PT1848744E

PT1848744E - Anticorpos anti-interferão gama e os seus processos de utilização

Info

Publication number: PT1848744E
Application number: PT06765483T
Authority: PT
Inventors: Greg Elson; Olivier Leger; Walter Ferlin; Nicolas Fischer
Original assignee: Novimmune Sa
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2012-04-24
Also published as: KR101380570B1; KR20070102566A; NO340445B1; WO2006109191A3; CA2595276C; EA013118B1; US7700098B2; BRPI0607238A2; US9682142B2; ES2381203T3; EA200701589A1; US20170291943A1; US20100158922A1; CN101151277A; CA2595276A1; EP1848744B1; BRPI0607238B8; UA92337C2; PL1848744T3; AU2006233353A1

Description

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DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS ΑΝΤΙ-INTERFERÃO GAMA E OS SEUS PROCESSOS DE UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se na generalidade a anticorpos anti-interferão gama totalmente humanos bem como a processos para a sua utilização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 interferão gama humano (IFNy, IFN-gama) é uma linfocina produzida por linfócitos T activados e células naturais "killer" (células naturais assassinas). Evidencia actividades antiproliferativa, antiviral e imunomoduladora e liga-se ao IFNy-R, um receptor heterodimérico localizado na maioria das células primárias do sistema imunitário, e desencadeia uma cascata de eventos que conduzem à inflamação. A actividade antiviral e a actividade imunomoduladora do IFNy são conhecidas por exercerem efeitos benéficos em uma série de situações clinicas. No entanto, existem muitos cenários clínicos em que a actividade do IFNy é conhecida por exercer efeitos deletérios. Por exemplo, as doenças auto-imunitárias estão associadas a elevados níveis de IFNy nos tecidos arterial e patológico de pacientes auto-imunitários. A actividade do IFNy tem-se associado também a processos patológicos como caquexia e choque séptico. A Patente de invenção internacional W02004/035747 descreve anticorpos humanos que inibem a actividade do IFNy. 2

Por conseguinte, são necessárias terapias que tenham como alvo a actividade do IFNy.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos especificamente dirigidos contra o interferão gama (IFNy, também referido na presente invenção como IFN-gama) como definidos nas reivindicações. Os anticorpos monoclonais descritos na presente invenção incluem NI-0501; AC1.2R3P2_A6 (também referido na presente invenção como "A6"); AC1.2R3P2 B4 (também referido na presente invenção como "B4"); AD1.4R4P1_B9 (também referido na presente invenção como "B9"); AD1.4R4P2_C9 (também referido na presente invenção como "C9"); AC1.4R4P2_C10 (também referido na presente invenção como "CIO"); AC1.2R3P7_D3 (também referido na presente invenção como "D3"); AD1.2R2P2 D6 (também referido na presente invenção como "D6"); AC1.2R2P2_D8 (também referido na presente invenção como "D8"); AD1.3R3P6_E1 (também referido na presente invenção como "El"); AD1.3R3P5_F8 (também referido na presente invenção como "F8"); ADl.3R3P6_F9 (também referido na presente invenção como "F9"); AD1.4R4P2_G7 (também referido na presente invenção como "G7"); AD1.1R3P3_G9 (também referido na presente invenção como "G9"); e AD1.3R3P6 G10 (também referido na presente invenção como "G10").

Um anticorpo para huIFNY contém uma região variável de cadeia pesada que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nos: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94, ou 103 e uma região variável de cadeia leve que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ N0s ID: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 ou 105. De preferência, as 3 três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada incluem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência escolhida no grupo constituído por SYAMS (SEQ ID N0 :3) ; AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0 :4) ; DGSSGWYVPHWF DP (SEQ ID N0:5) ; DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID N0:13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID N0:21); DGWNALGWLES (SEQ ID N0:29); SNAMS (SEQ ID N0:43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID N0:44); GTELVGGGLDN (SEQ ID N0:45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID N0:64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID N0:69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID N0:76); e DFWVITSGNDY (SEQ ID N0:89); e uma cadeia leve com três CDRs que incluem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência escolhida no grupo constituído pela sequência de aminoácidos de TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:8); EDNQRPS (SEQ ID N0:9); QSYDGSNRWM (SEQ ID No:10); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:16); EDNQRPS (SEQ ID N0:17);

QSNDSDNVV (SEQ ID N0:18); DDDQRPS (SEQ ID N0:25); QSYDSSNVV (SEQ ID N0 :2 6) ; TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID N0:32); DDKKRPS (SEQ ID N0: 33 ) ; QSYDSNNLVV (SEQ ID N0:34) ; TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID N0: 3 9 ) ; QSYDNSNHWV (SEQ ID N0: 4 0) ; TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID N0: 4 8 ) ; QSYDSDNHHVV (SEQ ID N0: 4 9) ; TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0: 55 ) ; QSYDSSNQEVV (SEQ ID N0 :56); QSYDSNNFWV (SEQ ID N0:61) ; TRSSGSIASNYVH (SEQ ID N0 : 72) ; QSSDTTYHGGVV (SEQ ID N0:73) ; QSYEGF (SEQ ID N0:79); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID N0:84); EDTQRPS (SEQ ID N0:85); QSSDSNRVL (SEQ ID N0:86); QSFDSTNLVV (SEQ ID N0: 92) ; AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:97); QSYSYNNQW (SEQ ID N0:98) ; TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID No:106); EDNRRPS (SEQ ID No:107). O anticorpo liga-se ao IFNy.

Os anticorpos para huIFNY incluem uma região CDR1 VH que compreende a sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID N0:3) ou SNAMS (SEQ ID N0:43); uma região CDR2 VH que compreende a sequência de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0:4) ou TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID N0:44), e uma região CDR3 VH que 4 compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituido por DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID N0:5); DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID N0:13) ; DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID N0:21); DGWNALGWLES (SEQ ID N0:29); GTELVGGGLDN (SEQ ID N0:45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID N0:64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID N0:69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID N0:76); e DFWVITSGNDY (SEQ ID N0:89).

Os anticorpos para huIFNy incluem uma região CDR1 VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida entre o grupo constituido por TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:8); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID N0:32); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID N0:39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID N0:48); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID N0:72); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID N0:84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:97) e TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID No:106), uma região CDR2 da VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituido por EDNQRPS (SEQ ID N0:9); EDNQRPS (SEQ ID N0:17) ; DDDQRPS (SEQ ID N0:25); DDKKRPS (SEQ ID N0:33); EDTQRPS (SEQ ID N0:85) e EDNRRPS (SEQ ID No:107); e uma região CDR3 da VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituido por QSYDGSNRWM (SEQ ID No:10);

QSNDSDNVV (SEQ ID N0:18) ; QSYDSSNVV (SEQ ID N0: 26) ; QSYDSNNLVV (SEQ ID N0 : 34 ) ; QSYDNSNHWV (SEQ ID O o QSYDSDNHHVV (SEQ ID N0: 4 9) ; QSYDSSNQEVV (SEQ ID N0: 5 6) ; QSYDSNNFWV (SEQ ID N0:61) ; QSSDTTYHGGVV (SEQ ID N0:73); QSYEGF (SEQ ID N0 : 79) ; QSSDSNRVL (SEQ ID N0: 86) ; QSFDSTNLVV (SEQ ID N0: 92) ; e QSYSYNNQVV (SEQ ID N0:98).

Os anticorpos para huIFNy incluem, por exemplo, uma região CDR1 da VH que compreende a sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID N0:3) ou SNAMS (SEQ ID N0:43); uma região CDR2 da VH que compreende a sequência de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0:4) ou TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID N0:44); uma região CDR3 da VH que compreende uma sequência de 5

aminoácidos escolhida no grupo constituído por DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID N0:5) ; DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID N0:13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID N0:21) ; DGWNALGWLES (SEQ ID N0:29); GTELVGGGLDN (SEQ ID N0:45) ; RSFDSGGSFEY (SEQ ID N0:64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID N0: 69) ; GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID N0:76); e DFWVITSGNDY (SEQ ID N0:89), uma região CDR1 da VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituído por TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0: 8) ; TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:16); TRSGGSIGSYYVQ

(SEQ ID N0:32) ; TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID N0:39); TGSGGSIATNYVQ

(SEQ ID N0:4 8); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:55); TRSSGSIASNYVH

(SEQ ID N0:72) ; TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID N0:94); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID N0:97) e TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID No:106), uma região CDR2 da VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituído por EDNQRPS (SEQ ID N0:9); EDNQRPS (SEQ ID N0:17); DDDQRPS (SEQ ID N0:25); DDKKRPS (SEQ ID N0:33) ; EDTQRPS (SEQ ID N0:85) e EDNRRPS (SEQ ID No:107); e uma região CDR3 de VL que compreende uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituído por QSYDGSNRWM (SEQ ID N0:10) ; QSNDSDNVV (SEQ ID N0:18); QSYDSSNVV (SEQ ID N0:2 6) ; QSYDSNNLVV (SEQ ID N0:34); QSYDNSNHWV (SEQ ID No:40); QSYDSDNHHVV (SEQ ID N0:49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID N0:56); QSYDSNNFWV (SEQ ID N0:61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID N0:73); QSYEGF (SEQ ID N0:79); QSSDSNRVL (SEQ ID N0:86); QSFDSTNLVV (SEQ ID N0: 92) ; e QSYSYNNQVV (SEQ ID N0:98). A cadeia pesada de um anticorpo para huIFNy provém de um gene da linhagem germinativa da região V (variável) como, por exemplo, o gene da linha germinativa DP47 (IGHV3-23) (N° de

Admissão M99660 no GenBank) ou uma sequência homóloga de ácido nucleico da sequência do gene da linha germinativa DP47 humano. A sequência dos ácidos nucleicos no gene da linha germinativa DP47 (IGHV 3-23) inclui, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos apresentada seguidamente: 6 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGaGAGGCTTGGTftCAGCCTGGGGGGTCCCTGACACTC ; TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT j CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTArrAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTAC j GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCGAAGAACACGCrGTAT j CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA (S£Q j ID HO:99} A cadeia leve de um anticorpo para huIFNY provém de um gene da linhagem germinativa da região variável da cadeia leve lambda de uma Ig como, por exemplo, IGLV6-57 ou V1-22 (N° de Admissão Z73673 no GenBank) ou uma sequência homóloga de ácidos nucleicos da sequência humana do gene da linha germinativa IGLVG-57. A sequência de ácidos nucleicos do gene IGLV6-57 da linha germinativa inclui, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos apresentada seguidamente: aattttaioctgactcagccccactctgtgtcggagtctccgoggaaoacggtaaccatc TCCrQCACCCGCÃGCAGTGGCAGCATÍGCCAGCAACTATGTGCAGTGGlACCAGCAGCGC CCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGG&TARCCAAAGACCCTCTGGGGTCCCT gatcggttctctggctccatcgaca.gctcctccaactctgcctccctcaccatctctgga CTSAÃGACTGAGGACGAGGCimCTACTACTGTCAGTCTTMGATAGCÃ.GCAATCA {SEQ ID HO: 1Ô8)

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona processos para o tratamento, a prevenção ou o alivio de um sintoma de um distúrbio relacionado com a imunologia mediante a administração de um anticorpo para huIFNY a um paciente. Por exemplo, os anticorpos para huIFNY utilizam-se para tratar, prevenir ou aliviar um sintoma associado a distúrbios relacionados com a imunidade como Doença de Crohn, lúpus sistémico eritematoso, psoriase, sarcoidose, artrite reumatóide, vasculite, dermatite atópica e esclerose múltipla secundária progressiva. Facultativamente, administra-se ainda ao paciente um segundo agente como, mas não limitado a, uma anticitocina ou um reagente anti-quimiocina que reconhece citocinas como a interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31, e/ou quimiocinas como MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e fractalcina. 7 0 paciente padece de ou apresenta predisposição para desenvolver um distúrbio relacionado com o sistema imunitário, como, por exemplo, uma doença auto-imunitária ou um processo inflamatório.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 evidencia uma série de representações de sequências de nucleótidos e de sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve e variáveis da cadeia pesada dos anticorpos NI-0501 e AC1.2R3P2_A6 para huIFNy. A Figura IA mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada do Nl-0501, e a Figura 1B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura IA. Na Figura 1B as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas. A Figura 1C mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve do Nl-0501, e a Figura 1D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1C. As CDRs estão sublinhadas na Figura 1D. A Figura 1E mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada do AC1.2R3P2_A6, e a Figura 1F representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1E. Na Figura 1F as CDRs estão sublinhadas. A Figura 1G mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve de AC1.2R3P2_A6, e a Figura 1H representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1G. Na Figura 1H as CDRs estão sublinhadas. A Figura 2 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das 8 regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AC1.2R3P2_B4 para huIFNY. A Figura 2A mostra as sequências de nucleótidos que codificam a região variável da cadeia pesada, e a Figura 2B representa as sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de nucleótidos apresentadas na Figura 2A. Na Figura 2B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 2C mostra as sequências de nucleótidos que codificam a região variável da cadeia leve, e a Figura 2D representa as sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de nucleótidos apresentadas na Figura 2C. Na Figura 2D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 3 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.4R4P1_B9 para huIFNy. A Figura 3A mostra as sequências de nucleótidos que codificam a região variável da cadeia pesada, e a Figura 3B representa as sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de nucleótidos apresentadas pela Figura 3A. Na Figura 3B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 3C mostra as sequências de nucleótidos que codificam a região variável da cadeia leve, e a Figura 3D representa a sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de nucleótidos apresentadas na Figura 3C. Na Figura 3D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 4 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.4R4P2_C9 para huIFNy. A Figura 4A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 4B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 4A. Na Figura 4B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 9 4C representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 4D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 4C. Na Figura 4D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 5 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AC1.4R4P2_C10 para huIFNy. A Figura 5A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 5B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 5A. Na Figura 5B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 5C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 5D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 5C. Na Figura 5D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 6 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AC1.2R3P7_D3 para huIFNY. A Figura 6A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 6B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 6A. Na Figura 6B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 6C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 6D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 6C. Na Figura 6D as CDRs estão sublinhadas. 10 A Figura 7 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.2R2P2_D6 para huIFNY. A Figura 7A mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 7B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 7A. Na Figura 7B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 7C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 7D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 7C. Na Figura 7D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 8 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AC1.2R2P2_D8 para huIFNY. A Figura 8A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 8B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 8A. Na Figura 8B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 8C representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 8D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 8C. Na Figura 8D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 9 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.3R3P6_E1 para huIFNY. A Figura 9A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 9B representa a sequência de aminoácidos 11 codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 9A. Na Figura 9B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 9C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 9D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 9C. Na Figura 9D os CDRs estão sublinhados. A Figura 10 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesadas do anticorpo AD1.3R3P5_F8 para huIFNY. A Figura 10A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 10B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 10A. Na Figura 10B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 10C mostra a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 10D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 10C. Na Figura 10D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 11 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.3R3P6_F9 para huIFNY. A Figura 11A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 11B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 11A. Na Figura 11B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 11C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 11D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de 12 nucleótidos apresentada na Figura 11C. Na Figura 11D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 12 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.4R4P2_G7 para huIFNy. A Figura 12A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 12B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 12A. Na Figura 12B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 12C apresenta a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 12D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada pela Figura 12C. Na Figura 12D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 13 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo AD1.1R3P3_G9 para huIFNY. A Figura 13A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 13B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 13A. Na Figura 13B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 13C representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 13D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 13C. Na Figura 13D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 14 consta de uma série de representações das sequências de nucleótidos e das sequências de aminoácidos das regiões variável leve e variável pesada do anticorpo 13 ADI.3R3P6_G10 para huIFNY. A Figura 14A representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia pesada, e a Figura 14B representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 14A. Na Figura 14B as CDRs estão sublinhadas. A Figura 14G representa a sequência de nucleótidos que codifica a região variável da cadeia leve, e a Figura 14D representa a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 14C. Na Figura 14D as CDRs estão sublinhadas. A Figura 15 representa um gráfico que mostra a inibição da expressão dos genes repórter induzida pelo IFNy utilizando extractos periplásmicos contendo scFv. Extractos quantificados contendo scFv inibiram o gene repórter induzido pelo IFNy de um modo dependente da dose. Para cada clone de scFv ensaiaram-se diversas concentrações (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 e 0,011 nM) como se apresenta nas colunas localizadas por cima do nome de cada clone (concentração decrescente da esquerda para a direita, veja também o Quadro 3 que se apresenta a seguir).

Na Figura 16, os Quadros 1-12 representam uma série de gráficos que mostram a inibição da expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy relativamente a células de melanoma utilizando extractos contendo scFv. O scFv totalmente humano purificado inibiu a expressão da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma. Os clones scFv () e o anticorpo monoclonal 16C3 murino anti IFNy humano [mouse anti-human IFNy mAb 16C3] (---) estão representados.

Na Figura 17, os Quadros 1-7 representam uma série de gráficos que mostram a inibição da expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma 14 utilizando extractos contendo scFv que foram reformatados para uma estrutura IgG totalmente humana. Anticorpos monoclonais purificados totalmente IgG inibiram a expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma. Estão representados os clones totalmente IgG (-x-) , o mAb 16C3 murino anti-IFNY humano (-A-) , e ο MAB285 murino_anti-IFNY humano (·) de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). A Figura 18 consiste em um gráfico que representa a afinidade do anticorpo Nl-0501 para huIFNY dirigido ao IFNy humano. A Figura 19 representa um gráfico que compara a actividade de anticorpos gerados por clones de A6 e de Nl--0501 (também denominada na presente invenção como "A6 mutado de volta" (back-mutated) na linha germinal (germline)" ou "A6 mutado de volta"). A Figura 20 consta de um gráfico que representa a actividade do anticorpo Nl-0501 para o huIFNY relativamente ao IFNy humano nativo.

As Figuras 21A-21F representam uma série de gráficos que ilustram a ligação do anticorpo Nl-0501 para o huIFNY com IFNy recombinante proveniente de diversas espécies. A Figura 22 consta de um gráfico que mostra a capacidade do anticorpo Nl-0501 para o huIFNY destinado a neutralizar a regulação positiva ("upregulation") da classe II do MHC induzida por IFNy cinomorfo nativo. 15 A Figura 23 consta de um gráfico que representa a capacidade do anticorpo NI-0501 para o huIFNY bloquear a produção da IP-10 induzida pelo IFNy no sangue completo.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos específicos contra o interferão gama (IFNy) tal como definidos nas reivindicações.

Os anticorpos para o huIFNY são, por exemplo, antagonistas ou inibidores do IFNy que regulam pelo menos uma actividade biológica do IFNy. As actividades biológicas do IFNy incluem, por exemplo, a ligação ao receptor do IFNy (IFNy-R), regulando, por exemplo, reduzindo ou inibindo, a expressão das moléculas de classe II do complexo major de histocompatibilidade (MHC) à superfície das células, e regulando, por exemplo, reduzindo ou inibindo, a proliferação das células. Por exemplo, os anticorpos para o huIFNY inibem totalmente ou parcialmente a actividade do IFNy bloqueando parcialmente ou totalmente a ligação do IFNy e do receptor do IFNy (IFNy-R) . Considera-se que os anticorpos para o IFNy inibem totalmente a actividade do IFNy quando a concentração da actividade do IFNy na presença do anticorpo para o huIFNY é reduzida em pelo menos 95%, por exemplo, em 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em comparação com o nível de actividade do IFNy na ausência de ligação com um anticorpo para o huIFNY descrito na presente invenção. Considera-se que os anticorpos para o IFNy inibem parcialmente a actividade do IFNy quando o nível de actividade dos IFNy na presença do anticorpo para o huIFNY diminui para menos de 95%, por exemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ou 90% em comparação com o nível de actividade do IFNy na ausência de ligação a um anticorpo para o huIFNY descrito na presente invenção. 16

Adicionalmente, os anticorpos para o huIFNY da presente invenção inibem a expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células (ver por exemplo, os Exemplos 4 e 5). Preferivelmente, os anticorpos para o huIFNY exibem uma inibição superior a 50% da expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy na linha de células Me67.8 de melanoma humano em uma concentração de pelo menos 0,02 nM. Por exemplo, os anticorpos exibem uma inibição superior a 50% da expressão de células da classe II do MHC induzida pelo IFNy na linha de células Me67.8 em uma concentração na proporção entre 0,022 nM e 0,044 nM, por exemplo, em uma concentração de 0,022 nM, 0,028 nM ou 0,044 nM.

Os anticorpos para huIFNY regulam uma resposta imunitária em um paciente, por exemplo, em um paciente humano. De preferência, os anticorpos para huIFNY regulam uma resposta imunitária adaptativa em um paciente. Mais preferivelmente, os anticorpos para huIFNY regulam a resposta imunitária celular ou mediada por células, também conhecida como resposta do tipo da de Thl (Células T helper tipo 1) ou mediada por Thl.

Por exemplo, os anticorpos para huIFNY descritos na presente invenção regulam, por exemplo, reduzem, inibem ou previnem uma exagerada resposta imunitária mediada pelas Thl, tal como uma exagerada resposta imunitária mediada pelas Thl associada a um distúrbio auto-imunitário ou inflamatório tal como, por exemplo, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistémico, psoriase, sarcoidose, artrite reumatóide, vasculite, dermatite atópica e esclerose múltipla secundária progressiva. Quando utilizado na presente invenção, o termo "exagerada" na frase resposta imunitária mediada por células Thl refere-se à presença de um elevado nivel de citocinas(s) sintetizadas pelas Thl, tais como IL-2, IL-3, TNF-alfa (TNFa) 17 e IFNy, em um paciente em comparação com o nível de produção de citocinas pelas Thl em um indivíduo que não padece de uma doença ou de um distúrbio associada(o) a uma exagerada resposta imunitária mediada pelas Thl. Para classificar uma resposta imunológica mediada pelas Thl como uma resposta exagerada, avalia-se o nível de uma resposta de produção de citocinas mediada pelas Thl, por exemplo, calculando e analisando a concentração de citocinas segregadas utilizando um ensaio ELISA ou outro.

Os anticorpos para huIFNy descritos na presente invenção regulam, por exemplo, inibem, reduzem ou previnem, a comutação ("switching") de um isotipo da classe IgG, por exemplo comutando a classe induzida pelo IFNy. Esses anticorpos para huIFNY regulam, por exemplo, inibem, previnem ou reduzem uma resposta mediada pelas Thl e, consequentemente, diminuem a comutação induzida pelo IFNy.

Os anticorpos para huIFNy da presente invenção produziram-se por imunização de um animal com IFNy, como por exemplo, IFNy murino ou humano (ver, por exemplo, Genbank N° de Admissão X13274) ou um seu fragmento, derivado ou mutante ("variant") imunogénico. Alternativamente, o animal é imunizado com células transfectadas com um vector contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica o IFNy, tal que o IFNy que é expresso na e acompanha a superfície das células transfectadas. Alternativamente obtêm-se os anticorpos seleccionando uma biblioteca que contém sequências do domínio de ligação do anticorpo ou do antigénio para se ligarem ao IFNy. Essa biblioteca prepara-se, por exemplo, em bacteriófagos por via de fusões de proteínas ou de péptidos na proteína de revestimento do bacteriófago que é expressa na superfície de partículas de fagos formadas e as sequências de 18 ADN codificantes contidas no interior das particulas fágicas (ou seja, "biblioteca apresentada em fagos").

Anticorpos para huIFNY da presente invenção incluem, por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada (CDRs) apresentadas seguidamente no Quadro 1, as CDRs da cadeia leve apresentadas no Quadro 2, e suas associações.

Quadro 1. Sequências da VH provenientes de clones de anticorpos que se ligam ao IFN© e o neutralizam

Nome do clone CDR1 da VH CDR2 da VH CDR3 da VH NI-0501 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5) AC1.2R3P2_A6 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGSSGYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5) AC1.2R3P2 D8 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5) AC1.4R4P2 CIO SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO:5) AC1R3P2 B4 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:1) DHSSGWYVISG*HDV (SEQ ID NO:13) AD14R4P1 B9 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21) ADI.3R3P5_F8 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO:69) ADI.3R3P6_F9 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO:76) AD1.3R3P6 EI SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO:64) AD14R4P2 C9 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) AD14R4P2_G7 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) AD1.1R3P6 G10 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) AD1R2P2 D6 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) AD1.1R3P3 G9 SYAMS (SEQ ID NO:3) AISGSGGSTYYADSVRG (SEQ ID NO:4) DFWVITSGNDY (SEQ ID NO:89) AC1.2R3P7_D3 SNAMS (SEQ ID NO:43) TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO:44) GTELVGGGLDN (SEQ ID NO:45) 19

Quadro2. Sequências da VL provenientes de clones de anticorpos que se ligam ao IFN© e o neutralizam

Nome do clone CDR1 da VL CDR2 da VL CDR3 da VL NI-0501 TRSSGSIASNYV Q (SEQ ID NO:8) EDNQRPS (SEQ ID NO:9) QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10) AC1.2R3P2_A6 TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106) EDNRRPS (SEQ ID NO:107) QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10) AC1.2R3P2_D8 TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 8) EDNQRPS (SEQ ID NO:17) QSYDSMNFWV (SEQ ID NO:61) AC1.4R4P2 CIO TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO: 39) EDNQRPS (SEQ ID NO:17) QSYDNSNHWV (SEQ ID NO:40) AC1R3P2 B4 TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16) EDNQRPS (SEQ ID NO:17) QSNDSDNW (SEQ ID No:18) AD14R4P1 B9 TRSSGSIV SNYV Q (SEQ ID NO:8) DDDQRPS (SEQ ID NO:25) QSYDSSNW (SEQ ID NO:26) AD1.3R3P5 F8 TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72) EDNRRPS (SEQ ID NO:9) QSSDTTYHGGW SEQ ID NO:73) AD1.3R3P6 F9 TRSSGSIASNYV Q (SEQ ID NO: 1 6) EDNQRPS (SEQ ID NO:17) QSYEGF (SEQ ID NO:79) AD1.3R3P6 EI TRSSGYIASSYV Q (SEQ ID NO:8) EDDRRPS (SEQ ID NO:25) QSYDDTTPWV (SEQ ID NO:26) AD14R4P2 C9 TRSGGSIGSYYV Q (SEQ ID NO:32) DDKKRPS (SEQ ID NO:33) QSYDSNNLW (SEQ ID NO:34) ADI 4R4P2 G7 TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84) EDNQRPS (SEQ ID NO:85) QSSDSNRVL (SEQ ID NO:86) ADI 3R3P6_G10 AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97) EDNQRPS (SEQ ID NO:I7) QSYSYNNQW (SEQ ID NO:98) ADI R2P2_D6 TGSSGSIASNYVQ ID NO:55) EDNQRPS (SEQ ID NO:I7) QSYDSSNQEW (SEQ ID NO:56) ADI.1R3P3_G9 TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16) EDNRRPS (SEQ ID NO:9) QSFDSTNLW (SEQ ID NO:92) AC1.2R3P7 D3 TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO: 46) EDNQRPS (SEQ ID NO:17) QSYDSDNHHW (SEQ ID NO:49)

Um anticorpo monoclonal para huIFNY exemplar é o anticorpo NI-0501 descrito na presente invenção. 0 anticorpo NI-0501 é uma versão mutada "de volta" ("back-mutated") do anticorpo AC1.2R3.P2_A6. Quando utilizada na presente invenção, a expressão "back-mutated" refere-se à mutação de um nucleótido ou de um resto de um aminoácido "de volta" para o nucleótido ou para o resto detectado na posição correspondente na sequência da linha germinativa. 0 anticorpo NI-0501 inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID Nq: 2) codificada pela sequência de ácidos nucleicos 20 apresentada em SEQ ID No:l, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID N0:7) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID N0:6 (Figuras 1A-1D).

Os aminoácidos incluídos nas regiões determinantes de complementaridade (CDR) tal como definidas por Chotlia et ai. e E.A. Kabat et al. estão sublinhados nas Figuras 1B e ID. (Ver Chothia, C, et al., Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). As CDRs da cadeia pesada do anticorpo A6 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo A6 apresentam as sequências seguintes: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:8); EDNQRPS (SEQ ID NO:9); e QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10).

Um outro exemplar anticorpo monoclonal para huIFNy é o anticorpo AC1.2R3.P2_A6 ("A6") descrito na presente invenção. 0 anticorpo A6 inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:103) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID No:102, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID No:105) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID No:104 (Figuras 1E-1H). Os aminoácidos que abrangem as regiões determinantes de complementaridade (CDR) como definido por Chothia et ai. e E.A. Kabat et al. estão sublinhados nas Figuras 1F e 1H. (Ver Chothia, C, et al., Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). As CDRs de cadeia pesada do anticorpo A6 apresentam as sequências seguintes: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4), e 21 DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo A6 apresentam as sequências seguintes: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO:106); EDNRRPS (SEQ ID NO:107); e QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10). O anticorpo AC1.2R3P2_B4 (também designado na presente invenção por "B4") inclui uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:12) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:11, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:15) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:14 (Figuras 2A-2D). Os aminoácidos incluídos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas

Figuras 2B e 2D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo B4 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DHSSGWWISGMDV (SEQ ID NO:13). As CDRs da cadeia leve do anticorpo B4 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSNDSDNVV (SEQ ID NO:18). O anticorpo AD1.4R4P1_B9 (também designado na presente invenção por "B9") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:20) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:19, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:23) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:22 (Figuras 3A-3D). Os aminoácidos incluídos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas

Figuras 3B e 3D. As CDRs de cadeia pesada do anticorpo B9 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO:21). As CDRs da cadeia leve do anticorpo B9 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO:8); DDDQRPS (SEQ ID NO:25); e QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26). 22 0 anticorpo AD1.4R4P2_C9 (também designado na presente invenção por "C9") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:28) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:27, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:31) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:30 (Figuras 4A-4D). Os aminoácidos incluídos na CDR tal como definido por Chothia et ai. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 4B e 4D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo C9 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID N0:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0:4); e DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29). As CDRs da cadeia leve do anticorpo C9 apresentam as seguintes sequências: TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO:32); DDKKRPS (SEQ ID NO:33); e QSYDSNNLW (SEQ ID NO:34). 0 anticorpo AC1.4R4P2_C10 (também designado na presente invenção por "CIO") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:36) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:35, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:38) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:37 (Figuras 5A-5D). Os aminoácidos incluídos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 5B e 5D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo CIO apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID N0:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) ; e DGSSGWYVPHWF DP (SEQ ID N0:5). As CDRs da cadeia leve do anticorpo CIO apresentam as seguintes sequências: TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO:39); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSYDNSNHWV (SEQ ID NO:40). O anticorpo AC1.2R3P7_D3 (também designado na presente invenção por "D3") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:42) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:41, e uma região variável 23 da cadeia leve (SEQ ID NO:47) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:46 (Figuras 6A-6D). Os aminoácidos incluidos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 6B e 6D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo D3 apresentam as seguintes sequências: SNAMS (SEQ ID NO:43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO:44); e GTELVGGGLDN (SEQ ID NO:45). As CDRs da cadeia leve do anticorpo D3 apresentam as seguintes sequências: TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO:48); EDNQRPS (SEQ ID NO:17) e QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO:49). O anticorpo AD1.2R2P2_D6 (também designado na presente invenção por "D6") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:51) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:50, e uma região variável da cadeia leve (SEQ TD NO:54) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:53 (Figuras 7A-7D). Os aminoácidos incluidos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et ai., 1991 estão sublinhados nas Figuras 7B e 7D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo D6 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID N0:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) ; e DGWNALGWLE S (SEQ ID NO:29). As CDRs da cadeia leve do anticorpo D6 apresentam as seguintes sequências: TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:55); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO:56). O anticorpo AC1.2R2P2_D8 (também designado na presente invenção por "D8") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 58) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 57, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:60) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:59 (Figuras 8A-8D). Os aminoácidos incluidos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas 24

Figuras 8B e 8D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo D8 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID N0:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) ; e DGSSGWYVPHWF DP (SEQ ID NO:5). As CDRs da cadeia leve do anticorpo D8 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO:8); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSYDSNNFWV (SEQ ID NO:61). O anticorpo AD1.3R3P6_E1 (também designado na presente invenção por "El") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:63) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:62, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 66) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 65 (Figuras 9A a 9D) . Os aminoácidos incluídos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 9B e 9D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo El apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO:64). As CDRs da cadeia leve do anticorpo El apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO:8); DDDQRPS (SEQ ID NO:25); e QSYDSSNVV (SEQ ID NO:26). O anticorpo AD1.3R3P5_F8 (também designado na presente invenção por "F8") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:68) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:67, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 71) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:70 (Figuras 10A--10D) . Os aminoácidos incluídos na CDR como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 10B e 10D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo F8 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo F8 25 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO:72); EDNRRPS (SEQ ID NO:9); e QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO:73). O anticorpo AD1.3R3P6_F9 (também designado na presente invenção por "F9") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:75) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:74, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:78) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:77 (Figuras 11A--11D). Os aminoácidos incluidos na CDR, tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 11B e 11D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo F9 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID N0:4); e GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 7 6) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo F9 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSYEGF (SEQ ID NO:79). 0 anticorpo AD1.4R4P2_G7 (também designado na presente invenção por "G7") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:81) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:80, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:83) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:82 (Figuras 12A--12D). Os aminoácidos incluidos na CDR tal como definido por Chothia et al. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 12B e 12D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo G7 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo G7

apresentam as seguintes sequências: TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84); EDTQRPS (SEQ ID NO:85); e QSSDSNRVL (SEQ ID NO:86). 26 0 anticorpo AD1.1R3P3_G9 (também designado na presente invenção por "G9") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:88) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:87, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:91) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:90 (Figuras 13A--13D). Os aminoácidos incluídos na CDR, tal como definido por Chothia et ai. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 13B e 13D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo G9 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo G9 apresentam as seguintes sequências: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:16); EDNRRPS (SEQ ID NO:9); e QSFDSTNLVV (SEQ ID NO:92). O anticorpo ADI.3R3P6_G10 (também designado na presente invenção por "G10") inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:94) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:93, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:96) codificada pela sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO:95 (Figuras 14A--14D). Os aminoácidos incluídos na CDR, tal como definido por Chothia et ai. 1989, E.A. Kabat et al., 1991 estão sublinhados nas Figuras 14B e 14D. As CDRs da cadeia pesada do anticorpo G10 apresentam as seguintes sequências: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4); e DGWNALGWLES (SEQ ID NO:29) . As CDRs da cadeia leve do anticorpo G10 apresentam as seguintes sequências: AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:97); EDNQRPS (SEQ ID NO:17); e QSYSYNNQW (SEQ ID NO:98).

Os anticorpos para huIFNy da presente invenção abrangem também anticorpos que incluem uma sequência variável de aminoácidos da cadeia pesada que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos das 27 SEQ ID NO: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94, ou 103 (Figuras 1-14) e/ou um aminoácido variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% ou mais idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7, 15, 23, 31 , 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 ou 105 (Figuras 1-14).

Alternativamente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo como por exemplo NI-0501, A6, B4, B9, C9, CIO, D3, D6, D8, El, F8, F9, G7, G9 ou G10.

Salvo indicação em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem manter os significados normalmente aprovados pelos peritos experientes na arte. Além disso, excepto quando expressamente requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir os plurais e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em ligação com, e as técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular, e química e hibridação de proteínas e de oligo- ou de polinucleótidos descritas na presente invenção são as bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na arte. Utilizam-se técnicas convencionais na tecnologia do ADN recombinante, na síntese de oligonucleótidos, e na cultura e transformação de tecidos (por exemplo, electroporação, lipofecção) . As reacções enzimáticas e as técnicas de purificação realizam-se de acordo com as especificações do fabricante ou como vulgarmente realizadas na arte ou como descritas na presente invenção. As técnicas e procedimentos anteriores realizam-se na generalidade de acordo com processos convencionais bem conhecidos na arte e como descritos em diversas referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente memória descritiva. Ver por exemplo, Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a 28 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)) . As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de, quimica analitica, química orgânica de síntese, e química medicinal e farmacêutica que se descrevem na presente invenção são os bem conhecidos e vulgarmente utilizados na arte. Para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, e administração, e tratamento dos doentes utilizam-se técnicas convencionais.

Deve referir-se que quando utilizados de acordo com a descrição da presente invenção, os termos seguintes, a menos que indicados de outro modo, apresentam os seguintes significados:

Quando utilizado na presente invenção, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas de imunoglobulina e a porções activas sob o ponto de vista imunológico de moléculas de imunoglobulinas (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antigénio que se liga especificamente a (imunorreagem com) um antigénio. Tais anticorpos incluem, embora sem carácter limitativo, policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia única, fragmentos Fab, Fab- e F(ab-)2, e uma biblioteca Fab de expressão. A frase "specifically bind" (liga-se especificamente) ou "immunoreacts with" (imunorreage com) significa que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigénicos do antigénio desejado e não reage (isto é, não se liga) com outros polipéptidos ou liga-se em situações de afinidade muito menor (Kd> 10~6) com outros polipéptidos. A unidade estrutural básica de um anticorpo é conhecida por incluir um tetrâmero. Cada tetrâmero é formado por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, possuindo cada par 29 uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma pesada (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos responsável principalmente pelo reconhecimento do antigénio. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante responsável principalmente pela função efectora. As cadeias leves humanas classificam-se como cadeias leves kapa e lambda. As cadeias pesadas classificam-se como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. No interior das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes encontram-se unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. Ver na generalidade, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., et al., 2a ed. Raven Press, NY (1989)) . As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o sitio de ligação do anticorpo. A expressão "anticorpo monoclonal" (MAb) ou "composição de anticorpos monoclonais", quando utilizada na presente invenção, refere-se a um população de moléculas de anticorpos que contêm apenas uma espécie molecular de moléculas de anticorpos constituída por um único produto génico de cadeia leve e um único produto génico de cadeia pesada. Em particular, a regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. Os MAbs contêm um sítio de ligação ao antigénio capaz de imunorreagir com um epitopo específico do antigénio caracterizado por uma afinidade de ligação característica a esse sítio dos MAbs.

Em geral, as moléculas de anticorpos obtidas a partir de seres humanos referem-se a qualquer das classes IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem umas das outras pela natureza da 30 cadeia pesada presente na molécula. Algumas classes apresentam também subclasses, como IgGi, IgG2, e outras. Além disso, no homem, a cadeia leve pode ser uma cadeia kapa ou uma cadeia lambda. A expressão "sitio de ligação ao antigénio" ou "zona de ligação" ("binding portion") refere-se à parte da molécula da imunoglobulina que participa na ligação ao antigénio. O sitio de ligação ao antigénio é formado por restos de aminoácidos das regiões variáveis ("V") do N-terminal das cadeias pesada ("H") e leve ("L"). Três regiões ("stretches") muito diferentes no interior das regiões V das cadeias pesada e leve, designadas "regiões hipervariáveis", interpõem-se entre as regiões flanqueadoras ("flanking stretches") mais protegidas conhecidas como "regiões de framework ou regiões esqueleto" "FRs". Assim, a sigla "FR" refere-se a sequências de aminoácidos que se encontram naturalmente entre, e adjacentes a, regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão colocadas em relação umas às outras em três espaços dimensionais para formar uma superfície de ligação ao antigénio. A superfície de ligação ao antigénio é complementar à superfície tridimensional de um antigénio ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve designam-se por "regiões determinantes de complementaridade", ou "CDRs". A determinação dos aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of immunological interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). 31

Quando utilizado na presente invenção, o termo "epitopo" inclui qualquer determinante em uma proteina capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina, um scFv, ou a um receptor de células T. 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante de uma proteina capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina ou a um receptor de células T. Os determinantes epitópicos consistem normalmente em agrupamentos de moléculas da superfície activas sob o ponto de vista quimico como cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcares e apresentam geralmente caracteristicas estruturais tridimensionais especificas, bem como carga especifica caracteristica. Considera-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando a dissociação constante é ^ 1 μΜ; de preferência < 100 nM e ainda mais preferivelmente < 10 nM.

Quando utilizadas na presente invenção, as expressões "ligação imunológica" e "propriedades de ligação imunológica" referem-se a interacções não covalentes do tipo das que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antigénio para o qual a imunoglobulina é especifica. A força, ou a afinidade das interacções de ligações imunológicas pode expressar-se em termos da constante de dissociação (Kd) da interacção, em que uma Kd menor representa uma maior afinidade. As propriedades da ligação imunológica dos polipéptidos escolhidos quantificam-se utilizando processos bem conhecidos na arte. Um tal processo impõe a avaliação das taxas de formação do complexo sitio de ligação ao antigénio/antigénio e de dissociação, dependendo essas taxas das concentrações dos intervenientes no complexo, da afinidade da interacção, e dos parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa em ambas as direcções. Assim, pode determinar-se tanto a "constante da taxa de associação" (Kon) como a "constante da taxa de dissociação" (K0ff) mediante o cálculo das concentrações e das taxas reais de 32 associação e de dissociação. (Ver Nature 361:186-87 (1993)). A proporção entre K0ff/K0n permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados com a afinidade, e é igual à constante de dissociação Kd. (Ver, em geral, Davies et ai. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Um anticorpo da presente invenção considera-se que se liga especificamente a um epitopo do IFNy quando a constante de ligação de equilíbrio (Kd) é ^ 1 μΜ, de preferência ^ 100 nM, mais preferencialmente ^ 10 nM, sendo mais preferencialmente entre ^ 100 pM e cerca de 1 pM, tal como medido por ensaios tais como ensaios de ligação a radioligantes ou a ensaios similares que os peritos na especialidade conhecem.

Os peritos na especialidade poderão confirmar que é possível determinar, sem ensaios excessivos, se um anticorpo monoclonal humano tem a mesma especificidade que um anticorpo monoclonal humano da presente invenção (por exemplo, o anticorpo monoclonal NI-0501, A6, B4, B9, C9, CIO, D3, D6, D8, El, F8, F9, G7, G9 ou G10) demonstrando se o primeiro impede o último de se ligar a um polipéptido antigénico IFNy. Se o anticorpo monoclonal humano a ensaiar compete com um anticorpo monoclonal humano da presente invenção, como indicado por uma diminuição na ligação mediada pelo anticorpo monoclonal humano da presente invenção, então os dois anticorpos monoclonais ligam-se ao mesmo epitopo, ou a um outro muito semelhante Um outro modo de determinar se um anticorpo monoclonal humano tem a especificidade de um anticorpo monoclonal humano da presente invenção consiste em pré-incubar o anticorpo monoclonal humano da presente invenção com o polipéptido antigénico IFNy com o qual reage normalmente, e adicionar-se depois o anticorpo monoclonal humano a ensaiar para determinar se o anticorpo monoclonal humano a ensaiar é inibido na sua capacidade de se ligar ao polipéptido antigénico IFNy. Se o anticorpo monoclonal humano 33 a ensaiar é inibido então, com toda a probabilidade, tem a mesma especificidade epitópica, ou equivalente, sob o ponto de vista funcional, que o anticorpo monoclonal da presente invenção.

Para a produção dos anticorpos monoclonais dirigidos contra uma proteina tal como uma proteína IFNy, ou contra seus derivados, fragmentos, homólogos análogos ou ortólogos utilizam-se diversos métodos conhecidos na especialidade. (Ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, e Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, citado na presente invenção a título de referência). Anticorpos totalmente humanos são moléculas de anticorpos em que a sequência completa de ambas a cadeia leve e a cadeia pesada, incluindo as CDRs, surgem dos genes humanos. Tais anticorpos designam-se na presente invenção "anticorpos humanos", ou "anticorpos totalmente humanos". Os anticorpos monoclonais humanos preparam-se, por exemplo, utilizando os métodos descritos nos Exemplos apresentados seguidamente. Os anticorpos monoclonais humanos podem também preparar-se utilizando a técnica com triomas, a técnica do hibridoma utilizando células B humanas (ver Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72), e a técnica do hibridoma-EBV (vírus Epstein-Barr) para produzir anticorpos monoclonais humanos (ver Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96). Os anticorpos monoclonais humanos podem utilizar-se e podem produzir-se utilizando hibridomas humanos (ver Cote, et al., 1983 Proc

Natl Acad Sei USA 80:202 6-2030) ou por transformação de células B humanas com vírus de Epstein Barr in vitro (ver Cole, et al., 1985 In:. MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96). 34

Os anticorpos purificam-se por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade utilizando a proteína A ou a proteína G, que fornecem principalmente a fracção da IgG do soro imunitário. Subsequentemente, ou alternativamente, pode imobilizar-se o antigénio específico, que é o alvo da imunoglobulina procurada, ou um seu epitopo, em uma coluna para purificar o anticorpo imunitário específico por cromatografia de imunoafinidade. A purificação de imunoglobulinas é discutida, por exemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado pelo The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14., No. 8 (Abril 17,2000), pp 25-28). É desejável modificar o anticorpo da presente invenção a respeito da função efectora, de modo a aumentar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de doenças relacionadas com a imunidade. Por exemplo, na região Fc podem introduzir--se restos de cisterna, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade melhorada de internalização e/ou aumento da morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). [Ver Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]. Alternativamente pode conceber-se pela aplicação de técnicas de engenharia genética um anticorpo que apresenta duas regiões Fc e pode assim exibir capacidades de lise melhorada mediada pelo complemento e de ADCC. (Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:. 219-230 (1989)). A presente invenção inclui também fragmentos Fv, Fab, Fab^ e F(ab' j 2 do huIFNy, anticorpos de cadeia simples para o huIFNy, anticorpos biespecíficos para o huIFNy e anticorpos heteroconjugados para o huIFNY. 35

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que apresentam especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No caso presente, uma das especificidades de ligação é para o IFNy. 0 segundo alvo de ligação é qualquer outro antigénio, e vantajosamente é uma proteína da superfície celular ou um receptor ou uma subunidade do receptor.

Os processos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante dos anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeias pesadas/cadeias leves da imunoglobulina, em situações em que as duas cadeias pesadas apresentam especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à variedade aleatória das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma apresenta a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta realiza-se normalmente por fases de cromatografia de afinidade. Na Patente de invenção internacional WO 93/08829 publicada em 13 de Maio de 1993, e em Traunecker et ai., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) descrevem-se procedimentos semelhantes.

Domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de associação anticorpo-antigé-nio) podem fundir-se com sequências do domínio constante da imunoglobulina. A fusão é de preferência com um domínio constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões charneira, CH2, e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) que contém o sítio necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNA que 36 codificam as fusões das cadeias pesadas das imunoglobulinas e, se desejado, da cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados, e são co-trans-fectados para um organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes de gerar os anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com uma outra abordagem descrita na Patente de invenção internacional WO 96/27011, o interface entre um par de moléculas de um anticorpo pode ser concebido pela aplicação de técnicas de engenharia genética para maximizar a percentagem de heterodimeros que se recuperam a partir de uma cultura de células recombinantes. O interface preferido compreende pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante do anticorpo. Nesse processo, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos provenientes do interface da molécula do primeiro anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao das cadeias laterais maiores são geradas sobre o interface da segunda molécula do anticorpo mediante a substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos podem preparar-se como anticorpos completos ("full length") ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos têm sido descritas na bibliografia. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem preparar-se 37 utilizando uma ligação química. Brennan et ai., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que os anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2· Esses fragmentos são reduzidos na presença do arsenito de sódio agente complexante do ditiol para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfuretos intermoleculares. Os fragmentos Fab' gerados convertem-se depois em derivados de tionitrobenzoatos (TNB). Em seguida um dos derivados Fab'-TNB converte-se novamente em Fab'-tiol mediante redução com mercaptoetilamina e mistura-se com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem utilizar-se como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Adicionalmente, os fragmentos Fab' podem recuperar-se directamente a partir da E. coli e acoplarem-se quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de um anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente a partir da E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como desencadear a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos tumorais mamários humanos. Têm sido descritas diversas técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos directamente a partir de culturas de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecíficos utilizando zíperes (fechos de correr) de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 38 148 (5):1547-1553 (1992). Os péptidos zíperes de leucina das proteínas Fos e Jun ligaram-se às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e seguidamente oxidaram-se novamente para formar os heterodímeros de anticorpos. Esse processo pode também utilizar-se para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia "diabody", descrita por Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:6444-6448 (1993), proporcionou um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios complementares VL e VH de um outro fragmento, formando desse modo dois sítios de ligação ao antigénio. Tem-se referido também uma outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos mediante a utilização de dímeros de cadeia simples Fv (sFv). Ver, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Os anticorpos com mais de duas valências são considerados. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Os anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epitopos diferentes, pelo menos um dos quais tem origem na proteína do IFNy. Alternativamente, um braço anti-antigé-nico de uma molécula de imunoglobulina pode associar-se a um braço que se liga a uma molécula de activação ("triggering") localizada em um leucócito como uma molécula receptora de células T (por exemplo, CD2, IFNy, CD28, ou B7), ou receptores de Fc para IgG (FcyR) , tais como FcyyRI (CD64), 39

FcyRII (IFNy2) e FcyRIII (CD16) de modo a focar os mecanismos de defesa celular para a célula que expressa o antigénio específico. Os anticorpos biespecíficos podem também utilizar-se para dirigir agentes citotóxicos contra células que expressam um antigénio específico. Esses anticorpos possuem um braço de ligação ao antigénio e um braço que se liga a um agente citotóxico ou a um quelante que contém um radionuclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, ou TETA. Um outro anticorpo biespecífico de interesse liga-se ao antigénio proteico descrito na presente invenção e liga-se ainda ao factor tecidular (TF) .

Os anticorpos heteroconjugados são também abrangidos pelo âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos associados de um modo covalente. Sugeriu-se que esses anticorpos tivessem, por exemplo, como alvo células do sistema imunitário contra células indesejadas (Patente de invenção norte-americana N° 4 676 980), e o tratamento da infecção por HIV (Patentes de invenção internacional WO 91/00360 e WO 92/200373, e Patente de invenção europeia EP 03 089). Considera-se que os anticorpos podem preparar-se in vitro utilizando processos conhecidos em química de síntese de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, podem construir-se imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para essa finalidade incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os descritos, por exemplo, na Patente de invenção norte-americana N° 4 676 980. A descrição refere-se também a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como uma toxina (por exemplo, uma toxina activa sob o 40 ponto de vista enzimático de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).

Toxinas activas sob o ponto de vista enzimático e seus fragmentos que se podem utilizar incluem cadeia difteria A, fragmentos activos não ligantes da toxina da difteria, cadeia de exotoxina A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricino A, cadeia de abrin A, cadeia de modeccin A, alfa--sarcin, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcin, crotin, inibidor da saponaria officinalis, gelonina, mitogellin, restrictocin, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma diversidade de radionuclideos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bí, 131i, 131in, 90Y, e 18 6Re .

Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são produzidos utilizando uma diversidade de agentes de acoplamento a proteínas bifuncionais tal como N-succinimidil--3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT) , derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeidos (como glutaraldeido) , compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazóniobenzoil)--etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bi-activados (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma imunotoxina de ricino pode preparar-se como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). 0 ácido 1-isotiocia-natobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado com o carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a 41 conjugação de radionuclídeos ao anticorpo. (Ver Patente de invenção internacional WO94/11026).

Os peritos experientes na arte reconhecerão que se pode acoplar uma grande diversidade de radicais possíveis aos anticorpos resultantes ou a outras moléculas da presente invenção. (Ver, por exemplo, "Conjugates Vaccines", Contributions to Microbiology and Imunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989). 0 acoplamento realiza-se mediante qualquer reacção química que ligue as duas moléculas desde que o anticorpo e o outro radical conservem as suas respectivas actividades. Essa ligação pode incluir muitos mecanismos químicos, como por exemplo ligação covalente, ligação de afinidade, intercalação, ligação de coordenação e complexação. A ligação preferida é, no entanto, a ligação covalente. A ligação covalente consegue-se quer por condensação directa de cadeias laterais existentes quer pela incorporação de moléculas ponte externas. Muitos agentes de ligação bivalentes ou polivalentes são úteis em moléculas de acoplamento de proteínas, tal como os anticorpos da presente invenção, a outras moléculas. Por exemplo, agentes de acoplamento representativos podem incluir compostos orgânicos, tais como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, di-isocianatos, glutaraldeído, diazobenzenos e diaminas hexametileno. Essa lista não pretende ser exaustiva das várias classes de agentes de acoplamento conhecidos na arte, mas, em vez disso, é exemplar dos agentes de acoplamento mais comuns. (Ver Killen e Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); e Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987). Os linkers preferidos estão descritos na bibliografia. (Ver, por exemplo, Ramakrishnan, S. et al., Câncer Res. 44:201-208 42

(1984) que descrevem a utilização de MBS (éster da M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Ver também, a Patente de invenção norte-americana No. 5 030 719, que descreve a utilização de derivados de acetil hidrazida halogenados acoplados a um anticorpo sob a forma de um linker oligopeptidico. Linkers especialmente preferidos incluem: (i) EDC (l-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem Co. , Cat #21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamide]hexanoato (Pierce Chem Co. Cat #2165-G); e (v) sulfo-NHS (N-hidro-xistilfo-succinimida: Pierce Chem Co., Cat #24510) conjugada com EDC.

Os linkers descritos antes contêm componentes que possuem atributos diferentes, conduzindo assim a conjugados com diferentes propriedades físico-quimicas. Por exemplo, ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo são mais estáveis do que ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Linkers contendo éster-NHS são menos solúveis do que ésteres sulfo-NHS. Além disso, o linker SMPT contém uma ligação dissulfureto estericamente impedida, e pode formar conjugados com maior estabilidade. As ligações dissulfureto, são em geral, menos estáveis do que outras ligações porque a ligação dissulfureto é clivada in vitro, originando conjugados menos eficazes. Sulfo-NHS, em particular, pode melhorar a estabilidade dos acoplamentos com carbodimida. Os acoplamentos com carbodimida (tais como EDC), quando utilizados em conjunto com sulfo-NHS, formam ésteres que são mais resistentes à hidrólise do que a reacção de acoplamento com carbodimida apenas. 43 A expressão "polinucleótido isolado" quando utilizada na presente invenção significará um polinucleótido de origem genómica, cDNA, ou de sintese ou algumas suas associações, o qual em virtude da sua origem de "polinucleótido isolado" (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleótido em que o "polinucleótido isolado" se encontra na natureza, (2) se liga de um modo funcional ("operably linked") a uma polinucleótido que na natureza não está ligado, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. A expressão "proteina isolada" referida na presente invenção significa uma proteina de cDNA, RNA recombinante ou de origem sintética ou alguma associação desses significados, que em virtude de sua origem ou fonte de derivação, a "proteina isolada" (1) não está associada a proteínas que ocorrem na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, livres de proteínas marinhas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. 0 termo "polipéptido" utiliza-se na presente invenção como um termo genérico para referir-se a proteínas nativas, fragmentos, ou análogos de uma sequência de polipéptidos. Portanto, fragmentos de proteínas nativas e análogos são espécies do género polipéptido. Polipéptidos preferidos de acordo com a presente invenção compreendem as moléculas de imunoglobulinas humanas de cadeias pesadas representadas pelas Figuras 1B, 2B, 3B e 4B e as moléculas de imunoglobulinas humanas de cadeias leves representadas pelas figuras 1D, 2D, 3D e 4D, bem como moléculas de anticorpos formadas por associações que compreendem as moléculas de imunoglobulinas de cadeias pesadas com as moléculas de imunoglobulina de cadeias leves, como moléculas de 44 imunoglobulinas de cadeias leves kapa, e vice-versa, bem como fragmentos e seus análogos. A expressão "que ocorre de um modo natural" quando utilizada na presente invenção como adaptada a um alvo refere-se ao facto de que esse alvo pode ocorrer na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptidos ou de polinucleótidos que está presente em um organismo (incluindo virus) que se pode isolar a partir de uma fonte natural e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ou caso contrário ocorre naturalmente. A expressão "ligado de um modo funcional" ("operably linked") quando utilizada na presente invenção refere-se a posições em que se encontram os componentes assim descritos em uma ligação que lhes permita actuar através da forma pretendida. Uma sequência de controlo "ligada de um modo funcional" a uma sequência de codificação liga-se de tal forma que a expressão da sequência de codificação se obtém sob condições compatíveis com as sequências de controlo. A expressão "sequência de controlo", quando utilizada na presente invenção, refere-se a sequências de polinucleótidos que são necessárias para levar a cabo a expressão e processamento de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo depende do organismo hospedeiro em procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente um sítio promotor, de ligação ribossomal, e uma sequência de terminação da transcrição em eucariotas, geralmente, incluindo tais sequências de controlo promotoras e uma sequência de terminação da transcrição. A expressão "sequências de controlo" destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, podendo incluir também componentes 45 adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências lider e sequências parceiras de fusão. 0 termo "polinucleótido" quando referido na presente invenção significa um material polimérico de boro em nucleótidos de pelo menos 10 bases de comprimento, quer ribonucleótidos quer desoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. 0 termo inclui formas de DNA de fitas simples e duplas. O termo oligonucleótidos referido na presente invenção inclui nucleótidos naturais, e modificados ligados entre si por ligações oligonucleotídicas que eventualmente ocorrem naturalmente. Os oligonucleótidos são um subconjunto de polinucleótidos que geralmente apresentam um comprimento de 200 bases ou menos. De preferência os oligonucleótidos exibem 10 a 60 bases de comprimento e na maioria de preferência 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são geralmente de cadeia simples, por exemplo, para sondas, embora os oligonucleótidos possam ser de cadeia dupla, por exemplo, para utilização na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos da presente invenção são oligonucleótidos sense ou anti-sense. A expressão "nucleótidos que ocorrem naturalmente" referida na presente invenção inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. A expressão "nucleótidos modificados" referida na presente invenção inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. A expressão "Ligações dos oligonucleótidos" referida na presente invenção inclui ligações de oligonucleótidos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato, e semelhantes. Ver, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986), Stec et al. J. Am. Chem. 46

Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Câncer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides e Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de invenção norte-americana N° 5 151 510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviewes 90:543 (1990). Um oligonucleótido pode incluir um "label" de detecção, se desejado.

Pela expressão "hibridizar de um modo selectivo" referida na presente invenção entende-se ligar-se de um modo detectável e especificamente. Polinucleótidos; oligonucleótidos e seus fragmentos de acordo com a presente invenção hibridizam selectivamente com tiras de ácidos nucleicos sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Para alcançar condições de hibridação selectivas como conhecidas na arte e discutidas na presente invenção podem utilizar-se condições de elevado rigor. Geralmente, a homologia das sequências de ácido nucleico entre os polinucleótidos, oligonucleótidos, e fragmentos da presente invenção e uma sequência de ácido nucleico de interesse será de pelo menos 80%, e mais caracteristicamente com homologias preferencialmente crescentes de pelo menos 85%, 90%, 95%, 99% e 100%. Duas sequências de aminoácidos são homólogas quando existe uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, homologia de 85% significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências são alinhadas para a correspondência máxima. Aos "gaps" (em qualquer das duas sequências a corresponderem) permite-se pela maximização da correspondência comprimentos de 5 ou menos ou sendo os mais preferidos de 2 ou menos. Alternativamente e de preferência, duas sequências de proteínas (ou sequências polipeptídicas 47 delas provenientes de pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, tal como esse termo é utilizado na presente invenção, se as mesmas apresentam uma pontuação de alinhamento em mais de 5 (em unidades de desvio padrão) , usando o programa ALIGN com a matriz dos dados de mutação e uma penalidade de gap de 6 ou superior. Veja Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pág. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Rsearch Foundation (1972)) e Supplement 2 a esse volume, pág. 1-10. As duas sequências ou suas partes são preferivelmente mais homólogas se os seus aminoácidos idênticos são maiores ou iguais a 50% quando muito favoravelmente alinhados utilizando o programa ALIGN. A expressão "corresponde a" utiliza-se na presente invenção para significar que uma sequência polinucleotídica é homóloga (isto é, é idêntica, não estritamente relacionada evolutivamente) para o todo ou uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência, ou que uma sequência polipeptídica é idêntica a uma sequência polipeptídica de referência. Em contraposição, o termo "complementar" utiliza--se na presente invenção para significar que a sequência complementar é homóloga de toda ou de uma porção de uma sequência polinucleotídica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotídica "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar de uma sequência de referência "GTATA".

As expressões seguintes utilizam-se para descrever as relações das sequências entre duas ou mais sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade da sequência", "percentagem da identidade da sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para uma comparação com a sequência; a sequência de referência pode ser um subconjunto 48 de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de uma sequência de ADNc em toda a extensão ou de genes indicada em uma listagem de sequências ou pode compreender uma sequência de ADNc completa ou de genes. Geralmente, uma sequência de referência apresenta pelo menos 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos, 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos de comprimento, emais frequente pelo menos 48 nucleótidos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que dois polinucleótidos ou sequências de aminoácidos podem, cada uma (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção do polinucleótido completo ou sequência de aminoácidos) que é similar entre as duas moléculas, e (2) pode ainda compreender uma sequência que é divergente entre os dois polinucleótidos ou sequências de aminoácidos, comparações de sequência entre duas (ou mais) moléculas realizam-se de um modo caracteristico comparando sequências das duas moléculas através de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", quando utilizada na presente invenção, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 18 posições contíguas de nucleótidos ou de 6 aminoácidos, em que uma sequência polinucleotídica ou uma sequência de aminoácidos pode comparar-se a uma sequência de referência de pelo menos 18 nucleótidos contíguos ou 6 sequências de aminoácidos e em que a porção da sequência polinucleotídica na janela de comparação pode incluir adições, deleções, substituições, e similares (isto é, "gaps") de 2 0 por cento ou menos em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento perfeito das duas sequências. O alinhamento perfeito das sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento da homologia de Needleman e Wunsch 49 J. Mol. Biol 48:443 (1970), pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package release 7,0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), Geneworks ou MacVector software packages), ou por inspecção, e selecciona-se o melhor alinhamento (isto é, resultando em maior percentagem de homologia ao longo da janela de comparação) gerado pelos vários processos. A expressão "identidade da sequência" significa que duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos são idênticas (isto é, em uma base nucleótido-a-nucleótido ou resto a resto) através da janela de comparação. A expressão "percentagem da identidade da sequência" calcula-se comparando duas sequências perfeitamente alinhados através da janela de comparação, determinando o número de posições em que ocorre a base de ácido nucleico (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou de restos idêntica em ambas as sequências para se obter o número de posições correspondentes ("matched"), dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para se obter a percentagem da identidade da sequência. A expressão "identidade substancial" quando utilizada na presente invenção significa uma caracteristica de uma sequência de ou de aminoácidos, em que a sequência de polinucleótidos ou de aminoácidos compreende uma sequência que apresenta pelo menos 85 por cento de identidade da sequência, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade da sequência, mais vulgarmente 99 por cento de identidade da sequência quando em comparação com uma sequência de referência através de uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleótidos 50 (6 aminoácidos), frequentemente através de uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleótidos (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade da sequência calcula-se comparando a sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência através da janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior.

Quando utilizados na presente invenção, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Estereoisómeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tal como aminoácidos a,a-dissubstituídos, aminoácidos N-alquilicos, ácido láctico, e outros aminoácidos não convencionais podem ser componentes igualmente adequados para polipéptidos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4 hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-forniilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação dos polipéptidos utilizada na presente invenção, a direcção para a esquerda é a direcção do amino-terminal e a direcção para a direita é a direcção do carboxi-terminal, de acordo com a utilização modelo e a convenção.

Da mesma forma, salvo disposição em contrário, a extremidade esquerda das sequências de polinucleótidos de cadeia simples é a extremidade 5' a direcção esquerda das sequências de polinucleótidos de cadeia dupla é referida como 51 a direcção 5'. A direcção da adição de 5' para 3' de transcritos de RNA nascente é referida como as regiões de sequências da direcção de transcrição na cadeia do DNA que exibe a mesma sequência do RNA e que são 5' para a extremidade 5' do transcrito do RNA são referidas como "sequências a montante", regiões de sequências na cadeia de DNA que têm a mesma sequência do RNA e as quais são 3' para a extremidade 3'do transcrito de RNA são referidas como "sequências a jusante".

Quando aplicada a polipéptidos, a expressão "identidade substancial" significa que duas sequências de péptidos que, quando alinhados de forma ideal, como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos gap por omissão, compartilham pelo menos 80 por cento da identidade da sequência, de preferência pelo menos 90 por cento de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 por cento da identidade da sequência

De preferência, posições de restos que não são idênticos diferem por substituições em aminoácidos conservativos.

Substituições conservativas de aminoácidos referem-se a permutabilidade de restos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é constituído por glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é constituído por serina e treonina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais que contêm amidas é constituído por asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais aromáticas é a fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias 52 laterais básicas é constituído por lisina, arginina, e histidina; e um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais que contêm enxofre é constituído por cisterna e metionina. Grupos preferidos de substituição conservativa de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutâmico-aspártico, e asparagina-glutamina.

Tal como discutido na presente invenção, variações minor nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou de moléculas de imunoglobulinas consideram-se como estando englobadas na presente invenção, desde que as variações nas sequências de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95%, e mais preferivelmente 99%. Em particular, consideram-se substituições conservativas de aminoácidos. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Aminoácidos codificados sob o ponto de vista genético estão geralmente divididos em famílias: (1) aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato, (2) aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina, (3) aminoácidos não polares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, e (4) aminoácidos polares sem carga são glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Os aminoácidos hidrofílicos incluem arginina asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina, e treonina. Os aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Outras famílias de aminoácidos incluem (i) serina e treonina, que constituem a família alifática-hidroxi; (ii) asparagina e glutamina, que constituem a família que contém amida, (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que constituem a família alifática; e 53 (iv) fenilalanina, triptofano, e tirosina, que constituem a família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição semelhante de um aminoácido por outro aminoácido relacionado sob o ponto de vista estrutural não exercerá um efeito major sobre a ligação ou as propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido em um sítio framework. Se uma alteração de aminoácidos originar um péptido funcional pode determinar-se facilmente mediante ensaio da actividade específica do derivado polipeptídico. Na presente invenção descrevem-se s ensaios em detalhe. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou de moléculas de imunoglobulinas podem ser preparados facilmente pelos peritos experientes na arte. Amino- e carboxi-terminais preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites ("boundaries") dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem identificar-se por comparação dos dados das sequências de nucleótidos e/ou de aminoácidos com as bases de dados das sequências públicas ou de marcas comerciais ("proprietary") De preferência, utilizam-se os métodos de comparação computadorizados para identificar "sequence motifs" (padrões para proteínas de estrutura primária) ou domínios de conformação de proteínas previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou de função conhecida(s). Conhecem-se métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram adoptando uma estrutura tridimensional conhecida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Assim, os exemplos precedentes demonstram que os peritos na arte podem reconhecer "sequence motifs" e conformações estruturais que se podem utilizar para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a presente invenção. 54

As substituições preferidas de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteraram a afinidade de liqação para a formação de complexos com proteínas, (4) alteram as afinidades de ligação, e (5) conferem ou modificam outras propriedades funcionais fisico-quimicas ou propriedades funcionais desses análogos. Os análogos podem incluir diversas muteinas de uma sequência muito diferente da sequência de péptidos que ocorre naturalmente. Por exemplo, podem realizar-se substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (de preferência substituições conservativas de aminoácidos) na sequência que ocorre naturalmente (de preferência na porção do polipéptido fora do(s) dominio(s) que formam contactos intermoleculares. Uma substituição conservativa de aminoácidos não deve alterar no essencial as características estruturais da sequência precursora (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve ter tendência para quebrar uma hélice que ocorra na sequência precursora, ou destruir outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência precursora). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptídicas reconhecidas na arte são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991). A expressão "fragmento de polipéptido" quando utilizada na presente invenção refere-se a um polipéptido que apresenta uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal, mas onde a restante sequência de aminoácidos é idêntica à das posições correspondentes na sequência deduzida de ocorrência natural, por exemplo, a partir de uma sequência de cDNA de comprimento total. De um modo característico os fragmentos são pelo menos 55 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos longos, preferivelmente pelo menos 14 aminoácidos longos, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos longos, normalmente pelo menos 50 aminoácidos longos, e ainda mais preferencialmente pelo menos 70 aminoácidos longos. O termo "análogo" quando utilizado na presente invenção refere-se a polipéptidos que constam de um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que apresentam identidade considerável em relação a uma porção de uma sequência de aminoácidos deduzida e que tem, pelo menos, uma das seguintes propriedades: (1) ligação especifica ao IFNy, sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade para bloquear a ligação apropriada ao IFNy, ou (3) capacidade para inibir o crescimento de células que expressam o IFNy in vitro ou in vivo. De um modo caracteristico, os análogos de polipéptidos compreendem uma substituição conservativa de aminoácidos (ou adição ou deleção) a respeito da sequência de ocorrência natural. Os análogos são de um modo caracteristico pelo menos 20 aminoácidos longos, preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos longos ou mais longos, podendo muitas vezes ser tão longos como um polipéptido de ocorrência natural.

Os péptidos análogos são comummente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não-peptídicos com propriedades análogas às do péptido modelo ("template"). Esses tipos de compostos não-peptídicos denominam-se "péptidos miméticos" (peptide mimetics ou peptidomimetics). Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber e Freidinger TINS p.392 (1955); e Evans et al. J. Med. Chem 30:1229 (1987). Esses compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio da modelagem molecular computorizada. Os péptidos miméticos que são estruturalmente similares aos péptidos úteis sob o ponto de vista terapêutico podem utilizar-se para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente 56 semelhantes a um polipéptido paradigma (isto é, um polipéptido que apresenta uma propriedade bioquímica ou uma actividade farmacológica) , tal como um anticorpo humano, mas que apresentam uma ou mais ligações peptidicas eventualmente substituídas por uma ligação escolhida no grupo constituído por: -CH2nh-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans) , -COCH2-, CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na arte. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode utilizar-se para gerar péptidos mais estáveis. Além disso, péptidos restringidos que compreendem uma variação na sequência de consenso ou na sequência de consenso essencialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na arte (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por exemplo, pela adição de restos internos de cisteina capazes de formarem pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. 0 termo "agente" utiliza-se na presente invenção para significar um composto quimico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extracto proveniente de materiais biológicos.

Quando utilizado na presente invenção, o termo "marcador" ou "marcado" refere-se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, por incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipéptido de radicais biotinilados que podem ser detectados por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que se pode detectar por métodos ópticos ou calorimétricos). Em determinadas situações, o marcador ("label" ou "marker") pode também ser terapêutico. Na arte conhecem-se e podem utilizar-se vários métodos de marcação com polipéptidos e glicoproteínas. 57

Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, embora sem carácter limitativo, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 11:LIn, 125j^ 131i) , marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescente, grupos biotinilo, epitopos polipeptidicos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de ziperes de leucina, sitios de ligação para anticorpos secundários, dominios de ligação a metais, "tags" epitopos). Em algumas formas de realização, os marcadores ligam-se por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. A expressão "agente (agente ou drug) farmacêutico" quando utilizada na presente invenção refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando se administra adequadamente a um paciente.

Na presente invenção utilizam-se outros termos químicos de acordo com a utilização convencional na arte, como exemplificado pelo McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). A expressão "agente antineoplásico" utiliza-se na presente invenção para referir agentes que têm a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou a progressão de uma neoplasia em um ser humano, especialmente uma lesão maligna (cancerosa), como carcinoma, sarcoma, linfoma, ou leucemia. A inibição das metástases é frequentemente uma propriedade dos agentes antineoplásicos.

Quando utilizada na presente invenção, a expressão "realmente pura" significa que uma espécie objecto é a 58 espécie presente predominante (isto é, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) , e de preferência uma fracção realmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) da espécie macromolecular presentes.

Geralmente, uma composição realmente pura compreenderá mais do que aproximadamente 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferivelmente mais do que aproximadamente 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferivelmente, purifica-se a espécie objecto até à homogeneidade essencial (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. O termo paciente inclui seres humanos e veterinária. O termo indivíduo inclui seres humanos e outros mamíferos.

ANTICORPOS HUMANOS e HUMANIZAÇÃO de ANTICORPOS

Um anticorpo huIFNY é gerado, por exemplo, utilizando os procedimentos descritos nos exemplos fornecidos seguidamente. Um anticorpo IgG para o huIFNy é gerado, por exemplo, através da conversão de um clone de scFv em formato IgG (ver, por exemplo, o Exemplo 6) . Alternativamente, desenvolve-se esse anticorpo huIFNy, por exemplo, utilizando métodos de exibição de fagos ("phage-display methods") recorrendo a anticorpos que contêm apenas sequências humanas. Essas abordagens são bem conhecidas na arte, por exemplo, em W092/01047 e Patente de invenção norte-americana N° 6 521 404, que se incorporam na presente invenção a título de referência. Nessa abordagem, uma biblioteca combinatória de fagos que transportam pares 59 aleatórios de cadeias leves e pesadas são seleccionados utilizando uma fonte natural ou recombinante do IFNy ou seus fragmentos.

Um anticorpo para o huIFNY é produzido por um processo em que pelo menos uma fase do processo inclui a imunização de um animal não-humano transgénico, com a proteina IFNy humana. Alguns dos loci das cadeias endógenas pesadas e/ou leves kapa desse animal não-humano xenogénico foram desactivados e são incapazes do rearranjo necessário para gerar genes que codificam imunoglobulinas em resposta a um antigénio. Além disso, pelo menos, um locus humano da cadeia pesada e pelo menos um locus humano da cadeia leve foram transfectados de um modo estável no animal. Assim, em resposta a um antigénio administrado, os loci humanos rearranjados para fornecerem genes que codificam regiões variáveis humanas imunoespecificas para o antigénio. Após a imunização, por conseguinte, o xeno murganho produz as células B que segregam imunoglobulinas totalmente humanas.

Na arte conhece-se bem uma diversidade de técnicas para a produção de animais não-humanos xenogénicos. Por exemplo, ver as Patente de invenção norte-americanas Nos 6 075 181 e 6 150 584. Mediante uma estratégia, introduzem-se genes de imunoglobulina xenogénicos (humanos) de cadeias pesadas e leves na linha germinal do hospedeiro (por exemplo, esperma ou oócitos) e, em fases separadas, os genes hospedeiros correspondentes tornam-se não funcionais por inactivação utilizando recombinação homóloga. Os genes de imunoglobulinas humanas de cadeias pesadas e leves são reconstruídos em um microrganismo apropriado eucariótico ou procariótico, e os fragmentos de DNA resultantes são introduzidos no hospedeiro apropriado, por exemplo, no pronúcleo de oócitos de murganho fertilizados ou células-tronco embrionárias [(stem cells) 60 células estaminais] . A inactivação dos loci de imunoglobulinas endógenas hospedeiras é conseguida através da ruptura dirigida dos loci adequados por recombinação homóloga nas células hospedeiras, especialmente nas células-tronco embrionárias ou pronúcleo de oócitos fertilizados de murganho. A ruptura dirigida pode envolver a introdução de uma lesão ou deleção no locus alvo, ou supressão no interior do locus alvo acompanhada pela inserção no locus, por exemplo, a inserção de um marcador de selecção. No caso das células-tronco embrionárias os animais quiméricos são gerados os quais derivam em parte das células-tronco embrionárias modificadas e são capazes de transmitir modificações genéticas através da linha germinal. O acasalamento de hospedeiros com loci de imunoglobulinas humanas introduzidos para estirpes com loci endógenos inactivados originará animais cuja produção de anticorpos é puramente xenogénica, por exemplo, o homem.

Em uma estratégia alternativa, pelo menos porções dos loci de imunoglobulinas humanas de cadeias pesadas e leves utilizam-se para substituir directamente os correspondentes loci endógenos de imunoglobulinas por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias. Isso resulta na inactivação simultânea e substituição da imunoglobulina endógena. Isto é seguido pela geração de animais quiméricos em que as células derivadas das células estaminais embrionárias podem contribuir para as linhas germinativas.

Por exemplo, um clone de célula B que expressa anticorpo humano anti-IFNY é removido do animal não-humano xenogénico e imortalizado de acordo com alguns métodos conhecidos na arte. Tais células B pode derivar directamente do sangue do animal ou de tecidos linfóides, incluindo mas não se restringindo ao baço, amígdalas, nódulos linfáticos, e medula óssea. O 61 resultante, as células B imortalizadas podem expandir-se e cultivar-se in vitro para produzir grandes quantidades aplicáveis sob o ponto de vista clinico do anticorpo huIFNY. Alternativamente, os genes que codificam as imunoglobulinas com uma ou mais regiões humanas variáveis podem ser recuperados e expressas em um tipo de célula diferente, incluindo, mas não se restringindo a um sistema de cultura de células de mamifero, a fim de obter os anticorpos directamente ou as suas cadeias individuais, formados por moléculas Fv de cadeia simples.

Além disso, todo o conjunto de anticorpos totalmente humanos anti-IFNy gerados pelo animal não-humano xenogénico pode ser seleccionado para identificar um tal clone com as caracteristicas óptimas. Tais caracteristicas incluem, por exemplo, afinidade de ligação à proteína IFNy humana, estabilidade da interacção bem como do isotipo do anticorpo totalmente humano anti-IFNy. Os clones de todo o conjunto que tenham as caracteristicas desejadas utilizam-se em seguida como uma fonte de sequências de nucleótidos que codificam as regiões variáveis desejadas para posterior manipulação para gerar anticorpos com essas caracteristicas, em sistemas celulares alternativos, utilizando técnicas recombinantes ou transgénicas convencionais.

Esta estratégia geral foi demonstrada em conexão com as primeiras estirpes XenoMouse™ como publicado em 1994. Ver Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Essa abordagem será discutida posteriormente e delineada nos Pedidos de Patentes de invenção norte-americanas com os Nos de série 07/466 008, depositada em 12 de Janeiro de 1990, 07/610 515, depositada em 08 de Novembro de 1990, 07/919 297, depositada em 24 de Julho, 1992, 07/922 649, depositada 30 de Julho de 1992, 08/031 801, depositada em 15 de Março de 1993, 08/112 62 848, depositada em 27 de Agosto de 1993, 08/234 145, depositada em 28 de Abril de 1994, 08/376 279, depositada em 20 de Janeiro de 1995, 08/430 938, depositada em 27 de Abril de 1995, 08/464 584, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/464 582, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/463 191, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/462 837, depositada em 5 de Junho, 1995, 08/486 853, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/486 857, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/486 859, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/462 513, depositada em 05 de Junho de 1995, 08/724 752, depositada em 02 de Outubro de 1996, e 08/759 620, depositada em 03 de Dezembro de 1996 e as Patentes de invenção norte-americanas Nos 6 162 963, 6 150 584, 6 114 598, 6 075 181, e 5 939 598 e as Patentes de invenção japonesas Nos 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, e 3 068 507 B2. Ver também Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med.:188:483-4 95 (1998) . Ver também a Patente de invenção europeia N° EP 0 463 151 Bl, concessão publicada em 12 Junho de 1996, Pedido de Patente de invenção internacional, WO 94/02602, publicada em 03 de Fevereiro de 1994, Pedido de Patente de invenção Internacional N° WO96/34096, publicada em 31 de Outubro de 1996, WO 98/24893, publicada em 11 de Junho de 1998, WO 00/76310, publicada em 21 de Dezembro de 2000.

Em uma abordagem alternativa, outros utilizaram uma abordagem de um "minilocus". Na abordagem do "minilocus", um locus de Ig exógeno é mimetizado por meio da inclusão de partículas (pieces) (genes individuais) provenientes do locus da Ig. Assim, um ou mais genes da VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante mu, e uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) consistem em uma construção para inserção em um animal. Essa abordagem está descrita na Patente de invenção norte- gama americana N° 5 545 807 da autoria de Surani et al. e as 63

Patentes de invenção norte-americanas Nos 5 545 806, 5 625 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, 5 770 429, 5 789 650, 5 814 318, 5 877 397, 5 874 299, 6 255 458 todas da autoria de Lonberg e Kay, Patentes de invenção norte-americanas Nos 5 591 669 e 6 023 010 de Krimpenfort e Berns, as Patente de invenção norte-americanas Nos 5 612 205, 5 721 367, e 5 789 215 de Berns et al., e as Patentes de invenção norte- americanas Nos 5 643 763 de Choi e Dunn, e Pedidos de

Patentes de invenção norte-americanas da GenPharm International com os Nos de série 07/574 748, depositada em 29 de Agosto de 1990, 07/575 962, depositada em 31 de Agosto de 1990, 07/810 279, depositada em 17 de Dezembro de 1991, 07/853 408, depositada em 18 de Março de 1992, 07/904 068, depositado em 23 de Junho de 1992, 07/990 860, depositada em 16 de Dezembro de 1992, 08/053 131, depositada em 26 de Abril de 1993, 08/096 762, depositada em 22 de Julho de 1993, 08/155 301, depositada em 18 de Novembro de 1993, 08/161 739, depositada em 03 de Dezembro de 1993, 08/165 699, depositada em 10 de Dezembro de 1993, 08/209 741, depositada em 09 de Março de 1994. Ver também a Patente de invenção europeia N° 0 546 073 Bl, os Pedidos de Patentes de invenção International Nos WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 e a Patente de invenção norte-americana N°. 5 981 175. Veja também Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993,

Tuaillon et al. ,, 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), e Tuaillon et al., (1995),

Fishwild et al., (1996).

Uma vantagem da abordagem com o "minilocus" é a rapidez com que as construções que incluem porções do locus da Ig podem ser geradas e introduzidas em animais. De um modo comensurável, contudo, uma desvantagem significativa da abordagem com o minilocus é que, introduz-se diversidade 64 insuficiente através da inclusão de pequenos números de genes V, D e J. Com efeito, a obra publicada aparece para apoiar essa preocupação. 0 desenvolvimento de células B e a produção de anticorpos em animais obtidos utilizando a abordagem com um minilocus ocorrer de um modo retardado. Assim, a investigação em torno da presente invenção tem sido consistentemente dirigida para a introdução de grandes porções do locus da Ig a fim de alcançar maior diversidade e num esforço para reconstituir o repertório imunitário dos animais.

Tem-se demonstrado também a geração de anticorpos humanos a partir de murganhos nos quais, através da fusão de microcélulas, se têm introduzido grandes partículas ("pieces") de cromossomas, ou cromossomas inteiros. Ver Pedidos de Patentes de invenção europeias Nos 773 288 e 843 961.

Respostas dos anticorpos humanos anti-murganho (HAMA) levaram a indústria a preparar anticorpos quiméricos ou humanizados de outro modo. Mantendo os anticorpos quiméricos uma região constante humana e uma região variável imunitária é expectável que se observem algumas respostas dos anticorpos humanos anti-quiméricos (HACA), especialmente em utilizações crónicas ou de doses múltiplas do anticorpo. Assim, seria desejável proporcionar anticorpos totalmente humanos contra o IFNy, a fim de anular preocupações e/ou efeitos da resposta dos HAMA ou HACA. A produção de anticorpos com reduzida imunogenicidade realiza-se também via humanização e técnicas de exibição (display techniques) utilizando bibliotecas adequadas. Compreende-se que anticorpos murinos ou anticorpos provenientes de outras espécies possam ser humanizados ou 65 primatizados utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Ver por exemplo, Winter e Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) e Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). 0 anticorpo de interesse pode ser obtido por técnicas de engenharia genética de ADN recombinante para substituir os dominios CHI, CH2, CH3, domínios de charneira, e/ou os dominios de framework com a sequência humana correspondente (Ver Patente de invenção internacional WO 92102190 e Patentes de invenção norte-americanas Nos 5 530 101, 5 585 089, 5 693 761, 5 693 792, 5 714 350, e 5 777 085). Além disso utilização de DNAc de Ig para a construção de genes imunoglobulinas quiméricas é conhecida na arte (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) e J. Immunol. 139:3521 (1987)). O mRNA é isolado a partir de um hibridoma ou de outra célula que produz o anticorpo e utilizado para produzir o ADNc. O ADNc de interesse pode ser amplificado pela reacção em cadeia da polimerase utilizando primers específicos (Patentes de invenção norte-americanas Nos 4 683 195 e 4 683 202). Alternativamente, produz-se uma biblioteca e selecciona-se para isolar a sequência de interesse. A sequência de ADN que codifica a região variável do anticorpo é então fundida com sequências humanas na região constante. As sequências de genes humanos nas constantes regiões podem pesquisar-se em Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological interest, N.I.H. publication n° 91-3242. Os genes humanos das regiões C obtêm-se facilmente a partir de clones conhecidos. A escolha do isotipo será focalizada nas funções efectoras desejadas, tais como fixação do complemento, ou actividade destinada à citotoxicidade celular dependente do anticorpo. Isotipos preferidos são IgGl, IgG3 e IgG4. Pode utilizar-se qualquer uma das regiões constantes humanas de cadeias leves, kappa ou lambda. Seguidamente o anticorpo humanizado, quimérico é expresso por processos convencionais. 66

Os fragmentos de anticorpos, tais como Fv, F(ab')2 e Fab podem preparar-se por clivagem da proteina intacta, por exemplo, por protease ou clivagem química. Alternativamente, desenha-se um gene truncado. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção do fragmento F(ab')2 incluiria sequências de ADN que codificam as regiões do domínio CHI e charneira da cadeia H, seguido por um codão stop (ou de terminação) translacional para se obter a molécula truncada.

As sequências de consenso das regiões H e LJ podem utilizar-se para conceber oligonucleótidos para utilização como primers para introduzir sítios de restrição úteis na região J para a ligação subsequente dos segmentos da região V aos segmentos da região C humana. 0 cDNA da região C pode modificar-se por mutagénese sitio-dirigida para colocar um sítio de restrição na posição análoga da sequência humana.

Os vectores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, YACs e epissomas derivados de EBV, e semelhantes. Um vector conveniente é aquele que codifica uma sequência de imunoglobulina CH ou CL totalmente humana sob o ponto de vista funcional, com sítios de restrição apropriados obtidos por técnicas de engenharia genética de forma que qualquer sequência VH ou VL-31 pode ser facilmente inserida e expressa. Em vectores como estes, o splicing ocorre geralmente entre o sítio dador do splicing na região J inserida e o sítio aceitador de splicing que precede a região C humana, e também nas regiões de splice que ocorrem no interior dos exões CH humanos. A poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em sítios cromossómicos nativos a jusante das regiões de codificação. 0 anticorpo quimérico resultante pode unir-se a qualquer promotor, incluindo LTRs retrovirais, por exemplo, o promotor inicial SV-40 precoce, (Okayama et al. Mol. Cell Bio. 3:280 (1983)), 67 o vírus do sarcoma de Rous LTR (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), e LTR do vírus da leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al. Cell. 41:885 (1985)). Além disso, como se compreenderá, podem utilizar-se os promotores nativos da Ig e similares.

Além disso, anticorpos humanos ou anticorpos provenientes de outras espécies podem ser gerados através de tecnologias do tipo de exibição (display type technologies), incluindo, sem limitação, exibição de fagos, exibição retroviral, exibição ribossomal, e outras técnicas, utilizando técnicas bem conhecidas na arte, podendo as moléculas resultantes submeterem-se a maturação adicional, tal como a maturação de afinidade, técnicas em si bem conhecidas na arte. Wright e Harris, supra., Hanes e Plucthau PEAS USA 94:4937-4942 (1997) (exibição ribossomal), Parmley e Smith Gene 73:305-318 (1988) (exibição de fagos), Scott TIB5 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), e Patente de invenção norte-americana N°. 5 733 743. Quando se utilizam as tecnologias de exibição para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados como descrito antes.

Utilizando essas técnicas, os anticorpos podem ser gerados também para células que expressam o IFNy, o próprio IFNy, formas de IFNy, epitopos ou seus péptidos, e também bibliotecas de expressão (Ver por exemplo, a Patente de invenção norte-americana N° 5 703 057) que podem seleccionar-se posteriormente como descrito antes para as actividades previamente descritas. 68

Design e Desenvolvimento de Outra Terapêutica

De acordo com a descrição da presente invenção e com base na actividade dos anticorpos que são produzidos e caracterizados na mesma invenção relativamente ao IFNy, facilita-se o design de outras modalidades de terapêutica além dos fragmentos de anticorpos. Tais modalidades incluem, sem limitação, terapêutica de vanguarda com anticorpos, tais como anticorpos biespecificos, imunotoxinas e radio-terapêutica, desenvolvimento de terapêutica com peptídeos, terapias génicas, especialmente intrabodies (anticorpos intracelulares), terapêutica anti-senso, e pequenas moléculas.

Por exemplo, em ligação com anticorpos biespecificos, podem desenvolver-se anticorpos biespecificos que incluem: (i) dois anticorpos um com uma especificidade para o IFNy e outro para uma segunda molécula que se apresentam conjugados no mesmo lugar, (ii) um anticorpo individual que apresenta uma cadeia especifica para o IFNy e uma segunda cadeia especifica para uma segunda molécula, ou (iii) um anticorpo com uma única cadeia que apresenta especificidade para o IFNy e para outra molécula. Tais anticorpos biespecificos são gerados utilizando técnicas que são bem conhecidas por exemplo, em ligação com (i) e (ii) Ver, por exemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) e Wright e Harris, supra, e em ligação com (iii) Ver por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Em ligação com imunotoxinas, os anticorpos podem ser modificados para actuar como imunotoxinas utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. Ver por exemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver também Patente de invenção norte-americana N° 5 194 594. Em ligação com a preparação de 69 anticorpos radiomarcados, tais anticorpos modificados podem também preparar-se facilmente utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Junghans et al. em Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafner and Long, eds. Lippincott Raven (1996)). Veja também as Patentes de invenção norte-americanas 4 681 581, 4 735 210, 5 101 827, 5 102 990 (RE 35 500), 5 648 471, e 5 697 902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas radiomarcadas destinam-se provavelmente a destruir (to kill) as células que expressam o IFNy, e especialmente as células em que os anticorpos da presente invenção são eficazes.

Em conexão com a geração de péptidos terapêuticos, mediante a utilização de informação estrutural relacionada com o IFNy e também com anticorpos, tais como os anticorpos da presente invenção ou selecção de bibliotecas de péptidos, podem gerar-se péptidos terapêuticos que são dirigidos contra o IFNy. Em conformidade com Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS EUA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake e Litzi-Davis Bioconjugate Chem. 3:510-513 (1992), discute-se o design e a pesquisa ("screening") da terapêutica com péptidos. Imunotoxinas e moléculas radiomarcadas podem também preparar-se, de uma maneira semelhante, em ligação com os fragmentos peptídicos como discutido antes na ligação com anticorpos. Assumindo que a molécula do IFNy (ou uma forma, como uma variante produzida por mecanismos de "splice" ou forma alternativa) é activa sob o ponto de vista funcional no processo da doença, será igualmente possivel conceber também uma terapêutica génica e "antisense" através de técnicas convencionais. Tais modalidades podem utilizar-se para modular a função do IFNy. Também em conformidade os anticorpos da presente invenção facilitam a concepção ("design") e a utilização de ensaios funcionais relacionados 70 com o mesmo. Um design e uma estratégia para terapêutica "antisense" discutem-se em detalhe no Pedido de Patente de invenção internacional N° WO 94/29444. Design e estratégias para terapia genética conhecem-se bem. No entanto, em especial, a utilização de técnicas de terapêutica génica envolvendo anticorpos intracelulares ("intrabodies") poderá revelar-se especialmente vantajosa. Ver por exemplo, Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) e Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). O design geral de e considerações relacionadas com a terapêutica génica é também discutida no Pedido de Patente de invenção internacional N° WO 97/38137.

[0141] O conhecimento adquirido a partir da estrutura da molécula do IFNy e suas interacções com outras moléculas de acordo com a presente invenção, tais como os anticorpos da mesma invenção, e outros podem utilizar-se para conceber (to design) racionalmente modalidades terapêuticas adicionais. A esse respeito, as técnicas racionais de concepção de fármacos tais como cristalografia de raios X, modelagem molecular assistida (apoiada) por computador (CAMM), relação quantitativa (ou qualitativa) estrutura-actividade (QSAR), e tecnologias similares podem utilizar-se para concentrar os esforços na investigação de fármacos. O design racional permite a predição de estruturas de proteinas ou de síntese que podem interagir com as moléculas ou as suas formas específicas que se podem utilizar para modificar ou modular a actividade do IFNy. Tais estruturas podem sintetizar-se quimicamente ou expressar-se em sistemas biológicos. Essa abordagem foi revista por Capsey et al. em Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Além disso, podem conceber-se e sintetizar-se e utilizar-se bibliotecas combinatórias em programas de rastreio, tais como elevados esforços de processamento de selecção. 71

Administração Terapêutica e Formulações

Compreender-se-á que a administração de entidades terapêuticas de acordo com a presente invenção administrar-se-ão com veículos, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados em formulações para proporcionar melhor veiculo, administração, tolerância, e outros factores. Uma quantidade de formulações adequadas pode encontrar-se no formulário que todos os quimicos farmacêuticos conhecem: Remington 's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), especialmente no citado formulário o Capitulo 87 da autoria de Blaug, Seymour. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, vaselinas, ceras, óleos, lipidos, vesículas contendo lípidos (catiónicos ou aniónicos) (como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, Carbowax em emulsões (polietilenoglicóis de diversos pesos moleculares) , geles semi-sólidos, e misturas semi-sólidas que contêm carbowax. Qualquer dessas misturas anteriores pode ser apropriada para tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção desde que o componente activo da formulação não seja inactivado pela formulação e a formulação seja compatível e tolerável sob o ponto de vista fisiológico com a via de administração. Veja também Baldrick P. "Pharmaceutical excipiente development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32 (2) :210 — 8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203 (1-2) :1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sei.89 (8) :967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol. 52:238-311 (1998) e as citações aí contidas para informação adicional 72 relacionada com formulações, excipientes e veículos que os químicos farmacêuticos bem conhecem.

As formulações terapêuticas da presente invenção, que incluem um anticorpo para o huIFNY da presente invenção, utilizam-se para tratar ou aliviar um sintoma associado a distúrbio relacionado com a imunidade como, por exemplo, uma doença auto-imunitária ou um distúrbio inflamatório.

Por exemplo, a administração de um anticorpo para o huIFNY a um paciente que padeça de Doença de Crohn (CD) pode actuar directamente sobre as células imunitárias causadoras da doença, proporcionando assim uma intervenção rápida com supressão mínima do sistema imunitário. A administração de um anticorpo para huIFNY a um paciente que padeça de Lupus Eritematoso Sistémico constitui uma outra indicação médica que proporciona uma oportunidade para modificar as células imunitárias responsáveis pela doença. A administração de um anticorpo para o huIFNY, uma proteína totalmente humana, a um paciente que padeça de psoríase evita a necessidade de tratar os pacientes com medicamentos mais agressivos (por exemplo, metotrexato) que apresenta efeitos colaterais indesejados bem documentados (por exemplo, lesões hepáticas). A administração de um anticorpo para o huIFNY a um paciente que padeça de artrite reumatóide constitui uma outra indicação médica que proporciona a oportunidade de modular a montante a geração e a função da resposta mediada pelas Thl indutoras da doença.

As doenças auto-imunitárias incluem, por exemplo, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA, que é um virai com um componente auto-imunitário) , alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica auto-imunitária, Doença de Addison auto-imunitária, anemia hemolítica auto-imunitária, hepatite autoimunitária, doença 73 autoimunitária do ouvido interno (AIED), sindrome linfoproliferativa auto-imunitária (ALPS), Púrpura autoimunitária trombocitopénica (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, doença celiaca, dermatite herpetiforme, sindrome de deficiência orgânica imunitária e fadiga crónica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIPD), penfigóide cicatricial, doença por aglutininas a frio, sindrome de CREST, Doença de Crohn, doença de Degos, dermatomiosite juvenil, lupus discóide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, doença de Graves, sindrome de Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatia por IgA, diabetes mellitus insulino-dependente, artrite crónica juvenil (Doença de Still), artrite reumatóide juvenil, doença de Méniére, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, sindromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinémia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenómeno de Raynaud, sindrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia (esclerose sistémica progressiva (ESP), também conhecida por esclerose sistémica (ES)), sindrome de Sjõgren, sindrome de Man Stiff, lúpus eritematoso sistémico, arterite de Takayasu, arterite temporal (arterite de células gigantes), colite ulcerativa, uveite, vitiligo e granulomatose de Wegener.

Distúrbios inflamatórios incluem, por exemplo, distúrbios crónicos e inflamatórios agudos. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem doença de Alzheimer, asma, alergia atópica, alergia, aterosclerose, asma brônquica, eczema, glomerulonef rite, doença enxerto contra hospedeiro, anemias hemoliticas, osteoartrite, sepsis, acidente vascular 74 cerebral, o transplante de tecidos e órgãos, vasculite, retinopatia diabética e lesão pulmonar induzida pelo ventilador mecânico.

Os anticorpos para o huIFNY modulam uma resposta imunitária em um paciente, por exemplo, em um paciente humano. Por exemplo, os anticorpos para o huIFNY descritos na presente invenção modulam, por exemplo reduzem, inibem ou previnem uma resposta imunitária exagerada mediada pelas células Thl associada a um distúrbio auto-imunitário ou inflamatório como, por exemplo, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistémico, psoríase, sarcoidose, artrite reumatóide, vasculite, dermatite atópica e esclerose múltipla secundária progressiva. Em uma resposta imunitária exagerada mediada pelas células Thl, citocina (s) Thl, como IL-2, IL-3, TNF-alfa (TNFa) e IFNy, estão presentes em um paciente em um nível que é superior ao nível de produção de citocinas Thl em um paciente que não sofre de qualquer doença ou distúrbio associado a uma resposta imunitária exagerada das Th-1. Para classificar uma resposta imunitária mediada por Thl como uma resposta exagerada, avalia-se o nível de uma resposta de produção de citocinas Thl, por exemplo, determinando e analisando o nível de citocinas segregadas utilizando um ensaio ELISA ou outro.

Os anticorpos para o huIFNY descritos na presente invenção utilizam-se também para modular, por exemplo inibir, reduzir ou prevenir, a comutação ("switching") de um isotipo da classe IgG, por exemplo comutando a classe induzida pelo IFNy. Esses anticorpos para o huIFNY modulam, por exemplo, inibem, previnem ou reduzem uma resposta mediada por Thl e consequentemente diminuem a comutação induzida pelo IFNy. 75

Em uma forma de realização, as composições de anticorpos para o huIFNY utilizadas para tratar um distúrbio relacionado com a imunidade administram-se em associação com uma qualquer variedade de agentes anti-citocinas ou agentes anti-quimiocinas. Reagentes anti-citocinas ou anti-quimiocinas adequados reconhecem, por exemplo, citocinas como interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31, e/ou quimiocinas como MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e fractalcina. A presente invenção fornece também processos para tratar ou aliviar um sintoma associado a um distúrbio relacionado com a imunidade. Por exemplo, as composições da presente invenção utilizam-se para tratar ou aliviar um sintoma de qualquer das doenças auto-imunitárias e distúrbios inflamatórios descritos na presente invenção. Os sintomas associados a distúrbios relacionados com a imunidade, por exemplo, inflamação, febre, perda de apetite, perda de peso, sintomas abdominais, tais como, por exemplo, dor abdominal, diarreia ou obstipação, dores nas articulações ("pain" ou "aches") (artralgia), fadiga, erupções cutâneas, anemia, extrema sensibilidade ao frio (fenómeno de Raynaud), fraqueza muscular, fadiga muscular, mudanças de tom na pele ou tecidos, falta de ar (encurtamento da respiração) ou outros padrões anormais de respiração, dor no peito ou constrição dos músculos do tórax, a frequência cardiaca anormal (por exemplo, elevada ou reduzida), sensibilidade à luz, visão desfocada ou anormal por outro motivo, e função reduzida dos órgãos.

As formulações terapêuticas de anticorpos para o huIFNY administram-se a um paciente que padeça de um distúrbio relacionado com a imunidade, como uma doença auto-imunitária 76 ou um distúrbio inflamatório. Um paciente que padeça de uma doença auto-imunitária ou de um distúrbio inflamatório identifica-se por processos conhecidos na arte. Por exemplo, pacientes que padeçam de uma doença auto-imunitária como doença de Crohn, lúpus ou psoriase, identificam-se utilizando um qualquer de diversos ensaios clinicos e/ou laboratoriais como, exame fisico, exame radiológico e análises ao sangue, urina e fezes para avaliar o estado imunitário. Por exemplo, pacientes que sofrem de lúpus identificam-se realizando o teste de anticorpos antinucleares (ANA) para determinar se estão presentes no sangue auto-anticorpos para os núcleos das células. Os pacientes que padecem da Doença de Crohn identificam-se, por exemplo, realizando uma radiografia do trato gastrintestinal superior ["upper gastrointestinal (GI) series"] e/ou uma colonoscopia para avaliar os intestinos delgado e grosso, respectivamente. Os pacientes que sofrem de psoriase identificam-se, por exemplo, utilizando um exame microscópico do tecido retirado através de um adesivo aplicado na pele afectada, enquanto que se identificam os doentes que sofrem de artrite reumatóide utilizando, por exemplo, análises ao sangue e/ou raios-x ou outras avaliações por imagiologia.

No caso de se obterem diversos resultados laboratoriais ou clinicos procede-se à administração de um anticorpo para o huIFNY a um paciente que padeça de um distúrbio relacionado com a imunidade como uma doença auto-imunitária ou um distúrbio inflamatório. Por exemplo, a administração de um anticorpo para o huIFNY a um paciente que sofra de um distúrbio relacionado com a imunidade como uma doença auto-imunitária ou um distúrbio inflamatório considera-se bem sucedida se um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio é aliviado, reduzido, inibido ou não progride para um outro estado, isto é, não piora. A administração de um anticorpo 77 para o huIFNY a um paciente que sofra de um distúrbio relacionado com a imunidade como uma doença auto-imunitária ou um distúrbio inflamatório considera-se bem sucedida se o distúrbio, por exemplo, uma doença auto-imunitária, entrar em remissão ou não progredir para um estado pior.

Formulações para Diagnóstico e Profilácticas

Os mAbs totalmente humanos anti-IFNY utilizam-se em formulações para diagnóstico e profiláticas. Em uma forma de realização, um MAb para o huIFNY da presente invenção administra-se a pacientes que estão em risco de desenvolver uma das doenças auto-imunitárias mencionadas antes. A predisposição de um paciente para uma ou mais das doenças auto-imunitárias mencionadas antes pode determinar-se utilizando marcadores genotipicos, serológicos ou bioquímicos.

Em uma outra forma de realização da presente invenção, administra-se um anticorpo para huIFNY a pacientes humanos diagnosticados com uma ou mais das doenças auto-imunitárias mencionadas antes. Após o diagnóstico, administra-se um anticorpo para huIFNY para mitigar ou inverter os efeitos de auto-imunidade.

Anticorpos da presente invenção são igualmente úteis para a detecção do IFNy em amostras de doentes e consequentemente são úteis para diagnóstico. Por exemplo, os anticorpos do huIFNY da presente invenção utilizam-se em ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para detectar os níveis do IFNy em uma amostra de pacientes.

Em uma outra forma de realização, um anticorpo huIFNY é imobilizado sobre um suporte sólido (por exemplo, a(s) 78 cavidade(s) ("well(s)") de uma placa de microtitulação). 0 anticorpo imobilizado actua como um anticorpo de captura para qualquer IFNy que pode estar presente em uma amostra de ensaio. Antes do contacto do anticorpo imobilizado com uma amostra de pacientes, lava-se o suporte sólido e trata-se com um aqente de bloqueio como a proteína ou a albumina de vison para evitar a adsorção não específica do analito.

Subsequentemente tratam-se as cavidades com uma amostra em ensaio suspeita de conter o antigénio, ou com uma solução que contém uma quantidade padrão do antigénio. Tal amostra é, por exemplo, uma amostra de soro proveniente de um paciente suspeito de apresentar niveis de antigénio circulante considerados indicarem o diagnóstico de uma patologia. Após lavagem da amostra ou do padrão em ensaio, trata-se o suporte sólido com um segundo anticorpo que é marcado de um modo identificável. 0 segundo anticorpo marcado actua como um anticorpo de detecção. 0 nivel do marcador identificável é avaliado, e determina-se a concentração do antigénio IFNy na amostra em ensaio por comparação com uma curva padrão obtida a partir das amostras padrão.

Compreender-se-á que com base nos resultados obtidos utilizando os anticorpos para huIFNy da presente invenção em um ensaio de diagnóstico in vitro, é possível determinar-se o estádio da doença (por exemplo, uma doença auto-imunitária ou um processo inflamatório) em um paciente com base nos níveis de expressão do antigénio IFNy. Para uma determinada doença, colhem-se amostras de sangue a partir de pacientes diagnosticados como estando em diversas fases na progressão da doença, e/ou em diversos pontos no tratamento terapêutico da doença. Utilizando uma população de amostras que fornece resultados significativos sob o ponto de vista estatístico para cada estágio de progressão ou de terapia, é designada 79 uma proporção de concentrações do antigénio que pode considerar-se característica de cada estádio.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes, incluindo as experiências realizadas e os resultados obtidos são fornecidos apenas a titulo exemplificativo e não são para interpretar como limitativos da presente invenção. EXEMPLO 1: Clonagem, Expressão e Purificação do Interferão Gama Humano

Clonagem A sequência correspondente à sequência madura do interferão gama humano (hlFNY, huIFNY) foi amplificada a partir de cADN humano por reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizando oligonucleótidos específicos. A produção de amplificação purificou-se em gele e clonou-se no vector de expressão pET41c (Novagen, San Diego CA). 0 vector foi ainda modificado para introduzir um Avitag™ (Avidity, Denver CO) e um octa-histidina tag (pequenas caudas ou etiquetas) no terminal C do hlFNy permitindo in vivo a biotinilação da proteína e a purificação por IMAC [Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (cromatografia de afinidade utilizando um ião metálico imobilizado)].

Expressão

As células de E. coli BL21 foram co-transformadas com o pET41c-hIFNy e um vector pACYC184-BirA, que codifica a enzima BirA necessária para a biotinilação in vivo da sequência Avitag™. Escolheram-se colónias individuais resistentes à 80

Canamicina (50 yg/ml) e ao Cloranfenicol (10 yg/ml) e utilizaram-se para inocular uma cultura iniciadora em LB (Can 50 yg/ml/CmlOyg/ml) e cultivaram-se durante a noite a 37 °C.

No dia seguinte, utilizou-se a cultura para inocular (diluição a 1:100) uma cultura de 400 ml de LB (Can 50 pg/ml/Cm 10 yg/ml) suplementado com 50 μΜ de biotina. A cultura desenvolveu-se a 37 °C com agitação (240 rpm) até se atingir uma D06oo de 0,6. Nesse ponto, adicionou-se isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) até uma concentração final de 1 mM, e incubou-se a cultura durante mais 3 h sob as mesmas condições. Centrifugaram-se as células a 4000 rpm durante 20 minutos, e congelou-se o "pellet" a -20 °C. Nessas condições todos os hlFNy mostraram-se realmente insolúveis e observaram-se no seu interior corpos de inclusão.

Purificação

Descongelaram-se pellets bacterianos e suspenderam-se novamente em 8 ml de reagente de BugBuster contendo 8 μΐ de Benzonaze (Novagen) e incubaram-se à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Centrifugou-se a solução durante 30 minutos a 15 000 g a 4 °C. 0 pellet contendo os corpos de inclusão foi novamente suspenso em 7 ml de tampão de solubilização (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazole, 5 mM de β-mercaptoetanol, 6M de Guanidin-HCl). Centrifugou-se o material suspenso de novo a 4 °C durante 30 minutos a 15 OOOg.

Duas colunas Hi Trap Chelating de 5 ml (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra), carregadas com NiS04 e equilibradas com tampão de solubilização, ligaram-se entre si 81 de acordo com as instruções do fabricante. Filtrou-se o sobrenadante após a fase de centrifugação em uma membrana de 0,45 ym e acondicionou-se ("loaded") em uma coluna com o auxilio de uma bomba peristáltica a 1 ml/min. Colocaram-se depois as colunas em um sistema de cromatografia modelo AKTA prime para "refolding" e eluição das proteínas sobre a coluna. Lavou-se a proteína imobilizada com 35 ml de tampão de solubilização a 1 ml/minuto. Um gradiente linear de tampão de solubilização com concentração crescente de tampão de "refolding" (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 300 mM NaCl) aplicou-se a 1 ml/minuto durante 1 hora até se atingir 100% do tampão de "refolding". Seguidamente lavou-se a coluna com 25 ml de tampão de "refolding". A proteína "refolded" (redobrada) foi eluída depois a partir da coluna com tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 400 mM de imidazole) . Reuniram-se as fracções contendo a proteína e dessalinizaram-se em colunas PD10 (Amersham) equilibradas com PBS. A proteína dessalinizada dividiu-se seguidamente em alíquotas e armazenou-se a -80 °C. EXEMPLO 2: As células que expressam o Interferão Gama na superfície da célula

Transfectaram-se de maneira estável células de ovário de hamster chinês (CHO) [ (obteníveis em ATCC (American Type Culture Comission) com cDNA de IFNy humano marcado com c-myc. Subclonaram-se os cDNAs em plasmídeos pcDNA 3.1 (Invitrogen, Carlsbad CA) contendo genes de resistência à neomicina. Escolheram-se os transfectantes utilizando esse antibiótico, e conseguiu-se com êxito a sucessiva separação das células por citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti-6xHis (Sigma). A expressão à superfície do IFNy humano foi confirmada através de citometria de fluxo utilizando um mAb anti-IFNy (clone B27, Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ). 82 EXEMPLO 3: Selecção de Bibliotecas de scFv humanos

Procedimentos Gerais para a construção e manipulação de bibliotecas de scFv humanos são descritos por Vaughan et ai. (Nat. Biotech., 1996, 14:309-314) e Incorporados na presente invenção a titulo de referência na sua totalidade. Bibliotecas de scFv humanos foram seleccionados contra o hlFNy de acordo com o seguinte procedimento.

Selecção da fase líquida

Aliquotas de bibliotecas de scFv expressos em fagos (1012 Pfu) fornecidas por Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK) foram bloqueadas com PBS contendo 3% (w/v) de leite desnatado durante uma hora à temperatura ambiente em um misturador rotativo. 0 fago bloqueado foi seguidamente "desseleccionado" ("deselected") sobre esferas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280) durante uma hora à temperatura ambiente sobre um misturador rotativo. Seguidamente incubou-se o fago desseleccionado com hlFNy biotinilado in vivo (100 nM) durante duas horas à temperatura ambiente em um misturador rotativo. Capturaram-se as pérolas utilizando um suporte magnético, e seguidamente procedeu-se a quatro lavagens com PBS/0,1% Tween 20 e 3 lavagens com PBS. Em seguida adicionaram-se directamente as pérolas a 10 ml de células TG1 em crescimento exponencial e incubadas durante uma hora a 37 °C com agitação lenta (100 rpm) . Uma aliquota de células TG1 infectadas foi diluída em série até à concentração necessária para a saída de selecção. As restantes TG1 infectadas foram ainda centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos e suspenderam-se novamente em 0,5 ml 2xTY-AG (meio 2xTY contendo 100 yg/ml de ampicilina e 2% de glucose) e espalharam-se sobre placas Bioassay de agar 2xTYAG. Após incubação durante a noite a 30 °C adicionaram-se 83 às placas 10 ml de 2xTYAG e rasparam-se as células ds superfície e transferiram-se para um tubo de polipropileno de 50 ml. Adicionou-se o meio 2xTYAG contendo glicerol a 50% à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. As alíquotas da fase de selecção mantiveram-se a-80 °C.

Selecção da superfície celular

Alíquotas de bibliotecas de scFv expressos em fagos (1012 Pfu) fornecidas por Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK) foram bloqueadas com PBS contendo 3% (w/v) de leite desnatado durante uma hora à temperatura ambiente em um misturador rotativo. 0 fago bloqueado foi seguidamente "desseleccionado" ("deselected") durante uma hora a 37 °C/5% de CO2 em células CHO transfectadas para um vector pDisplay vazio [(em um frasco T-175 (para cultura de células) alcançaram a confluência de 80%) ] tendo esse sido previamente bloqueado com PBS contendo 2% (w/v) de leite desnatado. Seguidamente o fago "desseleccionado" foi incubado com células CHO-pDisplay-hlFNy durante uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Seguidamente lavaram-se as células dez vezes com PBS. O fago ligado foi eluído mediante a adição directa de 10 ml de TG1 em crescimento exponencial ao frasco T-175 e incubação durante uma hora a 37 °C com agitação lenta. Diluiu-se em série uma alíquota das células TG1 infectadas até à concentração necessária para a saída de selecção. Centrifugaram-se as células TG1 infectadas a 3000 rpm durante 15 minutos e suspenderam-se novamente em 0,5 ml 2xTY-AG (meio 2xTY contendo 100 yg/ml de ampicilina e 2% de glucose) e espalharam-se em placas Bioassay 2xTYAG. Depois da incubação durante a noite a 30 °C adicionaram-se às placas 10 ml de 2xTYAG e rasparam-se as células da superfície e transferiram-se para um tubo de polipropileno de 50 ml. À 84 suspensão de células adicionou-se 2xTYAG contendo glicerol a 50% para se obter uma concentração final de glicerol a 17%. As aliquotas da fase de selecção mantiveram-se a-80 °C.

Recuperação do fago A 20 ml de 2xTYAG adicionaram-se 100 μΐ de suspensão de células obtidos a partir dos ciclos de selecção anteriores e cultivaram-se a 37 °C com agitação (240 rpm) até se atingir uma DC>6oo de 0,3 a 0,5. A cultura foi depois super-infectada com 3,3 x 1010 de fago helper MK13K07 e incubada durante uma hora a 37 °C (150 rpm). Seguidamente mudou-se o meio mediante centrifugação das células a 2000 rpm durante 10 minutos, eliminou-se o meio e suspendeu-se de novo o "pellet" (o pequeno aglomerado esférico) em 20 ml de 2xTYAK (100yg/ml de ampicilina; 50 yg/ml de canamicina). Seguidamente a cultura desenvolveu-se durante a noite à temperatura de 30 °C (240 rpm) .

Recuperação do fago monoclonal utilizando ELISA

Colheram-se clones individuais para uma placa de microtitulação contendo 150 μΐ de meio 2xTYAG (2% glucose) por cavidade ("well") e desenvolveram-se a 37 °C (100-120 rpm) durante 5-6 h. Adicionou-se o fago helper M13K07 a cada cavidade para se obter uma multiplicidade de infecção [(MOI) multiplicity of infection] de 10 (isto é, 10 fagos por cada célula da cultura) e incubou-se a 37 °C (100 rpm) durante 1 h. Após o desenvolvimento centrifugaram-se as placas a 3 200 rpm durante 10 minutos. Eliminou-se o sobrenadante cuidadosamente, suspenderam-se as células novamente em 150 μΐ do meio 2xTYAK e cultivaram-se durante a noite a 30 °C (120 rpm). Para o ensaio ELISA, os fagos são bloqueados mediante a adição de 150 μΐ de PBS de concentração 2x contendo 5% de 85 leite em pó desnatado seguindo-se uma hora de incubação à temperatura ambiente. Seguidamente centrifugaram-se as placas 10 minutos a 3 000 rpm e utilizou-se o sobrenadante contendo os fagos no ensaio ELISA.

Fagos ELISA

Revestiram-se placas ELISA (Maxisorb, Nunc) durante a noite com 2 yg/ml de hlFNY em PBS. As placas de controlo revestiram-se com 2yg/ml de BSA. Seguidamente bloquearam-se as placas com 3% de leite desnatado/PBS à temperatura ambiente durante 1 h. Lavaram-se as placas 3 vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20 antes de se transferirem os sobrenadantes contendo os fagos pré-bloqueados e incubaram-se durante uma hora à temperatura ambiente. Lavaram-se depois as placas 3 vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20. A cada cavidade adicionaram-se 50μ1 de 3% de leite desnatado/PBS contendo anticorpos anti-M13 conjugados com (HRP) (Amersham, diluido 1:10 000). Após a incubação à temperatura ambiente durante 1 hora, lavaram-se as placas 5 vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20. O ensaio ELISA foi então revelado mediante a adição de 50μ1 de TMB (Sigma) e 50μ1 de H2SO4 2N para interromper a reacção. A intensidade da absorção foi lida a 450 nm.

Sequenciamento de clones de fagos

Colocaram-se clones individuais em uma placa de microtitulação contendo 150 μΐ do meio 2xTYAG (2% glucose) por cavidade e desenvolveram-se a 30 °C (120 rpm) durante a noite. No dia seguinte transferiram-se 5 μΐ da cultura para outra placa contendo 45 μΐ de dH20 e agitaram-se. Seguidamente congelaram-se as placas a -2 0 °C. Após descongelação, utilizou-se 1 μΐ dessa suspensão para suspensão para 86 amplificação por PCR utilizando protocolos padrão de PCR com o "primer" (iniciador) especifico para pCANTAB6: mycseq, 5'-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3'(SEQ ID NO:100) e o primer gene31eader, 5 ' -TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3' (SEQ ID NO:101).

As reacções de PCR purificaram-se no formato de placas de 96 cavidades utilizando o sistema Montage PCRy96 (Millipore). Submeteram-se a sequenciamento 5 μΐ do DNA eluido utilizando os "primers" mycseq e gene31eader.

Preparação do scFv periplásmico para ensaios funcionais

Inocularam-se clones individuais em uma placa de microtitulação de cavidades profundas contendo 0,9 ml do meio 2xTYAG (0,1% glucose) por poço ou cavidade e cultivaram-se a 37 °C durante 5-6h (250 rpm). Seguidamente adicionaram-se 100 μΐ por poço de IPTG 0,2 mM em meio 2xTY para se obter uma concentração final de IPTG 0,02 mM. Seguidamente incubaram-se as placas durante a noite a 30 °C com agitação a 250 rpm. Centrifugaram-se as placas de poços profundos a 2 500 rpm durante 10 minutos e eliminou-se o sobrenadante cuidadosamente. Suspenderam-se novamente os "pellets" em 150 μΐ de tampão TES (50 mM de Tris/HCl (pH 8), 20% de sacarose, complementado com inibidor completo de protease, Roche). Mediante a adição de 150 μΐ de tampão TES diluido (diluição 1:5 TES:água) e incubação sobre gelo durante 30 minutos produziu-se um choque hipotónico. Seguidamente centrifugaram-se as placas a 4 000 rpm durante 10 minutos para eliminar as células e fragmentos ("debris"). Transferiram-se cuidadosamente os sobrenadantes para uma outra placa de microtitulação e conservaram-se sobre gelo para verificação imediata em ensaios funcionais ou ELISAs. 87

Purificação do scFv em larga escala

Inoculou-se uma cultura inicial de 1 ml de 2xTYAG com uma única colónia proveniente de uma placa com 2xTYAG agar semeada recentemente e incubada com agitação (240 rpm) a 37 °C durante 5 horas. Utilizou-se 0,9 ml desta cultura para inocular uma cultura de 400 ml do mesmo meio e desenvolveu-se durante a noite a 30 °C com agitação enérgica (300 rpm).

No dia seguinte induziu-se a cultura mediante a adição de 400 μΐ de 1M de IPTG e a incubação prosseguiu durante mais 3 horas adicionais. Recolheram-se as células por centrifugação a 5 000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Suspenderam-se novamente as células peletizadas (sob a forma de um pequeno aglomerado esférico) em 10 ml de tampão TES arrefecido com gelo complementado com inibidores de protease como descritos antes. O choque osmótico foi conseguido através de adição de 15 ml de tampão TES diluído a 1:5 e incubação durante 1 hora sobre gelo. Centrifugaram-se células a 10 000 rpm durante 20 minutos a 4 °C para perlitizar fragmentos de células. Transferiu-se o sobrenadante cuidadosamente para um tubo recente. A cada tubo adicionou-se imidazole ao sobrenadante até uma concentração final de 10 mM. A cada tubo adicionou-se 1 ml de resina Ni-NTA (Qiagen), equilibrada em PBS e incubou-se em um misturador rotativo a 4 °C (20 rpm) durante 1 hora.

Centrifugaram-se os tubos a 2000 rpm durante 5 minutos e eliminou-se o sobrenadante cuidadosamente. A resina peletizada suspendeu-se novamente em 10 ml de tampão de Lavagem 1 frio (4 °C) (50 mM NatbPCt, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazole, pH de 8,0). A suspensão adicionou-se a uma coluna polyprep (Biorad). Utilizaram-se 8 ml de tampão de Lavagem 2 frio (50 mM NaH2P04, 300 mM de NaCl, 20 mM de 88 imidazole, pH de 8,0) para lavar a coluna por fluxo de gravidade. Os scFv foram eluidos a partir da coluna com 2 ml de tampão de Eluição (50 mM NaH2P04, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazole, pH de 8,0) . Analisaram-se as fracções por absorção a 280 nm e reuniram-se ("were pooled") as fracções contendo as proteínas antes da troca do tampão em uma coluna dessalinizada PD10 (Amersham) equilibrada com PBS. Os scFv em PBS foram analisados por SDS-PAGE e quantificados por absorção a 280 nm. Os scFv purificados dividiram-se em aliquotas e armazenaram-se a -20 °C e a 4 °C. EXEMPLO 4: Inibição pelo Extracto contendo scFv da Expressão do Gene Repórter Induzida pelo Interferão Gama

Extractos periplasmáticos contendo scFv de diversos anticorpos huIFNy foram produzidos como descrito antes. Para a identificação de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) bloqueadores da actividade do IFNy utilizou-se um ensaio baseado na evidência das células por "High-. Um gene repórter (luciferase do pirilampo) dirigido pelo promotor GBP1 IFNy susceptivel de indução foi transfectado para a linha de células de melanoma humano, Me67.8. Concomitantemente adicionaram-se ambos scFv e IFN à cultura das células. Após um periodo de incubação de 6 horas, realizou-se o ensaio do repórter com a luciferase. 0 scFv que se averiguou inibir a indução da luciferase do pirilampo ficou retido para posterior validação.

Alguns extractos de scFv inibiram o gene repórter induzido pelo IFNy de um modo dependente da dose (Figura 15). Para cada clone de scFv apresentado na Figura 15, ensaiaram-se diversas concentrações (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 e 0,011 nM) como representado através das colunas anteriores pelo nome de cada clone (concentração decrescente da esquerda para a 89 direita). A inibição em percentagem exibida por cada extracto contendo scFv nessas diversas concentrações é apresentada no seguinte Quadro 3.

Quadro 3:Inibição em % da expressão do gene repórter induzida pelo IFNy utilizando extractos periplásmicos contendo scFv [ scFv] nM I Ã6 I H8 I ~ D8 I CIO B4 B9F9A4 EI C9G7I G10 I D6G6G9 D3 F8 2,7 82 80 85 60 63 63 62 68 36 43 56 75 47 82 73 52 69 64 0,68 92 75 86 60 50 49 53 32 1 68 67 73 44 73 66 12 55 64 0,17 100 65 87 40 53 21 56 3 0 38 58 24 0 31 25 0 36 48 0,043 87 26 65 10 34 5 0 0 0 10 33 38 0 11 0 0 28 0 0,011 0 0 13 0 19 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 20 0 EXEMPLO 5 Inibição pelo scFv da Expressão da Classe II do MHC Induzida pelo Interferão Gama

Para identificar anticorpos IgG totalmente humanos, ou seus fragmentos, capazes de bloquear a expressão de moléculas da classe II do MHC induzida pelo IFNy implementou-se um ensaio de citometria de fluxo. Após o plaqueamento de células Me67.8, adicionaram-se às culturas 5 ng/ml de IFNy recombinante humano na presença de diversas concentrações de anticorpos monoclonais anti IFNy totalmente humanos candidatos. Após 48 h em cultura, coraram-se as células com anticorpos anti-células da classe II do MHC (HLA-DR) por fluorescência e analisaram-se utilizando um FACSCalibur®. Assim, determina-se o CI5o (em que 50% da expressão da classe II do MHC induzida por IFNy é inibida, isto é, a concentração inibitória 50%) para cada anticorpo candidato.

Produziram-se scFv totalmente humanos purificados como descrito antes no Exemplo 1. Avaliou-se o efeito do scFv no que se refere à expressão da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma utilizando o ensaio com evidência celular por citometria de fluxo descrito antes. Esses scFv 90 inibiram a expressão das células da classe II do MHC induzida por IFNy em células de melanoma. (Figura 16, Gráficos 1-12). A capacidade desses clones para inibir a expressão de células de classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma foi comparada com um mAb de murganho anti IFN-y humano referido na presente invenção como clones 16C3.scFv (-) e o mAbl6C3 de murganho anti-IFN-γ humano (—) estão representados na Figura 16.

EXEMPLO 6: Reformatação do scFv na Forma IgG

Produziram-se scFv totalmente humanos purificados como descrito antes no Exemplo 1. Amplificaram-se as sequências das VH e VL dos scFv escolhidos com oligonucleótidos específicos introduzindo uma sequência líder e um sítio de restrição HindIII na extremidade 5'. Introduziu-se um sítio Apal ou Avrll na extremidade 3' da sequência das cadeias pesadas e leves, respectivamente. As sequências VH amplificadas foram digeridas HindiII/Apal e clonadas no vector de expressão pCon_gammal (LONZA, Basileia, Suíça). As sequências VL amplificadas foram digeridas com HindIII/AvrIl e clonadas no vector de expressão pCon_lambda2 (LONZA). As construções foram confirmadas por sequenciação antes da transfecção em células de mamíferos.

As sequências de cDNA das VH e VL foram transfectadas nos seus vectores de expressão adequados em células de mamíferos utilizando o Reagente de Transfecção Fugene 6 (Roche, Basileia, Suíça). Resumidamente, cultivaram-se células Peak em placas de 6 cavidades em uma concentração de 6 x 105 células por cavidade em 2 ml de meio de cultura contendo soro fetal bovino. Os vectores de expressão, que codificam as sequências VH e VL candidatas, foram co-trans- 91 fectadas nas células utilizando o reagente de transfecção Fugene 6 de acordo com as instruções do fabricante. Um dia após a transfecção, aspirou-se o meio de cultura, e adicionaram-se às células 3 ml de meios recentes isentos de soro e cultivaram-se durante três dias à temperatura de 37 °C. Após o período de cultura de três dias, recolheu-se o sobrenadante tendo em vista a IgG purificada das colunas das proteínas G. A IgG totalmente reformatada purificou-se a partir de sobrenadantes isentos de soro provenientes de células transfectadas utilizando colunas de fluxo rápido de proteína G-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, incubaram-se sobrenadantes provenientes de células transfectadas durante a noite a 4 °C com tampão de ligação à IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Seguidamente as amostras passaram pelas colunas de fluxo rápido de Proteína G-Sepharose 4B e consequentemente purificou-se a IgG utilizando tampão de eluição. Dializou-se seguidamente a fracção de IgG eluída face a PBS e quantificou-se o teor em IgG por absorção a 280 nm. A pureza e a integridade da IgG foram verificadas por SDS-PAGE. EXEMPLO 7: Inibição da Expressão das Células da Classe II do MHC Induzida pelo Interferão Gama utilizando um scFv reformatado

Reformataram-se scFv em uma forma IgG como descrito antes. O efeito dos clones de IgG relativamente à expressão da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma avaliou-se utilizando o ensaio com evidência celular por citometria de fluxo descrito antes no Exemplo 2 como apresentado na Figura 17. 92

Nos gráficos 1-7, esses clones IgG inibiram a expressão da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma. A capacidade desses clones de IgG para inibir a expressão da classe II do MHC induzida pelo IFNy em células de melanoma foi comparada com a do mAb 16C3 de murganho humano anti-IFNY e do anticorpo MAB285 de murganho anti-IFNY humano do R&D Systems. Estão esquematizados clones totalmente IgG (-X-) , o mAb 16C3 (-A-) de murganho anti-IFNY humano, e o MAB285 de murganho anti-IFNY humano de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) do mouse (-M) são sendo descrito.

Seguidamente apresentam-se no Quadro 4 valores da CI50 para esses clones de IgG

Quadro 4. Análise da CI50 de anticorpos monoclonais anti-IFNy totalmente humanos

mAb Ig6 Ensaio da CI50 baseado nas Células de inibição da Classe II do MHC 16C3 ΙΟΟρΜ MAB285 4 00pM AC1.2R3P2_A6 4 lpM AD14R4P1_B9 322pM AC1.4R4P2 CIO 203pM AC1.2R3P2 D8 7 08pM AD1.3R3P5 F8 1525pM AD1.3R3P6 F9 185pM AD14R4P2 G7 233pM EXEMPLO 8: "Back-Mutation" em Clones do Anticorpo para o huIFNy da Sequência Germinativa

Nos estudos descritos na presente invenção, os restos de nucleótidos e de aminoácidos da sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos do clone A6 foram mutados para corresponder ao resto do nucleótido ou do aminoácido encontrado na sequência da linha germinativa. Esse processo é referido na presente invenção como "back-mutation" ("trazer de volta mutações"). 93

Cadeia pesada do A6: 0 gene variável pesado da região da imunoglobulina do anticorpo A6 apresentou uma homologia de 100% com a linha germinal humana DP-47 ou IGHV3-23 (número de admissão no GenBank M99660). A região de junção da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHJ) do A6 comparou-se às seis regiões IGHJ funcionais humanas. A região IGHJ da A6 identificou-se como IGHJ2 (Quadro 5A seguinte), mas tinha uma melhor homologia global com a IGHJ5-02 (Quadro 5B seguinte). A região IGHJ original do A6 foi portanto mutada para corresponder à sequência da IGHJ5-02, mas apenas para a sequência fora da CDR3. Restos de nucleótidos e de aminoácidos mutados apresentam-se em quadrados nos Quadros 5A e 5B, e as regiões CDR estão sublinhadas.

Quadro 5A: Comparação entre ο A6 e genes IGHJ2 humanos funcionais ^CÃCA^^TTCGA{^c|jjChGGGGCC<^GGCACCCTGGTCACf^TCTC^KG^ AS íseq it> KOsioaí H IÍ ^FO gWGRGTLVTVSS íseq rt> ncciio} CTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA IGHJ2 ism ID 80=111) y W Y F P I» WGRGTAVTVS S fssq id soa«> COR 3

Quadro 5B: Comparação entre ο A6 e o gene IGHJ5-02 humano funcional ÍC^\CTGGTTCGACCCCTGÍ3GGCCBgGQQaCCCTGGTCACCGTCTCPÃg5 A6 iSSQ id KO.U13) ”^|§ WPDPWGgGTOVTVSS {SEO ID 80:114) ACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCCTCTCCTCA iGKCrs-oa (seo id sfo-.ii! _HT W F O P WGQGThVTVSS íssq id B0:iis) CDR 3

Cadeia leve do A6: 0 gene variável lambda (VL) da imunoglobulina do anticorpo A6 pertence ao subgrupo IGLV6-57 ou Vl-22 (Número de Admissão no GenBank Z73673) . 0 VL do A6 apresenta 7 mutações em comparação com o IGLV6-57, três nas CDRs e quatro nas regiões "frameworks" (Quadro 6 seguinte). Os restos de nucleótidos e de aminoácidos mutados apresentam- 94 -se em quadrados no Quadro 6, e as regiões CDRs estão sublinhadas.

As quatro mutações nas regiões "framework" são: Ser para Ala na região framework 2 em posição Kabat 43; Ser para Thr na região 3 em posição Kabat 72; Lys para Glu e Thr para Ala na região framework 3 em posições Kabat 79 e 80, respectivamente. As quatro mutações nas regiões framework mudaram primeiro individualmente, seguidamente voltaram todas em conjunto para o correspondente resto da linha germinal humana. As mutações desses quatro restos que voltaram para o aminoácido correspondente da linha germinal humana não alteraram de qualquer forma a afinidade de ligação do anticorpo NI-0501, designado também na presente invenção como "A6 backmutated", ao seu antigénio alvo quando em comparação com o anticorpo A6. As mutações da sequência da VL do A6 em relação ao resto correspondente da linha germinal na CDRl (Ala para Vai) e na CDR2 (Gin para Arg) realizaram-se tendo-se demonstrado não se ter modificado a afinidade global do huIFNy para o anticorpo NI-0501 ("A6 backmutated") em comparação com o anticorpo A6.

Quadro 6: Comparação entre A6 e o gene IGHV6-57 humano funcional CDR 1 (5|) CBR 2 A6-VL ^rmTQPHSVSBSFGK^TieCTReSSS^SWQWYQORKSSIãlPTTl.UYEO^RPSGVP 60 ******************♦·*** * * * * * * * ^ * * * ** * fc******^*******·**^*#**** m j73,8Õ| COR 3

Hutnsn IGOVS-S? DSFSGSIDSSSfijsjftSLTISGLSgBDEADYYCQSTOfslsH...............36 (SEQ ID NO :117) AS-WO na (SEO td NO;116) * ******** J J *********** A* * *

As sequências completas das cadeias pesada e leve do NI-0501 estão apresentadas nas Figuras 1A-1D. Os restos de nucleótidos e de aminoácidos que foram "backmutated" para 95 produzir o anticorpo NI-0501 (isto é, aqueles nucleótidos e restos que foram alterados a partir da sequência original do A6) estão sublinhados e em itálico nas Figuras IA e 1C.

EXEMPLO 9: Afinidade e Cinética de Ligação do Anticorpo para o huIFNY A afinidade e a cinética de ligação do anticorpo NI-0501 para/ao huIFNY foram caracterizadas em um aparelho Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). Imobilizaram-se 200 RU do NI-0501 por quimica EDC/NHS em um chip Biacore Cl. Avaliou-se a ligação mediante passagem do hlFNY (R&D Systems) em tampão HBS-EP em concentrações entre 200 nM e 1 nM. O caudal foi de 100 μΐ/minuto fixando-se a temperatura a 25 °C. Ajustaram-se os dados de acordo com o modelo de Langmuir 1:1 e determinaram-se os valores de Κοη, K0ff e KD (Figura 18) . EXEMPLO 10: Actividade do Anticorpo para o huIFNy

Comparou-se a actividade do anticorpo NI-0501 para o huIFNY com a actividade do anticorpo produzido utilizando o clone A6 (ou seja, o anticorpo A6 para o huIFNy) . Nesse estudo, avaliou-se a capacidade de cada anticorpo para o huIFNy para inibir a "up-regulation" das células da classe II do MHC induzida pelo IFNy recombinante humano (rhuIFNy) na linha de células de melanoma humano, Me67.8 Resumidamente, incubaram-se células de melanoma Me67.8 com rhuIFNy, na presença de NI-0501 ou do anticorpo A6 para o huIFNy durante 48-72 horas. Determinou-se a "up-regulation" das células da classe II do MHC como descrito antes no Exemplo 5. Os dois anticorpos apresentaram uma actividade similar, o que demonstra que trazer de volta mutações ("backmutations") no anticorpo NI-0501 para o huIFNy não modificaram a actividade do anticorpo (Figura 19). 96 [0196] Seguidamente analisou-se a actividade do anticorpo NI-0501 para o huIFNY relativamente ao IFNy nativo. Nesse estudo, activaram-se as células mononucleares do sangue periférico humanas (PBMC) com 1 yg/ml do mitogénio PHA durante 48 h, e analisaram-se os sobrenadantes através de ELISA quanto à presença do IFNy nativo. Seguidamente utilizou-se esse sobrenadante para estimular a up-regulation das células da Classe II do MHC nas células Me67.8. O NI-0501 foi capaz de neutralizar a up-regulation da classe II do MHC induzida pelo IFNy humano nativo (Figura 20). EXEMPLO 11: Reactividade-Cruzada do Anticorpo para o huIFNy

Ensaio de ligação: avaliou-se o NI-0501 quanto à sua capacidade de se ligar ao IFNy recorrendo a um ensaio que utiliza o formato denominado ELISA Sanduíche. Resumidamente capturou-se IFNy proveniente das espécies mencionadas no título de cada gráfico apresentado na Figura 21 com NI-0501 pré-revestido (-A-) ou o mAb de controlo anti-IFNY de cada espécie (--). O IFNy de cada espécie detectou-se utilizando um anticorpo policlonal específico para o IFNy naquele ensaio. Como observado na Figura 21, o NI-0501 que se liga ao IFNy de rato é semelhante ao anticorpo controlo, mas não ao das outras espécies, excluindo o macaco cinomorfo.

Neutralização da actividade do IFNy: Analisou-se o anticorpo NI-0501 quanto à sua capacidade para neutralizar ou inibir proteínas do IFNy recombinante provenientes de algumas espécies diferentes. Resumidamente, cultivou-se o IFNy recombinante proveniente de diversas espécies analisadas com células Me67.8 na presença ou na ausência do NI-0501 durante 48-72 h. Determinou-se a "up-regulation" (regulação de forma positiva) das células de classe II do MHC como descrito antes no Exemplo 5. A reactividade cruzada com, e a neutralização 97 do, IFNy cinomorfo demonstrou-se mediante inibição da "up-regulation" das células de classe II do MHC na linha de células de melanoma humano, Me67.8 (Figura 21). 0 NI-0501 foi capaz de inibir o IFNy proveniente de macacos cinomorfos mas não pode neutralizar o IFNy proveniente de outras espécies analisadas, não demonstrando o anticorpo reactividade cruzada com essas espécies (Quadro 7).

Quadro 7:Reactividade cruzada do NI-0501 NI-0501 nhuIFNy rhuIFNy necylFNy rcylFNy rdIFNy rcIFNy rrIFNy rmIFNy Ligação + + + + - - - - Neutralização + + + + * * * * nhu = IFNy humano nativo rhu = IFNy humano recombinante ncy = IFNy cinomorfo nativo rcy = IFNy recombinante rd = IFNy de cão recombinante rc = IFNy de gato recombinante rr = IFNy murino recombinante

Orm = IFNy de murganho recombinante + = interreage - = não interreage * = não ensaiado

Além disso, activaram-se células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) cinomorfas com 1 pg/ml do mitogénio PHA durante 48 h, e analisaram-se os sobrenadantes através de ELISA quanto à presença do IFNy nativo. Esse sobrenadante utilizou-se depois para estimular a "up-regulation" das células da classe II do MHC na Me67.8. 0 NI-0501 foi capaz de neutralizar a "up-regulation" das células da classe II do MHC induzida pelo IFNy cinomorfo nativo (Figura 22). EXEMPLO 12: Actividade Biológica do Anticorpo para o huIFNy

Os estudos descritos na presente invenção foram concebidos para analisar a actividade biológica do anticorpo NI-0501 para o huIFNy mediante administração a macacos 98 cinomorfos ("cynomolgus"). Escolheu-se o NI-0501 tendo em vista os estudos de segurança e de farmacocinética [pharmacokinetics (PK)] descritos na presente invenção porque se observou que esse anticorpo para o huIFNy interreage ("cross-react") com o IFNy dos macacos cinomorfos, como descrito antes. Para avaliar os efeitos clinicos adversos após várias perfusões intravenosas, administraram-se aos macacos por perfusão as seguintes doses: 30 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg.

Em murganhos com um gene do IFNy interrompido ("disrupted"), observaram-se concentrações decrescentes de IgG2a e concentrações crescentes de IgGl em resposta à imunização pela KLH [Keyhole Limpet Hemocyanin (Hemocianina do molusco Keyhole Limpet)], demonstrando a correlação entre o IFNy e a resposta da IgG. Durante o principal estudo toxicológico de 13 semanas, imunizaram-se os macacos com KLH em Adjuvante de Freund incompleto (IFA). Uma resposta imunitária caracteristica a KLH/IFA em macacos, co-tratados com placebo, elicia uma resposta IgM e IgG especifica da KLH detectável no soro. Esses estudos são concebidos para avaliar se a neutralização do IFNy em macacos tratados com NI-0501 que foram imunizados com KLH em IFA, altera o titulo da IgG especifica da KLH. EXEMPLO 13:Modulação da Actividade do IFNy Utilizando Anticorpos para huIFNy A produção da quimiocina IP-10 é regulada em alta ("up-regulated") pelo IFNy em algumas diferentes linhas de células. Com base nessa observação realizou-se um ensaio de sangue completo. Nesse ensaio de sangue completo, misturaram-se amostras de sangue completo provenientes de alguns dadores com uma concentração fixa de IFNy e diferentes concentrações 99 de NI-0501. Após a incubação, determinaram-se as concentrações da IP-10 por ELISA como um processo para avaliar a eficácia do anticorpo anti-IFNY para bloquear a produção da IP-10 (Figura 23) .

Outras Formas de Realização

Embora a presente invenção tenha sido relatada em conjunto com a sua descrição detalhada, a exposição anterior propõe-se esclarecer e não limitar o alcance da presente invenção, o qual é definido pelo âmbito das reivindicações anexas.

Lisboa, 13 de Abril de 2012.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-IFNY monoclonal totalmente humano isolado ou um seu fragmento, em que o referido anticorpo compreende: (a) uma região CDR1 da VH que compreende a sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ-ID NO: 3); (b) uma região CDR2 da VH que compreende a sequência de aminoácidos AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4); e (c) uma região CDR3 da VH que compreende a sequência de aminoácidos DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID N0:5), (d) uma região CDR1 da VL que compreende a sequência de aminoácidos TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO:8); (e) uma região CDR2 da VL que compreende a sequência de aminoácidos EDNQRPS (SEQ ID NO:9); e (f) uma região CDR3 da VL que compreende a sequência de aminoácidos QSYDGSNRWM (SEQ ID NO:10). e em que o referido anticorpo se liga ao IFN-γ humano.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1., em que o mencionado anticorpo é de isotipo IgG.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1., em que o mencionado anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 e uma região variável de cadeia leve que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7.

4. Composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3. e um veiculo.

5. Utilização de um anticorpo anti-IFNY no fabrico de um medicamento para aliviar um sintoma de uma doença auto- 2 -imunitária ou de um processo inflamatório em um paciente com essa necessidade, em que o referido anticorpo é um anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3., e em que o referido anticorpo está presente no mencionado medicamento em uma quantidade suficiente para aliviar o sintoma da doença auto-imunitária ou do processo inflamatório no paciente.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 5., em que o mencionado paciente é o homem.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 5., em que se escolhe a mencionada(o) doença autoimunitária ou processo inflamatório no grupo constituído por Doença de Crohn, lúpus eritematoso sistémico, psoriase, artrite reumatóide, vasculite, dermatite atópica e esclerose múltipla secundária progressiva.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 5., em que se formula o mencionado medicamento para administração endovenosa.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 5., em que se co-administra o mencionado anticorpo com um segundo agente escolhido no grupo constituído por: (a) uma anti-citosina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre interleucinas 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) um reagente anti-quimiocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; e (c) uma quimiocina escolhida entre MIP 1 alfa, MIP 1 3 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e a fractalcina.

10. Utilização de um anticorpo anti-IFNY no fabrico de um medicamento para reduzir a expressão das moléculas da classe II do Complexo major de histocompatibilidade [MHC (Major histocompatibility complex)] em uma célula, em que o referido anticorpo anti-IFNY é um anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3., em que se formula o referido medicamento para contactar uma célula, e em que o referido anticorpo anti-IFNY está presente no referido medicamento em uma quantidade suficiente para reduzir a expressão das moléculas da classe II do MHC na referida célula.

11. Utilização de acordo com a reivindicação 10., em que a mencionada célula é uma célula de melanoma humano.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 10., em que se faz contactar a mencionada célula com um segundo agente escolhido no grupo constituído por: (a) uma anti-citocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre interleucinas 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) um reagente anti-quimiocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; e (c) uma quimiocina escolhida entre MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e fractalcina.

13. Anticorpo anti-IFNY para utilização em um processo para aliviar um sintoma de uma doença auto-imunitária ou de um processo inflamatório em um paciente com essa necessidade, em 4 que o referido anticorpo é um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1. a 3..

14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13. para utilização no processo de acordo com a reivindicação 13., em que o referido paciente é um humano.

15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13. para utilização no processo de acordo com a reivindicação 13., em que se escolhe a(o) referida(o) doença autoimunitária ou processo inflamatório no grupo constituído por Doença de Crohn, lúpus eritematoso sistémico, psoríase, artrite reumatóide, vasculite, dermatite atópica e esclerose múltipla secundária progressiva.

16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13. para utilização no processo de acordo com a reivindicação 13., em que se administra o referido anticorpo por via intravenosa.

17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13. para utilização no processo de acordo com a reivindicação 13., em que se co-administra o referido anticorpo com um segundo agente escolhido no grupo constituído por: (a) uma anti-citocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre interleucinas l(IL-l), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) um reagente anti-quimiocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; e (c) uma quimiocina escolhida entre MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e fractalcina. 5

18. Anticorpo anti-IFNY para utilização em um processo de redução da expressão das moléculas da classe II do Complexo major de histocompatibilidade [MHC (Major histocompatibility complex) ] em uma célula, em que o referido anticorpo anti-IFNY é um anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3., em que se formula o referido anticorpo anti-IFNY para contactar uma célula em uma quantidade suficiente para reduzir a expressão das moléculas da classe II do MHC na referida célula.

19. Anticorpo anti-IFNY de acordo com a reivindicação 18., para utilização no processo de acordo com a reivindicação 18., em que a referida célula é uma célula de melanoma humano.

20. Anticorpo anti-IFNY de acordo com a reivindicação 18., em que se faz contactar a referida célula com um segundo agente escolhido no grupo constituído por: (a) uma anti-citocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre interleucinas l(IL-l), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; (b) um reagente anti-quimiocina que reconhece uma ou mais citocinas escolhidas entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 e IL-31; e (c) uma quimiocina escolhida entre MIP1 alfa, MIP1 beta, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF e fractalcina. Lisboa, 13 de Abril de 2012.