ME00261B - Tweak vezujuća antitijela - Google Patents

Abstract

Opisana su anti-tweak antitijela.

Description

Ova prijava traži prioritet US prijave sa serijskim br. 60/685, 149, podnete 27 maja, 2005, i pozivanje na nju se odnosi na njen celoviti sadržaj.

Citokini srodni sa faktorom nekroze tumora (tumor-necrosis factor-TNF) su superfamilija proteina koja ima skup funkcija, uključujući one koje su uključene u imunološku regulaciju i regulaciju apoptoze. TWEAK (slabi izazivač apoptoze sličan TNF) je jedan član ove superfamilije.

Anti-TWEAK antitela mogu biti korišćena u lečenju različitih stanja i poremećaja, na pr. zapaljenskih poremećaja, neuronskih poremećaja ili drugih ovde opisanih poremećaja. Kada su korišćena u lečenju humanih subjekata, antitela su poželjno humana, humanizovana ili na drugi način efikasna humana antitela.

Antitelo se može vezati za epitop na TWEAK koji obuhvata bar jedan, dva, tri ili četiri amino-kiselinska ostatka iz epitopa na TWEAK koja prepoznaje P2D10, za peptid od TWEAK koji je vezan sa P2D10 (npr., peptid dužine manje od 25, 20, ili 15 amino kiselina) ili za region TWEAK koji prepoznaje P2D10. Na primer, antitelo se specifično veže za epitop, npr. linearni ili konformacioni epitop TWEAK, naročito humanog TWEAK, npr., rastvomi region TWEAK. Antitelo može da se takmiči sa P2D10 za vezivanje za TWEAK, npr. za humani TWEAK. Antitelo može kompetitivno inhibirati vezivanje P2D10 za TWEAK, npr., humani TWEAK. U jednom izvođenju, anitelo se može vezati za epitop koji se preklapa sa onim od P2D10, na pr., uključuje bar jednu, dve, tri ili četiri amino kiseline zajedničke sa P2D10 epitopom, ili epitopom koji, kada se veže, stemo sprečava interakcije TWEAK sa P2D10.

|0006] Na primer, anti-TWEAK antitelo se može vezati za TWEAK i modulirati, npr. inhibirati, interakciju (npr. vezivanje) između TWEAK i TWEAK receptora, npr., Fnl4 (npr., humani Fnl4). Antitelo može takođe smanjivati signalnu aktivnost TWEAK receptora. Antitelo može ciljati TWEAK, sekvester TWEAK, i/ili modulirati in vivo stabilnost TWEAK.

U jednom izvođenju, anititelo se specifično veže za bar deo mesta interakcije na TWEAK koji je u kontaktu sa Fnl4 (npr., humani Fnl4). Antitelo se može takmičiti sa Fnl4 za vezivanje za TWEAK. npr., za humani TWEAK. Antitelo može kompetitivno inhibirati vezivanje Fnl4 za TWEAK. Antitelo može reagovati sa epitopom na TWEAK koji kada se veže, sterno sprečava interakcije između TWEAK i Fnl4 (npr., između humanog TWEAK i humanog Fnl4).

U jednom izvođenju, antitelo može inhibirati jednu ili više aktivnosti u vezi sa TWEAK sa IC50 od oko 50 nM do 5 pM, tipično oko 100 do 250 pM ili manje. Na primer, antitelo može inhibirati sposobnost TWEAK da potpomaže proliferaciju endotelijalnih ćelija ili neovaskularizaciju. U jednom izvođenju, anti-TWEAK antitela smanjuju bar jednu aktivnost koja je u vezi sa TWEAK, npr., tako da antitelo kada se daje subjektu može modulirati zapaljenska stanja.

U drugom izvođenju, anitelo može se vezati za TWEAK sa kinetikom u opsegu od 103 do 108 M-1s-1, tipično 104 do 107 M-1s-1. U još jednom izvođenju, anitelo ima kinetiku disocijacije u opsegu od 10-2 do 10-6s-1, tipično 0-2 do 10-5s-1. U jednom izvođenju, antitelo se veže za TWEAK, npr., humani TWEAK, sa afinitetom i/ili kinetikom sličnom (na pr., između faktora pet ili deset) monoklonalnom antitelu P2D10, ili njegovim modifikovanim oblicima, npr. njegovim himernim oblicima ili humaniziranim oblicima (npr., ovde opisanim humaniziranim oblicima). Afinitet i kinetika vezivanja anti-TWEAK antitela može biti testirana, npr. korišćenjem tehnologije biosenzora (BIACORE™).

U jednom izvođenju, antitelo je fragment pune dužine antitela koji se veže za antigen, npr. Fab, F(ab’)2, Fv ili jednolančani Fv fragment. Tipično je antitelo pune dužine. Antitelo može biti monoklonalno antitelo ili mono-specifično antitelo. Na primer, antitelo je u kompoziciji koja obuhvata manje od 20 drugih vrsta anti-TWEAK antitela, npr., u kompoziciji koja ne uključuje druge vrste anti-TWEAK antitela.

Antitelo može biti efikasno humano. “Efikasno humano” antitelo je antitelo koje uključuje dovoljan broj humanih aminokiselinskih položaja tako da antitelo ne izaziva imunogeni odgovor kod normalnih ljudi. Poželjno, protein ne izaziva odgovor neutralizacije antitelima, npr. odgovor humanog anti-mišijeg antitela (HAMA - the human anti-murine antibody). FIAMA može biti problematična u brojnim situacijama, npr. ukoliko je poželjno da antitela budu davana više puta, npr. u lečenju stanja hroničnih bolesti ili bolesti koje se vraćaju. HAMA odgovor može učiniti ponovljeno davanje antitela potencijalno neefiksasnim zbog povećanog kliransa antitela iz seruma (videti, npr., Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32: 180-190 (1990)) i takođe zbog potencijalnih alergijskih reakcija (videti, npr., LoBuglio et al. (1986) Hybridoma, 5: 5117-5123).

Na primer, antitelo može biti humano, humanizovano, CDR-graftovano, himerno, mutirano, afmitetno razvijeno, deimunizirano, sintetičko ili na drugi način in vz'/ro-stvoreno antitelo i njegove kombinacije. U jednom izvođenju, anti-TWEAK antitelo je humanizovano antitelo.

Teški i laki lanci anti-TWEAK antitela mogu biti u suštini pune dužine. Protein može uključivati bar jedan i poželjno dva, kompletna teška lanca i bar jedan, a poželjno dva, kompletno laka lanca) ili može uključivati fragment koji vezuje antigen (npr., Fab, F(ab’)2, Fv ili jednolančani Fv fragment). U još jednom izvođenju, antitelo 5 ima konstantan region teškog lanca izabran od npr, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, i IgE; naročito, izabran od, npr., IgGl, IgG2, IgG3, i IgG4, određenije, IgGl (npr., humani IgGl). Tipično, konstantan region teškog lanca je human ili modifikovan oblik humanog konstantnog regiona. U drugom izvođenju, antitelo ima konstantni region lakog lanca izabran od, npr., kapa ili lambda, naročito, kapa (npr., humani kapa).

U jednom izvođenju, protein uključuje bar jedan, dva i poželjno tri CDRs iz

varjabilnog regiona lakog ili teškog lanca ovde opisanog antitela, npr., P2D10. U ovom kontekstu, CDRs se odnosi na CDRs kao što je defmisano Chothia hipervarjabilnim petljama. Na primer, protein uključuje, u sekvenci promenjivog domena teškog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona:

GFTFSRYAMS (CDR1) (SEQ ID br: 1),

EISSGGSYPYYPDTVTG (CDR2) (SEQ ID br: 2),

VLYYDYDGDRIEVMDY (CDR3) (SEQ ID br: 3), ili CDR ima sekvence amino kiselina koje se razlikuju, ali ne više od 4, 3, 2. 5, 2, 1. 5, 1, ili 0. 5 promena (npr., supstitucije, insercije ili delecije) na svakih 10 amino kiselina (npr., broj razlika je proporcijalan dužini CDR) u odnosu na gore navedene sekvence, npr. bar jedna promena, ali ne više od dve, tri ili četiri po CDR. Sekvenca promenjivog domena teškog lanca može uključivati one CDR sekvence naročito u CDR3, ili bar dva CDRs, npr., CDR1 i CDR3, CDR2 i CDR3, ili u sva tri CDRs.

Protein može uključivati, u sekvenci promenjivog domena teškog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona (amino kiseline u zagradama predstavljaju alternative za odgovarajuće položaje):

(iii) (VL)-(IL)-(YF)-(YF)-D-(YF)-D; (SEQ ID br: 6) ili (DE)-(RK)-(ILVM)-(EQD)-(VAL)-M-(DE); (SEQ ID br: 7).

Protein može uključivati, u sekvenci promenjivog domena lakog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona:

RSSQSLVSSKGNTYLH; (CDR1) (SEQ ID br: 8),

KVSNRFS; (CDR2) (SEQ ID br: 9), i

SQSTHFPRT; (CDR3) (SEQ ID br: 10), ili CDR ima amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje ali ne više od 4, 3, 2. 5, 2, 1. 5, 1, ili 0. 5 promena (npr., supstitucija, insercija ili delecija) na svakih 10 amino kiselina (npr., broj razlika je proporcionalan dužini CDR) u odnosu na gore navedenu sekvencu, npr., bar jedna promena, ali ne više od dve, tri ili četiri po CDR. Sekvenca promenjivog domena lakog lanca može uključivati ove CDR sekvence naročito u CDR3, ili bar u dva CDRs, npr, CDR1 i CDR3, CDR2 i CDR3, ili u sva tri CDRs.

Protein može obuhvatati, sekvencu promenjivog regiona lakog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona (amino kiseline u zagradama predstavljaju promene za odgovarajući položaj):

(i) (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-(EHDNQY); (SEQ ID br: 11), ili (RK)-S-S-Q-S-(LI)-V-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-H; (SEQ ID br: 12)

(ii) (KE)-(LVI)-S-(NYS)-(RW)-(FAD)-S; (SEQ ID br: 13), ili K(LVI)-S-(NYS)-R-(FAD)-S; (SEQ ID br: 14), i

(iii) (SM)-Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-(FWL)-P; (SEQ ID br: 15) ili S-Q-(GSA)-(SIT> (HEQ)-F-P; (SEQ ID br: 16).

[| U jednom poželjnom izvođenu, protein uključuje svih šest CDR's iz P2D10 ili blisko povezanih CDRs, npr., CDRs koji su identični ili koji imaju bar jednu amino kiselinsku alternaciju, ali ne više od dve, tri ili četiri promene (npr., supstitucije, delecije ili insercije), ili druge ovde opisane CDR.

U još jednom primeru, protein uključuje bar jedan, dva ili tri CDR regiona koji imaju istu kanonsku strukturu i odgovaraju Chothia CDR regionima P2D10, npr.,iste kanonske strukture kao bar CDR1 i/ili CDR2 promenjivih domena teških i/ili lakih lanaca P2D10.

Protein može obuhvatati jednu od sledećih sekvenci:

• DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 17)

• DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 18)

• DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSP RRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 19)

• DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSP RRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 20)

• DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 21)

• DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQPP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 22)

• DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 23)

• DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSP QLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 24)

• DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWLQQRPGQPP RLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 25)

• DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVSSKGNTYLHWYQQKPGKAP KLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTH FPRT (SEQ ID br: 26)

ili sekvencu koja ima manje od osam, sedam, šest, pet, četiri, tri ili dve promene (npr., supstitucije, insercije ili delecije, npr., konzervativne supstitucije ili supstitucije amino kiselinskog ostatka u odgovarajućem položaju u P2D10, huP2D10-Ll, ili huP2D10-L2). Primeri supstitucija su u jednom od sledećih Kabat položaja: 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47,

49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101, i 102. Supsitutcije mogu, na primer, supstituisati jednu ili više amino kiselina iz P2D10 u odgovarajuće položaje u ‘framework’ regionu, npr., humani ‘framework region, npr., u FR2 (npr, u položaju 46 do Phe prema konsekutivnom brojanju) i u FR3 (npr, u položaju 87 do Phe).

Protein može uključivati jednu od sledećih sekvenci u promenjivom domenu teškog lanca:

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 27)

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQRLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 28)

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQATGQGLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 29)

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 30)

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 31)

• QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQALEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 32)

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 33)

• QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQARGQRLEWIG EISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAA VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 34)

• EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVA EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 35)

• EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK DVLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 36)

• QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWIRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 37)

• EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVG EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 38)

• EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 39)

• EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 40)

• EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 41)

• QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVA EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 42)

• QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVA EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 43)

• QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVA EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 44)

• QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVA EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 45)

• EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAK DVLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 46)

• EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 47)

• EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSRYAMSWFRQAPGKGLEWVG EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 48)

• EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEYVS EISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCAR VLYYDYDGDRIE (SEQ ID br: 49)

ili sekvence koje imaju manje od osam, sedam, šest, pet, četiri, tri ili dve promene (npr., supstituicije, insercije ili delecije, npr., konzervativne supstitucije ili supstitucije aminokiselinskog ostatka u odgovarajućem položaju u P2D10). Primeri supstitucija su u jednom od sledećih Kabat pložaja: 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106, i 107. Supstitucije mogu, na primer, supstituisati jednu ili više amino kiselina iz P2D10 u odgovarajuće položaje u ‘framework regionu, npr., humanom ‘framework’ regionu.

U jednom izvođenju, ‘framework’ teškog lanca (npr., FR1, FR2, FR3, individualno ili sekvenca obuhvata FR1, FR2, i FR3, ali izuzimajući CDRs) uključuje amino kiselinsku sekvencu koja je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili više identična ‘framework teškog lanca jedne od sledećih segmenta sekvence V germinativne linije: DP-25, DP-1, DP-12, DP-9, DP-7, DP-31, DP-32, DP-33, DP-58, DP-54, drugaVH I podgrupa sekvence germinativne linije, druga VH III podgrupa sekvence germinativne linije, ili drugi V gen koji je kompatibilan sa kanonskim strukturama klase 1-3 (videti, npr., Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol.

Biol. 227: 776-798). Drugi ‘frameworks’ kompatibilni sa kanonskim strukturama klase 1-3 uključuju ‘framevvorks’ sa jednim ili više sledećih ostataka prema Kabat numeraciji: Ala, Gly, Thr, ili Val u položaju 26; Gly u položaju 26; Tyr, Phe, ili Gly u položaju 27; Phe, Val, Ile, ili Leu u položaju 29; Met, Ile, Leu, Val, Thr, Trp, ili Ile u položaju 34;

Arg, Thr, Ala, Lys u položaju 94; Gly, Ser, Asn, ili Asp u položaju 54; i Arg u položaju 71.

U jednom izvođenju, ‘framework lakog lanca (npr., FR1, FR2, FR3, individualno ili sekvenca koja obuhvata FR1, FR2, i FR3, ali isključuje CDRs) uključuje amino kiselinsku sekvencu, koja je bar 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% ili više identična ‘framework lakog lanca Vk II podgrupe sekvence germinativne linije ili jedne od sledećih segmenta sekvenci germinativne linije V A17, Al, A18, A2, A19/A3, A23, Vk I podgrupe sekvenci germinativne linije (npr., DPK9 sekvenca), ili drugi V gen koji je kompatibilan sa kanonskim strukturama klase 4-1 (videti, npr., Tomlinson et al.

(1995) EMBO J. 14: 4628). Drugi ‘frameworks’ kompatibilni sa kanonskom strukturom kalse 4-1 obuhvataju ‘framevvorks’ sa jednim ili više sledećih ostataka prema Kabat numeraciji: Val ili Leu ili Ile u položaju 2; Ser ili Pro u položaju 25; Ile ili Leu u položaju 27b; Gly u položaju 29; Phe ili Leu u položaju 33; i Phe u položaju 71. Dalje, prema Kabat numeraciji, položaj 48 može biti Ile ili Val.

[| U još jednom izvođenju, ‘framework lakog lanca (npr., FR1, FR2, FR3, pojedinačno ili sekvenca obuhvata, FR1, FR2, i FR3, ali isključujući CDRs) obuhvata amino kiselinsku sekvencu, koja je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa ‘framework lakog lanca sekvence Vk I podgrupe germinativne linije, npr, DPK9 sekvenca.

U jednom izvođenju, promenjivi ‘framework lakog ili teškog lanca (npr., region obuhvata bar FR1, FR2, FR3, i opciono FR4) može biti izabran od: (a) promenjivog ‘framework’ lakog ili teškog lanca koji uključuje bar 80%, 90%, 95%, ili poželjno 100% amino kiselinskih ostataka iz humanog promenjivog ‘framework lakog ili teškog lanca, npr., ostatak promenjivog ‘framework’ lakog ili teškog lanca iz humanog sazrelog antitela, humane sekvence germinativne linije, humane konsezusne sekvence ili ovde opisanog humanog antitela; (b) promenjivi ‘framework’ lakog ili teškog lanca uključuje od 20% do 80%, 40% do 60%, 60% do 90%, ili 70% do 95% amino kiselinskih ostataka iz promenjivog ‘framework’ humanog lakog ili teškog lanca, npr., ostatak promenjivog ‘framework’ lakog ili teškog lanca humanog sazrelog antitela, humane sekvenca germinativne linije, humane konsezusne sekvence; (c) nehumani ‘framework (npr., a ‘framework glodara); ili (d) nehumani ‘framework koji je modifikovan, npr., da ukloni antigene ili citotoksične determinante, npr. deimunizirane, ili delimično humanizovane. U jednom izvođenju, promenjive domenske sekvence teškog lanca obuhvataju humane ostatke ili ostatke humane konsezusne sekvence u jednom ili više sledećih položaja (poželjno bar pet, deset, dvanaest ili sve): (u FR promenjivog domena lakog lanca) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L,

68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, i/ili (u FR promenjivog domena teškog lanca) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H. 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 9IH, 92H, 93H, i/ili 103H (prema Kabat numeraciji).

U jednom izvođenju, protein uključuje bar jedan nehumani CDR, npr., mišiji CDR, npr., CDR iz P2D10, ili njegov mutant, i bar jedan ‘framework koji se razlikuje od P2D10 u bar jednoj amino kiselini, npr., bar 5, 8, 10, 12, 15, ili 18 amino kiselina. Na primer, proteini uključuju jedan, dva, tri, četiri, pet ili šet takvih nehumanih CDR’s i uključuje bar jednu amino kiselinsku razliku u bar tri HC FR1, HC FR2, HC FR3, LC FR1, LC FR2, i LC FR3.

U jednom izvođenju, sekvenca promenjivog domena teškog ili lakog lanca proteina uključuje amino kiselinsku sekvencu, koja je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa sekvencom promenjivog domena ovde opisanog antitela npr., P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2; ili koji se razlikuju u bar 1 ili 5 ostataka, ali manje od 40, 30, 20, ili 10 ostataka, od sekvence promenjivog domena ovde opisanog antitela, npr., P2D10. huP2D10-l, ili huP2D10-2.

U jednom izvođenju, jedan ili oba promenjiva domena uključuju amino kiselinske položaje u ‘framework regionu koji su različito izvedeni iz oba, mišijeg antitela (npr., P2D10) i humanizovanog antitela (npr., 56-84m i Kl07) ili sekvence germinativne linije. Na primer, promenjivi domeni će uključivati brojne položaje u kojima je amino kiselina identična u oba, i mišijem antitelu i humanom antitelu (ili sekvenci germinativne linije) jer su ta dva identična u tom položaju. Od ostalih ‘framework’ položaja gde se mišiji i humani razliku, bar 50, 60, 70, 80, ili 90% položaja promenjivog domena su poželjno identični humanom antitelu (ili sekvenci germinativne linije) pre nego mišije. Nijedan, ili bar jedan, dva, tri ili četiri od preostalih ‘framework’ položaja mogu biti identični mišijem antitelu pre nego humanom antitelu. Na primer. u HC FR1, jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji; u HC FR2. jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji; u FR3, jedan, dva, tri ili četiri takva položaja mogu biti mišiji; u LC FR1. jedan, dva, tri ili četiri takva položaja mogu biti mišiji; u LC FR2, jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji; u LC FR3, jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji.

U jednom izvođenju, sekvenca varjabilnog domena teškog ili lakog lanca proteina obuhvata amino kiselinske sekvence kodirane ovde opisanom sekvencom nukleinske kiseline ili nukleinskom kiselinom koja hibridizuje sa ovde opisanom sekvencom nukleinske kiseline (npr., specifična sekvenca nukleinske kiseline ili sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ovde opisanu amino kiselinsku sekvencu) ili njegov komplement, npr. pod uslovima niskog sparivanja, srednjeg sparivanja, visokog sparivanja, ili veoma visokog sparivanja.

Anti-TWEAK antitela mogu biti derivatizovana ili povezana za drugi funkcionalni molekul, npr., drugi peptid, protein ili jedinjenje. Na primer, antitelo može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili na drugi način) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, između ostalih kao što su druga antitela (npr., biospecifično ili multispecifično antitelo), toksini, radioizotopi, polimeri, citotoksična ili citostatička sredstva.

U drugom aspektu, opis obezbeđuje kompozicije, npr. farmaceutske kompozicije, koje uključuju farmaceutski prihvatljive nosače i anti-TWEAK antitelo, npr., ovde opisano anti-TWEAK antitelo.

LI još jednom izvođenju, anti-TWEAK antitelo (npr., njihova farmaceutska kompozicija) se daje subjektu kome je potrebna terapija anti-TWEAK antitela ili čije stanje bi bilo ublaženo sa antitelom. Na primer, anti-TWEAK antitelo može biti davano subjektu koji ima ili je u opasnosti od zapaljenskog poremećaja, imunog poremećaja, autoimunog poremećaja, neuronskog poremećaja, neoplastičnog poremećaja, ili drugog ovde opisanog poremećaja. U jednom izvođenju, ovde opisana anti-TWEAK antitela su korišćena za dobijanje leka za lečenje zapaljenskog poremećaja, imunog poremećaja, autoimunog poremećaja, neuronskog poremećaja, neoplastičnog poremećaja ili drugog ovde opisanog poremećaja.

U drugom aspektu, opis predstavlja postupak tretiranja subjekta sa poremećajem u vezi sa TWEAK. Postupak uključuje: davanje subjektu anti-TWEAK antitela, u količini dovoljnoj da leči (npr., poboljša ili spreči) poremećaj u vezi sa TWEAK. Anti-TWEAK antitela mogu biti davana subjektu, sama ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim postupcima kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, subjekat je sisar, npr. čovek, npr. čovek koji ima poremećaj u vezi sa TWEAK, npr., ovde opisani poremećaj. Antitelo može biti korišćeno da ublaži jedan ili više simptoma takvih poremećaja. Izraz ‘tretiranje’ odnosi se na davanje terapije u količini, na način i/ili u režimu efikasanom da poboljša ili spreči stanje, simptom ili parametar u vezi sa poremećajem (npr., ovde opisani poremećaj) ili da spreči početak, progresiju ili pogoršanje poremećaja, ili do statističkog značajnog stupnja ili do stupnja koji se može detektovati od strane osobe iz struke. Prema tome, lečenjem se mogu postići terapeutske i/ili profilaktičke koristi. Efikasna količina, način ili režim mogu varirati u zavisnosti od subjekta i mogu biti prilagođeni subjektu. U jednom izvođenju, ovde opisano anti-TWEAK antitelo je korišćeno za dobijanje leka za lečenje poremećaja u vezi sa TWEAK.

U još jednom aspektu, opis predstavlja postupak modelovanja interakcije između TWEAK i proteina receptora TWEAK. Na primer, anti-TWEAK antitelo može biti korišćeno da smanji ili inhibira vezivanje, između TWEAK i TVVEAK receptora, kao što je Fnl4. Postupak sadrži dovođenje u kontakt TWEAK ili kompleksa koji sadrži TWEAK sa antitelima. Postupak može biti korišćen na ćelijama in vitro npr., u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo. Na primer, ćelije koje eksprimiraju TWEAK receptor mogu biti kultivisane in vitro u medijumu za kulturu i kontaktni stupanj se može postići dodavanjem anti-TWEAK antitela u medijum za kulturu. Alternativno, postupak može biti izveden na ćelijama prisutnim na subjektu, npr., kao deo in vivo (npr., terapeutskog ili profilaktičkog) protokola. Na primer, anti-TWEAK antitelo može biti davano lokalno ili sistemski. U jednom izvođenju, ovde opisano anti-TWEAK antitelo je korišćeno za dobijanje leka za interakciju modulovanja između TWEAK i proteina receptora TWEAK.

Postupak može uključivati dovođenje u kontakt TWEAK sa kompleksom receptora TWEAK, ili njegove podjedinice, pod uslovima koji omogućavaju interakciju između TWEAK i kompleksa receptora TWEAK, ili njegove podjedinice, da izazovu da se tako obrazuje smeša TWEAK/TWEAK receptora. Generalno, anti-TWEAK antitelo je obezbeđeno u efikasnoj količini, npr. tako da se dovodi u kontakt smeša TWEAK/TWEAK receptora sa moduliranim anti-TWEAK antitelima, npr., utiče na (npr., inhibira, blokira ili na drugi način redukuje) interakcije između TWEAK i proteinskog receptora ili bar jedne funkcije TWEAK, npr., signaliziranje posredovano sa TWEAK.

[0036| Opis takođe predstavlja nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence, koje kodiraju promenjive regione teškog i lakog lanca npr., ovde opisanih anti-TWEAK antitela. Na primer, opis predstavlja prvu i drugu nukleinsku kiselinu koja kodira odgovarajuće promenjive regione teškog i lakog lanca P2D10. U drugom aspektu, opis predstavlja ćelije domaćina i vektore koji sadrže ovde opisane nukleinske kiseline.

Opis takođe predstavlja epitop TWEAK, npr., humani TWEAK, koji prepoznaje P2D10 i proteine sposobne da reaguju sa epitopom. Na primer, proteini i peptidi koji uključuju epitop mogu biti korišćeni da stvore ili za odabir drugih jedinjenja koja se vezuju i koja reaguju sa epitopom, npr. proteini kao što su antitela ili mali molekuli. Na primer, peptidi koji uključuju epitop mogu biti korišćeni kao imunogen ili meta za odabir ekspresione biblioteke. Takođe je moguće da se proceni sposobnost jedinjenja da reaguje sa peptidom, ili mapiranjem ili određivanjem strukture, da bi se procenila sposobnost jedinjenja da reaguju sa epitopom, npr. u kontekstu zrelosti TWEAK. Primer procene uključuje određivanje da li jedinjenje može da reaguje sa TWEAK u prisustvu kompetitivnog P2D10 antitela.

Takođe su opisani postupci za davanje ili ciljanje sredstva, npr. terapeutskog (uključujući genetsko sredstvo) ili citotoksičnog sredstva, sa anti-TWEAK antitelom (npr., P2D10 ili drugo ovde opisano antitelo) u ćeliju koja eksprimira TWEAK ili strukturu in vivo.

Ovde korišćen izraz ‘antitelo’ odnosi se na protein koji obuhvata bar jedan promenjivi deo imunoglobulina, npr., amino kiselinsku sekvencu koja obezbeđuje promenjivi deo imunoglobulina ili sekvencu promenjivog domena imunoglobulina. Na primer, antitelo može da uključuje promenjivi region teškog (H) lanca (skraćeno ovde VH), i promenjivi region lakog (L) lanca (skraćeno ovde VL). U drugom primeru, antitelo uključuje promenjive regione dva teška lanca (H) i promenjive regione dva laka (L) lanca. Izraz “antitelo” obuhvata fragmente antitela koji se vezuju za antigen (npr., antitela jednog lanca, Fab fragmente, F(ab')2 fragmente, Fd fragmente, Fv fragmente, i dAb fragmente) kao i antitela pune dužine, npr., imunoglobuline tipova IgA, IgG (npr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD, IgM (kao i njihove podtipove) pune dužine. Izraz “antitelo pune dužine” odnosi se na antitelo koje ima bar 96% dužine prirodnog antitela koje je obrađeno da ukloni bilo koju signalnu sekvencu. Antitela pune dužine mogu uključivati prirodno antitelo pune dužine, npr., ostatke od amino terminalnog ostatka prirodnog antitela (npr, a IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) do njegovog karboksi-terminalnog ostatka.

“Sekvenca promenjivog domena imunoglobulina” odnosi se na amino kiselinsku sekvencu koja može obrazovati strukturu promenjivog domena imunoglobulina. Na primer, sekvenca može uključivati sve ili deo amino kiselinske sekvence promenjivog domena koji se javlja u prirodi. Na primer, sekvenca može ili ne mora uključivati jedan, dva ili više N- ili C-terminalnih amino kisleina, ili može uključivati druge promene koje su kompatibilne sa obrazovanjem proteinske strukture.

‘ ‘Izolovana kompozicija” odnosi se na kompoziciju koja je uklonjena od bar 90% bar jedne komponente prirodnog uzorka iz kojeg izolovana kompozicija može biti dobijena. Veštački proizvedene kompozicije ili prirodne mogu biti "kompozicije bar” izvesnog stepena čistoće ukoliko vrste ili populacija vrste od interesa je bar 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 95, 98, ili 99% čista u odnosu na težinu.

“Epitop”se odnosi na mesto na ciljnom jedinjenju koje se veže za antitelo. U slučaju gde je ciljno jedinjenje protein, na primer, epitop se može odnositi na amino kiseline (naročito na amino kiselinske bočne lance) koje su vezane od strane antitela. Preklapajući epitopi uključuju bar jednan običan ostatak amino kiseline, npr., bar 2, 3, 4 ili 5 običnih ostataka amino kiselina.

Ovde korišćen izraz “hibridiziraju pri uslovima niskog sparivanja, srednjeg sparivanja, visokog sparivanja, ili vrlo visokog sparivanja” opisuju uslove za hibridizaciju i ispiranje. Uputstvo za izvođenje reakcija hibridizacije mogu biti nađeni kod Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6. 3. 16. 3. 6. U toj referenci opisani su vodeni i nevodeni postupci i jedani i drugi mogu biti korišćeni. Specifični uslovi hibridizacije na koje se ovde poziva su su sledeći: 1) uslovi hibridizacije za nisko sparivanje u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45°C, praćeno sa dva ispiranja u 0. 2X SSC, 0. 1% SDS na bar 50°C (temperatura ispiranja može biti povećana na 55°C za uslove niskog sparivanja); 2) hibridizacioni uslovi za srednje sparivanje u 6X SSC na oko 45°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 0. 2X

SSC, 0. 1% SDS na 60°C; 3) hibridizacioni uslovi za visoko sparivanje u 6X SSC na oko 45°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 0. 2X SSC, 0. 1% SDS na 65°C; i poželjno 4) hibridizacioni uslovi za veoma visoko sparivanje su 0. 5M natrijum fosfat, 7% SDS na 65°C, praćano sa jednim ili više ispiranja na 0. 2X SSC, 1% SDS na 65°C. Uslovi visokog sparivanja (3) su poželjni uslovi koji treba da su korišćeni ukoliko drugačije nije navedeno.

“Poremećaj u vezi sa TWEAK” je bilo koji poremećaj u kome TWEAK doprinosi etiologiji ili poremećaju čiji uslovi, simptomi, ili rizik početka su menjani određivanjem sredstva koje blokira TWEAK.

|] Ukoliko nije drugačije defmisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje koje je uobičajeno za prosečnog stručnjaka iz oblasti tehnike u koju ovaj pronalazak spada Mada su postupci i matarijali slični ili ekvivalentni onima ovde opisanim mogu biti korišćeni u praksi ili ovde opisanom testiranju, dole su opisani pogodni postupci i materijali. Pored toga, izvođenja pronalaska opisanih u odnosu na Chothia CDRs mogu takođe biti implementirani korišćenjem Kabat CDRs.

Sve ovde pomenute objave, patentne prijave, patenti i druge reference uključene su ovde kao referenca u svojoj celovitosti. U slučaju sukoba interesa, prikazani opis, uključujući definicije će biti odlučujući. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nemaju nameru da budu ograničavajući.

DETALJNI OPIS

P2D10 je primer mišijeg antitela koje se specifično veže za humani TWEAK i inhibira TWEAK funkciju. Varijante P2D10 antitela su takođe opisane, uključujući primere humaniziranih varijanti. Ova antitela, drugačija od anti-TWEAK antitela, i drugačija od sredstava koji blokiraju TWEAK mogu biti korišćena u lečenju ili prevenciji poremećaja u kojima posreduje TWEAK, npr., zapaljenski poremećaji i drugi ovde opisani poremećaji.

Anti-TWEAK antitela

Ovaj opis uključuje sekvence specifičnih primera anti-TWEAK antitela, kao što su P2D10, huP2D10-l, i huP2D10-2. Određena antitela, kao što su ova, mogu biti napravljena, na primer pripremanjem i eksprimiranjem sintetičkih gena koji kodiraju navedene amino kiselinske sekvence ili mutiranjem humanih gena germinativne linije da bi se dobio gen koji kodira navedene amino kiselinske sekvence. Povrh toga, ova antitela i druga anti-TWEAK antitela mogu biti proizvedena, npr., korišćenjem jednog ili više sledećih postupaka.

Dostupni su brojni postupci za dobijanje antitela, naročito humanih antitela. Jedan primer postupka uključuje odabiranje proteinske ekspresione biblioteke, npr. ispoljenih biblioteka faga ili ribozoma. Ispoljeni fag je opisan, na primer, U. S.

5, 223, 409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; i WO 90/02809. Npr., u U. S. Pat. Nos. 5, 658, 727; 5, 667, 988; i 5, 885, 793 opisan je ispoljeni Fab’s na fagu.

Pored upotrebe ispoljenih biblioteka, mogu biti korišćeni drugi postupci za dobijanje antitela koje vezuje TWEAK. Na primer, TWEAK protein ili njegov peptid mogu biti korišeni kao antigen u nehumanoj životinji, npr., a glodaru, npr., mišu, hrčku, ili pacovu.

U jednom izvođenju, nehumana životinja obuhvata bar deo humanih imunoglobulinskih gena. Na primer. moguće je isplanirati vrstu miša koja je deficijentna u proizvodnji mišijih antiela sa velikim fragmentima humanog Ig lokusa. Koristeći tehnologiju hibridoma, mogu biti proizvedena i odabrana antigen-specifična monoklonalna antitela koja potiču od gena sa željenom speciflčnošću. Videti, npr., XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, U. S. 2003-0070185, WO 96/34096, i WO 96/33735.

U drugom izvođenju, monoklonalno antitelo je dobijeno iz životinje koja nije čovek, i zatim modifikovana, npr., humanizovana ili deimunizirana. Winter opisuje primer postupka CDR-graftovanja koji može biti korišćen za pripremanje ovde opisanih humanizovaniih antitela (U. S. 5, 225, 539). Svi ili neki od CDRs određenog humanog anitela mogu biti zamenjena sa bar delom nehumanog antitela. Može samo biti neophodno zameniti potrebne CDRs za vezivanje ili vezujuće determinante takvih CDRs da bi se došlo do korisnih humanizovanih antitela koja se vezuju za TWEAK.

Humanizovana antitela mogu biti stvorena zamenom sekvenci Fv promenjivog regiona koji nisu direktno uključeni u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv promenjivih regiona. Opšti postupci za stvaranje humanizovanih antitela su dobijeni od, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207, odOi et al. (1986) BioTechniques 4: 214. i od US 5, 585, 089; US 5, 693, 761; US 5, 693, 762; US 5, 859, 205; i US 6, 407, 213. Ovi postupci uključuju izolovanje, manipulisanje i eksprimovanje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo Fv promenjivih regiona imunoglobulina bar jednog teškog ili lakog lanca. Izvori takvih nukleinskih kiselina su dobro poznati osobama iz struke i na primer, mogu biti dobijeni iz hibridoma koji proizvodi antitelo protiv prethodno određenog cilja, kao što je gore opisano, od imunoglobulinskih gena germinativne linije, ili iz sintetskih konstrukta. Rekombinantno DNK kodiranje humanizovanog antitela može zatim biti klonirano u odgovarajući eksperesioni vektor.

Humane sekvence germinativne linije, na primer, su opisane u Tomlinson,

I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J Mol. Bio. 227: 799-817; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14: 4628-4638. V BASE direktorijum obezbeđuje potpuni direktorijum sekvenci promenjivog regiona humanog imunoglobulina (sastavljen od Tomlinson, l. A. et al.

MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Ove sekvence mogu biti korišćene kao izvor humanih sekvenci, npr. za ‘framework regione i CDRs. Konsezusni humani 'framework regioni mogu takođe biti korišćeni, npr., kao što je opisano u U. S. Pat. No. 6, 300, 064.

Nehumano antitelo koje veže TWEAK-može takođe biti modifikovano specifičnim brisanjem humanih epitopa T-ćelija ili “deimunizacijom” sa postupcima opisanim u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, promenjivi regioni teškog i lakog lanca antitela mogu biti analizirani na peptide koji se vezuju za MHC Klasa II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T-ćelija (kao stoje defmisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T-ćelija, može biti korišćen prilaz kompijuterskog modelovanja pod nazivom “peptidno namotavanje” (‘peptide threading’), i dodatno može biti pretraživana baza podataka humanih proteina koji se vežu za MHC klase II, na motive prisutne u sekvencama Vh i VL, kao stoje opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih alotipova MHC klase II DR, i prema tome grade potencijalne epitope T ćelija. Epitopi potencijalnih T-ćelija mogu biti eliminisani zamenom malog broja amino kiselinskih ostataka u promenjivim regionima, ili poželjno, jednostavnim amino kiselinskim supstitucijama. Koliko god je moguće, učinjene su konzervativne supstitucije. Često, ali ne isključivo, može biti korišćena uobičajena amino kiselina u položaju sekvence antitela humane germinativene linije. Pošto su deimunizirajuće promene identifikovane, nukelinska kiselina koja kodira Vh i Vl može biti konstruisana mutagenezom ili drugim sintetičkim postupcima (npr., de novo sintezom, kasetnom zamenom, i tako dalje). Mutagenezirane promenjive sekvence mogu, opciono biti spojene za humani konstantni region, npr. humani IgGl ili kapa konstantne regione.

|0057) U nekim slučajevima, potencijalni epitop T-ćelija će uključivati ostatke koji su poznati ili predviđeni kao važni za funkciju antitela. Na primer, potencijalni epitopi T ćelija su uglavnom naklonjeni CDRs. Pored toga, potencijalni epitopi T ćelija se mogu javiti u ‘framework’ ostatcima važnim za strukturu antitela i vezivanje. Promene eliminisanja ovih potencijalnih epitopa će u nekim slučajevima zahtevati veći nadzor, npr., pripremanjem i testiranjem lanaca sa i bez izmene. Gde je moguće, potencijalni epitopi T ćelija koji se preklapaju CDRs mogu biti eliminisani supstitucijom van CDRs.

U nekim slučajevima, alternacija između CDR je jedina opcija i prema tome varijante sa i bez ove susptitucije mogu biti testirane. U drugim slučajevima, supstitucija neophodna da ukloni potencijalne epitope T ćelija je položaju ostatka u okviru ‘framework’ koji može biti kritičan za vezivanje antitela. U ovim slučajevima, testirane su varijante sa i bez supstitucije. Prema tome, u nekim slučajevima napravljeno je nekoliko varijanti deimuniziranih promenjivih regiona teških i lakih lanaca i testirane su različite kombinacije teškog/lakog lanca da se identifikuju optimalana deimunizirana antitela.

Izbor krajnjeg deimuniziranog antitela može biti napravljen uzimanjem u obzir afiniteta vezivanja različitih varijanti u konjukciji sa obimom deimunizacije, naročito, broja potencijalnih epitopa T ćelija koji ostaje u promenjivom regionu. Deimunizacija može biti korišćena da modifikuje bilo koje antitelo, npr. antitelo koje uključuje nehumanu sekvencu, npr., sintetičko antitelo, mišije antitelo drugačije od drugog nehumanog monoklonalnog antitela ili antitela izolovanog iz ispoljene biblioteke.

Takođe mogu biti korišćeni drugi postupci za humanizovnje antitela. Na primer, drugi postupci mogu objašnjavati trodimenzionalnu strukturu antitela, ‘framework’ položaja koji su u trodimenzionalnoj blizini determinanti koje se vezuju i imunogenske peptidne sekvence. Videti, npr., WO 90/07861; U. S. Pat. Nos. 5, 693, 762; 5, 693, 761; 5, 585, 089; 5, 530, 101; i 6, 407, 213; Tempest et al. (1991) Biotechnology 9. 266-211. Još jedan postupak nazvan “humaniziran)e” i opisan je, na primer u U. S. 2005-008625.

[| Antitelo može uključivati humani Fc region, npr., prirodni Fc region ili Fc region koji uključuje jednu ili više alternacija. U jednom izvođenju, konstanti region je menjan, na pr. mutiran, da se modifikuju osobine antitela (npr., da se poveća ili smanji jedna ili više od: Fc vezivanja receptora, glikozilacije antitela, broja cisteinskih ostataka, efektora ćelijskih funkcija ili komplementnih funkcija). Na primer, humani IgGl konstantni region može biti mutiran na jednom ili više ostataka, npr., jedan ili više ostataka 234 i 237. Antitela mogu imati mutacije u CFI2 regionu teškog lanca koji smanjuje ili menja funkciju efektora, npr., Fc receptorsko vezivanje i komplementarnu aktivaciju. Na primer, antitela mogu imati mutacije kao što su one opisane u U. S. Patent Nos. 5, 624, 821 i 5, 648, 260. Antitela mogu takođe imati mutacije koje stabilizuju disulfidnu vezu između dva teška lanca imunoglobulina, kao što su mutacije u zavisnom regionu IgG4, kao što je opisano u stanju tehnike (npr., Angal et al. (1993) Mol. lmmunol. 30: 105-08). Videti takođe, npr., U. S. 2005-0037000.

Sazrevanje afiniteta.

U jednom izvođenju, anti-TWEAK antitelo je modifikovano, npr., mutagenezom, da bi se obezbedio skup modifikovanih antitela. Modifikovana antitela su procenjivana da identifikuju jedno ili više antitela koja imaju promenjive funkcionalene osobine (npr., poboljšano vezivanje, poboljšanu stabilnost, smanjenu antigenost ili povećanu stabilnost in vivo). U jednom ostvarenju, tehnologija ispoljene biblioteke je korišćena za selektovanje ili proveru skupa modifikovanih antitela. Antitela višeg afiniteta su zatim identifikovana iz druge biblioteke, npr. korišćenjem većeg sparivanja ili kompetitivnijih uslova vezivanja i ispiranja. Takođe mogu biti korišćene druge tehnike provere.

|) U nekim ostvarenjima, mutageneza je ciljana u poznate regione ili koji su verovatno na kontaktnoj površini vezivanja. Ukoliko su, na primer, identifikovani vezujući proteini antitela, onda mutageneza može biti usmerena u CDR regione teških ili lakih lanaca kao što je ovde opisano. Dalje, mutageneza može biti usmerena na ‘framework regione u blizini ili susedne CDRs, npr., ‘framework’ regioni, naročito između 10, 5, ili 3 amino kiselina CDR spoja. U slučaju antitela, mutageneza takođe može biti ograničena na jedan ili nekoliko CDRs, npr., da se naprave poboljšanja u stupnjevima.

[) U jednom izvođenju, mutageneza je korišćena da se napravi antitelo sličnije jednoj ili više sekvenci germinativne linije. Jedan postupak germinativne linije kao primer može uključivati: identifikovanje jedne ili više sekvenci germinativne linije koje su slične (npr., najsličinje u odgovarajućoj bazi podataka) sekvenci izolovanog antitela. Deset mutacija (na amino kiselinskom nivou) može biti učinjeno u izolovanom antitelu, ili inkrementno, u kombinaciji, ili oboje. Na primer, napravljena je biblioteka nukleinske kiseline koja uključuju sekvence koje kodiraju neke ili sve moguće mutacije germinativne linije. Mutirana antitela su zatim procenjivana, npr., da identifikuju antitelo koje ima jedan ili više dodatnih ostataka germinativne linije u odnosu na izolovano antitelo, a koje je još uvek korisno (npr., ima funkcionalnu aktivnost). U jednom izvođenju, u izolovano antitelo je uneto onoliko ostataka germinativne linije koliko je moguće.

U jednom izvođenju, mutageneza je korišćena da se zameni ili umetne jedan ili više ostataka germinativne lije u CDR regionu. Na primer, CDR ostatak germinativne linije može biti iz sekvence germinativne linije koja je slična (npr. najsličnija)

promenjivom regionu koji je modifikovan. Posle mutageneze, aktivnost (npr. vezivanje ili druga funkcionala aktivnost) antitela može biti procenjivana da bi se odredilo da li ostatak ili ostatci germinativne linije su tolerisani. Slično mutageneza može biti izvedena u ‘framework’ regionima.

Selektovanje sekvence germinativne linije može biti izvedeno na različite načine. Na primer, sekvenca germinativne linije može biti odabrana ukoliko ispunjava prethodno određene kriterijume selektivnosti ili sličnosti, npr. bar izvesan procent identičnosti, npr. bar 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 99. 5% identičnosti, u odnosu na donora nehumanog antitela. Odabir može biti izveden korišćenjem bar 2, 3, 5, ili 10 sekvenci germinativne linije. U slučaju CDR1 i CDR2, identifikovanje slične sekvence germinativne linije može uključivati selekciju jedne takve sekvence. U slučaju CDR3, identifikovanje slične sekvence germinativne linije može uključivati jednu takvu sekvencu, ali može uključivati korišćenje dve sekvence germinativne linije koje odvojeno doprinose amino terminalnom delu i karboksi terminalnom delu. U drugim ostvarenjima, više od jedne ili dve sekvence germinativne linije su korišćene, npr. za obrazovanje konsezusne sekvence.

[| U drugim izvođenjima, antitelo može biti modifikovano da ima izmenjeni glikozilacioni uzorak (tj. izmenjeni u odnosu na originalni ili prirodni glikozilacioni uzorak). Kao stoje korišeno u ovom kontekstu, “izmenjen” označava da su jedan ili više ugljovodoničnih radikala izbrisani, i/ili imaju jedno ili više glikozilacionih mesta dodatih originalnom antitelu. Dodavanje glikozilacionih mesta u sada opisana antitela može biti postignuto menjanjem amino kiselinske sekvence da sadrži sekvencu konsezusnu sa glikozilacionim mestom; takve tehnike su dobro poznate u tehnici. Drugi način za povećavanje broja ugljovodoničnih radikala na antitelu je hemijsko ili enzimsko kuplovanje glikozida za ostatak amino kiseline antitela. Ovi postupci su opisani u. npr., WO 87/05330, i Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 259-306. Uklanjanje bilo kog ugljovodoničnog radikala prisutnog u antitelima hemijski ili enzimski kao što je opisano u tehnici (Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131; and Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138: 350). Videti, npr., U. S. Pat. No. 5, 869, 046 za modifikaciju koja povećava in vivo polu život obezbeđivanjem opravdanog i iskorišćenog epitopa za vezivanje receptora.

|] U jednom izvođenju, antitelo ima CDR sekvence koje se nesuštinski razlikuju od onih P2D10. Nesuštinske razlike uključuju manje amino kiselinske promene, kao što su supstitucije 1 ili 2 od bilo kojih tipičnih 5-7 amino kiselina u sekvenci CDR, npr., Chothia ili Kabat CDR. Tipično amino kiselina je supstituisana srodnim amino kiselinama koje imaju slično naelektrisanje, hidrofobnost ili stereohemijske karakteristike. Take supstitucije bi bile u okviru umešnosti prosečnog stručnjaka. Drugačije od CDRs, suštinskije razlike u strukturi framework regiona (FRs) mogu biti učinjene bez suprotnog delovanja na osobine vezivanja antitela. Izmene FRs uključuju, ali bez ograničenja, humanizovanje ‘framework’ koji nije humani ili konstruisanje izvesnih ‘framework’ ostataka koji su važni za kontakt antigena ili stabilizaciju mesta vezivanja, npr. menjanjem klase ili podklase konstatnog regiona, menjanje specifičnih amino kiselinskih ostataka koji mogu menjati funkciju efektora kao vezivanje Fc receptora (Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-24), ili menjanje vrsta iz kojih potiče konstanti region.

Anti-TWEAK antitela mogu biti u obliku antitela pune dužine, ili u obliku fragmenata antitela, na pr., Fab, F(ab’)2, Fd, dAb, i scFv fragmenti. Dodatni oblici uključuju protein koji uključuje pojedinačni promenjivi domen, na pr., kamilin ili kamelizovani domen. Videti na pr., U. S. 2005-0079574 i Davies et al. (1996) Protein Eng. 9(6): 531-7.

Proizvodnja antitela. Neka antitela, na pr., Fab’s, mogu biti proizvedeni u bakterijskim ćelijama, na pr., ćelijama E. coli. Antitela mogu takođe biti proizvedena u eukariotskim ćelijama. U jednom izvođenju, antitela (na pr., scFv’s) su eksprimovani u ćelijama kvasca kao što je Pichia (videti, npr., Povvers et al. (2001) J Immunol Methods. 251: 123-35), Hanseula, ili Saccharomyces.

(0069) U jednom izvođenju, antitela su proizvođena u ćelijama sisara. Primer ćelije domaćina sisara za eksprimiranje antitela obuhvata ćelije jajnika kineskog hrčka (Chinese Flamster Ovary (CHO ćelije) (uključujući dhfr~ CFIO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, korišćene sa DHFR selektivnim markerom, na pr. kao stoje opisano u Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), ćelijske linije lmfocita, na pr., ćelije NSO mieloma i SP2 ćelije, COS ćelije, i ćelije transgenskih životinja, na pr, transgenskog sisara. Na primer, ćelija je epitelna ćelija mlečne žlezde.

Pored toga sekvenca nuklenske kiseline kodira raznoliki imunoglobulinski domen, rekombinantni ekspresioni vektori mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje reglušu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (na pr., porekla replikacije) i selektivne marker gene. Selektivni marker gen olakšava odabir ćelija domaćina u koje će vektor biti unet (vieti na pr., U. S. Pat. Nos. 4, 399, 216, 4, 634, 665 i 5, 179, 017). Na primer, tipično selektivni marker gen daje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin, ili metotreksat, na ćeliji domaćinu u koju je bio unet vektor.

U jednom primeru sistema za ekspresiju antitela, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira oba lanca antitela i teški i laki je unet u dhfr ̅ CHO ćelije transfekcijom u kojoj je posredovao kalcij um fosfat. Između rekombinantnog ekspresionog vektora, geni lakog i teškog lanca anitela su svaki operativno vezani za pojačivačke/promoterne regulatorne elemente (na pr., koji potiču od SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što su CMV pojačivač/AdMLP promoter regulatornog elementa ili SV40 pojačivač/AdMLP promoter regulatornog elementa), a da dovede do visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gene, koji omogućavaju selekciju CHO ćelija koje su bile transfektvane sa vektorom korišćenjem metotreksat selekcije/ampliflkacije. Selektovane trasformisane ćelije domaćina su kultivisane da se omogući ekspresija teškog i lakog lanca antitela i antitelo je regenerisano iz medijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije su korišćene za dobijanje rekombinantnih ekpresionih vektora, transfektovanih ćelija domaćina, odabranih transformanata, kultivisanje ćelija domaćina i regeneraciju antitela iz medijuma kulture. Na primer, neka antitela mogu biti izolovana afmitetnom hromatografijom na matriksu sa kuplovanim proteinom A ili proteinom G.

Za antitela koja uključuju Fc domen, sistem za proizvodnju antitela poželjno sintetizuje antitela u kojima je Fc region glikozilovan. Na primer, Fc domen IgG molekula je glikozilovan na asparaginu 297 u CFI2 domenu. Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju sa oligosaharidima biantenarnog tipa. Dokazano je daje glikozilacija potrebna za efektorske funkcije u kojima posreduje Fcy receptor i komplement Clq (Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51: 1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev.

163: 59-76). U jednom izvođenju, Fc domen je proizveden u ekspresionom sistemu sisara koji se odgovarajuće glikoziluje ostatak koji odgovara asparaginu 297. Fc domen ili ostali regioni antitela mogu takođe uključivati ostale eukarioteke post-translacione modifikacije.

Antitela mogu takođe biti proizvedena od strane transgenskih životinja. Na primer, U. S. Pat. No. 5, 849, 992 opisuje postupak ekspresije antitela u mlečnim žlezdama transgenskih životinja. Transgen je konstruisan da uključuje promoter za mleko i nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo od interesa i signalnu sekvencu za sekreciju. Mleko proizvedeno od strane ženki takvih transgenskih sisara uključuje, u njima lučena, antitela od interesa. Antitelo može biti prečišćeno iz mleka, ili za neke primene, korišćeno direktno.

Karakterizacija

Osobine vezivanja antitela mogu biti merene bilo kojim standardnim postupkom, na pr. jednim od sledećih postupaka: BIACORE™ analizom, ELISA-testom (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA), transferom fluorescentne rezonantne energije (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET), kristalografijom x-zracima, analizom sekvence i skaniranjem mutagenaze. Sposobnost proteina da inhibira jedno ili dva dejstva TWEAK može biti procenjena in vitro ili na životinjskom modelu poremećaja na pr. ovde opisanog poremećaja. Poželjno, antitela imaju statistički značajan efekat koji ukazuje da antitelo inhibira jedno ili više dejstava TWEAK.

U jednom izvođenju, antitelo je procenjeno u odnosu na inliibiciju sposobnosti TWEAK da stimuliše proizvodnju IL-8, MMP-1, PGE2, IL-6, IP-10 i

RANTES u dermalnim fibroblastima. Videti Chicheportiche et al. (2002) Arthritis Res. 4(2): 126-133 za pogodne uslove testiranja.

U drugom izvođenju, antitelo je procenjeno u odnosu na njegovu sposobnost da inhibira TWEAK stimulacijom proliferacije endotelijalnih ćelija. Videti na pr., U. S. 2003-0211993 koji opisuje test proliferacije (kao i drugi korisni testovi) kao što sledi: HVEC su zasejani na mikrotitarske ploče sa 96-bunarčića pri subkonfluenci (4000 ćelija po bunarčiću) i kultivisani su u toku noći u CS-C Medij umu bez dodavanja dodataka za rast od strane snabdevača. Medijum je zamenjen sa kompletnim medijumom ili bazalnim medijumom. Ćelije su kultivisane u bazalnom medijumu sa ili bez TWEAK (100 ng/ml), bFGF korišćenjem 1/500 do 1/1000 razblaženja bFGF dodatka za rast (Clonetics) ili 1 ng/ml (R&D Systems), VEGF (10 ng/ml) ili kombinacije ovih faktora. Gde je naglašeno, testirano je 10 µg/ml antitela ili je takođe dodavano kontrolno antitelo. Ćelije su inkubirane na 37°C sa 5% CO2 za tri dana i proliferacija je merena pulsno sa H-timidinom u toku bar 10 sati kultivisanja. Radioaktivnost vezana za ćeliju može biti merena sa BETAPLATE™ (EG&G Wallac, Gaithersburg, Md. ). Pad u proliferaciji u kojoj je posredovao TWEAK ili kombinacija TWEAK i bFGF može ukazati daje antitelo efikasno u blokiranju TWEAK aktivnosti.

Površinska plazmon rezonanaca (Surface Plasmon Resonance - SPR).

Interakcije vezivanja proteina od interesa i supstrata (na pr., TWEAK) mogu biti analizirane korišćenem SPR. SPR ili Test biomolekulamih interakcija (Biomolecular Interaction Analysis (BIA)) detektuje biospecifične interakcije u stvaranom vremenu, bez obeležavanja bilo kog učesnika u interakciji. Promene u masi na površini vezivanja (indikativne za slučaj vezivanja) kod BIA čipa dovode do promena indeksa refrakcije svetla blizu površine (optička pojava površinske plazmon rezonance (SPR)). Promene u refraktivnosti stvaraju detektabilni signal, koji je meren kao indikacija reakcija u stvaranom vremenu između bioloških molekula. Opisani su postupci za korišćenje SPR, na primer, u U. S. Pat. No. 5, 641, 640; Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705 i ‘on-line’ izvori obezbeđeni od BIAcore International AB (Uppsala, Sweden). Informacije iz SPR mogu biti korišćeni da obezbede tačne i

kvantitativne mere ravnotežne konstante disocijacije (Kd), i kinetičkih parametara, uključujući Kon i Koff, za vezivanje biomolekula za cilj.

Epitopi mogu takođe biti direktno mapirani procenjivanjem sposobnosti različtitih antitela da se takmiče jedan sa drugim za vezivanje za TWEAK (na pr., humani TV/EAK, naročito rastvomi humani TWEAK) korišćenjem BIAcore hromatografskih tehnika (Pharmacia BIAtechnology Elandbook, "Epitope Mapping", Section 6. 3. 2, (May 1994); videti takođe Johne et al. (1993) J. Immunol. Methods, 160: 191-198). Dodatno opšte navođenje za procenjivanje antitela, na pr. u testovima Western blots i imunoprecipitacije, mogu biti nađeni u Antibodies: A Laboratory Manual, ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor press (1988)).

Poremećaji u vezi sa TWEAK-om

Anti-TWEAK antitela (kao što su ovde opisana anitela) mogu biti korišćena za lečenje različtitih poremećaja, kao što su poremećaji u vezi sa TWEAK-om. Na primer, antitela mog biti korišćena za lečenje inflamatorih, imunih ili autoimunih poremećaja kod pacijenata, kao i neoplastičnih poremećaja. Primeri inflamatornih poremećaja u vezi sa TWEAK-om uključuju reumatoidni artritis, psorijatički artritis, ankilozni spondilitis, inflamatornu bolest creva (uključujući ulcerozni kolitis i Crohn-ovu bolest), psorijazu, ili inflamatorni miozitis. Drugi primeri inflamatornih poremećaja koji mogu biti lečeni uključuju histiocitozu Langerhans-ovih ćelija, adultni respirotarni distres sindrom /bronhiolitis obliterans, Wegener-ovu granulomatozu, vaskulitis, kateksiju, stomatitis, idiopatsku pulmonarnu fibrozu, dermatomiozitis ili polimiozitis, ne-infektivni skleritis, hroničnu sarkoidozu sa plućnim komplikacijama, mielodisplastični sindromi/refraktorna anemija sa viškom blasta, ulcerozni kolitis, umerene do ozbiljne hronične plućne bolesti i arteritis giganskih ćelija.

Subjektu koji je u opasnosti, ili sa dijagnozom ili ima jedno od ovih poremećaja mogu biti davana anti- TWEAK antitela u količini i toku vremena da se obezbedi celokupni terapeutski efekat. Anti-TWEAK antitelo može biti davano samo ili u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, USSN 60/679, 518 opisuje postupke za davanje sredstva za bolokiranje TWEAK u kombinaciji sa sredstvima za blokiranje

TNF-α. U slučaju kombinovane terapije, količine i vreme davanja mogu biti takva da obezbede na pr., sinergijski terapeutski efekat. Dalje, davanje sredstava za blokiranje TWEAK (sa ili bez drugog sredstva) može biti korišćeno kao primamo, na pr., prva linija lečenja, ili kao sekundarno lečenje, na pr., za subjekta koji ima neodgovarajući odgovor na prethodno davanu terapiju (tjterapiju koja je drugačija nego ona sa sredstvom za blokiranje TWEAK).

Reumatoidni artritis (RA)

Anti-TWEAK antitelo (kao stoje ovde opisano antitelo) može biti korišćeno za lečenje reumatoidnog artritisa i srodnih poremeća. Reumatoidni artritis ("RA") je hronična inflamatorna bolest koja izaziva bol, otok, ukočenost i gubitak funkcije, primarno u zglobovima. RA često počinje u sinovijalnoj membrani, koja okružuje zglob obrazujući zaštitnu kesu. Kod mnogo pojedinaca koji pate od RA, leukociti se infiltriraju iz krvnog sistema u sinovijalnu membranu izazivajući kontinualna abnormalna zapaljenja (na pr., sinovitis). Zbog toga, sinovijalna membrana postaje upaljena izazivajući toplotu, crvenilo, naticanje i bol. Kolagen u hrskavici se postepeno uništava, sužavajući prostor u zglobu i eventualno oštećujući kost. Zapaljenje izaziva erozivno oštećenje kosti u oštećenoj zoni. U toku ovog postupka, ćelije sinovijalne membrane rastu i dele se abnormalno, čineći normalno tanku sinovijalnu membranu debelom i dovodeći do zgloba koji natiče i koji je naduven na dodir.

Kako RA napreduje, abnormalne sinovijalne ćelije mogu napasti i uništiti hrskavicu i kost u zglobu. Okolni mišići, ligamenti, i tetive koje podržavaju i stabilizuju zglob mogu postati slabe i nesposobne da rade normalno. RA takođe može izazvati opšti gubitak kosti koji može voditi do osteoporoze, čineći kosti lomljivijim i sklonijim lomljenju. Svi ovi efekti izazivaju bol, pogoršanja i deformitete u vezi sa RA. Regioni koji mogu biti ugroženi uključuju ručne zglobove, članke, kolena i delove stopala ispod palca. Često, mnogo zglobova može biti uključeno i čak i kičma može biti ugrožena. U oko 25% ljudi sa RA, zapaljenja malih krvnih sudova može izazvati reumatoidne čvoriće, ili izrasline, ispod kože, koje često obrazuju blizu zglobova. Kako bolest napreduje, tečnost se takođe može akumulirati, naročito u nožnim člancima. Kod mnogo pacijenata sa RA takođe se razvija anemija, ili pad u normalnom broju crvenih krvnih zrnaca.

RA obuhvata brojne potipove bolesti, kao što je Felty-jev sindrom, seronegativni RA, "klasičan" RA, progresivni i/ili povratni RA, i RA sa vaskulitisom. Neki eksperti klasifikuju bolest u tip 1 ili tip 2. Tip 1, manje uobičajeni oblik, traje najviše nekoliko meseci i ne ostavlja trajne posledice. Tip 2 je hronični i traje godinama, a nekad doživotno. RA se može takođe manifestovati kao potkožni reumatoidni čvorići, visceralni čvorići, vaskulitis koji izaziva čireve na nozi ili mononeuritis multipleks, pleuralno ili perikardijalno izlivanje, limfadenopatija, Felty-ijev sindrom, Sjogren-ov sindrom i episkleritis. Podtipovi ove bolesti i takođe subjekti koji imaju jedan ili više gornjih simptoma mogu biti tretirani korišćenjem ovde opisanih antitela.

RA može biti procenjivan različitim kliničkim merenjima. Neki primeri pokazatelja uključuju ukupan Sharp-ov rezultat (TSS), rezultat Sharp-ove erozije, i HAQ indeks onesposobljenosti. Ovi postupci mogu biti korišćeni za postizanje poboljšanja za bar jedan od ovih pokazatelja. Terapeutske osobine anti-TWEAK antitela za tretiranje RA mogu biti procenjeni na životinjskom modelu, na pr., korišćenjem modela izazivanja kod miša artritisa u vezi sa kolagenom (mouse collagen-induced arthritis (mClA)) (videti na pr., Stuart et al., J. Clin. Invest. 69: 673-683 (1982).

Multiple skleroza

Anti-TWEAK antitelo (kao što je ovde opisano antitelo) može biti korišćeno u lečenju multiple skleroze (MS) i srodnih poremećaja. MS je bolest centralnog nervnog sistema koja je karakterisana zapaljenjem i gubitkom mijelinskog omotača.

Pacijenti koji imaju MS mogu biti identifikovani kriterijumom postavljanja klinički nedvosmislene dijagnoze MS kao što je defmisano praktično na dijagnozi MS (Poser et ah, Ann. Neurol. (1983) 13: 227). Ukratko, pojedinac sa klinički nedvosmislenom MS ima dva napada i klinički dokaz ili dve lezije ili klinički dokaz jedne lezije i paraklinički dokaz drugih odvojenih lezija. Definitivni MS mogu takođe biti dijagnostifikovani dokazom dva napada i oligoklonalnih traka IgG u cerebrospinalnoj tečnosti ili kombinacijom napada, kliničkih dokaza dve lezije i oligoklonalnih traka IgG u cerebrospinalnoj tečnosti.

Efikasan tretman multiple skleroze može biti ispitivan na nekoliko drugačijih načina. Sledeći parametri mogu biti korišćeni za merenje efikasnosti lečenja. Korišćena su tri različita kriterijuma: EDSS (skala stanja produžene onesposobljenosti), izgled egzacerebracija ili MRI (snimanje magnetnom rezonancom). EDSS ceni klinička pogoršanja na osnovu MS (Kurtzke (1983) Neurology 33: 1444). Osam funkcionalnih sistema je procenjivano na tip i ozbiljnost neuroloških pogoršanja. Ukratko, pre lečenja, pacijenti su procenjivani na pogoršanja u sledećim sistemima: piramidalno, cereberalno, moždani sisem, čulno, creva i bešika, vizualno, cerebralno, i drugo. Ispitivanja su izvođenja u definisanim intervalima. Skala je bila u obimu od 0 (normalno) do 10 (smrt usled MS). Pad u EDSS ukazuje na efikasano lečenje (Kurtzke (1994) Ann. Neurol. 36: 573-79).

Primer modela na životinji za multiple sklerozu je eksperimentalni model autimunog encefalitisa na mišu (EAE), na pr., kao što je opisano kod Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. lmmunol. (1984) 132: 2393-2401), i Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). Mišu se može davati ovde opisano antitelo pre izazivanja EAE. Miševi su procenjivani za karakteristične kriterijume da bi se odredila efikasnost antitela.

Moždani udar

Anti-TWEAK antitela (kao što su ovde opisana antitela) mogu biti korišćena u lečenju subjekata koji su imali moždani udar, na pr., tromboembolični ili hemoralgični moždani udar (na pr., između bar 48, 24, 12, 8, ili 2 sata), ili da spreče moždani udar, na pr., kod subjekta koji je u opasnosti od moždanog udara. Postupci kao primer su opsani u USSN 60/653, 811. Moždani udar je opšti termin za akutno oštećenje mozga koji nastaje kao posledica bolesti krvnih sudova. Moždani udar može biti klasifikovan u bar dve glavne kategorije: hemoralgični moždani udar (prouzrokovan izlivom krvi iz normalnih krvnih sudova) i ishemiski moždani udar (cerebralna ishemija usled nedostatka snabdevenosti krvi). Neka stanja mogu izazvati ishemijski moždani udar uključujući trombozu, emboliju i sistemsku hipoperfuziju (sa rezultujućom ishemijom i hipoksijom).

Moždani udar generalno izaziva neuronsku smrt i oštećenja u mozgu usled nedostatka kiseonika i sekundarnih posledica. Deo mozga koji umire kao rezultat nedostatka snabdevenosti krvlju ili drugog oštećenja se naziva infarkt. U nekim slučajevima, ovde opisana lečenja mogu biti korišćena da smanje ili minimiziraju veličinu infarkta, na pr. smanjivanjem sekundarnih događaja koji izazivaju neuronsku smrt ili oštećenja.

Obstrukcija cerebrane arterije koja je posledica tromba koja je nastao na zidu moždane arterije se generalno naziva cerebralna tromboza. U cerebralnoj emboliji, okulzivni materijal blokira cerebralnu arteriju nizhodno u krvotoku (na pr. ugrušak je nošen kroz cerebralnu arteriju od srca). Teško je razlikovati da li je moždani udar izazvan trombozom ili embolijom, izraz tromboembolija se koristi da pokrije oba ova tipa moždanog udara. Sistemska hipoperfuzija može nastati kao posledica sniženog krvnog pritiska, smanjenih hematokrita, niskog krvnog pritiska ili nemogućnosti srca da pumpa krv adekvantno.

Dalje, anti-TWEAK antitelo može biti davano kao profdaktička terapija protiv moždanog udara, ili njegove komponenta, na pr., subjektu koji je imao prolazni ishemijski napad (transient ischemic attack - TIA) ili pokazuje simptome TIA.

Neuronski poremećaji

Anti-TWEAK antitela (kao što su ovde opisana antiela) mogu biti korišćena za lečenje ili sprečavanje neuronskih poremećaja kao što su neuronske traume i neurodegenerativni poremećaji. Primeri mehaničkih neuronskih trauma uključuju povrede kičmene moždine (spinal cord injury - SCI) i traumatske povrede mozga (traumatic brain injury - TBI). Primeri neurodegenerativnih poremećaja uključuju aminotrofičnu leteralnu sklerozu (amyotrophic lateral sclerosis - ALS), progresivnu bulbamu paralizu (progressive bulbar palsy - PBP), primarnu lateralnu sklerozu (primary lateral sclerosis -PLS), progresivnu mišićnu atrofiju (progressive muscular atrophy -PMA), Parkinson-ovu bolest, Huntington-ovu bolest (HD), i Alzheimer-ovu bolest.

Videti, na pr., USSN 60/653, 813. U jednom izvođenju, neuronski poremećaj je primamo karakterisan uništenjem ili smrću nervnih ćelija, na pr. motornih neurona (na pr., ALS),

strialni neuroni bazalnih ganglija i/ili kortikalni neuroni (na pr., Huntington-onova bolest), neuroni crne supstance (substantia nigra) (na pr., Parkinson-ova bolest).

Kancer

TWEAK i njegovi receptori mogu biti uključeni u razvoj bar nekih tipova kancera, na pr., kancer pankreasa. Anti-TWEAK antitela (kao stoje antielo ovde opisano) mogu biti korišćeni u lečenju ili sprečavanju kancera (na pr., adenokarcinoma) i drugih neoplastičnih bolesti. Videti na pr, “TREATMENT OF CANCER, ” USSN 60/685, 465, podnetu maja 27, 2005.

Farmaceutske kompozicije

Anti-TWEAK antitelo (kao stoje ovde opisano antitelo) može biti

formulisano kao farmaceutska kompozicija za davanje subjektu, na pr., da se leči ovde opisani poremećaj. Tipično, farmaceutska kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde korišćen izraz, “farmaceutski prihvatljiv nosač” uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, prevlake, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična i apsorpciona sredstva za odlaganje i slično koja su fizološki kompatibilna. Kompozicija može uključiti farmaceutski prihvatljivu so, na pr. kiselu adicionu so ili baznu adicionu so (videti na pr.. Berge, S. M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66: 1-19).

Farmaceutka formulacija je dobro ustanovljena u praksi i dalje opisana u na pr. Gennaro (ed. ), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed.,

Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); and Kibbe (ed. ), Handbookof Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

Farmaceutske kompozicije mogu biti u različitim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečne, polu čvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (na pr., injektibilne i infuzibilne rastvore), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškove, lipozome i supozitorije. Poželjni oblik može zavisiti od namenjenog načina davanja i terapeutske primene. Tipično kompozicije ovde opisanih sredstava su u obliku injektibilnih ili infuzionih rastvora.

U jednom izvođenju, anti-TWEAK antitelo je formulisano sa materijalima ekscipijenata, kao stoje natrijum hlorid, natrijum dibazni fosfat heptahidarat, natrijum monobazni fosfat i stabilizator. Na primer može biti dobijen u puferisanom rastvoru pri pogodnim koncentracijama i može biti čuvan na 2-8°C.

Takve kompozicije mogu biti davane paranteralno (na pr., intravenskom, subkutanoznom, intraperitonealnom, ili intramuskularnom injekcijom). Fraze “parenteralno davanje” i “davano parenteralno” ovde korišćeno označava načine davanja koji su drugačiji od enteralne i lokalne primene, uglavnom injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskulamu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, trahealnu, subkutanoznu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju ili infuziju.

Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druge uređene strukture pogodne za stabilno skladištenje u visokim koncentracijama. Sterilni injektibilni rastvori mogu biti pripremljeni ugradnjom ovde opisanih sredstava u željenu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, ako je potrebno, praćeno sterilizacijom ceđenjem. Generalno, disperzije su pripremljene ugradnjom ovde opisanog sredstva u sterilno sredstvo koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne ostale sastojke onih gore nabrojanih. U slučaju sterilnog praška za dobijanje sterilnih injektibilnih rastvora, poželjni postupci dobijanja su sušenje u vakumu i sušenje smrzavanjem koje daje prašak ovde opisanog sredstva plus bilo koji željeni sastojak iz ranijih rastvora sterilno proceđenih. Pogodna fluidnost rastvora može biti održavana, na primer, upotrebom obloge kao stoje lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih sredstava. Produžena apsorpcija injektibilnih kompozicija može biti dovedena uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.

U izvesnim izvođenjima, anti-TWEAK antitelo može biti pripremljeno sa nosačem koji će štititi jedinjenje protiv brzog oslobađanja, kao stoje formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i sisteme za mikroinkapsulirano davanje. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu biti korišćeni, kao stoje etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za dobijanje takvih formulacija su patentirani i opšte poznati. Videti na pr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Ine., New York (1978).

Anti-TWEAKantitelo može biti modifikovano, na pr., sa delom koji poboljšava njegovu stabilizaciju i/ili zadržavanje u krvotoku, na pr., u krvi, serumu, ili drugim tkivima, na pr., bar 1. 5, 2, 5, 10, ili 50 puta. Modifikovana antitla mogu biti procenjena da li dolaze do mesta zapaljenja na pr. zglobova.

Na primer, anti-TWEAK antitelo može biti u vezi sa (na pr., konjugovano za) polimerom, na pr., suštinski ne-antigenskim polimerom, kao što je polialkilen oksid ili polietilen oksid. Pogodni polimeri će suštinski varirati u težini. Mogu biti korišćeni polimeri imaju prosečnu molekulsku težine od oko 200 do oko 35, 000 daltona (ili oko

1, 000 do oko 15, 000, i 2, 000 do oko 12, 500).

Na primer, anti-TWEAK antitelo može biti konjugovan sa vodorastvornim polimerom, na pr., hidrofilni polivinil polimer, na pr., polivinilalkohol ili polivinilpirolidon. Primeri takvih polimera uključuju polialkilen oksid homopolimere kao što su polietilen glikol (PEG) ili polipropilen giikole, polioksietilenovane poliole, njihove kopolimere i njihove blok kopolimere, uz uslov daje rastvorljivost blok kopolimera u vodi održana. Dodatni korisni polimeri uključuju polioksialkilene kao što su polioksietilen, polioksipropilen i blok kopolimeri polioksietilena i polioksipropilena, polimetakrilata, karbomera i razgranatih ili nerazgranatih polisaharida.

U nekim primenama, anti-TWEAK antitelo može takođe biti kuplovano ili na drugi način povezano sa sredstvom za obeležavanje ili drugim sredstvom, na pr., drugim terapeutskim sredstvom kao što je citotoksično ili citostatičko sredstvo, mada, u mnogo izvođenja, ova konfiguracija nije potrebna. Primeri citotoksičnih i hemoterapeutskih sredstava uključuju taksol, citohalasin B, gramicidin D, vinblastin, doksorubicin, daunorubicin, maitansinoid (na pr., maitansinol ili DM1 maitansinoid, derivat maitansina koji sadrži sulfhidril), mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, taksan, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihovi analozi ili homolozi.

Kada je anti-TWEAK antitelo korišćeno u kombinaciji sa drugim sredstvom (na pr., anti-TNF-α antitelom ili drugim sredstvom), dva sredstva mogu biti formulisana odvojeno ili zajedno. Sredstva mogu biti formulisana ili na drugi način korišćena u sinergijski efiksanim količinama. Takođe je moguće da se koristi jedno ili oba sredstva u količinama manjim od onih što bi bile korišćene u mono-terapiji. Na primer, odgovarajuće farmaceutske kompozicije mogu biti pomešane, na pr. upravo pre davanja i mogu biti davane zajedno ili odvojeno, na primer istovremeno ili odvojeno.

Takođe je moguće korišćenje drugih TWEAK blokirajućih sredstava, na pr., sredstava opisanih u USSN 60/679, 518. Sredstvo može biti bilo koji tip jedinjenja (na pr., mali organski ili neorganski molekul, nukleinska kiselina, protein ili mimetički peptid) koji može biti davan subjektu. U jednom izvođenju, sredstvo za blokiranje je biološko, na pr. protein ima molekulsku težinu između 5-300 kDa. Na primer, TWEAK blokirajuće sredstvo može inhibirati vezivanje TWEAK za TWEAK receptor. Primeri TWEAK blokirajućih sredstava, drugačijih od antitela koja se vežu za TWEAK, uključuju antitela koja se vežu za TWEAK-R i rastvorne oblike TWEAK-R (na pr.,

Fnl4) koji se takmiče sa ćelijskom površinom TWEAK-R za vezivanje za TWEAK. Druga ovde opisana terapeutska sredstva mogu takođe biti obezbeđena kao farmaceutske kompozicije, na pr. standardnim postupcima ili ovde opisanim postupcima..

Davanje

Anti-TWEAK antitelo može biti davano subjektu, na pr., humanom subjektu, različitim postupcima. Za mnoge primene, način davanja je jedan od: intravenskom injekcijom ili infuzijom (IV), subkutanoznom injekcijom (SC), intraperitonealno (IP), ili intramusculamom injekcijom. Takođe je moguće korišćenje intra-artikularnog davanja. Takođe mogu biti korišćeni drugi načini parenteralnog davanja. Primeri takvih načina ukuljučuju: intraarterialnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, transtrahealnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, i epiduralnu i intrasternalnu injekciju. U nekim slučajevima, davanje može biti direktno na mesto upale, na primer u zglob ili drugo upaljeno mesto.

Put i/ili način davanja antitela takođe može biti prilagođen individualnom slučaju, na pr., posmatranjem subjekta, na pr., korišćenjem tomografskog snimanja, neurološkog testa i standardnih parametara koji su u vezi sa odgovarajućim poremećajem, na pr., kriterij um za procenu reumatoidnog artritisa.

Antitelo može biti davano u fiksnoj dozi ili u dozi mg/kg. Doza može takođe biti izabrana da snižava ili izbegava dobijanje antitela protiv anti-TWEAK antitela.

Dozni režimi su prilagođeni da obezbeđuju željeni odgovor, na pr. terapeutski odgovor ili kombinovani terapeutski efekat. Generalno, doze anti-TWEAK antitela (i opciono drugog sredstva) mogu biti korišćene u cilju obezbeđivanja subjekta sa sredstvom u biodostupnim količinama. Na primer, mogu biti davane doze u opsegu 0. 1 -100 mg/kg, 0. 5-100 mg/kg, 1 mg/kg-100 mg/kg, 0. 5-20 mg/kg, 0. 1-10 mg/kg, ili 1-10 mg/kg.

Takođe mogu biti korišćene i druge doze.

Dozni jedinični oblik ili “fiksna doza1' koji se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se leče, svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog da proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa poželjnim farmaceutskim nosačem i opciono zajedno sa drugim sredstvima. Mogu biti davane pojedinačne ili višestruke doze. Alternativno ili pored toga, antitelo može biti davano kontinualnom infuzijom.

Doza anti-TWEAK antitela može biti davana, na pr., u periodičnim intervalima u toku vremenskom periodu (u toku lečenja) dovoljnog da obuhvati bar 2 doze, 3 doze, 5 doza, 10 doza, ili više, na pr., jednom ili dva puta dnevno, ili oko jednom do četiri puta nedeljno, ili poželjno nedeljno, u dve nedeljne, mesečno, na pr., za između oko ldo 12 nedelja, poželjno između 2 do 8 nedelja, poželjnije između oko 3 do 7 nedelja, i čak poželjnije u toku bar 4, 5, ili 6 nedelja. Faktori koji mogu uticati na dozu i vreme potrebno da efikasno tretiraju subjekta uključuju, na pr., ozbiljnost bolesti ili poremećaja, formulacije, načina davanja, ranijih tretmana, opšteg zdravlja i/ili godina subjekta i drugih prisutnih bolesti. Povrh svega, lečenje subjekta sa terapeutski efikasnom količinom jedinjenja može uključivati jedno lečenje ili poželjno, može uključivati serije tretmana. Životinjski modeli mogu takođe biti korišćeni da se odrede korisne doze, na pr. inicijalne doze ili režim.

Ukoliko postoji rizik da se kod subjekta razvije zapaljenski poremećaj ili drugi ovde opisan poremećaj, antitelo može biti davano pre potpunog početka poremećaja na pr., kao preventivne mere. Trajanje takvih preventivnih tretmana može biti jedinična doza antitela ili lečenje se može nastaviti (na pr., višestrukim doziranjem). Na primer, subjekat koji je u opasnosti od poremećaja ili koji ima predispoziciju za poremećaj može biti tretirana sa antitelom u toku dana, nedelja, meseci ili čak godina tako da spreči da se poremećaj javi ili pojavi u velikom intenzitetu.

Farmaceutska kompozicija može uključivati ‘‘terapeutski efikasnu količinu” ovde opisanog sredstva. Takva efikasna količina može biti određena na osnovu efekta datog sredstva ili kombinovanog efekta sredstva ukoliko je korišćeno više od jednog sredstva. Terapeutski efikasna količina može takođe variarati prema faktorima kao što su bolesno stanje, godine, pol i težina pojedinaca i sposobnosti jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinaca, na pr. ublažavanjem bar jednog parametra poremećaja ili ublažavanjem bar jednog simptoma bolesti. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti kompozicije su bili važniji od terapeutski korisnih efekata.

Uređaji i kitovi za terapiju

Farmaceutske kompzicije uključuju anti-TWEAK antitela, i mogu biti konfigurisane da se daju jedna ili više doznih jedinica antitela. Uređaj može biti dalje konfigurisan za davanje drugog sredstva, na pr. anti-TNF-α antitela, ili kao pojedinačna farmaceutska kompozicija koja takođe uključuje anti-TWEAK antitelo ili dve odvojene farmaceutske kompozicije.

Na primer, farmaceutska kompozicija može se davati uređajem za hipodermičku inekciju bez igle, kao što su uređaji opisani u US 5, 399, 163; 5, 383, 851; 5, 312, 335; 5, 064, 413; 4, 941, 880; 4, 790, 824; ili 4, 596, 556. Primeri dobro poznatih implantata i modula uključuju: US 4, 487, 603, koji opisuje implantibilne mikro-infuzione pumpe za davanje leka kontrolisanom brzinom; US 4, 486, 194, koji opisuje terapeutski uređaj za davanje lekova preko kože; US 4, 447, 233, koji opisuje infuzionu pumpu za lek za davanje lekova preciznom infuzionom brzinom; US 4, 447, 224, koji opisuje različite protoke implantiranog infuzionog preparata za kontinualno davanje leka; US 4, 439, 196, koji opisuje osmotski sistem za davanje leka koji ima odeljke sa više komora; i US 4, 475, 196, koji opisuje osmotski sistem za davanje leka. Takođe je poznato mnogo drugih uređaja, implantata, sistema za davanje i modula.

Anti-TWEAK antitelo omože biti u obliku kita. U jednom izvođenju, kit obuhvata (a) sud koji sadrži kompoziciju koja uključuje anti-TWEAK antitelo, i opciono (b) informacioni materijal. Informacioni materijal može biti opis, uputstvo, propagandni ili drugačiji materijal koji se odnosi na ovde opisane postupke i/ili upotrebu sredstava u terapeutske svrhe.

U jednom izvođenju, kit takođe uključuje drugo sredstvo za tretiranje bolesti zapaljenja, na pr. anti- TNF-α antitelo. Na primer, kit uključuje prvi sud koji sadrži kompozicije koje uključuju anti-TWEAK antitelo, i drugi sud koji uključuje drugo sredstvo. Informacioni materijal kitova nije ograničen njegovim oblikom. U jednom izvođenju, informacioni materijal može uključivati informaciju oko proizvodnje jedinjenja, molekulske težine jedinjenja, koncentracije, datuma trajanja, serije proizvodnje ili informacije o mestu proizvodnje itd. U jednom izvođenju, informacioni materijal odnosi se na postupke davanja anti-TWEAK antitela, na pr., pogodne doze, doznim oblicima, ili načinima davanja (na pr., doza, dozni oblik ili način ovde opisan davanja), za lečenje subjekta koji je imao ili koji je u opasnosti od zapaljenskog poremećaja ili drugih ovde opisanih poremećaja. Informacija može biti obezbeđena u različitim oblicima, uključujući štampani tekst, materijal koji se može čitati na kompijuteru, video zapis ili audio zapis ili informacija koja obezbeđuje vezu ili adresu za osnovni materijal, na pr. na internetu.

Pored antitela, kompozicija u kitu može uključivati druge sastojke, kao što su rastvarač ili pufer, stabilizator ili sredstvo za održavanje. Antitelo može biti obezbeđeno u obliku, na pr. tečnosti, osušenom ili liofilizovanom obliku, poželjno suštinski čistom i/ili sterilnom. Kada su sredstva obezbeđena u tečnom rastvoru, tečni rastvor poželjno je vodeni rastvor. Kada su sredstva obezbeđena u suvom obliku, generalno rekonstrukcija je dodavanjem pogodnog rastvarača. Rastvarač, na pr. sterilna voda ili pufer, može opciono biti obezbeđen u kitu.

Kit može uključivati jedan ili više posuda koji sadrže sredstvo. U nekim izvođenjima, kit sadrži odvojene sudove, pregrade ili odeljke za kompozicije i informacioni materijal. Na primer, kompozicija može biti u boci, fioli ili špricu i informacioni materijal može biti u plastičnoj navlaci ili paketu. U drugm izvođenjima, odvojeni elementi kita su u jednom neizdeljenom sudu. Na primer, kompozicija se nalazi u boci, fioli ili špricu za koji je prikačen informacioni materijal u obliku nalepnice. U nekim izvođenjima, kit uključuje više (na pr., paket) individualnih sudova, od kojih svaki sadrži jedan ili više doznih oblika (na pr., ovde opisanih doznih oblika) sredstava. Sud može uključivati kombinovanu doznu jedinicu, na pr. jedinicu koja sadrži i anti-TWEAK antitelo i drugo sredstvo, na pr. u željenom odnosu. Na primer, kit uključuje mnogo špriceva, ampula, paketa u foliji, blister paketa ili medicinskih uređaja na pr., svaki sadrži jednu kombinaciju jedinične doze. Sudovi u kitovima mogu biti nepropusni za vazduh, vodootporni (na pr. nepropusne za promenu u vlazi ili isparavanje), i/ili zaštićeni od svetla.

Kit opciono uključuje uređaj pogodan za davanje kompozicije, na pr., špric ili drugi pogodni uređaj. Uređaj može biti prethodno napunjen sa jednim ili dva sredstva ili može biti prazan, ali pogodan za punjenje.

Ciljanje TWEAK-ekspresionih ćelija

Ovde opisana anti-TWEAK antitela mogu biti korišćena da ciljano deluju na ćelije koje eksprimiraju TWEAK ili druga tkiva ili strukturu koji su u vezi sa TWEAK. Na primer, antitela mogu biti vezana za virus ili čestice slične virusu koje mogu dostavljati egzogene gene (na pr., za gensku terapiju) ili za lipozom, na pr. lipozom koji inkapsulira terapeutska sredstva ili egzogene gene. Primer postupka korišćenja antitela za ciljni virus opisan je u Roux et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 9079-9083. See also, e. g., Curr Gene Ther. (2005) 5: 63-70 and Hum Gene Ther. (2004) 15: 1034-1044.

Anti-TWEAK Abs prema ovom pronalasku, mogu takođe biti vezana za lipozome koji sadrže terapeutsko sredstvo kao stoje hemoterapeutsko sredstvo.

Vezivanje anitela za lipozome može biti postignuto bilo kojim poznatim sredstvom za umrežavanje kao su heterobifunkcionalna sredstva za urmežavanje koja su široko korišćena za kuplovanje toksina ili hemoterapeutskih sredstva za antitela za ciljano davanje. Na primer, konjugacija za lipozome može biti postignuta korišćenjem karbohidrat usmerenog umreženog reagensa za umrežavanje hidrazida 4-(4-maleimidofenil) buterne kiseline (MPBH) (Duzgunes et al. (1992) J. Cell. Biochem.

Abst. Suppl. 16E 77). Antitela koja sadrže lipozome mogu takođe biti pripremljena dobro poznatim postupcima (videti na pr. DE 3, 218, 121; Epstein et al. (1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 3688-92; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-34; U. S. 4, 485, 045 and 4, 544, 545).

Dijagnostičke upotrebe

Anti-TWEAK antitela mogu biti korišćena u dijagnostičke svrhe za detektovanje prisustva TWEAK, in vitro (na pr., biološki uzorak, kao što je tkivo, biopsija) ili in vivo (na pr., in vivo snimanje subjekta). Na primer, humana ili efikasna humana anti-TWEAK antitela mogu biti davana subjektu da detektuju TWEAK unutar subjekta. Na primer, antitelo može biti obeleženo, na pr., sa MRI detektabilnim oznakama ili radioaktivnim oznakama. Ovaj subjekat može biti procenjivan korišćenjem sredstava za detektovanje detektabilnih oznaka. Na primer, subjekt može biti procenjivan korišćenjem detektabilnih oznaka. Na primer, subjekat može biti skeniran da bi se skenirao položaj antitela u subjektu. Na primer, subjekat je sniman, na pr., sa NMR ili drugim tomografskim sredstvima.

Primeri označivača korisnih za dijagnostičko slikanje uključujući radioaktivne obeleživače kao što su 131I, 111In, 123I, 99Tc, 32P, 33P, 1251, 3H, 14C, i 188Rh, fluorescentne označivači kao što su fluorescin i rodamin, označivače aktivni na nuklearnu magnetnu rezonancu, izotope koji emituju pozitrone koji se mogu detektovati skenerom pozitronske emisione tomografije (“PET”) scanner, hemiluminiscentna sredstva kao što je luciferin, i enzimske markere kao što su peroksidaze ili fosfataze. Mogu takođe biti korišćeni radioaktivni emiteri kratkog dometa, kao što su izotopi detektabilni sa detektorima kratkog dometa. Proteinski liand može biti obeležen sa takvim reagensima korišćenjem poznatih tehnika. Na primer, videti Wensel i Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York za tehnike koje su u vezi sa radioobeležavanjem antitela i et al. (1986) Meth. Enzymol. 121: 802-816.

Subjekt može biti “sniman” in vivo korišćenjem poznatih tehnika kao što su radionuklearno skeniranje korišćenjem na pr., gama kamera ili emisione tomografije. Videti na pr., A. R. Bradwell et al., “Developments in Antibody Imaging”, Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldvvin et al., (eds. ), pp 65-85 (Academic Press 1985). Alternativno, skener pozitronske emisione trasaksijalne tomografije, kao što je označen sa Pet VI smešten u Brookhaven National Laboratory, može biti korišćen gde radioaktivni obeleživači emituju pozitrone (na pr., 11C, l8F, 15O. i 13N).

MRI kontrastna sredstva. Snimanje magenetne rezonance (MRI) koristi NMR da bi vizualizovao unutrašnje karakteristike živih subjekata i koristan je za prognozu, dijagnosticiranje, lečenje i operaciju. MRI može biti korišćen bez jedinjenja radioaktivnih indikatora za očiglednu korist. Neke MRI tehnike su ukratko izložene u

EPO 502 814 A. Generalno, razlike u vezi sa konstantama relaksacionog vremena TI i T2 protona vode u različitim okolinama je korišćen da stvori sliku. Međutim, razlike mogu biti nedovoljne da se obezbedile oštre slike visokea rezolucija.

Razlike u ovim relaksacionim vremenskim konstantama mogu biti povećane kontrastnim sredstvima. Primeri takvih kontrastnih sredstava uključuju brojna magnetna sredstva, paramagnetna sredstva (koja primarno menjaju TI) i feromagnetana ili supermagnetna sredstva (koja primarno menjaju T2 odgovor). Helati (na pr., EDTA, DTPA i NTA helati) mogu biti korišćeni za vezivanje (i smanjivanje toksičnosti) nekih paramagnetnih susptanci (na pr., Fe3+, Mn2+, Gd3+). Druga sredstva mogu biti u obliku čestica, na pr. manjim od 10 µm do oko 10 nm u prečniku). Četice mogu imati feromagnetne, anti-feromagnetne ili superparamagnetne osobine. Čestice mogu obuhvatati, na pr. magnetit (Fe3O4), γ-Fe2O3, ferite i druga magnetna mineralna jedinjenja prelaznih elemenata. Magnetne čestice mogu uključivati jedan ili više magnetnih kristala sa ili bez nemagnetnih materijala. Nemagnetni materijal može obuhvatati sintetičke li prirodne polimere kao što su sefaroza, dekstran, dekstrin, škrob i slično).

Anti-TWEAK antitela mogu takođe biti obeležena sa grupom indikatorom koja sadrži NMR-aktivan 19F atom, ili više takvih atoma pošto (i) suštinski svi prirodni atomi fluora su izotop 19F i prema tome, sva jedinjenja koja sadrže fluor su NMR-aktivna; (ii) mnogo hemijski aktivnih polifluorovanih jedinjenja kao što je anhidrid trifluorosirćetne kiseline su komercijalno dostupni po relativno niskoj ceni, i (iii) ustanovljeno je daje mnogo fluorovanih jedinjenja medicinski prihvatljivo za humanu upotrebu kao što su perfluorovani polietri korišćeni da nose kiseonik kao zamena za hemoglobin. Posle nekog vremena za inkubaciju, izveden je MRI celog tela korišćenjem aparata kao što je onaj opisan kod Pykett (1982) Scientific American, 246: 78-88 da se locira i snimi raspoređenost TWEAK.

U drugom aspektu, opis obezbeđuje postupak detektovanja prisustva TWEAK u uzorku in vitro (na pr., biološkom uzorku, kao što je serum, plazma, tkivo, biopsija). Predmetni postupak može biti korišćen za dijagnosticiranje poremećaja, na pr. poremećaja u vezi sa imunim ćelijama. Postupak uključuje: (i) dovođenje u kontakt uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-TWEAK antitelom; i (ii) procenivanje uzorka na prisustvo TWEAK, na pr., detektovanjem obrazovanog kompleksa između anti-TWEAK antitela i TWEAK, ili detektovanjem prisustva antitela ili TWEAK. Na primer, antitelo može biti imobilizovano, na pr. na nosaču, detektovano je zadržavanje antigena na nosaču i /ili obnuto. Kontrolni uzorak može biti uključen. Statistički značajna promena u obrazovanju kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak može biti indikativna za prisustvo TWEAK u uzorku. Generalno, anti-TWEAK antitelo može biti korišćeno u prijavama koje obuhvataju florescentnu polarizaciju, mikroskopiju, ELISA, centrifugiranje, hromatografiju i ćelijsko sortiranje (na pr., fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje).

Primer 1

Sekvenca promenjivog domena teškog lanca mišijeg P2D10, sa podvučenim CDRs, je:

1 EVQLVESGGG LVRPGGSLKL FCAASGFTFS RYAMSWVRQS PEKRLEWVAE 51 ISSGGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNTLY LEMSSLKSED TAMYYCARVL 101 YYDYDGDRIE VMDYWGQGTA VIVSS (SEQ ID br.: 50)

Ovo je podgupa 3D mišijeg promenjivog domena teškog lanca.

Sekvenca promenjivog domena lakog lanca mišijeg P2D10, sa podvučenim CDRs, je:

1 DVVMTQSPLS LSVSLGDQAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPK 51 FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVAAEDLGV YFCSQSTHFP 101 RTFGGGTTLE IK (SEQ ID br.: 51)

Ovo je podgrupa 2 kapa mišijeg lakog lanca.

Sledeći humani akceptori ‘framevvorks’ su izabrani za huP2D10: Humana 56-84m podgrupa 3 promenjivog domena teškog lanca (pristupni broj NCBI baze podataka GI: 33318898, Scamurra et al., direktno podnošenje). Sekvenca sa podvučenim CDRs je sledeća.:

1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMSWVRQA PGKGLEWVAN 51 IKQDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP 101 MTTVVKPSLA TNDYWGQGTL VTVSS (SEQ ID br.: 52)

Sekvenca humane Kl07 podgrupe 2 promenjivog domena lakog lanca (pristupni broj NCBI baze podataka GI: 21669075, Akahori et al., direktno podnošenje), sa podvučenim CDRs je:

1 DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ 51 LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTP 101 LTFGGGTKVE IK (SEQ ID br.: 53)

U prikazanoj sekvenci humanog akceptora, CDRs (koji su podvučeni) su iste dužine i kanoničkih klasa kao one u promenjivim domenima muP2D10.

Dole je prikazano poravnavanje promenjivih domena teškog lanca mišijeg P2D10 (gornji) i humanog akceptora 56-84m (donji) (identičnost 68. 8%):

Dole je prikazano poravnavanje promenjivih domena lakog lanca mišijeg

P2D10 (gornji) i humani akceptora K107 (donji) (identičnost 75. 9%):

1 DWMTQSPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPK 50

Postoje dve verzije huP2D 10 lakog lanca (LI i L2). Antitelo huP2D10-l odnosi se na antitelo koje uključuje huP2D10 Hl i huP2D10 LI. Antitelo huP2D10-2 odnosi se na antitelo koje uključuje huP2D10 Hl i huP2D10 L2.

Dole je prikazano poravnavanje promenjivih domena teškog lanca 56-84m humanog akceptora (gornji) i huP2D10 Hl (donji):

|] CDRs su podvučeni. huP2D10 teški lanac je ravnolančani CDR graft (tj., ne postoje povratne mutacije u 'framework).

Dole je prikazano poravnavnje promenjivih domena lakog lanca Kl 07 humanog kapa akceptora (gornji) i huP2D10 LI (donji):

100

CDRs su podvučeni. huP2D10 LI laki lanac ima dve povratne mutacije koje su pokazane u donjem slučaju u gore pokazanom ‘framev/ork’: L46F u FR2 i Y87F u FR3.

Dole je prikazano poravnavanje promenjivog domena K107 humanog akceptora (gornji) i huP2D10 L2 lakog lanca (donji):

CDRs su podvučeni. huP2D10 L2 laki lanac je ravnolančani CDR graft (bez povratnih muatacija u 'framework’-u).

Ovo je primer amino kiselinske sekvence teškog lanca zrelog huP2D10 Hl IgGl:

Kabat numeracija za Vh segment promenjivog domena teškog lanca (SED ID br: 65) je prikazana dole:

Ovo je primer amino kiselinske sekvence lakog lanca zrelog huP2D10 LI:

Kabat numeracija za ovaj VL segment je dole prikazana (SEQ ID br: 67):

Ovo je primer amino kiselinske sekvence lakog lanca zrelog huP2D10 L2:

Primer 2

Blokiranje monoklonalnog antitela za TWEAK, mP2D10, značajno smanjuje kliničku jačinu na modelima multiple skelroze, moždanog udara i reumatoidnog artritisa. Podešavana je farmakokinetika (PK) anti-TWEAK monoklonalnog antitela, mP2D10, posle intravenskog (IV) davanja.

mP2D10 je davan mišu u količini 1, 10 ili 100 mg/kg pomoću IV injekcije. Koncentracije mP2D10u serumu su određene korišćenjem ELISA. PK profil koncentracija-vreme je analiziran korišćenjem modela sa dva odeljka sa eliminacijom prvog reda ili Mihaelis-Mentenovom eliminacijom iz centralnog odeljka zapremine VI. Konstante brzine između dva odeljka su bile Kl2 (izlazeći iz odeljka 1 u 2) i K21 (izlazeći iz odeljka 2 u 1). Za model eliminacije prvog reda, brzina eliminacione konstante je bila K10. Za Mihaelis-NMentenov model eliminacije, lek je uklonjen brzinom Vm*Cl/(Km+Cl), u kojoj, Cl je bila koncentracija mP2D10 u centralnom odeljku, Vm i Km su konstante. Podaci su uklapani sa ADAPT II softverom (D'Argenio, D. Z. and A. Schumitzky. ADAPT II User's Guide: Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Systems Analysis Software. Biomedical Simulations Resource, Los Angeles, 1997. ) korišćenjem postupka procenjivanja maksimalne verovatnoće.

Za model dva odeljka sa linearnom eliminacijom, VI je bio 23. 2 mL/kg, K10 je bio 0. 0096 h-1, K12 je bio 2. 501 i K21 je bio 1. 053. Veličina površine ispod krive (AIC) je bila 298 i Schwarz-ova vrednost je bila 304. 2. Za model dva odeljka linearne eliminacije, VI je bio 0. 0235. Vm je bio 9. 22 mg/kg/hr. Km je bio 484. 2 µg/mL. K12 je

bio 2. 348 h-1, i K21 je bio 0. 966 h-1. AIC vrednost je bila 269 i Schwarz-ova vrednost je bila 276. PK od mP2D10 je bolje predviđena sa nelinearnim modelom nego linearnim modelom.

Profili koncentracija-vreme mP2D10 su bolje predviđeni sa modelom sa dva odeljka sa Mihaelis-Mentenovom eliminacjom nego eliminacijom prvog reda.

Ljudi iz struke će zanati, ili biti u mogućnosti da korišćenjem samo rutinskih ekperimenata dođu do mnogih ekvivalenta ovde opisanih specifičnih izvođenja

Claims (29)

1.    Izolovani protein koji sadrži sekvencu promenjivog domena teškog lanca i sekvencu promenjivog domena lakog lanca, koji može obrazovati vezujuće mesto antigena koji se veže za humani TWEAK, gde protein ima jedno ili više sledećih osobina: (a)    protein se nadmeće sa P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2 za vezivanje za humani TWEAK; (b)    protein se veže za epitop humanog TWEAK koji se preklapa sa epitopom koji se graniči sa P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2; (c)    sekvenca promenjivog domena teškog i/ili lakog lanca je kodirana nukleinskom kiselinom koja hibridizuje pod uslovima visokog sparivanja sa komplementom nukleinske kiseline koji kodira P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2; (d)    sekvenca promenjivog domena teškog i/ili lakog lanca je bar 80% identična sa amino kiselinskom sekvencom odgovarajućeg promenjivog domena P2D10, huP2D10-l, ili huP2D 10-2; (e)    sekvenca promenjivog domena teškog i lakog lanca je bar 95% identična u CDR regionima (zbirno) sa CDR regionima promenjivih domena lakih i teških lanaca P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2; ili (f)    bar 95% identična u ‘framework' regionima (zbirno) sa ‘framework’ regionima promenjivih domena teškog i lakog lanca P2D10, huP2Dl 0-1, ili huP2Dl 0-2.

2.    Protein prema zahtevu 1, gde sekvenca promenjivog domena teškog lanca sadrži bar dve od sledećih sekvenci u okviru CDR regiona: GFTFSRYAMS (CDR1) (SEQ ID br: l), EISSGGSYPYYPDTVTG (CDR2) (SEQ ID br.: 2), VLYYDYDGDRIEVMDY (CDR3) (SEQ ID br.: 3).

3.    Protein prema zahtevu 1 ili 2, gde sekvenca promenjivog domena lakog lanca sadrži: jednu ili više sledećih sekvenci u okviru CDR regiona: RSSQSLVSSKGNTYLH (CDR1) (SEQ ID br.: 8), KVSNRFS (CDR2) (SEQ ID br.: 9), i SQSTHFPRT (CDR3) (SEQ ID br.: 10).

4.    Protein prema zahtevu 2, gde sekvenca promenjivog domena teškog lanca obuhvata sledeće CDRS: GFTFSRYAMS (CDR1) (SEQ ID br.: l), EISSGGSYPYYPDTVTG (CDR2) (SEQ ID br.: 2), VLYYDYDGDRIEVMDY (CDR3) (SEQ ID br.: 3); i sekvenca promenjivog domena lakog lanca obuhvata: jednu ili više sledećih sekvenci u okviru CDR regiona: RSSQSLVSSKGNTYLH (CDR1) (SEQ ID br.: 8), KVSNRFS (CDR2) (SEQ ID br.: 9), i SQSTHFPRT (CDR3) (SEQ ID br.: 10).

5.    Protein prema zahtevu 1 koji je rekombinant, pune dužine IgG.

6. Protein prema zahtevu 1 koji sadrži humani Fc region.

7. Protein prema zahtevu 1 koji sadrži humani Fc region sa tri ili manje aminokiselinskih supstitucija.

8.    Protein prema zahtevu 1 koji je Fab ili scFv.

9.    Protein prema zahtevu 1 koji sadrži ‘framevvork’ regione koji su bar 90% identičani sa ‘framevvork’ regionima humane germinativne linije.

10.    Protein prema zahtevu 1, gde ‘framevvork’ regioni sekence promenjivog domena lakog lanca su bar 95% identični, zbirno, sekvenci Vκl podgrupe sekvence germinativne linije.

11. Protein prema zahtevu 1, gde ‘framevvork’ regioni promenjive domenske sekvence teškog lanca su bar 95% identični, zbirno, sa DP54 sekvencom germinativne linije.

12. Protein prema zahtevu 1, gde ‘framework’ regioni sekvence promenjivog domena lakog lanca su bar 95% identične, zbirno, sekvenci DPK9 sekvence germinativne linije.

13.    Protein prema zahtevu 1, gde ‘framevvork’ regioni sekvence promenjivog domena teškog lanca su bar 95% identični, zbirno, sekvenci VH I podgrupe sekvence germinativne linije.

14.    Protein prema zahtevu 1 koji sadrži hipervarjabilnu petlju, koja ima iste kanonične strukture kao P2D10, huP2D10-l, ili huP2D10-2.

15.    Protein prema zahtevu 1, gde sekvenca promenjivog domena teškog lanca sadrži sekvencu bar 95% identičnu SEQ ID br.: 65.

16.    Protein prema zahtevu 1, gde sekvenca promenjivog domena teškog lanca sadrži SEQ ID br.: 65.

17.    Protein prema zahtevu 1, gde sekvenca promenjivog domena lakog lanca se sastoji od sekvence bar 95% identične sa SEQ ID br: 67 ili 69.

18.    Protein prema zahtevu 1 ili 15, gde sekvenca promenjivog domena lakog lanca sadrži SEQ ID br.: 67 ili 69.

19.    Protein prema zahtevu 1, sekvenca promenjivog domena teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID br: 27-49, ili sekvencu bar 95% njoj identičnu.

20.    Protein prema zahtevu 1, gde sekvenca promenjivog domena lakog lanca sadrži bilo koju od of SEQ ID br.: 17-26, ili sekvencu bar 95% njoj identičnu.

21.    Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein prema bilo kom od prethodnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.

22.    Postupak dobijanja antitela, koji obuhvata: dobijanje ćelije domaćina koja sadrži sekvence rekombinantnih nukleinskih kiselina za eksprimovanje proteina koji sadrži sekvencu promenjivog domena teškog lanca i sekvencu promenjivog domena lakog lanca, a protein je prema zahtevu 1; i održavanje ćelije pod uslovima pri kojima se protein eksprimuje.

23.    Postupak prema zahtevu 22, dalje obuhvata izolovanje proteina i formulisanje proteina sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

24.    Postupak lečenja auto-imunog poremeća kod subjekta, koji obuhvata: davanje subjektu, farmaceutske kompozicije prema zahtevu 21 u količini efikasnoj za lečenje autoimunog poremećaja.

25.    Postupak lečenja reumatoidnog artritisa kod subjekta, koji obuhvata: davanje subjektu, farmaceutske kompozicije prema zahtevu 21 u količini efikasnoj za lečenje reumatoidnog artritisa.

26.    Postupak za lečenje multiple skleroze kod subjekta, koji obuhvata: davanje subjektu, farmaceutske kompozicije prema zahtevu 21 u količini efikasnoj za lečenje multiple skleroze.

27.    Postupak za lečenje moždanog udara kod subjekta, koji obuhvata: davanje subjektu farmaceutske kompozicije prema zahtevu 21 u količini efiksanoj za lečenje moždanog udara.

28. Postupak za lečenje kancera kod subjekta, koji obuhvata: davanje subjektu farmaceutske kompozicije prema zahtevu 21 u količini efikasnoj za lečenje kancera.

29. Postupak prema zahtevu 28 gde je kancer, kancer pankerasa.