MX2007008719A

MX2007008719A - Anticuerpos anti-interferon gamma y metodos de uso de los mismos.

Info

Publication number: MX2007008719A
Application number: MX2007008719A
Authority: MX
Inventors: Olivier Leger; Nicolas Fischer; Walter Ferlin; Elson Greg
Original assignee: Novimmune Sa
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2007-09-11
Also published as: CN101151277B; PT1848744E; WO2006109191A3; UA92337C2; KR101380570B1; NO20073882L; PL1848744T3; KR20070102566A; ATE541859T1; JP5173437B2; EP1848744B1; NO340445B1; BRPI0607238B8; US9682142B2; IL184749A0; US20100158922A1; AU2006233353B2; AU2006233353A1; CA2595276A1; US20170291943A1

Abstract

La invencion se relaciona con anticuerpos completamente humanos y fragmentos de los mismos, que se unen al interferon gamma humano (hIFn(), modulando por lo tanto la interaccion entre el IFN( y su receptor, IFN(-R, y/o modulando las actividades biologicas del IFN(. La invencion se relaciona tambien con el uso de tales anticuerpos anti- IFN( en la prevencion o tratamiento de trastornos relacionados con la inmunidad y en el alivio de un sintoma asociado con un trastorno relacionado con la inmunidad.

Description

ANTICUERPOS ANTI-INTERFERON GAMMA Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona generalmente con anticuerpos anti-interferón gamma completamente humanos, así como métodos para utilizar los mismos.

ANTECEDENTES DE LA. INVENCIÓN El interferón gamma humano (IFN?, IFN-gamma) es una linfocina producida por los linfocitos T activados y los linfocitos citolíticos naturales. Manifiesta actividades antiproliferativas, antivirales e inmunomoduladoras y se une al IFN?-R, un receptor heterodimérico en la mayoría de las células primarias del sistema inmune, y desencadena una cascada de eventos que conducen a la inflamación. La actividad antiviral e inmunomoduladora del IFN? se conoce por tener efectos benéficos en varias condiciones clínicas. Sin embargo, hay muchos escenarios clínicos en los cuales la actividad del IFN? se conoce por tener efectos dañinos. Por ejemplo, las enfermedades autoinmunes están asociadas con altos niveles de IFN? en la sangre y el tejido enfermo de los pacientes autoinmunes. La actividad del IFN? también se ha relacionado con estados de enfermedad tales como caquexia y choque séptico. En consecuencia, existe la necesidad de terapias que tengan como objetivo la actividad del IFN?.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos, dirigidos especialmente contra el interferón gamma (IFN?, también referido en la presente como IFN-gamma) . Los anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen NI-0501; AC1.2R3P2_A6 (también referido en la presente como "A6") ; AC1.2R3P2_B4 (también referido en la presente como "B4"); AD1.4R4P1_B9 (también referido en la presente como "B9"); AD1.4R4P2_C9 (también referido en la presente como "C9"); AC1.4R4P2_C10 (también referido en la presente como "CIO"); AC1.2R3P7 D3 (también referido en la presente como "D3' AD1.2R2P2 D6 (también referido en la presente como "D6"); AC1.2R2P2 D8 (también referido en la presente como "D8") ; AD1.3R3P6_E1 también referido en la presente como "El"); AD1.3R3P5_F8 también referido en la presente como "F8"); AD1.3R3P6_F9 también referido en la presente como "F9"); AD1.4R4P2_G7 también referido en la presente como "G7"); AD1.1R3P3 G9 también referido en la presente como "G9") y AD1.3R3P6_G10 (también referido en la presente como "G10") descritos en la presente. De manera alterna, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une al mismo epitopo que NI-0501; AC1.2R3P2_B4 AD1.4R4P1_B9 AD1.4R4P2_C9; AC1.4R4P2_C10; AC1.2R3P7_D3 AD1.2R2P2_D6 AC1.2R2P2_D8; AD1.3R3P6_E1; AD1.3R3P5_F8 AD1.3R3P6 F9 AD1.4R4P2_G7; AD1.1R3P3_G9 o AD1.3R3P6_G10. Los anticuerpos son referidos en la presente respectivamente como anticuerpos huIFN?. Un anticuerpo huIFN? contiene una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 ó 103 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 ó 105. De manera preferida, las tres regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cadena pesada, incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) ; DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO: 13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29); SNAMS (SEQ ID NO: 43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO:76) y DFWVITSGNDY (SEQ ID NO : 89 ) y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:8); EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18) DDDQRPS (SEQ ID NO:25); QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26) TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO:32); DDKKRPS (SEQ ID NO:33) QSYDSNNLVV(SEQ ID NO:34); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39) QSYDNSNHWV (SEQ ID NO:40); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO : 48 ) QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO:49); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:55) QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61) TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO:73) QSYEGF (SEQ ID NO:79); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84) EDTQRPS (SEQ ID NO:85); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86) QSFDSTNLVV (SEQ ID NO:92); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97) QSYSYNNQVV (SEQ ID NO:98); TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106) EDNRRPS (SEQ ID NO: 107) . El anticuerpo se une al IFN?. Los anticuerpos huIFN? de la invención incluyen una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) o SNAMS (SEQ ID NO:43); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) o TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44), y una región CDR3 VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5); DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO:13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO:45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO:76) y DFWVITSGNDY (SEQ ID NO:89) . Los anticuerpos huIFN? incluyen una región CDRl VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:8); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO.32); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO:48); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO.97) y TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); una región CDR2 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); DDDQRPS (SEQ ID NO:25); DDKKRPS (SEQ ID NO:33); EDTQRPS (SEQ ID NO:85) y EDNRRPS (SEQ ID NO: 107) y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18); QSYDSSNVV (SEQ ID NO: 26; QSYDSNNLVV (SEQ ID NO:34); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO:40; QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO:49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56; QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO:73I QSYEGF (SEQ ID NO: 79); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO:92) y QSYSYNNQVV (SEQ ID NO:98). Los anticuerpos huIFN? incluyen, por ejemplo, una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID N0:3) o SNAMS (SEQ ID NO:43); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) o TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44); una región CDR3 VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) ; DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID N0:13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO:45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 76) y DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89); una región CDRl VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8) TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO:32) TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO:48) TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72) TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97) y TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); una región CDR2 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); EDNQRPS (SEQ ID NO.17); DDDQRPS (SEQ ID NO:25); DDKKRPS (SEQ ID NO:33); EDTQRPS (SEQ ID NO:85) y EDNRRPS (SEQ ID NO: 107) y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18); QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26); QSYDSNNLVV (SEQ ID NO:34); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO : 40 ) ; QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO: 49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO: 73); QSYEGF (SEQ ID NO : 79 ) ; QSSDSNRVL (SEQ ID NO:86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO:92) y QSYSYNNQVV (SEQ ID NO:98). La cadena pesada de un anticuerpo huIFN? se deriva de un gen de una línea germinal V (variable) , tal como por ejemplo, el gen de la línea germinal DP47 (IGHV3-23) (No. de Acceso de GenBank M99660) o una secuencia de ácidos nucleicos homologa a la secuencia del gen de la línea germinal DP47 humana. La secuencia de ácidos nucleicos para el gen de la línea germinal DP47 (IGHV3-23) incluye, por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos mostrada a continuación: GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA (SEQ ID NO:99) La cadena ligera de un anticuerpo huIFN? se deriva de un gen de la línea germinal de la región variable de cadena ligera lambda de Ig, tal como por ejemplo, IGLV6-57 o Vl-22 (No. de Acceso de GenBank Z73673) o una secuencia de ácidos nucleicos homologa a la secuencia del gen de la línea germinal IGLV6-57 humana. La secuencia de ácidos nucleicos para el gen de la línea germinal IGLV6-57 incluye, por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos mostrada a continuación. AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATC TCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGC CCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCT GATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGA CTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCAATCA (SEQ ID NO:108) En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de un trastorno relacionado con la inmunidad, administrando un anticuerpo huIFN? a un sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos huIFN? se utilizan para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado con los trastornos relacionados con la inmunidad, tales como Enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, soriasis, sarcoidosis, artritis reumatoide, vasculitis, dermatitis atópica y esclerosis múltiple secundaria progresiva. Opcionalmente, al sujeto se le administra además un segundo agente tal como, de manera no exclusiva, un reactivo anticitocina o antiquimiocina que reconoce las citocinas, tal como interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31 y/o quimiocinas tales como MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCPl, IP-10, ITAC, MIG, SDF y fractalcina. El sujeto sufre de, o está predispuesto a desarrollar un trastorno relacionado con la inmunidad, tal como por ejemplo, una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable de los anticuerpos huIFN? NI-0501 y AC1.2R3P2_A6. La Figura ÍA describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada de NI-0501, y la Figura IB representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura ÍA. Las regiones que determinan la complementariedad (CDR) están subrayadas en la Figura IB. La Figura 1C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera de NI-0501, y la Figura ID representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1C. Las CDR están subrayadas en la Figura ID. La Figura 1E describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada de AC1.2R3P2_A6, y la Figura 1F representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1E . Las CDR están subrayadas en la Figura 1F. La Figura 1G describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera de AC1.2R3P2_A6, y la Figura ÍH representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1G. Las CDR están subrayadas en la Figura ÍH. La Figura 2 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AC1.2R3P2_B4. La Figura 2A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 2B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 2A. Las CDR están subrayadas en la Figura 2B. La Figura 2C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 2D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 2C. Las CDR están subrayadas en la Figura 2D. La Figura 3 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.4R4P1_B9. La Figura 3A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 3B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 3A. Las CDR están subrayadas en la Figura 3B. La Figura 3C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 3D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 3C. Las CDR están subrayadas en la Figura 3D. La Figura 4 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.4R4P2_C9. La Figura 4A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 4B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 4A. Las CDR están subrayadas en la Figura 4B. La Figura 4C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 4D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 4C. Las CDR están subrayadas en la Figura 4D. La Figura 5 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AC1.4R4P2_C10. La Figura 5A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 5B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 5A. Las CDR están subrayadas en la Figura 5B. La Figura 5C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 5D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 5C. Las CDR están subrayadas en la Figura 5D. La Figura 6 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AC1.2R3P7_D3. La Figura 6A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 6B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 6A. Las CDR están subrayadas en la Figura 6B. La Figura 6C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 6D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 6C . Las CDR están subrayadas en la Figura 6D. La Figura 7 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.2R2P2_D6. La Figura 7A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 7B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 7A. Las CDR están subrayadas en la Figura 7B. La Figura 7C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera-,, y la Figura 7D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 7C. Las CDR están subrayadas en la Figura 7D. La Figura 8 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AC1.2R2P2_D8. La Figura 8A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 8B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 8A. Las CDR están subrayadas en la Figura 8B.- La Figura 8C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 8D representa la, secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 8C. Las CDR están subrayadas en la Figura 8D. La Figura 9 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.3R3P6_E1. La Figura 9A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 9B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 9A. Las CDR están subrayadas en la Figura 9B . La Figura 9C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 9D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 9C. Las CDR están subrayadas en la Figura 9D. La Figura 10 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.3R3P5_F8. La Figura 10A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 10B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 10A. Las CDR están subrayadas en la Figura 10B. La Figura 10C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 10D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 10C. Las CDR están subrayadas en la Figura 10D.

La Figura 11 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.3R3P6_F9. La Figura HA describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 11B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura HA. Las CDR están subrayadas en la Figura 11B. La Figura 11C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 11D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 11C. Las CDR están subrayadas en la Figura 11D. La Figura 12 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.4R4P2_G7. La Figura 12A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 12B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 12A. Las CDR están subrayadas en la Figura 12B. La Figura 12C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 12D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 12C. Las CDR están subrayadas en la Figura 12D. La Figura 13 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.1R3P3_G9. La Figura 13A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 13B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 13A. Las CDR están subrayadas en la Figura 13B. La Figura 13C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 13D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 13C. Las CDR están subrayadas en la Figura 13D. La Figura 14 es una serie de representaciones de la secuencia nucleotídica y las secuencias de aminoácidos para las regiones ligera variable y pesada variable del anticuerpo huIFN? AD1.3R3P6_G10. La Figura 14A describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, y la Figura 14B representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 14A. Las CDR están subrayadas en la Figura 14B. La Figura 14C describe la secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera, y la Figura 14D representa la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 14C. Las CDR están subrayadas en la Figura 14D. La Figura 15 es una gráfica que describe la inhibición de la expresión del gen reportero inducida por IFN? utilizando extractos scFv periplásmicos . Los extractos scFv cuantificados inhibieron el gen reportero inducido por IFN? de una manera dependiente de la dosis. Para cada clona scFv, se probaron varias concentraciones (2.7, 0.68, 0.17, 0.043 y 0.011 nM) , como se muestra por las columnas encima del nombre de cada clona (concentración descendente de la izquierda a la derecha, véase también la Tabla 3 siguiente) . La Figura 16, Paneles 1-12 son una serie de gráficas que describen la inhibición de la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células de melanoma, utilizando extractos scFv. Los scFv completamente humanos purificados, inhibieron la expresión de MHC II inducida por IFN? en las células de melanoma. Se describen las clonas scFv ( ) y el mAb 16C3 de IFN? antihumano de ratón ( ) . La Figura 17, Paneles 1-7 son una serie de gráficas que describen la inhibición de la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células de melanoma, utilizando extractos de scFv que se reformatearon en una cadena principal de IgG completamente humana. Los mAb de IgG completamente purificados inhibieron la expresión de MHC II inducida por IFN? en las células de melanoma. Se describen las clonas de IgG completas (-x-), el mAb 16C3 de IFN? antihumano de ratón (-A-), y el MAB285 de IFN? antihumano de ratón de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) (-•-) • La Figura 18 es una gráfica que describe la afinidad del anticuerpo huIFN? NI-0501 para el IFN? humano. La Figura 19 es una gráfica que compara la actividad de los anticuerpos producidos por las clonas A6 y NI-0501 (también referidas en la presente como "A6 retromutada a la línea germinal" o "A6 retromutada") . La Figura 20 es una gráfica que describe la actividad del anticuerpo huIFN? NI-0501 en el IFN? humano nativo . Las Figuras 21A-21F son una serie de gráficas que describen la unión del anticuerpo huIFN? NI-0501 con el IFN? recombinante de varias especies. La Figura 22 es una gráfica que describe la capacidad del anticuerpo huIFN? NI-0501 para neutralizar la sobrerregulación de MHC clase II inducida por el IFN? de macaco de Java nativo.

La Figura 23 es una gráfica que describe la capacidad del anticuerpo huIFN? NI-0501 para bloquear la producción de IP-10 inducida por IFN? en la sangre completa .

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos contra el interferón gamma (IFN?) . Los anticuerpos son referidos de manera colectiva en la presente como anticuerpos huIFN?. Los anticuerpos huIFN? son, por ejemplo, antagonistas o inhibidores del IFN? que modulan al menos una actividad biológica del IFN?. Las actividades biológicas del IFN? incluyen, por ejemplo, unir el receptor del IFN? (IFN?-R), modular, por ejemplo, reducir o inhibir, expresión del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) clase II en la superficie de la célula, y modular, por ejemplo, reducir o inhibir, la proliferación celular. Por ejemplo, los anticuerpos huIFN? inhiben completa o parcialmente la actividad del IFN? al bloquear parcial o completamente la unión del IFN? y el receptor del IFN? (IFN?-R) . Se considera que los anticuerpos IFN? inhiben completamente la actividad del IFN? cuando el nivel de actividad del IFN? en la presencia del anticuerpo huIFN? disminuye por al menos 95%, por ejemplo, por 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%, en comparación con el nivel de la actividad del IFN? en la ausencia de la unión con el anticuerpo huIFN? descrito en la presente. Se considera que los anticuerpos IFN? inhiben parcialmente la actividad del IFN? cuando el nivel de actividad del IFN? en la presencia del anticuerpo huIFN? disminuye por menos que el 95%, por ejemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ó 90%, en comparación con el nivel de la actividad del IFN?, en la ausencia de la unión con el anticuerpo huIFN? descrito en la presente. Además, los anticuerpos huIFN? de la invención inhiben la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células (véase, por ejemplo, los Ejemplos 4 y 5) . De manera preferida, los anticuerpos huIFN? exhiben una inhibición mayor que el 50% de la expresión de MCH clase II inducida por IFN? en la línea celular de melanoma humano Me67.8 a una concentración de al menos 0.02 nM . Por ejemplo, los anticuerpos exhiben más que el 50% de inhibición de la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en la línea celular Me67.8, a una concentración en el intervalo de 0.022 nM a 0.044 nM, por ejemplo, a una concentración de 0.022 nM, 0.028 nM o 0.044 nM . Los anticuerpos huIFN? modulan una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo, en un sujeto humano. De manera preferida, los anticuerpos huIFN? modulan una respuesta inmune adaptativa en un sujeto. De manera más preferida, los anticuerpos huIFN? modulan la respuesta inmune celular o mediada por células, también conocida como respuesta del tipo Thl o mediada por Thl. Por ejemplo, los anticuerpos huIFN? descritos en la presente modulan, por ejemplo, reducen, inhiben o evitan una respuesta inmune mediada por Thl exagerada, tal como una respuesta inmune mediada por Thl exagerada asociada con un trastorno autoinmune o inflamatorio, tal como por ejemplo, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, soriasis, sarcoidosis, artritis reumatoide, vasculitis, dermatitis atópica y esclerosis múltiple secundaria progresiva. Como se utiliza en la presente, el término respuesta inmune mediada por Thl "exagerada" se refiere a la presencia de un nivel elevado de las citocinas de Thl, tales como IL-2, IL-3, TNF-alfa (TNFa) e IFN?, en un sujeto, en comparación con el nivel de la producción de la citocina de Thl en un sujeto que no sufre de una enfermedad o trastorno asociado con una respuesta inmune Thl exagerada. Para clasificar una respuesta inmune mediada por Thl como una respuesta exagerada, el nivel de una respuesta de producción de la citocina de Thl se evalúa, por ejemplo, midiendo y analizando el nivel de citocinas secretadas utilizando un ensayo ELISA u otro ensayo. Los anticuerpos huIFN? descritos en la presente modulan, por ejemplo, inhiben, reducen o evitan, el cambio de clase a un isotipo de IgG, tal como un cambio de clase inducido por el IFN?. Estos anticuerpos huIFN? modulan, por ejemplo, inhiben, previenen o reducen una respuesta mediada por Thl y en consecuencia disminuyen el cambio inducido por el IFN?. Los anticuerpos huIFN? de la invención se produjeron inmunizando un animal con el IFN?, tal como, por ejemplo, IFN? murino o humano (véase, por ejemplo, No. de Acceso de Genbank X13274) o un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. De manera alterna, el animal se inmuniza con células transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el IFN?, de manera que el IFN? se expresa y asocia con la superficie de las células transfectadas. De manera alterna, los anticuerpos se obtienen seleccionando una biblioteca que contiene las secuencias del dominio de unión al anticuerpo o al antígeno para unirse al IFN?. Esta biblioteca se prepara, por ejemplo, en un bacteriófago como fusiones de proteína o péptido a una proteína recubierta con el bacteriófago que se expresa en la superficie de las partículas montadas del fago y las secuencias de ADN codificante contenidas dentro de las partículas del fago (es decir, "biblioteca mostrada en el fago") . Los anticuerpos huIFN? de la invención incluyen, por ejemplo, las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de cadena pesada mostradas a continuación en la Tabla 1, las CDR de cadena ligera mostradas en la Tabla 2, y combinaciones de las mismas.

Tabla 1. Secuencias VH de las clonas del anticuerpo que se unen y neutralizan al IFN? Tabla 2. Secuencias VL de las clonas del anticuerpo que se unen y neutralizan al IFN? Un anticuerpo monoclonal huIFN? ejemplar es el anticuerpo NI-0501 descrito en la presente. El anticuerpo NI-0501 es una versión retromutada del anticuerpo AC1.2R3P2_A6. Como se utiliza en la presente, el término "retromutado" se refiere a mutar un residuo nucleotídico o de aminoácido nuevamente al nucleótido o residuo encontrado en la ubicación correspondiente en la secuencia de la línea germinal. El anticuerpo NI-0501 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID N0:2) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO : 1 , y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO : 7 ) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 6 (Figuras 1A-1D) . Los aminoácidos que abarcan las regiones que determinan la complementariedad (CDR) como se define por Chothia et al. y E.A. Kabat et al., están subrayadas en las Figuras IB y ID. (Véase Chothia, C, et al, Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al, Sequences of Protein of immunological interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (US Departmen t of Heal th ' and Human Services) , Oficina de Impresión del Gobierno ' de los Estados Unidos (1991)). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo A6 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) y DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo A6 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:8); EDNQRPS (SEQ ID NO : 9 ) y QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10). Otro anticuerpo monoclonal huIFN? ejemplar es el anticuerpo AC1.2R3. P2_A6 ("A6") descrito en la presente. El anticuerpo A6 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 103) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la' SEQ ID NO: 102 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 105) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 104 (Figuras 1E-1H) . Los aminoácidos que abarcan las regiones que determinan la complementariedad (CDR) como se define por Chothia et al. y E.A. Kabat et al. están subrayadas en las Figuras 1F y ÍH. (Véase Chothia, C, et al, Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al, Sequences of Protein of immunological interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (US Department of Heal th and Human Services) , Oficina de Impresión del Gobierno de los Estados Unidos (1991)). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo A6 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) y DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo A6 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); EDNRRPS (SEQ ID NO: 107) y QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10). El anticuerpo AC1.2R3P2_B4 (también referido en la presente como "B4") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 12) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 11, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 15) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 14 (Figuras 2A-2D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 2B y 2D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo B4 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) y DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO: 13). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo B4 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16); EDNQRPS (SEQ ID NO:17) y QSNDSDNVV (SEQ ID NO:18). El anticuerpo AD1.4R4P1_B9 (también referido en la presente como "B9") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 20) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 19, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:23) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 22 (Figuras 3A-3D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 3B y 3D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo B9 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) y DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo B9 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO : 8 ) ; DDDQRPS (SEQ ID NO:25) y QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26). El anticuerpo AD1.4R4P2 C9 (también referido en la presente como "C9") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:28) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO:27, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 31) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 30 (Figuras 4A-4D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 4B y 4D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo C9 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) y DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo C9 tienen las siguientes secuencias: TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID' NO:32); DDKKRPS (SEQ ID NO:33) y QSYDSNNLVV (SEQ ID NO:34). El anticuerpo AC1.4R4P2_C10 (también referido en la presente como "CIO") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 36) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 35, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:38) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 37 (Figuras 5A-5D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 5B y 5D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo CIO tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo CIO tienen las siguientes secuencias: TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYDNSNHWV (SEQ ID NO.40). El anticuerpo AC1.2R3P7_D3 (también referido en la presente como "D3") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 42) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 41, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 47) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 46 (Figuras 6A-6D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 6B y 6D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo D3 tienen las siguientes secuencias: SNAMS (SEQ ID NO:43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO : 44 ) y GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo D3 tienen las siguientes secuencias: TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO:48); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO:49). El anticuerpo AD1.2R2P2_D6 (también referido en la presente como "D6") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 51) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 50, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 54) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 53 (Figuras 7A-7D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 7B y 7D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo D6 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) y DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo D6 tienen las siguientes secuencias : TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 55); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO:56) . El anticuerpo AC1.2R2P2_D8 (también referido en la presente como "D8") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 58) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO:57, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 60) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 59 (Figuras 8A-8D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 8B y 8D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo D8 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo D8 tienen las siguientes secuencias : TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO:8); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYDSNNFWV (SEQ ID NO:61). El anticuerpo AD1.3R3P6 El (también referido en la presente como "El") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 63) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 62, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 66) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 65 (Figuras 9A-9D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 9B y 9D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo El tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO:64). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo El tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO : 8 ) ; DDDQRPS (SEQ ID NO:25) y QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26). El anticuerpo AD1.3R3P5_F8 (también referido en la presente como "F8") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 68) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 67, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 71) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 70 (Figuras 10A-10D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 10B y 10D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo F8 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0:4) y VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO:69). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo F8 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72); EDNRRPS (SEQ ID NO: 9) y QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO:73). El anticuerpo AD1.3R3P6_F9 (también referido en la presente como "F9") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 75) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO:74, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:78) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 77 (Figuras 11A-11D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 11B y 11D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo F9 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) y GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO:76). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo F9 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYEGF (SEQ ID NO:79). El anticuerpo AD1.4R4P2_G7 (también referido en la presente como "G7") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 81) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 80, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 83) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 82 (Figuras 12A-12D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al, 1991 están subrayados en las Figuras 12B y 12D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo G7 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO : 3 ) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo G7 tienen las siguientes secuencias: TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84); EDTQRPS (SEQ ID NO:85) y QSSDSNRVL (SEQ ID NO:86). El anticuerpo AD1.1R3P3_G9 (también referido en la presente como "G9") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 88) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 87, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 91) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 90 (Figuras 13A-13D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 13B y 13D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo G9 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y DFWVITSGNDY (SEQ ID NO : 89 ) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo G9 tienen las siguientes secuencias: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNRRPS (SEQ ID NO: 9) y QSFDSTNLVV (SEQ ID NO:92). El anticuerpo ADl .3R3P6_G10 (también referido en la presente como "G10") incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 94) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 93, y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 96) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 95 (Figuras 14A-14D) . Los aminoácidos que abarcan las CDR como se define por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 están subrayados en las Figuras 14B y 14D. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo G10 tienen las siguientes secuencias: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) y DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo G10 tienen las siguientes secuencias: AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) y QSYSYNNQVV (SEQ ID NO:98). Los anticuerpos huIFN? de la invención también incluyen los anticuerpos que incluyen una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que es al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 ó 103 (Figuras 1-14) y/o un aminoácido variable de cadena ligera que es al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o más idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 ó 105 (Figuras 1-14) . De manera alterna, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une al mismo epitopo que NI-0501, A6, B4, B9, C9, CIO, D3, D6, D8 , El, F8 , F9, G7, G9 o G10. A menos, que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención tendrán el significado que se entiende comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos en singular deben incluir las pluralidades y los términos en plural deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas con relación a, y las técnicas del cultivo celular y de tejidos, biología molecular y química e hibridación de proteína y oligo o polinucleótidos descritas en la presente, son aquéllas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para el ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la técnica o como se describió en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de la presente especificación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas con relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, son aquéllas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéutico y el tratamiento de pacientes . Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, debe entenderse que tienen los significados siguientes: Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig) , es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno, que se une de manera específica (inmunorreacciona con) un antígeno. Tales anticuerpos incluyen, de manera no exclusiva, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, Fah, Fab- y F(ab')2 y una biblioteca de expresión de Fab. Por "se une de manera específica" o "inmunorreacciona con", se quiere decir que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona (es decir, se une) con otros polipéptidos o se une a una afinidad mucho menor (Kd>10~6) con otros polipéptidos . La unidad estructural del anticuerpo básico se conoce por comprender un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente para el reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente para la función del efector. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase generalmente, Fundamental Immunology C. 7 (Paul, W., ea., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada, forman el sitio de unión del anticuerpo . El término "anticuerpo monoclonal" (MAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie molecular de una molécula de anticuerpo que consiste de un solo producto génico de cadena ligera y un solo producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones que determinan la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal, son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión al anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un epitopo particular del antígeno, caracterizado por una afinidad de unión única por el mismo. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos, se relacionan con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren unas de otras por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases tienen subclases también, tales como IgGl, IgG2, y otras. Además, en los humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. El término "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión", se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno se forma por residuos de aminoácidos de las regiones variables N terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L") . Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, referidas como "regiones hipervariables", se interponen entre los tramos flanqueantes más conservados, conocidos como "regiones del marco" o "FR". Así, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a las regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se colocan unas con relación a las otras en un espacio tridimensional para formar una superficie que se une al antígeno. La superficie que se une al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se refieren como "regiones que determinan la complementariedad" o "CDR". La asignación de los aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md . (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol.

Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989) . Como se utiliza en la presente, el término "epitopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina, como scFv, o un receptor del linfocito T. El término "epitopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina o receptor del linfocito T. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupaciones de moléculas con superficie químicamente activa tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 µM; de manera preferida < 100 nM y de manera más preferida < 10 nM . Como se utilizan en la presente, los términos "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica", se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que ocurre entre la molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una afinidad mayor. Las propiedades de unión inmunológicas de los polipéptidos seleccionados se cuantifican utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Un método tal abarca medir las velocidades de formación y disociación del complejo del sitio de unión del antígeno/antígeno, en donde esas velocidades dependen de las concentraciones de los compañeros del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influencian igualmente la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de velocidad activada" (Kon) y la "constante de velocidad desactivada" (K0ff) , pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Véase, Nature 361:186-87 (1993)). La relación de K0ff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Véase, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente invención se une de manera específica al epitopo IFN? cuando la constante de unión en el equilibrio (Kd) es < 1 µM, de manera preferida < 100 nM, de manera más preferida < 10 nM, y de manera más preferida < 100 pM a aproximadamente 1 pM, como se mide por ensayos tales como ensayos de unión al radioligando o ensayos similares conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.

Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal humano tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal humano de la invención (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal NI-0501, A6, B4, B9, C9, CIO, D3, D6, D8, El, F8 , F9, G7 o G10), determinando si el primero evita que el último se una a un polipéptido del antígeno IFN?. Si el anticuerpo monoclonal humano que se prueba compite con un anticuerpo monoclonal humano de la invención, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal humano de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo, o a un epitopo estrechamente relacionado. Otra manera de determinar si un anticuerpo monoclonal humano tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal humano de la invención, es preincubar el anticuerpo monoclonal humano de la invención con el polipéptido del antígeno IFN? con el cual es reactivo normalmente, y a continuación agregar el anticuerpo monoclonal humano siendo probado para determinar si el anticuerpo monoclonal humano que está siendo probado se inhibe en su capacidad para unirse al polipéptido del antígeno IFN?. Si el anticuerpo monoclonal humano siendo probado se inhibe entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica o una funcionalmente equivalente que el anticuerpo monoclonal de la invención. Se utilizan varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína, tal como la proteína IFN?, o contra derivados, fragmentos, homólogos u ortólogos análogos de los mismos. (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lañe D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, incorporada en la presente como referencia) . Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en los cuales la secuencia entera de la cadena ligera y la cadena pesada, incluyendo las CDR, surgen de genes humanos . Tales anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos" o "anticuerpos completamente humanos", en la presente. Los anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos a continuación en los Ejemplos. Los anticuerpos monoclonales humanos también pueden prepararse utilizando una técnica de trioma; la técnica de hibridoma del linfocito B humano (véase, Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72); y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase, Colé, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp . 77-96) . Los anticuerpos monoclonales humanos pueden utilizarse y pueden producirse utilizando hibridomas humanos (véase, Cote, et al., 1983. Proc Nati Acad Sci USA 80:2026-2030), o transformando linfocitos B humanos con el virus de Epstein Barr in vitro (véase, Colé, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBOD±ES AND CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96) . Los anticuerpos se purifican por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía por afinidad utilizando la proteína A o la proteína G, que proporcionan principalmente la fracción de IgG del suero inmune. Posteriormente, o de manera alterna, el antígeno especifico que es el objetivo de la inmunoglobulina buscada, o un epitopo de la misma, puede inmovilizarse en una columna para purificar el anticuerpo específico inmune mediante cromatografía por inmunoafinidad. La purificación de las inmunoglobulinas se discute, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Filadelfia PA, Vol. 14, No. 8 (Abril 17, del 2000), pp . 25-28) . Es deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades inmunorrelacionadas . Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fe, permitiendo por lo tanto la formación de un enlace de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado, puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular incrementada mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . (Véase, Carón et al., 'J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)). De manera alterna, un anticuerpo puede diseñarse de manera que tenga regiones Fe dobles, y pueda por lo tanto tener una lisis del complemento y capacidades ADCC mejoradas. (Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) ) . La invención también incluye fragmentos huIFN? Fv, Fab Fab' y F(ab')2/ anticuerpos huIFN? de una sola cadena, anticuerpos huIFN? biespecíficos y anticuerpos huIFN? heteroconjugados . Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para IFN?. El segundo objetivo de unión es cualquier otro antígeno, y de manera ventajosa, es una proteína de la superficie celular o un receptor o subunidad del receptor. Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas), producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra usualmente mediante pasos de cromatografía por afinidad. Los procedimientos similares se discuten en la WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan el anticuerpo-antígeno) , pueden fusionarse a secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión de manera preferida es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la articulación, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedero adecuado. Para los detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo, puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplaza con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo, reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero con respecto a los productos finales no deseados, tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos, se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando un enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante de ditiol de arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte a continuación al Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas. Además, los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), describen la producción de una molécula de F(ab')2 de un anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó de manera separada de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor I ErbB2 y a los linfocitos T humanos normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos del tumor de mama humano . También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Im unol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y a continuación se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros del anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alterno para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazante, que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento corto son forzados a aparearse con los dominios VL y VH de otro fragmento, formando por lo tanto dos sitios de unión del antígeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de una sola cadena (sFv), también se ha reportado. Véase, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991). Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno de la proteína de la invención. De manera alterna, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina puede combinarse con un brazo que se une a una 'molécula activante en un leucocito, tal como una molécula del receptor del linfocito T (por ejemplo, CD2, huIFN?, CD28 o B7 ) , o receptores Fe para IgG (Fc?R), tales como Fc?RI (CD64), Fc?RII (huIFN?2) y Fc?RIII (CD 16) , para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para dirigir los agentes citotóxicos a las células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo que se une al antígeno y un brazo que se une al agente citotóxico o un quelante de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno de la proteína descrito en la presente y se une además al factor del tejido (TF) . Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para seleccionar las células del sistema inmune para las células indeseadas (Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089) . Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo aquéllas que involucran agentes reticulantes . Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito, incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquéllos descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980. La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, de plantas o animales o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden utilizarse, incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131ln, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes bifuncionales que se acoplan a la proteína, tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina), diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor bis activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14, es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. (Véase la WO94/11026) . Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que una gran variedad de posibles porciones puede acoplarse a los anticuerpos resultantes o a otras moléculas de la invención. (Véase, por ejemplo, "Conjúgate Vaccines", Contributions to Microbiology and Im unology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), el contenido total de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . El acoplamiento se logra mediante cualquier reacción química que unirá las dos moléculas, siempre que el anticuerpo y la otra porción retengan sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complej ación . La unión preferida es, sin embargo, la unión covalente. La unión covalente se logra ya sea mediante condensación directa de cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas de puente externas. Muchos agentes enlazantes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteína, tales como los anticuerpos de la presente invención a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, esteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilen diaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las varias clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que en su lugar, es ejemplar de los agentes de acoplamiento más comunes.

(Véase, Killen y Liridstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Los enlazantes preferidos se describen en la literatura. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cáncer Res. 44:201-208 (1984), que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) . Véase también la Patente de los Estados Unidos No. 5,030,719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazante de oligopéptido. Los enlazantes particularmente preferidos incluyen: (i) EDC clorhidrato de (l-etil-3- (3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT ( -succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio) -tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3- (2-piridilditio) propionamido] hexanoato (Pierce Chem. Co . , Cat #21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP ( 6 [3- (2-piridilditio) -propianamida] hexanoato de sulfosuccinimidilo (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co . , Cat. #24510), conjugado a EDC. Los enlazantes descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo así a conjugados con propiedades fisicoquímicas diferentes. Por ejemplo, los esteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los esteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazantes que contienen un éster de NHS son menos solubles que los esteres de sulfo-NHS. Además, el enlazante SMPT contiene un enlace disulfuro impedido esféricamente, y puede formar conjugados con estabilidad incrementada. Los enlaces de disulfuro son en general, menos estables que otros enlaces debido a que los enlaces de disulfuro se escinden in vitro, resultando en menos conjugado disponible. El sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida . Los acoplamientos de carbodiimida (tales como EDC) cuando se utilizan en conjunto con sulfo-NHS, forman esteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de la carbodiimida sola. El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en la presente, significará un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con otro o una porción del polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado de manera operable a un polinucleótido, que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "proteína aislada" referida en la presente, significa una proteína de ADNc, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) se expresa por una célula de diferentes especies, o (4) no aparece en la naturaleza. El término "polipéptido" se utiliza en la presente como un término genérico para referirse a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de la proteína nativa y los análogos son especies del género de polipéptido. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana representadas por las Figuras IB, 2B, 3B y 4B, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera humana representadas por las Figuras ID, 2D, 3D y 4D, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. El término "natural", como se utiliza en la presente, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus), que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra manera es natural . El término "enlazado de manera operable" como se utiliza en la presente, se refiere a posiciones de componentes descritos que están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "enlazada de manera operable" a una secuencia codificante, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedero en los procariotes, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción en los eucariotes, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y una secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, a todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y pueden también incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias del compañero de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente, significa un boro polimérico de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de una sola hebra y de doble hebra de ADN. El término oligonucleótido referido en la presente, incluye nucleótidos naturales y modificados, enlazados juntos por enlaces oligonucleotídicos naturales o no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. De manera preferida, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud, y de manera más preferida de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de una sola hebra, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble hebra, por ejemplo, para utilizarse en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención son oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos naturales" referido en la presente, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente, incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y lo similar. El término "enlaces oligonucleotídicos" referido en la presente, incluye enlaces oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforonmidato y lo similar. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cáncer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp . 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente de los Estados Unidos No. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección, si se desea. El término "hibridar de manera selectiva" referido en la presente, significa unir de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, o igonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención, se hibridan selectivamente a las hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y de lavado, que reducen al mínimo las cantidades apreciables de unión detectable a los ácidos nucleicos no específicos. Pueden utilizarse condiciones de alto rigor para lograr las condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y se discute en la presente. Generalmente, la homología de la secuencia de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y la secuencia de ácidos nucleicos de interés será de al menos 80%, y más típicamente con homologías que se incrementan de manera preferida de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homologas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para una correspondencia máxima. Los huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se hacen corresponder) , se permiten en la maximización de la correspondencia, las longitudes de hueco de 5 o menos se prefieren, con 2 o menos siendo más preferidas. De manera alterna y preferida, dos secuencias de proteína (o secuencias polipeptídicas derivadas de las mismas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homologas, como se utiliza este término en la presente, si tienen una calificación de alineación de cuando mucho 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de los datos de mutación y una penalización del hueco de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp . 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 de este volumen, pp . 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son, de manera más preferida homologas si sus aminoácidos son mayores o iguales que 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la presente para significar que una secuencia polinucleotídica es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada de manera evolutiva) a toda o una porción de la secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. En distinción por contraste, el término "complementario a", se utiliza en la presente para significar que la secuencia complementaria es homologa a toda o una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia. Para ilustración, la secuencia nucleotídica "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de la secuencia entre dos o más secuencias polinucleotídicas o de aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de la secuencia", "porcentaje de identidad de la secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para una comparación de la secuencia, una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o una secuencia génica dada en un listado de secuencia o puede comprender un ADNc completo o una secuencia génica. Generalmente, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y con frecuencia al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácido pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos, las comparaciones de la secuencia entre dos o ( o más) moléculas, se, realiza típicamente comparando las secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación", para identificar y comparar las regiones locales de similitud de la secuencia. Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones nucleotídicas contiguas o 6 aminoácidos, en donde una secuencia polinucleotídica o una secuencia de aminoácidos puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones y lo similar (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos, en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl: Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete del Programa de Wisconsin Genetics Versión 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr . , Madison, Wis.), Geneworks, o paquetes del programa MacVector) , o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, que resulta en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación), generada por los varios métodos. El término "identidad de la secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de la secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base o residuo del ácido nucleico idéntico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I), aparece en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que corresponden, dividiendo el número de posiciones que corresponden entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) , y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se utiliza en la presente, denota una característica de una secuencia polinucleotídica o de aminoácidos, en donde el polinucleótido o el aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de la secuencia, de manera preferida, al menos 90 a 95 por ciento de identidad de la secuencia, más usualmente al menos 99 por ciento de identidad de la secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones nucleotídicas (6 aminoácidos), frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones nucleotídicás (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de la secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones, que totaliza 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. Como se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Immunology - A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales, tales como los aminoácidos a, a-disustituidos, los N-alquil aminoácidos, el ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos e aminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación polipeptídica utilizada en la presente, la dirección de la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar.

De manera similar, a menos que se especifique de otra manera, el extremo hacia la izquierda de las secuencias polinucleotídicas de una sola hebra es el extremo 5', la dirección hacia la izquierda de las secuencias polinucleotídicas de doble hebra, se refiere como la dirección 5' . La dirección de la adición 5' a 3' de transcriptos de ARN incipientes, se refiere como las regiones de la secuencia de la dirección de transcripción de la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están 5' al extremo 5' del transcripto ARN, se refieren como "secuencias corriente arriba", las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que está 3' al extremo 3' del transcripto de ARN se refieren como las "secuencias corriente abajo". Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial", significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando las ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos 80 por ciento de identidad de la secuencia, de manera preferida, al menos 90 por ciento de identidad de la secuencia, de manera más preferida, al menos 95 por ciento de identidad de la secuencia, y de manera aún más preferida, al menos 99 por ciento de identidad de la secuencia . De manera preferida, las posiciones del residuo que no son idénticas, difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es la serina y la treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida, es la asparagina y la glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es la lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutámico-ácido aspártico y asparagina-glutamina . Como se discute en la presente, están contempladas las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, como que están abarcadas por la presente invención, con la condición de que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantenga al menos 75%, de manera más preferida al menos 80%, 90%, 95%, y de manera aún más preferida 99%. En particular, están contemplados los reemplazos conservadores de los aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquéllos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente están divididos generalmente en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, 'serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrofílicos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrofóbicos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxialifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor en la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro del sitio del marco. Si un cambio de un aminoácido resulta en un péptido funcional, puede determinarse fácilmente probando la actividad específica del derivado polipeptídico. Se describen ensayos con detalle en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos con experiencia en la técnica. Los términos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por la comparación de los datos del nucleótido y/o la secuencia de aminoácidos con bases de datos públicas o patentadas de las secuencias. De manera preferida, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar los motivos de la secuencia o los dominios de conformación predichos de la proteína, que aparecen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar secuencias de proteínas que se doblan en una estructura tridimensional son conocidos. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Así, los siguientes ejemplos demuestran que aquellos con experiencia en la técnica pueden reconocer motivos de la secuencia y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente a la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos (de manera preferida, sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la secuencia natural (de manera preferida, en la porción del polipéptido fuera de los dominios de los contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper la hélice que aparece en la secuencia original, o romper otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia original) . Los ejemplos de estructuras de polipéptidos secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed . , W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105(1991). El término "fragmento polipeptídico" como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino terminal y/o carboxi terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restantes es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, de manera preferida al menos 14 aminoácidos de largo, de manera más preferida al menos 20 aminoácidos de largo, usualmente al menos 50 aminoácidos de largo, e incluso de manera más preferida, al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se utiliza en la presente, se refiere a polipéptidos que están comprendidos de un segmento de al menos 25 aminoácidos, que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida, y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a IFN?, bajo condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión a IFN? apropiada, o (3) la capacidad de inhibir el crecimiento de las células que expresan a IFN? in vitro o in vivo. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución conservadora de un aminoácido (o adición o supresión) con respecto a la secuencia natural. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de largo, de manera preferida al menos 50 aminoácidos de largo o más largos, y con frecuencias pueden ser tan largos como el polipéptido natural de longitud completa. Los análogos peptídicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquéllas del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986), Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan con frecuencia con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente.

Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica) , tal como un anticuerpo humano, pero que tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: —CH2NH— , —CH2S-, —CH2-CH2— , —CH=CH— (cis y trans), —COCH2— , CH(OH)CH2— y -CH2SO— , por métodos bien conocidos en la técnica'. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), puede utilizarse para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consens'o sustancialmente idéntica, mediante métodos conocidos en la1 técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, agregando residuos internos de cisteína capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido. El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos . Como se utiliza en la presente, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o una unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o calorimétricos) . En ciertas situaciones, la marca o el marcador también pueden ser terapéuticos . Varios métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas se conocen en la técnica y pueden utilizarse. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, de manera no exclusiva, lo siguiente: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, U1ln, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminiscentes, biotinilados, epitopos de polípéptido predeterminados, reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de un par de cremalleras de leucina, sitios de unión para los anticuerpos secundarios, dominios de unión metálicos, marcas de epitopo) . En algunas modalidades, las marcas se unen por brazos separadores de varias longitudes para reducir el potencial de impedimento esférico. El término "fármaco o agente farmacéutico" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de manera apropiada a un paciente. Otros términos químicos de la presente se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed:, McGraw-Hill, San Francisco (1985)) . El término "agente antineoplásico" se utiliza en la presente para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o progresión de un neoplasma en un humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad de los agentes antineoplásicos. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" significa que una especie es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie 'individual en la composición) , y de manera preferida, una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más que aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, de manera más preferida más que aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Aún de manera más preferida, la especie es purificada a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición , mediante métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios. El término sujeto incluye humanos y otros mamíferos .

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos Se genera un anticuerpo huIFN?, por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos proporcionados a continuación. Un anticuerpo huIFN? de IgG se genera, por ejemplo, convirtiendo una clona scFv en un formado de IgG (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6) . De manera alterna, tal anticuerpo huIFN? se desarrolla, por ejemplo, utilizando métodos de representación de la fase utilizando anticuerpos que contienen sólo secuencias humanas . Tales procedimientos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, en la WO92/01047 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,521,404, las cuales se incorporan en la presente como referencia. «En este procedimiento, una biblioteca combinatoria de fagos que portan pares aleatorios de cadenas ligeras y pesadas se selecciona utilizando una fuente natural o recombinante de IFN? o fragmentos del mismo. Un anticuerpo huIFN? se produce mediante un proceso en donde al menos un paso del proceso incluye inmunizar un animal transgénico no humano con una proteína IFN? humana. Algunos de los sitios de la cadena pesada y/o la ligera kappa endógena de este animal xenogénico no humano se han inhabilitado y son incapaces del rearreglo requerido para generar los genes que codifican las inmunoglobulinas en respuesta a un antígeno. Además, al menos un sitio de una cadena pesada humana y al menos un sitio de una cadena ligera humana se han transfectado de manera estable en el animal. Así, en respuesta a un antígeno administrado, los sitios humanos se rearreglan para proporcionar genes que codifican las regiones variables humanas inmunoespecíficas para el antígeno. Tras la inmunización, por lo tanto, el xenorratón produce linfocitos B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas . Una variedad de técnicas son bien conocidas en la técnica para producir animales xenogénicos no humanos. Por ejemplo, véase la Patente de los Estados Unidos No. 6,075,181 y No. 6,150,584. Mediante una estrategia, los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera xenogenéicos (humanos), se introducen en la línea germinal del hospedero (por ejemplo, esperma u oocitos) y en pasos separados, los genes del hospedero correspondiente se vuelven no funcionales mediante la inactivación, utilizando recombinación homologa. Los genes de la inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera se reconstruyen en un microorganismo eucariótico o procariótico apropiado, y los fragmentos de ADN resultantes se introducen en el hospedero apropiado, por ejemplo, los pronúcleos de los oocitos de ratón fertilizados o las células germinales embriónicas. La inactivación de los sitios de la inmunoglobulina endógena del hospedero se logra por la ruptura seleccionada de los sitios apropiados mediante recombinación homologa en las células hospederas, particularmente células germinales embriónicas o los pronúcleos de los oocitos de ratón fertilizados. La ruptura seleccionada puede involucrar la introducción de una lesión o supresión en el sitio objetivo, o una supresión dentro del sitio objetivo acompañada por la inserción en el sitio, por ejemplo, inserción de un marcador seleccionable. En el caso de células germinales embriónicas, se generan animales quiméricos que son derivados, en parte, de las células germinales embriónicas y son capaces de transmitir las modificaciones genéticas a través de la línea germinal. La correspondencia de los hospederos con los sitios de inmunoglobulina humana introducidos a las cepas con los sitios endógenos inactivados, proporcionará animales cuya producción de anticuerpos es puramente xenogenéica, por ejemplo, humana. En una estrategia alterna, al menos las porciones de los sitios de la inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana se utilizan para reemplazar directamente los sitios de inmunoglobulina endógena mediante recombinación homologa en las células germinales embriónicas. Esto resulta en la inactivación y el reemplazo simultáneo de la inmunoglobulina endógena. Esto es seguido por la generación de animales quiméricos en los cuales las células derivadas de las células germinales embriónicas pueden contribuir a las líneas germinales. Por ejemplo, una clona de linfocitos B que expresa el anticuerpo anti-IFN? humano se retira del animal xenogénico no humano y se inmortaliza de acuerdo con varios métodos conocidos dentro de la técnica. Tales linfocitos B pueden derivarse directamente de la sangre del animal o de tejidos linfoides, incluyendo, de manera no exclusiva, del bazo, amígdalas, nodos linfáticos y médula ósea. Los linfocitos B inmortalizados resultantes pueden expandirse y cultivarse in vitro para producir cantidades grandes, clínicamente aplicables del anticuerpo huIFN?. De manera alterna, los genes que codifican las inmunoglobulinas con una o más regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse en un tipo de célula diferente, incluyendo, de manera no exclusiva, a un sistema de cultivo celular de mamífero, con el fin de obtener los anticuerpos directamente o cadenas individuales de los mismos, compuestas de moléculas Fv de una sola cadena. Además, todo el conjunto de anticuerpos anti-IFN? completamente humanos generado por el animal xenogénico no humano puede seleccionarse para identificar una clona tal con las características óptimas. Tales características incluyen, por ejemplo, afinidad de unión a la proteína IFN? humana, estabilidad de la interacción, así como el isotipo del anticuerpo anti-IFN? completamente humano. Las clonas de todo el conjunto que tienen las características deseadas se utilizan a continuación como una fuente de las secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables deseadas, para una manipulación adicional, para generar anticuerpos con estas características, en sistemas celulares alternos, utilizando técnicas recombinantes o transgénicas convencionales. Esta estrategia general se demostró con relación a la generación de las primeras cepas XenoMouse™ como se publicó en 1994. Véase Green et al. Nature Genetics 7:13- 21 (1994). Este procedimiento se discute además y se delinea en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 07/466,008, presentada en enero 12, de 1990, 07/610,515, presentada en noviembre 8, de 1990, 07/919,297, presentada en julio 24, de 1992, 07/922,649, presentada en julio 30, de 1992, 08/031,801, presentada en marzo 15, de 1993, 08/112,848, presentada en agosto 27, de 1993, 08/234,145, presentada en abril 28, de 1994, 08/376,279, presentada en enero 20, 1995, 08/430,938, abril 27, de 1995, 08/464,584, presentada en junio 5, de 1995, 08/464,582, presentada en junio 5, de 1995, 08/463,191, presentada en junio 5, de 1995, 08/462,837, presentada en junio 5, de 1995, 08/486,853, presentada en junio 5, de 1995, 08/486,857, presentada en junio 5, de 1995, 08/486,859, presentada en junio 5, de 1995, 08/462,513, presentada en junio 5, de 1995, 08/724,752, presentada en octubre 2, de 1996, y 08/759,620, presentada en diciembre 3, de 1996 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 y 5,939,598 y las Patentes Japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véase también Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med.: 188: 483-495 (1998). Véase también la Patente Europea No., EP 0 463 151 Bl, publicación otorgada en junio 12, de 1996, Solicitud de Patente Internacional No., WO 94/02602, publicada en febrero 3, de 1994, Solicitud de Patente Internacional No., WO 96/34096, publicada en octubre 31, de 1996, WO 98/24893, publicada en junio 11, de 1998, WO 00/76310, publicada en diciembre 21, del 2000. En un procedimiento alterno, otros han utilizado un procedimiento de "minisitio". En el procedimiento de minisitio, un sitio de Ig exógena se imita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del sitio de Ig. Así, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (de manera preferida, una región constante gamma) se forman en un constructo para la inserción en un animal. Este procedimiento se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,545,807 de Surani et al., y en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299 y 6,255,458, cada una de Lonberg y Kay, Patente de los Estados Unidos No. 5,591,669 y 6,023,010 de Krimpenfort y Berns, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,612,205, 5,721,367 y 5,789,215 de Berns et al., y Patente de los Estados Unidos No. 5,643,763 de Choi y Dunn, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos de GenPharm International Nos. de Serie 07/574,748, presentada en agosto 29, de 1990, '07/575,962, presentada en agosto 31, de 1990, 07/810,279, presentada en diciembre 17, de 1991, 07/853,408, presentada en marzo 18, de 1992, 07/904,068, presentada en junio 23, de 1992, 07/990,860, presentada en diciembre 16, de 1992, 08/053,131, presentada en abril 26, de 1993, 08/096,762, presentada en julio 22, de 1993, 08/155,301, presentada en noviembre 18, de 1993, 08/161,739, presentada en diciembre 3, de 1993, 08/165,699, presentada en diciembre 10, de 1993, 08/209,741, presentada en marzo 9, de 1994. Véase también la Patente Europea No. 0 546 073 Bl, Solicitudes de Patente Internacionales Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,981,175. Véase además, Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996). Una ventaja del procedimiento de minisitio es la rapidez con la cual los constructos que incluyen las porciones del sitio Ig pueden generarse e introducirse en los animales. De manera conmensurable, sin embargo, una desventaja significativa del procedimiento del minisitio es que, en teoría, se introduce insuficiente diversidad a través de la inclusión de pequeños números de genes V, D, y J. En realidad, el trabajo publicado parece apoyar esta preocupación. El desarrollo de los linfocitos B y la producción de anticuerpos de animales producidos a través del uso del procedimiento del minisitio parecen atrofiados. Por lo tanto, la investigación que rodea la presente invención ha sido dirigida de manera consistente hacia la introducción de grandes porciones del sitio de Ig con el fin de lograr una diversidad mayor y en un esfuerzo por reconstituir el repertorio inmune de los animales. La generación de anticuerpos humanos de ratones en los cuales, a través de la fusión de la microcélula, grandes piezas de cromosomas o cromosomas enteros, se han introducido, también se ha demostrado. Véase las Solicitudes de Patente Europeas Nos. 773 288 y 843 961. Las respuestas al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otra manera. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante y una región variable inmune, se espera que ciertas respuestas a los anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA) se observen, particularmente en utilizaciones crónicas o con múltiples dosis del anticuerpo. Así, sería deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos contra IFN?, con el fin de invalidar las preocupaciones y/o efectos de la respuesta a HAMA o HACA. La producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida también se logra vía técnicas de humanización y representación utilizando bibliotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden humanizarse o primatizarse utilizando técnicas conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) y Wright et al. Crit, Reviews in Immunol . 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede diseñarse mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1, CH2, CH3, de articulación y/o el dominio del marco con la secuencia humana correspondiente. (Véase WO 92102190 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101, 5,585,089,5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 y 5,777,085). También, el uso del ADNc de Ig para la construcción de genes quiméricos de inmunoglobulina se conoce en la técnica (Liu et al. P. N.A.S. 84:3439 (1987) y J. Immunol . 139:3521 (1987)). El ARNm se aisla de un hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo y se utiliza para producir ADNc. El ADNc de interés puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195 y 4,683,202). De manera alterna, se hace y selecciona una biblioteca para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo se fusiona a continuación a las secuencias de la región constante humana. Las secuencias de las regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H., publicación no. 91-3242. Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles de clonas conocidas. La elección del isotipo será guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación al complemento o actividad en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgGI, IgG3 e IgG4. Cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humana, kappa o lambda, puede utilizarse. El anticuerpo quimérico humanizado es expresado entonces mediante métodos convencionales . Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab')2 y Fab pueden prepararse mediante escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante escisión con proteasa o química. De manera alterna, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab')2 incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región de articulación de la cadena H, seguido por un codón de paro traslacional para proporcionar la molécula truncada. Las secuencias de consenso de las regiones H y L J pueden utilizarse para diseñar oligonucleótidos para utilizarse como atisbadores para introducir los sitios de restricción útiles en la región J para el enlace posterior de los segmentos de la región V a los segmentos de la región C humana. El ADNc de la región C puede modificarse mediante mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana . Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YAC, epitomas derivados de EBV y lo similar. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados diseñados de manera que cualquiera de las secuencias VH o VL-31 puede insertarse y expresarse fácilmente. En tales vectores, el empalme ocurre usualmente entre el sitio donador del empalme en la región J insertada y el sitio receptor del empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de empalme que aparecen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción ocurren en los sitios cromosomales nativos corriente abajo de las regiones codificantes. El anticuerpo quimérico resultante puede unirse a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTR retrovirales, por ejemplo, promotor inicial SV-40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al. P. N.A.S. 79:6777 (1982)), y LTR del virus de la leucemia murina de moloney (Grosschedl et1 al. Cell 41:885 (1985)). También, como se apreciará, pueden utilizarse los promotores de Ig nativos y lo similar. Además, los anticuerpos humanos o los anticuerpos de otras especies pueden generarse a través de tecnologías del tipo de representación, incluyendo, de manera no exclusiva, representación del fago, representación retroviral, representación ribosomal y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración adicional, tales como 'maduración por afinidad, puesto que tales técnicas son bien conocidas en la técnica. Wright and Harris, supra., Hanes y Plucthau PEAS USA 94:4937-4942 (1997) (representación ribosomal), Parmley y Smith Gene 73:305-318 (1988) (representación del fago), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucí. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol . Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992) y Patente de los Estados Unidos No. 5,733,743. Si se utilizan tecnologías de representación para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos pueden humanizarse como se describió anteriormente. Utilizando estas técnicas, pueden generarse anticuerpos para células que expresan IFN?, IFN? mismo, formas de IFN?, epitopos o péptidos de los mismos y bibliotecas de expresión de los mismos (Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,703,057), que pueden seleccionarse posteriormente como se describió anteriormente para las actividades descritas anteriormente.

Diseño y generación de otros terapéuticos De acuerdo con la presente invención y basándose en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente con respecto a IFN?, el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de las porciones del anticuerpo se facilita. Tales modalidades incluyen, de manera no exclusiva, terapéuticos de anticuerpos avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas y terapéuticos radiomarcados, generación de terapéuticos peptídicos, terapias génicas, particularmente intracuerpos, terapéuticos antisentido y moléculas pequeñas . Por ejemplo, con relación a los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos biespecíficos pueden generarse, para que comprendan (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad a IFN? y otro a una segunda molécula, que se conjugan juntos, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica a IFN? y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de una sola cadena que tiene especificidad a IFN? y la otra molécula.

Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse utilizando técnicas que son bien conocidas, por ejemplo, con relación a (i) y (ii) . Véase, por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, supra, y con relación a (iii). Véase, por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Supl.) 7:51-52 (1992). Con relación a las inmunotoxinas, los anticuerpos pueden modificarse para actuar como inmunotoxinas, utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la Patente de los Estados Unidos No. 5,194,594. Con relación a la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que son bien conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, Junghans et al. en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véase también las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y las moléculas marcadas probablemente destruirían las células que expresan IFN?, y particularmente aquellas células en las cuales los anticuerpos de la invención son efectivos. Con relación a la generación de péptidos terapéuticos, a través del uso de la información estructural relacionada con IFN? y los anticuerpos del mismo, tales como los anticuerpos de la invención o la selección de bibliotecas peptídicas, pueden generarse péptidos terapéuticos que están dirigidos contra IFN?. El diseño y la selección de los terapéuticos peptídicos se discute con relación a Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), i Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas también pueden prepararse, y de manera similar, con relación a las porciones peptídicas como se discutió anteriormente con relación a los anticuerpos. Suponiendo que la molécula de IFN? (o una forma, tal como una variante empalmada o una forma alterna) es funcionalmente activa en un proceso de enfermedad, también será posible diseñar genes y terapéuticos antisentido de los mismos, a través de técnicas convencionales . Tales modalidades pueden utilizarse para modular la función de IFN?. Con relación a lo mismo, los anticuerpos de la presente invención i facilitan el diseño y el uso de ensayos funcionales relacionados con los mismos. Un diseño y estrategia para los terapéuticos antisentido se discute con detalle en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/29444. El diseño y las estrategias para la terapia génica también son bien conocidos. Sin embargo, en particular, el uso de técnicas terapéuticas génicas que involucran intracuerpos puede probar ser particularmente ventajoso. Véase, por ejemplo, Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) y Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). El diseño general de, y las consideraciones relacionadas con los terapéuticos génicos se discute también en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 97/38137. El conocimiento recogido de la estructura de la molécula de IFNY y sus interacciones con otras moléculas de acuerdo con la presente invención, tales como los anticuerpos de la invención, y otros, pueden utilizarse para diseñar de manera racional modalidades terapéuticas adicionales. A este respecto, pueden utilizarse técnicas racionales de diseño del fármaco, tales como cristalografía con rayos X, modelado molecular ayudado por computadora (o asistido) (CAMM) , relación cuantitativa o cualitativa de la estructura-actividad (QSAR) , y tecnologías similares para enfocar los esfuerzos de descubrimiento del fármaco. El diseño racional permite la predicción de la proteína o estructuras sintéticos que pueden interactuar con la molécula o formas específicas de la misma, que pueden utilizarse para modificar o modular la actividad de IFN?. Tales estructuras pueden sintetizarse químicamente o expresarse en sistemas biológicos. Este procedimiento ha sido revisado en Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Además, pueden diseñarse y sintetizarse bibliotecas combinatorias y utilizarse en programas de selección, tales como esfuerzos de selección de alto rendimiento.

Administración terapéutica y formulaciones Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con portadores, excipientes y otros agentes adecuados, que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro y tolerancia mejorados y lo similar. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975) ) , particularmente el Capítulo 87 por Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilen glicoles dé varios pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203 ( 1-2 ): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging ( concepts" . J Pharm Sci. 89(8):967-78 Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en las mismas para la información adicional relacionada con las formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos por los químicos farmacéuticos . Las formulaciones terapéuticas de la invención, que incluyen un anticuerpo huIFN? de la invención, se utilizan para tratar ó aliviar un síntoma asociado con un trastorno inmunorrelacionado, tal como por ejemplo, una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo huIFN? a un sujeto que sufre de la Enfermedad de Crohn (CD) puede actuar directamente en las células inmunes que causan la enfermedad, proporcionando por lo tanto una intervención rápida con una supresión mínima del sistema inmune. La administración de un anticuerpo huIFN? a un sujeto que sufre de Lupus Eritematoso Sistémico es otra indicación médica que proporciona una oportunidad para modificar las células inmunes responsables de la enfermedad. La administración de un anticuerpo huIFN?, una proteína completamente humana, a un sujeto que sufre de soriasis, evita la necesidad de tratar pacientes con medicaciones más agresivas (por ejemplo, Metotrexato) , que tienen efectos colaterales indesados bien documentados (por ejemplo, daño del hígado) . La administración de un anticuerpo huIFN? a un sujeto que sufre de artritis reumatoide es otra indicación médica que proporciona la oportunidad de modular la generación y la función corriente arriba de la respuesta mediada por Thl que induce la enfermedad. Las enfermedades autoinmunes incluyen por ejemplo, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmune), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad autoinmune de Addison, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED) , síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmune (ATP) , enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, dermatitis celiaca esprue herpetiforme; síndrome de disfunción inmune de fatiga crónica (CFIDS) , polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIPD) , pemfigoide cicatrizal, enfermedad de aglutinina fría, síndrome de crest, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mezclada esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), neuropatía IgA, diabetes mellitus dependiente de la insulina, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulimenia primaria, cirrosis biliar primaria, soriasis, artritis soríática, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre , reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma (esclerosis sistémica progresiva (PSS) , también conocida como esclerosis sistémica (SS) ) , síndrome de Sjógren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, artritis temporal/arteritis de las células gigantes, colitis ulcerativa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Los trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios crónicos y agudos. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen enfermedad de Alzheimer, asma, alergia atópica, alergia, aterosclerosis, asma bronquial, eczema, glomerulonefritis, enfermedad de injerto vs . hospedero, anemias hemolíticas, osteoartritis, sepsis, apoplejía, transplante de tejido y de órganos, vasculitis, retinopatía diabética y lesión del pulmón inducida por ventilador. Los anticuerpos huIFN? modulan una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo, en un sujeto humano. Por ejemplo, los anticuerpos huIFN? descritos en la presente modulan, por ejemplo, reducen, inhiben o evitan una respuesta inmune mediada por Thl exagerada, tal como una respuesta inmune mediada por Thl exagerada, con un trastorno autoinmune o inflamatorio tal como por ejemplo, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, soriasis, sarcoidosis, artritis reumatoide, vasculitis, dermatitis atópica y esclerosis secundaria progresiva múltiple. En una respuesta inmune mediada por Thl exagerada, las citocinas de Thl, tales como IL-2, IL-3, TNF-alfa (TNFa) e IFN? se presentan en un sujeto a un nivel que es más alto que el nivel de la producción de la citocina Thl en un sujeto que no sufre de una enfermedad o trastorno asociado con una respuesta inmune Thl exagerada. Para clasificar una respuesta inmune mediada por Thl como una respuesta exagerada, el nivel de una respuesta de producción de la citocina Thl se evalúa, por ejemplo, midiendo y analizando el nivel de las citocinas secretadas utilizando un ensayo ELISA u otro ensayo. Los anticuerpos huIFN? descritos en la presente también se utilizan para modular, por ejemplo, inhibir, reducir o prevenir el cambio de clase a un isotipo IgG, tal com un cambio de clase inducido por IFN?. Estos anticuerpos huIFN? modulan, por ejemplo, inhiben, evitan o reducen una respuesta mediada por Thl y en consecuencia, disminuyen el cambio inducido por IFN?. En una modalidad, las composiciones del anticuerpo huIFN? utilizadas para tratar un trastorno relacionado con la inmunidad, se administran en combinación con cualquiera de una variedad de agentes anticitocina o agentes antiquimiocina . Los reactivos anticitocina o antiquimiocina adecuados reconocen, por ejemplo, citocinas tales como la interleucina 1 (IL-I), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31 y/o quimiocinas tales como MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF y fractalcina. La presente invención también proporciona métodos para tratar o aliviar un síntoma asociado con un trastorno relacionado con la inmunidad. Por ejemplo, las composiciones de la invención se utilizan para tratar o aliviar un síntoma de cualquiera de las enfermedades autoinmunes y trastornos inflamatorios descritos en la presente. Los síntomas asociados con los trastornos relacionados con la inmunidad incluyen, por ejemplo, inflamación, fiebre, pérdida del apetito, pérdida de peso, síntomas abdominales tales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento, dolor articular o dolores persistentes (atralgia), fatiga, erupción cutánea, anemia, sensibilidad extrema al frío (fenómeno de Raynaud), debilidad muscular, fatiga muscular, cambios en el tono de la piel o los tejidos, falta de aliento u otros patrones anormales de la respiración, dolor pectoral o constricción de los músculos del pecho, frecuencia cardiaca anormal (por ejemplo, elevada o disminuida) , sensibilidad a la luz, visión borrosa o de otra manera anormal y función de los órganos disminuida. Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo IFN? se administran a un sujeto que sufre de un trastorno relacionado con la inmunidad, tal como una enfermedad autominmune o un trastorno inflamatorio. Un sujeto que sufre de una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio se identifica mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que sufren de una enfermedad autoinmune tal como la enfermedad de Crohn, lupus o soriasis, se identifican utilizando cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico, examen radiológico y análisis de sangre, orina y heces para evaluar el estado inmune. Por ejemplo, los pacientes que sufren de lupus se identifican, por ejemplo, utilizando la prueba del anticuerpo antinuclear (ANA) para determinar si los autoanticuerpos a los núcleos celulares están presentes en la sangre. Los pacientes que sufren de la enfermedad de Crohn se identifican, por ejemplo, utilizando una serie gastrointestinal (Gl) superior y/o una colonoscopía para evaluar el intestino delgado y grueso, respectivamente. Los pacientes que sufren de soriasis se identifican, por ejemplo, utilizando examen microscópico del tejido tomado del parche de piel afectada, mientras que los pacientes que sufren de artritis reumatoide se identifican utilizando, por ejemplo, pruebas de sangre y/o rayos x u otra evaluación con formación de imágenes. La administración de un anticuerpo huIFN? a un paciente que sufre de un trastorno relacionado con la inmunidad tal como una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio si cualquiera de una variedad de resultados de laboratorio o clínicos se logra. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo IFN? a un paciente que sufre de un trastorno relacionado con la inmunidad tal como una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con el trastorno se alivia, reduce o inhibe o no progresa a un estado adicional, es decir, peor. La administración de un anticuerpo huIFN? a un paciente que sufre de un trastorno inmune tal como una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio se considera exitosa si el trastorno, por ejemplo, un trastorno autoinmune, entra en remisión o no progresa a un estado adicional, es decir, peor .

Formulaciones de diagnóstico y profilácticas Los MAB anti-IFN? completamente humanos de la invención se utilizan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una modalidad, un MAb huIFN? de la invención se administra a pacientes que están en riesgo de desarrollar una de las enfermedades autoinmunes mencionadas anteriormente. Una predisposición del paciente a una o más de las enfermedades aútoinmunes mencionadas anteriormente puede determinarse utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos. En otra modalidad de la invención, un anticuerpo huIFN? se administra a individuos humanos diagnosticados con una o más de las enfermedades autoinmunes mencionadas anteriormente. Tras el diagnóstico, un anticuerpo huIFN? se administra para mitigar o invertir los efectos de la autoinmunidad . Los anticuerpos de la invención son también útiles en la detección de IFN? en muestras de pacientes y en consecuencia, son útiles como diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos huIFN? de la invención se utilizan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar los niveles de IFN? en una muestra de un paciente. En una modalidad, un anticuerpo huIFN? de la invención se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, los pozos de una placa de microtitulación) . El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquier IFN? que pueda estar presente en la muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se enjuaga y trata con un agente de bloqueo tal como proteína de visón o albúmina para evitar la adsorción no específica del analito. Posteriormente, los pozos se trataron con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados como el diagnóstico de una patología. Después de enjuagar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que está marcado de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como un anticuerpo de detección. El nivel de la marca detectable se mide, y la concentración del antígeno IFN? en la muestra de prueba se determina mediante comparación con una curva estándar desarrollada de las muestras estándar. Se apreciará que basándose en los resultados obtenidos utilizando los anticuerpos huIFN? de la invención en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible determinar la etapa de una enfermedad (por ejemplo, un trastorno autoinmune o inflamatorio) en un sujeto, basándose en los niveles de expresión del antígeno IFN?. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de los sujetos diagnosticados como que están en varias etapas en la progresión de la enfermedad y/o en varios puntos en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporcione resultados estadísticamente significativos para cada etapa de la progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada etapa. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan en la presente como referencia, como si cada una de tales publicaciones o documentos se indicara de manera específica e individual como que está incorporado en la presente como referencia. La cita de las publicaciones y documentos de patente no se pretende como una admisión de que alguna sea una técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión del contenido o la fecha de los mismos. La invención se ha descrito ahora a manera de descripción escrita, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes son para propósito de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados logrados se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no deben considerarse como que limitan la presente invención.

EJEMPLO 1: Clonación, Expresión y Purificación del Interferón Gamma Clonación La secuencia que corresponde a la secuencia madura del interferón gamma humano (hlFN?, huIFN?) se amplificó de un ADNc humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos. La producción de la amplificación se purificó en gel y se clonó en el vector de expresión pET41c (Novagen, San Diego CA) . El vector se modificó además para introducir un Avitag™ (Avidity, Denver CO) y una marca de octa-histidina en el término C del hlFN?, permitiendo la biotinilación in vivo de la proteína y la purificación mediante IMAC (Cromatografía de Afinidad del Ion Metálico Inmovilizado) .

Expresión Las células ,de E . coli BL21 se cotransfectaron con pET41c-hIFN? y un vector pACYC184-BirA, que codifica la enzima BirA requerida para la biotinilación in vivo de la secuencia Avitag™. Las colonias únicas resistentes a la Kanamicina (50 µg/ml) y al Cloramfenicol (10 µg/ml) se seleccionaron y utilizaron para inocular un cultivo de inicio en LB (Kan 50 µg/ml/Cm 10 µg/ml) y se cultivó durante la noche a 37°C. Al siguiente día, el cultivo se utilizó para inocular (dilución 1:100) un cultivo de 400 ml de LB (Kan 50 µg/ml/Cm 10 µg/ml) suplementado con biotina 50 µM. El cultivo se d jó crecer a 37°C con agitación (240 rpm) hasta que se alcanzó una OD60o de 0.6. En este punto, se agregó isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM, y el cultivo se incubó además durante 3 horas bajo las mismas condiciones. Las células se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos, y la pelotilla se congeló a -20°C. Bajo estas condiciones, esencialmente todo el hlFN? fue insoluble y se encontró en cuerpos de inclusión.

Purificación ' I Las pelotillas bacterianas se descongelaron y resuspendieron en 8 ml de reactivo Bugbuster que contiene 8 µl de Benzonaze (Novagen) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución se centrifugó durante 30 minutos a 15' 000 g a 4°C. La pelotilla que contiene los cuerpos de inclusión se resuspendió en 7 ml de amortiguador de solubilización (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, ß-mercaptoetanol 5 mM, Guanidin-HCl 6M) . El material resuspendido se centrifugó a 4°C durante 30 minutos a 15' 000 g. Dos columnas de 5 ml Hi Trap Chelating (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) , cargadas con NiS04 y equilibradas con amortiguador de solubilización, se conectaron juntas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sobrenadante después del paso de centrifugación se filtró en una membrana de 0.45 µm y se cargó en la columna con la ayuda de una bomba peristáltica 1 ml/minuto. Las columnas se colocaron en un sistema de cromatografía AKTA prime para el replegado y elusión en la columna.' La proteína inmovilizada se lavó con 35 ml de amortiguador de solubilización a 1 ml/minuto. Un gradiente lineal de amortiguador de solubilización con una concentración que se incrementa de amortiguador de replegado (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 300 mM) se aplicó a 1 ml/minuto durante 1 hora hasta que 100% del amortiguador de replegado se alcanzó,. La columna se lavó además con 25 ml del amortiguador de replegado. Las proteína replegada se eluyó entonces de la columna con amortiguador de elusión (Tris-HCl 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 400 mM) . Las fracciones que contienen la proteína se recolectaron y desalaron en columnas PD10 (Amersham) equilibradas con PBS. Se tomaron alícuotas de la proteína desalada y se almacenaron a -80°C.

EJEMPLO 2 : Células que Expresan el Interferón Gamma en la Superficie de la Célula Células de ovario de hámster chino (CHO) (disponibles de ATCC) , se transfectaron de manera estable con ADNc de IFN? humano marcado con c-myc. Los ADNc se subclonaron en plásmidos pCDNA 3.1 (Invitrogen, Carisbad CA) que contienen genes de resistencia a la neomicina. Los transfectantes se seleccionaron utilizando este antibiótico, y la clasificación sucesiva de las células se logró mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-6xHis (Sigma) . La expresión superficial del IFN? humano se confirmó vía citometría de flujo utilizando un mAb anti-IFN? (clona B27, Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) .

EJEMPLO 3 : Selección de las bibliotecas scFv humanas Los procedimientos generales para la construcción y el manejo de las bibliotecas scFv humanas se describen en Vaughan et al., (Nat. Biotech. 1996, 14:309-314), incorporado en la presente como referencia en su totalidad.

Las bibliotecas de scFv humano scFv se seleccionaron contra hlFN? de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Selecciones en fase líquida Las alícuotas de las bibliotecas del fago scFv (1012 ufp) obtenidas de Cambridge Antibody Technology (Cambridge, RU) se bloquearon con PBS que contiene 3% (peso/volumen) de leche descremada durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. El fago bloqueado se deseleccionó entonces en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. El fago deseleccionado se incubó entonces con hlFN? biotinilado in vivo (100 nM) durante dos horas a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. Las perlas se capturaron utilizando soporte magnético seguido por cuatro lavados con PBS/Tween 20 al 0.1% y 3 lavados con PBS. Las perlas se agregaron entonces directamente a 10 ml de células TG1 que crecen exponencialmente y se incubaron durante una hora a 37 °C con agitación lenta (100 rpm). Una alícuota de TG1 infectadas se diluyó en serie para titular el resultado de la selección. Las TG1 infectadas restantes se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y se resuspendieron en 0.5 ml de 2xTY-AG (medio 2xTY que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 2% de glucosa) y se dispersaron en placas de Bioassay con agar 2xTYAG. Después de una incubación durante la noche a 30°C, se agregaron 10 ml de 2xTYAG a las placas y las células se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml . 2xTYAG que contiene 50% de glicerol se agregó a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17% de glicerol. Las alícuotas de la ronda de selección se mantuvieron a -80°C.

Selecciones de la superficie celular Las alícuotas de las bibliotecas del fago scFv (1012 ufp) obtenidas de Cambridge Antibody Technology (Cambridge, RU) se bloquearon con PBS que contiene 3% (peso/volumen) de leche descremada durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. El fago bloqueado se deseleccionó durante una hora a 37°C/5% de C02 en células CHO transfectadas con un vector pDisplay vacío (en un matraz T75 a un 80% de confluencia) y que se había bloqueado previamente con PBS que contiene 2% (peso/volumen) de leche descremada. El fago deseleccionado se incubó entonces con células CHO-pDisplay-hIFN? durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se lavaron diez veces con PBS. El fago unido se eluyó agregando directamente 10 ml de TG1 que crece exponencialmente al matraz T75 e incubando durante una hora a 37°C con agitación lenta. Una alícuota de las TG1 infectadas se diluyó en serie para titular el resultado de la selección. Las TG1 infectadas se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y se resuspendieron en 0.5 ml de 2xTY-AG (medio 2xTY que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 2% de glucosa) y se dispersaron en placas de Bioassay con agar 2xTYAG. Después de la incubación durante la noche a 30°C, se agregaron 10 ml de 2xTYAG a las placas y las células se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml . 2xTYAG que contiene 50% de glicerol se agregó a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17% de glicerol. Las alícuotas de la ronda de selección se mantuvieron a -80°C.

Rescate del fago 100 µl de la suspensión celular obtenida de las rondas de selección previas se agregaron a 20 ml de 2xTYAG y se cultivaron a 37°C con agitación (240 rpm) hasta que se alcanzó una ODÉOO de 0.3 a 0.5. El cultivo se superinfectó con 3.3 x 1010 de fago auxiliar MK13K07 y se incubó durante una hora a 37°C (150 rpm) . El medio se cambió entonces mediante centrifugación de las células a 2000 rpm durante 10 minutos, eliminando el medio y resuspendiendo la pelotilla en 20 ml de 2xTY-AK (100 µg/ml de ampicilina; 50 µg/ml de kanamicina) . El cultivo creció durante la noche a 30°C (240 rpm) .

Rescate del fago monoclonal para ELISA Las clonas únicas se recolectaron en una placa de microtitulación que contiene 150 µl de medio 2xTYAG (2% de glucosa) por pozo y se cultivaron a 37°C (100-120 rpm) durante 5-6h. El fago auxiliar M13K07 se agregó a cada pozo para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 10 (es decir, 10 fagos por cada célula en el cultivo) y se incubó a 37°C (100 rpm) durante 1 hora. Después del crecimiento, las placas se centrifugaron a 3,200 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó cuidadosamente, las células se resuspendieron en 150 µl de medio 2xTYAK y se cultivaron durante la noche a 30°C (120 rpm) . Para el ELISA, los fagos son bloqueados agregando 150 µl de una concentración 2x de PBS que contiene 5% de leche descremada en polvo, seguido por una hora de incubación a temperatura ambiente. Las placas se centrifugaron entonces 10 minutos a 3000 rpm y el fago que contiene el sobrenadante utilizado para el ELISA.

ELISA del fago Las placas del ELISA (Maxisorb, NUNC) se recubrieron durante la noche con 2 µg/ml de hlFN? en PBS.

Las placas de control se recubrieron con 2 µg/ml de BSA.

Las placas se bloquearon entonces con 3% de leche descremada/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y Tween 20 al 0.05% antes de transferir los sobrenadantes del fago prebloqueado y la incubación durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces 3 veces con PBS y Tween 20 al 0.05%. 50 µl de 3% de leche descremada/PBS que contiene el anticuerpo anti-M13 conjugado con (HRP) (Amersham, diluido 1:10,000) a cada pozo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron 5 veces con PBS y Tween 20 al 0.05%. El ELISA se reveló entonces agregando 50 µl de TMB (Sigma) y 50 µl de H2S04 2N para detener la reacción. La intensidad de la reacción se leyó a 450 nm.

Secuenciamiento de la clona del fago Las clonas únicas se colocaron en una placa de microtitulación que contiene 150 µl de medio 2xTYAG (2% de glucosa) por pozo y se cultivaron a 30°C (120 rpm) durante la noche. El siguiente día 5 µl del cultivo se transfirieron en otra placa que contiene 45 µl de dH20 y se mezcló. Las placas se congelaron entonces a -20°C. Después de la descongelación, 1 µl de esta suspensión se utilizó para la amplificación con PCR utilizando protocolos estándar para la PCR con un cebador específico para pCANTABd: mycseq, 5' -CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3' (SEQ ID NO:100) y el gene31eader, 5'- TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3' (SEQ ID NO.101). Las reacciones de la PCR se purificaron en un formato de 96 pozos utilizando el sistema Montage PCRµ96 (Millipore) . 5 µl del ADN eluido se secuenciaron utilizando los cebadores mycseq y gene31eader.

Preparación de scFv periplásmico para las pruebas funcionales Las clonas individuales se inocularon en una palca de microtitulación de pozos profundos que contiene 0.9 ml de medio 2xTYAG (0.1% de glucosa) por pozo y se cultivaron a 37°C durante 5-6 horas (250 rpm). 100 µl por pozo de IPTG 0.2 mM en medio 2xTY se agregaron a continuación para proporcionar una concentración final de IPTG 0.02 mM. Las placas se incubaron entonces durante la noche a 30°C con agitación a 250 rpm. Las placas de pozos profundos se centrifugaron a 2,500 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Las pelotillas se resuspendieron en 150 µl de amortiguador TES (Tris/HCl 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM (pH 8), sucrosa al 20%, complementado con inhibidor de proteasa completo, Roche) . Un choque hipotónico se produjo agregando 150 µl del amortiguador TES diluido (dilución 1:5 de TES: agua) e incubación en hielo durante 30 minutos. Las placas se centrifugaron a continuación a 4000 rpm durante 10 minutos para eliminar las células y los desechos. Los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamente en otra placa de microtitulación y se mantuvieron en hielo para la prueba inmediata en ensayos funcionales o ELISA.

Purificación de scFv a gran escala Un cultivo iniciador de 1 ml de 2xTYAG se inoculó con una sola colonia de una placa de agar 2xTYAG estriada recientemente e incubada con agitación (240 rpm) a 37°C durante 5 horas. 0.9 ml de este cultivo se utilizaron para inocular un cultivo de 400 ml del mismo medio y se hizo crecer durante la noche a 30°C con agitación vigorosa (300 rpm) . Al siguiente día el cultivo se indujo agregando 400 µl de IPTG 1M y la incubación continuó durante 3 horas adicionales . Las células se recolectaron mediante centrifugación a 5,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Las células en pelotillas se resuspendieron en 10 ml de amortiguador TES enfriado con hielo complementado con inhibidores de la proteasa como se describió anteriormente. El choque osmótico se logró agregando 15 ml de amortiguador TES diluido 1:5 y la incubación durante 1 hora en hielo. Las células se centrifugaron a 10,000 rpm durante 20 minutos a 4°C para hacer una pelotilla de los desechos celulares. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un tubo fresco. Se agregó imidazol al sobrenadante a una concentración final de 10 mM . 1 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) , equilibrada en PBS se agregó a cada tubo y se incubó en un mezclador giratorio a 4°C (20 rpm) durante 1 hora. Los tubos se centrifugaron a 2,000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. La pelotilla de resina se resuspendió en 10 ml de amortiguador de lavado 1 frío (4°C) (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH a 8.0) . La suspensión se agregó a una columna poliprep (Biorad) . Se utilizaron 8 ml de amortiguador de lavado 2 frío (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH a 8.0) para lavar la columna mediante flujo por gravedad. Los scFv se eluyeron de la columna con 2 ml de amortiguador de elusión (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH a 8.0). Las fracciones se analizaron mediante absorción a 280 nm y las fracciones que contienen la proteína se recolectaron antes del intercambio del amortiguador en una columna de desalación PD10 (Amersham) equilibrada con PBS. Los scFv en PBS se analizaron mediante SDS-PAGE y se cuantificaron mediante absorción a 280 nm. Se tomaron alícuotas de los scFv purificados y se almacenaron a -20°C y a 4°C.

EJEMPLO 4 : Inhibición del Extracto de scFv de la Expresión del Gen Reportero Inducida por el Interferón Gamma Los extractos de scFv periplásmicos de varios anticuerpos huIFN? se produjeron como se describió anteriormente. Se utilizó un ensayo basado en las células de selección de alto rendimiento para la identificación de los bloqueadores de un solo fragmento de cadena variable (scFv) de la actividad del IFN?. Un gen reportero (luciferasa de luciérnaga), accionado por el promotor GBP1 inducible por IFN?, se transfectó en la línea celular de melanoma humano, Me67.8. Tanto los scFv como el IFN? se agregaron al cultivo celular de manera concomitante. Después de un tiempo de incubación de 6 horas, se realizó en ensayo del reportero de la luciferasa. Los scFv que se encontró que inhiben la inducción de la luciferasa de luciérnaga se retuvieron para una validación adicional . Varios extractos de scFv inhibieron el gen reportero inducido por IFN? de una manera dependiente de la dosis (Figura 15) . Para cada clona scFv mostrada en la Figura 15, se probaron varias concentraciones (2.7, 0.68, 0.17, 0.043 y 0.011 nM) como se muestra por las columna arriba de cada nombre de la clona (concentración descendente de izquierda a derecha) . El porcentaje de inhibición exhibido por cada extracto scFv a estas varias concentraciones, se muestra en la Tabla 3 siguiente.

Tabla 3: Porcentaje de inhibición de la expresión del gen reportero inducida por IFN? por los extractos periplásmicos EJEMPLO 5: Inhibición de los scFv de la Expresión de MHC Clase II Inducida por el Interferón Gamma Se implemento un ensayo de citometría de flujo para identificar los anticuerpos IgG completamente humanos, o fragmentos de los mismos, capaces de bloquear la expresión de las moléculas de MHC de clase II inducida por IFN?. Después del emplazamiento de las células Me67.8, se agregaron 5 ng/ml de IFN? humano recombinante a los cultivos en la presencia de varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-IFN? completamente humanos candidatos. Después de 48 horas en, cultivo, las células se tiñeron con anticuerpo MCH clase II antihumano (HLA-DR) marcado con fluorescencia y se analizaron utilizando un FACSCalibur®. Así, la CI50 (en donde 50% de la expresión de MHC clase II inducida por IFN? se inhibe, es decir, 50% de concentración inhibidora), para cada anticuerpo candidato se mide. Los scFv completamente humanos purificados se produjeron como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. El efecto de los scFv en la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células de melanoma se evaluó utilizando el ensayo basado en las células de citometría de flujo descrito anteriormente. Estos scFv inhibieron la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células de melanoma. (Figura 16, Paneles 1-12). La capacidad de estas clonas scFv para inhibir la expresión de MCH clase II inducida por IFN? en las células de melanoma se comparó con un mAb IFN? antihumano de ratón, referido en la presente como 16C3. Las clonas scFv (-) y el mAb IFN? antihumano de ratón 16C3 ( ) se describen en la Figura 16.

EJEMPLO 6 : Reformateado de los scFv en el Formado IgG Los scFv completamente humanos purificados se produjeron como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Las secuencias VH y ' VL de los scFv seleccionados se amplificaron con oligonucleótidos específicos que introducen una secuencia líder y un sitio de restricción HindIII en el extremo 5' . Un sitio Apal o Avrll se introdujo en el extremo 3' de la secuencia de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Las secuencias VH amplificadas se digirieron con HindIII/Apal y se clonaron en el vector de expresión pCon_gammal (LONZA, Basilea, Suiza) . Las secuencias VL amplificadas se digirieron con HindIII/AvrlI y se clonaron en el vector de expresión pCon_lambda2 (LONZA) . Los constructos se verificaron mediante el secuenciamiento antes de la transfección en células de mamífero. Las secuencias de ADNc VH y VL en sus vectores de expresión apropiados, se transfectaron en células de mamífero utilizando el Reactivo de Transfección Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza) . Brevemente, las células Pico se cultivaron en placas de 6 pozos a una concentración de 6 x 105 células por pozo en 2 ml de medio de cultivo que contiene suero bovino fetal. Los vectores de expresión, que codifican las secuencias VH y VL candidatas, se cotransfectaron en las células utilizando el Reactivo de Transfección Fugene 6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, el medio de cultivo se aspiró, y se agregaron 3 ml de medio libre de suero a las células y se cultivaron durante tres días a 37°C. Después del periodo de cultivo de tres días, el sobrenadante se recolectó para la IgG purificada en columnas de proteína G. La IgG completamente reformateada se purificó de los sobrenadantes libres de suero de las células transfectadas utilizando columnas de flujo rápido de Proteína G-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sobrenadantes de las células transfectadas se incubaron durante la noche a 4°C con amortiguador de unión a la IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL) . Las muestras se pasaron entonces sobre columnas de flujo rápido de Proteína G-Sepharose 4B y la' IgG se purificó posteriormente utilizando amortiguador de elusión. La fracción de IgG eluida se dializó entonces contra PBS y el contenido de IgG se cuantificó mediante absorción a 280 nm. La pureza y la integridad de la IgG se verificaron mediante SDS-PAGE.

EJEMPLO 7: Inhibición de la Expresión de MHC Clase II inducida por el Interferón Gamma por los scFv Reformateados Los scFv se reformatearon en el formato IgG como se describió anteriormente. El efecto de las clonas de IgG en la expresión de MHG clase II inducida por IFN? en las células de melanoma se evaluó utilizando el ensayo basado en células de citometría de flujo descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 17, Paneles 1-7, estas clonas de IgG inhibieron la expresión de MHC clase II inducida por IFN? en las células de melanoma. La capacidad de estas clonas de IgG para inhibir la expresión de MCH clase II inducida por IFN? en las células de melanoma, se comparó con el mAb IFN? antihumano de ratón 16C3 y el anticuerpo IFN? antihumano de ratón MAB285 de R&D Systems. Las clonas de IgG completas (-x-), el mAb IFN? antihumano de ratón 16C3 (-A-) y el IFN? antihumano i de ratón MAB285 de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) (-•-) se describen. Los valores de CI5o para estas clonas de IgG se muestran a continuación en la Tabla 4.

Tabla 4. Análisis de la CI50 de los anticuerpos monoclonales anti-IF ? completamente humanos .

EJEMPLO 8 : Retromutación de la Clona del Anticuerpo huIFN? a la Secuencia de la Linea Germinal En los estudios descritos en la presente, los nucleótidos y residuos de aminoácidos en la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la clona A6 se mutaron para corresponder con el residuo de nucleótido o aminoácido encontrado en la secuencia de la línea germinal. Este proceso se refiere en la presente como "retromutación".

Cadena pesada de A6: El gen variable pesado de inmunoglobulina del anticuerpo A6 tuvo un 100% de homología con la línea germinal humana DP-47 o IGHV3-23 (Número de Acceso de GenBank M99660) . La región de unión pesada de inmunoglobulina (IGHJ) de A6 se comparó con seis regiones IGHJ funcionales humanas. La región IGHJ de A6 se identificó como IGHJ2 (Tabla 5A siguiente) , pero tuvo una mejor homología general con IGHJ5-02 (Tabla 5B siguiente). La región IGHJ original de A6 mutó por lo tanto para que corresponda con la secuencia de IGHJ5-02, pero sólo para la secuencia fuera de CDR3. Los nucleótidos y residuos de aminoácidos mutados se muestran en recuadros en las Tablas 5A y 5B, y las regiones CDR están subrayadas.

Tabla 5A: Comparación entre A6 los genes IGHJ2 funcionales humanos |ACCACAJTÍ^TTCGA|c|c[3cTGsGGCC(fiGGCACCCTQGTCAC[c|GTCTfAGlIj AS (SEQ ID NO:109) § |i¡ § F D g W G ¡R G T L V T V S S (SEQ ID o io) CTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA IGHJ2 (SEQ ID NO.-III) Y W Y F D W G R G T V T V S S (SEQ ID o-.?i2) CDR 3 Tabla 5B: Comparación entre A6 y el gen IGHJ5-02 funcional humano Cadena ligera de A6: El gen variable lambda de inmunoglobulina (VL) del anticuerpo A6 pertenece al subgrupo IGLV6-57 o Vl-22 (Número de Acceso a GenBank Z73673) . A6-VL tiene 7 mutaciones en comparación con IGLV6-57, tres en las CDR y cuatro en los marcos (Tabla 6 siguiente) . Los nucleótidos y residuos de aminoácidos mutados se muestran en recuadros en la Tabla 6, y las regiones CDR están subrayadas. Las cuatro mutaciones en las regiones del marco son: Ser a Ala en la región del marco 2 en la posición Kabat 43; Ser a Thr en la región del marco 3 en la posición Kabat 72; Lys a Glu y Thr a Ala en la región del marco 3 en las posiciones Kabat 79 y 80, respectivamente. Las cuatro mutaciones en las regiones del marco se cambiaron primero individualmente, a continuación todas juntas nuevamente al residuo de la línea germinal humana correspondiente. Las mutaciones de estos cuatro residuos nuevamente al aminoácido de la línea germinal humana correspondiente no altera de ninguna manera la afinidad de unión del anticuerpo NI-0501, también referido en la presente como "A6 retromutado", a su antígeno objetivo, en comparación con el anticuerpo A6. Las mutaciones de la secuencia VL de A6 al residuo de la línea germinal correspondiente en CDRl (Ala a Val) y CDR2 (Gln a Arg) se llevaron a cabo y no mostraron modificar la afinidad general para huIFN? del anticuerpo NI-0501 (A6 retromutado) en comparación con el anticuerpo A6.

Tabla 6: Comparación entre A6 y el gen IGHV6-57 funcional humano CDR 1 ¡43] CDR 2 IGLV6-57 Humano MFmtQPHSvsESPGKTvt?scra3SGS?[a|3W?vQ nfQQ PGsgp tviYEP?|gapsGVP 60 A6-v?, HFM TQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSI|V|SHYVQWVQQRPG?|J PTTVIYEDKHRPSGVP 60 ****** *********************** _ ******** ***** . ********* . ****** 72 79 , 80 CDR 3 IGLV6-57 Humano DRFSGSIDSSSN[ &SLTISGI@EDEADYYC2SY^Í¡SN - - -- gs (SEQ ID NO : I I 7 ) A6-VL DRFSGSIDSSSN AS TISGI@EDEADYYC^Y^SNE^FGGGTKLTV]JG 112 (SEQ ID NO : 118 ) . ************ ** Las secuencias completa de las cadenas pesada y ligera de NI-0501 se exponen en las Figuras 1A-1D. Los nucleótidos y residuos de aminoácidos que se retromutaron para producir el anticuerpo NI-0501 (es decir, aquellos nucleótidos y residuos que se cambiaron de la secuencia A6 original) están subrayados y con itálicas en las Figuras ÍA y 1C.

E EMPLO 9 : Afinidad y Cinética de Unión del Anticuerpo huIFN? La afinidad y la cinética de unión del anticuerpo huIFN? NI-0501 se caracterizaron en un instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) . 200 RU de NI-0501 se inmovilizaron mediante química EDC/NHS en una microplaqueta Cl de Biacore. La unión se midió pasando el hlFN? (R&D Systems) en amortiguador HBS-EP a concentraciones entre 200 nM y 1 nM . La velocidad de flujo fue de 100 µl/minuto y la temperatura se fijó a 25°>. Los datos se ajustaron de acuerdo con 1:1 el modelo de Langmuir y los valores de Kon, K0ff y KD determinados (Figura 18) .

EJEMPLO 10: Actividad del Anticuerpo huIFN? La actividad del anticuerpo huIFN? NI-0501 se comparó con la actividad del anticuerpo producido por la clona A6 (es decir, el anticuerpo A6 huIFN?) . En este estudio, se evaluó la capacidad de cada anticuerpo huIFN? para inhibir la sobrerregulación de MHC clase II inducida por el IFN? humano recombinante (rhuIFN?) de la línea celular de melanoma humano, Me67.8. Brevemente, las células de melanoma Me67.8 se incubaron con rhuIFN?, en la presencia de NI-0501 o el anticuerpo A6 huIFN? durante 48-72 horas. La sobrerregulación de MHC clase II se midió como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. Los dos anticuerpos presentaron una actividad similar, lo que demuestra que las retromutaciones en el anticuerpo huIFN? NI-0501 no modifica la actividad del anticuerpo (Figura 19) . La actividad del anticuerpo huIFN? NI-0501 se probó entonces en el IFN? nativo. En este estudio, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se activaron con 1 µg/ml del PHA del mitógeno durante 48 horas, y los sobrenadantes se probaron vía ELISA para la presencia del IFN? nativo. Este sobrenadante se utilizó entonces para estimular la sobrerregulación de MHC clase II en las células Me67.8. NI-0501 fue capaz de neutralizar la sobrerregulación de MHC clase II inducida por el IFN? humano nativo (Figura 20) .

EJEMPLO 11: Reactividad Cruzada del Anticuerpo huIFN? Ensayo de unión : El NI-0501 se probó por su capacidad para unirse al IFN? utilizando un ensayo de formato ELISA Intercalado. Brevemente, el IFN? de las especies mencionadas en el título de cada gráfica mostrada en la Figura 21 se capturó con NI-0501 prerrecubierto (-A-) o el mAb IFN? antiespecies de control (-•-) . El IFN? de cada especie se detectó utilizando un anticuerpo policlonal específico para el IFN? en ese ensayo. Como se observa en la Figura 21, el NI-0501 que se une a IFN? de rata es similar al anticuerpo de control, pero no para las otras especies, excluyendo el macaco de Java. Neutralización de la actividad del IFN?: El anticuerpo NI-0501 se probó por su capacidad para neutralizar o inhibir las proteínas IFN? recombinantes de varias diferentes especies. Brevemente, el IFN? recombinante de las varias especies probadas se colocó en cultivo con células Me67.8 en la presencia o ausencia de NI-0501 durante 48-72 horas. La sobrerregulación de MHC clase II se midió como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. La reactividad cruzada a, y la neutralización del IFN? de macaco de Java se demostró inhibiendo la sobrerregulación de MHC clase II en la línea celular de melanoma humano Me67.8 (Figura 21). El NI-0501 fue capaz de inhibir el IFN? del macaco de Java pero no pudo neutralizar el IFN? de otras especies probadas, demostrando ninguna reactividad cruzada del anticuerpo con estas especies (Tabla 7).

Tabla 7 : Reactividad cruzada del NI-0501 nhu = I FN? humano nativo rhu = I FN? humano recombinante ncy = IFN? nativo de macaco de Java rey = IFN? recombinante de macaco de Java rd = IFN? recombinante de perro rc = IFN? recombinante de gato rr = IFN? recombinante de rata rm = IFN? recombinante de ratón + = reacción cruzada - = no hay reacción cruzada * = no se probó Además, los PBMC de macaco de Java se activaron con 1 µg/ml del PHA de mitógeno durante 48 horas, y los sobrenadantes se probaron vía ELISA para la presencia del IFN? nativo. Este sobrenadante se utilizó entonces para estimular la sobrerregulación de MHC clase II en Me67.8. El NI-0501 fue capaz de neutralizar la sobrerregulación de MHC clase II inducida por el IFN? nativo de macaco de Java (Figura 22) .

EJEMPLO 12 : Actividad Biológica del Anticuerpo huIFN? Los estudios descritos en la presente se diseñaron para probar la actividad biológica del anticuerpo huIFN? NI-0501 tras la administración a macacos de Java. El NI-0501 se eligió por los estudios de seguridad y de farmacocinética (PK) descritos en la presente, debido a que se encontró que este anticuerpo huIFN? reacciona de manera cruzada con el IFN? de los macacos de Java, como se describió anteriormente. Para evaluar los efectos clínicos adversos después de múltiples infusiones intravenosas, los macacos se infundieron con las siguientes dosis: 30 mg/kg, 100 mg/kg y 200 mg/kg. En los ratones con un gen IFN? roto, se observaron niveles disminuidos de IgG2a y niveles incrementados de IgGl en respuesta a la inmunización con KLH, demostrando la correlación entre el IFN? y la respuesta de IgG. Durante la semana 13 del estudio de toxicología principal, los macacos se inmunizaron con KLH en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) . Una respuesta inmune típica para KLH/IFA en los macacos cotratados con el placebo, provoca una respuesta IgM e IfG específica de KLH detectable en el suero. Estos estudios se diseñan para evaluar si la neutralización de IFN? en los macacos tratados con NI-0501 que se inmunizaron con KLH en IFA, altera el título de IgG específico de KLH.

EJEMPLO 13: Modulación de la Actividad del IFN? Utilizando los Anticuerpos huIF ? La producción de la quimiocina IP-10 es sobrerregulada por el IFN? en varias líneas celulares diferentes. Basándose en esta observación, se desarrolló un ensayo de sangre completa. En este ensayo de sangre completa, se mezclaron las muestras de sangre completa de varios donadores con una concentración fija de IFN? y diferentes concentraciones de NI-0501. Después de la incubación, los niveles de IP-10 se midieron mediante ELISA como un medio para evaluar la eficacia del anticuerpo anti-IFN? para bloquear la producción de IP-10 (Figura 23) .

Otras modalidades Aunque la invención se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un anticuerpo monoclonal anti-IFN? completamente humano aislado o un fragmento del mismo, que comprende : (a) una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID N0:3) o SNAMS (SEQ ID NO:43); (b) una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) o
TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO:44), y (c) una región CDR3 VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) ; DHSSGWYVISGMDV
(SEQ ID NO: 13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21); DGWNALGWLES
(SEQ ID NO:29); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO:45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY
(SEQ ID NO:76) y DFWVITSGNDY (SEQ ID NO:89), en donde el anticuerpo se une al IFN?. 2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende además: (d) una región CDRl VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:8); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO:32); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO : 48 ) ; TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72); TGRNGNIASNYVQ
(SEQ ID NO:84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97) y TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); (e) una región CDR2 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); i DDDQRPS (SEQ ID NO:25); DDKKRPS (SEQ ID NO:33); EDTQRPS
(SEQ ID NO:85) y EDNRRPS (SEQ ID NO:107) y (f) una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); QSNDSDNVV (SEQ ID
NO: 18); QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26); QSYDSNNLVV (SEQ ID
NO:34); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO:40); QSYDSDNHHVV (SEQ ID
NO: 49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO:73); QSYEGF (SEQ ID NO:79); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO: 92) y QSYSYNNQVV (SEQ ID NO:98). 3. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un isotipo de IgG. 4. El anticuerpo según la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO:3); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) , una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) ; una región CDRl VL que comprende la secuencia de aminoácidos TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); una región CDR2 V que comprende la secuencia de aminoácidos EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos QSYDGSNRWM (SEQ ID N0:10) . 5. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es NI-0501. 6. Un anticuerpo monoclonal humano completamente aislado, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 ó 103, en donde el anticuerpo se une al IFN?. 7. El anticuerpo según la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende además una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 ó 105, en donde el anticuerpo se une al IFN?. 8. El anticuerpo según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo comprende una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 3); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4), una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos
DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO : 5 ) ; una región CDRl VL que comprende la secuencia de aminoácidos TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO : 8 ) ; una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10) . 9. El anticuerpo según la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un isotipo de IgG. 10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 y un portador. 11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 4 y un portador.
12. Un método para aliviar un síntoma de una enfermedad autoinmune o un trastorno inflamatorio, el método comprende administrar un anticuerpo según la reivindicación 1 a un sujeto en necesidad del mismo, en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma de la enfermedad autoinmune o el trastorno inflamatorio en el sujeto.
13. El método según la reivindicación 12, en donde el sujeto es un humano.
14. El método según la reivindicación 12, en donde el anticuerpo comprende una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO:3); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) , una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5); una región CDRl VL que comprende la secuencia de aminoácidos TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10) .
15. El método según la reivindicación 14, en donde el anticuerpo es NI-0501.
16. El método según la reivindicación 12, en donde la enfermedad autoinmune o el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste de Enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, soriasis, artritis reumatoide, vasculitis, dermatitis atópica y esclerosis múltiple secundaria progresiva.
17. El método según la reivindicación 12, en donde el anticuerpo se administra intravenosamente.
18. El método según la reivindicación 12, en donde el anticuerpo se coadministra con un segundo agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) una anticitocina que reconoce una o más de las citocinas seleccionadas de interleucina 1 (IL-I), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) un reactivo de antiquimiocina que reconoce una o más citocinas seleccionadas de IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (c) una quimiocina seleccionada de MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF y fractalcina .
19. Un método para reducir la expresión de MHC clase II en una célula, el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo según la reivindicación 1 en una cantidad suficiente para reducir la expresión de MHC clase II en la célula.
20. El método según la reivindicación 19, en donde la célula es una célula de melanoma humano.
21. El método según la reivindicación 19, en donde el anticuerpo comprende una región CDRl VH que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 3); una región CDR2 VH que comprende la secuencia de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 4 ) , una región CDR3 VH que comprende la secuencia de aminoácidos DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5); una región CDRl VL que comprende la secuencia de aminoácidos TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); una región CDR2 VL que comprende la secuencia de aminoácidos EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); y una región CDR3 VL que comprende una secuencia de aminoácidos QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10) .
22. El método según la reivindicación 21, en donde el anticuerpo es NI-0501.
23. El método según la reivindicación 19, en donde la célula se pone en contacto con un segundo agente seleccionado del grupo que consiste de: (a) una anticitocina que reconoce una o más citocinas seleccionadas de interleucina 1 (IL-I), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) un reactivo antiquimiocina que reconoce una o más citocinas seleccionadas de IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (c) una quimiocina seleccionada de MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF y fractalcina .