos del componente C4 del complemento (p menor de 0.001) y la inmunoglobulina G estaba notablemente elevada (p menor de 0.001). Este estudio sugiere la activación del sistema de complemento por la vía clásica y apoya la posibilidad de que en la patogenia de la enfermedad esté implicado un proceso inmunológico crónico local (Mattila, J., et al., Eur. Urol. 9:350-352, 1983). Por otra parte, después de la unión de anticuerpos con antígenos en la mucosa de la vejiga, la activación del complemento podría estar implicada en la generación del daño tisular y en la inflamación crónica autosostenida típica de esta enfermedad (Helin, H., et al., Clin. Immunol. Immunopathol . 43:88-96, 1987).

Además de la función del complemento en las enfermedades urogenitales inflamatorias, las funciones reproductivas pueden verse afectadas por la regulación local de la vía del complemento. Los inhibidores naturales del complemento han evolucionado para suministrar células hospedadoras con la protección que necesitan para controlar el sistema de complemento del cuerpo. El Crry, un inhibidor natural del complemento de roedor que es estructuralmente semejante a los inhibidores del complemento humano, el MCP y el DAF, ha sido estudiado para delimitar el control regulador del complemento en el desarrollo del feto. De manera interesante, los intentos por generar ratones Crry(-/-) no tuvieron éxito. En su lugar, se descubrió que los ratones Crry(-/-) homocigoto murieron en el útero. Los embriones Crry(-/-) sobrevivieron aproximadamente hasta 10 días después del coito y la sobrevivencia se redujo rápidamente cuando murieron como resultado de la falta de desarrollo. En el tejido placentario de los embriones Crry(-/-) se observó también una notable invasión de células inflamatorias. En contraste, parecía que el C3 se había depositado en la placenta de los embriones Crry(+/+). Esto sugiere que la activación del complemento se había presentado en el nivel de la placenta y al faltar la regulación del complemento, los embriones murieron. Los estudios de confirmación investigaron la introducción de la mutación Crry en una base con deficiencia de C3. Esta estrategia de rescate tuvo éxito. En conjunto, estos datos indican que la interfaz del complemento feto-materno debe estar regulada. Pequeñas alteraciones en la regulación del complemento dentro de la placenta pueden contribuir a disfunción placentaria y aborto natural (Xu, C, et al., Science 287 ¡498-507, 2000) . La preeclampsia es un trastorno hipertensivo inducido por el embarazo, en el cual ha estado implicada la activación del sistema de complemento, aunque esto sigue generando controversia (Haeger, M., Int. <J. Gynecol. Obstet. 43:113-127, 1993). La activación del complemento en la circulación general está muy relacionada con la enfermedad declarada en la preeclampsia, pero no se habían observado elevaciones en forma previa a la presencia de síntomas clínicos y, por lo tanto, los componentes del complemento no pueden ser utilizados para anticipar la preeclampsia (Haeger, et al., Obstet. Gynecol. 78:46, 1991) . Sin embargo, el aumento en la activación del complemento en el entorno local del lecho de la placenta puede superar a los mecanismos de control locales, derivando en elevados niveles de las anafilatoxinas y el C5b-9 (Haeger, et al., Obstet. Gynecol. 73:551, 1989). Un mecanismo propuesto para la infertilidad relacionada con anticuerpos antiespermatozoides o ASA, por sus siglas en inglés, es mediante la función de la activación del complemento en el tracto genital. La generación del C3b y de la opsonina iC3b, que pueden potenciar la unión del espermatozoide mediante las células fagociticas a través de sus receptores de complemento, asi como la formación del complejo terminal C5b-9 en la superficie del espermatozoide, reduciendo asi la motilidad del espermatozoide, son causas potenciales asociadas a una menor fertilidad. También ha demostrado que hay niveles elevados de C5b-9 en el liquido folicular ovárico de mujeres infértiles (D'Cruz, 0. J. , et al., J. Immunol. 744:3841-3848, 1990). Otros estudios han mostrado afectaciones en la migración de los espermatozoides y una menor interacción espermatozoide-óvulo, que puede estar asociados al complemento (D'Cruz, 0. J., et al., J. Immunol. 146:611-620, 1991; Alexander, N. J., Fértil.

Steril. 47:433-439, 1984). Finalmente, los estudios con sCRl demostraron un efecto protector de los espermatozoides humanos en contra de la lesión mediada por el complemento y por los ASA (D'Cruz, 0. J. , et al., Biol. Reprod. 54:1217-1228, 1996). Estos datos aportan varias lineas indicativas para el uso de los inhibidores del complemento durante el tratamiento de enfermedades y trastornos urogenitales. Un aspecto de la invención aporta asi un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece algún trastorno urogenital, al administrarle al sujeto que padece dicho trastorno una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Se cree que los trastornos urogenitales que estarán sometidos al tratamiento terapéutico con los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, a manera de ejemplo no limitante, enfermedad de la vejiga dolorosa, enfermedad de la vejiga sensible, cistitis abacteriana crónica y cistitis intersticial, infertilidad masculina y femenina, disfunción placentaria y aborto natural y preeclampsia . El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al paciente, por ejemplo, por vía intraarterial , intravenosa, intra-muscular , por inhalación, subcutánea u otra vía de administración parenteral, o potencialmente por vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . Como alternativa, la composición inhibidora de la MASP-2 puede suministrarse localmente al tracto urogenital, como por ejemplo, por irrigación o instilación intravesicular con una solución líquida o composición en gel . La administración puede repetirse según lo determine el médico con la finalidad de controlar o remitir la enfermedad.

DIABETES Y ENFERMEDADES DIABÉTICAS La microangiopatía retinal diabética está caracterizada por un aumento en la permeabilidad, la leucostasis, la microtrombosis y la apoptosis de las células capilares, todo lo cual podría ser provocado o promovido por la activación del complemento. Las estructuras glomerulares y los microvasos endoneuriales de los pacientes con diabetes presentan signos de activación del complemento. La reducción en la disponibilidad o eficacia de los inhibidores del complemento en la diabetes ha sido sugerida por el descubrimiento de que un elevado nivel de glucosa in vitro reduce selectivamente la expresión del CD55 y el CD59, los dos inhibidores que son proteínas de membrana ancladas por el glucosilfosfatidilinositol (GPI), en la superficie celular endotelial y que el CD59 se somete a la glucación no enzimática que impide su función inhibidora del complemento . Los estudios realizados por Zhang et al. (Diabetes 57:3499-3504, 2002), investigaron la activación del complemento como una característica de la retinopatía diabética no proliferativa y su asociación con los cambios en las moléculas inhibidoras. Encontraron que la precipitación del C5b-9, el producto terminal de la activación del complemento, ocurre en la pared de los vasos retínales de donadores de ojo que tienen diabetes tipo 2, pero no en los vasos de donadores no diabéticos de edad semejante. No se detectaron en retinas diabéticas ni el Clq y ni el C4, los componentes del complemento exclusivos de la vía clásica, lo que indica que el C5b-9 se generó por la vía alternativa. Los donadores diabéticos tuvieron una importante reducción en los niveles retínales de CD55 y CD59, los dos inhibidores del complemento unidos a la membrana plasmática mediante anclas de GPI . En ratas con 10 semanas de diabetes inducida con estreptozotocina, se observó la activación del complemento en los vasos retínales, así como la reducción selectiva en los niveles retínales de CD55 y CD59. De este modo, parece que la diabetes provoca una mala regulación de los inhibidores del complemento y la activación del complemento que precede a la mayoría de otras manifestaciones de la microangiopatía retinal diabética. Gerl et al. ( Investigative Ophthalmology and Visual Science 43:1104-08, 2000) determinaron la presencia de componentes del complemento activado en ojos afectados por la retinopatía diabética. En los estudios inmunohistoquímicos se encontraron extensos depósitos de los complejos C5b-9 del complemento, los cuales fueron detectados en los coriocapilares inmediatamente debajo de la membrana de Bruch y rodeando densamente a los capilares en los 50 especímenes de retinopatía diabética. La tinción del C3d se correlacionó positivamente con la tinción del C5b-9, indicando el hecho de que la activación del complemento se había realizado in situ. Adicionalmente, se encontró que hubo tinción de la vitronectina, que forma complejos estables con el C5b-9 extracelular . En contraste, no ocurrió la tinción de la proteina reactiva a la C (CRP) , de la lectina de unión a mañana (MBL) , del Clq o del C4 , lo que indica que la activación del complemento no se realizó por la vía dependiente de C4. Así, la presencia de C3d, C5b-9 y de vitronectina indica que la activación del complemento se realiza hasta su término, posiblemente por la vía alternativa en los coriocapilares de ojos afectados por la retinopatía diabética. La activación del complemento puede ser un factor causante en las secuelas patológicas que pueden contribuir a las enfermedades del tejido ocular y a la afectación de la visión. Por tanto, el uso de un inhibidor del complemento puede ser una terapia eficaz para reducir o bloquear los daños en los microvasos que ocurren en la diabetes. La diabetes mellitus dependiente de la insulina o IDDM, por sus siglas en inglés, a la que también se le denomina diabetes tipo I, es una enfermedad autoinmunitaria asociada a la presencia de diferentes tipos de autoanticuerpos (Nicoloff et al., Clin. Dev. Im unol. 11:61-66, 2004). La presencia de estos anticuerpos y sus antígenos correspondientes en el torrente sanguíneo lleva a la formación de inmunocomplej os circulantes o CIC, por sus siglas en inglés, que se sabe persisten en la sangre por periodos prolongados. La precipitación de los CIC en los pequeños vasos sanguíneos cuentan con el potencial para producir la microangiopatía con las consecuencias del debilitamiento clínico. Existe una correlación entre los CIC y la generación de complicaciones microvasculares en niños diabéticos. Estos descubrimientos sugieren que los elevados niveles de IgG en los CIC están asociados con la generación de nefropatías diabéticas tempranas y que un inhibidor de la vía del complemento puede ser eficaz para bloquear la nefropatía diabética (Kotnik, et al., Croat. Med. J. 44:707-11, 2003). Adicionalmente, es probable que la formación de las proteínas del complemento corriente abajo y la participación de la vía alternativa sea un factor contribuyente a la función general de las células de los islotes en la IDDM y se espera que el uso de un inhibidor del complemento reduzca el daño potencial o limite la muerte celular (Caraher, et al., J. Endocrino!. 162:143-53, 1999) . Las concentraciones circulantes de la MBL son muy elevadas en pacientes con diabetes tipo 1 en comparación con las personas sanas del grupo de control y estas concentraciones de MBL se correlacionan positivamente con la expulsión de albúmina en la orina (Hansen et al., J. Clin. Endocrinol. Metab . 88:4857-61, 2003). En un estudio clínico reciente se encontró que las frecuencia de ocurrencia de genotipos de la MBL de baja y alta expresión eran similares entre pacientes con diabetes tipo 1 y las personas sanas de control (Hansen et al., Diabetes 53:1570-76, 2004). Sin embargo, el riesgo de que entre los pacientes diabéticos se presenten nefropatias aumentaba en forma significativa cuando tenían un genotipo de alta MBL. Esto indica que los elevados niveles de MBL y la activación del complemento por la vía de la lectina pueden contribuir a la aparición de nefropatía diabética. Esta conclusión está soportada por un reciente estudio prospectivo en el que se estudió la asociación entre los niveles de la MBL y la aparición de la albuminuria en una cohorte de pacientes con diabetes tipo 1 recientemente diagnosticados (Hovind et al., Diabetes 54:1523-21, 2005). Se encontró que los elevados niveles tempranos de la MBL en la evolución de la diabetes tipo 1 estaban asociados, de manera significativa, con la posterior aparición de la albuminuria persistente. Estos resultados sugieren que la MBL y la vía de la lectina pueden estar implicadas en la patogenia específica de las complicaciones vasculares de la diabetes más que en provocar únicamente la aceleración de las alteraciones existentes. En un estudio clínico reciente (Hansen et al., Arch. Intern. Med. 166:2001-13, 2006) , se determinaron los niveles de la MBL en la línea basal en una cohorte bien caracterizada de pacientes con diabetes tipo 2 en quienes se realizó un seguimiento de más de 15 años. Se encontró que incluso después de ajustar los factores de confusión conocidos, el riesgo de muerte era bastante mayor entre pacientes con elevados niveles plasmáticos de la BL (>1000 µg/L) que entre los pacientes con bajos niveles de la MBL (<1000 µg/L) . En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que padece diabetes sin obesidad (IDDM) o que padecen las complicaciones angiopáticas , neuropáticas o retinopáticas de la IDDM o la diabetes del adulto (diabetes tipo 2) mediante la administración de una composición de un inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al paciente, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente, por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . De manera alternativa, la administración puede realizarse mediante el suministro local en el sitio de los síntomas angiopáticos , neuropáticos o retinopáticos . El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse periódicamente durante un lapso de tiempo prolongado para el tratamiento o control de una enfermedad crónica o en una sola administración o administrada en forma secuencial para el tratamiento del cuadro agudo de la enfermedad.

ADMINISTRACIÓN Y TRATAMIENTO PERIQUIMIOTERAPÉUTICO DE ENFERMEDADES CANCEROSAS La activación del sistema de complemento también puede estar implicada en las patogenias de las enfermedades cancerosas. Recientemente, se encontraron neoantígenos del complejo C5b-9 del complemento, de la IgG, del C3, del C4, de la proteína S/vitronectina, de la fibronectina y de los macrófagos en 17 muestras de cáncer de mama y en 6 muestras de tumores benignos de mama utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales y la técnica de la estreptavidina-biotina-peroxidasa . Todas las muestras de tejido con carcinoma de cada una de las etapas de TNM presentaron depósitos de C5b-9 en las membranas de las células tumorales u oncocitos, gránulos esbeltos en los remanentes celulares y depósitos difusos en las áreas necróticas (Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140: 1039-1043, 1992) . Adicionalmente, la activación del complemento puede ser consecuencia de la quimioterapia o de la radioterapia y, de este modo, la inhibición de la activación del complemento sería útil como un elemento auxiliar en el tratamiento de neoplasias malignas para reducir la inflamación iatrogénica. Cuando la quimioterapia y la radioterapia preceden a la cirugía, los depósitos de C5b-9 eran más intensos y extendidos. En todas las muestras con lesiones benignas no hubo depósitos de C5b-9. La proteína S/vitronectina estuvo presente en depósitos fibrilares en la matriz del tejido conectivo y como depósitos difusos alrededor de los oncocitos, en menor cantidad y extensión que la fibronectina . Sólo en las muestras de carcinoma se encontraron depósitos de IgG, C3 y C . La presencia de depósitos de C5b-9 es indicativa de la activación del complemento y sus posteriores efectos patogenéticos en el cáncer de mama (Niculescu, F. , et al., Mi. J. Pathol. 140:1039-1043, 1992). La terapia con láser de colorante pulsado ajustable o PTDL, por sus siglas en inglés, de 577 nm induce la coagulación de la hemoglobina y la necrosis tisular, que está limitada principalmente a los vasos sanguíneos. En un estudio en piel normal irradiada con PTDL, los descubrimientos principales fueron los siguientes: 1) en las paredes de los vasos se depositaron fragmentos de C3, C8, C9 y MAC; 2) estos depósitos no se debían a la desnaturalización de las proteínas debido a que aparecieron sólo 7 minutos después de la irradiación, al contrario de la precipitación inmediata de la transferrina en los sitios de los eritrocitos coagulados; 3) se demostró que los depósitos de C3 amplificaban la activación del complemento por la vía alternativa, una reacción que era específica debido a que la misma necrosis tisular no derivó en esta amplificación, y 4) estas reacciones precedieron a la acumulación local de leucocitos polimorfonucleares . La necrosis tisular fue más pronunciada en los hemangiomas. Los vasos angiomatosos más grandes en el centro de la necrosis no fijaron al complemento de manera significativa. En contraste, la precipitación del complemento en los vasos ubicados en la periferia fue semejante a la observada en la piel normal, con una excepción: en algunos vasos sanguíneos, el C8, el C9 y el MAC fueron detectados inmediatamente después del tratamiento con láser, un descubrimiento que es congruente con el ensamblado del MAC que se realiza directamente sin la formación de una C5 convertasa. Estos resultados indican que el complemento está activado en la necrosis vascular inducida por PTDL y puede ser el responsable de la continuación de la respuesta inflamatoria. La terapia fotodinámica (PDT por sus siglas en inglés) de tumores, provoca una intensa respuesta inmunitaria del hospedero, y una de sus manifestaciones es una marcada neutrofilia. Además de los fragmentos del complemento (mediadores directos) liberados como consecuencia de la activación del complemento inducida por PDT, existen al menos una docena de mediadores secundarios surgidos todos como resultado de la activación del complemento. Éstos últimos incluyen las citocinas IL-lbeta, TNF-alfa, IL-6, IL-10, G-CSF y KCCM, tromboxano, prostaglandinas, leucotrienos, histamina y factores de coagulación (Cecic, L., et al., Cáncer Lett. 785:43-51, 2002) . Finalmente, el uso de inhibidores de la activación del complemento dependiente de la MASP-2 pueden preverse junto con el régimen terapéutico estándar para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el tratamiento con rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico, puede asociarse con los efectos secundarios de moderados a graves de la primera dosis, de manera notable en pacientes con gran concentración de oncocitos circulantes. En estudios recientes realizados durante la primera infusión del rituximab se determinaron los productos de activación del complemento (C3b/c y C4b/c) y las citocinas (factor alfa de la necrosis tumoral o TNF-alfa) , interleucina-6 o IL-6 y la IL-8) en cinco pacientes con linfoma no hodgkiniano (o NHL) de escasa malignidad que recayeron. La infusión de rituximab indujo la rápida activación del complemento, que precede a la liberación de TNF-alfa, IL-6 e IL-8. Aunque el grupo de estudio era pequeño, el nivel de activación del complemento pareció estar correlacionado tanto con el número de células B circulantes antes dé la infusión (r = 0.85; P = 0.07) como con la gravedad de los efectos secundarios. Los resultados indicaron que el complemento tiene un papel fundamental en la patogenia de los efectos secundarios del tratamiento con el rituximab. Ya que la activación del complemento no puede evitarse con corticosteroides , en el estudio puede ser relevante la posible función de los inhibidores del complemento durante la primera administración del rituximab (van der Kolk, L. E., et al., Br. J. Haematol. 775:807-811, 2001). En otro aspecto de la invención, se presentan métodos para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto tratado con quimioterapia y/o radioterapia, que incluye sin limitación al tratamiento de enfermedades cancerosas. Este método incluye la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un paciente en forma periquimioterapéutica, es decir, antes y/o durante y/o después de la administración de las sustancias quimioterapéutica y/o de la radioterapia. Por ejemplo, la administración de la composición inhibidora de la MASP-2 de la presente invención puede comenzar antes de o concurrentemente con la administración de la quimioterapia o la radioterapia, y continuar durante toda la terapia, para reducir los efectos perjudiciales de la quimioterapia y/o la radioterapia en tejidos sanos que no son el objetivo. Además, la composición inhibidora de la MASP-2 puede administrarse después de la quimioterapia y/o la radioterapia. Se entiende que los regímenes de quimioterapia y/o radioterapia implican, con frecuencia, la repetición del tratamiento y, por tanto, es posible que la administración de una composición inhibidora de la ASP-2 también tenga que repetirse y ser relativamente coincidente con los tratamientos quimioterapéuticos y/o radioterapéuticos . También se cree que los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden utilizarse como agentes quimioterapéuticos, solos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos y/o con la radioterapia, para tratar a pacientes que tienen cáncer. La administración puede realizarse de manera adecuada por la vía oral (para no peptidérgicos ) , intravenosa, intramuscular u otra vía parenteral.

ENFERMEDADES DEL SISTEMA ENDOCRINO Al sistema de complemento también se le ha asociado en fechas recientes con algunas enfermedades o trastornos del sistema endocrino ( endocrinopatias ) , entre las que se incluyen, la tiroiditis de Hashimoto (Blanchin, S., et al., Exp. Eye Res. 73 ( 6) : 887-96, 2001), la tensión, la ansiedad y otros trastornos hormonales potenciales que implican que la pituitaria libere en forma regulada prolactina, el factor del crecimiento o del crecimiento de tipo insulina y la adrenocorticotropina (Francis, K., et al., FASEB J. 77:2266-2268, 2003; Hansen, T. K., Endocrinology 1 4 ( 12 ): 5422-9, 2003). Entre los sistemas endocrino e inmunitario existe una comunicación bidireccional que utiliza moléculas como hormonas y citocinas. Recientemente se ha dilucidado una nueva vía por la cual el C3a, una citocina derivada del complemento, estimula la liberación de hormonas de la pituitaria anterior y activa el eje hipotalámico pituitario suprarrenal, un reflejo fundamental en la respuesta al estrés y en el control de la inflamación. Los receptores de C3a se expresan en células de la pituitaria que secretan hormonas y que no secretan hormonas (folículo-estrelladas). El C3a y el C3adesArg (un metabolito no inflamatorio) estimulan los cultivos de células de pituitaria para que liberen prolactina, hormona del crecimiento y adrenocorticotropina . Los niveles séricos de estas hormonas, junto con la corticosterona suprarrenal, aumentan la dosis, dependiendo de la administración C3a y C3adesArg recombinantes in vivo. La implicación es que la vía del complemento modula las respuestas inflamatorias sistémica y específica del tejido mediante la comunicación con la glándula pituitaria endocrina (Francis, K., et al., FASEB J. 77:2266-2268, 2003). Un número cada vez mayor de estudios en animales y en humanos indican que la hormona del crecimiento o GH, por sus siglas en inglés, y el factor I del crecimiento de tipo insulina (IGF-1) modulan la función inmunitaria. La terapia con la GH aumentó la mortalidad en pacientes muy graves. La excesiva mortalidad se debió casi totalmente al choque septicémico o a una falla multiorgánica , lo que podría sugerir la participación de la modulación inducida por la GH y la función del complemento. La lectina de unión a mañana o BL es una proteína plasmática que realiza una importante función en la inmunidad innata a través de la activación de la cascada del complemento y la inflamación posterior a la unión a las estructuras glucídicas. Las pruebas sustentan la influencia significativa que la hormona del crecimiento tiene sobre los niveles de la MBL y, por lo tanto, potencialmente, sobre la activación del complemento dependiente de la lectina (Hansen, T. K., Endocrinology 144 ( 12 ): 5422-9, 2003) . La tiroperoxidasa (TPO) es uno de los principales autoantígenos participantes en las enfermedades autoinmunitarias de la tiroides. La TPO está formada por un gran módulo de tipo mieloperoxidasa del extremo N seguido de un módulo de tipo proteína de control del complemento (o CCP, por sus siglas en inglés) y un módulo de tipo factor de crecimiento epidérmico. El módulo CCP es un constituyente de las moléculas participantes en la activación del componente C4 del complemento, de modo que se realizaron estudios para investigar si el C4 puede unirse a la TPO y activar la vía del complemento en enfermedades autoinmunitarias. La TPO a través de su módulo CCP activa directamente al complemento sin mediación de la Ig. Por otra parte, en pacientes con la tiroiditis de Hashimoto, los tirocitos sobreexpresan al C4 y a todos los componentes corriente abajo de la vía del complemento. Estos resultados indican que la TPO, junto con otros mecanismos relacionados con la activación de la vía del complemento, puede contribuir a la destrucción celular masiva observada en la tiroiditis de Hashimoto (Blanchin, S., et al., 2001). Un aspecto de la invención presenta así un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 para tratar una endocrinopatía al administrarle a un sujeto que padece dicho trastorno una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico. Los padecimientos sujetos a tratamiento de conformidad con la presente invención incluyen, a manera de ejemplo no limitante, tiroiditis de Hashimoto, estrés, ansiedad y otros trastornos hormonales potenciales que incluyen la liberación regulada de prolactina, del factor de crecimiento o factor de crecimiento tipo insulina y de la adrenocorticotropina de la pituitaria. El agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse sistémicamente al paciente, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, nasal, por inhalación, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente, por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . La composición del agente inhibidor de la MASP-2 puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La administración puede repetirse según lo determine el médico hasta que la enfermedad haya desaparecido .

ENFERMEDADES OFTÁLMICAS La degeneración macular relacionada con la edad o AMD, por sus siglas en inglés, es una enfermedad que produce ceguera y que aflige a millones de adultos, a pesar de lo cual, es aún muy poco el conocimiento que se tiene de las secuelas bioquímicas, celulares y/o de la actividad molecular que desembocan en la génesis de la AMD. La AMD deriva en la destrucción progresiva de la mácula, lo que ha sido correlacionado con la formación de depósitos extracelulares , llamados drusas o drusen, que se ubican en y alrededor de la mácula, detrás de la retina y entre el epitelio pigmentario retiniano o EPR, por sus siglas en inglés, y el coroide. Estudios recientes han revelado que entre los constituyentes asociados a las drusas predominan las proteínas asociadas a la inflamación y a los procesos mediados por el sistema inmunitario. En las células retínales, del RPE y coroidales se han detectado transcriptos que codifican varias de estas moléculas. Esta información también demuestra que las células dendríticas, que son potentes presentadoras de antígeno, están íntimamente asociadas a la formación de las drusas y que la activación del complemento es una vía clave que está activa tanto dentro de las drusas como a lo largo de la interfaz RPE-coroide (Hageman, G. S., et al., Prog. Retin. Eye Res., 20:705-732, 2001). Varios estudios independientes han demostrado que hay una fuerte asociación entre la AMD y un polimorfismo genético en el gen del factor H del complemento (CFH) en el que la probabilidad de la AMD aumenta en un factor de 7.4 en personas homocigoto del alelo del riesgo (Klein, R. J. et al., Science, 308:362-364, 2005; Haines et al., Science 308:362-364, 2005; Edwards et al., Science 308:263-264, 2005). El gen del CFH ha sido localizado en el cromosoma lq31, una región a la que se había implicado en la AMD por seis barridos de vinculación independientes (ver, por ejemplo, D. W.

Schultz et al., Hum. Mol. Genet. 72:3315, 2003). Se sabe que el CFH es un importante regulador del sistema de complemento. Se ha demostrado que el CFH en las células y en la circulación regula la actividad del complemento al inhibir la activación del C3 en C3a y C3b y al desactivar el C3b existente. Se ha observado precipitación del C5b-9 en la membrana de Brusch, en las columnas intercapilares y dentro de las drusas de pacientes con AMD (Klein et al . ) . Los experimentos con inmunofluorescencia sugieren que en la AMD, el polimorfismo del CFH puede dar lugar a la precipitación del complemento en vasos y en capilares coroidales (Klein et al . ) . El inhibidor del complemento asociado a la membrana, el receptor 1 del complemento, también está ubicado en las drusas, pero no es detectado inmunohistoquimicamente en las células del RPE. En contraste, en las células asociadas a las drusas está presente un segundo inhibidor del complemento asociado a la membrana, la proteína del cofactor de membrana, tanto como en los pequeños elementos subestructurales esféricos dentro de las drusas. Estos elementos no identificados previamente también muestran una intensa inmunorreactividad con los fragmentos proteolíticos del componente C3 del complemento, que de manera característica, se depositan en los lugares de la activación del complemento. Se propone que estas estructuras representan restos de residuos de la degeneración de las células del RPE que son los objetivos del ataque del complemento (Johnson, L. V., et al., Exp. Eye Res. 73:887-896, 2001). La identificación y localización de éstos diversos reguladores del complemento, tanto como de los productos de la activación del complemento (C3a, C5a, C3b, C5b-9) ha llevado a que los investigadores concluyan que la activación crónica del complemento desempeña una importante función en el proceso de la biogénesis de las drusas y la etiología de la AMD (Hageman et al., Progress Retinal Eye Res. 20:705-32, 2001). La identificación de los productos C3 y C5 de la activación en las drusas no aportó conocimientos adicionales en cuanto a que el complemento se active a través de la vía clásica, de la vía de la lectina o el bucle de amplificación alternativo, como se entiende de conformidad con la presente invención, debido a que tanto el C3 como el C5 son comunes a las tres. Sin embargo, en dos estudios se ha buscado el inmunomarcaj e de las drusas utilizando anticuerpos específicos del Clq, el componente de reconocimiento esencial para la activación de la vía clásica (Mullins et al., FASEB J. 74:835-846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70:441-449, 2000). Los dos estudios concluyeron que, en general, no se observó el inmunomarcaj e con Clq. Estos resultados negativos con el Clq sugieren que la activación del complemento en las drusas no se realiza por la vía clásica. Adicionalmente , en el estudio de Mullins et al., 2000, se informa que el inmunomarcaj e de los constituyentes del inmunocomplej o (cadenas ligeras de la IgG, IgM) en las drusas es de débil a variable, lo que además indica que la vía clásica realiza una función menor en la activación del complemento que se presenta en este estado patológico. Dos estudios de reciente publicación han evaluado el papel del complemento en la aparición de la neovascularización coroidal inducida con láser o CNV en ratones, un modelo de la CNV humana. Bora y sus colegas (2005) utilizando métodos inmunohistológicos encontraron importantes depósitos de los productos C3b y C5b-9 (MAC) de la activación del complemento en el complejo neovascular después del tratamiento con láser (Bora et al., J. Immunol. 174:491-1, 2005). De manera importante, la CNV no ocurrió en ratones con deficiencia genética de C3 (ratones C3 (-/-)), el componente esencial necesario en todas las vías de activación del complemento. Los niveles de VEGF, TGF~ 2 y ß-FGF en el ARN mensajero, tres factores angiogénicos implicados en la CNV, eran elevados en el tejido ocular de los ratones después de la CNV inducida con láser. El agotamiento del complemento derivó, significativamente, en una notable reducción en los niveles de éstos factores angiogénicos. Usando métodos de ELISA, Nozaki y sus colegas demostraron que las potentes anafilatoxinas C3a y C5a se generaron tempranamente durante la CNV inducida con láser (Nozaki et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 103:2328-33, 2006) . Además, estos dos fragmentos bioactivos de C3 y C5 indujeron la expresión del VEGF después de la inyección intravitrea en ratones silvestres. En congruencia con estos resultados, Nozaki y sus colegas también demostraron que la ablación genética de los receptores de C3a y de C5a reduce la expresión del VEGF y la formación de la CNV después de la lesión por láser y que la neutralización, mediada con anticuerpos, del C3a o del C5a o el bloqueo farmacológico de sus receptores también reduce la CNV . Estudios anteriores han mostrado que la incorporación de leucocitos, y macrófagos en particular, juega un papel fundamental en la CNV inducida con láser (Sakurai et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3578-85, 2003; Espinosa-Heidmann, et al., Invest. Opthomol. Vis. Sci. 44:3586-92, 2003) . En su articulo de 2006, Nozaki y colegas informaron que la incorporación de leucocitos se redujo notablemente en ratones C3aR(-/-) y C5aR(-/-) después de la lesión con láser . Un aspecto de la invención presenta asi un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 para tratar la degeneración macular relacionada con la edad u otra enfermedad oftálmica mediada por el complemento mediante la administración de una composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 en un vehículo farmacéutico a un sujeto que padece esta enfermedad u otra enfermedad oftálmica mediada por el complemento. La composición inhibidora de la MASP-2 puede administrarse al ojo en forma local, como por ejemplo, por medio de la irrigación o la aplicación de la composición en forma de gel, bálsamo o gotas. En forma alternativa, el agente inhibidor de la MASP-2 puede administrarse en forma sistémica al paciente, por ejemplo, por las vías intraarterial , intravenosa, intramuscular, nasal, por inhalación, subcutánea u otra vía de administración parenteral o, potencialmente, por la vía oral en caso de agentes no peptidérgicos . La composición del agente inhibidor de la MASP-2 puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales, como los que se describen en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. Núm. 2004-0072809-A1. La administración puede repetirse según lo determine el médico hasta que la enfermedad haya desaparecido o esté controlada.

IV. AGENTES INHIBIDORES DE LA MASP-2 En un aspecto, la presente invención presenta métodos para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento, dependiente de la MASP-2. Los agentes inhibidores de la MASP-2 se administran en una cantidad eficaz para inhibir en un sujeto vivo la activación del complemento dependiente de la MASP-2. Al poner en práctica este aspecto de la invención, los agentes inhibidores de la MASP-2 representativos incluyen: moléculas que inhiben la actividad biológica de la MASP-2 (por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos anti-MASP-2 o péptidos bloqueadores que interactúan con la MASP-2 o que interfieren con una interacción proteína-proteína) y moléculas que disminuyen la expresión de la MASP-2 (tales como moléculas de ácido nucleico antisentido MASP-2, moléculas de ARNi especificas de la MASP-2 y ribozimas de MASP-2), evitando asi que la MASP-2 active las vías alternativas del complemento. Los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden usarse solos como una terapia principal o combinados con otros elementos terapéuticos como terapia coadyuvante para aumentar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos. La inhibición de la activación del complemento dependiente de la MASP-2 se caracteriza porque como resultado de la administración de un agente inhibidor de la MASP-2 de conformidad con los métodos de la invención, tiene lugar al menos uno de los siguientes cambios en uno de los componentes del sistema de complemento: la inhibición de la generación o la producción de los productos C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) del sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2 (determinada, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), la reducción de la activación del complemento por la vía alternativa evaluada en un análisis hemolitico utilizando eritrocitos de conejo o de cobayo no sensibilizados, la reducción de la escisión del C4 y de la precipitación del C4b (determinada, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2) o la reducción de la escisión de C3 y de la precipitación de C3b (determinada, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2) . De conformidad con la presente invención, los agentes inhibidores de la MASP-2 que se utilizan son eficaces para inhibir al sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2. Los agentes inhibidores de la MASP-2 útiles para poner en práctica este aspecto de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-MASP-2 y fragmentos de los mismos, péptidos inhibidores de la MASP-2, moléculas pequeñas, receptores solubles de la MASP-2 e inhibidores de la expresión. Los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2 al bloquear la función biológica de la MASP-2. Por ejemplo, un agente inhibidor puede bloquear con eficacia las interacciones de la proteina MASP-2 con otras proteínas, interferir con la dimerización o ensamblado de la MASP-2, bloquear la unión con Ca2+, interferir con el sitio activo de la MASP-2 serina proteasa, o puede disminuir la expresión de la proteína MASP-2. En algunas modalidades, los agentes inhibidores de la MASP-2 inhiben selectivamente la activación del complemento por la MASP-2, dejando intacta la funcionalidad del sistema de la activación del complemento que depende de Clq. En una modalidad, un agente inhibidor de la MASP-2 útil en los métodos de la invención es un agente inhibidor de la MASP-2 específico que específicamente se une a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6 con una afinidad al menos 10 veces mayor que la de otros antigenos del sistema de complemento. En otra modalidad, un agente inhibidor de la MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6 con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que la de otros antígenos del sistema de complemento. La afinidad de unión del agente inhibidor de la MASP-2 puede determinarse utilizando una prueba de unión adecuada. El polipéptido MASP-2 tiene una estructura molecular semejante a la de la MASP-1, MASP-3 y a la de Clr y Cls, las proteasas del sistema de complemento Cl. La molécula de ADNc presentada en SEQ ID NO : 4 codifica un ejemplo representativo de la MASP-2 (constituido por la secuencia de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO: 5) y suministra el polipéptido MASP-2 humano con una secuencia líder (aa 1-15) que es escindido después de la secreción, derivando en la forma madura de la MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6) . Como se muestra en la figura 2, el gen de la MASP-2 humana incluye doce exones. El ADNc de la MASP-2 humana es codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. Un empalme alternativo produce una proteína de 20 kDa denominada proteína 19 asociada a la MBL (la "MAp 19", también llamada "sMAP") (SEQ ID NO:2), codificada por (SEQ ID NO:l) que se origina a partir de los exones B, C, D y E, como se muestra en la figura 2. La molécula de ADNc presentada en SEQ ID NO: 50 codifica la MASP-2 de múrido (constituida por la secuencia de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO: 51) y suministra el polipéptido MASP-2 de múrido con una secuencia líder que es escindida después de la secreción, derivando en la forma madura de la MASP-2 de múrido (SEQ ID NO:52). La molécula de ADNc presentada en SEQ ID NO: 53 codifica la MASP-2 de rata (constituida por la secuencia de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO: 54) y suministra el polipéptido MASP-2 de rata con una secuencia líder que es escindida después de la secreción, derivando en la forma madura de la MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 55) . Quienes tienen experiencia en la técnica reconocerán que las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 4, en SEQ ID NO: 50 y en SEQ ID NO: 53 representan alelos sencillos de la MASP-2 de humano, de múrido y de rata, respectivamente, y que se espera que ocurra su variante alélica y su empalme alternativo. Las variantes alélicas de las secuencias de los nucleótidos mostrados en la SEQ ID N0:4, en la SEQ ID NO:50 y en la SEQ ID NO:53, incluidas las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones producen cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la invención. Las variantes alélicas de la secuencia de la MASP-2 pueden clonarse al explorar el ADNc o las genotecas genómicas de diferentes individuos de conformidad con los procedimientos estándar. Los dominios de la proteina ASP-2 de humano (SEQ ID NO: 6) se muestran en la figura 3A e incluyen un dominio (aa 1-121 de la SEQ ID NO: 6) de la proteina morfogénica Clr/Cls/Vegf de erizo de mar/hueso (CUBI) N terminal, un dominio de tipo factor de crecimiento epidérmico (aa 122-16), un segundo dominio CUBI (aa 167-293), asi como una serie de dominios de la proteina de control del complemento y un dominio de serina proteasa. El empalme alternativo del gen MASP 2 deriva en la MApl9 mostrada en la figura 3B. La MApl9 es una proteina no enzimática que contiene la región CUB1-EGF N terminal de la MASP-2 con cuatro residuos adicionales (EQSL) derivados del exón E, como se muestra en la figura 2. Se ha demostrado que varias proteínas se unen a (o interactúan con) la MASP-2 mediante interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, se sabe que la MASP-2 se une a las proteínas de la lectina MBL, H-ficolina y L-ficolina y con éstas forma complejos dependientes del Ca2+. Se ha demostrado que cada complejo MASP-2/lectina activa el complemento mediante la escisión, dependiente de la MASP-2, de las proteínas C4 y C2 (Ikeda, K. , et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 776:1497-2284, 2000; Matsushita, . , et al., J. Immunol. 768:3502-3506, 2002). Los estudios han mostrado que los dominios de CUB1-EGF de la MASP-2 son esenciales para la asociación de la MASP-2 con la MBL (Thielens, N . M . , et al., J. Immunol. 766:5068, 2001) . También han mostrado que los dominios median en la dimerización de la MASP-2, lo cual es necesario para la formación de un complejo de MBL activo (Wallis, R. , et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000) . Por lo tanto, los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden identificarse porque se unen a o interfieren con las regiones objetivo de la MASP-2 que se sabe son importantes para la activación del complemento dependiente de la MASP-2.

ANTICUERPOS ANTI-MASP-2 En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el agente inhibidor de la MASP-2 contiene un anticuerpo anti-MASP-2 que inhibe al sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2. Los anticuerpos anti-MASP-2 útiles en este aspecto de la invención incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales o recombinantes derivados de cualquier mamífero que produzca anticuerpos y pueden ser multiespecí fieos , quiméricos, humanizados, anti-idiotipo y fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen a los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab)2, F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos scFv y a anticuerpos de una sola cadena como se describirá adicionalmente más adelante. En la literatura se han descrito varios anticuerpos anti-MASP-2, algunos de ellos se enumeran más adelante en la Tabla 1. Los anticuerpos anti-MASP-2 previamente descritos pueden seleccionarse por su capacidad para inhibir al sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2 utilizando las técnicas analíticas que se describen aquí. Por ejemplo, se ha identificado que los anticuerpos anti-rata MASP-2 Fab2 bloquean la activación del complemento dependiente de la MASP-2, descritos con mayor detalle en los Ejemplos 24 y 25 de este documento. Una vez que se identifica que un anticuerpo anti-MASP-2 funciona como agente inhibidor de la MASP-2, puede ser utilizado para producir anticuerpos anti-idiotipo y usarse para identificar a otras moléculas de unión a la MASP-2, como se describe más adelante.

Tabla 1: ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE LA MASP-2 (DE LA LITERATURA) ANTÍGENO TIPO DE ANTICUERPO REFERENCIA MASP-2 Policlonal de rata Peterson, S. V., et al., Mol.

Recombinante Immunol. 37:803-811, 2000.

Fragmento CCP1/2- MoAb (subclase IgGl) Moller-Kristensen, M. , et SP recombinante de rata al., J. of Immunol. Methods de humano (MoAb 282:159-167, 2003. 8B5) MA.pl9 MoAb (subclase IgGl) Moller-Kristensen, M. , et recombinante de de rata al . , J. of Immunol . Methods humano (MoAb 282:159-167, 2003. 6G12) (reacciona en forma cruzada con la MASP-2) hMASP-2 MoAb de ratón (S/P) Peterson, S. V., et al., Mol. MoAb de ratón (extremo Immunol. 35:409, abril 1998. N) hMASP-2 (dominio MoAb de rata: CCP1-CCP2-SP) NimoablOl, producido WO 2004/106384 por la línea celular de hibridoma 03050904 (ECACC) hMASP-2 (his MoAbs de múrido: marcado de WO 2004/106384 longitud NimoAbl04 , producido completa) por la línea celular de hibridoma M0545YM035 (DSMZ) NimoAbl08, producido por la línea celular de hibridoma M0545YM029 (DSMZ) NimoAbl09, producido por la línea celular de hibridoma M0545YM046 (DSMZ) NimoAbllO, producido por la línea celular de hibridoma M0545YM048 (DSMZ) ANTICUERPOS ANTI-MASP-2 CUYA FUNCIÓN EFECTORA ESTÁ DISMINUIDA En algunas modalidades de este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-MASP-2 tienen una función efectora disminuida con la finalidad de reducir la inflamación que puede originarse de la activación de la vía clásica del complemento. Se ha demostrado que la capacidad de las moléculas IgG para disparar la vía clásica del complemento se encuentra en la porción Fe de la molécula (Duncan, A. R., et al., Nature 332:738-740 1988). Las moléculas IgG a las que, por escisión enzimática, se les ha eliminado la porción Fe, carecen de esta función efectora (ver Harlow, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). En consecuencia, como resultado de la falta de la porción Fe de la molécula, pueden generarse anticuerpos con función efectora disminuida al contar con una secuencia Fe genéticamente manipulada que minimiza la función efectora, o al ser ya sea la IgG2 de humano o el isotipo IgG4. Pueden producirse anticuerpos cuya función efectora esté disminuida, mediante la manipulación biológico-molecular estándar de la porción Fe de las cadenas pesadas de la IgG, como se describe en el Ejemplo 9 de la presente y descrito también en Jolliffe, et al., Int'l Rev. Immunol. 70:241-250, 11993 y en Rodrigues, et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998. Los anticuerpos con función efectora disminuida también incluyen a los isotipos IgG2 e IgG4 de humano con capacidad disminuida para activar el complemento y/o para interactuar con los receptores de Fe (Ravetch, J. V., et al., Annu . Rev. Immunol. 9:457-492, 1991/ Isaacs, J. D., et al., J. Immunol. 148:3062-3011, 1992; van de Winkel, J. G., et al., Immunol. Today 74:215-221, 1993). Los anticuerpos humanizados o totalmente de humano específicos de la MASP-2 de humano constituidos por los isotipos IgG2 o IgG4 pueden ser producidos por alguno de los varios métodos conocidos por cualquiera que tenga experiencia en la técnica, como se describe en Vaughan, T. J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-MASP-2 Los anticuerpos anti-MASP-2 pueden ser producidos utilizando polipéptidos MASP-2 (por ejemplo, MASP-2 de longitud completa) o utilizando péptidos portadores del epítopo de MASP-2 antigénicos (por ejemplo, una porción del polipéptido de MASP-2). Los péptidos inmunogénicos pueden ser pequeños, por ejemplo, de cinco residuos de aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido MASP-2 que incluye toda la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 puede ser utilizado para inducir los anticuerpos anti-MASP-2 útiles en el método de la invención. Los dominios de MASP-2 particulares que se sabe participan en las interacciones proteina-proteina, como por ejemplo, los dominios CUBI y CUBIEGF, asi como la región que incluye al sitio activo serina-proteasa, pueden expresarse como los polipéptidos recombinantes que se describen en el Ejemplo 5 y utilizarse como antigenos. Además, los péptidos que contienen una porción de al menos 6 aminoácidos del polipéptido MASP-2 (SEQ ID NO: 6) también son útiles para inducir anticuerpos anti-MASP-2. En la Tabla 2 se presentan algunos ejemplos más de los antigenos derivados de la MASP-2 útiles para inducir los anticuerpos MASP-2. Los péptidos y polipéptidos MASP-2 utilizados para formar los anticuerpos pueden aislarse como polipéptidos naturales o como péptidos recombinantes o sintéticos e inactivar, catalíticamente, a los polipéptidos recombinantes, tales como la MASP-2A, como se describirá adicionalmente en los Ejemplos 5-7. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-MASP-2 se obtienen mediante una cepa de ratón transgénico, como se describe adelante y en los Ejemplos 8 y 9. Los antígenos útiles para producir anticuerpos anti-MASP-2 también incluyen polipéptidos de fusión, como por ejemplo, las fusiones de la MASP-2 o de una porción de la misma con un polipéptido de inmunoglobulina o con proteína de unión a maltosa. El inmunogen polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es de tipo hapteno, esta porción puede estar ventajosamente unida o ligada a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana o KLH, albúmina de suero de bovino o BSA o toxoide tetánico) para la inmunización.

Tabla 2: ANTÍGENOS DERIVADOS DE LA MASP-2 SEQ ID NO: Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 Proteína MASP-2 de humano SEQ ID NO: 51 Proteína MASP-2 de múrido SEQ ID NO: 8 Dominio CUBI de la MASP-2 de humano (aa 1-121 de la SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 9 Dominios CUBIEGF de la MASP-2 de humano (aa 1-166 de la SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 10 Dominios CUBIEGFCUBII de la MASP-2 de humano (aa 1-293 de la SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 11 Dominio EGF de la MASP-2 de humano (aa 122-166 de la SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 12 Dominio serina proteasa de la MASP-2 de humano (aa 429-671 de la SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 13 Forma mutante inactivada de la serina proteasa (aa GKDSCRGDAGGALVFL 610-625 de la SEQ ID NO: 6 con Ser 618 mutada) SEQ ID NO: 14 Péptido CUBI de humano TPLGPKWPEPVFGRL SEQ ID NO: 15: Péptido CUBI de humano TAPPGYRLRLYFTHFDLEL SHLCEYDFVKLSSGAKVL ATLCGQ SEQ ID NO: 16: Región de unión con la MBL del dominio CUBI de TFRSDYSN humano SEQ ID NO: 17: Región de unión con la MBL del dominio CUBI de FYSLGSSLDITFRSDYSNEK humano PFTGF SEQ ID NO: 18 Péptido EGF IDECQVAPG SEQ ID NO: 19 Péptido del sitio activo de la serina proteasa ANMLCAGLESGGKDSCRG DSGGALV ANTICUERPOS POLICLONALES Los anticuerpos policlonales contra la MASP-2 pueden prepararse inmunizando un animal con el polipéptido MASP-2 o con una porción inmunogénica de la misma utilizando métodos bien conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, "Production of Polyclonal Antisera" de Green et al. en " Immunochemical Protocols" (Manson, ed.), página 105, y lo que se describirá adicionalmente en el Ejemplo 6. La inmunogenicidad de un polipéptido MASP-2 puede aumentarse con el uso de un adyuvante, entre los que se incluyen geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund (completo o incompleto) , sustancias con superficie activa, como por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol . Los anticuerpos policlonales se cultivan, normalmente, en animales, tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayos, cabras o borregos. Alternativamente, un anticuerpo anti-MASP-2 útil en la presente invención también puede derivarse de un primate subhumano. Técnicas generales para cultivar anticuerpos útiles para fines diagnósticos y terapéuticos en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en la publicación internacional de patente número WO 91/11465 de Goldenberg et al. y en Losman, M. J., et al., Int. J. Cáncer 46:310, 1990. Entonces, a partir de la sangre de estos animales inmunizados se producen sueros que contienen anticuerpos inmunológicamente activos, utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica.

ANTICUERPOS MONOCLONALES En algunas modalidades, el agente inhibidor de la MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2. Los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 son muy específicos y están dirigidos contra un solo epítopo de MASP-2. Como se utiliza en la presente, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, como se obtiene de una población de anticuerpos esencialmente homogénea y no deberá interpretarse que el anticuerpo necesita ser producido con algún método particular. Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse utilizando cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo por medio de líneas celulares continuas en cultivo, tales como el método del hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse con métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de EE . UU . Núm. 4, 816, 567, de Cabilly) . Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de colecciones de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas que se describen en Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991.

Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, entre las que se incluyen IgG, IgM, IgE, IgA e IgD y cualquier subclase de éstas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse al inyectarle a un mamífero adecuado (por ejemplo, un ratón BALB/c) una composición que contiene un polipéptido MASP-2 o una porción del mismo. Después de un periodo de tiempo predeterminado, se retiran del ratón los esplenocitos y se suspenden en un medio de cultivo celular. Los esplenocitos se fusionan entonces con una línea celular continua para formar un hibridoma . Los hibridomas formados se desarrollan en el cultivo celular y se seleccionan según su capacidad para producir un anticuerpo monoclonal contra la MASP-2. En el Ejemplo 7 se presenta otro ejemplo que describe la producción de anticuerpos monoclonales anti-MASP-2. (Ver también Current Protocole in Immunology, Vol . I, John Wiley & Sons, páginas 2.5.1-2.6.7, 1991). Los anticuerpos monoclonales de humano pueden obtenerse utilizando ratones transgénicos que han sido genéticamente manipulados para producir anticuerpos específicos de humano en respuesta a la exposición a los antígenos. En esta técnica, los elementos de los sitios (locus) de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana se introdujeron en cepas de ratones derivadas de líneas celulares troncales embrionarias que tienen alteraciones dirigidas de los sitios (locus) de la cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, como por ejemplo, los antígenos de la MASP-2 que se describen aquí, y los ratones pueden utilizarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos de la MASP-2 de humano al fusionar células B de estos animales con líneas celulares de mieloma adecuadas utilizando la tecnología convencional de Kohler-Milstein, como se describe en el Ejemplo 7. Los ratones transgénicos con el genoma de la inmunoglobulina humana pueden adquirirse en el comercio (por ejemplo, de Abgenix, Inc., Fremont, CA. y de Medarex Inc., Annandale, N. J. ) Los métodos para obtener anticuerpos de humano a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, en Green, L. L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; y Taylor, L. D., et al., Int. Immun. 6:519, 1994. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridoma utilizando una variedad de técnicas bien establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía por afinidad con proteína-A sepharose, la cromatografía por exclusión de tamaño y la cromatografía por intercambio iónico (ver, por ejemplo, las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3 de Coligan; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" en Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, páginas 79-104, 1992). Una vez producidos, a los anticuerpos policlonales , monoclonales o derivados de fagos se les prueba primero su especificidad de unión con MASP-2. Con la finalidad de detectar aquellos anticuerpos que se unen específicamente a la MASP-2 puede utilizarse una variedad de técnicas analíticas conocidas por quienes tienen experiencia en la técnica. Algunos análisis ilustrativos incluyen: transferencia Western o análisis por inmunoprecipitación con métodos estándar (por ejemplo, como se describe en Ausubel et al.), inmunoelectroforésis , análisis con inmunoadsorbente unido a enzima (ELISA) , análisis de transferencia en mancha, análisis de inhibición o competencia y análisis inmunorradiométrico de intercalación ("sandwich assay") (como se describe en Harlow & Land, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Una vez que se ha identificado que los anticuerpos se unen específicamente a la MASP-2, con alguno de los diferentes ensayos, como por ejemplo, el ensayo de escisión de C4 específico de la lectina (descrito en el Ejemplo 2), el análisis de precipitación de C3b (descrito en el Ejemplo 2) o el análisis de precipitación de C4b (descrito en el Ejemplo 2) se prueba la capacidad de los anticuerpos anti-MASP-2 para funcionar como inhibidor de la MASP-2.

La afinidad de los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 puede ser fácilmente determinada por cualquiera que tenga habilidad ordinaria en la técnica (ver, por ejemplo, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 57:660-672, 1949). En una modalidad, los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 útiles en los métodos de unión a la MASP-2 de la invención que tienen una afinidad de unión de <100 nM, preferentemente, <10 nM y con la máxima preferencia <2 nM.

ANTICUERPOS QUIMÉRICOS/HUMANIZADOS Los anticuerpos monoclonales útiles en el método de la invención incluyen anticuerpos quiméricos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertence a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como a los fragmentos de estos anticuerpos (patente de EE.UU. Núm. 4,816,567, de Cabilly y Morrison, S. L., et al., Proc . Nat'lAcad. Sci. USA 87 : 6851-6855, 1984) . Una forma de anticuerpo híbrido útil en la invención es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humanizado. Las formas humanizadas de anticuerpos que no son de humano (por ejemplo, de múrido) son anticuerpos quiméricos, los cuales contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen al transferir las regiones que determinan la complementariedad (también llamadas CDR) no humana (por ejemplo, de ratón), de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Por lo regular, los residuos de anticuerpos de humano se sustituyen entonces en las regiones estructurales de las contrapartes no humanas. Por otra parte, los anticuerpos humanizados pueden contener residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donador. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado contendrá esencialmente al menos un dominio completo y, normalmente, dos dominios variables, en los cuales, todos o esencialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones estructurales Fv son las de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado también contendrá, opcionalmente , al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente, la de una inmunoglobulina de humano. Para consultar detalles adicionales, ver Jones, P. T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L . , et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992. Los anticuerpos humanizados útiles en la invención incluyen anticuerpos monoclonales de humano que al menos incluyen una región CDR3 de unión a MASP-2. Adicionalmente , las porciones Fe pueden ser sustituidas de modo tal que produzcan tanto IgA o IgM como anticuerpos IgG de humano. Estos anticuerpos humanizados tendrán una particular utilidad clínica debido a que reconocerán específicamente a la MASP-2 de humano, pero no provocarán en seres humanos una respuesta inmunitaria contra este mismo anticuerpo. En consecuencia, están mejor adaptadas para la administración in vivo en seres humanos, en especial, cuando es necesario administrar dosis repetidas o de largo plazo. En el Ejemplo 10 de este documento se presenta un ejemplo de la generación de un anticuerpo anti-MASP-2 humanizado a partir de un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 de múrido. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados también se describen, por ejemplo, en Jones, P. T., et al., Nature 321:522, 1986; Cárter, P., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J. S., Crit . Rev. Biotech. 72:437, 1992; Singer, I. I., et al., J. Immun. 750:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., páginas 399-434, 1996; y en la patente de EE. UU. Núm. 5, 693,762 de Queen, 1997. Por otra parte, existen algunas entidades comerciales que sintetizarán anticuerpos humanizados a partir de regiones de anticuerpos de múrido, como por ejemplo, Protein Design Labs (Mountain View, CA) .

ANTICUERPOS RECOMBINANTES Los anticuerpos anti-MASP-2 también pueden preparase utilizando métodos recombinantes . Por ejemplo, los anticuerpos de humano pueden prepararse utilizando colecciones de expresión de inmunoglobulina (que pueden obtenerse de, por ejemplo, Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para producir fragmentos de anticuerpos de humano (VH, VL, Fv, Fd, Fab or F(ab' ) 2> « Estos fragmentos se utilizan entonces para fabricar anticuerpos enteros de humano utilizando técnicas semejantes a las que se usan para producir anticuerpos híbridos.

ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPO Una vez que se ha identificado a los anticuerpos anti- ASP-2 que tienen la actividad inhibidora, estos anticuerpos pueden ser utilizados para generar, utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica, anticuerpos anti-idiotipo que se parecen a una porción de la MASP-2. Ver, por ejemplo, Greenspan, N. S., et al., FASEB J. 7:437, 1993. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a la MASP-2 y que inhiben por competencia la interacción con la proteina MASP-2 necesaria para la activación del complemento pueden ser utilizados para generar anti-idiotipos que se parecen al sitio de unión de la MBL en la proteina MASP-2 y, por lo tanto, se unen a un ligando de unión de la MASP-2 como por ejemplo, la MBL, y lo neutralizan.

FRAGMENTOS DE INMUNOGLOBULINA Los agentes inhibidores de la MASP-2 útiles en 'el método de la invención incluyen no solo moléculas intactas de inmunoglobulina , sino también los fragmentos bien conocidos que incluyen a los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab)2f F(ab' )2 y Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespeci fieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Es bien sabido en la técnica que sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el parátopo, está implicada en la unión del anticuerpo con su epitopo (ver, por ejemplo, Clark, W. R. , The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Las regiones pFc' y Fe del anticuerpo son efectores de la vía clásica del complemento, pero no están implicadas en la unión con el antígeno. Un anticuerpo al que se le ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que ha sido producido sin la región pFc', se le denomina fragmento F(ab' )2 y conserva los dos sitios de unión con el antígeno de un anticuerpo intacto. A un fragmento F(ab' )2 se le denomina fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión con antígeno. De manera similar, a un anticuerpo al que se le ha escindido enzimáticamente la región Fe, o que ha sido producido sin la región Fe, se le denomina fragmento Fab y conserva uno de los sitios de unión con el antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse por medio de hidrólisis proteolítica , como por ejemplo, por digestión de los anticuerpos completos con pepsina o papaína de los métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos por la escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab' )2- Este fragmento puede escindirse aún más con un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse con un grupo bloqueador de los grupos sulfhidrilo que resulte de la escisión de los enlaces disulfuro. En forma alternativa, la escisión enzimática con pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y, directamente, un fragmento Fe. Estos métodos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. Núm. 4,331,647 de Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys . 89:230, 1960; Porter, R. R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., en Methods in Enzymology, 1:422, Academic Press, 1967; y en Coligan, páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. En algunas modalidades, se prefiere usar fragmentos de anticuerpo que carecen de la región Fe para evitar la activación de la via clásica del complemento, la cual se inicia cuando el Fe se une al receptor de Fcy. Hay varios métodos por medio de los cuales se puede producir un MoAb que evita las interacciones con el receptor de Fcy. Por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo monoclonal puede - eliminarse con métodos químicos utilizando la digestión parcial con enzimas proteolíticas (como la digestión con ficina) , generando así, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de unión con antígeno, tales como los fragmentos Fab o F(ab)2 (Mariani, . , et al., Mol. Immunol. 28:69-11, 1991). En forma alternativa, durante la fabricación de un anticuerpo humanizado, como se describe en la presente, puede utilizarse el isotipo ?4 IgG humano, que no se une a receptores Fcy. Los anticuerpos, los anticuerpos de una sola cadena y los dominios de unión con antígeno que carecen del dominio Fe también pueden ser genéticamente manipulados utilizando las técnicas recombinantes aquí descritas.

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO DE UNA SOLA CADENA Alternativamente, es posible crear moléculas de unión con una cadena peptidica sencilla especifica de la MASP-2 en la que las regiones Fv de la cadena pesada y ligera están conectadas. Los fragmentos Fv pueden conectarse por medio de un conector peptidico para formar una proteina de unión con antigeno de una sola cadena o scFv. Estas proteínas de unión con antígeno de una sola cadena se preparan cuando se construye un gen estructural que contiene secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL que están conectados por un oligonucleótido . El gen estructural se inserta en un vector de expresión, el cual se introduce posteriormente en una célula hospedera, como por ejemplo, E. coli. Las células hospederas recombinantes sintetizan una cadena polipeptídica sencilla con un péptido conector que establece un puente entre los dos dominios V. Los métodos para producir scFvs se describen, por ejemplo, en Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; patente de EE . UU . Núm. 4, 946, 778, de Ladner; Pack, P., et al., Bio/'Technology 11:1271, 1993. Como ejemplo ilustrativo, puede obtenerse un scFv específico de MASP-2 al exponer in vitro a linfocitos ante el polipéptido MASP-2 y al seleccionar colecciones exhibidoras de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, al utilizar proteina o péptido ASP-2 inmovilizado o marcado) . Los genes que codifican polipéptidos que tienen dominios de unión con polipéptido MASP-2 potenciales pueden ser obtenidos rastreando colecciones aleatorias de péptidos exhibidas en el fago o en bacterias tales como E. coli. Estas colecciones aleatorias exhibidoras de péptidos pueden ser utilizadas para seleccionar péptidos que interactúen con la MASP-2. Las técnicas para crear y seleccionar estas colecciones exhibidoras de péptidos aleatorias son bien conocidas en la técnica (patente de EE. UU . Núm. 5,223,409, de Lardner; patente de EE . UU . Núm. 4, 946, 778, de Lardner; patente de EE. UU. Núm. 5,403, 484, de Lardner; patente de EE. UU. Núm. 5,571,698, de Lardner; y Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) y las colecciones exhibidoras de péptidos al azar y los juegos para examinar estas colecciones pueden adquirirse en forma comercial, por ejemplo, de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ. ) . Otra forma de un fragmento de anticuerpo anti-MASP-2 útil en este aspecto de la invención es un péptido que codifica para una sola región que determina la complementariedad (CDR) que se une a un epitopo en un antígeno MASP-2 e inhibe la activación del complemento dependiente de la MASP-2. Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse al construir genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Estos genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable del ARN de las células productoras de anticuerpos (ver, por ejemplo, Larrick et al., Methods : A Companion to Methods ín Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," en Monoclonal Antibodies : Production , Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166, Cambridge University Press, 1995; y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, " en Monoclonal Antij odies; Principies and Applications, Birch et al. (eds.), página 137, Wiley-Liss, Inc., 1995) . Los anticuerpos MASP-2 descritos en la presente se administran al sujeto que lo necesite para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2. En algunas modalidades, el agente inhibidor de la MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humanizado o de humano de alta afinidad cuya función efectora está disminuida .

INHIBIDORES PEPTIDICOS En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el agente inhibidor de la MASP-2 contiene inhibidores peptidicos de la MASP-2 aislados, incluyendo inhibidores peptidicos naturales aislados e inhibidores polipeptidicos sintéticos que inhiben el sistema de activación del complemento dependiente de la MASP-2. Como se utiliza en la presente, la expresión "inhibidores peptidicos de la MASP-2 aislados" se refiere a péptidos que inhiben la activación del complemento dependiente de la MASP-2 al unirse a, compitiendo con la MASP-2 por unirse a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina) en la vía de la lectina, y/o al interactuar directamente con la MASP-2 para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2, mismos péptidos que son esencialmente puros y prácticamente libres de otras sustancias junto con las que se les puede encontrar en la naturaleza en una cantidad práctica y adecuada para el uso que se pretende darles. Los inhibidores peptidicos han sido utilizados con éxito in vivo para interferir con las interacciones proteina-proteina y los sitios catalíticos. Por ejemplo, los inhibidores peptidicos que se adhieren a moléculas estructuralmente relacionadas con LFA-I han sido aprobados recientemente para su uso clínico en coagulopatías (Ohman, E. M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995). Se ha descrito que los péptidos lineales de cadena corta (< 30 aminoácidos) evitan la o interfieren en la adhesión dependiente de la integrina (Murayama, O., et al., J. Biochem. 720:445-51, 1996). También se han utilizado péptidos de cadena más larga, cuya longitud varia entre 25 y 200 residuos de aminoácidos, para bloquear con éxito la adhesión dependiente de la integrina (Zhang, L., et al., J. Bíol. Chem. 271 (47) : 29953-57, 1996). En general, los inhibidores peptidicos de cadena más larga tienen mayores afinidades y/o menores constantes de disociación que los péptidos cortos y, por lo tanto, pueden ser inhibidores más potentes. También se ha demostrado que los inhibidores peptidicos cíclicos son inhibidores eficaces de las integrinas in vivo para el tratamiento de enfermedades inflamatorias humanas (Jackson, D. Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). Un método para producir péptidos cíclicos incluye la síntesis de péptidos en la que los aminoácidos terminales del péptido sean cisteínas, lo que de este modo permite que el péptido exista en forma cíclica gracias a los enlaces disulfuro entre los aminoácidos terminales, lo cual ha demostrado que mejora la afinidad y la vida media in vivo para el tratamiento de neoplasias hematopoyéticas (por ejemplo, patente de EE. UU. Núm. 6,649,592 de Larson) .

INHIBIDORES PEPTIDICOS SINTÉTICOS DE LA MASP-2 Los péptidos inhibidores de la MASP-2 útiles en los métodos de este aspecto de la invención se ilustran por medio de secuencias de aminoácidos que imitan las regiones objetivo importantes para la función de la MASP-2. Los péptidos inhibidores útiles para poner en práctica los métodos de la invención tienen un tamaño que varia aproximadamente entre 5 aminoácidos y 300 aminoácidos. La Tabla 3 presenta una lista de péptidos inhibidores ilustrativos que pueden ser útiles en la puesta en práctica de este aspecto de la presente invención. Un candidato a péptido inhibidor de la MASP-2 puede ser puesto a prueba en cuanto a su capacidad para funcionar como agente inhibidor de la MASP-2 en una de las varias pruebas, por ejemplo, un análisis de escisión del C4 especifico de la lectina (descrito en el Ejemplo 2) y una prueba de precipitación de C3b (descrita en el Ejemplo 2) En algunas modalidades, los péptidos inhibidores de la MASP-2 se derivan de polipéptidos de la MASP-2 y se seleccionan de la proteina MASP-2 madura de longitud completa (SEQ ID NO: 6) o de un dominio particular de la proteina MASP-2, como por ejemplo, el dominio CUBI (SEQ ID NO: 8), el dominio CUBIEGF (SEQ ID NO: 9), el dominio EGF (SEQ ID NO: 11) y el dominio de la serina proteasa (SEQ ID NO: 12). Como se describió en lo anterior, se ha demostrado que para la dimerización y unión con la MBL, son necesarias las regiones CUBEGFCUBII (Thielens et al., supra) . En particular, se ha demostrado que la secuencia de péptidos TFRSDYN (SEQ ID NO: 16) del dominio CUBI de la MASP-2 está implicada en la unión con la MBL en un estudio que identificó a un humano que porta la mutación homocigótica en Aspl05 a Glyl05, lo que derivó en la pérdida de la MASP-2 del complejo MBL ( Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003). Los péptidos inhibidores de la MASP-2 también pueden derivarse de la MApl9 (SEQ ID NO: 3). Como se describirá en el Ejemplo 30, la MApl9 (SEQ ID NO: 3) (también denominada sMAP) , tiene la capacidad de atenuar por regulación la vía de la lectina, la cual es activada por el complejo MBL. Iwaki et al., J. Immunol. 777:8626-8632, 2006. En tanto que no se desea estar amarrados por la teoría, es probable que la sMAP pueda ocupar el sitio de unión con la MASP-2/sMAP en la MBL y evitar que la MASP-2 se una a la MBL. También se ha informado que la sMAP compite con la MASP-2 asociada con la ficolina A e inhibe la activación del complemento por parte del complejo ficolina A/MASP-2. Endo Y. et al., Immuno genetics 57: 837-844 (2005). En algunas modalidades, los péptidos inhibidores de la MASP-2 se derivan de las proteínas lectina que se unen a la MASP-2 y están involucradas en la vía del complemento por la lectina. Se ha identificado que en esta vía participan varias lectinas diferentes, entre las que se incluyen, lectina de unión a mañana o MBL, L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina. (Ikeda, K., et al., J. Biol .

Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M . , et al . , J. Exp. Med. 776:1497-2284, 2000; Matsushita, M . , et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Estas lectinas están presentes en el suero como oligómeros de subunidades homotriméricas , cada una de las cuales tienen fibras de tipo colágeno N terminales con dominios de reconocimiento de carbohidratos. Se ha demostrado que estas diferentes lectinas se unen a la MASP-2, y el complejo lectina/MASP-2 activa al complemento al escindir a las proteínas C4 y C2. La H-ficolina tiene una región amino terminal de 24 aminoácidos, un dominio de tipo colágeno con 11 repeticiones Gly-Xaa-Yaa, un dominio de cuello de 12 aminoácidos, y un dominio de tipo fibrinógeno de 207 aminoácidos (Matsushita, M., et al . , J. Immunol. 168:3502-3506, 2002) . La H-ficolina se une a la GlcNAc y aglutina los eritrocitos de humano recubiertos con LPS derivada de S. typhimurium, S. minnesota y E. coli. Se ha demostrado que la H-ficolina se asocia con la MASP-2 y la MApl9 y activa la vía de la lectina. Id. La L-ficolina/P35 también se une a la GlcNAc y se ha demostrado que se asocia con la MASP-2 y la MApl9 en el suero humano y se ha demostrado que este complejo activa la vía de la lectina (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). En consecuencia, los péptidos inhibidores de la MASP-2 útiles en la presente invención pueden contener una región de al menos 5 aminoácidos seleccionados de la proteína MBL (SEQ ID NO:21), de la proteina H-ficolina (número de acceso al Genbank NM_173452) , de la proteína M-ficolina (número de acceso al Genbank 000602) y de la L-ficolina (número de acceso al Genbank NM_015838) . Más específicamente, los científicos han identificado que el sitio de unión con la MASP-2 en la MBL está en las 12 tripletas Gly-X-Y "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SEQ ID NO: 26) que se encuentran entre la articulación y el cuello de la porción C Terminal del dominio de tipo colágeno de la MBP (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). Esta región del sitio de unión con la MASP-2 también tiene un elevado grado de conservación en la H-ficolina de humano y en la L-ficolina de humano. Se ha descrito que un sitio de unión por consenso está presente en las tres proteínas que contienen la secuencia de aminoácidos "OGK-X-GP" (SEQ ID NO:22), donde la letra "O" representa hidroxiprolina y la letra "X" es un residuo hidrófobo (Wallis et al., 2004, supra) . En consecuencia, en algunas modalidades, los péptidos inhibidores de la MASP-2 útiles en este aspecto de la invención tienen una longitud de al menos 6 aminoácidos y contienen la SEQ ID NO: 22. Se ha demostrado que los péptidos derivados de la MBL que contienen la secuencia de aminoácidos "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SEQ ID NO: 24) se unen in vitro a la MASP-2 (Wallis, et al., 2004, supra). Para mejorar la unión con la MASP-2, pueden sintetizarse péptidos que estén flanqueados por dos tripletas GPO en cada extremo ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP 0" SEQ ID NO:25) para aumentar la formación de hélices triples según se encuentran en la proteina MBL nativa (como se describe adicionalmente en Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279: 14065, 2004) . Los péptidos inhibidores de la MASP-2 también pueden derivarse de la H-ficolina humana que contiene la secuencia "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SEQ ID NO:27) de la región de unión con la MASP-2 de consenso en la H-ficolina. También están incluidos los péptidos derivados de la L-ficolina humana que contienen la secuencia "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQ ID NO:28) de la región de unión con la MASP-2 de consenso, en la L-ficolina. Los péptidos inhibidores de la MASP-2 también pueden derivarse del sitio de escisión de la C4, como por ejemplo, "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI " (SEQ ID NO: 29), que es el sitio de escisión de la C4 ligado a la porción del extremo C de la antitrombina III (Glover, G. L, et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).

Tabla 3: EJEMPLOS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA MASP-2 Nota: La letra "O" representa hidroxiprolina. La letra "X" es un residuo hidrófobo.

Los péptidos derivados del sitio de escisión de C4 asi como otros péptidos que inhiben el sitio de la MASP-2 serina proteasa pueden modificarse químicamente, de modo que sean inhibidores ireversibles de la proteasa. Por ejemplo, las modificaciones adecuadas pueden incluir, aunque no están necesariamente limitadas a, halometilcetonas (de Br, Cl, I y F) en los extremos C, Asp o Glu, o anexas a cadenas lateraless funcionales; grupos haloacetilo (u otro -haloacetilo) en grupos amino u otras cadenas laterales funcionales; grupos que contienen epóxido o imina en los extremos amino o carboxilo o en cadenas laterales funcionales; o ásteres de imidato en los extremos amino o carboxilo o en cadenas laterales funcionales. Estas modificaciones proporcionarían la ventaja de inhibir permanentemente a la enzima mediante la unión covalente del péptido. Lo anterior podría derivar en menores dosis efectivas y/o en que se necesite una administración menos frecuente del inhibidor peptídico. Además de los péptidos inhibidores anteriormente descritos, los péptidos inhibidores de la MASP-2 útiles en el método de la invención incluyen péptidos que contienen la región CDR3 de unión con la MASP-2 del MoAb anti-MASP-2 obtenido tal como se describe en la presente. La secuencia de las regiones CDR de uso en la síntesis de los péptidos puede determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica. La región variable de cadena pesada es un péptido cuya longitud varia, por lo general, entre 100 y 150 aminoácidos. La región variable de cadena ligera es un péptido cuya longitud varia, por lo general, entre 80 y 130 aminoácidos. Las secuencias CDR que se encuentran en las regiones variables de cadena pesada y ligera incluyen sólo aproximadamente entre 3 y 25 secuencias de aminoácidos cuya secuencia pueden ser fácilmente obtenida por cualquiera que tenga habilidad ordinaria en la técnica . Aquellos que tengan experiencia en la técnica reconocerán que las variaciones esencialmente homologas de los péptidos inhibidores de la MASP-2 anteriormente descritos también presentarán actividad inhibidora de la MASP-2. Las variaciones ilustrativas incluyen, aunque no están necesariamente limitadas a, péptidos que tienen inserciones, supresiones, sustituciones y/o aminoácidos adicionales en las porciones del extremo carboxilo o del extremo amino de estos péptidos y de sus mezclas. En consecuencia, se considera que esos péptidos homólogos que tienen actividad inhibidora de la MASP-2 son útiles en los métodos de esta invención. Los péptidos descritos también pueden incluir motivos duplicadores y otras modificaciones con sustituciones conservadoras. Las variantes conservadoras se describen en otra parte de este documento e incluyen el intercambio de un aminoácido por otro de semejante carga, tamaño o hidrofobicidad y lo similar.

Los péptidos inhibidores de la MASP-2 pueden ser modificados para aumentar la solubilidad y/o aumentar al máximo la carga positiva o negativa con la finalidad de parecerse más estrechamente al segmento de la proteina intacta. El derivado puede tener o no la estructura primaria exacta de los aminoácidos de un péptido descrito en la presente, siempre y cuando el derivado retenga, de manera funcional, la deseada propiedad de inhibir la MASP-2. Las modificaciones pueden incluir la sustitución del aminoácido con alguno de los veinte aminoácidos más comúnmente conocidos o con otro aminoácido, con un aminoácido derivado o sustituido que tenga las características auxiliares deseables, como por ejemplo, resistencia a la degradación enzimática, o con un D-aminoácido o la sustitución con otra molécula o compuesto, tal como un carbohidrato, que imite la conformación natural y la función del aminoácido, de los aminoácidos o del péptido; la supresión del aminoácido; la inserción de alguno de los veinte aminoácidos más comúnmente conocidos o de otro aminoácido o de un aminoácido derivado o sustituido que tenga las características auxiliares deseables, tal como la resistencia a la degradación enzimática, o de un D-aminoácido o la sustitución con otra molécula o compuesto, como por ejemplo, un carbohidrato, que imite la conformación natural y la función del aminoácido, de los aminoácidos y del péptido; o la sustitución con otra molécula o compuesto, como por ejemplo, un carbohidrato o monómero de ácido nucleico, que imite la conformación natural, la distribución de carga y la función del péptido de origen. Los péptidos también pueden modificarse por acetilación o amidación. La síntesis de los péptidos inhibidores derivados puede depender de las técnicas conocidas de biosíntesis de péptidos, de biosíntesis de carbohidratos y lo similar. Como punto inicial, el que tenga experiencia en la técnica puede depender de un programa de computadora adecuado para determinar la conformación de un péptido de interés. Una vez que se conoce la conformación del péptido aquí expuesto, el técnico en la materia puede entonces determinar en un diseño racional, cuál es el tipo de sustituciones que pueden realizarse en uno o más sitios para diseñar un derivado que conserve la conformación básica y la distribución de carga del péptido de origen, pero que pueda contener características que no están presentes o que se han mejorado con respecto a las que tiene el péptido de origen. Una vez que las moléculas derivadas candidato han sido identificadas, los derivados puede ser sometidos a prueba para determinar si funcionan como agentes inhibidores de la MASP-2, utilizando los análisis que se describen en la presente.

SELECCIONAR LOS PÉPTIDOS INHIBIDORES DE LA MASP-2 También podemos utilizar el modelado molecular y el diseño molecular racional para generar y seleccionar los péptidos que imitan las estructuras moleculares de las regiones de unión clave de la MASP-2 e inhiben las actividades de la MASP-2 en el complemento. Las estructuras moleculares utilizadas para el modelado incluyen tanto a las regiones CDR de los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2, como a las regiones objetivo que se sabe son importantes para la función de la MASP-2 que incluye a la región necesaria para la dimerización, a la región implicada en la unión con la MBL, y el sitio activo de la serina proteasa como se describió en lo anterior. Los métodos para identificar a los péptidos que se unen a un objetivo particular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para la construcción de estructuras macromoleculares de novo, como por ejemplo, los péptidos que se unen a una molécula particular, puede utilizarse la impresión molecular. Ver, por ejemplo, Shea, K. J. , "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites", TRIP 2 : (5) 1994. Como ejemplo ilustrativo, se menciona a continuación un método para preparar imitadores de péptidos de unión con la MASP-2. Los monómeros funcionales de un péptido de unión con la MASP-2 o la región de unión de un anticuerpo anti-MASP-2 que tiene propiedades inhibidoras de la ASP-2 (la plantilla) se polimerizan. La plantilla se retira entonces, a lo que le sigue la polimerización de una segunda clase de monómeros en el hueco dejado por la plantilla, para producir una nueva molécula que tenga una o más propiedades deseadas que sean similares a las de la plantilla. Además de preparar péptidos de esta manera, también pueden prepararse otras moléculas de unión con la MASP-2 que sean agentes inhibidores de la MASP-2, como por ejemplo, polisacáridos, nucleósidos, fármacos, nucleoproteinas , lipoproteinas , carbohidratos, glucoproteinas, esteroides, lipidos y otros materiales biológicamente activos. Este método es útil para diseñar una amplia variedad de imitadores biológicos que sean más estables que sus contrapartes o equivalentes naturales debido a que, por lo general, se preparan mediante la polimerización con radicales libres de monómeros funcionales, lo que deriva en un compuesto que tiene una cadena principal no biodegradable .

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS Los péptidos inhibidores de la MASP-2 pueden prepararse con las técnicas bien conocidas en el campo, como por ejemplo, la técnica sintética en fase sólida inicialmente descrita por Merrifield en <J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963. Es posible lograr la síntesis automatizada utilizando, por ejemplo, el Sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) de conformidad con las instrucciones suministradas por el fabricante. Otras técnicas se encuentran, por ejemplo, en Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, segunda edición, John iley & Sons, 1976, asi como en otras obras de referencia conocidas por quienes tengan experiencia en la técnica . Los péptidos también pueden prepararse utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas por los que tengan experiencia en la técnica. Por ejemplo, el péptido puede ser producido por la vía enzimática al insertar ácido nucleico que codifica al péptido en un vector de expresión, que expresa el ADN y al traducir el ADN en el péptido en presencia de los aminoácidos necesarios. El péptido se purifica entonces utilizando técnicas de cromatografía o de electroforésis , o utilizando una proteína portadora que puede fusionarse con y, posteriormente, escindirse del péptido al insertar en el vector de expresión en fase con el péptido que codifica la secuencia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína portadora. La fusión proteína-péptido puede aislarse utilizando técnicas de cromatografía, de electroforésis o de inmunología (como por ejemplo, la unión con una resina a través de un anticuerpo ante la proteína portadora) . El péptido puede escindirse utilizando métodos químicos o enzimáticos, como por ejemplo, con hidrolasas. Los péptidos inhibidores de la MASP-2 que son útiles en el método de la invención también pueden ser producidos en células hospedadoras recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un péptido inhibidor de la MASP-2 que codifica una secuencia, una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido debe estar operativamente ligada a las secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y luego introducirse en una célula hospedadora. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y mejoradores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción y un gen marcador, que es adecuado para la selección de células que portan vectores de expresión. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido inhibidor de la MASP-2 pueden sintetizarse con "máquinas génicas" utilizando protocolos, tales como el método de la fosforamidita . Si para una aplicación, tal como la síntesis de un gen o de un fragmento del gen, se necesita el ADN de doble hebra químicamente sintetizado, entonces, cada hebra complementaria se prepara por separado. La producción de genes cortos (de 60 a 80 pares de bases) es técnicamente sencilla y puede lograrse sintetizando las hebras complementarias e hibridándolas luego. Para la producción de genes más largos, los genes sintéticos (de doble hebra o cadena) se ensamblan en forma modular a partir de fragmentos de una sola hebra cuya longitud varia desde 20 hasta 100 nucleótidos. Para revisiones acerca de la síntesis de polinucleótidos véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA" , ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu . Rev. Biochem. 53:323, 1984; and Climie, S., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990.

INHIBIDORES DE MOLÉCULA PEQUEÑA En algunas modalidades, los agentes inhibidores de la MASP-2 son inhibidores de molécula pequeña que incluyen sustancias naturales y sintéticas cuyo peso molecular es bajo, tales como por ejemplo, péptidos, imitadores de péptidos e inhibidores que no son péptidos (que incluyen oligonucleótidos y compuestos orgánicos). Los inhibidores de molécula pequeña de la MASP-2 pueden ser generados con base en la estructura molecular de las regiones variables de los anticuerpos anti-MASP-2. Los inhibidores de molécula pequeña también pueden diseñarse y generarse con base en la estructura cristalina de la MASP-2 utilizando el diseño de fármacos por computadora (Kuntz I. D., et al., Science 257:1078, 1992) . Ya se ha descrito la estructura cristalina de la MASP-2 de rata (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348- 2359, 2003) . Utilizando el método descrito por Kuntz et al., las coordenadas de la estructura cristalina de la MASP-2 se usan como información de entrada en un programa de computadora, tal como DOCK, el cual produce una lista de estructuras de moléculas pequeñas que se espera se unan con la MASP-2. El uso de programas de computadora de este es bien conocido por los que tienen experiencia en la técnica. Por ejemplo, para identificar los ligandos no peptidicos únicos que son inhibidores de la HIV-1 proteasa se utilizó la estructura cristalina del inhibidor de la HIV-1 proteasa evaluando la idoneidad de los compuestos encontrados en la base de datos Cambridge Crystallographic para el sitio de unión de la enzima, utilizando el programa DOCK (Kuntz, I. D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R. L., et al., PNAS 87 : 6644-6648, 1990) . La lista de estructuras de molécula pequeña que son identificadas con un método computacional como potenciales inhibidores de la MASP-2 se seleccionan utilizando un análisis de unión con la MASP-2, como se describe en el Ejemplo 7. Las moléculas pequeñas que se encontró se unen a la MASP-2 se someten a pruebas en un análisis funcional, como el que se describe en el Ejemplo 2, para determinar si inhiben la activación del complemento dependiente de la MASP-2.

RECEPTORES SOLUBLES DE LA MASP-2 Se cree que otros agentes inhibidores de la MASP-2 adecuados incluyen receptores solubles de la MASP-2, los cuales pueden producirse utilizando técnicas conocidas por quienes tienen habilidad ordinaria en la técnica .

INHIBIDORES DE EXPRESIÓN DE LA MASP-2 En otra modalidad de este aspecto de la invención, el agente inhibidor de la MASP-2 es un inhibidor de la expresión de la MASP-2 capaz de inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2. En la puesta en práctica de este aspecto de la invención, los inhibidores representativos de la expresión de la MASP-2 incluyen a las moléculas del ácido nucleico antisentido de la MASP-2 (como por ejemplo, el ARNm antisentido, el ADN antisentido o los oligonucleótidos antisentido) , las ribozimas y las moléculas del ARNi de la MASP-2. Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm de la MASP-2 al hibridarse con el ARNm de la MASP-2 y evitar la traducción de la proteina MASP-2. Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser construida siguiendo varias formas diferentes siempre que tenga la capacidad de interferir con la expresión de la MASP-2. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser construida invirtiendo la región de codificación (o una porción de la misma) del ADNc de la MASP-2 (SEQ ID NO: 4) con respecto a su orientación normal para la transcripción y permitir la transcripción de su complemento. La molécula de ácido nucleico antisentido es, por lo general, prácticamente idéntica a por lo menos una porción de gen o genes objetivo. No obstante, no es necesario que el ácido nucleico sea completamente idéntico para inhibir la expresión. En general, para compensar el uso de una molécula de ácido nucleico antisentido más corta, puede utilizarse una mayor homología. El porcentaje de identidad mínimo es, normalmente, mayor de aproximadamente 65%, aunque un mayor porcentaje de identidad puede ejercer una represión más efectiva de la expresión de la secuencia endógena. Por lo general, se prefiere un porcentaje de identidad considerablemente mayor de aproximadamente 80%, aunque lo que más se prefiere es, normalmente, desde aproximadamente 95% hasta la identidad total. No es necesario que la molécula de ácido nucleico antisentido tenga el mismo patrón de intrones o exones que el del gen objetivo, y los segmentos no codificantes del gen objetivo pueden ser igualmente efectivos que los segmentos de codificación para lograr la supresión antisentido de la expresión del gen objetivo. Como molécula de ácido nucleico antisentido puede utilizarse una secuencia de ADN de al menos 8, o un número semejante de, nucleótidos, aunque se prefiere una secuencia más larga. En la presente invención, un ejemplo representativo de un agente inhibidor de la MASP-2 útil es una molécula de ácido nucleico de la MASP-2 antisentido cuya identidad sea de al menos de noventa por ciento a la del complemento del ADNc de la MASP-2 formado por la secuencia de ácidos nucleicos mencionados en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de ácidos nucleicos expuestos en la SEQ ID NO: 4 codifica la proteina MASP-2 que está formada por la secuencia de aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 5. El dirigir los oligonucleótidos antisentido para que se unan al ARNm de la MASP-2 es otro mecanismo que puede ser utilizado para reducir el nivel de la síntesis de la proteína MASP-2. Por ejemplo, la síntesis de la poligalacturonasa y el receptor de acetilcolina de tipo 2 de muscarina es inhibido por los oligonucleótidos antisentido dirigido hacia sus respectivas secuencias de ARNm (patente de EE . UU . Núm. 5,739,119, de Cheng y patente de EE. UU . Núm. 5,759,829, de Shewmaker) . Por otra parte, se han demostrado ejemplos de la inhibición antisentido con la proteína ciclina nuclear, el gen de la multirresistencia a los fármacos o MDG1, el ICAM-1, la E-selectina, el STK-1, el receptor de la GABAA del cuerpo estriado y el EGF de humano (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. Núm. 5,801, 154, de Baracchini; la patente de EE. UU. Núm. 5, 789,573, de Baker; la patente de EE . UU . Núm. 5, 718, 709, de Considine y la patente de EE. UU . Núm. 5,610,288, de Reubenstein) . Se ha descrito un sistema que permite que cualquiera que tenga habilidad ordinaria determine cuales oligonucleotidos son útiles en la invención, lo que implica explorar los sitios adecuados en el ARNm objetivo utilizando la escisión de la Rnasa H como un indicador de la facilidad de acceso de las secuencias dentro de los transcritos. Scherr, M . , et al., Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. A los extractos celulares que expresan la MASP-2, tales com los hepatocitos, se añade una mezcla de oligonucleotidos antisentido que son complementarios de ciertas regiones del transcrito de la MASP-2, y se híbrida para crear ün sitio vulnerable a la ARNasa H. Este método puede combinarse con la selección de la secuencia auxiliada por computadora que puede predecir la selección de la secuencia óptima para las composiciones antisentido con base en su capacidad relativa para formar dímeros, horquillas u otras estructuras secundarias que reducirían o prohibirían la unión específica con el ARNm objetivo en una célula hospedero. Estas consideraciones sobre el análisis de la estructura secundaria y la selección del sitio objetivo pueden realizarse utilizando el software de análisis del cebador OLIGO (Rychlik, L., 1997) y el software del algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul, S. F. , et al., Nucí. Acids Res. 25:3389-3402, 1997). Los compuestos antisentido dirigidos hacia la secuencia objetivo tienen, de preferencia, una longitud de aproximadamente entre 8 y 50 nucleótidos. En particular, se prefieren a los oligonucleotidos antisentido que contienen aproximadamente entre 9 y 35 nucleótidos, o un número semejante. Los inventores consideran que todas las composiciones de oligonucleotidos en el intervalo de 9 a 35 nucleótidos (es decir, las de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 más o menos bases de largo) son las que más se prefieren para poner en práctica los métodos basados en oligonucleotidos antisentido de la invención. Las regiones objetivo del ARNm de la MASP-2 que más se prefieren son aquellas que están en el codón de inicio de la traducción de AUG o cerca de éste, y aquellas secuencias que son prácticamente complementarias de las regiones 5' del ARNm, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen de la MASP-2 (SEQ ID NO:4). En la Tabla 4 se presentan inhibidores de expresión de la MASP-2 ilustrativos .

Tabla 4: INHIBIDORES DE EXPRESIÓN DE LA MASP-2 ILUSTRATIVOS Como se mencionó en lo anterior, el término "oligonucleótido" , como se utiliza en la presente, se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN) o de imitadores de los mismos. Este término abarca también a aquellas oligonucleobases constituidas por nucleótidos, azúcares y enlaces internucleósidos (cadena principal) covalentes naturales, tanto como a los oligonucleótidos que tienen modificaciones que no son naturales. Estas modificaciones permiten introducir ciertas propiedades deseables que no están presentes en los oligonucleótidos naturales, como por ejemplo, menores propiedades tóxicas, una mayor estabilidad contra la degradación de la nucleasa y una mejor absorción celular. En modalidades ilustrativas, los compuestos antisentido de la invención difieren del ADN nativo en la modificación de la cadena principal de fosfodiéster para prolongar la vida del oligonucleótido antisentido en la cual, los sustituyentes del fosfato son reemplazados por fosforotioatos . Del mismo modo, uno o los dos extremos del oligonucleótido pueden ser sustituidos por uno o más derivados de la acridina que se intercalan entre pares de bases adyacentes dentro de una hebra de ácido nucleico. Otra alternativa al antisentido es el uso de la "interferencia del ARN o ARNi". Los ARNs de doble hebra o ARNds pueden provocar la sinonimia génica en mamíferos vivos. La función natural del ARNi y la cosupresion parece ser una protección del genoma contra la invasión por elementos genéticos móviles, como por ejemplo, retrotransponsones y virus que producen ARN o ARNds aberrantes en la célula hospedero cuando se activan (ver, por ejemplo, Jensen, J., et al., Wat. Genet. 21:209-12, 1999) . La molécula de ARN de doble hebra puede prepararse sintetizando dos hebras de ARN capaces de formar una molécula de ARN de doble hebra, donde cada una tiene una longitud de aproximadamente 19 y 25 (por ejemplo, de 19 a 23 nucleótidos) . Por ejemplo, una molécula de ARNds útil en los métodos de la invención puede contener al ARN que corresponde a una secuencia y su complemento enumerado en la Tabla 4. De preferencia, al menos una hebra del ARN tiene una proyección 3 ' de 1 a 5 nucleótidos. Las hebras de ARN sintetizadas se combinan en condiciones que permiten formar una molécula de dos hebras. La secuencia de ARN pueden puede contener al menos una porción de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: con una longitud total de 25 nucleótidos o menos. El diseño de las secuencias ARNsi de un objetivo determinado está dentro de la habilidad t, ordinaria de un técnico en la materia. Existen servicios comerciales que diseñan la secuencia ARNsi y garantizan una atenuación o disminución ( " knockdown" ) de al menos 70% de la expresión (Qiagen, Valencia, Calif ) . El ARNds puede administrarse en forma de una composición farmacéutica y portarse usando métodos conocidos, donde un ácido nucleico se introduce en una célula objetivo deseada. Los métodos de transferencia génica comúnmente utilizados incluyen a los métodos del fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, microinyección y virales. Estos métodos se presentan en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993. También pueden utilizarse ribozimas para disminuir la cantidad y/o la actividad biológica de la MASP-2, como por ejemplo, ribozimas que se dirigen al ARNm de la MASP-2. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico que pueden escindir moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia que es total o parcialmente homologa con la secuencia de la ribozima. Es posible diseñar transgenes de ribozima que codifiquen para ribozimas de ARN que se aparean específicamente con un ARN objetivo y escinden la cadena principal de fosfodiéster en un lugar específico, inactivando funcionalmente así al ARN objetivo. Al realizar esta escisión, la ribozima misma no es alterada y, de este modo, tiene la capacidad para reciclarse y escindir otras moléculas. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de ARN le confiere actividad para escindir ARN, aumentando así la actividad de las construcciones antisentido. Las ribozimas útiles para poner en práctica la invención contienen, normalmente, una región de hibridación de por lo menos, aproximadamente nueve nucleótidos, misma que es complementaria, en la secuencia de nucleótidos, de al menos parte del ARNm de la MASP-2 objetivo y una región catalítica que es apta para escindir el ARNm de la MASP-2 objetivo (ver, en general, EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J. , et al., Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M. J. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T. R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986). Las ribozimas pueden ser dirigidas directamente a las células en forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozima o introducirse en la célula en forma de vector de expresión que codifica el ARN ribozimal deseado. Las ribozimas pueden ser utilizadas y aplicadas en forma muy parecida a la descrita para los polinucleótidos antisentido. El ARN y el ADN antisentido, las ribozimas y las moléculas de ARNi útiles en los métodos de la invención pueden ser preparadas por cualquier método conocido en la técnica para sintetizar moléculas de ADN y ARN. Estas incluyen a las técnicas bien conocidas en el área para sintetizar químicamente los oligodesoxirribonucleótidos y los oligorribonucleótidos, como por ejemplo, la síntesis química con fosforamidita en fase sólida. En forma alternativa, las moléculas de ARN pueden ser generadas mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican para la molécula de ARN antisentido. Estas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan a los promotores de la ARN polimerasa, tal como los promotores de la T7 o SP6 polimerasa. De manera alternativa, las construcciones de ADNc antisentido que sintetizan el ARN antisentido ya sea por constitución o por inducción, dependiendo del promotor utilizado, pueden introducirse en forma estable en las líneas celulares. Para aumentar la estabilidad y la vida media pueden introducirse diversas modificaciones bien conocidas de las moléculas de ADN. Las modificaciones útiles incluyen, aunque no se limitan a, la adición de secuencias flanqueadoras de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en vez de los enlaces de fosfodiesterasa dentro de la cadena principal del oligodesoxirribonucleótido .

V. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE SUMINISTRO DOSIFICACIÓN En otro aspecto, la invención presenta composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2, que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden administrársele a un sujeto que los necesite, en dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mitigar enfermedades asociadas con la activación del complemento dependiente de la MASP-2. Con la expresión 'dosis terapéuticamente eficaz' se hace referencia a la cantidad del agente inhibidor de la MASP-2 que sea suficiente para producir la mitigación de los síntomas de la enfermedad. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden determinarse con los procedimientos farmacéuticos estándar que utilizan modelos animales, como por ejemplo, el modelo de múrido de MASP-2 -/- de ratón que expresa el transgen de la MASP-2 de humano descritas en el Ejemplo 3. Al usar estos modelos animales, es posible determinar el nivel del efecto adverso no observado o NOAEL ("no observed adverse effect level") y la dosis eficaz mínima o MED ("the minimally effective dose") utilizando métodos estándar. La relación de dosificación entre los efectos del NOAEL y la MED es la relación terapéutica, que se expresa como la relación NOAEL/MED. Los agentes inhibidores de la MASP-2 que más se prefieren son aquellos que arrojan relaciones o índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de pruebas en cultivos celulares y en estudios en animales pueden ser utilizados para conformar un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación del agente inhibidor de la MASP-2 se ubica, de preferencia, en un intervalo de concentraciones circulatorias que incluyen una MED con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar en de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración usada. En caso de alguna formulación compuesta, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse utilizando modelos animales. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en un modelo animal para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye a la MED. Los niveles cuantitativos del agente inhibidor de la MASP-2 en el plasma también pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Además de los estudios de toxicidad, la dosis eficaz también puede calcularse con base en la cantidad de proteina presente en un sujeto vivo y en la afinidad de unión del agente inhibidor de la MASP-2. Se ha demostrado que los niveles de la MASP-2 en el suero de sujetos normales está presente en niveles bajos, en el intervalo de 500 ng/ml y que los niveles de la MASP-2 en cualquier persona pueden determinarse por medio del análisis cuantitativo de la MASP-2 descrito en Moller-Kristensen M . , et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003. En general, la dosificación de las composiciones administradas que contengan agentes inhibidores de la MASP-2 varia dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la talla, el sexo, la condición médica general y el historial médico del sujeto. En forma ilustrativa, los agentes inhibidores de la MASP-2, como por ejemplo, los anticuerpos anti-MASP-2, pueden administrarse en intervalos de dosificación de aproximadamente 0.010 a 10.0 mg/kg, de preferencia, de 0.010 a 1.0 mg/kg y con más preferencia, de 0.010 a 0.1 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, la composición contiene una combinación de anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores de la MASP-2. La eficacia terapéutica de las composiciones inhibidoras de la MASP-2 y de los métodos de la presente invención en cualquier sujeto, asi como las dosificaciones adecuadas pueden determinarse de conformidad con los análisis del complemento, que son bien conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica. El complemento genera una gran cantidad de productos específicos. Durante la década anterior, se crearon análisis sensitivos y específicos, mismos que se encuentran en forma comercial para la mayor parte de estos productos de la activación, entre los que se incluyen, la poca activación de los fragmentos C3a, C4a y C5a y los fragmentos de mucha activación iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos análisis utilizan anticuerpos monoclonales que reaccionan con los nuevos antígenos (neoantígenos ) expuestos en el fragmento, pero no en las proteínas nativas a partir de las que se formaron, lo que provoca que estos análisis sean muy sencillos y específicos. La mayoría de ellos depende de la tecnología de ELISA, aunque el radioinmunoanálisis se utiliza todavía ocasionalmente para el C3a y el C5a. Estos últimos análisis determinan tanto los fragmentos no procesados como sus fragmentos "desArg", que son las principales formas halladas en la circulación. Los fragmentos no procesados y el C5adesArg son rápidamente despejados por la unión con los receptores de la superficie de la célula y, de este modo, están presentes en concentraciones muy bajas, en tanto que, el C3adesArg no se une con las células y se acumula en el plasma. La determinación del C3a proporciona un indicador de la activación del complemento, sensitivo e independiente de la vía. La activación por la vía alternativa puede evaluarse al determinar el fragmento Bb. La detección del producto en fase liquida de la activación por la vía de ataque a la membrana, el sC5b-9, suministra indicios de que el complemento se está activando en su totalidad. Debido a que tanto la vía de la lectina como la vía clásica generan los mismos productos de activación, el C4a y el C4d, la determinación de estos dos fragmentos no suministra información alguna sobre cual de estas dos vías ha generado los productos de activación.

AGENTES ADICIONALES Las composiciones y métodos que contienen agentes inhibidores de la MASP-2 pueden contener, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, mismos que pueden aumentar la actividad del agente inhibidor de la MASP-2 o aportar funciones terapéuticas relacionadas en forma aditiva o sinérgica. Por ejemplo, pueden administrarse uno o más agentes inhibidores de la MASP-2, combinados con uno o más agentes antiinflamatorios y/o analgésicos. La inclusión y selección de este o estos agentes adicionales estará determinada en función de lograr un resultado terapéutico deseado. Los agentes antiinflamatorios y/o analgésicos adecuados incluyen: antagonistas del receptor de la serotonina; agonistas del receptor de la serotonina; antagonistas del receptor de la histamina; antagonistas del receptor de la bradicinina; inhibidores de la calicreina; antagonistas del receptor de la taquicinina, entre los que se incluyen antagonistas del subtipo del receptor de neurocininai y neurocinina2; antagonistas del receptor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) ; antagonistas del receptor de la interleucina ; inhibidores de las enzimas activas en la via sintética de los metabolitos del ácido araquidónico, que incluyen inhibidores de la fosfolipasa, que incluyen inhibidores de la isoforma PLA2 e inhibidores de la isoforma PLCy, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) (que pueden ser inhibidores de la COX-1, de la COX-2 o inhibidores no selectivos de la COX-1 y la COX-2), inhibidores de la lipooxigenasa; antagonistas del receptor del prostanoide, que incluyen antagonistas del subtipo del receptor del eicosanoide EP-1 y EP-4 y los antagonistas del subtipo del receptor tromboxano; antagonistas del receptor del leucotrieno, que incluyen, antagonistas del subtipo del receptor del leucotrieno B4 y los antagonistas del subtipo del receptor del ¦ leucotrieno D4; agonistas del receptor de opioide, que incluyen a los agonistas del subtipo del receptor del µ-opioide, d-opioide y -opioide; agonistas y antagonistas del purinoceptor que incluyen a los antagonistas del receptor del P2X y agonistas del receptor del P2Y; elementos abridores del canal del potasio sensibles al trifosfato de adenosina (ATP) ; inhibidores de la MAP cinasa; inhibidores de la acetilcolina nicotinica, y agonistas del receptor alfa-adrenérgico (que incluyen a los agonistas del alfa-1, del alfa-2 y no selectivos alfa-1 y 2) . Cuando se utiliza en la prevención o el tratamiento de la restenosis, el agente inhibidor de la MASP-2 de la presente invención puede combinarse con uno o más agentes antirrestenosis y administrarse en forma concomitante. Los agentes antirrestenosis adecuados incluyen: agentes antiplaquetarios que incluyen: inhibidores y antagonistas del receptor de la trombina, antagonistas del receptor del difosfato de adenosina (ADP) (también conocidos como agonistas del receptor del purinoceptori ) , inhibidores y antagonistas del receptor del tromboxano y antagonistas del receptor de la glucoproteina de la membrana plaquetaria; inhibidores de las moléculas de adhesión a la célula, que incluyen, inhibidores de la selectina e inhibidores de la integrina; agentes antiquimiotácticos ; antagonistas del receptor de la interleucina; e inhibidores de la señalización intracelular que incluyen: inhibidores de la proteina cinasa C (PKC) y fosfatasas de la proteina tirosina, moduladores de los inhibidores de la proteina tirosina cinasa intracelular, inhibidores de los dominios con homologia2 src (SH2) y antagonistas del canal del calcio. Los agentes inhibidores de la MASP-2 de la presente invención también pueden administrarse en combinación con uno o más inhibidores del complemento. Hasta el momento no se han aprobado inhibidores del complemento para usarlos en seres humanos, sin embargo, se ha demostrado que algunos agentes farmacológicos bloquean el complemento in vivo. Muchos de estos agentes también son tóxicos o solamente son inhibidores parciales (Asghar, S. S., Pharmacol. Rev. 36:223-44, 1984) y el uso de los mismos ha estado limitado a su uso como herramientas para la investigación. El K76cOOH y el mesilato de nafamstat son dos agentes que han mostrado cierta efectividad en modelos animales de transplante (Miyagawa, S., et al., Transplant Proc. 24:483-484, 1992). También se ha demostrado que las heparinas de bajo peso molecular son eficaces para regular la actividad del complemento (Edens, R. E., et al., Complement Today, pp. 96-120, Basel: Karger, 1993). Se piensa que estos inhibidores de molécula pequeña pueden ser útiles como agentes para usarlos en combinación con los agentes inhibidores de la MASP-2 de la presente invención. Otros inhibidores naturales del complemento pueden ser útiles en combinación con los agentes inhibidores de la MASP-2 de la presente invención. Los inhibidores biológicos del complemento incluyen al factor 1 soluble del complemento o sCRl . Éste es un inhibidor natural que puede estar presente en la membrana externa de las células humanas. Otros inhibidores de membrana incluyen: DAF, MCP y CD59. En las formas recombinantes se ha probado su actividad anticomplemento in vitro e in vivo. Se ha demostrado que el sCRl es eficaz en el xenotransplante, donde el sistema de complemento (tanto por la vía alternativa como por la vía clásica) proporciona el disparo o la activación del síndrome del rechazo hiperactivo a unos cuantos minutos de la irrigación sanguínea en el órgano recién transplantado (Platt J. L., et al., Immunol . Today 11:450-6, 1990; Marino I. R. , et al., Transplant Proc. 1071:6, 1990; Johnstone, P. S., et al., Transplantation 54:573-6, 1992). El uso del sCRl protege y prolonga el tiempo de sobrevivencia del órgano transplantado, lo que implica la vía del complemento en la patogenia de la sobrevivencia del órgano (Leventhal, J. R. et al., Transplantation 55:857-66, 1993; Pruitt, S. K. , et al., Transplantation 57:363-70, 1994). Los inhibidores adecuados del complemento que pueden usarse en forma combinada con las composiciones de la presente invención también incluyen, a manera de ejemplo, MoAbs, tales como los que están siendo desarrollados por Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut y los MoAbs antiproperdina . Cuando se usan en el tratamiento de artritis (por ejemplo, de la osteoartritis y la artritis reumatoide) , el agente inhibidor de la MASP-2 de la presente invención puede combinarse con uno o más agentes condroprotectores, que pueden incluir uno o más promotores del anabolismo de cartílago y/o uno o más inhibidores del catabolismo de cartílago y, en forma adecuada, tanto un agente anabólico, como un agente inhibidor catabólico, para administrarlos en forma concurrente. Los agentés condroprotectores adecuados que promueven el anabolismo incluyen: agonistas del receptor de la interleucina (IL) que incluyen a la IL-4, IL-10, IL-13, rhIL-4, rhIL-10 y rhIL-13, y la IL-4, IL-10 o IL-13 quiméricas; los agonistas de la superfamilia del factor de crecimiento transformante ß, que incluyen: TGF-ß, TGF-ß?, TGF- 2, TGF-ß3; osteoproteínas morfogénicas que incluyen: BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) y OP-2/BMP-8; factores de la diferenciación del crecimiento, que incluyen: GDF-5, GDF-6 y GDF-7, TGF^s y BMPs recombinantes , y TGF-ß y BMP quiméricos; factores de crecimiento de tipo insulínico que incluyen IGF-1; y factores del crecimiento de fibroblasto que incluyen bFGF. Los agentes condroprotectores adecuados inhibidores del catabolismo incluyen agonistas del receptor de la interleucina-1 (IL-1), también denominados IL-lra, que incluyen a los receptores solubles de la IL-1 humana (shuIL-lR), rshuIL-lR, rhlL-lra, anti-ILl-anticuerpo, AF11567 y AF12198; agonistas del receptor del factor de la necrosis tumoral (TNF) o TNF- , que incluyen receptores solubles que incluyen receptores solubles del TNF recombinantes sTNFRl y sTNFRII, y receptores solubles del TNF quiméricos, que incluyen rhTNFR:Fc quimérico, receptores solubles de fusión de Fe y anticuerpos anti-TNF; inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (específicos de la COX-2), que incluyen DuP 697, SC-58451, celecoxib, rofecoxib, nimesulide, diclofenaco, meloxicam, piroxicam, NS-398, RS-57067, SC-57666, SC-58125, flosulide, etodolaco, L-745,337 y DFU-T-614; inhibidores de la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) , que incluyen a los inhibidores de ERK1 , ERK2, SAPK1, SAPK2a, SAPK2b, SAPK2d, SAPK3, que incluyen SB 203580, SB 203580 iodo, SB202190, SB 242235, SB 220025, R J 67657, RWJ 68354, FR 133605, L-167307, PD 98059, PD 169316; inhibidores del factor nuclear kappa B (NFKB) , que incluyen feniltetiléster del ácido caféico (CAPE), DM-CAPE, péptido SN-50, himenialdisina y ditiocarbamato de pirolidona; inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS), que incluyen, NG-monometil-L-arginina, 1400W, difenileniodio, S-metil isotiourea, S- ( aminoetil ) isotiourea, L-N6-(l-iminoetil) lisina, 1,3-PBITU, 2-etil-2-tiopseudourea, aminoguanidina, Nu-nitro-L-arginina, y metiléster de ??-nitro-L-arginina , inhibidores de las metaloproteinasas de matriz (MMP) , que incluyen, inhibidores de la MMP-1, M P-2, MMP-3, MMP-7, MP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MP-14 y M P-15, y que incluyen U-24522, minociclina, 4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH, Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2, TIMPl rhumano, TIMP2 rhumnao, y fosforamidon; moléculas de adhesión celular, que incluyen agonistas y antagonistas de la integrina, que incluyen, ?ß3 MoAb LM 609 y equistatina; agentes antiquimiotácticos que incluyen receptores de F-Met-Leu-Phe, receptores de IL-8, receptores de MCP-1 y receptores de MIP1-I/RANTES; inhibidores de la señalización intracelular, que incluyen: (a) inhibidores de la proteina cinasa, que incluyen tanto (i) inhibidores de la proteina cinasa C (PKC) (isocima) que incluyen calfostina C, G-6203 y GF 109203X, y (ii) inhibidores de la proteina tirosina cinasa; (b) moduladores de las proteínas tirosina fosfatasas intracelulares (PTPasas); y (c) inhibidores de los dominios SH2 (dominios src Homology2) . En algunas aplicaciones, puede arrojar beneficios administrar los agentes inhibidores de la MASP-2 de la presente invención en forma combinada con un agente inhibidor de espasmos. Por ejemplo, en el caso de aplicaciones urogenitales, puede ser benéfico incluir al menos un agente inhibidor de los espasmos del músculo liso y/o al menos un agente antiinflamatorio y, en el caso de procedimientos vasculares, puede ser útil para incluir al menos un inhibidor de vasoespasmos y/o al menos un agente antiinflamatorio y/o al menos un agente anti-restenosis . Los ejemplos adecuados de agentes inhibidores de espasmos incluyen: antagonistas del subtipo del receptor de la serotonina2; antagonistas del receptor de la taquicinina; donadores de óxido nítrico; abridores del canal de potasio sensibles al ATP; antagonistas del canal de calcio, y antagonistas del receptor de endotelina.

PORTADORES FARMACÉUTICOS Y VEHÍCULOS DE SUMINISTRO En general, las composiciones del agente inhibidor de la MASP-2 de la presente invención, combinados con cualesquiera otros agentes terapéuticos seleccionados, están adecuadamente contenidos en un portador farmacéuticamente aceptable. El portador es un material biocompatible, no tóxico y se selecciona de modo que no afecte perj udicialmente la actividad biológica del agente inhibidor de la MASP-2 (y de cualesquiera otros agentes terapéuticos que estén combinados con éste) . Los portadores ilustrativos farmacéuticamente aceptables de los péptidos se describen en la patente de EE. UU. Núm. 5,211,657 de Yamada . Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores útiles en la invención pueden prepararse en formulaciones sólidas, semisólidas, en gel, líquidas o gaseosas, como por ejemplo, tabletas, cápsulas, polvo, gránulos, ungüentos, soluciones, depósitos, inhalantes e inyecciones que permiten la administración oral, parenteral o quirúrgica. La invención también contempla la administración local de las composiciones a través de dispositivos médicos de recubrimiento y lo similar . Los portadores adecuados para el suministro parenteral por inyección, infusión o irrigación y tópica incluyen agua destilada, solución fisiológica salina amortiguada con fosfato, soluciones de Ringer normal o con lactato, solución de dextrosa, solución de Hank o propanodiol . Adicionalmente, como disolvente o medio de suspensión pueden utilizarse aceites fijos estériles. Con esta finalidad, es posible utilizar cualquier aceite que sea biocompatible, que incluye mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de composiciones inyectables encuentran aplicación los ácidos grasos, como por ejemplo, el ácido oleico. Con el portador y el agente pueden prepararse composiciones liquidas, en suspensión, en gel polimerizable o no polimerizable, en pasta o en bálsamo . El portador también puede contener un vehículo de suministro que mantenga (es decir, que prolongue, retrase o regule) el suministro del o de los agentes o que aumente el suministro, la absorción, la estabilidad o la farmacocinética del o de los agentes terapéuticos. Este vehículo de suministro puede incluir, a manera de ejemplo no limitante, micropartículas , microesferas , nanoesferas o nanopartículas constituidas por proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos y micelas poliméricas. Los sistemas de suministro adecuados de hidrogel y micelas incluyen a los copolimeros PEO:PHB:PEO y a los complejos de copolimero/ciclodextrina descritos en el documento WO 2004/009664 A2 y el PEO y los complejos de PEO/ciclodextrinas descritos en el documento US 2002/0019369 Al. Estos hidrogeles pueden inyectarse en forma local en el sitio de la acción deseada o en forma subcutánea o intramuscular para obtener un depósito de liberación prolongada. En caso del suministro intraarticular, el agente inhibidor de la MASP-2 puede ser portado en los portadores líquidos o en gel descritos en lo anterior que sean inyectables, en los vehículos de suministro de liberación prolongada descritos en lo anterior que sean inyectables o en un ácido hialurónico o en un derivado de éste. En el caso de la administración oral de agentes no peptidérgicos , el agente inhibidor de la MASP-2 puede ser portado en un diluyente o agente de carga inerte, por ejemplo, sacarosa, almidón de maíz o celulosa. En el caso de la administración tópica, el agente inhibidor de la MASP-2 puede ser portado en un ungüento, loción, crema, gel, gotas, supositorio, rocío, líquido o polvo o en gel o en sistemas de suministro de microcápsulas a través de un parche transdérmico . Una variedad de sistemas de suministro nasal y pulmonar, que incluyen: aerosoles, inhaladores de dosis medidas, inhaladores de polvo seco y nebulizadores, está siendo desarrollada y puede ser adaptada, en forma adecuada, para suministrar la presente invención en un vehículo de suministro en aerosol, de inhalador o nebulizado, respectivamente. En caso delsuministro intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV) pueden usarse sistemas estériles de suministro adecuados (por ejemplo, líquidos, en gel, en suspensión, etc.) para administrar la presente invención . Las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, amortiguadores, mejoradores de la penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes y saborizantes (para la administración oral).

PORTADORES FARMACÉUTICAS DE ANTICUERPOS Y PÉPTIDOS Más específicamente, con respecto a los anticuerpos anti-MASP-2 y a los péptidos inhibidores, las formulaciones ilustrativas pueden administrarse parenteralmente como dosis inyectables de una solución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril, como por ejemplo, agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. En forma adicional, en las composiciones que contienen anticuerpos anti-MASP-2 y péptidos inhibidores pueden estar presentes sustancias auxiliares, como por ejemplo, agentes humectantes o emulsionantes, surfactantes, reguladoras de pH y lo similar. Los componentes adicionales de las composiciones farmacéuticas incluyen petróleo (por ejemplo, de origen animal, vegetal o sintético), por ejemplo, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles, tales como el propilenglicol o el polietilenglicol , son los portadores líquidos preferidos para las soluciones inyectables. Los anticuerpos anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores también pueden administrarse por medio de un depósito de inyección o preparación de implante que pueden formularse en tal forma que permita la liberación prolongada o por pulsos de los agentes activos.

PORTADORES FARMACÉU ICAMENTE ACEPTABLES DE INHIBIDORES DE LA EXPRESIÓN Más específicamente, con respecto a los inhibidores de expresión útiles en los métodos de la invención, se presentan composiciones que contienen un inhibidor de la expresión, tal como se describió en lo anterior y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede además contener un sistema de dispersión coloidal.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen inhibidores de la expresión pueden contener, aunque no están limitados a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposoma. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, aunque no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes . La preparación de estas composiciones incluye, por lo general, combinar el inhibidor de expresión con uno o más de los siguientes: amortiguadores o reguladores, antioxidantes, polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextrina, agentes secuestrantes, como por ejemplo, EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. La solución regulada neutra o la solución salina mixta con albúmina de suero no específica son ejemplos de diluyentes adecuados. En algunas modalidades, las composiciones pueden prepararse y formularse como emulsiones que son sistemas normalmente heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas (ver, Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger and Banker (eds.), arcek Dekker, Inc., N. Y., 1988). Los ejemplos de emulsionantes naturales utilizados en formulaciones en emulsión incluyen acacia, cera de abeja, lanolina, lecitina y fosfátidos. En una modalidad, las composiciones que incluyen ácidos nucleicos pueden ser formuladas como microemulsiones . Una microemulsión, como se utiliza en la presente, se refiere a un sistema de agua, aceite y un anfifilo, la cual es una solución liquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (ver, Rosoff en Pharmaceutical Dosage Forms, Vol . 1) . El método de la invención también puede utilizar liposomas para la transferencia y suministro de oligonucleótidos antisentido en el sitio deseado. Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones de los inhibidores de la expresión que se administran tópicamente pueden incluir parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, rocíos, líquidos y polvos. Pueden utilizarse portadores farmacéuticos convencionales, tanto como bases, espesantes y lo similar, acuosos, en polvos u oleosos.

FORMAS DE ADMINISTRACIÓN Las composiciones farmacéuticas que contienen agentes inhibidores de la MASP-2 pueden administrarse de varias formas, dependiendo de cual es la forma de administración más adecuada para la enfermedad que será tratada, la local o la generalizada o sistémica. Adicionalmente, como se describió ya en lo anterior con respecto a los procedimientos de revascularización extracorporal , los agentes inhibidores de la MASP-2 pueden administrarse introduciendo las composiciones de la presente invención en la sangre o el plasma en recirculación. Por otra parte, las composiciones de la presente invención pueden suministrarse recubriendo con las composiciones un dispositivo médico implantable o incorporándolas en dicho dispositivo.

SUMINISTRO SISTÉMICO O GENERALIZADO Como se utiliza en la presente, se pretende que las expresiones "suministro sistémico o generalizado" y "administración sistémica o generalizada" incluyan, aunque no se limitan a, las vías oral y parenteral que incluyen las vías intramuscular o IM, subcutánea, intravenosa o IV, intraarterial , por inhalación, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras que derivan eficazmente en la dispersión del agente suministrado en un solo sitio o en una multitud de sitios de acción terapéutica deseada. Las vías preferidas para el suministro sistémico de las composiciones de la presente incluyen las vías intravenosa, intramuscular, subcutánea y por inhalación. Podrá observarse que la vía de administración generalizada exacta de los agentes seleccionados utilizados en las composiciones particulares de la presente invención se determinará, en parte, para justificar la susceptibilidad del agente ante las vías de transformación metabólica asociadas a la via de administración determinada. Por ejemplo, lo más adecuado es que los agentes peptidérgicos se administren por otras vías que no sean la oral. Los anticuerpos y los polipéptidos inhibidores de la MASP-2 pueden administrarse a un sujeto que los necesite utilizando cualquier medio adecuado. Los métodos para suministrar los polipéptidos y los anticuerpos de la MASP-2 incluyen la administración por las vías oral, pulmonar, parenteral (por ejemplo, por inyección intramuscular, intraperitoneal , intravenosa o IV o subcutánea) , por inhalación (tal como a través de una formulación en polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual y pueden prepararse en formas de dosificación adecuadas para cada vía de administración. A manera de ejemplo representativo, los anticuerpos y los péptidos inhibidores de la MASP-2 pueden introducirse en un cuerpo vivo aplicándolos a una membrana corporal capaz de absorber los polipéptidos, por ejemplo, las membranas nasal, gastrointestinal y rectal. Los polipéptidos se aplican, normalmente, a la membrana absorbente junto con un promotor de permeación. (Ver, por ejemplo, Lee, V. H. L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V. H. L., J. Controlled Reléase 13:213, 1990; Lee, V. H. L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A. G., et al., J. Controlled Reléase, 13:241, 1990.) Por ejemplo, el STDHF es un derivado sintético de ácido fusidico, un surfactante esteroidal cuya estructura es semejante a las de las sales biliares y que se ha utilizado como un promotor o mejorador del suministro nasal. (Lee, W. A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990.) Los anticuerpos y polipéptidos inhibidores de la MASP-2 pueden introducirse asociados con otra molécula, como por ejemplo, un lipido, para proteger a los polipéptidos de la degradación enzimática. Por ejemplo, para proteger a ciertas proteínas de la hidrólisis enzimática en el cuerpo y, de este modo, prolongar la vida media, se ha utilizado la unión covalente de los polímeros, en especial, el polietilenglicol o PEG (Fuertges, F . , et al., J. Controlled Reléase 11:139, 1990). Para el suministro de proteínas se ha informado de muchos sistemas poliméricos (Bae, Y. H., et al., J. Controlled Reléase 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Reléase 10:195, 1989; Asano, . , et al., J. Controlled Reléase 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Reléase 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Reléase 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989). Recientemente, se han creado liposomas con mejores estabilidad sérica y tiempos medios de circulación (ver, por ejemplo, la patente núm. 5,741,516 de Webb). Por otra parte, se han revisado los diversos métodos de preparaciones liposomales y de tipo liposomal como potenciales portadores de fármacos (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU . Núm. 5, 567, 434, de Szoka; patente de EE. UU. Núm. 5,552, 157, de Yagi; la patente de EE . UU. Núm. 5, 565, 213, de Nakamori; la patente de EE . UU . Núm. 5,738, 868, de Shinkarenko y la patente de EE. UU. Núm. 5,795, 587, de Gao) . En el caso de las aplicaciones transdérmicas , los anticuerpos y los polipéptidos inhibidores de la ASP-2 pueden combinarse con otros ingredientes adecuados, como por ejemplo, portadores y/o adyuvantes. No hay limitaciones en cuanto a la naturaleza de estos otros ingredientes, con la excepción de que deben ser farmacéuticamente aceptables en lo que respecta a su administración deseada y no deben degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de los vehículos adecuados incluyen ungüentos, cremas, geles o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Los anticuerpos y los polipéptidos inhibidores de la MASP-2 también pueden estar impregnados en parches transdérmicos , yesos y vendajes, de preferencia, en forma líquida o semilíquida . Las composiciones de la presente invención también pueden ser administradas en forma generalizada de manera periódica en intervalos de tiempo determinados para que el efecto terapéutico se mantenga en el nivel deseado. Por ejemplo, pueden administrarse composiciones, como por ejemplo, mediante inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas o en intervalos más espaciados. El médico determinará el régimen de dosificación tomando en cuenta varios factores que pueden influir en la acción de la combinación de agentes. Estos factores incluirán el grado de desarrollo de la enfermedad que se está tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, asi como otros factores clínicos. La dosificación de cada agente individual variará en función del agente inhibidor de la MASP-2 que esté contenido en la composición, así como de la presencia y la naturaleza de cualquier vehículo de suministro del fármaco (por ejemplo, un vehículo que permita la liberación prolongada) . Por otra parte, es posible ajustar la magnitud de la dosis para compensar la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento cinético del o de los agentes suministrados.

ADMINISTRACIÓN LOCAL Como se utiliza en la presente, el término "local" incluye la aplicación de un fármaco en el sitio de acción localizada deseada o cerca de este sitio y podría incluir, por ejemplo, la administración tópica en la piel o en otros tejidos afectados, el suministro oftálmico, y la administración, colocación o irrigación intratecal o IT, intracerebroventricular o ICV, intraarticular, intracavidad, intracraneana o intravesicular . Es posible que se prefiera la administración local con la finalidad de emplear dosis más bajas, de evitar los efectos secundarios generalizados y de controlar con mayor precisión el tiempo de la administración y la concentración de los agentes activos en el sitio de la administración local. La administración local permite utilizar una concentración conocida en el sitio objetivo, sin que importe la variabilidad en el metabolismo, el flujo sanguíneo, etc., entre pacientes. Al emplear la forma de administración directa se mejora también el control de la dosificación. Es posible lograr la administración o el suministro local de un agente inhibidor de la MASP-2 en el contexto de los métodos quirúrgicos utilizados para el tratamiento de un padecimiento o enfermedad, como por ejemplo, durante procedimientos tales como la cirugía de revascularización arterial, la aterectomía, los procedimientos con láser, los procedimientos con ultrasonido, la angioplastia con globo y la colocación de endoprótesis . Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un inhibidor de la MASP-2 conjuntamente con la realización de un procedimiento de angioplastia con globo.

El procedimiento de la angioplastia con globo implica insertar en una arteria un catéter que tiene un globo desinflado. El globo desinflado se coloca cerca de la placa aterosclerótica y se infla de tal forma que la placa se comprima contra la pared vascular. Como resultado, la superficie del globo está en contacto con la capa de células endoteliales vasculares de la superficie del vaso sanguíneo. El agente inhibidor de la ASP-2 puede adherirse al catéter del globo para angioplastia de manera que el agente se libere en el sitio de la placa aterosclerótica. El agente puede adherirse al catéter de globo de conformidad con los procedimientos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, el agente puede colocarse en un compartimiento del catéter de globo hasta que éste se infla, momento en el cual, el agente es liberado en el entorno local. Alternativamente, el agente puede estar impregnado en la superficie del globo, de modo tal que entre en contacto con las células de la pared arterial cuando el globo se infle. El agente también puede aplicarse en un catéter de globo perforado, como los que se describen en Flugelman, M. Y., et al., Circulation 85:1110-1117, 1992. Ver también la solicitud PCT publicada WO 95/23161 sobre un procedimiento ilustrativo para adherir una proteína terapéutica a un catéter de angioplastia con globo. Del mismo modo, el agente inhibidor de la MASP-2 puede estar incluido en un gel o recubrimiento polimérico aplicado a una endoprótesis o puede incorporarse en el material de la endoprótesis, de tal forma que la endoprótesis eluye el agente inhibidor de la MASP-2 después de la colocación vascular. Las composiciones inhibidoras de la MASP-2 utilizadas en el tratamiento de la artritis y otros trastornos osteomusculares pueden administrarse localmente por medio dé una inyección intraarticular . Estas composiciones pueden incluir, en forma adecuada, un vehículo de suministro de liberación prolongada. En un ejemplo más de esos casos en los que puede ser deseable la administración local, las composiciones inhibidoras de la MASP-2 empleadas para tratar de enfermedades urogenitales pueden ser adecuadamente instiladas intravesicularmente o al interior de otra estructura urogenital.

RECUBRIMIENTOS EN UN DISPOSITIVO MÉDICO Los agentes inhibidores de la MASP-2, tales como anticuerpos y péptidos inhibidores, pueden ser inmovilizados sobre (o en el interior) de una superficie de un dispositivo médico implantable o adherible. La superficie modificada estará, normalmente, en contacto con el tejido vivo después de su implantación en el cuerpo del animal. La expresión "dispositivo médico implantable o adherible" está destinada a cualquier dispositivo que se implante en o se adhiera al tejido de un cuerpo animal, durante la operación normal del dispositivo (por ejemplo, endoprótesis y dispositivos implantadles suministradores de fármacos). Estos dispositivos médicos implantables o adheribles pueden estar hechos de, por ejemplo, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, dextrano, Sepharose, agar, almidón, nailon, acero inoxidable, titanio, y polímeros biodegradables o biocompatibles . La adhesión de la proteína a un dispositivo puede lograrse utilizando cualquier técnica que no destruya la actividad biológica de la proteína adherida, por ejemplo, adhiriendo al dispositivo uno o los dos residuos del extremo N o C de la proteína. La adhesión también puede realizarse en uno o más sitios internos de la proteína. También puede emplearse la adhesión múltiple (es decir, tanto interna como en los extremos de la proteína) . Una superficie de un dispositivo médico implantable o adherible puede modificarse para que incluya grupos funcionales (por ejemplo, carboxilo, amida, amino, éter, hidroxilo, ciano, nitrido, sulfamido, acetilínico, epóxido, silánico, anhidro, succinímico, azido) para inmovilizar la proteína en los mismos. El acoplamiento de compuestos químicos incluye, pero no se limita a, la formación de ésteres, éteres, amidas, derivados azido y sulfanamido, cianato y otros enlaces con los grupos funcionales disponibles en los anticuerpos o péptidos inhibidores de la MASP-2. Los anticuerpos o fragmentos inhibidores de la MASP-2 también pueden unirse no covalentemente al agregar a la proteina una secuencia identificadora de afinidad, como por ejemplo, GST (D. B. Smith and K. S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidinas (E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411:77, 1987) o biotina. Estos identificadores de afinidad pueden ser utilizados para adherir reversiblemente la proteina al dispositivo. Las proteínas también pueden adherirse covalentemente a la superficie del cuerpo del dispositivo, por ejemplo, mediante la activación covalente de la superficie del dispositivo médico. A manera de ejemplo representativo, la o las proteínas matricelulares pueden adherirse al cuerpo del dispositivo utilizando cualquiera de los siguientes pares de grupos reactivos (un elemento del par está presente en la superficie del cuerpo del dispositivo, en tanto que el otro está presente en la o las proteínas matricelulares) : hidroxilo/ácido carboxílico para producir un enlace éster; hidroxilo/anhídrido para producir un enlace éster; hidroxilo/isocianato para producir un enlace uretano. Aquella superficie del cuerpo del dispositivo que no posea grupos reactivos útiles puede ser tratada por mordentado con plasma de descarga de radiofrecuencia o RFGD para formar grupos reactivos con la finalidad de permitir que la o las proteínas matricelulares se depositen (por ejemplo, por tratamiento con plasma de oxígeno para introducir grupos que contienen oxígeno; por tratamiento con plasma de aminopropilo para introducir grupos amina) . Los agentes inhibidores de la ASP-2 que contienen moléculas de ácido nucleico como las antisentido, inhibidores peptídicos que codifican para ARNi o ADN pueden ser impregnados en matrices porosas adheridas al cuerpo del dispositivo. Las matrices porosas representativas útiles para formar la capa superficial son las que se preparan a partir de tendón o de colágeno dérmico, como el que puede obtiene de una variedad de proveedores comerciales (por ejemplo, Sigma and Collagen Corporation) o matrices de colágeno preparadas como se describe en las patentes de EE. UU . Núm. 4, 394,370 de Jefferies y Núm. 4,975,527 de Koezuka. A un material colagenoso se le denomina UltraFiberMR, mismo que es fabricado por Norian Corp. (Mountain View, California). Si se desea también pueden emplearse ciertas matrices poliméricas e incluir polímeros de éster de acrílico y polímeros de ácido láctico, como se describe en las patentes de EE. UU. Núm. 4, 526, 909 de Urist y Núm. 4,563,489 de Urist, por ejemplo. Ejemplos particulares de polímeros útiles son los ortoésteres, anhídridos, propileno-cofumaratos o un polímero de uno o más monómeros del ácido a-hidroxicarboxílico (por ejemplo, ácido -hidroxiacético (ácido glicólico) y/o ácido a- hidroxipropiónico (ácido láctico) ) .

REGÍMENES DE TRATAMIENTO En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto que es susceptible de o que de alguna manera está en riesgo de presentar alguna enfermedad asociada con la activación del complemento dependiente de la MASP-2, dicha administración se realiza en la cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de presentar los síntomas de dicha enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se le administran al sujeto que se sospeche o se sepa que padece alguna enfermedad asociada con la activación del complemento dependiente de la MASP-2, en una cantidad terapéutica eficaz, suficiente para aliviar o para reducir, al menos parcialmente, los síntomas de la enfermedad. En ambos regímenes, el profiláctico y el terapéutico, las composiciones que contienen agentes inhibidores de la MASP-2 pueden administrarse en varias dosis hasta que en el sujeto se haya alcanzado una evolución terapéutica suficiente. La aplicación de las composiciones inhibidoras de la MASP-2 de la presente invención pueden realizarse por medio de una sola administración de la composición o de una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de una enfermedad aguda, por ejemplo, la lesión por revascularización u otra lesión traumática. La composición puede, en forma alternativa, administrarse a intervalos periódicos durante un lapso de tiempo prolongado para el tratamiento de enfermedades crónicas, por ejemplo, artritis o psoriasis. Los métodos y las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para inhibir la inflamación y los procesos relacionados que se producen, normalmente, como resultado de procedimientos médicos y quirúrgicos terapéuticos y de diagnóstico. Para inhibir estos procesos, las composición inhibidora de la ASP-2 de la presente invención puede aplicarse en forma periprocedimental . Como se utiliza en la presente, el término "periprocedimental" se refiere a la administración de la composición inhibidora preprocedimentalmente y/o intraprocedimentalmente y/o posprocedimentalmente, es decir, antes del procedimiento; antes y durante el procedimiento; antes y después del procedimiento; antes, durante y después del procedimiento; durante el procedimiento; durante y después del procedimiento; o después del procedimiento. La aplicación periprocedimental puede realizarse mediante la administración local de la composición en el sitio quirúrgico o del procedimiento, por ejemplo, mediante la inyección o la irrigación continua o intermitente del sitio o mediante la administración sistémica. Los métodos adecuados para la administración local perioperatoria de las soluciones del agente inhibidor de la MASP-2 se presentan en las patentes de EE . UU. Núm. 6, 420, 432 de Demopulos y 6, 645,168 del mismo inventor. Los métodos adecuados para la administración local de las composiciones condroprotectoras que incluyen uno o más agentes inhibidores de la MASP-2 se describen en la solicitud internacional de patente PCT WO 01/07067 A2. Los métodos y las composiciones adecuados para dirigir la administración sistémica de composiciones condroprotectoras que incluyen uno o más agentes inhibidores de la MASP-2 se describen en la solicitud internacional de patente PCT WO 03/063799 A2.

VI . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran simplemente la mejor forma considerada hasta el momento para poner en práctica la invención, no obstante, no deberá interpretarse que la invención se limita a éstos. Todas la literatura técnica citada en la presente queda de este modo, explícitamente incorporada como referencia.

EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la generación de una cepa de ratón con deficiencia de MASP-2 (MASP-2-/-) pero con suficiente MApl9 (MApl9+/+) . Materiales Métodos : El vector de direccionamiento pKO-NTKV 1901 fue diseñado para alterar los tres exones que codifican para el extremo terminal C de la MASP-2 de múrido, que incluye al exon que codifica para el dominio de la serina proteasa, como se muestra en la figura 4. El PKO-NTKV 1901 se utilizó para transinfectar ( transíectar ) la linea celular ES (SV129 Ola) de múrido E14.1a. Se seleccionaron los clones resistentes a la neomicina y los sensibles a la timidina cinasa. 600 clones ES se examinaron y, de estos, se identificaron cuatro clones diferentes, mismos que por medio de transferencia Southern se verificó que contuvieran el direccionamiento selectivo esperado y el suceso de recombinación, como se muestra en la figura . A partir de estos cuatro clones positivos se generaron los híbridos o quimeras mediante transferencia de embriones. Los híbridos se retrocruzaron luego con el antecedente genético C57/BL6 para crear machos transgénicos . Los machos transgénicos se cruzaron con las hembras para generar Fls, donde el 50% de la descendencia presentó heterocigosidad del gen MASP-2 alterado. Los ratones heterocigotos se entrecruzaron para generar descendencia homocigota con deficiencia de MASP-2, lo que derivó en ratones heterocigotos y silvestres en una proporción de 1:2:1, respectivamente. Resultados y fenotipo: Se encontró que los ratones homocigotos con deficiencia de MASP-2-/- obtenidos eran viables y fértiles y, mediante transferencia Southern, se verificó la deficiencia de MASP-2 para confirmar el correcto suceso de direccionamiento, mediante transferencia Northern, para confirmar la ausencia del ARNm de la MASP-2 y, mediante transferencia Western, para confirmar la ausencia de la proteina MASP-2 (los datos no se muestran) . La presencia del ARNm de la MApl9 y la ausencia del ARNm de la MASP-2 se confirmaron adicionalmente utilizando la RT-PCR con resolución temporal en una máquina LightCycler. Los ratones MASP-2-/-continúan expresando la MApl9, la MASP-1 y el ARNm de la MASP-3 y la proteina, tal como se esperaba (los datos no se muestran) . La presencia y abundancia del ARNm de la Properdina, factor B, factor D, C4, C2 y C3 en los ratones MASP-2-/- se evaluó mediante un análisis en la máquina LightCycler y se encontró que era idéntica a la de los ratones de control silvestres de la misma carnada (los datos no se muestran) . El plasma de los ratones homocigotos MASP-2-/- carece por completo de la activación del complemento mediada por la vía de la lectina y la activación del complemento por la vía alternativa como se describirá adicionalmente en el Ejemplo 2. La generación de una cepa MASP-2-/- en un antecedente C57/BL6 puro: Los ratones MASP-2-/- se retrocruzaron con una linea C57/BL6 pura por nueve generaciones para utilizar a la cepa MASP-2-/- como modelo animal para experimentos.

EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra que para la activación del complemento por la vía alternativa y la vía de la lectina es necesaria la ASP-2. Métodos y Materiales : Prueba de escisión del C4 especifico de la via de la lectina: Peterson et al.,J. Immunol . Methods 257:101 (2001), han descrito una prueba de escisión del C4 que determina la activación por la via de la lectina que se deriva del ácido lipoteicoico o LTA, por sus siglas en inglés, proveniente de S. aureus, que se une a la L-ficolina. La prueba descrita en el Ejemplo 11 se adaptó para determinar la activación de la via de la lectina a través de la MBL, recubriendo la placa con LPS y mañana o cimosán antes de añadir el suero de ratones MASP-2-/-, como se describe a continuación. La prueba también se modificó para eliminar la posibilidad de la escisión del C4 debida a la via clásica. Lo anterior se logró utilizando un amortiguador de dilución de la muestra que contiene NaCl 1 M, lo cual permite la unión de gran afinidad de los componentes de reconocimiento de la via de la lectina con sus ligandos, aunque evia la activación de C4 endógeno, excluyendo de esta manera, la participación de la via clásica al disociar el complejo Cl . Dicho en pocas palabras, en la prueba modificada, las muestras de suero (diluidas en un amortiguador con gran contenido de sal (NaCl 1 M) ) se añadieron a las placas recubiertas con ligando, seguido de la adición de una cantidad constante de C4 purificado en un amortiguador con una concentración fisiológica de sal. Los complejos de reconocimiento ligados que contienen la MASP-2 escinden al C4, lo que produce la precipitación del C4b. Métodos de análisis: 1) Las placas para microtitulación Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, núm. de catálogo 442404, Fisher Scientific) se recubrieron con 1 pg/ml de mañana (M7504 Sigma) o con cualquier otro ligando (por ejemplo, como los que se enumeran más adelante) diluido en un amortiguador de recubrimiento (Na2C03 15 mM, NaHC03 35 mM, pH 9.6). En el análisis se utilizaron los siguientes reactivos : a. mañana (1 pg/pozo de mañana (M7504 Sigma) en 100 µ? de la solución amortiguadora de recubrimiento) ; b. cimosán (1 pg/pozo de cimosán (Sigma) en 100 µ? de la solución amortiguadora de recubrimiento) ; c. LTA (1 pg/pozo en 100 µ? de la solución amortiguadora de recubrimiento o 2 pg/pozo en 20 µ? de metanol ) ; d. 1 pg del Mab 4H5 especifico de la H-ficolina en la solución amortiguadora de recubrimiento; e. PSA de Aerococcus viridans (2 g/pozo en 100 µ? de la solución amortiguadora de recubrimiento) ; f. 100 µ?/???? de S. aureus fijada en formalina DSM20233 (OD550 = 0.5) en la solución amortiguadora de recubrimiento. 2) Las placas se incubaron durante toda la noche a 4°C. 3) Después de incubar durante toda la noche, los sitios de la unión con proteina residual se saturaron al incubar las placas con 0.1% de regulador de bloqueo HSA-TBS (0.1% (p/v) de HSA en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN3 1.5 mM, pH 7.4) durante 1-3 horas, las placas se lavaron 3 veces con TBS/Tween/Ca2+ (TBS con 0.05% de Tween 20 y CaCl2 5 mM, MgCl2 1 mM, pH 7.4). 4) Las muestras de suero que se van a probar se diluyeron en solución amortiguadora de unión con MBL (NaCl 1 M) , estas muestras diluidas se añadieron luego a las placas y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Los pozos ¦ que recibieron sólo la solución amortiguadora se utilizaron como elementos de control negativo. 5) Después de incubar toda la noche a 4°C, las placas se lavaron 3 veces con TBS/tween/Ca2+ . El C4 de humano (100 µ?/???? de 1 g/ml diluido en BBS (barbital 4mM , NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7.4)) se añadió entonces a las placas y se incubó durante 90 minutos a 37°C. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con TBS/tween/Ca . 6) La precipitación de C4b se detectó con un C4c antihumano de pollo conjugado con fosfatasa alcalina (diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+) , el cual se añadió a las placas y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo 3 veces con TBS/tween/Ca2+ . 7) La fosfatasa alcalina se detectó añadiendo 100 µ? de solución de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo, incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos y leyendo la OD4 05 en un lector de placa de microtitulación . Resultados : Las figuras 6A y 6B muestran la cantidad de C4b depositada en mañana (Figura 6A) y cimosán (Figura 6B) en diluciones de suero de MASP-2+/+ (cruces), MASP-2+/- (circuios) y MASP-2-/- (triángulos cerrados) . La figura 6C muestra la actividad de la C4 convertasa relativa en placas recubiertas con cimosán (barras blancas) o mañana (barras sombreadas) de ratones MASP-2-/+ (n = 5) y ratones MASP-2-/- (n = 4) con respecto a los ratones silvestres (n = 5) con base en la determinación de la cantidad de C4b depositado normalizada al suero silvestre. Las barras de error representan la desviación estándar. Como se muestra en las figuras 6A a 6C, el plasma de los ratones MASP-2-/- es totalmente deficiente en la activación del complemento mediada por la via de la lectina en placas recubiertas con mañana y cimosán. Estos resultados demuestran con toda claridad que la MASP-2, pero no la MASP-1 o la MASP-3, es el componente efector de la vía de la lectina. Prueba de precipitación de C3b: 1) Placas de microtitulación Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, Núm. de catálogo 442404, Fisher Scientific) se recubrieron con 1 pg/pozo de mañana (M7504 Sigma) o con cualquier otro ligando diluido en la solución amortiguadora de recubrimiento (Na2C03 15 mM, NaHC03 35 mM, pH 9.6) y se incubaron durante toda la noche a 4°C. 2) Los sitios de unión con proteina residual se saturaron al incubar la placa con un amortiguador bloqueador de HSA-TBS al 0.1% (0.1% (p/v) de HSA en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN3 1.5 mM, pH 7.4) de 1 a 3 horas . 3) Las placas se lavaron con TBS/tw/Ca++ (TBS con 0.05% de Tween 20 y CaCl2 5 mM) , luego, a las muestras de suero se les añadió BBS diluido (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7.4) . Los pozos que sólo recibieron la solución amortiguadora se utilizaron como elementos de control negativo. A un conjunto de muestras séricas de control obtenidas de ratones MASP-2-/-silvestres se les agotó el Clq antes de utilizarlo en el ensayo. El suero de ratón al que se le agotó el Clq se preparó utilizando Dynabeads acopladas con proteina A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubiertas con IgG Clq antihumano de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) de conformidad con las instrucciones del proveedor. 4) Después de incubar durante toda la noche a 4°C y de otro lavado con TBS/tw/Ca++, el C3 convertido y ligado se detectó con un anticuerpo C3c-antihumano policlonal (Dako A 062) diluido 1:1000 en TBS/tw/Ca++) . El anticuerpo secundario es IgG anticonejo de cabra (de molécula completa) conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma Immunochemicals A-3812) diluido 1:10,000 en TBS/tw/Ca++. La presencia de la vía alternativa del complemento o "AP", por "alternative pathway" se determinó al añadir 100 µ? de solución de sustrato (conjuntos de tabletas "Sigma Fast p-Nitrophenyl Phosphate", Sigma) y al incubar a temperatura ambiente. La hidrólisis se supervisó cuantitativamente midiendo la absorción a 405 nm en una lectora placas de microtitulación . Para cada análisis se preparó una curva estándar, utilizando para ello una serie de diluciones de las muestras de plasma/suero. Resultados : Los resultados mostrados en las figuras 7A y 7B provienen del suero combinado de varios ratones. Las estrellas representan suero MASP-2+/+, los circuios llenos representan suero MASP-2+/+ en el que se agotó el Clq, los cuadrados vacíos representan suero MASP-2-/- y los triángulos vacíos representan suero MASP-2-/-en el que se agotó el Clq. Como se muestra en las figuras 7A y 7B, el suero de ratones MASP-2-/- analizado en una prueba de precipitación de C3b demostró tener muy bajos niveles de activación de C3 en placas recubiertas con mañana (figura 7A) y en placas recubiertas con cimosán (figura 7B) . Este resultado demuestra claramente que la MASP-2 es necesaria para contribuir a la generación inicial de C3b a partir del C3 para iniciar al complemento por la via alternativa. Este es un resultado sorprendente en vista de la ampliamente aceptada opinión de que los factores C3, el factor B, el factor D y la properdina del complemento forman una via alternativa funcional independiente en la cual el C3 puede presentar un cambio de conformación espontáneo a una forma de "tipo C3b", el cual genera entonces una iC3Bb convertasa en fase liquida y deposita moléculas de C3b en superficies de activación como el cimosán. La MASP-2 recombinante reconstituye la activación del C4 dependiente de la via de la lectina en suero de ratones MASP-2-/- Para determinar que la ausencia de la MASP-2 era la causa directa de la pérdida de la activación del C4 dependiente de la via de la lectina en ratones MASP-2-/-, se estudió el efecto de añadir proteina MASP-2 recombinante a muestras de suero en el ensayo de escisión de C4 descrito arriba. Las proteínas recombinantes MASP-2 de múrido funcionalmente activa y MASP-2 de múrido catalíticamente inactiva (en la que el sitio activo del residuo de serina del dominio de la serina proteasa se sustituyó con el residuo de alanina) fueron producidas y purificadas, tal y como se describe más adelante en el Ejemplo 5. El suero combinado de 4 ratones MASP-2-/- se incubó previamente con concentraciones cada vez mayores de la MASP-2 recombinante de múrido o de la MASP-2A recombinante de múrido inactiva y la actividad de la C4 convertasa se determinó como ya se mencionó arriba. Resultados : Como se muestra en la figura 8, la adición de proteína MASP-2 recombinante de múrido funcionalmente activa (indicada con triángulos vacíos) al suero obtenido de ratones MASP-2-/- restauró la activación del C4 dependiente de la vía de la lectina, en función de la concentración, en tanto que la proteína MASP-2A catalíticamente inactiva de múrido (indicada con estrellas) no restauró la activación del C4. Los resultados mostrados en la figura 8 se normalizaron a la activación del C4 observada en el suero de ratón silvestre combinado (mostrada con la línea a trazos) .

EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la generación de una cepa de ratones transgénicos que es MASP-2-/- de múrido, MApl9+/+ y que expresa un transgen MASP-2 de humano (una MASP-2 de múrido con desactivación génica y una MASP-2 de humano con activación génica) . Materiales y métodos : Se construyó un minigen que codifica para la MASP-2 de humano, llamado "mini hMASP-2" (SEQ ID NO: 49), como se muestra en la figura 5, el cual contiene la región promotora del gen MASP-2 de humano, que incluye los primeros 3 exones (del exón 1 al exón 3) seguidos de la secuencia de ADNc que representa la secuencia de codificación de los siguientes 8 exones, codificando de esta manera la proteina MASP-2 de longitud completa, impulsada por su promotor endógeno. La mini construcción hMASP-2 se inyectó en cigotos fecundados de MASP-2-/- con la finalidad de sustituir el gen deficiente de la MASP-2 de múrido con la MASP-2 de humano de expresión transgénica.

EJEMPLO 4 Este ejemplo describe el aislamiento de la proteina MASP-2 de humano en forma de proenzima de suero humano . Método para el aislamiento de la MASP-2 de humano: Matsushita et al., en J. Immunol. 165:2637-2642, 2000, han descrito un método para aislar la MASP-2 del suero humano. En pocas palabras, el suero humano se hace pasar a través de una columna de mañana de levadura-Sepharose utilizando una solución amortiguadora de imidazol 10 mM (pH 6.0) que contenia NaCl 0.2 M, CaCl2 20 mM, NPGB 0.2 mM, p-APMSF 20 µ y 2% de manitol . Las proenzimas MASP-1 y MASP-2 se complejan con MBL y se eluyen con la solución amortiguadora anterior que contenia mañosa 0.3 M. Para separar las proenzimas MASP-1 y MASP-2 de la MBL, unas preparaciones que contenían el complejo se aplicaron a Sepharose-antiMBL y las MASP se eluyeron luego con solución amortiguadora de imidazol que contenía EDTA 20 mM y NaCl 1 M. Finalmente, las proenzimas MASP-1 y MASP-2 se separaron una de la otra haciéndolas pasar a través de Sepharose-antiMASP-1 en la misma solución amortiguadora usada para la Sepharose-antiMBL. La MASP-2 se recuperó en el efluente, en tanto que la MASP-1 se eluyó con un amortiguador de glicina 0.1 M (pH 2.2) .

EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la expresión recombinante y la producción proteínica de MASP-2 recombinante de humano de longitud completa, de rata y de múrido, de polipéptidos derivados de la MASP-2 y de formas mutantes de la MASP-2 catalíticamente inactivada.

Expresión de la MASP-2 de humano de longitud completa, de múrido y de rata: La secuencia de ADNc de longitud completa de la MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 4) también fue subclonada en el vector de expresión de mamífero pCI-Neo (Promega), lo que promueve la expresión eucariótica bajo el control de la región potenciadora/promotora CMV (descrita por Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)) . Tanto el ADNc de ratón de longitud completa (SEQ ID NO: 50) como el ADNc de la MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 53) se subclonaron en el vector de expresión pED. Los vectores de expresión de la MASP-2 fueron transinfectados luego en la linea celular ovárica DXB1 de hámsteres chinos utilizando el procedimiento de transinfección estándar de fosfato de calcio descrito por Maniatis et al., 1989. Las células transinfectadas con estas construcciones crecieron muy lentamente, lo que implicó que la proteasa codificada es citotóxica . En otra estrategia, la construcción minigénica (SEQ ID NO: 49) que contiene el ADNc de humano de la MASP-2 promovida por su promotor endógeno es temporalmente transinfectada en células ováricas de hámster chino o CHO, por sus siglas en inglés. En el medio de ' cultivo se secretó la proteina MASP-2 de humano y se aisló como se describe más adelante. Expresión de la MASP-2 de longitud completa catalíticamente inactivada: Fundamento: La MASP-2 se activa mediante escisión catalítica después de que los componentes de reconocimiento de la MBL o las ficolinas (cualquiera de la L-ficolina, la H-ficolina o la M-ficolina) se unen a sus respectivos patrones glucidicos. La escisión autocatalitica que deriva en la activación de la MASP-2 ocurre con frecuencia durante el procedimiento de aislar a la MASP-2 del suero, o durante la purificación posterior a la expresión recombinante . Con la finalidad de preparar una proteina más estable que será utilizada como antigeno, se generó una forma catalíticamente inactivada de la MASP-2, denominada MASP-2A, al sustituir el residuo de serina presente en la triada catalítica del dominio de la proteasa con un residuo de alanina en rata (SEQ ID NO: 55 Ser617 a Ala617); en ratón (SEQ ID NO: 52 Ser617 a Ala617) o en humano (SEQ ID NO: 3 Ser618 a Ala618) . Para generar las proteínas MASP-2A catalíticamente inactivadas de humano y de múrido, se realizó la mutagenia dirigida al sitio utilizando los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5. El objetivo del diseño de los oligonucleótidos de la Tabla 5 es hibridar la región del ADNc de humano y de múrido que codifica para la serina enzimáticamente activada y el oligonucleótido contiene un malapareamiento con la finalidad de cambiar el codón de la serina en un codón de alanina. Por ejemplo, se usaron los oligonucleótidos SEQ ID NO: 56 a 59 de la PCR combinados con el ADNc de la MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 4) para amplificar la región del codón de inicio a la serina enzimáticamente activada y de la serina al codón de fin para generar la lectura abierta completa de la ASP-2A mutada que contiene la mutación Ser618 a Ala618. Los productos de la PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa y de la preparación de la banda y, utilizando un procedimiento estándar de adición de colas, se generaron traslapes sencillos de adenosina. La MASP-2A a la que se añadió adenosina se clonó entonces en el vector sencillo pGEM-T, transformado en E. coli. Se generó una proteina MASP-2A de rata, catalíticamente inactivada, por la adición de cinasa y la hibridación de la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 65 combinando estos dos oligonucleótidos en cantidades equimolares, calentándolos a 100°C durante 2 minutos y enfriándolos lentamente hasta temperatura ambiente. El fragmento hibridado resultante tiene extremos compatibles Pstl y Xbal y se insertó en lugar del fragmento Pstl-Xbal del ADNc de la MASP-2 de rata silvestre (SEQ ID NO: 53) para generar la MASP-2A de rata. 51 GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT31 (SEQ ID NO: 64) 5 ' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA3 ' (SEQ ID NO: 65) Cada una de de las ASP-2A de humano, de múrido y de rata se subclonó adicionalmente ya sea en vectores de expresión pED o pCI-Neo de mamífero y se transinfectó en la línea celular ovárica DXB1 de hámster chino, como se describe a continuación. En otra estrategia, se creó una forma catalíticamente inactivada de la MASP-2, utilizando el método descrito por Chen et al., J. Biol. Chem. , 276 (28) : 25894-25902, 2001. En pocas palabras, el plásmido que contiene el ADNc de la MASP-2 de humano de longitud completa (descrito por Thiel et al., Nature 386:506, 1997) se digirió con Xhol y EcoRl y el ADNc de la MASP-2 (descrito en la presente como SEQ ID NO: 4) se clonó en los sitios de restricción correspondientes del vector de transferencia del baculovirus pFastBacl (Life Technologies, NY) . El sitio activo de la serina proteasa MASP-2 en Ser618 se alteró entonces a Ala618 al sustituir los oligonucleótidos de doble hebra que codifican para los aminoácidos 610 a 625 de la región peptídica (SEQ ID NO: 13) con los aminoácidos 610 a 625 de la región nativa para crear un polipéptido de longitud completa de la MASP-2 con un dominio de proteasa inactivo. Construcción de los plásmidos de expresión que contienen regiones peptídicas derivadas de la MASP-2 de humano. Las siguientes construcciones fueron producidas utilizando al péptido de señalización de la MASP-2 (residuos 1 a 15 de la SEQ ID NO: 5) para secretar varios dominios de la MASP-2. La construcción que expresa el dominio CUBI de la MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 8) se creó amplificando por PCR la región que codifica los residuos 1 a 121 de la MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio CUBI del extremo N) . La construcción que expresa el dominio CUBIEGF de la MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 9) se creó amplificando por PCR la región que codifica los residuos 1 a 166 de la MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio CUBIEGF del extremo N) . La construcción que expresa el dominio CUBIEGFCUBII de la MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 10) se creó amplificando por PCR la región que codifica los residuos 1 a 293 de la MASP-2 (SEQ ID NO: 6) (correspondiente al dominio CUBIEGFCUBII del extremo N) . Los dominios mencionados en lo anterior se amplificaron mediante PCR, utilizando a la polimerasa VentR y a la pBS-MASP-2 como plantilla, de conformidad con los métodos de PCR establecidos. La secuencia cebadora 5' del cebador de sentido (51-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3 ' SEQ ID NO: 34) introduce un sitio de restricción BamHI (subrayado) en el extremo 5' de los productos de la PCR. Los cebadores antisentido de cada uno de los dominios MASP-2, mostrados más adelante en la Tabla 5, se diseñaron para introducir un codón de fin (en negritas) seguido de un sitio EcoRI (subrayado) en el extremo de cada producto de la PCR. Una vez amplificados, los fragmentos de ADN se digirieron con BamHI y EcoRI y se clonaron en los correspondientes sitios del vector pFastBacl . Las creaciones o construcciones resultantes se caracterizaron usando cartografía de restricción y se confirmaron por medio de la secuenciación del ADNds .

Tabla 5: CEBADORES PCR DE LA MASP-2 Expresión eucariótica recombinante de la MASP-2 y producción proteinica de la MASP-2A de humano, de rata y de ratón enzimáticamente inactivada La MASP-2 y las construcciones de expresión de la MASP-2A arriba descritas fueron transinfectadas en células DXBl utilizando el procedimiento estándar de transinfección con fosfato de calcio (Maniatis et al., 1989) . La MASP-2A se produjo en un medio sin suero para asegurar que las preparaciones no estuviesen contaminadas con otras proteínas séricas. Los medios se recolectaron de células confluentes cada dos días (cuatro veces en total) . La concentración de la ASP-2A recombinante fue en promedio de 1.5 mg/litro del medio de cultivo en cada una de las tres especies . Purificación de la proteina MASP-2A: La MASP-2A (Ser-Ala mutante descrita en lo anterior) se purificó usando cromatografía por afinidad en columnas de MBP-A-agarosa. Esta estrategia permitió su rápida purificación sin utilizar etiquetas ajenas. La MASP-2A (100-200 mi del medio diluido con un volumen igual de la solución amortiguadora de carga (Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, que contenía NaCl 150 mM y CaCl2 mM) se cargó en una columna de afinidad con MBP-agarosa (4 mi) preequilibrada con 10 mi de la solución amortiguadora de carga. Después de lavar con 10 mi más de la solución amortiguadora de carga, la proteína se eluyó en fracciones de 1 mi con Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, que contenía NaCl 1.25 M y EDTA 10 mM . Las fracciones que contienen la MASP-2A fueron identificadas con SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida . Cuando sea necesario, la MASP-2A se purificó adicionalmente usando cromatografía de intercambio iónico en una columna MonoQ (HR 5/5) . La proteína se dializó con Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, que contenía NaCl 50 mM y se colocó en la columna equilibrada en la misma solución amortiguadora. Después del lavado, la MASP-2A unida se eluyó con un gradiente de 10 mi de NaCl de 0.05 a 1 M. Resultados : De los 200 mi del medio se obtuvo una rendimiento de 0.25 a 0.5 mg de la proteina MASP-2A. La masa molecular de 77.5 kDa determinada usando MALDI-MS es mayor que el valor calculado del polipéptido sin modificar (73.5 kDa) debido a la glucosilación . La unión de glucanos en cada uno de los sitios de la N-glucosilación explica la masa observada. La MASP-2A migra como una sola banda en los geles de SDS-poliacrilamida, lo que demuestra que durante la biosintesis no se procesó en forma proteolitica . La masa molecular ponderada en peso determinada por medio de ultracentrifugación en equilibrio está en concordancia con el valor calculado para los homodimeros del polipéptido glucosilado.

PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES DE LA MASP-2 DE HUMANO Thielens, N. M . , et al., J. Immunol. 166:5068- 5077, 2001, describen otro método para producir MASP-2 recombinante y polipéptidos derivados de la MASP-2A. En pocas palabras, las células del insecto Spodoptera frugiperda (células Ready-Plaque Sf9 obtenidas de Novagen, Madison, WI) se desarrollaron y mantuvieron en medio sin suero Sf900ll (Life Technologies) suplementado con 50 IU/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies) . Las células del insecto Trichoplusia ni (High Five) (suministradas por Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Francia) se mantuvieron en el medio TC100 (Life Technologies) que contenia 10% de FCS (Dominique Dutscher, Brumath, Francia) suplementado con 50 IU/ml penicilina y 50 mg/ml estreptomicina. Utilizando el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies) se generaron los baculovirus recombinantes . El ADN de BACmid se purificó utilizando el sistema de purificación Quiagen midiprep (Quiagen) y fue utilizado para transinfectar células Sf9 de insectos utilizando "cellfectin" en un medio Sf900 II SFM (Life Technologies), como se describe en el protocolo del fabricante. Las partículas del virus recombinante se recolectaron 4 días después, se cuantificaron usando el ensayo en placa de virus y se amplificaron como lo describen King y Possee en The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., Londres, págs . 111-114, 1992. Las células High Five (1.75 x 107 células/175 cm2 del matraz de cultivo de tejido) se infectaron con los virus recombinantes que contienen los polipéptidos de la MASP-2 a una multiplicidad de infección de 2 en el medio Sf900 II SFM a 20°C durante 96 horas. Los sobrenadantes se recolectaron por medio de centrifugación y se les añadió fosfofluoridato de diisopropilo hasta una concentración final de 1 mM. Los polipéptidos de la MASP-2 se secretaron en el medio de cultivo. Los sobrenadantes del cultivo se sometieron a diálisis contra NaCl 50 mM, CaCl2 lmM, clorhidrato de trietanolamina 50 mM, pH 8.1 y se cargaron en una columna Q-Sepharose Fast Flow a 1.5 ml/min. (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm) , donde la misma solución amortiguadora está en equilibrio. La elución se realizó con un gradiente lineal de 1.2 litros para NaCl 350 mM en la misma solución amortiguadora. Las fracciones que contienen los polipéptidos de la MASP-2 recombinantes se identificaron usando el análisis por transferencia Western, se precipitaron mediante la adición de (NH4)2S04 al 60% (p/v) hasta y se dejaron reposar toda la noche a 4°C. Las perlas volvieron a suspenderse en NaCl 145 mM, CaCl2 1 mM, clorhidrato de trietanolamina 50 mM, pH 7.4 y se colocaron en una columna TSK G3000 SWG (7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) , donde la misma solución amortiguadora está en equilibrio. Los polipéptidos purificados se concentraron entonces hasta 0.3 mg/ml mediante ultrafiltración en microconcentradores Microsep (peso molecular de corte = 10,000) (Filtron, Karlstein, Alemania) .

EJEMPLO 6 Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos policlonales contra polipéptidos de la MASP-2. Materiales y métodos : Antigenos MASP-2 : El antisuero de MASP-2 antihumano policlonal se produce al inmunizar conejos con los siguientes polipéptidos de la MASP-2 aislados: MASP-2 de humano (SEQ ID NO: 6) aislada del suero, como se describió en el Ejemplo 4; MASP-2 recombinante de humano (SEQ ID NO: 6); MASP-2A que contiene el dominio de proteasa inactivo (SEQ ID NO: 13), como se describió en los Ejemplos 4 y 5; y el CUBI recombinante (SEQ ID NO: 8); CUBEGFI (SEQ ID NO: 9) y CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10) expresado como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. Anticuerpos policlonales: Conejos de seis semanas de edad, cebados con BCG (vacuna contra el bacilo de Calmette-Guerin) fueron inmunizados al inyectarles 100 pg del polipéptido de la MASP-2 a una concentración de 100 g/ml en solución salina estéril. Las inyecciones se aplicaron cada 4 semanas, con un titulo de anticuerpos monitoreado por medio de un ensayo ELISA, como se describe en el Ejemplo 7. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron para purificar los anticuerpos mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

EJEMPLO 7 Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos monoclonales de múrido contra polipéptidos de MASP-2 de rata o de humano.

Materiales y métodos : A ratones A/J macho (Harían, Houston, Tex.) de entre 8 y 12 semanas se les inyectaron en forma subcutánea 100 µg de rMASP-2 de humano o de rata o de polipéptidos de r ASP-2 (preparados como se describió en los Ejemplos 4 o 5) en adyuvante de Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en 200 µ? de solución salina amortiguada con fosfato o solución PBS, pH 7.4. A los ratones se les inyectaron, en intervalos de dos semanas y en forma subcutánea, 50 iq de rMASP-2 de humano o de rata o polipéptido de rMASP-2 en adyuvante de Freund incompleto. En la cuarta semana, a los ratones se les inyectaron 50 pg de rMASP-2 de humano o de rata o polipéptido de rMASP-2A en PBS y se fusionaron 4 días después. Para cada fusión se prepararon suspensiones de una sola célula a partir del bazo de un ratón inmunizado, las cuales se utilizaron para la fusión con células de mieloma Sp2/0. En un medio que contenia 50% de polietilenglicol (peso molecular=1 50 ) (Kodak, Rochester, N.Y.) y 5% de sulfóxido de dimetilo (Sigma Chemical Co . , St. Louis, Mo . ) se fusionaron 5xl08 de las células Sp2/0 y 5x10 de células del bazo. La concentración de las células se ajustó entonces en 1.5xl05 células de bazo por cada 200 µ? de la suspensión en medio de Iscove (Gibco, Grand Island, N. Y.), suplementado con suero fetal de bovino al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 de estreptomicina, hipoxantina 0.1 mM, aminopterina 0.4 µ y timidina 16 µ?. Doscientos microlitros de la suspensión celular se añadieron a cada uno de los pozos de cerca de veinte placas de microcultivo de 96 pozos cada una. Después de aproximadamente diez días, se retiraron los sobrenadantes de cultivo para evaluarlos en cuanto a su reactividad con factor MASP-2 en un ensayo ELISA. Ensayo ELISA: Los pozos de placas de micropruebas de Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se recubrieron añadiéndoles 50 µ? de hMASP-2 de 50 ng/ml o rMASP-2 (o rMASP-2A) de rata durante toda la noche a temperatura ambiente. La baja concentración de la MASP-2 para el recubrimiento permitió la selección de anticuerpos de gran afinidad. Después de que la solución de recubrimiento se retiró de la placa sacudiendo ésta ligeramente, en cada pozo se colocaron 200 µ? de BLOTTO (leche descremada en polvo) en PBS durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora después, los pozos se lavaron con solución amortiguadora de PBST (PBS con 0.05% de Tween 20). De cada pozo de fusión se recolectaron cincuenta microlitros del sobrenadante del cultivo y se mezclaron con 50 µL de BLOTTO y se añadieron luego a los pozos individuales de placas de microprueba. Después de una - hora de incubación, los pozos se lavaron con PBST . Los anticuerpos de múrido ligados fueron detectados por la reacción con IgG (especifica de Fe) antirratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o HRP, por sus siglas en inglés (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) y se diluyeron a 1:2, 000 en BLOTTO. A los pozos se les añadió una solución de sustrato de peroxidasa que contenia 3 , 3 , 5 , 5-tetrametilbencidina (Sigma, St. Louis, Mo.) y 0.0003% de peróxido de hidrógeno (Sigma) para que revelaran color en 30 minutos. La reacción se termina al añadirle a cada pozo 50 µ? de H2S04 2M. La densidad óptica a 450 nm de la mezcla de reacción se leyó en una lectora ELISA de BioTek (BioTek Instruments, Winooski, Vt . ) . Ensayo de unión con la MASP-2 : Los sobrenadantes del cultivo cuya prueba dio positiva en el ensayo ELISA de la MASP-2 descrito en lo anterior pueden ser sometidos a un ensayo de unión para determinar la afinidad de unión que los agentes inhibidores de la MASP-2 tienen por la MASP-2. También puede utilizarse un ensayo semejante para determinar si los agentes inhibidores se unen a otros antigenos del sistema de complemento. Los pozos de placas de microtitulación de poliestireno (placas de 96 pozos de unión con el medio, Corning Costar, Cambridge, MA) se recubrieron durante toda la noche a 4°C con MASP-2 (20 ng/100 µ?/????, Advanced Research Technology, San Diego, CA) en solución salina amortiguada con fosfato o solución PBS, pH 7.4. Después de aspirar la solución de MASP-2, los pozos se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con PBS que contenia 1% de albúmina de suero de bovino o BSA, por sus siglas en inglés (Sigma Chemical) . Los pozos sin recubrimiento con MASP-2 sirven como control de referencia. A los pozos se añadieron alícuotas de sobrenadantes de hibridoma o de MoAbs anti-MASP-2 purificados, en concentraciones variables en solución bloqueadora. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los pozos se enjuagaron perfectamente con PBS. El MoAb anti-MASP-2 ligado a la MASP-2 se detectó mediante la adición de IgG antirratón de cabra conjugada con peroxidasa (Sigma Chemical) en solución bloqueadora, misma que se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa de nuevo se enjuagó perfectamente con PBS y se le añadieron 100 µ? del sustrato de 3, 3 ', 5, 51 -tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) . La reacción del TMB se detiene mediante la adición de 100 µ? de ácido fosfórico 1 M y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplacas (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . En los sobrenadantes del cultivo de los pozos que dieron positivo se probó su capacidad para inhibir la activación del complemento en un ensayo funcional, como por ejemplo, el ensayo de escisión de C4 que se describió en el Ejemplo 2. Las células de los pozos positivos se clonaron entonces limitando la dilución. A los MoAb se les probó nuevamente su reactividad con hMASP-2 en un ensayo ELISA, tal como se describió en lo anterior. Los hibridomas seleccionados se cultivaron en matraces de centrifuga y el sobrenadante del cultivo gastado se recolectó para purificar el anticuerpo con cromatografía de afinidad con proteína A.

EJEMPLO 8 Este ejemplo describe la generación de un ratón con desactivación del MASP-2-/- que expresa la ASP-2 de humano para usarlo como modelo en el cual seleccionar los agentes inhibidores de la MASP-2. Materiales y métodos : Un ratón MASP-2-/-, como el descrito en el Ejemplo 1, y un ratón MASP-2-/- que expresa una construcción transgénica de la MASP-2 de humano (activación de la MASP-2 de humano), como el descrito en el Ejemplo 3, se cruzaron y su progenie que era MASP-2-/- de múrido, MApl9+ de múrido y MASP-2+ de humano, fue utilizada para identificar a los agentes inhibidores de la MASP-2 de humano. Los modelos animales de este tipo pueden ser utilizados como sustratos para probar la identificación y eficacia de los agentes inhibidores de la MASP-2, como por ejemplo, los anticuerpos anti-MASP-2 de humano, los péptidos y no péptidos inhibidores de la MASP-2 y las composiciones que contienen agentes inhibidores de la MASP-2. Por ejemplo, el modelo animal se expone ante un compuesto o agente que se sabe dispara la activación del complemento dependiente de la MASP-2 y al modelo animal se le administra un agente inhibidor de la MASP-2 durante un tiempo y una concentración suficientes para producir la reducción de los síntomas de la enfermedad en el animal expuesto . Además, la MASP-2-/- de múrido, la MApl9+ y los ratones con MASP-2+ de humano pueden ser utilizados para generar líneas celulares que contienen uno o más tipos de células implicadas en una enfermedad asociada a la MASP-2, las cuales pueden ser utilizadas como modelo de cultivo celular de ese trastorno. La generación de líneas celulares continuas a partir de animales transgénicos es bien conocida en la técnica ver, por ejemplo, Small, J. A., et al., Mol. Cell Biol., 5:642-48, 1985.

EJEMPLO 9 Este ejemplo describe un método para producir anticuerpos de humano contra la MASP-2 de humano en un ratón con desactivación de MASP-2 que expresa la MASP-2 de humano, así como inmunoglobulinas de humano.

Materiales y métodos : i Se creó un ratón MASP-2-/-, tal y como se describió en el Ejemplo 1. Se creó entonces un ratón que expresa la MASP-2 de humano, como el descrito en el Ejemplo 3. Un ratón MASP-2-/- homocigoto y un ratón MASP- 2-/- que expresa la MASP-2 de humano se cruzaron, cada uno, con un ratón derivado de una linea celular troncal embrionaria manipulada genéticamente de modo que contenga las alteraciones deseadas en los loci (lugares) de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina endógena y la expresión de al menos un segmento del locus (lugar) de la inmunoglobulina de humano. De preferencia, el segmento del locus de la inmunoglobulina de humano incluye secuencias no reordenadas de los componentes cadena pesada y ligera. Tanto la inactivación de los genes de inmunoglobulina endógena como la introducción de genes de inmunoglobulina exógena pueden lograrse mediante la recombinación homologa dirigida. Los mamíferos transgénicos obtenidos en este proceso tienen la capacidad de reordenar funcionalmente las secuencias del componente inmunoglobulina y de expresar un repertorio de anticuerpos de varios isotipos codificados por los genes de la inmunoglobulina humana, sin expresar genes de inmunoglobulina endógena. La producción y propiedades de los mamíferos que tienen estas características la describe, por ejemplo, Thomson, A. D., en Nature 148:1547- 1553, 1994 y Sloane, B. F . , en Nature Biotechnology 14:826, 1996. En el mercado pueden conseguirse cepas de ratón genéticamente manipuladas en las que los genes del anticuerpo de ratón han sido inactivados y funcionalmente sustituidos con genes de anticuerpos humanos, por ejemplo, la XenoMouse®, comercializada por Abgenix, Fremont, CA) . La descendencia de ratones resultante tiene la capacidad de producir MoAb de humano contra la MASP-2 de humano, cuyo uso es adecuado en la terapia de humanos.

EJEMPLO 10 Este ejemplo describe la generación y producción de anticuerpos anti-MASP-2 de múrido humanizados y fragmentos de anticuerpos. En ratones A/J macho se generó un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 de múrido, como se describió en el Ejemplo 7. El anticuerpo de múrido se humaniza entonces como se describe a continuación para reducir su inmunogenicidad al sustituir las regiones constantes de múrido con sus equivalentes humanos para generar un fragmento híbrido de IgG y Fab del anticuerpo, que es útil para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en seres humanos, de conformidad con la presente invención. 1. Clonación de genes de la región variable anti- MASP-2 de células de hibridoma de múrido. La totalidad del ARN se aisló de las células de hibridoma que secretan MoAb anti- ASP-2 (obtenidas tal y como se describió en el Ejemplo 7) utilizando ARNzol y siguiendo el protocolo del fabricante (Biotech, Houston, Tex.). La primera hebra del ADNc se sintetizó a partir del ARN completo utilizando como cebador al oligo d . La PCR se realizó utilizando cebadores 3' derivados de la región C constante de la inmunoglobulina y conjuntos de cebadores degenerados derivados del péptido líder o de la primera región estructural de los genes VH o VK de múrido como los cebadores 5'. Se efectuó una PCR anclada, como la describen Chen y Platsucas (Chen, P. F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). Para clonar al gen VK, se preparó un ADNc de doble hebra utilizando un cebador Notl-MAK1 (5 ' -TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3 ' SEQ ID NO: 38). Los adaptadores hibridados AD1 ( 5 ' -GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3 ' SEQ ID NO: 39) y AD2 ( 5 ' -TCCGAGAATAACGAGTG-3 ' SEQ ID NO: 40) se ligaron tanto a los extremos 5' como 3' del ADNc de doble hebra. Los adaptadores en los extremos 3' se eliminaron por digestión con Notl. El producto digerido se utilizó entonces como la plantilla de la PCR, el oligonucleótido AD1 se utilizó como el cebador 5' y el MAK2 (5 ' -CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3 ' SEQ ID NO : 41 ) , como el cebador 3'. En el pUC19 se clonaron fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pares de bases o bp, por sus siglas en inglés. Para el análisis de las secuencias se seleccionaron varios clones con la finalidad de verificar que la secuencia clonada incluyera a la región constante de inmunoglobulina de múrido esperada. Los oligonucleótidos Notl-MAKl y MAK2 se derivaron de la región VK y tienen, respectivamente, 182 y 84 bp corriente abajo del primer par de bases del gen kappa C. Se eligieron los clones que incluían la VK completa y al péptido líder. Para clonar al gen VH, se preparó un ADNc de doble hebra utilizando al cebador Notl MAG1 (51-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3 ' SEQ ID NO: 42). Los adaptadores hibridados ADl y AD2 se ligaron en los dos extremos 5' y 3' del ADNc de doble hebra. Los adaptadores en los extremos 3' se eliminaron por digestión con Notl. El producto digerido se utilizó como la plantilla de la PCR, como cebadores se utilizaron al oligonucleotido ADl y al MAG2 ( 5 ' -CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3 ' SEQ ID NO: 43) . En el pUC19 se clonaron fragmentos de ADN con una longitud de entre 500 y 600 bp. Los oligonucleótidos Notl-MAG1 y MAG2 se derivaron de la región Cy.7.1 de múrido y tienen, respectivamente, 180 y 93 bp corriente abajo del primer par de bases del gen Cy.7.1 de múrido. Se eligieron los clones que incluían la VH completa y al péptido líder. 2. Construcción de vectores de expresión del híbrido de IgG de MASP-2 y Fab. Los genes VH y VK clonados descritos en lo anterior fueron utilizados como plantillas en una reacción de PCR para añadir la secuencia de consenso de Kozak *al extremo 5' y el donador de empalme al extremo 3' de la secuencia del nucleótido. Después de que las secuencias fueron analizadas para confirmar la ausencia de errores por la PCR, los genes VH y VK fueron insertados en casetes del vector de expresión que contenían, respectivamente, el C.y.l y el C. kappa, para producir pSV2neoVH-huCyl and pSV2neoV-huCy . Para transinfectar células COS por medio de electroporación se utilizó a los ADN del plásmido purificado con un gradiente de CsCl de los vectores de la cadena pesada y ligera. 48 horas después, el sobrenadante del cultivo se analizó con un ELISA para confirmar la presencia de aproximadamente 200 ng/ml de la IgG quimérica o híbrida. Las células se recolectaron y se preparó el ARN completo. La primera hebra del ADNc se sintetizó a partir del ARN completo utilizando como cebador al oligo dT . Este ADNc fue usado como la plantilla en la PCR para generar los fragmentos Fd y ADN kappa. Para el gen Fd, la PCR se realizó utilizando 5 ' -AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3 ' (SEQ ID NO: 44) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de CH1 (5 ' -CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3 ' SEQ ID NO: 45) . Se confirmó que la secuencia de ADN contenía el VH completo y el dominio CH1 de la IgGl humana. Después de la digestión con las enzimas adecuadas, los fragmentos de ADN Fd fueron insertados en los sitios de restricción HindIII y BamHI del cásete pSV2dhfr-TUS del vector de expresión para obtener pSV2dhfrFd. El plásmido pSV2 puede adquirirse en forma comercial y está constituido por segmentos del ADN de varias fuentes. El ADN pBR322 (linea delgada) contiene el origen pBR322 de la replicación del ADN (pBR ori) y al gen de resistencia a la lactamasa ampicilina (Amp) ; el ADN SV40, representado por un sombreado más ancho y marcado, contiene el origen SV40 de la replicación del ADN (SV40 ori), el promotor anticipado (51 para el dhfr y genes neo) y la señal de poliadenilación (31 para el dhfr y genes neo) . La señal de poliadenilación (pA) derivada del SV40 también está colocada en el extremo 3' del gen Fd. En el caso del gen kappa, la PCR se realizó utilizando 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3 ' ( SEQ ID NO: 46) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de CK ( 5 ' -CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3 ' SEQ ID NO: 47). Se confirmó que la secuencia de ADN contenia el VK completo y regiones CK de humano. Después de la digestión con las enzimas de restricción adecuadas, los fragmentos de ADN kappa fueron insertados en los sitios de restricción HindIII y BamHI del cásete pSV2neo-TUS del vector de expresión para obtener pSV2neoK. Tanto la expresión del gen Fd como del kappa es promovida por los elementos potenciador y promotor derivados del HCMV . Puesto que el gen Fd no incluye al residuo del aminoácido cisteina involucrado en el enlace disulfuro entre cadenas, este Fab híbrido recorabinante contiene a las cadenas pesada y ligera enlazadas en forma no covalente. A este Fab híbrido se le denomina cFab. Para obtener un Fab recombinante con un enlace bisulfuro entre las cadenas pesada y ligera, el anterior gen Fd puede extenderse para que incluya la secuencia de codificación de 9 aminoácidos adicionales (EPKSCDKTH SEQ ID NO: 48) de la región de bisagra de la IgG humana. El segmento ADN BstEII-BamHI que codifica para 30 aminoácidos en el extremo 3' del gen Fd puede ser sustituido con segmentos de ADN que codifican para el Fd extendido, lo que deriva en el pSV2dhfrFd/ 9aa . 3. Expresión y purificación de la IgG anti-MASP-2 quimérica Para generar las líneas celulares que secretan la IgG anti-MASP-2 híbrida, las células NSO fueron transinfectadas con ADN de plásmido purificados del pSV2neoVH-huC . ?? y pSV2neoV-huC kappa por medio de electroporación . Las células transinfectadas se seleccionaron en presencia de 0.7 mg/ml de G418. Las células se cultivaron en un matraz de centrífuga de 250 mi en un medio que contenía suero. El sobrenadante del cultivo de 100 mi de la centrífuga se cargó en una columna PROSEP-A de 10 mi ( Bioprocessing, Inc., Princeton, N. J. ) . La columna se lavó con 10 volúmenes de lecho de PBS . El anticuerpo ligado se eluyó con 50 mM de solución amortiguadora de citrato, pH 3.0. A la fracción que contenia el anticuerpo purificado se le añadió un volumen igual de Hepes 1 M, pH 8.0, para ajustar el pH a 7.0. Las sales residuales se retiraron por intercambio de solución amortiguadora con PBS mediante ultrafiltración en membrana de Millipore (peso molecular de corte: 3,000). La concentración de la proteina del anticuerpo purificado se determinó usando el método BCA (Pierce). 4. Expresión y purificación del Fab anti-MASP-2 híbrido Para generar las lineas celulares que secretan el Fab anti-MASP-2 híbrido, las células CHO fueron transinfectadas con ADN de plásmido purificados del pSV2dhfrFd (o del pSV2dhfrFd/9aa) y pSV2neokappa por medio de electroporación . Las células transinfectadas se seleccionaron en presencia de G418 y metotrexato. Las líneas celulares seleccionadas se amplificaron en concentraciones crecientes de metotrexato. Las células se subclonaron en una sola célula limitando la dilución. Las líneas celulares de alta producción subclonadas en una sola célula fueron cultivadas entonces en un cultivo de centrífuga de 100 mi con un medio sin suero. El Fab anti-MASP-2 híbrido se purificó por medio de cromatografía de afinidad utilizando un MoAb antiidiotípico de ratón para el MoAb de la MASP-2. Es posible crear un MoAb de MASP-2 antiidiotípico al inmunizar ratones con un MoAb anti-MASP-2 de múrido conjugado con hemocianina de lapa de California o KLH, por sus siglas en inglés, y rastreando para separar la unión con MoAb especifica que puede estar en competencia con la MASP-2 de humano. Para la purificación, en la columna de afinidad acoplada con un MoAb de MASP-2 antiidiotipo se cargaron 100 mi del sobrenadante de los cultivos de la centrifuga de las células CHO que producen el cFab o el cFab/9aa. Luego, la columna se lavó perfectamente con PBS antes de que el Fab ligado se eluyera con dietilamina 50 mM, pH 11.5. Las sales residuales se eliminaron mediante intercambio de solución amortiguadora, como se describió en lo anterior. La concentración de la proteina del Fab purificado se determinó usando el método BCA (Pierce) . La capacidad de la IgG de MASP-2 híbrida, del cFab y del cFAb/9aa para inhibir las vías del complemento dependientes de la MASP-2 puede ser determinada aplicando las pruebas de inhibición descritas en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 11 Este ejemplo describe una prueba de escisión de C4 in vitro utilizada como tamiz funcional para identificar agentes inhibidores de la MASP-2 capaces de bloquear la activación del complemento dependiente de la MASP-2 por medio de L-ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina o mañana. Prueba de escisión del C4 : Peterson, S. V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, han descrito una prueba de escisión del C4 que determina la activación por la vía de la lectina que se deriva del ácido lipoteicoico o LTA, por sus siglas en inglés, proveniente de S. aureus, que se une a la L-ficolina. Reactivos : El S. aureous (DS 20233) fijado en formalina se preparó como se indica a continuación: las bacterias se cultivaron durante toda la noche a 37°C en un medio de sangre y soya tripsínica, se lavó tres veces con PBS y luego se fijó durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS/0.5% de formalina y se lavó tres veces más con PBS antes de volver a suspenderse en la solución amortiguadora de recubrimiento (Na2C03 15 m , NaHC03 35 mM, pH 9.6). Ensayo : Los pozos de una placa de microtitulación Nunc Maxisorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) se recubrieron con: 100 µ? de S. aureus DSM20233 fijado en formalina (OD550 = 0.5) en solución amortiguadora de recubrimiento con 1 ug de L-ficolina en un amortiguador de recubrimiento. Después de incubarlos durante toda la noche, los pozos se bloquearon con 0.1% de albúmina de suero humano (HSA) en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) y se lavaron luego con TBS que contenía 0.05% de Tween 20 y CaCl2 mM (solución amortiguadora de lavado) . Las muestras de suero humano se diluyeron en Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 mM, CaCl2 10 mM, 0.05% de Tritón X-100, 0.1% de HSA, pH 7.4, lo que evita la activación del C4 endógeno y disocia al complejo Cl (constituido por Clq, Clr y Cls). Los agentes inhibidores de la MASP-2, entre los que se incluyen los MoAbs anti-MASP-2 y los péptidos inhibidores se añadieron a las muestras de suero en concentraciones variables. Las muestras diluidas se añadieron a las placas y se incubaron durante toda la noche a 4°C. 24 horas después, las placas se lavaron perfectamente con la solución amortiguadora de lavado, posteriormente, a cada pozo se añadió 0.1 g de C4 de humano purificado (obtenido como lo describe Dodds, A.

W., en Methods Enzymol. 223:46, 1993) en 100 µ? de barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7.4. Después de 1.5 horas a 37°C, las placas se lavaron otra vez y la precipitación del C4b se detectó utilizando C4c antihumano de pollo conjugado con fosfatasa alcalina (obtenido de Immunsystem, Uppsala, Suecia) y se determinó con sustrato colorimétrico de fosfato de p-nitrofenilo . Ensayo de C4 en mañana: El ensayo descrito anteriormente se adaptó para determinar la activación por la vía de la lectina a través de la MBL al recubrir la placa con LSP y mañana antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de la MASP-2. Ensayo de C4 en H-ficolina (antigeno de Hakata) : El ensayo descrito anteriormente se adaptó para determinar la activación por la vía de la lectina a través de la H-ficolina al recubrir la placa con LSP y H-ficolina antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de la MASP-2.

EJEMPLO 12 El siguiente ensayo demuestra la presencia de la activación por la vía clásica en ratones silvestres y MASP-2-/-. Métodos : Los inmunocomplej os se generaron in situ recubriendo las placas de microtitulación (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) con 0.1% de albúmina de suero humano en Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4 por 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la incubación durante toda la noche a 4°C con antisuero antisuero completo de borrego (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland) diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+ . Las muestras de suero se obtuvieron de ratones silvestres y MASP-2-/- y se añadieron a las placas recubiertas. Se prepararon muestras de control en la que el Clq se agotó de la muestras de suero silvestre y MASP-2-/-. El suero de ratón al que se le agotó el Clq se preparó utilizando Dynabeads acopladas con proteina A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubiertas con IgG Clq antihumano de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) de conformidad con las instrucciones del proveedor. Las placas se incubaron durante 90 minutos a 37°C. El C3b ligado se detectó con un anticuerpo anti-C3c-humano policlonal (Dako A 062) diluido 1:1000 en TBS/tw/Ca++. El anticuerpo secundario es IgG anticonejo de cabra. Resultados : La figura 9 muestra los niveles de precipitación o depósito relativo de C3b en placas recubiertas con IgG en suero silvestre, en suero MASP-2-/-, en suero silvestre en el que se agotó el Clq y en suero MASP-2-/- en el que se agotó el Clq. Estos resultados demuestran que la via clásica está intacta en la cepa de ratón MASP-2-/-.

EJEMPLO 13 Se utilizó la siguiente prueba o ensayo para probar si un agente inhibidor de la MASP-2 bloquea la via clásica al analizar el efecto de un agente inhibidor de la MASP-2 en condiciones en las que los inmunocomplej os inician la via clásica. Métodos : Para probar el efecto de un agente inhibidor de la MASP-2 a las condiciones de activación del complemento en las que la vía clásica se inició con inmunocomplejos, se incubaron muestras triplicadas de 50 µ? a 37°C que contenían 90% de NHS en presencia de 10 g/ml del inmunocomplej o (IC) o PBS, durante la incubación también se incluyeron muestras paralelas triplicadas (+/-IC) que contenían anticuerpos monoclonales de antiproperdina 200 nM. Después de dos horas de incubación a 37°C, a todas las muestras se les añadió EDTA 13 mM para detener la activación del complemento y luego se enfriaron de inmediato hasta 5°C. Las muestras se almacenaron entonces a -70°C antes de analizar los productos de la activación del complemento (C3a y sC5b-9) utilizando kits del ensayo ELISA (Quidel, Catalog Nos. A015 and A009) y siguiendo las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 14 Este ejemplo demuestra que el sistema de activación del complemento MASP-2 dependiente de la lectina se activa en la fase isquémica/de revascularización posterior a la reparación del aneurisma aórtico abdominal. Fundamento y diseño del experimento: Los pacientes que padecen la reparación del aneurisma aórtico abdominal o AAA, por sus siglas en inglés, están sujetos a la lesión de isquemia-revascularización, que está mediada principalmente por la activación del complemento. Los inventores investigaron la función de la vía de la lectina dependiente de la MASP-2 de activación del complemento en la lesión de isquemia-revascularización en pacientes sometidos a reparación de la AAA. El consumo de lectina de unión a mañana o MBL en suero se utilizó para determinar la cantidad de activación por la via de la lectina dependiente de la MASP-2 que se presentó durante la revascularización .

Aislamiento de la muestra de suero del paciente: Este estudio incluyó un total de 23 pacientes sometidos a reparación infrarrenal de AAA elegida y 8 pacientes de control sometidos a cirugía abdominal mayor. En el caso de los pacientes sometidos a reparación del AAA, de la arteria radial de cada paciente se tomaron muestras de sangre del cuerpo (a través de una tubería arterial) en cuatro tiempos definidos durante el procedimiento: tiempo # 1: inducción de la anestesia; tiempo #2: poco antes del pinzamiento aórtico; tiempo # 3: poco antes de retirar el pinzamiento aórtico; tiempo # 4: durante la revascularización. En el caso de los pacientes de control sometidos a cirugía abdominal mayor, durante la inducción de la anestesia se tomaron muestras de la sangre del cuerpo y dos horas después de iniciado el procedimiento. Análisis de los niveles de la MBL: En cada una de las muestras de plasma del paciente se analizaron los niveles de lectina de unión a mañana (MBL) utilizando técnicas de ELISA. Resultados : Los resultados de este estudio se muestran en la figura 10, misma que presenta una gráfica que muestra el cambio porcentual medio en los niveles de la MBL (eje Y) en cada tiempo (eje X) . Los valores iniciales de la MBL son el 100%, con respecto a la reducción relativa que se presentó posteriormente. Como se muestra en la figura 10, los pacientes AAA (n = 23) mostraron una reducción significativa en los niveles plasmáticos de la MBL, que en promedio fue una reducción de aproximadamente el 41% en el momento de la isquemia/revascularización posterior a la AAA. En contraste, en los pacientes de control (n = 8) sometidos a cirugía abdominal mayor, en las muestras de plasma sólo se observó un pequeño consumo de la MBL. Los datos presentados aportan una prueba poderosa de que la vía de la lectina dependiente de la MASP-2 del sistema de complemento se activa en la fase de la isquemia/revascularización posterior a la reparación de la AAA. La reducción en los niveles de la MBL parece estar asociada a la lesión de isquemia-revascularización debido a que los niveles de la MBL caen rápida y significativamente cuando el importante vaso pinzado se revasculariza después del término de la operación. En contraste, los sueros de los pacientes de control sometidos a cirugía abdominal mayor sin lesiones importantes por isquemia-revascularización mostraron solamente una ligera reducción en los niveles de MBL en plasma. En vista de la bien establecida contribución de la activación del complemento en la lesión por revascularización, se concluye que la activación de la vía de la lectina dependiente de la MASP-2 en las células endoteliales isquémicas es un factor principal en la patología de la lesión por isquemia/revascularización. Por lo tanto, se esperaría que el bloqueo o la reducción transitoria específica de la vía de la lectina de la activación del complemento dependiente de la MASP-2 tenga un impacto terapéutico benéfico significativo en la mejora de la evolución de los procedimientos clínicos y de las enfermedades que implican una lesión isquémica transitoria, por ejemplo, el infarto de miocardio, el infarto de intestino, en quemaduras, transplantes y ataque cerebrovascular .

EJEMPLO 15 Este ejemplo describe el uso de la cepa MASP-2-/- como el modelo animal para probar a los agentes inhibidores de la MASP-2 útiles para tratar la artritis reumatoide . Antecedentes y undamento : Modelo de artritis de múrido: Los ratones transgénicos (tg) del receptor de la célula T (TCR, por sus siglas en inglés) K/BxN son un modelo de la artritis inflamatoria de reciente desarrollo (Kouskoff, V., et al., Cell 87:811-822, 1996; Korganow, A. S., et al., Immunity 10:451-461, 1999; Matsumoto, I., et al., Science 286:1732-1735, 1999; Maccioni M. et al., J. Exp. Med. 195 (8) : 1071-1077, 2002) . Los ratones K/BxN presentan espontáneamente una enfermedad autoinmunitaria con la mayoría de las características clínicas, histológicas e inmunológicas de la RA de los humanos (Ji, H., et al., Immunity 16:157-168, 2002). El trastorno del múrido es especifico de la articulación, pero es iniciado y luego continuado por la autorreactividad de las células T y luego de las células B con la glucosa-6-fosfato isomerasa o GPI, un antigeno de expresión ubicua. Por otra parte, la transferencia del suero (o de las Ig antiGPI purificadas) de los ratones K/BxN artríticos a animales sanos les produce artritis en unos cuantos días. También se ha mostrado que los anticuerpos antiGPI policlonales o una combinación de anticuerpos monoclonales antiGPI del isotipo IgGl inducen la artritis cuando se inyecta en receptores sanos (Maccioni et al., 2002). El modelo de múrido es relevante para la RA humana, debido a que también se ha encontrado que el suero de pacientes con RA contiene anticuerpos antiGPI, que no se encuentran en individuos normales. En este sistema se analizó un ratón deficiente en C5 y se encontró que bloqueaba la generación de la artritis (Ji, H., et al., 2002, supra) . También hubo una importante inhibición de la artritis en ratones con nulo contenido de C3, lo que implicó la vía alternativa, no obstante, los ratones con nulo contenido de MBP-A generaron artritis. Sin embargo, en ratones, la presencia de MBP-C puede compensar la pérdida de MBP-A. Con base en las observaciones descritas en la presente de que la MASP-2 desempeña una función esencial en el inicio tanto de la vía de la lectina como de la vía alternativa, el modelo de artritis K/BxN es útil para separar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de la RA. Métodos : El suero de los ratones K/BxN artríticos se obtuvo cuando tenían 60 días de edad, se combinó y se inyectó (150-200 µ? i.p.) en receptores MASP-2-/- (obtenidos tal y como se describió en el Ejemplo 1) y en animales de control de la misma carnada con o sin agentes inhibidores de la MASP-2 (MoAb, péptidos inhibidores y lo similar, como se describe en la presente) en los días 0 y 2. Un grupo de ratones normales también recibió tratamiento previo con un agente inhibidor de la MASP-2 durante 2 días antes de recibir la inyección del suero. Otro grupo de ratones recibió una inyección del suero en el día 0, a la que le siguió, en el día 6, un agente inhibidor de la MASP-2. Con el paso del tiempo se evaluó un índice clínico registrando un punto por cada pata afectada y 1/2 punto por cada pata que sólo tenga una hinchazón leve. También se midió el grosor del tobillo utilizando un calibrador (el grosor se definió como la diferencia con respecto a la medición del día 0) .

EJEMPLO 16 Este ejemplo describe una prueba de la inhibición de la lesión tisular mediada por el complemento en un modelo ex vivo de corazones de conejo irrigados con plasma humano. Antecedentes y fundamento : La activación del sistema de complemento contribuye al rechazo hiperagudo de los xenotransplantes . Los estudios previos han mostrado que el rechazo hiperagudo puede presentarse en ausencia de anticuerpos antidonador por medio de la activación de la vía alternativa (Johnston, P.S., et al., Transplant Proc. 23:877-879, 1991) . Métodos : Para determinar si los agentes inhibidores anti-MASP-2, como por ejemplo, los anticuerpos anti-MASP-2 obtenidos como se describió en el Ejemplo 7 pueden inhibir la via del complemento en la lesión tisular, los MoAb anti-MASP-2 y los fragmentos de anticuerpos pueden ser probados utilizando un modelo ex vivo en el. cual, los corazones de conejo aislados son irrigados con plasma humano diluido. Con anterioridad se mostró que este modelo provoca lesiones en el miocardio de conejo debido a la activación de la via alternativa del complemento (Gralinski, M. R. , et al., Immunopharmacology 34:79-88, 1996).

EJEMPLO 17 Este ejemplo describe un ensayo que determina la activación de neutrófilos que es útil como una medida de una dosis eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 para el tratamiento de enfermedades asociadas con la via dependiente de la lectina de conformidad con los métodos de la invención. Métodos : Gupta-Bansal , R. , et al., en Molecular Immunol . 37:191-201, 2000, han descrito un método para medir la neutrófilo elastasa. En pocas palabras, el complejo de elastasa y cii-antitripsina sérica se determinó con un ensayo tipo sandwich de dos sitios que utiliza anticuerpos tanto contra la elastasa como contra la cii-antitripsina . Las placas de microtitulación hechas de poliestireno se recubrieron durante toda la noche a 4°C con una dilución de 1:500 de anticuerpos de elastasa antihumana (The Binding Site, Birmingham, UK) en PBS. Después de aspirar la solución del anticuerpo, los pozos se bloquearon con PBS que contenia 0.4% de HAS durante 2 horas a temperatura ambiente. A los pozos se añadieron alícuotas (100 µ?) de las muestras de plasma que se trataron con o sin un agente inhibidor de la MASP-2. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los pozos se enjuagaron perfectamente con PBS. El complejo de elastasa-cii-antitripsina ligado se detectó mediante la adición de una dilución 1:500 de anticuerpo peroxidasa conj ugada-cii-antitripsina en solución bloqueadora que permitió la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con PBS, se añadieron alícuotas de 100 µ? de sustrato de TMB . La reacción de la TMB se extinguió mediante la adición de 100 µ? de ácido fosfórico y la placa se leyó a 450 nm en una lectora de microplacas .

EJEMPLO 18 Este ejemplo describe un modelo animal para probar agentes inhibidores de la MASP-2 útiles para tratar la isquemia/revascularización de miocardio. Métodos : Vakeva et al., Circulation 97:2259- 2267, 1998 y Jordán et al., Circulation 104 ( 12 ) : 1413-1418 , 2001 han descrito un modelo de isquemia-revascularización del miocardio. El modelo descrito puede modificarse como se indica a continuación para usarlo en ratones MASP-2-/-y MASP-2+/+. En pocas palabras, los ratones macho adultos se anestesian. La vena yugular y la tráquea se canalizan y se mantiene una ventilación con oxígeno al 100% utilizando un ventilador para roedores ajustado para mantener al C02 exhalado entre 3.5% y 5%. Se realiza la toracotomía izquierda y se efectúa una sutura de 3 a 4 mm del origen de la arteria coronaria izquierda. Cinco minutos antes de la isquemia, se les suministra a los animales un agente inhibidor de la MASP-2, tales como, anticuerpos anti-MASP-2 (por ejemplo, en una gama de dosificación de entre 0.01 y 10 mg/kg) . A continuación la isquemia se inicia apretando la sutura alrededor de la arteria coronaria y se mantiene asi por 30 minutos, seguida de cuatro horas de revascularización. Los animales para la operación simulada se prepararon en forma idéntica sin apretar la sutura. Análisis de la precipitación del C3 del complemento : Después de la revascularización, de la región central del ventrículo izquierdo se obtuvieron muestras para el estudio inmunohistoquímico, mismas que se fijaron y congelaron a -80°C hasta el momento de procesarlas. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo C3 antirrata de cabra conjugado con HRP. En las secciones de tejido se analizó la presencia de la tinción de C3 en presencia de agentes inhibidores anti-MASP-2 en comparación con animales de control con operación simulada (testigos quirúrgicos) y animales MASP-2-/- para identificar los agentes inhibidores de la MASP-2 que reducen la precipitación de C3 in vivo.

EJEMPLO 19 Este ejemplo describe el uso de la cepa MASP-2-/- como el modelo animal para probar en los agentes inhibidores de la MASP-2 la capacidad para proteger al tejido transplantado contra la lesión por isquemia/revascularización . Antecedentes/Fundamento : Se sabe que durante el transplante se presenta en el órgano donado la lesión por isquemia/revascularización. El grado de lesión tisular está relacionado con la duración de la isquemia y está mediado por el complemento, como se demuestra en varios modelos de isquemia y por el uso de agentes inhibidores del complemento, como por ejemplo, el receptor soluble tipo 1 (CR1) (Weisman et al., Science 249:146-151, 1990; Mulligan et al., J. Immunol. 148:1479-1486, 1992; Pratt et al., Am. J. Path. 163(4) : 1457-1465, 2003). Pratt et al., ñm. J. Path. 163(4): 1457-1465, han descrito un modelo animal para el transplante, modelo que puede modificarse para usarlo con el modelo de ratón MASP-2-/- y/o para usarlo como un sistema modelo de MASP-2+ /+ en el cual se identifica la capacidad de los agentes inhibidores de la MASP-2 para proteger al tejido transplantado contra la lesión por isquemia/revascularización. El lavado del riñon donado con liquido de irrigación antes de transplantarlo da la oportunidad de introducir los agentes inhibidores anti-MASP-2 en el riñon. Métodos : Los ratones MASP-2-/- y/o MASP-2+/+ son anestesiados. El riñon izquierdo del donador se diseca y la aorta se liga a la arteria renal en dirección craneal y en dirección caudal. Entre las ligaduras se inserta un catéter Portex (Portex Ltd, Hythe, GB) y el riñon se irriga con 5 mi de solución de Soltran para la irrigación de riñon (Baxter Health Care, GB) que contenia agentes inhibidores de la MASP-2, como por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en una gama de dosificación que varió entre 0.01 mg/kg y 10 rag/kg) durante un periodo de por lo menos 5 minutos. Se realiza entonces el transplante renal y se inicia el monitoreo de los ratones. Análisis de los receptores del transplante: Los ríñones para transplantes se recolectan en varios intervalos de tiempo y las secciones de tejido se analizan con anti-C3 para determinar el grado de la precipitación de C3.

EJEMPLO 20 Este ejemplo describe el uso de un modelo animal de artritis inducida por colágeno o CIA, por sus siglas en inglés, para probar agentes inhibidores de la MASP-2 útiles para tratar la artritis reumatoide (RA) . Antecedentes y fundamento : La artritis inducida por colágeno o CIA representa una poliartritis autoinmunitaria que puede inducirse en cepas de roedores y primates después de la inmunización con colágeno nativo tipo II y ha sido reconocida como un modelo relevante para la artritis reumatoide (RA) humana (ver, Courtney et al., Nature 283: 666 (1980); Trenthan et al., J. Exp. Med. 146: 857 (1977)). Tanto la RA como la CIA se caracterizan por la inflamación de las articulaciones, la formación de paño sinovial y la erosión del cartílago y del hueso. La cepa de múrido DBA/lLacJ susceptible a la CIA se creó como el modelo para la CIA en la cual los ratones presentaron una artritis clínicamente grave después de la inmunización con colágeno tipo II de bovino (Wang et al., J. Immunol. 164: 4340-4347 (2000) . Una cepa de ratón deficiente en C5 se cruzó con la DBA/lLacJ y se determinó que la cepa resultante era resistente a la generación de la artritis CIA (Wang et al., 2000, supra) . Con base en las observaciones descritas en la presente de que la MASP-2 desempeña una función esencial en el inicio tanto de la vía de la lectina como de la vía alternativa, el modelo de artritis CIA es útil para identificar o separar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de la RA. Métodos : Se creó un ratón MASP-2-/-, tal y como se describió en el Ejemplo 1. Este ratón MASP-2-/- se cruzó luego con un ratón derivado de la cepa DBA/lLacJ (The Jackson Laboratory) La Fl y la descendencia posterior se entrecruzaron para producir MASP-2-/-homocigotos en la línea DBA/lLacJ. La inmunización con colágeno se realizó como lo describieron Wang et al., 2000, supra. En pocas palabras, los ratones DBA/lLacJ silvestres y los ratones MASP-2-/-DBA/lLacJ fueron inmunizados con colágeno tipo II de bovino (BCII) o con colágeno tipo II de ratón (MCII) (obtenido de Elastin Products, Owensville, MO) disuelto en ácido acético 0.01 M a una concentración de 4 mg/ml . Cada uno de los ratones recibió en la base de la cola una inyección intradérraica con 200 ug de CII y 100 ug de micobacterias . Los ratones volvieron a ser inmunizados 21 días después y fueron examinados todos los días para determinar la aparición de artritis. Al paso del tiempo se evaluó un índice de artritis relacionado con la gravedad de la artritis en cada pata afectada. Los agentes inhibidores - de la MASP-2 se rastrearon en ratones CIA DBA/lLacJ silvestres inyectándoles un agente inhibidor de la MASP-2, como por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosificación de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg) en el momento de la inmunización con colágeno, ya sea en forma local o sistémica en una o más articulaciones, evaluándose un índice de artritis con respecto al tiempo, como se describió en lo anterior. La función de los anticuerpos monoclonales anti-hMASP-2 como agentes terapéuticos puede ser fácilmente evaluada en un modelo de ratón CIA DBA/lLacJ MASP-2-/- y hMASP-+/+ con desactivación génica.

EJEMPLO 21 Este ejemplo describe el uso de un modelo animal Fi (NZB/W) para probar agentes inhibidores de la MASP-2 útiles en el tratamiento de la glomerulonefritis mediada por inmunocomplej o . Antecedentes y fundamento : Los ratones Fl Nueva Zelanda negros x Nueva Zelanda blancos (NZB/W) presentan espontáneamente un síndrome autoinmunitario con notables similitudes con la glomerulonefritis humana mediada por inmunocomplej o . Los ratones Fl NZB/W invariablemente sucumben ante la glomerulonefritis antes de tener 12 meses de edad. Como se mencionó antes, se ha demostrado que la activación del complemento tiene una función importante en la patogenia de la glomerulonefritis mediada por inmunocomplej o . Además se ha mostrado que la administración de un MoAb anti-C5 en el modelo de ratón NZB/W produjo como resultado una mejora significativa durante la evolución de la glomerulonefritis (Wang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 93:8563-8568 (1996)) . Con base en las observaciones descritas en la presente de que la MASP-2 desempeña una función esencial en el inicio tanto de la vía de la lectina como de la vía alternativa, el modelo animal Fi NZB/W es útil para identificar o separar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de la glomerulonefritis . Métodos : Se creó un ratón MASP-2-/-, tal y como se describió en el Ejemplo 1. Este ratón MASP-2-/- se cruzó entonces por separado con un ratón derivado tanto de la cepa NZB como de la cepa NZW (The Jackson Laboratory) . La Fl y la descendencia posterior se entrecruzaron para producir MASP-2-/- homocigotos en los antecedentes genéticos NZB como NZW. Para determinar la función de la MASP-2 en la patogenia de la glomerulonefritis en este modelo, se comparó la aparición de esta enfermedad en individuos Fl como resultado de las cruzas de los ratones NZB x NZW silvestres o de los ratones MASP-2-/-NZB x MASP-2-/-NZW. De los ratones Fl MASP-2+/+ y MASP-2-/- se recolectaron, en intervalos de una semana, muestras de orina, los niveles de proteina en orina se vigilaron para detectar la presencia de anticuerpos antiADN (como lo describe Wang et al., 1996, supra) . También se realizó el análisis histopatológico de los ríñones con la finalidad de observar la cantidad de precipitación de la matriz mesangial y la aparición de la glomerulonefritis . El modelo animal Fl NZB/W también es útil para rastrear o identificar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para usarlos como agentes terapéuticos en el tratamiento de la glomerulonefritis . Cuando los ratones tuvieron una edad de 18 semanas, se les inyectaron, en forma intraperitoneal , los agentes inhibidores de anti-MASP-2, como por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en una gama de dosificación de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg) con una frecuencia semanal o quincenal. Los anteriores marcadores histopatológicos y bioquímicos de la glomerulonefritis fueron utilizados para evaluar la evolución de la enfermedad en los ratones, así como para identificar a los agentes inhibidores de la MASP-2 útiles en el tratamiento de esta enfermedad.

EJEMPLO 22 Este ejemplo describe el uso de un circuito de tubería flexible como modelo para probar agentes inhibidores de la MASP-2 útiles en la prevención de lesiones tisulares derivadas de la circulación extracorporal o ECC, por sus siglas en inglés, como por ejemplo, un circuito de anastomosis quirúrgica cardiopulmonar o CPB, también por sus siglas en inglés. Antecedentes y Fundamento : Como se mencionó en lo anterior, los pacientes sometidos a ECC durante la CPB padecen una reacción inflamatoria generalizada, que es provocada parcialmente por la exposición de la sangre a las superficies artificiales del circuito extracorporal, aunque también es provocada por factores independientes de la superficie, tales como el traumatismo quirúrgico y la lesión por isquemia-revascularización (Butler, J. , et al . , Ann. Thorac. Surg. 55:552-9, 1993; Edmunds, L. H . , Ann. Thorac. Surg. 66 ( Suppl . ) : S12-6, 1998; Asimakopoulos , G., Perfusión 14:269-11, 1999). Se ha demostrado que la vía alternativa del complemento tiene un papel preponderante en la activación del complemento en circuitos de CPB, que se deriva de la interacción de la sangre con las superficies artificiales de los circuitos de CPB (ver, Kirklin et al., 1983, 1986, anteriormente citado). Por lo tanto, con base en las observaciones descritas en la presente de que la MASP-2 desempeña una función esencial en el inicio tanto de la vía de la lectina como de la vía alternativa, el modelo de circuito de tubería flexible es útil para identificar o separar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para ser utilizados como agentes terapéuticos en la prevención o el tratamiento de la respuesta inflamatoria activada por exposición extracorporal . Métodos : Se utilizó una modificación de un modelo de circuito de tubería flexible descrito previamente en los circuitos de revascularización cardiopulmonar (ver Gong et al., J. Clinical Immunol. 16 (4) :222-229 (1996)) como lo describe Gupta-Bansal et al., en Molecular Immunol. 37:191-201 (2000) . En pocas palabras, la sangre de una persona sana es recibida en un tubo Vacutainer de 7 mi (el cual ya contenía 7 unidades de heparina por mi de sangre entera) . Una tubería de polietileno semejante a la que se utiliza en los procedimientos de CPB (por ejemplo, con I. D. de 2.92 mm; O. D. de 3.73 mm y 45 cm de longitud) se llena con 1 mi de la sangre y se cierra con un tramo corto de tubería de silicona formando un bucle o circuito. Como control de referencia, se incluyó en el estudio una tubería de control que contenía sangre con heparina y EDTA 10 mM. Las tuberías de muestra y de control se hicieron girar verticalmente en un baño con agua a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, las muestras de sangre fueron transferidas a tubos de microcentrifuga de 1.7 mi que contenían EDTA, lo que derivó en una concentración final de EDTA de 20 mM. Las muestras se centrifugaron, recolectándose el plasma. A la sangre con heparina se le añadieron los agentes inhibidores de la ASP-2, como por ejemplo, los anticuerpos anti-MASP-2, justo antes de ponerlas a centrifugar. Las muestras de plasma se sometieron entonces a ensayos para determinarles la concentración de C3a y de C5b-9 soluble, como lo describe Gupta-Bansal et al., 2000, supra.

EJEMPLO 23 Este ejemplo describe el uso del sistema del modelo de ligamiento cecal y punción (o CLP, por sus siglas en inglés) en roedores para probar los agentes inhibidores de la MASP-2 útiles en el tratamiento de la septicemia o de una enfermedad derivada de la septicemia, entre las que se incluyen la septicemia grave, el choque séptico, el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda provocado por la septicemia y el síndrome de la respuesta inflamatoria generalizada. Antecedentes y Fundamento : Como ya se mencionó en lo anterior, en numerosos estudios se ha demostrado que la activación del complemento desempeña una función principal en la patogenia de la septicemia (ver Bone, R. C, Annals. Internal. Med. 115:457-469, 1991). El modelo CLP en roedor es un modelo reconocido que imita la evolución clínica de la septicemia en humanos y se considera que es un modelo sustituto razonable de la septicemia en seres humanos (ver, Ward, P., Nature Review Im unology Vol. 4: 133-142 (2004)). Un estudio reciente, Huber-Lang et al., J. of Immunol. 169: 3223-3231 (2002), ha demostrado que el tratamiento de animales de CLP con anticuerpos antiC5a produjo una reducción en la bacteremia y un importante aumento en la sobrevivencia. Por lo tanto, con base en las observaciones descritas en la presente de que la MASP-2 desempeña una función esencial en el inicio tanto de la vía de la lectina como de la vía alternativa, el modelo CLP en roedor es útil para identificar o separar los agentes inhibidores de la MASP-2 que son eficaces para ser utilizados como agentes terapéuticos en la prevención o el tratamiento de la septicemia o de alguna enfermedad derivada de la septicemia. Métodos : El modelo de CLP es una adaptación, misma que se indica a continuación, del modelo descrito por Huber-Lang et al., 2004, supra. Los animales MASP-2-/-y MASP-2+/+ son anestesiados. Se les practicó una incisión abdominal de 2 cm en la línea media y se ligó al ciego con fuerza por debajo de la válvula ileocecal, evitando la obstrucción intestinal. El ciego se puncionó entonces de lado a lado con una aguja calibre 21. La incisión abdominal se cerró luego por capas con sutura de seda y parches dérmicos (Ethicon, Sum erville, NJ) .

Inmediatamente después de la CLP, a los animales se les inyectó un agente inhibidor de la MASP-2, como por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosificación de 0.01 mg/kg a 10 mg/kg) . La función de los anticuerpos monoclonales anti-hMASP-2 como agentes terapéuticos puede ser fácilmente evaluada en un modelo de ratón CLP MASP-2-/- y hMASP-+/+ con desactivación génica. En el plasma de los ratones se analizaron entonces los niveles de las anafilatoxinas derivadas del complemento y el estallido respiratorios utilizando los ensayos descritos por Huber-Lang et al., 2004, supra.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la identificación de fragmentos de anticuerpo Fab2 anti-MASP-2 de gran afinidad que bloquean la actividad de la MASP-2. Antecedentes y fundamento : La MASP-2 es una proteina compleja que tiene muchos dominios funcionales separados, entre los que se incluyen: sitios de unión de la MBL y las ficolinas; un sitio catalítico de la serina proteasa; un sitio de unión con el sustrato proteolítico C2; un sitio de unión con un sustrato proteolítico C4; un sitio de escisión de la MASP-2 para la autoactivación del cimógeno de la MASP-2 y dos sitios de unión con Ca++. Se identificaron los fragmentos de anticuerpo Fab2 que se unen con gran afinidad a la MASP-2, estos fragmentos Fab2 identificados se analizaron en un ensayo funcional para determinar si eran capaces de bloquear la actividad funcional de la MASP-2. Para bloquear la actividad funcional de la MASP-2, un anticuerpo o fragmento del anticuerpo Fab2 debe unirse e interferir con un epitopo de la MASP-2 que es necesario para la actividad funcional de la MASP-2. Por lo tanto, muchos o todos los Fab2 anti-MASP-2 que se unen con gran afinidad podrían no inhibir la actividad funcional de la MASP-2, a menos que se unan a epítopos estructurales en la MASP-2 que están directamente involucrados en la actividad funcional de la MASP-2. Para evaluar la "actividad bloqueadora" de los Fab anti-MASP-2 se utilizó un ensayo funcional que determina la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la vía de la lectina. Se sabe que la función fisiológica principal de la MASP-2 en la vía de la lectina es generar al siguiente componente funcional de la vía del complemento mediada por la lectina, a saber, la C3 convertasa de la vía de la lectina. La C3 convertasa de la vía de la lectina es un complejo enzimático crítico (C4bC2a) que escinde proteolíticamente al C3 en C3a y C3b.

La MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la vía de la lectina (C4bC2a) ; sin embargo, es necesaria la actividad funcional de la MASP-2 para generar los dos componentes proteínicos (C4b y C2a) que comprende la C3 convertasa de la vía de la lectina. Por otra parte, parece que se necesitan todas las actividades funcionales separadas de la MASP-2, anteriormente enumeradas, para que la MASP-2 genere la C3 convertasa de la vía de la lectina. Por estas razones, se cree que un ensayo preferido que hay que utilizar para evaluar la "actividad bloqueadora" de los Fab anti-MASP-2 es un ensayo funcional que determina la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la vía de la lectina. Generación de los Fab2 de gran afinidad: Para crear los Fab2 de gran afinidad con la proteína MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 55) se utilizó una colección de exhibición de fagos de las secuencias de anticuerpos variables con cadenas ligera y pesada de humano y una tecnología de selección automatizada de anticuerpos para identificar los Fab2 que reaccionan con los ligandos seleccionados de interés. Para la selección de anticuerpos se utilizó una cantidad conocida de la proteína MASP-2 de rata (~1 mg, > 85% de pureza) . Para seleccionar los anticuerpos que tengan la mejor afinidad, se realizaron tres corridas de amplificación. Para el rastreo con ELISA se recolectaron aproximadamente 250 diferentes aciertos que expresan fragmentos de anticuerpos. Los aciertos de gran afinidad se sometieron a análisis de secuencia para determinar la unicidad de los diferentes anticuerpos. Se purificaron cincuenta anticuerpos anti-MASP-2 únicos y para la caracterización de la afinidad de unión con la MASP-2 y probar la funcionalidad de la via del complemento se utilizaron 250 pg de cada anticuerpo Fab2 purificado, como se describe a continuación de manera más detallada .

Ensayos utilizados para evaluar la actividad inhibidora (bloqueadora) de los Fab2 anti-MASP-2 1. Ensayo para determinar la inhibición de la formación de la C3 convertasa por la via de la lectina: Antecedentes: La C3 convertasa de la via de la lectina es el complejo enzimático (C4bC2a) que escinde proteoliticamente al C3 en dos fragmentos proinflamatorios potentes, la anafilatoxina C3a y la opsónica C3b. Parece que la formación de la C3 convertasa es un paso clave en la via de la lectina, en términos de la mediación de la inflamación. La MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la via de la lectina (C4bC2a) ; por lo tanto, los anticuerpos anti-MASP-2 (o Fab2) no inhibirán directamente la actividad de la C3 convertasa prexistente. Sin embargo, para generar los dos componentes proteinicos (C4b y C2a) que constituyen la C3 convertasa de la via de la lectina, en necesaria la actividad de la serina proteasa MASP-2. Por lo tanto, el Fab2 anti-MASP-2 que inhibe la actividad funcional de la MASP-2 (es decir, el Fab2 anti-MASP-2 bloqueador) inhibirá de nuevo la formación de la C3 convertasa de la vía de la lectina. El C3 contiene, como parte de su estructura, un inusual y muy reactivo grupo tioéster. Después de la escisión del C3 por la C3 convertasa de este ensayo, el grupo tioéster del C3b puede formar un enlace covalente con los grupos hidroxilo o amino de las macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pozos de plástico a través de los enlaces de éster o amida, facilitando asi la detección del C3b en el ensayo ELISA. La mañana de levadura es un activador conocido de la vía de la lectina. En el siguiente método para determinar la formación de la C3 convertasa, los pozos de plástico recubiertos con mañana se incubaron durante 30 minutos a 37°C con suero de rata diluido para activar la vía de la lectina. Luego, los pozos se lavaron y se analizó el C3b inmovilizado en ellos, utilizando métodos de ELISA estándar. La cantidad del C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de la nueva C3 convertasa de la vía de la lectina. En este ensayo se probó la capacidad de los Fab2 anti-MASP-2, en concentraciones seleccionadas, para inhibir la formación de la C3 convertasa y la posterior generación del C3b.

Métodos : Placas Costar Médium Binding de 96 pozos se pusieron a incubar a 5°C durante toda la noche con mañana diluida en solución amortiguadora de carbonato 50 mM, pH 9.5, a razón de 1 ug/50 µL por pozo. Después de pasar toda la noche en incubación, cada pozo se lavó tres veces con 200 µ? de PBS . Los pozos se bloquearon entonces con 100 µ?/???? de albúmina de suero de bovino al 1% en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mientras se les aplicaba un mezclado suave. Cada pozo se lavó luego tres veces con 200 µ? de PBS. Las muestras de Fab2 anti-MASP-2 se diluyeron a 5°C a las concentraciones seleccionadas en solución amortiguadora de GVB que contenía Ca++ y Mg++ (barbital 4.0 mM, NaCl 141 mM, MgCl2 1.0 mM, CaCl2 2.0 mM, 0.1% de gelatina, pH 7.4). A las muestras anteriores se les añadió suero de rata al 0.5% a 5°C y a cada pozo se les transfirieron 100 µ? . Las placas se cubrieron e incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo al transferir las placas del baño de agua a 37°C a un recipiente que contenía una mezcla de agua con hielo. Cada pozo se lavó cinco veces con 200 µ? de PBS-Tween 20 (0.05% de Tween 20 en PBS), luego se lavó dos veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? de una dilución 1:10,000 de anticuerpo primario (C3c antihumano de conejo, DAKO A0062) en PBS que contenía 2.0 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaba con suavidad. Cada pozo se lavó 5 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? de una dilución 1:10,000 del anticuerpo secundario (IgG anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa, American Qualex A102PU) en PBS que contenia 2.0 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se pusieron en incubación durante una hora a temperatura ambiente en un agitador aplicando una agitación suave. Cada pozo se lavó cinco veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? del sustrato TMB de peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 µ?/???? de H3P04 1.0 M y se midió luego el OD45o. 2. Ensayo para determinar la inhibición de la escisión de C4 dependiente de la MASP-2 Antecedentes: La actividad de la serina proteasa de la MASP-2 es muy especifica y únicamente se han identificado dos sustratos proteinicos para la MASP-2: el C2 y el C . La escisión del C4 genera el C4a y el C4b. El Fab2 anti-MASP-2 puede unirse a los epitopos estructurales de la MASP-2 que están directamente involucrados en la escisión del C4 (por ejemplo, el sitio de unión con la MASP-2; el sitio catalítico de la serina proteasa MASP-2) e inhibir, de esta manera, la actividad funcional de escisión del C4 de la MASP-2. La mañana de levadura es un activador conocido de la via de la lectina. En el siguiente método para determinar la actividad de escisión del C4, los pozos de plástico recubiertos con mañana se incubaron durante 30 minutos a 37°C con suero de rata diluido para activar la via de la lectina. Debido a que el anticuerpo primario utilizado en este ensayo ELISA sólo reconoce el C4 humano, también el suero de rata diluido se suplemento con C4 humano (1.0 µ?/???) . Los pozos se lavaron luego y se analizó el C4b humano inmovilizado en ellos, utilizando métodos de ELISA estándar. La cantidad de C4b generada en este ensayo es una medida de la actividad de escisión del C4 dependiente de la MASP-2. En este ensayo se probó la capacidad del Fab2 anti-MASP-2 , a las concentraciones seleccionadas, para inhibir la escisión del C4. Métodos : Placas Costar Médium Binding de 96 pozos se pusieron a incubar a 5°C durante toda la noche con mañana diluida en solución amortiguadora de carbonato 50 mM, pH 9.5, a razón de 1.0 g/50 pL por pozo. Cada pozo se lavó 3 veces con 200 µ? de PBS . Los pozos se bloquearon entonces con 100 µ?/???? de albúmina de suero de bovino al 1% en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mientras se les aplicaba un mezclado suave. Cada pozo se lavó 3 veces con 200 µ? de PBS. Las muestras de Fab2 anti-MASP-2 se diluyeron a 5°C, a las concentraciones seleccionadas, en solución amortiguadora de GVB que contenia Ca++ y Mg++ (barbital 4.0 mM, NaCl 141 mM, gCl2 1.0 mM, CaCl2 2.0 mM, 0.1% de gelatina, pH 7.4). En estas muestras también se incluyó 1.0 g/ml de C4 de humano (Quidel). A las muestras anteriores se les añadió suero de rata al 0.5% a 5°C y a cada pozo se les transfirieron 100 µ? . Las placas se cubrieron e incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo al transferir las placas del baño de agua a 37°C a un recipiente que contenia una mezcla de agua con hielo. Cada pozo se lavó cinco veces con 200 µ? de PBS-Tween 20 (0.05% de Tween 20 en PBS), luego, cada pozo se lavó dos veces con 200 µ? de PBS . Se añadieron 100 µ?/???? de una dilución 1:700 de C4c antihumano de pollo conjugado con biotina (Immunsystem ??, Uppsala, Suecia) en PBS que contenia 2.0 mg/ml de albúmina de suero de bovino o BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mientras se agitaba con suavidad. Cada pozo se lavó 5 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? de 0.1 µg/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pierce Chemical #21126) en PBS que contenia 2.0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en un agitador con agitación suave. Cada pozo se lavó 5 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? del sustrato TMB de peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 minutos. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 µ?/???? de H3P04 1.0 M y se midió luego el OD450. 3. Ensayo de unión del Fab2 MASP-2 antirrata con la MASP-2 de rata "nativa" Antecedentes: La MASP-2 está presente normalmente en el plasma como un complejo dimérico de MASP-2 que también incluye moléculas de lectina especificas (proteina de unión con mañosa (MBL) y ficolinas). Por lo tanto, si hay alguien interesado en estudiar la unión del Fab2 anti-MASP-2 con la forma fisiológicamente relevante de la MASP-2, es importante crear un ensayo de unión en el que se utilice la interacción entre el Fab2 y la MASP-2 "nativa" en el plasma, en vez del MASP-2 recombinante purificado. En este ensayo de unión, el complejo MASP-2 "nativa"-MBL del suero de rata al 10% se inmovilizó primero en pozos recubiertos con mañana. La afinidad de unión de los varios Fab2 anti-MASP-2 con la MASP-2 "nativa" inmovilizada se estudió entonces utilizando una metodología ELISA estándar. Métodos : Placas Costar High Binding de 96 pozos se pusieron a incubar a 5°C durante toda la noche con mañana diluida en solución amortiguadora de carbonato 50 mM, pH 9.5, a razón de 1 g/50 L por pozo. Cada pozo se lavó 3 veces con 200 µ? de PBS . Los pozos se bloquearon con 100 µ?/???? de leche en polvo sin grasa al 0.5% en PBS (PBS con 0.05% de Tween 20) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente aplicando un mezclado suave. Cada pozo se lavó 3 veces con 200 µ? de solución amortiguadora de TBS/Tween/Ca++ (solución salina amortiguada con Tris, 0.05% de Tween 20 y que contenia CaCl2 5.0 mM, pH 7.4) . En hielo se preparó 10% de suero de rata en solución amortiguadora de unión con alto contenido de sal (Tris 20 mM, NaCl 1.0 mM, CaCl2 lOmM, 0.05% de Triton-X100, 0.1% (p/v) de albúmina de suero de bovino, pH 7.4). Se añadieron 100 µ?/???? y se incubaron durante toda la noche a 5°C. Los pozos se lavaron 3 veces con 200 µ? de la solución amortiguadora de lavado de TBS/Tween/Ca++ . Luego, los pozos se lavaron 2 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? de la concentración seleccionada del Fab2 anti-MASP-2 diluida en solución amortiguadora de GVB que contenia Ca++ y Mg++ (barbital 4.0 mM, NaCl 141 mM, MgCl2 1.0 mM, CaCl2 2.0 mM, 0.1% de gelatina, pH 7.4) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mientras se mezclaban con suavidad. Cada pozo se lavó 5 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? de anti-Fab2 de cabra conjugado con HRP (Biogénesis Cat No 0500-0099) diluido al 1:5,000 en 2.0 mg/ml de albúmina de suero de bovino en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave. Cada pozo se lavó 5 veces con 200 µ? de PBS. Se añadieron 100 µ?/???? del sustrato TMB de peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 70 minutos. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 µ?/???? de H3P04 1.0 M y se midió luego el OD450.

RESULTADOS : Para la selección con ELISA se recolectaron aproximadamente 250 de los diferentes Fab2 que reaccionaron con gran afinidad con la proteina MASP-2 de rata. A estos Fab2 de gran afinidad se les analizó la secuencia para determinar la unicidad de los diferentes anticuerpos y se purificaron 50 anticuerpos anti-MASP-2 únicos para estudiarlos con mayor detalle. Para la caracterización de la afinidad de unión con la MASP-2 y la prueba funcional de la vía del complemento se utilizaron 250 ug de cada anticuerpo Fab2 purificado. Los resultados de este análisis se muestran a continuación en la Tabla 6.

Tabla 6: FAB2 ANTI-MASP-2 QUE BLOQUEA LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO POR LA VÍA DE LA LECTINA Como se mostró arriba en la Tabla 6, de los 50 Fab2 anti-MASP-2 probados, se identificó que diecisiete Fab2 eran bloqueadores de la MASP-2, mismos que inhibían potencialmente la formación de la C3 convertasa, donde la IC50 es igual o menor que 10 nM de Fab2 (una tasa de aciertos positivos de 34%). En ocho de los diecisiete Fab2 identificados el IC50 está en el intervalo subnanomolar . Por otra parte, los diecisiete Fab2 bloqueadores de la MASP-2 mostrados en la Tabla 6 tenían la propiedad de inhibir prácticamente por completo la formación de la C3 convertasa en el ensayo de la C3 convertasa por la vía de la lectina. La figura 11A ilustra gráficamente los resultados del ensayo de formación de la C3 convertasa en el caso del anticuerpo Fab2 #11, que es representativo de los otros anticuerpos Fab2 probados, los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 6. Esta es una importante consideración, puesto que teóricamente es posible que un Fab2 "bloqueador" solo pueda inhibir de manera fraccional la función de la MASP-2, aún cuando cada molécula de MASP-2 esté ligada por el Fab2. Aunque la mañana es un activador conocido de la via de la lectina, teóricamente es posible que la presencia de los anticuerpos antimanana en el suero de rata también pueda activar a la via clásica y generar al C3b a través de la C3 convertasa de la via clásica. No obstante, cada uno de los diecisiete Fab2 anti-MASP-2 bloqueadores enumerados en este ejemplo inhiben, potencialmente, la generación del C3b (> 95%), demostrando de este modo, la especificidad de este ensayo para la C3 convertasa de la via de la lectina. También se realizaron ensayos de unión con los diecisiete Fab2 bloqueadores con la finalidad de calcular, para cada uno de ellos, una Kd aparente. En la Tabla 6 también se muestran los resultados de los ensayos de unión de los Fab2 MASP-2 antirrata con la MASP-2 nativa de rata de seis Fab2 bloqueadores. La figura 11B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de unión con el anticuerpo Fab2 #11. También se realizaron ensayos de unión semejantes para los otros Fab2, los resultados de éstos se muestran en la Tabla 6. En general, las Kd aparentes obtenidas de la unión de cada uno de los seis Fab2 con la MASP-2 "nativa" corresponden razonablemente bien con el IC50 del Fab2 en el ensayo funcional de la C3 convertasa. Existen indicios de que la MASP-2 experimenta un cambio de conformación de la forma "inactiva" a la forma "activa" después de la activación de su actividad de proteasa (Feinberg et al., EMBO J. 22:2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). En el plasma normal de rata utilizado en el ensayo de formación de la C3 convertasa, la MASP-2 está presente principalmente en la conformación de cimógeno "inactivo". En contraste, en el ensayo de unión, la MASP-2 está presente como parte de un complejo con la MBL ligada a la mañana inmovilizada; por lo tanto, la MASP-2 estaría en la conformación "activa" (Petersen et al., J. Immunol. Methods 257:107-16, 2001). En consecuencia, no se esperaría, necesariamente, que haya una correspondencia exacta entre el IC50 y la Kd de cada uno de los diecisiete Fab2 bloqueadores probados en estos dos ensayos funcionales, debido a que en cada ensayo, el Fab2 se estaría uniendo a una diferente forma conformativa de la MASP-2. No obstante, con la excepción del Fab2 #88, parece existir una correspondencia razonablemente cercana entre el IC50 y la Kd aparente de cada uno de los otros dieciséis Fab2 probados en los dos ensayos (ver la Tabla 6) .

En varios de los Fab2 bloqueadores se evaluó el grado de inhibición de la escisión del C4 mediada por la MASP-2. La figura 11C ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de escisión del C4, que muestra la inhibición con el Fab2 #41 con una IC50 = 0.81 nM (ver la Tabla 6). Como se muestra en la figura 12, se encontró que todos los Fab2 probados inhiben la escisión del C4 con IC50 semejantes a los obtenidos en el ensayo de la C3 convertasa (ver la Tabla 6) . Aunque la mañana es un activador conocido de la via de la lectina, teóricamente es posible que la presencia de los anticuerpos antimanana en el suero de rata también pueda activar la via clásica y generar, de esta manera, al C4b a través de la escisión del C4 mediada por el Cls. Sin embargo, se ha identificado que varios Fab2 anti-MASP-2 inhiben potencialmente la generación del C4b (> 95%), demostrando asi la especificidad de este ensayo para la escisión del C4 mediada por la MASP-2. El C4, al igual que el C3, contiene, como parte de su estructura, un inusual y muy reactivo grupo tioéster. Después de la escisión del C4 por la MASP-2 en este ensayo, el grupo tioéster del C4b puede formar un enlace covalente con los grupos hidroxilo o amino de las macromoléculas inmovilizadas en el fondo de los pozos de plástico a través de los enlaces de éster o amida, facilitando asi la detección del C4b en el ensayo ELISA.

Estos estudios demuestran claramente la creación de Fab2 de gran afinidad por la proteína MASP-2 de rata, los cuales bloquean funcionalmente tanto la actividad de la C4 convertasa como de la C3 convertasa, evitando así la activación de la vía de la lectina.

EJEMPLO 25 Este ejemplo describe la cartografía del epítopo de varios de los anticuerpos Fab2 MASP-2 antirrata bloqueadores que se generaron tal y como se describió en el Ejemplo 24. Métodos : Como se muestra en la figura 13, las siguientes proteínas, todas con etiquetas 6X His del extremo N, se expresaron en células CHO utilizando el vector pED4. MASP-2A de rata, una proteína MASP-2 de longitud completa, inactivada al convertir en el centro activo la serina en alanina (S613A); MASP-2K de rata, una proteína MASP-2 de longitud completa, alterada para reducir la autoactivación (R424K) ; CUBI-II, un fragmento de la MASP-2 de rata del extremo N que solamente contiene los dominios CUBI, tipo EGF y CUBII; y tipo CUBI/EGF, un fragmento de la MASP-2 de rata del extremo N que solamente contiene los dominios CUBI y tipo EGF.

Estas proteínas se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo utilizando cromatografía de afinidad con níquel, como se describió en lo anterior (Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)). Un polipéptido del extremo C (CCPII-SP) , que contiene el dominio CCPII y de serina proteasa de la MASP-2 de rata, se expresó en E. coli como proteína de fusión con tiorredoxina utilizando pTrxFus ( Invitrogen) . La proteína se purificó a partir de los lisatos celulares utilizando la resina de afinidad Thiobond. La parte de fusión de la tiorredoxina se expresó a partir del pTrxFus vacío como un elemento de control negativo. Todas las proteínas recombinantes se dializaron en solución amortiguadora de TBS y sus concentraciones se determinaron midiendo el OD a 280 nm.

ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA EN MANCHA: Con las diluciones en serie de los cinco polipéptidos MASP-2 recombinantes descritos en lo anterior y mostrados en la figura 13 (y los polipéptidos de la tiorredoxina, como elemento de control negativo del polipéptido CCPII-serina proteasa) se manchó (se distribuyó en) una membrana de nitrocelulosa . La cantidad de proteína distribuida variaba de 100 ng a 6.4 pg en pasos quintuplicados. En experimentos posteriores, la cantidad de proteína distribuida variaba de 50 ng hasta 16 pg, nuevamente en pasos quintuplicados. Las membranas se bloquearon con leche descremada en polvo al 5% en TBS (solución amortiguadora de bloqueo) y se incubaron luego con 1.0 µ?/ml de Fab2 anti-MASP-2 en la solución amortiguadora de bloqueo (que contenia Ca2+ 5.0 mM) . Los Fab2 ligados se detectaron utilizando Fab antihumano conjugado con HRP (AbD/Serotec ; con dilución 1/10,000) y un kit de detección ECL (Amersham) . Una membrana se incubó con Ab policlonal de MASP-2 antihumana de conejo (descrita por Stover et al., J. Immunol. 163:6848-59 (1999)) como un elemento de control positivo. En este caso, el Ab ligado se detectó utilizando IgG anticonejo de cabra conjugado con HRP (Dako; con dilución 1/2,000).

Ensayo de unión con la MASP-2 Las placas del ELISA se recubrieron, a 4°C durante toda la noche, con 1.0 yg/pozo del polipéptido MASP-2A recombinante o CUBI-II en solución amortiguadora de carbonato (pH 9.0) . Los pozos se bloquearon con BSA al 1% en TBS, se añadieron luego las diluciones en serie de los Fab2 anti-MASP-2 en TBS que contenia Ca2+ 5.0 mM. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente o RT, siglas en inglés de "room temperature" . Después de lavar tres veces con TBS/tween/Ca2+, se añadió el Fab antihumano conjugado con HRP (AbD/Serotec) diluido 1/10,000 en TBS/Ca2+ y las placas se incubaron durante una hora más a RT. El anticuerpo ligado se detectó utilizando un kit de sustrato de peroxidasa TMB (Biorad) .

RESULTADOS: A continuación, en la Tabla 7 se presentan los resultados del análisis de transferencia en mancha que demuestran la reactividad de los Fab2 con varios polipéptidos de MASP-2. Los valores numéricos expuestos en la Tabla 7 indican la cantidad de mancha de proteina necesaria para obtener aproximadamente la mitad de la intensidad máxima de la señal. Como se muestra, todos los polipéptidos (con la excepción de la parte de fusión de la tiorredoxina sola) se reconocieron por medio del Ab de control positivo (sueros de MASP-2 antihumana policlonal, cultivada en conejos) .

Tabla 7: REACTIVIDAD CON VARIOS POLIPEPTIDOS MASP-2 RECOMBINANTES DE RATA EN ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA EN MANCHA .

NR = No hay reacción. El anticuerpo de control positivo es suero de MASP-2 antihumano policlonal cultivado en conej os .

Todos los Fab2 reaccionaron tanto con la MASP-2A como con la MASP-2K (los datos no se muestran). La mayor parte de los Fab2 reconocieron al polipéptido CCPII-SP, pero no los fragmentos del extremo N. Las dos excepciones son los Fab2 #60 y la Fab2 #57. El Fab2 #60 reconoce a la MASP-2A y al fragmento CUBI-II, pero no al polipéptido tipo CUBI/EGF o al polipéptido CCPII-SP, lo que sugiere que se une a un epítopo en el CUBII o se extiende al CUBII y al dominio de tipo EGF. El Fab2 #57 reconoce a la MASP-2A, pero no a cualquiera de los fragmentos de la MASP-2 probados, lo que quizá indica que este Fab2 reconoce un epitopo en CCP1. Los Fab2 #40 y #49 se unen sólo a MASP-2A completa. En el ensayo de unión ELISA mostrado en la figura 14, el Fab2 #60 también se une al polipéptido CUBI-II, aunque con una afinidad aparente ligeramente menor. Estos hallazgos muestran la identificación de los únicos Fab2 bloqueadores con múltiples regiones de la proteina MASP-2.

EJEMPLO 26 Este ejemplo describe el análisis realizado a ratones MASP-2-/- en un modelo de murido de isquemia/revascularización renal . Antecedentes/Fundamento : La lesión por isquemia-revascularización (I/R) en riñon a la temperatura del cuerpo es relevante en una variedad de padecimientos clínicos, entre los que se incluyen, el choque hipovolémico, la oclusión de la arteria renal y los procedimientos de pinzamiento cruzado. La isquemia-revascularización (I/R) renal es una de las causas importantes de la insuficiencia renal aguda, asociada a un índice de mortalidad de hasta el 50% (Levy et al., JAMA 275:1489-94, 1996; Thadhani et al., N. Engl .

J. Med. 334: 1448-60, 1996). La insuficiencia renal postransplante es una complicación común y que pone en peligro la vida después de un transplante de riñon (Nicholson et al., Kidney Int. 58:2585-91, 2000) . En la actualidad no se cuenta con un tratamiento eficaz contra la lesión por I/R renal y la hemodiálisis es el único tratamiento disponible. Es compleja la fisiopatologia de la lesión por I/R renal. Algunos estudios recientes han mostrado que la vía de la lectina de la activación del complemento puede tener una función importante en la patogenia de la lesión I/R renal (deVries et al., Am. J. Path. 165: 1677-88, 2004) . Métodos : Se creó un ratón ASP-2 (-/-) , tal como se describió en el Ejemplo 1 y se retrocruzó al menos durante 10 generaciones con C57B1/6. A seis ratones macho MASP-2-/- y a seis ratones silvestres ( + /+ ) con peso aproximado de entre 22 y 25 g se les administró una inyección intraperitoneal de Hypnovel (6.64 mg/kg; Roche Products Ltd., Welwyn Garden City, GB) y posteriormente fueron anestesiados por inhalación de isoflurano (Abbott Laboratories Ltd., Kent, GB) . Se eligió al isoflurano debido a su efecto anestésico se obtiene con una inhalación moderada y a su mínima toxicidad hepática; las concentraciones se producen con precisión y el animal se recupera rápidamente, incluso después de un efecto anestésico prolongado. El uso del Hypnovel se debió a que produce en el animal un estado de neuroleptanalgesia, lo que se traduce en que es necesario administrar menos isoflurano. Debajo del animal se colocó un cojincillo caliente para mantener constante su temperatura corporal. Luego, se practicó en el animal una incisión en la linea media abdominal y la cavidad corporal se mantuvo abierta utilizando un par de separadores. El tejido conectivo se abrió encima y debajo de la vena y la arteria renal tanto del riñon derecho como del izquierdo y el pedículo renal se pinzó colocándole pinzas de microaneurisma por un lapso de 55 minutos. Este periodo de isquemia tuvo como base inicial un estudio anterior realizado en' este laboratorio (Zhou et al., J. Clin. Invest. 105:1363-71 (2000)). Además, se eligió un periodo estándar de isquemia de 55 minutos después de cuantificar la isquemia y encontrar que 55 minutos producían una lesión congruente que también era reversible y de baja mortalidad, 5%. Después de la oclusión, en la cavidad abdominal se colocaron 0.4 mi de solución salina tibia (37°C), el abdomen se cerró luego para el periodo de isquemia. Después de retirar las pinzas de microaneurisma, los ríñones estuvieron en observación hasta que el cambio de color indicó el reinicio del flujo sanguíneo a los mismos. En la cavidad abdominal se colocaron otros 0.4 mi se solución salina tibia y la abertura se suturó, después de lo cual, los animales fueron devueltos a sus jaulas 24 horas después de retirar las pinzas se tomaron muestras de sangre de la cola y los ratones fueron sacrificados a las 48 horas, tomando una muestra más de sangre. Evaluación de la lesión renal: La función renal se evaluó a las 24 y 48 horas después de la revascularización en seis ratones macho MASP-2 (-/-) y en seis ratones WT (silvestres) (+/+). La determinación de la creatinina sanguínea se realizó utilizando la espectrometría de masas, la que suministra un índice reproducible de la función renal (sensibilidad < 1.0 pmol/l) . La figura 15 ilustra gráficamente la depuración del nitrógeno de la urea sanguínea de los ratones silvestres C57B1/6 de control y de los MASP-2 (-/-) a las 24 horas y a las 48 horas después de la revascularización. Como se muestra en la figura 15, los ratones MASP-2 (-/-) mostraron una reducción significativa en la cantidad de la urea sanguínea a las 24 y 48 horas, en comparación con los ratones silvestres de control, lo que indica un efecto funcional protector contra el daño renal en el modelo de lesión por isquemia revascularización. En términos generales, se observó un aumento en la urea sanguínea tanto en los ratones WT ( + /+) como en los ratones MASP-2 (-/-) a las 24 y a las 48 horas después del procedimiento quirúrgico y la lesión isquémica. Por separado se determinó que los niveles de urea en sangre en un animal T ( +/+ ) no isquémico de quirófano era de 5.8 mmol/1. Además de los datos presentados en la figura 15, un animal MASP-2 (-/-) mostró una protección casi completa contra la lesión isquémica, con valores de 6.8 y 9.6 mmol/1 a las 24 y 48 horas, respectivamente. Este animal fue excluido del análisis de grupo por ser un animal que posiblemente se sale de la normalidad, en el cual quizá no se presente ninguna lesión isquémica. Por lo tanto, el análisis final mostrado en la figura 15 incluyó 5 ratones MASP-2 (-/-) y 6 ratones WT (+/+), donde en los ratones MASP-2 (-/-) se observa una reducción estadísticamente significativa en la urea sanguínea a las 24 y 48 horas (prueba t de Student, p < 0.05). Estos hallazgos indican que se esperaría que la inhibición de la actividad de la MASP-2 tenga un efecto protector o terapéutico contra el daño renal debido a la lesión isquémica.

EJEMPLO 27 Este ejemplo describe el análisis realizado a ratones MASP-2 (-/-) en un modelo de isquemia/revascularización de miocardio en ratón. Anteceden es/Fundamen o : La lectina de unión a mañana o MBL es una molécula circulante que inicia la activación del complemento en una forma que es independiente de un inmunocomplej o, en respuesta a una amplia gama de estructuras glucidicas. Estas estructuras pueden ser componentes de agentes infecciosos o entidades glucidicas endógenas alteradas, en particular, en el interior de células necróticas, oncóticas o apoptósicas. Estas formas de muerte celular ocurren en el miocardio irrigado donde es probable que la activación del complemento extienda la lesión más allá del limite existente en ese momento cuando la isquemia termina con la irrigación. Aunque existen indicios de peso de que la activación del complemento agrava la irrigación del miocardio, el mecanismo de dicha activación no está bien entendido y es probable que la inhibición de todas las vías conocidas tenga efectos adversos intolerables. Un estudio reciente sugiere que la activación puede implicar a la MBL, más que a la vía clásica o al bucle de amplificación alternativo (como se definió en la presente invención) , debido a que el infarto se redujo en ratones con nula MBL(A/C), pero no con nulo Clq (Walsh M. C. et al., Jour. of Immunol . 175:541-546 (2005) ) . Sin embargo, aunque es un resultado alentador, estos ratones aún alojan componentes en circulación, como por ejemplo, la ficolina A, capaz de activar al complemento a través de la vía de la lectina. Este estudio investigó a ratones MASP-2 (-/-) contra ratones (+/+) silvestres de control con la finalidad de determinar si los MASP-2 (-/-) serian menos sensibles a la lesión por isquemia y revascularización del miocardio. Los ratones MASP-2 (-/-) estuvieron sometidos a isquemia regional y la magnitud del infarto se comparó con la de sus hermanos silvestres de la misma carnada. Métodos: El protocolo siguiente estuvo basado en un procedimiento para inducir la lesión por isquemia/revascularización previamente descrito por Marber et al., J. Clin. Invest. 95:1446-1456 (1995)). Se creó un ratón MASP-2 (-/-), tal como se describió en el Ejemplo 1 y se retrocruzó al menos durante 10 generaciones con C57B1/6. Siete ratones MASP-2 (-/-) y siete ratones (+/+) silvestres fueron anestesiados con cetamina/medetomidina (100 mg/kg y 0.2 mg/kg, respectivamente) y se colocaron en posición supina en un cojín calentador con control por termostato para mantener la temperatura rectal a 37°C ± 0.3°C. Los ratones fueron intubados con observación directa y ventilados con aire ambiental a una frecuencia respiratoria de 110/minuto y un volumen desplazado de 225 µ?/minuto (Ventilador - Hugo Sachs Elektronic MiniVent Type 845, Alemania) . Se les rasuró el pelo de la piel y se les practicó una incisión en la piel anterolateral, de la axila izquierda a la apófisis xifoides. El pectoral mayor se diseccionó, se cortó en el extremo del esternón y se desplazó a la fosa axilar. El pectoral menor se cortó en el extremo craneal y se desplazó en dirección caudal. Este músculo se usó posteriormente como un colgajo muscular que cubrió al corazón durante la oclusión de la arteria coronaria. En los músculos del quinto espacio intercostal y en la pleura parietal se insertaron unas pinzas en un punto ligeramente medial con respecto al margen del pulmón izquierdo, evitando asi dañar al pulmón o al corazón. Después de insertarse en la pleura, las pinzas fueron cuidadosamente dirigidas hacia la pleura hacia el esternón sin tocar al corazón y los músculos intercostales y de la pleura se diseccionaron con un cauterizador accionado con baterías (Harvard Apparatus, GB) . Se tuvieron cuidados especiales para evitar el sangrado. Utilizando la misma técnica, la toracotomía se extendió hasta la línea axilar media. Después de cortar la cuarta costilla en el extremo del esternón, se ensanchó el espacio intercostal hasta que todo el corazón quedó expuesto de la base al ápice. Con dos fórceps arteriales pequeños, se abrió el pericardio y con un soporte pericárdico de diseño especial se desplazó al corazón ligeramente hacia el frente. Se expuso a la arteria coronaria descendente anterior izquierda o LAD, por sus siglas en inglés, debajo de la cual, con una aguja redonda, se hizo pasar una sutura de 8-0 de un solo filamento. El sitio de la ligadura de la LAD se encuentra justo en dirección inferior de la punta de la aurícula izquierda, aproximadamente a 1/4 a lo largo de la línea que corre de la cresta auroventricular a la punta del ventrículo izquierdo.

Todos los experimentos se realizaron en forma encubierta, es decir, el investigador no conocía el genotipo de cada animal. Después de terminar la instrumentación y los procedimientos quirúrgicos, los ratones se dejaron reposar 15 minutos para que alcanzar el equilibrio. Los ratones se sometieron entonces a un periodo de 30 minutos de oclusión de la arteria coronaria con un periodo de irrigación de 120 minutos.

Modelo de oclusión de la arteria coronaria e irrigación La oclusión de la arteria coronaria se llevó a cabo utilizando el sistema de un peso suspendido, como fue previamente descrito (Eckle et al., ñm J Physiol Heart Circ Physiol 291 : H2533-H2540, 2006). Los dos extremos de la ligadura monofilamento se hicieron pasar por un tramo de tubo de polietileno PE-10 de 2 mm de largo y con pegamento de cianoacrilato se pegaron en un tramo de sutura de 5-0. La sutura se hizo pasar entonces por dos varillas metálicas móviles montadas en forma horizontal y en ambos extremos de la sutura se amarraron pesas de 1 g cada una. Al elevar las varillas, los pesos se suspendieron y la sutura quedó sometida a una tensión controlada para ocluir a la LAD con una presión constante y definida. La oclusión de la LAD se verificó por la palidez del área comprometida, al cambiar el color de la zona de irrigación de la LAD de rojo brillante al violeta, lo que indicó la interrupción del flujo sanguíneo. La irrigación se logró bajando las varillas hasta que los pesos se apoyaron en el cojín de operatorio y se liberó la tensión sobre la ligadura. La irrigación se verificó usando los mismos tres criterios utilizados para verificar la oclusión. Los ratones quedaron excluidos de cualquier análisis posterior en caso de que al inicio de la oclusión de la arteria coronaria o antes de 15 minutos después de la irrigación, respectivamente, no cumplieron con los tres criterios señalados. Durante la oclusión de la arteria coronaria, la temperatura y humedad de la superficie cardiaca se mantuvieron cubriendo al corazón con el colgajo del pectoral menor y sellando la toracotomía con una gasa mojada en solución salina al 0.9%. Determinación de la magnitud del infarto del miocardio : La magnitud del infarto (INF) y el área comprometida o AAR, siglas en inglés de "área at risk", se determinaron por medio de planimetría. Después de inyectar 500 I. U. de heparina por la vía i. v., la LAD volvió a ocluirse y en la vena yugular se inyectaron 300 µ? de azul de Evans ( Sigma-Aldrich, Poole, GB) al 5% (p/v) para delimitar el área comprometida o AAR. Esto provoca que el colorante ingrese en la región no isquémica del ventrículo izquierdo y deje sin teñir al AAR isquémica. Después de sacrificar a los ratones por dislocación cervical, rápidamente se les retiró el corazón. El corazón se enfrió en hielo y se montó en un bloque de agarosa al 5%, posteriormente, se cortó en 8 rebanadas transversales de 800 µp\ de grosor. Todas las rebanadas se incubaron a 37°C durante 20 minutos con 3% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (Sigma Aldrich, Poole, GB) disuelto en solución amortiguadora de Na2HP04/NaH2P04 0.1 M ajustada a un pH de 7.4. Durante la noche, las rebanadas se fijaron en formaldehido al 10%. Las rebanadas se colocaron entre dos cubreobjetos y de los lados de cada rebanada se capturó la imagen digital utilizando un escáner óptico de alta resolución. Las imágenes digitales se analizaron enseguida con el software SigmaScan (SPSS, US). La magnitud del área infartada (color pálido) , del área comprometida del ventrículo izquierdo (LV, por sus siglas en inglés) (en rojo) y de la zona del LV con irrigación normal (azul) se delimitó en cada sección identificando su aspecto y límites coloridos. Las áreas se cuantificaron en los dos lados de cada rebanada y el promedio fue calculado por un investigador. La magnitud del infarto se calculó, en cada animal, como el % de la zona comprometida. RESULTADOS: La magnitud del área infartada (color pálido), del área comprometida del LV (en rojo) y de la zona del LV con irrigación normal (azul) se delimitó en cada sección identificando su aspecto y límites coloridos. Las áreas se cuantificaron en los dos lados de cada rebanada y el promedio fue calculado por un investigador. La magnitud del infarto se calculó, en cada animal, como el % de la zona comprometida. La figura 16A muestra la evaluación que se realizó a siete ratones WT (+/+) y a siete ratones MASP-2 (-/-) para determinarles la magnitud del infarto después de someterlos a la técnica de oclusión de la arteria coronaria e irrigación descrita arriba. Como se muestra en la figura 16A, los ratones MASP-2 (-/-) mostraron una reducción estadísticamente significativa en (p < 0.05) la magnitud del infarto en comparación de los ratones silvestres (+/+) , lo que indica un efecto protector del miocardio contra los daños en el modelo de lesión por isquemia-irrigación. La figura 16B muestra la distribución de los animales individuales probados, que indica un claro efecto protector en los ratones MASP-2 (-/-) .

EJEMPLO 28 Este ejemplo describe los resultados de la MASP- 2-/- en un modelo de degeneración macular de múrido. Antecedentes/Fundamento: La degeneración macular relacionada con la edad o AMD, por sus siglas en inglés, es la causa principal de la ceguera después de los 55 años de edad en el mundo industrializado. La AMD se presenta en dos formas principales: La AMD neovascular (húmeda) y la AMD atrófica (seca) . La forma neovascular (húmeda) representa el 90% de la pérdida grave de la visión asociada a la AMD, aún cuando aproximadamente sólo el 20% de los sujetos con AMD presentan la forma húmeda. Las características clínicas de la AMD incluyen múltiples drusas, atrofia geográfica y neovascularización coroidal o CNV, por sus siglas en inglés. En diciembre de 2004, la FDA aprobó el Macugen (pegaptanib) , una nueva clase de fármacos oftálmicos que son específicos de un objetivo y bloquean los efectos del factor de crecimiento del endotelio vascular o VEGF, por sus siglas en inglés, para el tratamiento de la forma húmeda (neovascular) de la AMD (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Aunque el Macugen representa una opción terapéutica nueva y prometedora para un subconjunto de pacientes con AMD, aún existe la necesidad apremiante de encontrar tratamientos adicionales para esta compleja enfermedad. Una multitud de líneas de investigación independientes implican un papel fundamental de la activación del complemento en la patogenia de la AMD. La patogenia de la neovascularización coroidal o CNV, la forma más grave de la AMD, puede involucrar la activación de las vías del complemento. Hace más de veinticinco años, Ryan describió un modelo de lesión inducido por láser de la CNV en animales (Ryan, S.J., Tr. ñm. Opth . Soc. LXXVII : 707-745, 1979). El modelo se creó inicialmente utilizando monos rhesus, sin embargo, la misma tecnología ha sido utilizada desde entonces para producir modelos semejantes de la CNV en una variedad de animales de laboratorio, entre los que se incluye al ratón (Tobe et al., Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998) . En este modelo, se utilizó la fotocoagulación con láser para romper la membrana de Bruch, un acto que deriva en la formación de membranas de tipo CNV. El modelo de inducción con láser capta muchas de las características importantes de la enfermedad en humanos (si se desea leer una revisión reciente, consultar Ambati et al., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003). El modelo de inducción con láser en ratón está ahora bien establecido y se utiliza como la base experimental en un gran número, que cada vez es mayor, de proyectos de investigación. En general se acepta que el modelo de inducción con láser comparte la suficiente similitud biológica con la CNV en humanos que los estudios preclínicos de la patogenia y la inhibición con fármaco que utiliza este modelo son importantes para la CNV en humanos. Métodos: Se creó un ratón MASP-2 -/-, tal como se describió en el Ejemplo 1 y se retrocruzó con C57B1/6 durante 10 generaciones. El presente estudio comparó los resultados cuando se evaluaron ratones macho MASP-2 (-/-) y MASP-2 ( + / + ) en el transcurso de una CNV inducida con láser, un modelo acelerado de AMD neovascular enfocado en el volumen de la CNV inducida con láser usando microscopía de barrido con láser confocal como una medida de la lesión tisular y la determinación de los niveles del VEGF, un potente factor angiogénico implicado en la CNV, en epitelio del pigmento retinal (RPE) /coroides por medio de ELISA después de la lesión con el láser. Inducción de la neovascularizacion coroidal (CNV) : La fotocoagulacion con láser (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75pm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) la realizó el día cero en los dos ojos de cada animal una sola persona que desconocía (enmascarada) el fármaco asignado al grupo. Los puntos de láser se dispararon en forma estandarizada alrededor del nervio óptico, utilizando un sistema de suministro de lámpara hendida y un cubreobjetos como lente de contacto. El punto morfológico final de la lesión con láser fue la aparición de una burbuja de cavidad, señal que se cree se correlaciona con la ruptura de la membrana de Bruch . Los métodos detallados y los puntos finales evaluados son los siguientes. Angiografia con fluoresceina : La angiografía con fluoresceína se realizó con una cámara y un sistema de captación de imagen (cámara TRC 50 1A; sistema ImageNet 2.01; Topcon, Paramus , NJ) una semana después de la fotocoagulacion con láser. Las fotografías se tomaron con un lente 20-D en contacto con el lente de la cámara de fondo después de una inyección intraperitoneal de 0.1 mi de fluoresceina de sodio al 2.5%. Un experto en retinas no involucrado en la fotocoagulación con láser o en la angiografia evaluó en una única ocasión y en forma enmascarada (es decir, sin saber la información anterior) los angiogramas de fluoresceina. Volumen de la neovascularización coroidal (C V) : Una semana después de la lesión con láser, los ojos se enuclearon y se fijaron a 4°C con paraformaldehido al 4% durante 30 minutos. Las vesículas ópticas se obtuvieron después de retirar los segmentos anteriores y se lavaron tres veces con PBS, a lo que le siguió la deshidratacion y la rehidratación por medio de una serie con metanol. Después de bloquear dos veces durante 30 minutos con solución amortiguadora (PBS que contenía 1% de albúmina de suero de bovino y 0.5% de Tritón X-100) a temperatura ambiente, las vesículas ópticas se pusieron a incubar durante toda la noche a 4°C con FITC-isolectina B4 al 0.5% (Vector laboratories , Burlingame, CA) , diluida con PBS que contenía 0.2% de BSA y 0.1% de Tritón X-100, que se une a los residuos de ß-D-galactosa terminales en la superficie de células endoteliales y etiqueta, selectivamente, la vasculatura murina. Después de dos lavados con PBS que contenía 0.1% de Tritón X-100, la retina neurosensible se separó con cuidado y se seccionó del nervio óptico. Se realizaron cuatro incisiones radiales de relajamiento y el resto del complejo RPE-coroide-esclerótica se montó en un portaobjetos en un medio antidecoloración ("antifade") (Immu-Mount Vectashield Mounting Médium; Vector Laboratories) y se cubrió con un cubreobjetos. Los portaobjetos se examinaron con un microscopio de barrido con láser confocal (TCS SP; Leica, Heidelberg, Alemania). Los vasos se visualizaron por excitación con luz azul de argón con longitud de onda de 488 nm y captando la emisión entre 515 y 545 nm. En todos los estudios de captación de imágenes se utilizó un objetivo de 40X de inmersión en aceite. De la superficie del complejo RPE-coroide-esclerótica se obtuvieron secciones ópticas horizontales (en pasos de 1 µ?t?) . Se consideró que el plano focal más profundo en el que se pudo identificar a la red de vasos coroidales circundante que se conecta con la lesión era el piso de la lesión. Se consideró como CNV a cualquier vaso -del área objetivo del láser y superficial a este plano de referencia. Las imágenes de cada sección se almacenaron en forma digital. El área de fluorescencia relacionada con la CNV se determinó por medio de un análisis computarizado de la imagen realizado con el software del microscopio (TCS SP; Leica) . Como índice del volumen de la CNV se usó la sumatoria de toda el área fluorescente de cada sección horizontal. La captación de la imagen la realizó un operador enmascarado (que desconoce) ante el tratamiento de asignación del grupo. Debido a que la probabilidad de que cada lesión por láser que produce CNV está influida por el grupo al que pertenece (ratón, ojo y punto de láser) , se compararon los volúmenes medios de la lesión utilizando un modelo lineal mixto con un diseño de mediciones repetidas de trama dividida. El factor de trama completa fue el grupo genético al que pertenece el animal, en tanto que el factor de trama dividida fue el ojo. La significancia estadística se determinó en el nivel de 0.05. Las comparaciones a posteriori de los medios se elaboraron con un ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples. ELISA del VEGF. Tres días después de la lesión por 12 puntos con láser, el complejo RPE-coroide se sometió a sonicación durante 15 minutos en solución amortiguadora de lisis (imidazol HC1 20 mM, KC1 10 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 10 mM, Tritón X-100 al 1%, NaF 10 mM, molibdato de Na 1 mM y EDTA 1 mM con inhibidor de proteasa) en hielo. Los niveles de la proteína VEGF en el sobrenadante se determinaron utilizando un kit de ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) que reconoce todas las variantes de corte y empalme, de 450 a 570 nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) , y se normalizaron a la proteína total. Un operador que no participó en la fotocoagulación, en la captación de la imagen o en la angiografía realizó, en forma enmascarada, las determinaciones por duplicado. Los datos del VEGF se representaron como la media +/- SEM de al menos tres experimentos independientes y se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney. La hipótesis nula se rechazó a P < 0.05. RESULTADOS : Evaluación de los niveles del VEGF: La figura 17A ilustra gráficamente los niveles de la proteina VEGF en el complejo RPE-coroide aislado de ratones C57B16 silvestres y MASP-2 (-/-) en el dia cero. Como se muestra en la figura 17A, la evaluación de los niveles del VEGF indica una reducción en los niveles de la linea de referencia del VEGF en los ratones MASP-2 (-/-) comparado con los ratones C57bl silvestres de control. La figura 17B ilustra gráficamente los niveles de la proteina VEGF medidos tres días después de la lesión inducida con láser. Como se muestra en la figura 17B, los niveles del VEGF aumentaron en forma significativa en los ratones (+/+) silvestres tres días después de la lesión inducida con láser, lo que coincidía con los estudios publicados (Nozaki et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006) ) . Sin embargo, en los ratones MASP-2 (-/-) se observaron, sorprendentemente, niveles muy bajos del VEGF. Evaluación de la neovascularización coroidal (CNV) : Además de la reducción en los niveles del VEGF posterior a la degeneración macular inducida con láser, el área de la CNV se determinó antes y después de la lesión con láser. La figura 18 ilustra gráficamente el volumen de la CNV determinado en ratones C57bl silvestres y en ratones MASP-2 (-/-) siete dias después de la lesión inducida con láser. Como se muestra en la figura 18, los ratones MASP-2 (-/-) presentaron una reducción de aproximadamente 30% en el área de la CNV después del daño inducido con láser a los siete dias en comparación con los ratones silvestres de control. Estos hallazgos indican una reducción en el VEGF y en la CNV como la observada en los ratones MASP-2 (-/-) comparados con los ratones silvestres (+/+) de control y que el bloqueo de la MASP-2 con un inhibidor tendría un efecto preventivo o terapéutico en el tratamiento de la degeneración macular.

EJEMPLO 29 Este ejemplo describe los resultados de la MASP-2 (-/-) en un modelo de artritis reumatoide de múrido inducida con anticuerpos monoclonales. Antecedentes/Fundamento : El modelo animal más comúnmente utilizado para la artritis reumatoide o RA es la artritis inducida con colágeno o CIA (si se desea consultar una revisión reciente, ver Linton and Morgan, Mol. Immunol. 36:905-14, 1999). El colágeno tipo II o CU es uno de los principales constituyentes de las proteínas de la matriz articular y la inmunización con CII nativo en un adyuvante induce una poliartritis autoinmunitaria por medio de una respuesta autoinmunitaria reactiva en cruz ante el CII en el cartílago de la articulación. Al igual que en la RA, la susceptibilidad a la CIA está vinculada con la expresión de ciertas clases de alelos del MHC de clase II. Algunas cepas de ratones, entre las que se incluyen a la cepa C57B1/6, son resistentes a la clásica CIA, debido a que carecen de un haplotipo MHC adecuado y, por lo tanto, no generan altas concentraciones de anticuerpos anti-CII. Sin embargo, se ha encontrado que en todas estas cepas de ratones puede inducírseles una artritis uniforme al administrarles por vía i. v. o i. p. una mezcla de cuatro anticuerpos monoclonales específicos contra el colágeno tipo II. Estos anticuerpos monoclonales artridógenos pueden adquirirse en forma comercial (Chondrex, Inc., Redmond, WA) . El modelo de transferencia pasiva de la CIA ha sido utilizado con éxito en varios de los informes recientemente publicados, utilizando la cepa de ratones C57B1/6 (Kagari et al., J. Immunol. 169:1459-66, 2002; Kato et al., J. Rheumatol. 30:241-55, 2003; Banda et al., J. Immunol. 177:1904-12, 2006). El siguiente estudio comparó la sensibilidad de los ratones silvestres ( T, por "wild-type") ( +/+) y de los ratones MASP-2 (-/-) a enfermarse de artritis utilizando el modelo de transferencia pasiva de la CIA, donde ambos tipos de ratones comparten el antecedente genético C57B1/6. Métodos : Animales: Se creó un ratón MASP-2 (-/-), tal como se describió en el Ejemplo 1 y se retrocruzó con C57B1/6 durante 10 generaciones. En este estudio se utilizaron catorce ratones silvestres C57B1/6 macho y hembra cuya edad oscilaba entre las siete y las ocho semanas de edad al momento de la inyección del anticuerpo y diez ratones MASP-2 (-/-) y silvestres C57B1/6 ( +/+) macho y hembra cuya edad oscilaba entre las siete y las ocho semanas de edad al momento de la inyección del anticuerpo. A veinte ratones se les inyectó una mezcla o coctel de anticuerpos monoclonales para obtener 20 ratones seguros que respondan al tratamiento (dos grupos de diez) . Los animales (diez/grupo) se alojaron con cinco animales/j aula y se aclimataron de cinco a siete días antes de iniciar el estudio. A los ratones se les inyectó, en el dia 0 y en el dia 1, un coctel de anticuerpos monoclonales (Chondrex, Redmond WA) (5 mg) por vía intravenosa. El agente de prueba era un anticuerpo monoclonal + LPS de Chondrex. El dia 2, a los ratones se les administró ip con LPS. Los ratones se pesaron los días 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 y el dia 14 antes de terminar. El día 14, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se desangraron para extraerles el suero. Tras la recolección de la sangre, los ratones se sacrificaron y se les retiraron las extremidades delanteras y traseras junto con las rodillas, las cuales se colocaron en formalina para un tratamiento posterior. Grupos de tratamiento: Grupo 1 (de control) : 4 ratones de la cepa C57/BL/6 WT (+/+) ; Grupo 2 (de prueba) : 10 ratones de la cepa C57/BL/6 WT ( +/+) (que recibieron el coctel de mAb más LPS); y Grupo 3 (de prueba) : 10 ratones de la cepa C57/BL/MASP-2KO/6AÍ (-/-) (que recibieron el coctel de mAb más LPS) . Las calificaciones de la artritis clínica se asignaron diariamente utilizando la siguiente escala de calificaciones: 0 = normal; 1 = afectación en una articulación de la pata trasera o delantera; 2 = afectación en 2 articulaciones de las patas traseras o delanteras; 3 = afectación en 3 articulaciones de las patas traseras o delanteras; 4 = afectación moderada (eritema e hinchazón moderada o afectación en 4 articulaciones de los dedos); 5 = afectación grave (eritema difuso e hinchazón grave en toda la pata, incapacidad para doblar los dedos). Resultados : La figura 19 muestra los datos del grupo trazados con la calificación de la artritis clínica media diaria hasta de dos semanas . En el grupo de control que no recibió el tratamiento con MoAb CoL2 no se asignaron calificaciones de la artritis clínica. Los ratones MASP-2 (-/-) tuvieron una menor calificación de la artritis clínica del día 9 al días 14. La calificación general de la artritis clínica con el análisis del área bajo la curva (AUC) indicó una reducción del 21% en el grupo de los ratones MASP-2 (-/-) en comparación con los ratones WT ( +/+ ) . Sin embargo, los antecedentes del ratón C57B16, como se mencionó en lo anterior, no aportó una sólida calificación de la artritis clínica. Debido a la pequeña tasa de incidencia y tamaño del grupo, si bien con tendencia positiva, los datos sólo suministraron tendencias (p = 0.1) y no fue estadísticamente significativa en el nivel de p < 0.05. Para tener significancia estadística, se necesitarían más animales en los grupos de tratamiento. Debido a la menor incidencia de la artritis, se calificó la gravedad de la pata afectada.

En ninguno de los ratones MASP-2 (-/-) se observó una sola incidencia de calificación de la artritis clínica que fuera mayor de 3, lo cual se observó en el 30% de los ratones WT (+/+), lo que sugiere además que (1) la gravedad de la artritis puede estar relacionada con la activación de la vía del complemento y (2) el bloqueo de la MASP-2 puede tener un efecto benéfico en la artritis.

EJEMPLO 30 Este ejemplo demuestra que la proteína pequeña asociada con la lectina de unión a mañosa (MApl9 o sMAP) es un inhibidor de la activación del complemento dependiente de la MASP-2.

Antecedentes y fundamento: Resumen: La lectina de unión a mañana (MBL) y las ficolinas son proteínas de reconocimiento de patrón que actúan en la inmunidad innata y disparan la activación de la vía del complemento por la lectina por medio de las serina proteasas asociadas a la MBL (MASPs) . Después de la activación de la vía de la lectina, la MASP-2 escinde al C4 y al C2. La proteína pequeña asociada a la MBL (sMAP), una forma trunca de la MASP-2, también está asociada a los complejos MBL/ ficol ina-MASP . Para aclarar el papel de la sMAP, los inventores han creado ratones deficientes en sMAP (sMAP-/-) por alteración dirigida del exón específico de la sMAP . Debido a la alteración génica, en los ratones sMAP-/- también se redujo el nivel de expresión de la MASP-2. Cuando la sMAP recombinante (rsMAP) y la MASP-2 recombinante (rMASP-2) reconstituyeron el complejo MBL-MASP-sMAP en el suero deficiente, la unión de estos recombinantes con la MBL estaba compitiendo y la actividad de escisión del C4 del complejo MBL-MASP-sMAP fue restaurada por la adición de la rMASP-2, en tanto que la adición de la rsMAP atenuó la actividad. Por ende, la MASP-2 es esencial para la activación del C4 y la sMAP tiene una función reguladora en la activación de la vía de la lectina. Introducción: El sistema de complemento regula una reacción en cadena de proteólisis y de ensamblado de complejos proteinicos, realizando una función principal en la defensa biológica como parte de los dos sistemas inmunitarios innato y adaptivo. El sistema de complemento de los mamíferos está formado por tres vías de activación: la vía clásica, la vía alternativa y la vía de la lectina (Fujita, Wat. Rev. Immunol. 2: 346-353 (2002); alport, N Engl J Med 344: 1058-1066 (2001)). La vía de la lectina constituye la primera línea de defensa en contra de los patógenos invasores. Los componentes de reconocimiento de patógenos de esta vía, la lectina de unión a mañosa (MBL) y las ficolinas, se unen a arreglos de carbohidratos en las superficies de bacterias, virus y parásitos y activan las proteasas séricas asociadas a la MBL (MASP) para disparar una cascada de reacciones corriente abajo. La importancia de la vía de la lectina en la defensa inmunitaria innata se pone de manifiesto gracias a varios estudios clínicos que vinculan una deficiencia de MBL con un aumento en la susceptibilidad a una variedad de enfermedades infecciosas, en particular, en la primera infancia, antes de que se establezca el sistema inmunitario adaptativo (Jack et al., Immunol Rev 180: 86-99 (2001); Neth et al. Infect Immun 68: 688-693 (2000); Summerfield et al., Lancet 345: 886-889 (1995); Super et al., Lancet 2: 1236-1239 (1989)). No obstante, la vía de la lectina también contribuye a la activación no deseada del complemento, el cual está involucrado en la inflamación y el daño tisular en varias enfermedades patológicas, entre las que se incluye a la lesión por isquemia/irrigación en el corazón y los ríñones (de Vries et al., Am J Pathol 165: 1677-1688 (2004); Fiane et al., Circulation 108: 849-856 (2003); Jordán et al., Circulation 104: 1413-1418 (2001); Walsh et al., J. Immunol. 175: 541-546 (2005)). Como se mencionó anteriormente, la vía de la lectina implica el reconocimiento glucídico mediante la MBL y las ficolinas (Fujita et al., Immunol Rev 198: 185-202 (2004); Holmskov et al., Annu Rev Immunol 21: 547-578 (2003); Matsushita and Fujita, Immunobiology 205: 490-497 (2002) y estas lectinas forman complejos con la MASP-1 (Matsushita and Fujita, J Exp Med 176: 1497-1502 (1992); Sato et al., Int Immunol 6: 665-669 (1994); Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196: 1003-1009 (1993), con la MASP-2 (Thiel et al, Nature 386: 506-510 (1997), con la MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15: 127-135 (2001) y con una proteína trunca de la MASP-2 (la proteína pequeña asociada a la MBL, sMAP o MApl9) (Stover et al, J Immunol 162: 3481-3490 (1999); Takahashi et al., Int Immunol 11: 8590863 (1999) . Los miembros de la familia de la MASP están constituidos por seis dominios: dos dominios Clr/Cls/Uegf/proteína morfogénica de hueso (CUB) ; un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico o EGF; dos dominios de la proteína de control del complemento (CCP) o repeticiones de consenso corto (SCR) y un dominio de serina proteasa (Matsushita et al., Curr Opin Immunol 10: 29-35 (1998). La MASP-2 y la sMAP se generan por el corte y empalme alternativo de un solo gen estructural y la sMAP está formada por el primer dominio CUB (CUB1), el dominio tipo EGF y 4 aminoácidos extra en el extremo de la terminal C codificados por un exón específico de la sMAP . La MASP-1 y la MASP-3 también se generan a partir de un solo gen por corte y empalme alternativo (Schwaeble et al., Immunobiology 205: 455-466 (2002). Cuando la MBL y las ficolinas se unen a los carbohidratos en la superficie de los microbios, la forma proenzimática de la MASP se escinde entre el segundo dominio CCP y el dominio de la proteasa, derivando en la forma activa constituida por dos polipéptidos , llamados cadena pesada (H) y cadena ligera (L) y, de este modo, adquiriendo actividades proteolíticas en contra de los componentes del complemento. Los indicios acumulados muestran que' la MASP-2 escinde al C4 y al C2 (Matsushita et al, J. Immunol 165: 2637-2642 (2000), lo que lleva a la formación de la C3 convertasa (C4bC2a) . Los inventores proponen que la MASP-1 escinde directamente al C3 y, posteriormente, activa al bucle de amplificación (Matsushita and Fujita, Immunobiology 194: 443-448 (1995), aunque esta función está en controversia (Ambrus et al, J. Immunol. 170: 1374-1382 (2003). Aunque la MASP-3 también contiene un dominio de serina proteasa en la cadena L y exhibe su actividad proteolitica contra un sustrato sintético (Zundel et al, J Immunol. 172: 4342-4350 (2004), sus sustratos fisiológicos no han sido identificados. Sigue sin descubrirse la función de la sMAP que carece del dominio de serina proteasa. En este estudio, para aclarar la función de la sMAP en la activación del complemento por la via de la lectina, los inventores han alterado al exón especifico de la sMAP que codifica para 4 residuos de aminoácidos (EQSL) en el extremo C terminal de la sMAP y han creado ratones sMAP -/-. Y, por primera vez, informan aquí de la capacidad de la sMAP para atenuar la activación de la via de la lectina.

Materiales y métodos Ra tones Se preparó un vector dirigido que contenia los exones 1 a 4 y parte del exón 6 del gen MASP-2 de ratón 129/Sv y una cásete del gen de resistencia a la neomicina en vez del exón 5 (figura 20A) . En el extremo 3' del vector se insertó un gen DT-A, asi como tres sitios lox p para lograr el direccionamiento condicional para eliminar la cásete de neomicina y la región promotora en el futuro. El vector de direccionamiento se sometió a electroporesis en células ES 129/Sv. Los clones ES dirigidos se microinyectaron en blastocistos C57BL/6J que se implantaron en úteros de madres ICR sustitutas . Los ratones machó híbridos se aparearon con ratones hembra C57BL/6J con la finalidad de producir ratones heterocigotos (+/-) . Los ratones heterocigotos (+/-) se examinaron en un análisis de transferencia Southern del ADN de cola digerido con BamH I utilizando la sonda indicada en la figura 20A. El análisis de transferencia Southern mostró bandas de 6.5 kbp y 11 kbp en el ADN de ratones heterocigoto (+/-) (figura 20B) . Los ratones heterocigoto (+/-) se retrocruzaron con ratones C57BL/6J. Para obtener ratones homocigoto (-/-) , se entrecruzaron ratones heterocigoto ( +/-) . Por medio de genotipia basada en la PCR del ADN de cola, se identificaron los ratones homocigoto (-/-) (con antecedente C57BL/6J) . El análisis por PCR se realizó utilizando una mezcla de cebadores de sentido específicos del exón 4 y específicos del neogen y un cebador antisentido especifico del exón 6. El ADN de los ratones homocigoto (-/-) produjo una sola banda a 1.8 kbp (figura 20C) . En todos los experimentos, se utilizaron ratones con edades entre las 8 y las 12 semanas, de conformidad con las directrices para la experimentación con animales de la Fukushima Medical University.

Análisis por transferencia Northern El ARN poli (A) + (1 µg) de ratón silvestre ( +/+ ) y los hígados de ratones homocigoto (-/-) se separaron por medio de electroforesis , se transfirieron a una membrana de nailon y se hibridaron con una sonda de ADNc etiquetada con 32P específica del sMAP, de la cadena H de la MASP-2, de la cadena L de la MASP-2 o del neogen. Esta misma membrana se depuró y volvió a hibridarse con una sonda específica de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa o GAPDH .

RT-PCR cuantitativa La PCR en tiempo real (RT) se realizó con el sistema LightCycler (Roche Diagnostics) . Los ADNc sintetizados a partir de 60 ng del ARN poli (A) + de hígados de ratón silvestre ( +/+ ) y de ratón homocigoto (-/-) se utilizaron como plantillas para la PCR en tiempo real y los fragmentos de ADNc de las cadenas H y L de la MASP-2 y del sMAP se amplificaron y vigilaron.

Inmunotransferencía La muestra se sometió a electroforesis en 10 o 12% de geles SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno o PVDF. Las proteínas en las membranas se detectaron con antisuero anti-MASP-1 cultivado contra la cadena L de la MASP-1 o con antisuero anti- ASP-2/sMAP cultivado contra el péptido de la cadena H de la MASP-2.

Detección de las MASP y la sMAP en el complejo MBL-MASP-sMAP A 480 µ? de solución amortiguadora de TBS-Ca2+ (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 0.15 NaCl y CaCl2 5 mM) que contenía 0.1% (p/v) de BSA ( TBS-Ca2+/BSA) se añadieron 20 µ? de suero de ratón y se incubaron con 40 µ? de pulpa de gel de manana-agarosa al 50% ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)en solución amortiguadora de TBS-Ca2+/BSA a 4°C durante 30 minutos. Después de la incubación, cada gel se lavó con solución amortiguadora de TBS-Ca2+ y al gel se añadió la solución amortiguadora muestreada para la SDS-PAGE. El gel se hirvió y el sobrenadante se sometió a SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia para detectar la MASP-1, la MASP-2 y la sMAP en el complejo de la MBL.

Ensayo de precipitación del C4 El suero de ratón se diluyó con solución amortiguadora de TBS-Ca2+/BSA hasta un volumen de 100 µ? . La muestra diluida se añadió a pozos de microtitulación recubiertos con mañana y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los pozos se lavaron con solución amortiguadora de lavado fría (TBS-Ca2+ que contenia 0.05% (v/v) de Tween 20) . Después del lavado, a cada pozo se añadió C4 de humano y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Los pozos se lavaron con la solución amortiguadora de lavado fría, luego a cada pozo se añadió el anticuerpo policlonal C4 antihumano conjugado con HRP (Biogénesis, Poole, Inglaterra) . Después de la incubación a 37°C durante 30 minutos, los pozos se lavaron con la solución amortiguadora de lavado y a cada pozo se añadió solución de 3, 31 , 5, 51 -tetrametilbencidina (TMB) . Después del crecimiento, se añadió H3P04 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm.

Ensayo de precipitación del C3 El suero de ratón se diluyó hasta 100 µ? con un amortiguador de BBS (barbital 4 m , NaCl 145 mM, CaCl2 2mM y MgCl2 1 mM, pH 7.4) que contenia 0.1% (p/v) de HSA. La muestra diluida se añadió a pozos de microtitulación recubiertos con mañana y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavaron con la solución amortiguadora. Después del lavado, a cada pozo se añadió el anticuerpo policlonal C3c antihumano conjugado con HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) . Después de incubar a temperatura ambiente durante 1 hora, los pozos se lavaron con la solución amortiguadora de lavado y a cada pozo se añadió la solución de TMB. El color se determinó como se describió en lo anterior.

Recombinantes La sMAP recombinante (rsMAP) de ratón, la rMASP-2 y la MASP-2 mutante de ratón inactiva (MASP-2Í), cuyo residuo de serina de sitio activo en el dominio de la serina proteasa fue sustituido por el residuo de alanina, se prepararon como ya se describió en lo anterior (Iwaki and Fujita, 2005) .

Reconstitución del complejo MBL-MASP-sMAP El suero (20 µ? ) de ratón homocigoto (-/-) y cantidades variables de MASP-2Í y/o de rsMAP se incubaron sobre hielo en un volumen total de 40 µ? en solución amortiguadora de TBS-Ca2+ durante toda la noche. La mezcla se incubó con pulpa de gel de manana-agarosa y la MASP-2Í y la rsMAP del complejo MBL- ASP unida al gel se detectaron como se describió en "Detección de las MASP y la sMAP en el complejo MBL-MASP-sMAP" .

Reconstitución de la actividad de precipitación del C4 El suero (0.5 µ? ) de ratón homocigoto (-/-) y cantidades variables de rMASP-2 y/o de rsMAP se incubaron sobre hielo en un volumen total de 20 µ? en solución de TBS-Ca2+ durante toda la noche. La mezcla se diluyó con 80 µ? de la solución amortiguadora de TBS-Ca2+/BSA y se añadió a los pozos recubiertos con mañana. El resto de los procedimientos siguientes se realizaron como se describió en "Ensayo de precipitación del C4" .

Resultados FIGURA 20: Alteración dirigida del gen sMAP. (A) Mapas de restricción parcial del gen MASP-2/sMAP, del vector de direccionamiento y del alelo objetivo. El exón especifico de la sMAP (exón 5) fue sustituido con una cásete de neogen. (B) Análisis por transferencia Southern del ADN genómico de la descendencia derivada del apareamiento de ratones macho híbridos con ratones hembra C57BL/6J. El ADN de cola se digirió con BamH I y se híbrido con la sonda ilustrada en (A) . Del alelo silvestre se derivó una banda de 11 kbp y del alelo objetivo se derivó una banda de 6.5 kbp. (C) análisis de genotipia por PCR. El ADN de cola se analizó utilizando una mezcla de cebadores de sentido específicos del exón 4 y específicos del neogen y un cebador antisentido específico del exón 6. Del alelo silvestre se obtuvo una banda de 2.5 kbp y del alelo objetivo, una banda de 1.8 kbp.

FIGURA 21: Expresión de los ARNm de la sMAP y la MASP-2 en ratones homocigoto (-/-) . (A) Análisis por transferencia Northern. Los ARN poli (A) + de ratón silvestre (+/+) y los hígados de ratones homocigoto (-/-) se sometieron a electroforesis , se transfirieron a una membrana de nailon y se hibridaron con una sonda con etiquetado de 32P específica de la sMAP, de la cadena H de la MASP-2, de la cadena L de la MASP-2 o del neogen. En los ratones homocigoto (-/-) se observó una banda específica para el neo (2.2 kb) . (B) RT-PCR cuantitativa.

Las cadenas H y L de la MASP-2 y los fragmentos de ADNc de la sMAP se amplificaron mediante PCR en tiempo real en un aparato LightCycler (Roche Diagnostics ) . Los ADNc sintetizados a partir de los ARN poli (A) + de hígados de ratón silvestre (+/+) y de ratón homocigoto (-/-) se utilizaron como plantillas. Los datos mostrados son las medias de los dos experimentos . FIGURA 22: Deficiencia de MASP-2 en el suero de ratón homocigoto (-/-) . (A) Inmunotransferencia de la MASP-2 y la sMAP en suero de ratón. El suero (2 µ?) de ratón silvestre (+/+) u homocigoto (-/-) se sometió a inmunotransferencia y se detectó con un antisuero anti-MASP-2/sMAP. (B) Detección de las MASP y la sMAP en el complejo MBL-MASP-sMAP . El suero de ratón se incubó con gel de manana-agarosa y la sMAP, la MASP-1 y la MASP-2 del complejo MBL unidas al gel se detectaron tal y como se describió en Materiales y métodos. FIGURA 23: Reducción en la escisión del C4 y del C3 en el suero de ratón homocigoto (-/-) . (A) Precipitación del C4 en pozos recubiertos con mañana. El suero del ratón se diluyó dos veces y se incubó en pozos recubiertos con mañana a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del lavado de los pozos, a cada pozo se añadió C4 de humano y se incubaron en hielo durante 30 minutos. La cantidad del C4 de humano depositada o precipitada en los pozos se determinó utilizando un anticuerpo policlonal de C4 antihumano conjugado con HRP. (B) Precipitación del C3 en pozos recubiertos con mañana. El suero de ratón diluido se añadió a los pozos recubiertos con mañana y se incubaron a 37°C durante 1 hora. La precipitación del C3 endógeno en los pozos se detectó con un anticuerpo policlonal de C3c antihumano conjugado con HRP. FIGURA 24: Competencia por la unión de la sMAP y la ASP-2 a la MBL . (A) Reconstitución del complejo MBL- ASP-sMAP en el suero de ratón homocigoto (-/-) . La ASP-2i y/o la rsMAP (4 µg) se incubaron con suero de ratón homocigoto (-/-) (20 µ?). La mezcla se incubó en forma adicional con gel de manana-agarosa y la rsMAP y la MASP-2i de la fracción unida al gel se detectaron por inmunotransferencia . (B) Cantidades variables de la MASP-2i (de 0 a 5 µg) y una cantidad constante de la rsMAP (5 µg) se incubaron con suero (20 µ?) de ratón homocigoto (-/-) y se incubaron adicionalmente con gel de raanana-agarosa. (C) Una cantidad constante de la MASP-2Í (0.5 g) y cantidades variables de la rsMAP (de 0 a 20 µg) se incubaron con suero (20 µ?) de ratón homocigoto (-/-) . (D) Cantidades variables (de 0 a 20 pg) de la rsMAP se incubaron con suero (20 µ?) de ratón silvestre ( +/+) . FIGURA 25: Restauración de la actividad de precipitación del C4 por adición de la rMASP-2. Cantidades variables (de 0 a 5 µg) de la rsMAP (A) o de rMASP-2 (de 0 a 1.5 µg) (B) se incubaron sobre hielo durante toda la noche con 0.5 µ? de suero de ratón homocigoto (-/-) en un volumen total de 20 µ? en un amortiguador de TBS-Ca2+. La mezcla se diluyó luego con 80 µ? de amortiguador de TBS-Ca2+/BSA y se añadió a los pozos recubiertos con mañana, determinándose la cantidad del C4 depositada en los pozos. FIGURA 26: Reducción de la actividad de precipitación del C4 mediante la adición de la sMAP. (A) La rMASP-2 (1 g) y cantidades variables de la rsMAP (de 0 a 0.5 g) se incubaron con 0.5 µ? suero de ratón homocigoto (-/-) . La mezcla se añadió a los pozos recubiertos con mañana, determinándose la cantidad de C4 depositada en los pozos. (B) La rsMAP (de 0 a 0.7 µg) se incubó con suero (0.5 µ?) de ratón silvestre, determinándose luego la cantidad de C4 depositada en los pozos recubiertos con mañana.

RESULTADOS : Expresión de la sMAP y la MASP-2 en ratones homocigoto (-/-) Para aclarar la función de la sMAP in vivo, se estableció en un ratón un gen dirigido, el cual carecía de la sMAP. Se construyó un vector de direccionamiento para sustituir al exón específico de la sMAP (exón 5) por una cásete de gen resistente a la neomicina (figura 20A) . Los clones ES que dieron positivo se inyectaron en blastocistos C57BL/6 y los híbridos fundadores se reprodujeron con hembras C57BL/6J. El análisis por transferencia Southern del ADN de cola de cachorros de agutí de color presentaron una transmisión germinal de los alelos objetivo (figura 20B) . Los ratones heterocigotos (+/-) se examinaron en un análisis de transferencia Southern del ADN de cola digerido con BamH I utilizando la sonda indicada en la figura 20A. El análisis de transferencia Southern mostró bandas de 6.5 kbp y 11 kbp en el ADN de ratones heterocigoto (+/-) (figura 20B) . Los ratones heterocigoto (+/-) se retrocruzaron con ratones C57BL/6J. Para obtener ratones homocigoto (-/-), se entrecruzaron ratones heterocigoto (+/-). Por medio de genotipia, basada en la PCR, del ADN de cola, se identificaron los ratones homocigoto (-/-) (con antecedente C57BL/6J) , lo que produjo una sola banda de 1.8 kbp (figura 20C) . Los ratones homocigoto (-/-) crecieron normalmente y no mostraron diferencias significativas en el peso corporal con respecto a los ratones silvestres (+/+). Entre ellos tampoco hubo diferencias morfológicas. En un análisis por transferencia Northern, la sonda especifica de la sMAP detectó sólo una banda de 0.9 kbp en los ratones silvestres, en tanto que para los ratones homocigoto (-/-) no se detectaron bandas especificas (figura 21A) . Cuando se usó la sonda especifica de la cadena H o L de la MASP-2, en los ratones silvestres (+/+) se detectaron bandas especificas como ya se había informado anteriormente (Stover et al, 1999) y la sonda específica de la cadena H también detectó la banda específica de la sMAP. Sin embargo, en los ratones homocigoto (-/-), las bandas correspondientes eran muy débiles y se detectaron varias bandas adicionales. Con la finalidad de comprobar los niveles de expresión de los ARNm de la sMAP y de la MASP-2, también se realizó un análisis cuantitativo por RT-PCR. La expresión del ARNm de la sMAP estaba totalmente suprimida en ratones homocigoto (-/-) y la de la MASP-2 tenía también se redujo en forma significativa: con la PCR en tiempo real se cuantificó que ésta era de aproximadamente el 2% de la de los ratones silvestres ( +/+) tanto en la cadena H como en la cadena L (figura 21B) . Por otra parte, se examinó la expresión de la MASP-2 en el nivel proteico. Tanto la s AP como la MASP-2 fueron indetectables, por medio de inmunotransferencia, en suero de ratón homocigoto (-/-) (figura 22A) . Después de la incubación del suero de ratón homocigoto (-/-) con gel de manana-agarosa, ni la sMAP ni la MASP-2 pudieron ser detectadas en la fracción unida a los geles, no obstante, la MASP-1 fue detectada en el complejo (figura 22B) .

Actividades de escisión del C4 y del C3 por la vía de la lectina en el suero de ratón homocigoto (-/-) Cuando el suero de ratón homocigoto (-/-) se incubó en pozos recubiertos con mañana, la cantidad del C4 de humano depositada en los pozos fue aproximadamente de 20% de la del suero normal a diluciones que variaron entre 1/400 y 1/50 (figura 23A) . También se examinó la actividad de la precipitación del C3 por la vía de la lectina en el suero de ratón homocigoto (-/-) . El suero de ratón se añadió a los pozos recubiertos con mañana, determinándose la cantidad del C3 endógeno depositada en los pozos. La cantidad se redujo en el suero deficiente y fue 21% de la del suero normal a una dilución de 1/10 (figura 23B) .

Reconstitución del complejo MBL-MASP-sMAP en el suero de ratón homocigoto (-/-) Cuando la sMAP recombinante (rsMAP) de ratón o la ASP-2 mutante inactiva (MASP-2Í) de ratón se añadieron al suero de ratón homocigoto (-/-) , las dos recombinantes pudieron unirse a la MBL (figura 24A, carriles 3 y 4) . Cuando la rsMAP y la MASP-2Í se incubaron simultáneamente con el suero (figura 24A, carril 5), ambos recombinantes fueron detectados en el complejo BL- ASP-sMAP . Sin embargo, la cantidad de sMAP que se unió al complejo fue menor que la unida cuando sólo se incubó la rsMAP con el suero. Entonces, se decidió investigar más la competencia de la sMAP y la MASP-2 por unirse a la MBL. Al suero deficiente se añadió una cantidad constante de la rsMAP y cantidades variables de la MASP-2Í . La unión de la rsMAP se redujo en forma dependiente de la dosis conforme iban aumentando las cantidades de la MASP-2Í (figura 24B) . Y a la inversa, la cantidad de la MASP-2Í unida a la MBL se redujo al añadir rsMAP (figura 24C) . Cuando al suero de ratón silvestre se añade la rsMAP, se reduce la unión de la sMAP endógena y la MASP-2 con la MBL, en una forma que depende de la dosis (figura 24D) .

Reconstitución de la actividad de precipitación del C4 en suero de ratón homocigoto (-/-) Se realizó un experimento de reconstitución de la precipitación del C4 en pozos recubiertos con mañana, utilizando a los recombinantes. Cuando al suero deficiente se añadió la rsMAP, la cantidad de C4 realmente depositada se redujo hasta los niveles básales en una forma dependiente de la dosis (figura 25A) . Cuando al suero se añade la rMASP-2, la cantidad de C4 se recuperó hasta el 46% de la del suero de ratón silvestre en forma dependiente de la dosis y se alcanzó una meseta (figura 25B) . A continuación, se investigó el efecto de la sMAP sobre la precipitación del C4. Cuando al suero deficiente se añadió una cantidad constante de rMASP-2 y cantidades variables de rsMAP, la cantidad de C4 depositada se redujo al añadir la rsMAP en una forma que depende de la dosis (figura 26A) y la adición de la rsMAP al suero de ratón silvestre también redujo la cantidad del C4 depositado (figura 26B) , lo que sugiere que la sMAP tiene una función reguladora en la activación de la vía de la lectina.

Comentarios Los inventores han creado ratones sMAP -/- por medio de la alteración dirigida del exón especifico de la sMAP. En estos ratones, el nivel de expresión de la MASP-2 también se redujo de manera importante tanto en los niveles de la ARNm como de proteina (figuras 21 y 22). El análisis por transferencia Northern con una sonda MASP-2 sólo mostró bandas adicionales en el ARN poli (A) + de ratones sMAP -/-, lo que sugiere que el corte y empalme normal del gen de la MASP-2 fue alterado por el direccionamiento del gen de la sMAP y, por tanto, el grado de expresión de la MASP-2 se redujo notablemente. Como resultado, la escisión del C4 por medio del complejo MBL-MASP en el suero deficiente se redujo aproximadamente en 80% en comparación con la del suero normal (figura 23A) . En los experimentos de reconstitución, la adición de la rMASP-2 restauró la actividad de escisión del C4, lo que no ocurrió con la rsMAP (figura 25) . La reducción en la precipitación del C4 observada en el suero deficiente debe ser ocasionada por la deficiencia de la MASP-2 en el complejo MBL-MASP (figura 22B) . Por lo tanto, es evidente que la MASP-2 es esencial para que el complejo MBL-MASP active al C4. Sin embargo, la adición de la rMASP-2 no restauró por completo la actividad de escisión y la precipitación del C4 se estancó en una meseta. Como se informó anteriormente (Cseh et al., J. Immunol. 169: 5735-5743 (2002); Iwaki and Fujita, J Endotoxin Res 11: 47-50 (2005) ) , la mayor parte de la rMASP-2 se convirtió a la forma activa por autoactivación durante los procedimientos de purificación y perdió parte de su actividad de proteasa. Puesto que el estado activo o inactivo de la MASP-2 no influye de manera significativa en su asociación con la MBL (Zundel et al., J Immunol 272:4342-4350 (2004)), es posible que la rMASP-2, que ha perdido su actividad de proteasa, se una a la MBL y evita, por competencia, la asociación de la forma activa, lo que de ese modo provoca que la precipitación del C4 se restaure en forma incompleta. También hubo en el suero deficiente disminución en la actividad de escisión del C3 por la vía de la lectina (figura 23B) . Es probable que la declinación en la cantidad de C3 depositado se deba a la poquísima actividad de la C3 convertasa, constituida ésta última por los fragmentos C4b y C2a generados por la MASP-2. Cada una de la MASP-2 y la sMAP se asociaron como homodímeros y formaron complejos con la MBL o la L-ficolina a través de sus dominios tipo EGF y CUB del extremo N (Chen and Wallis, J Biol Chem 276: 25894-25902 (2001); Cseh et al., J Immunol 169: 5735-5743 (2002); Thielens et al., J Immunol 166: 5068-5077 (2001); Zundel et al., J Immunol 172: 4342-4350 (2004)). Las estructuras cristalinas de la sMAP y del segmento CUB1-EGF-CUB2 de la MASP-2 revelaron su estructura homodimérica (Feinberg et al., EMBO J 22: 2348-2359 (2003); Gregory et al., J Biol Chem 278: 32157-32164 (2003)). El dominio de tipo colágeno de la MBL está involucrado en la asociación con las MASP-2 (Wallis and Cheng, J Immunol 163: 4953-4959 (1999); Wallis and Drickamer, J Biol Chem 279: 14065-14073 (1999)) y algunas mutaciones introducidas en el dominio han reducido la unión de la MBL con los segmentos CUB1-EGF-CUB2 de la MASP-1 y la MASP-2 (Wallis and Dodd, J Biol Chem 275: 30962-30969 (2000)). Hay un traslape en los sitios de unión de la MASP-2 y la MASP-1/3, pero no son idénticos (Wallis et al., J Biol Chem 279: 14065-13073 (2004)).

Aunque el sitio de unión con la sMAP de la MBL aún no ha sido identificado, es probable que los sitios de unión de la sMAP y la MASP-2 sean idénticos, debido a que la región CUB1-EGF es la misma en la sMAP y en la MASP-2. Asi, parece razonable que la sMAP y la MASP-2 compitan entre si para unirse a la MBL durante la reconstitución del complejo MBL-MASP-sMAP (figura 24). La afinidad de la sMAP por la MBL es menor que la de la MASP-2 (Cseh et al., J Immunol 169: 5735-5743 (2002); Thielens et al., J Immunol 166: 5068-5077 (2001)). La concentración de la sMAP en el suero de ratón no ha sido determinada. Sin embargo, como se muestra en la figura 22A la cantidad de sMAP en el suero de ratón silvestre es mucho mayor que la de la MASP-2. Por lo tanto, la sMAP puede ocupar el sitio de unión MASP-2/sMAP y evitar que la MASP-2 se una a la MBL y, en consecuencia, que se reduzca la actividad de escisión del C4 del complejo MBL-MASP. Falta por estudiar el mecanismo regulador de la sMAP en la via de la lectina. Aún no se sabe si la sMAP realiza alguna función reguladora tanto antes como después de la activación del complemento. La sMAP puede evitar la activación accidental del complejo MBL-MASP antes de la infección microbiana o suprimir la activación excesiva de la via de la lectina una vez activada. Existe en la via de la lectina otro potencial elemento regulador. La MASP-3 también compite con la MASP-2 por unirse a la MBL y reduce la actividad de escisión del C4 y el C2 de la MASP-2 (Dahl et al., Immunity 15: 127-135 (2001)). Aunque todavía no se ha investigado la interacción entre la sMAP y la MASP-3, es posible que puedan atenuar, cooperativamente, la activación de la vía de la lectina. En este informe se ha demostrado que la sMAP y la MASP-2 compiten por unirse a la MBL y la sMAP tiene la capacidad de atenuar la vía de la lectina, la cual es activada por el complejo MBL-MASP. Parece razonable que la sMAP también regule otra ruta de la vía de la lectina activada por el complejo ficolina-MASP . La MASP-2 y la sMAP también compiten por unirse a la ficolina A de ratón y reducen la actividad de escisión del C4 del complejo ficolina A-MASP (Y. Endo et al., en preparación). Recientemente se presentó un estudio en ratones sin MBL (Shi et al., J Exp Med 199: 1379-1390 (2004). Los ratones sin MBL no tienen actividad de escisión de C4 en la vía de la lectina y no son susceptibles de infectarse con Staphylococcus aureus. En este estudio, los ratones sMAP-/-, que también son deficientes en la MASP-2, presentaban una reducción en la actividad de escisión del C3, además de la actividad de escisión del C4 en la vía de la lectina. Debido a que su actividad opsonizante no ha sido afectada, los ratones deficientes en sMAP pueden ser susceptibles de infectarse con bacterias. Investigaciones adicionales en ratones deficientes en la sMAP aclararán la función de la vía de la lectina en la protección contra las enfermedades infecciosas. Otro importante descubrimiento es que la adición de la rsMAP al suero normal provoca una reducción en la activación del C4 (figura 26B) . También se ha demostrado que la vía de la lectina regula la inflamación y la lesión tisular de varios órganos (de Vries et al., Am J Pathol 165: 1677-1688 (2004); Fiane et al., Circulation 108: 849-856 (2003); Jordán et al., Circulation 104: 1413-1418 (2001); alsh et al, J Immunol 175: 541-546 (2005)). En pacientes deficientes en MBL sometidos al tratamiento de un aneurisma aórtico abdominal torácico, no hubo activación del complemento y los niveles de los marcadores proinflamatorios se redujeron después de la cirugía (Fiane et al., Circulation 108: 849-856 (2003)). Los indicios acumulados han demostrado que la potencial función fisiopatológica de la MBL en situación de isquemia e irrigación en una variedad de lechos vasculares. Por lo tanto, el bloqueo específico de la MBL o la inhibición de la vía de la lectina del complemento puede representar una estrategia terapéuticamente relevante para prevenir los daños asociados a la isquemia/irrigación. Así, es posible que la sMAP sea una de los candidatos a ser dicho inhibidor, puesto que actúa como atenuador de la activación de la vía de la lectina.

EJEMPLO 31 Este ejemplo demuestra que la MASP-2 es la responsable de activar al C3 y evitar el C . Antecedentes y fundamento: Más recientemente, se ha mostrado que la inhibición de la vía alternativa protege al riñon contra la insuficiencia isquémica aguda (Thurman et al., J. Immunol 170: 1517-1523 (2003)). Los datos que aquí se describen implican que la vía de la lectina gobierna la activación de la vía alternativa, la cual, a su vez, amplifica sinérgicamente la activación del complemento. Los inventores plantean la hipótesis de que la inhibición transitoria de la vía de la lectina también puede afectar la activación de la vía alternativa y con ello mejorar la evolución a largo plazo en operaciones de transplante de órganos, ya que limita el daño al injerto mediado por el complemento y la inflamación, y puede moderar la inducción no deseada de una respuesta inmunitaria adaptativa contra el injerto y reducir el riesgo de rechazo secundario al injerto por el sistema inmunitario adaptativo. Esto se sustenta en datos clínicos recientes que muestran que la afectación parcial de la vía de la lectina, deriva de las deficiencias hereditarias en la MBL (presentes en aproximadamente el 30% de los seres humanos), está asociada al aumento en la sobrevivencia del aloinjerto renal en seres humanos (Berger, ñm J Transplant 5: 1361-1366 (2005) ) .

La participación de los componentes C3 y C4 del complemento en la lesión por isquemia-irrigación (I/R) estaba bien establecida en los modelos de isquemia muscular e intestinal transitoria que utilizan cepas de ratón con genes direccionados (Weiser et al., J Exp Med 183: 2342-2348 (1996); Williams et al. J Appl Physiol 86: 938-42, (1999)) . Se ha establecido perfectamente que el C3 tiene una función principal en la lesión por I/R renal y en el rechazo secundario del injerto (Zhou et al . , J Clin Invest 105: 1363-1371 (2000); Pratt et al., Nat Med 8: 582-587 (2002); Farrar, et al., Am J. Pathol 164: 133-141 (2004)). Por lo tanto, fue una sorpresa no observar en los modelos publicados de rechazo al aloinjerto de riñon en ratón un fenotipo para la deficiencia de C4 (Lin, 2005, en prensa) . Sin embargo, un análisis posterior de los sueros y plasmas de estos ratones deficientes en C4 indicó que estos ratones conservan una actividad funcional residual que muestra la escisión, dependiente de la LP, del C3 y una adicional activación, corriente abajo, del complemento (ver la figura 27C) . La existencia de una derivación o rodeo funcional del C4 (y la derivación o rodeo del C2) es un fenómeno que varios investigadores ya habían descrito (pero que no estaba totalmente caracterizado) (Miller et al., Proc Nati Acad Sci 72: 418-22 (1975); Knutzen Steuer et al., J Immunol 143(7): 2256-61 (1989); Wagner et al., J Immunol 163: 3549-3558 (1999)) y que se relaciona con el cambio a C3, independiente de la vía alternativa, en suero deficiente en C4 (y en C2). Métodos: Efectos de la vía de la lectina y la via clásica en la precipitación del C3. El plasma del ratón (que contiene EGTA/Mg2+ como anticoagulante) se diluye y recalcifica en barbital 4.0 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2.0 mM, MgCl2 1.0 mM, pH 7. , se añade luego a placas de microtitulación recubiertas con mañana (como se muestra en las figuras 27A y 27C) o con cimosán (como se muestra en la figura 27B) y se incuba durante 90 minutos a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces con Tris-Cl 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 5.0 mM, 0.05% de Tween 20, pH 7.4, posteriormente y utilizando un anticuerpo C3c anti-ratón, se determinó la precipitación del C3b. Resultados: Los resultados mostrados en las figuras 27A - 27C son representativas de 3 experimentos independientes. Cuando los mismos sueros se utilizan en pozos recubiertos con complejos de inmunoglobulina en vez de con mañana o cimosán, en los sueros de ratón WT (+/+) y en la combinación de sueros MASP-2 (-/-) se observa la precipitación del C3b y la escisión del factor B, lo que no sucede en los sueros en los que se agotó el Clq (los datos no se muestran) . Lo anterior indica que cuando el C3b inicial es suministrado por la actividad del CP, es posible restaurar la activación por la via alternativa en sueros MASP-2-/-. La figura 27C ilustra el sorprendente descubrimiento de que el C3 puede ser eficazmente activado, en una forma que depende de la vía de la lectina, en plasma deficiente en C4 (-/-) · Esta "derivación o rodeo del C4" queda suprimida por la inhibición de la activación de la vía de la lectina debida a la preincubación con mañana o mañosa soluble del plasma. Puede observarse que la precipitación del C3b en la mañana o el cimosán está gravemente comprometida en ratones deficientes en MASP-2 (-/-) , incluso en condiciones del laboratorio que, de conformidad con muchos artículos previamente publicados sobre la activación de la vía alternativa, debe permitir las tres vías. Como se muestra en las figuras 27A - 27C, el plasma de ratones deficientes en MASP-2 (-/-) no activó al C4 por la vía de la lectina ni escindió al C3 y tampoco lo hizo por la vía de la lectina ni por la vía alternativa. Por lo tanto, los inventores plantean la hipótesis de que para este rodeo o derivación del C4 en necesaria la MASP-2. Muy recientemente, el Prof. Teizo Fujita ha informado de otro avance en la identificación de los componentes que probablemente estén implicados en el rodeo del C4 dependiente de la vía de la lectina. El plasma de ratones deficientes en C4 cruzados con las cepas de ratón deficientes en MASP-1/3 de Fujita pierde su capacidad residual de plasma deficiente en C4 para escindir al C3 por la vía de la lectina. La cual se restableció al añadir MASP-1 recombinante al plasma con deficiencia combinada en C4 y MASP-1/3 (Takahashi, Mol Immunol 43: 153 (2006), lo que sugiere que la MASP-1 está involucrada en la formación de complejos derivados de la vía de la lectina que escinden al C3 en ausencia del C4 (la MASP-1 recombinante no escinde al C3, pero escinde al C2; Rossi et al . , J Biol Chem 276: 40880-7 (2001); Chen et al., J Biol Chem 279: 26058-65 (2004) . Se observa que para que se forme este rodeo o derivación, es necesaria la MASP-2. Aunque para consolidar este estudio piloto se necesita de la histología y de parámetros más funcionales y cuantitativos, sus resultados preliminares representan un apoyo firme a la hipótesis de que la activación del complemento por la vía de la lectina contribuye de manera significativa a la fisiopatología de la lesión por I/R renal, ya que los ratones MASP-2-/- presentan una recuperación mucho más rápida de sus funciones renales. Si bien se ha ilustrado y descrito la modalidad preferida de la invención, podrá observarse que en la misma pueden realizarse varios cambios sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Las modalidades de la invención sobre las cuales se reivindica la propiedad o privilegio exclusivo se definen a continuación:

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que necesita dicha inhibición, el método comprende administrarle al sujeto una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
2. El método según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6.
3. El método según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6 con una afinidad que por lo menos es 10 veces mayor de aquella con la que se une a diferentes antígenos del sistema de complemento .
4. El método según la reivindicación 2, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une a un polipéptido en un lugar al interior de los residuos de los aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6.
5. El método según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de la SEQ ID NO: 6.
6. El método según la reivindicación 5, donde el anticuerpo o fragmento del mismo es monoclonal .
7. El método según la reivindicación 5, donde el anticuerpo o fragmento del mismo es policlonal.
8. El método según la reivindicación 5, donde el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo recombinante .
9. El método según la reivindicación 5, donde la función efectora del anticuerpo está disminuida.
10. El método según la reivindicación 5, donde el anticuerpo es un anticuerpo híbrido, humanizado o de humano.
11. El método según la reivindicación 5, donde el anticuerpo se produce en un animal transgénico deficiente en MASP-2.
12. El método según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un péptido derivado de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por la MASP-2 de humano, la MBL de humano que inhibe a la MASP-2, la H-ficolina de humano que inhibe a la MASP-2, la M-ficolina de humano que inhibe a la MASP-2, la L-ficolina de humano que inhibe a la MASP-2 y el C4 de humano que inhibe a la MASP-2.
13. El método según la reivindicación 1, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un agente no peptídico que se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6.
14. El método según la reivindicación 13, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une a un polipéptido en un lugar al interior de los residuos de los aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6.
15. Un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que necesita dicha inhibición, el método comprende administrarle al sujeto una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir selectivamente la activación del complemento dependiente de la MASP-2 sin inhibir, esencialmente, la activación del complemento dependiente del Clq.
16. El método según la reivindicación 15, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6.
17. El método según la reivindicación 16, donde el agente inhibidor de la MASP-2 se une a un polipéptido en un lugar al interior de los residuos de los aminoácidos 1-176 de la SEQ ID NO: 6.
18. El método según la reivindicación 15, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de la SEQ ID NO: 6.
19. El método según la reivindicación 18, donde el anticuerpo o fragmento del mismo es monoclonal.
20. El método según la reivindicación 18, donde el anticuerpo es un anticuerpo híbrido, humanizado o de humano .
21. El método según la reivindicación 18, donde el anticuerpo se produce en un animal transgénico deficiente en MASP-2.
22. El método según la reivindicación 15, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un péptido derivado de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por la MASP-2 de humano, la MBL de humano que inhibe a la MASP-2, la H-ficolina de humano que inhibe a la MASP-2, la L- ficolina de humano que inhibe a la MASP-2 y el C4 de humano que inhibe a la MASP-2.
23. El método según la reivindicación 15, donde el agente inhibidor de la MASP-2 es un agente no peptidico que se une específicamente a un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 6.
24. Una composición para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2, composición que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Un método para fabricar un medicamento que se usará para inhibir, en aquellos sujetos que lo necesiten, los efectos de la activación del complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende combinar una 'cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inhibidor de la MASP-2 con un vehículo farmacéutico.
26. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad vascular mediada por el complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
27. El método según la reivindicación 26, donde el trastorno vascular se selecciona del grupo formado por un trastorno cardiovascular, un trastorno cerebrovascular, un trastorno vascular periférico (por ejemplo, osteomuscular ) , una enfermedad renovascular, una enfermedad vascular entérica/mesentérica, la revascularización en transplantes y/o reimplantaciones, vasculitis, nefritis púrpura de Henoch-Schonlein , vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a artritis reumatoide, vasculitis por inmunocomplejos, enfermedad de Takayasu, cardiomiopatia dilatada, angiopatia diabética, enfermedad de Kawasaki (arteritis), émbolo de gas venoso (VGE) y restenosis posterior a la colocación de una endoprótesis , aterectomia giratoria y angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) .
28. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a una lesión por isquemia-revascularización, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
29. El método según la reivindicación 28, donde la lesión por isquemia-revascularización está asociada a la reparación del aneurisma aórtico, a la revascularización cardiopulmonar, la reanastomosis vascular relacionada con los transplantes de órganos y/o la reimplantación de extremidades/dedos, ataque cerebrovascular, infarto de miocardio y reanimación hemodinámica posterior a procedimientos de choque y/o quirúrgicos .
30. - Un método para tratar y/o prevenir la aterosclerosis en un sujeto que lo necesite, el método comprende administrar una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2, eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
31. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a un trastorno gastrointestinal inflamatorio, el método comprende la administración de una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
32. El método según la reivindicación 31, donde el trastorno gastrointestinal inflamatorio se selecciona del grupo formado por pancreatitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de colon irritable y diverticulitis .
33. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad pulmonar mediada por el complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
34. El método según la reivindicación 33, donde la enfermedad pulmonar se selecciona del grupo formado por el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, lesiones pulmonares agudas relacionadas con la transfusión, lesiones pulmonares agudas por isquemia/revascularización, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad de la membrana basal antiglomerular (enfermedad de Goodpasture ) , síndrome de aspiración de meconio, síndrome de la bronquilitis obliterans, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda secundaria por quemaduras, edema pulmonar no cardiogénico, depresión respiratoria relacionada con la transfusión y enfisema.
35. Un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de revascularización extracorporal , el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
36. El método según la reivindicación 35, donde el procedimiento de revascularización extracorporal se selecciona del grupo formado por hemodiálisis, plasmaféresis , leucoféresis , oxigenación en membrana extracorporal (ECMO) , precipitación de LDL por oxigenación en membrana extracorporal inducida por heparina (HELP) y anastomosis quirúrgica cardiopulmonar (CPB) .
37. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad osteomuscular mediada por el complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
38. El método según la reivindicación 37, donde la enfermedad osteomuscular se selecciona del grupo formado por osteoartritis , artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, gota, artropatia neuropática, artritis psoriásica, espondiloartropatia, artropatia cristalina, distrofia muscular y lupus eritematoso sistémico (SLE) .
39. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad renal mediada por el complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
40. El método según la reivindicación 39, donde la enfermedad renal se selecciona del grupo formado por glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa ( glomerulonefritis mesangiocapilar) , glomerulonefritis posinfecciosa aguda ( glomerulonefritis posestreptocócica ) , glomerulonefritis crioglobulinémica, nefritis lúpica, nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein y neuropatía por IgA.
41. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad de la piel mediada por el complemento dependiente de la MASP-2, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
42. El método según la reivindicación 41, donde la enfermedad de la piel se selecciona del grupo formado por la psoriasis, las dermatosis ampulosas autoinmunitarias , la espongiosis eosinofi lica, el pénfigo ampuloso, la epidermólisis ampulosa adquirida, el herpes gestacional y las lesiones por quemaduras térmicas y químicas .
43. Un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un procedimiento de transplante de órgano o tejido, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
44. El método según la reivindicación 43, donde el procedimiento de transplante se selecciona del grupo formado por alotransplante de órgano, xenotransplante de órgano e injerto de tejido.
45. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a un trastorno o lesión en el sistema nervioso, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
46. El método según la reivindicación 45, donde el trastorno o lesión en el sistema nervioso se selecciona del grupo formado por esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Guillain Barre, revascularización posterior al accidente cerebrovascular, degeneración de discos, traumatismo encefálico, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Miller-Fisher , traumatismo y/o hemorragia encefálica, desmielinización y meningitis .
47. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a una hemopatia, el método comprende la administración de una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
48. El método según la reivindicación 47, donde la hemopatia se selecciona del grupo formado por la septicemia, la septicemia grave, el choque séptico, el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda derivado de la septicemia, el síndrome de la respuesta inflamatoria generalizada, el choque hemorrágico, la anemia hemolítica, el púrpura trombocitopénico trombótico autoinmunitario y el síndrome urémico hemolítico.
49. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a una enfermedad urogenital, el método comprende la administración de una cierta cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
50. El método según la reivindicación 49, donde la enfermedad urogenital se selecciona del grupo formado por la enfermedad de la vejiga dolorosa, la enfermedad de la vejiga sensible, la cistitis abacteriana crónica, la cistitis intersticial, la infertilidad, la disfunción placentería, el aborto espontáneo y la preeclampsia .
51. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad mediada por el complemento dependiente de la MASP-2 asociada a la diabetes no por obesidad (diabetes tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente) y/o a las complicaciones asociadas a la diabetes de tipo 1 o de tipo 2 (de inicio en la etapa adulta) , el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
52. El método según la reivindicación 51, donde la complicación asociada a la diabetes de tipo 1 o de tipo 2 se selecciona del grupo formado por angiopatía, neuropatía y retinopatía.
53. Un método para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, se está sometiendo o se someterá a un tratamiento quimioterapéutico y/o de terapia con radiaciones, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
54. Un método para tratar a un sujeto que padece una neoplasia maligna, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
55. Un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno del sistema endocrino, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
56. El método según la reivindicación 55, donde el trastorno del sistema endocrino se selecciona del grupo formado por tiroiditis de Hashimoto, tensión o estrés, ansiedad, trastornos hormonales que incluyen la liberación regulada de prolactina, del factor de crecimiento o de crecimiento tipo insulina y de la adrenocorticotropina de la pituitaria.
57. Un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad oftalmológica mediada por el complemento, el método comprende la administración de una cantidad de un agente inhibidor de la MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de la MASP-2.
58. El método según la reivindicación 57, donde la enfermedad oftalmológica es la degeneración macular relacionada con la edad.