[go: up one dir, main page]

CN112794903B - 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用 - Google Patents

一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112794903B
CN112794903B CN202110398237.XA CN202110398237A CN112794903B CN 112794903 B CN112794903 B CN 112794903B CN 202110398237 A CN202110398237 A CN 202110398237A CN 112794903 B CN112794903 B CN 112794903B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gamma
antibody
sequence
chain variable
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110398237.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112794903A (zh
Inventor
楼建荣
杨翔
谢桂华
黄慧红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Leide Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Leide Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Leide Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Leide Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110398237.XA priority Critical patent/CN112794903B/zh
Publication of CN112794903A publication Critical patent/CN112794903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112794903B publication Critical patent/CN112794903B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了涉及生物技术领域，公开了一种特异性结合IFN‑γ的抗体及其应用。抗体包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，重链可变区的HCDR1序列为SYWIH，HCDR2序列为AIDPSDSYTMHNEKFKD，HCDR3序列为GRLDY；轻链可变区LCDR1序列为KSSQSLLDSDGETYLN，LCDR2序列为LVSKLDS，LCDR3序列为WQNTHSPRT。本发明的特异性结合IFN‑γ抗体是针对真核表达的IFN‑γ抗原筛选出的，可应用于进行所有关于人的IFN‑γ的检测，抗体的特异性较高，可以开发成为IFN‑γ检测试剂、吸附剂等。

Description

一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用。
背景技术
γ-干扰素是一个重要的能行使免疫调节功能的细胞因子，其在一系列炎症反应中，可由许多的细胞分泌，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞等。并且在CAR-T细胞回输治疗过程，高度增殖的T细胞会引起细胞因子释放综合症（CRS）,血液中的IFN-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子会明显升高，出现“细胞因子风暴”。对γ-干扰素的检测在生物医学的科研中，体外诊断中都具有重大意义。IFN-γ细胞因子作为免疫学检测指标，其免疫学检测是在特异性抗IFN-γ抗体的基础上对样本中的IFN-γ定性定量分析。
结核病作为一种主要经呼吸道传播引起的全身慢性传染病，作为全球十大死因之一，其已然成为了一个社会关注的公共卫生问题。IGRAs（γ-干扰素释放试验）作为国际最新的用于结核杆菌感染的体外免疫诊断方法，其原理主要是人体初次感染结核菌后，使Ｔ淋巴细胞转化为记忆Ｔ淋巴细胞，当人体再次接触结核分枝杆菌后，会迅速产生效应Ｔ淋巴细胞，释放多种细胞因子，其中γ-干扰素是最关键的细胞因子，在机体外用分枝杆菌特异抗原刺激受试者外周血单个核细胞，若其中含有记忆Ｔ淋巴细胞，就会分泌大量IFN-γ细胞因子，测定分离至全血或单个核细胞的IFN-γ释放水平，可以判断是否有结核杆菌感染。γ-干扰素释放试验克服了结核菌素试验（TST）的不足，其采用结核特异性抗原刺激记忆T淋巴细胞，使其释放IFN-γ细胞因子，这些特异性抗原只存在于结核分枝杆菌复合群，具有高灵敏度和特异性，不仅可区分卡介苗接种（BCG）与非结核分枝杆菌（NTM）感染，还可用于肺外结核检测。
现有技术中制备的抗IFN-γ抗体大多为使用多肽或原核表达的抗原筛选的抗体，检测效果不佳，特异性较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种特异性结合IFN-γ的单克隆抗体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种特异性结合人IFN-γ的抗体，包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，
重链可变区的HCDR1序列为SYWIH，HCDR2序列为AIDPSDSYTMHNEKFKD，HCDR3序列为GRLDY；
轻链可变区LCDR1序列为KSSQSLLDSDGETYLN，LCDR2序列为LVSKLDS，LCDR3序列为WQNTHSPRT。
在一些实例中，所述重链可变区的恒定区序列包含HFR1～HFR4中的至少一条，其中：
HFR1：QVQLQQPGAELVKPGASVRMSCKASGYTFT；
HFR2：WVKQRPGQGLEWIG；
HFR3：KATLTVDASSNTAHMQLSGLTSEDSAVYYCTA；
HFR4：WGQGTTLTVSS。
在一些实例中，所述重链可变区的氨基酸序列为HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。
在一些实例中，所述轻链可变区的恒定区序列包含LFR1～LFR4中的至少一条，其中：
LFR1：DVVMTQTPLTLSVAIGQPASISC；
LFR2：WLLQRPGQSPKRLIY；
LFR3：GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC；
LFR4：FGGGTKLEIK。
在一些实例中，所述轻链可变区的氨基酸序列为LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在一些实例中，所述重链可变区的氨基酸序列为HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4，所述轻链可变区的氨基酸序列为LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在一些实例中，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双特异性抗体。Fab片段可以不同种属的Fc序列搭配使用；轻链和重链序列可通过设计形成sc Fv进行使用；轻链和重链可应用于双特异性抗体。
本发明的第二个方面，提供：
编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。
所述核苷酸序列可以根据具体的需要进行调整，如根据宿主的不同进行相应的调整，如进行密码子优化等，以使其可以更好地整合到宿主中进行表达。
本发明的第三个方面，提供：
一种表达系统，其可以表达本发明第一个方面所述的抗体，或含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列。
在一些实例中，所述表达系统的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞等现有的宿主细胞。
本发明的第四个方面，提供：
一种结合人IFN-γ的制剂，其含有本发明第一个方面所述的抗体。
在一些实例中，所述制剂还包括可接受的辅料。
本发明的第五个方面，提供：
本发明第一个方面所述抗体的应用，所述应用包括但不限于：
制备人IFN-γ检测试剂盒；
制备人IFN-γ吸附剂；
制备结核分枝杆菌的检测试剂盒，用于检测经结核特异性抗原刺激后γ-干扰素的释放水平；
制备治疗IFN-γ介导的综合征的制剂。
本发明的有益效果是：
本发明的特异性结合IFN-γ抗体是针对真核表达的IFN-γ抗原筛选出的，可应用于进行所有关于人的IFN-γ的检测，抗体的特异性较高。
本发明的特异性结合IFN-γ抗体可用于IFN-γ的检测试剂盒中，具体为，可针对以IFN-γ作为靶标或生物标志物进行诊断的试剂盒。根据检测方法的不同，试剂盒可以是Western-Blot检测试剂盒、FCM检测试剂盒、Pull-down检测试剂盒、ELISA检测试剂盒。试剂盒可包括检测所需的其他多种试剂，可根据需要进行自行配置或外购得到。
本发明的特异性结合IFN-γ抗体可广泛应用于免疫学研究，用作人免疫状态的评价及感染性疾病诊断的相关研究。
本发明的特异性结合IFN-γ抗体，可以作为吸附剂吸附去除血液中过量的IFN-γ，进而对IFN-γ介导的综合征直到一定的治疗或辅助治疗作用。
附图说明
图1是本发明的特异性结合IFN-γ抗体的SDS-PAGE电泳图；
图2是本发明的特异性结合IFN-γ抗体的检测人IFN-γ的标准曲线。
具体实施方式
本发明的特异性结合IFN-γ抗体，也可以通过重组蛋白的形式进行生产。用于表达重组蛋白的核苷酸序列可以基于现有技术构建得到。用于表达单克隆抗体的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括但不限于为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞COS细胞。
IFN-γ介导的综合征包含但不限于发炎、后天免疫缺陷综合征(AIDS)、类风湿性关节炎，包括青少年类风湿性关节炎、发炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)、多发性硬化症、艾迪生病(Addison’sdisease)、糖尿病(第I型)、副睪炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林巴利综合征(Guillain-Barresyndrome)、桥本病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、动脉粥样硬化、红血球生成素阻抗性、移植物抗宿主病、移植排斥、自体免疫性肝炎诱发的肝损伤、胆汁性肝硬化、酒精诱发的肝损伤，包括酒精性肝硬化、风湿热、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏综合征(Sjogren’ssyndrome)、脊柱关节病、强直性脊柱炎、川崎病(kawasaki disease)、干眼病、噬血细胞淋巴组织细胞增多症、巨噬细胞活化综合征、甲状腺炎、血管炎，或其组合。通过吸附去除血液中过量的IFN-γ有望治疗或缓解相关疾病。
下面结合以下实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1:单克隆抗体的制备
步骤1：小鼠免疫
免疫原：人IFN-γ抗原（外购：南京金斯瑞生物科技有限公司），小鼠选择4-5周雌性Balb/c健康小鼠。取1xPBS溶解的人IFN-γ抗原100ug，用注射器将弗氏佐剂和人INF-γ抗原按照体积比1:1混合成油包水乳浊液制成免疫原。
初次免疫：免疫剂量为100ug/只，采用背部多点注射法；两周后二次免疫：免疫剂量为50 ug/只，采用背部多点注射法；二次免疫一周后，第1次采血进行效价检测，效价应大于1:10000；四周后三次免疫：免疫量为100 ug/只，采用背部多点注射法；三次免疫一周后，第2次采血进行效价检测，效价应大于1:100000；加强免疫，在细胞融合前3天，取50ug人IFN-γ抗原采用生理盐水配置200ul，免疫量为50ug/只，采用腹腔注射。
步骤2：杂交瘤细胞融合
取没有被免疫接种过免疫原的6-10周Balb/c健康小鼠的骨髓瘤细胞，扩大培养至细胞浓度不低于0.2-1×107个/ml，将加强免疫的小鼠摘眼球采血，作为阳性血清，采血后的小鼠手术切除脾脏，去除结缔组织，经培养研磨后，制得小鼠脾细胞悬液，细胞数量至少要达到5×107个/ml，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞并培养7d。
步骤3：阳性杂交瘤细胞株的筛选
采用间接ELISA检测杂交瘤融合细胞上清中抗体，并将培养7d的杂交瘤融合细胞培养上清加入包被好的酶标板中，每板分别选取无细胞生长的两孔作为阴性对照，选取无细胞生长两孔加入100ul的稀释好的阳性对照血清，以450、630双波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作出判断为阳性孔，采用倒置显微镜观察细胞生长情况，根据筛选出阳性杂交瘤细胞数较少的高值阳性结果的阳性杂交瘤细胞。
步骤4：阳性杂交瘤细胞的克隆培养
将上述筛选出的每组阳性杂交瘤细胞制备成细胞悬液，计算细胞浓度，将细胞浓度调整至5-8个/ml，将调整好的细胞悬液100ul/孔加入新的96孔细胞培养板中，使得每个孔中含有1个细胞，培养3-5d待96孔中的杂交瘤细胞生长至孔底面积中的30%以上时，通过间接ELISA法检测杂交瘤细胞上清中抗体。经过3-5次克隆化，直到阳性率达到100%，收集阳性细胞悬液。
步骤5：单克隆抗体表达与测序
将步骤4培养到细胞密度1×106cells/ml，细胞活率大于90%时，加入VPA（2-丙基戊酸钠盐），放置于37℃，5%CO2，100rpm恒温摇床中培养，将培养的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体序列。
步骤6：单克隆抗体的生产与纯化
5-6周健康Balb-c小鼠注射0.5ml/只石蜡油，使得小鼠致敏，将上述细胞悬液离心去上清，加入生理盐水至细胞浓度为1×106～2×106个/ml，吸取10ml的细胞悬液腹腔注射小鼠，每只小鼠注射0.5ml，5d后抽取腹水，离心吸取腹水上清，将制备的腹水先经饱和硫酸铵沉淀，制备出鼠抗-人IFN-γ抗体粗品，之后经亲和层析柱Protein G进行纯化。
经筛选得到效价较高的特异性结合人IFN-γ的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图如图1所示。对单克隆抗体纯度进行检测，观察55KD、26KD左右处可见目标条带，无其他条带或显色较弱的杂带。通过凝胶成像系统分析单克隆抗体纯度≥95%。
测序结果分析表明，该特异性结合人IFN-γ的单克隆抗体包括一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其中，重链可变区的HCDR1序列为SYWIH（SEQ ID NO.：1），HCDR2序列为AIDPSDSYTMHNEKFKD（SEQ ID NO.：2），HCDR3序列为GRLDY（SEQ ID NO.：3）；
轻链可变区LCDR1序列为KSSQSLLDSDGETYLN（SEQ ID NO.：4），LCDR2序列为LVSKLDS（SEQ ID NO.：5），LCDR3序列为WQNTHSPRT（SEQ ID NO.：6）。
所述重链可变区的恒定区序列包含HFR1～HFR4，其中：
HFR1：QVQLQQPGAELVKPGASVRMSCKASGYTFT（SEQ ID NO.：7）
HFR2：WVKQRPGQGLEWIG（SEQ ID NO.：8）
HFR3：KATLTVDASSNTAHMQLSGLTSEDSAVYYCTA（SEQ ID NO.：9）
HFR4：WGQGTTLTVSS（SEQ ID NO.：10）。
所述轻链可变区的恒定区序列包含LFR1～LFR4中的至少一条，其中：
LFR1：DVVMTQTPLTLSVAIGQPASISC（SEQ ID NO.：11）
LFR2：WLLQRPGQSPKRLIY（SEQ ID NO.：12）
LFR3：GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC（SEQ ID NO.：13）
LFR4：FGGGTKLEIK（SEQ ID NO.：14）。
所述重链可变区的氨基酸序列为HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4，所述轻链可变区的氨基酸序列为LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
实施例2：单克隆抗体的效价测定
利用的间接ELISA法，采用人IFN-γ包被合格的透明单孔可拆酶标板，分别按下表加入稀释的单克隆抗体和外购的IFN-γ抗体（公司：BD Biosciences），加入酶标抗体（羊抗鼠-HRP）进行效价测定与效价对比。结果：应不低于0.1ug/ml（空白>0.035时，OD大于3倍空白对照OD值；空白<0.035时，OD大于0.105即为阳性），抗体效价实验布板如表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
根据表2结果分析可知，当包被浓度为1ug/ml至0.01ug/ml时，本发明的单克隆抗体与BD公司的IFN-γ抗体的效价均满足质控要求，但本发明的单克隆抗体检测值比BD公司的检测值高，说明本发明的单克隆抗体与进口的BD公司的抗体相比，其效价更高。
实施例3：单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定
以PBS为溶剂，配制如下表中各类细胞因子母液，包被酶标板，用本技术中的单克隆抗体进行间接ELISA法检测，细胞因子配制如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
交叉反应鉴定结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
在1000 pg/mL以下水平的IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-α，IL-12，IFN-α2b，IFN-β细胞因子 ，与0浓度和40 pg/mL的γ-干扰素抗体无显著性交叉反应，说明本发明的单克隆抗体检测IFN-γ具有较好的特异性。
实施例4：ELISA酶联免疫检测试剂盒（双抗体夹心法）
ELISA试剂盒包括：样本稀释液、洗涤液、抗体液、酶标液、底物A、底物B、终止液、校准品、高值质控品、低值质控品、酶标板、封板膜。
其中，样本稀释液可为含BSA的PBS基质液，洗涤液可为含Tween的PBS基质液，抗体液为生物素标记的标记抗体，酶标液为HRP标记的链霉亲和素，底物A为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB），底物B为过氧化脲，终止液为1.0M硫酸，校准品和高、低质控品均为重组IFN-γ冻干品。酶标板采用本技术中的单克隆抗体包被固相载体得到。其中：
标记抗体按以下方法制备：采用正交法，选用纯化后的鼠抗-人IFN-γ抗体作为包被抗体，即鼠抗-人IFN-γ包被抗体，包被酶标板，加入校准品样本，再加入选用生物素标记的鼠抗-人IFN-γ抗体作为标记抗体，即鼠抗-人IFN-γ标记抗体和链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（SHRP），形成包被抗体-抗原-生物素标记抗体+链霉亲和素-HRP复合物，加入底物显色经终止液终止反应，在450nm检测结果。选择校准曲线斜率好、本底低、检测值高的配对组合，进行进一步的性能检测，最终确定包被抗体和标记抗体。
酶标板的包被工艺如下：采用碳酸盐缓冲液选择（CBS,PH9.5±0.1）作为包被缓冲液，将包被抗体按1:300比例进行稀释，100ul/孔加入到 酶标板孔中进行包被，2-8℃包被14-17h后，每孔加入250ul的洗涤液，室温静置1min后，倒到拍干，重复3次，洗涤后采用含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭，200ul/孔封闭液，室温封闭2-3h，最后于36±1℃干燥2-2.5h，得到包被酶标板。
本实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，均为ELISA检测中的通用试剂，可根据需要对其进行自行配置或单独购买。
其中，CBS缓冲液按照如下方法配置：14.26g NaHCO3、3.908g Na2CO3、2ml ProClin300、工艺用水2kg。
洗涤液按照如下方法配置：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
封闭液按照下方法配置：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
使用人IFN-γ阴性血浆对人IFN-γ血浆（定值为9.5ng/mL）进行稀释，制备在已知线性范围内6个浓度水平（1000、333.3、111.1、37、12.3、4.1pg/mL）的样品，每个水平重复测定4次。试剂盒的标准曲线的建立以校准品的浓度为横坐标，OD450-630吸光值（使用酶标仪在光吸收模式下以450nm、630 nm双波长测定光吸收（OD）值，以该孔OD450nm减去OD630nm，再扣除空白孔OD450-630平均值）为纵坐标建立标准曲线，校准曲线如图2所示，回归系数R2≥0.99，可根据标准曲线对样品中IFN-γ进行定量检测。由图2可见，抗体检测人IFN-γ的线性范围4.1-1000pg/mL，相关系数R2不小于0.99，线性范围下限总允许误差1.8pg/mL，相较于同类产品，检测灵敏度更高，其检测范围更广。
实施例5：检测结核分枝杆菌的酶联免疫检测试剂盒的应用
该检测试剂盒用于检测经结核特异性抗原刺激记性T细胞产生的IFN-γ。
使用方法如下：
（1）样本采集：采用肝素真空采血管收集不少于3ml的人静脉血；
（2）刺激管准备：准备好阳性对照管（含外源凝集素），特异性刺激管（含ESAT6-CFP10融合蛋白），阴性对照管（含Tris），组装成三联管；
（3）刺激：将血样颠倒混匀8次，每管各加入600ul的血，然后颠倒刺激管几次，放置在37℃孵育箱孵育20±2h；
（4）收集血浆：在1000g 离心1min，收集血浆至新的EP管；
（5）加样：样本和样本稀释液1:1稀释，加入100ul至酶标板；室温，250rpm摇动孵育60min；
（6）洗涤：每孔加入250ul的洗涤液，室温静置1min，掉到，拍干，重复3次；
（7）二抗孵育：每孔加入100ul抗体液与酶标液混合后的酶结合液，室温250rpm摇动孵育60min；
（8）洗涤：每孔加入250ul的洗涤液，室温静置1min，掉到，拍干，重复5次；
（9）显色：每孔加入100ul显色液，避光显色20±2min；
（10）终止：加入100ul终止液，终止显色；
（11）读数：使用酶标仪在关吸收模式下以450nm、630 nm双波长测定关吸收（OD）值各孔OD值；通过测定各孔的450nm、630 nm的OD值计算OD450-630值。
样本来源：36例样本的医院临床诊断信息为阳性（诊断为肺结核或痰涂、菌培、T-SPOT、分子诊断和Gene Xpert 耐药结核检测，其中一项或多项为阳性）患者32例，阴性患者4例。其与临床诊断检测结果如下，灵敏度为90.63%，灵敏度较高。
Figure DEST_PATH_IMAGE014
本发明的特异性结合IFN-γ抗体可用于IFN-γ的检测试剂盒中，具体为，可针对以IFN-γ作为靶标或生物标志物进行诊断的试剂盒。根据检测方法的不同，试剂盒可以是Western-Blot检测试剂盒、FCM检测试剂盒、Pull-down检测试剂盒、ELISA检测试剂盒。试剂盒可包括检测所需的其他多种试剂，可根据需要进行自行配置或外购得到。
本发明的特异性结合IFN-γ抗体可广泛应用于免疫学研究，用作人免疫状态的评价及感染性疾病诊断的相关研究。
本发明的特异性结合IFN-γ抗体，可以作为吸附剂吸附去除血液中过量的IFN-γ，进而对IFN-γ介导的综合征直到一定的治疗或辅助治疗作用。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州市雷德生物科技有限公司
<120> 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Tyr Trp Ile His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Met His Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Arg Leu Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Trp Gln Asn Thr His Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ala His Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala
20 25 30
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Ala Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10

Claims (10)

1.一种特异性结合人IFN-γ的抗体，包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其特征在于：
重链可变区的HCDR1序列为SYWIH，HCDR2序列为AIDPSDSYTMHNEKFKD，HCDR3序列为GRLDY；
轻链可变区LCDR1序列为KSSQSLLDSDGETYLN，LCDR2序列为LVSKLDS，LCDR3序列为WQNTHSPRT。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的恒定区序列包含HFR1～HFR4中的至少一条，其中：
HFR1：QVQLQQPGAELVKPGASVRMSCKASGYTFT；
HFR2：WVKQRPGQGLEWIG；
HFR3：KATLTVDASSNTAHMQLSGLTSEDSAVYYCTA；
HFR4：WGQGTTLTVSS。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体，其特征在于：所述轻链可变区的恒定区序列包含LFR1～LFR4中的至少一条，其中：
LFR1：DVVMTQTPLTLSVAIGQPASISC；
LFR2：WLLQRPGQSPKRLIY；
LFR3：GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC；
LFR4：FGGGTKLEIK。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列为LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
6.编码权利要求1～5任一项所述抗体的DNA分子。
7.一种表达系统，其可以表达权利要求1～5任一项所述的抗体，或权利要求6所述的DNA分子。
8.根据权利要求7所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统的宿主细胞选自于由大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞组成的组。
9.一种结合人IFN-γ的制剂，其特征在于：其含有权利要求1～5任一项所述的抗体。
10.权利要求1～5任一项所述抗体的应用，其特征在于：所述应用包括：
制备人IFN-γ检测试剂盒；
制备人IFN-γ吸附剂；
制备结核分枝杆菌的检测试剂盒，用于检测经结核特异性抗原刺激后γ-干扰素的释放水平；
制备治疗IFN-γ介导的综合征的制剂。
CN202110398237.XA 2021-04-14 2021-04-14 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用 Active CN112794903B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110398237.XA CN112794903B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110398237.XA CN112794903B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112794903A CN112794903A (zh) 2021-05-14
CN112794903B true CN112794903B (zh) 2021-06-25

Family

ID=75811361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110398237.XA Active CN112794903B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112794903B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116400077A (zh) * 2022-07-04 2023-07-07 广州市雷德生物科技有限公司 鉴别活动性结核病和潜伏性结核病的抗原组合物及其应用
CN115710313B (zh) * 2022-09-14 2025-10-28 江苏睿源生物技术有限公司 用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用
CN116120447B (zh) * 2023-04-17 2024-09-06 北京纳百生物科技有限公司 IFN-γ蛋白单克隆抗体及其应用
CN116284381B (zh) * 2023-05-16 2023-09-05 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 抗IFN-γ的抗体及其应用
CN119591707B (zh) * 2025-02-10 2025-04-29 细胞生态海河实验室 抗人IFN-γ抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375145A (zh) * 2013-07-03 2021-02-19 因美诺克股份公司 人抗IFN-α抗体、IFN-α结合片段、多核苷酸、组合物、试剂盒及应用和制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA01005515A (es) * 1998-12-01 2003-07-14 Protein Design Labs Inc Anticuerpos humanizados para gamma-interferon.
US7335743B2 (en) * 2002-10-16 2008-02-26 Amgen Inc. Human anti-IFN-γ neutralizing antibodies as selective IFN-γ pathway inhibitors
WO2005035753A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
DK1848744T3 (da) * 2005-01-27 2012-03-19 Novimmune Sa Humane anti-interferon-gamma-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse heraf
WO2013078378A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 Amgen Inc. Methods of treatment using an antibody against interferon gamma
CA2996205A1 (en) * 2015-09-20 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (fgfr4) and methods of their use
TWI797124B (zh) * 2017-05-05 2023-04-01 香港商安立璽榮生醫(香港)有限公司 抗干擾素-γ之抗體及其應用
EP4435008A2 (en) * 2017-08-18 2024-09-25 Centessa Pharmaceuticals (UK) Limited Binding agents
CN112105373B (zh) * 2018-03-29 2024-04-05 安立玺荣(上海)生物医药科技有限公司 治疗b型肝炎病毒感染的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375145A (zh) * 2013-07-03 2021-02-19 因美诺克股份公司 人抗IFN-α抗体、IFN-α结合片段、多核苷酸、组合物、试剂盒及应用和制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112794903A (zh) 2021-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112794903B (zh) 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
CN111499746B (zh) 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用
KR20200037258A (ko) 생물학적 약물로 치료받은 피험자에서 중화 항체 수준 평가용 분석법 및 맞춤 의료에서 이의 사용
CA2924405C (en) Biomarkers for tuberculosis
EP2480252A1 (en) Methods, compositions, and kits for reducing anti-antibody responses
CN111004324A (zh) 一种钙卫蛋白单克隆抗体及其应用
CN115353566B (zh) 用于检测白细胞介素1-β的抗体组合及其应用
CN113912719B (zh) 检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN113480659B (zh) 人源抗结核分枝杆菌复合群lam单克隆抗体及其制备和应用
CN116284381B (zh) 抗IFN-γ的抗体及其应用
US20190025301A1 (en) Method And Kit For Diagnosis Of Active Tuberculosis
CN117229411B (zh) 特异性结合25-羟基维生素d的单克隆抗体、其应用及检测试剂盒
CN115710313B (zh) 用于检测γ干扰素的抗体组合及其应用
EP3239711B1 (en) Method for measuring anti-drug antibody
US20210199667A1 (en) Analysis of soluble tlr7 in human-derived sample
CN111458522A (zh) 一种用于检测血浆白细胞介素6天然抗体的检测试剂、试剂盒及其应用
CN115838692B (zh) 抗人突变型促红素鼠单克隆抗体、应用及人重组促红素兴奋剂检测方法
CN118562000A (zh) 抗猴IFN-γ的抗体及其在结核诊断中的应用
CN115960236B (zh) 一种定量检测血清中抗人白介素4受体α单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法
CN104884955B (zh) 抗‑mif抗体的细胞迁移测定方法
WO2025094128A1 (en) ANTI-IFN-γ ANTIBODIES
CN118243802A (zh) 一种抗Siglec-15单克隆抗体电荷异质性的检测方法
CN120992933A (zh) 一种脓肿分枝杆菌标志物及其应用
CN121203015A (zh) 一种抗钙卫蛋白单克隆抗体组合及其应用
CN119738579A (zh) 检测试剂、检测试剂盒、应用及使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant