RS55888B1 - Tweak vezujuća antitela - Google Patents

Abstract

Opisana su anti-tweak antitela.

Description

[0001 j Citokini srodni sa faktorom nekroze tumora (tumor-necrosis factor-'lNF) su superfamilija proteina koja trna skup funkcija, iddjučujući one koje su uključene u imunološku regulaciju i regulaciju apoptoze. TWEAK.{slabi izazivač apoptoze sličan TNF) je jedan član ove superfamiiije.

[0002] Anti-TWEAK antiieia mog« biti korišeena u Jedenju različitih stanja i poremećaja, na pr. zapaljensfcib poremećaja, neuronskih poremećaja iJi drugih ovde opisanih poremećaja. Kada su koriščena u lečertju humanih subjekata, aritiieia su poželjno humana, hujraatuzovana ili na. drugi način efikasna humana antiteta,

{IMHBj U jednom aspektu,, opisan je protein koj i uključuje prvu i drugu sekvencu promenjivog domena imunogiobuiina, a koji uvezuje za TWEAK, m>r., humani TWEAK. Protein se može vezati mTWEAK>apt,, sa-afinitetom koji odgovara Kp-manjoj od -1Q"7 M, »pr.fIO"<8>, 10* 1 0"lft, 10*'1 M ili još boljoj. Protein se ovđe-takođe naziva "anti-TWBAK antitelo." Sekvenee prvog i drugog promenjivog domena imunoglobulina mogu uključivati bar dovoljan deo imunoglobultskog promenjivog domena da bi se obrazovalo vezujuče mesto antigena koje se vezuje za TWEAK.

Tipičnoj, prva i druga sekvenea prornenjivih domena imunoglobulina odgovaraju odgovarajućim sekveneama teškog i lakog lanca imunoglobulinskog promenjivog domena »pr.ssparenog ili na drugi način kompatibilnog teškog i lakog lanca.

[80(14]Antitelo se može vezati za epitop na TWEAK koji obuhvata bar jedan, dva, tri ili četiri anuno-kiselinska ostatka iz epitopa na TVV'BAK. koja prepoznaje P2DI0, za pepfiđ ođ TWEAK koji je vezan sa P2D10 {npr., peptiđ dužine manje ođ 25, 20, ili 1.5 amino kiselina) ili za region TWEAK koji prepoznaje P2ĐI0. Na primer, antitelo se specifično veže za epitop, npr. linearni ili konformaciotu epitop TWEAK» naročito humanog TVvEAK, npr., rastvomi region TWEAK. Antitelo može da se takmiči sa P2DI0 za vezivanje za TWEAK, npr. za humani TWEAK. Antiteb može kompetitivno inhibiraii vezivanje P2DI0 zaTWEAK, npr., humani TWEAK.. U jednom izvođenju, anitelo se može vezati za epitop koji se preklapa sa onim ođ 1*2010, na pr., uključuje bar jednu, dve, tri Hi Četiri ami.no kiseline zajedničke sa P2 D i 0 epitopom. ili. epitopom koji, kada se veže, sterno sprečava interakcije TVvEAK sa P2D10.

f0005j Na primer, anti-TWEAK antitelo se može vezati za TWEAK i modulirati, npr. inhibirati, interakciju- (npr. vezivanje) između TWEAK i TWEAK receptora, npr., Fnl4 (npr., humani Fnl4). Antitelo može takođe smanjivati signatna aktivnost TWEAK reeeptora. Antitelo može ciljati TWEAK, sekvester TWEAK, i/ili moduliratiin vivostabilnost TWEAK.

f0006j U jednom izvođenju, amtiteio se specifično veže za bar deo mesta interakcije na TWEAK koji je u kontaktu sa Fnl4 (npr., humani Fni4). Antitelo se može takmičiti sa Fn i 4 za vezivanje za TWEAK, »pr.,zahumani TWEA'K. Antitelo- može kompetitivno inhibirati vezivanje Fni4 za TWEAK. Antitelo može reagovati sa epitopom na TWBAK. koji kada se.veže, sterno sprečava interakcije između TVV'EAiC i Fn I4 (npr., između humanog TWEAK i humanog FnI4).

{0007] U jednom izvođen? u, antitelo može inhibirati j eđn-u ili vise aktivnosti u vezi sa TWEAK sa IC50 od oko 50 nM do 5 pM, tipično oko i 00 đo 25(5 pM ili .manje. Na primer, antitelo može inhibirati sposobnost TWEAK da potpomaže proliferaciju enđotelijalnih ćelija ili neovaskularizaciju. II jednom izvođenju, an.ti-TWEAK aniiteia smanjuju bar jednu aktivnost koja je u vezi sa TWEAK, npr., tako da antitelo kada se daje subjektu može modulirati zapaljenska stanja.

|0898j U drugom izvođenju, anitelo može se vezati za TWBAIC sa kinetikom u opsegu od I O3 do 10* M'V*, tipično IO4 do 10' M'VV U još jednom izvođenju, anitelo ima kinetiku đisocijaćije u opsegu od 10"do IO"<6>s"<s>, tipično IO"2 do IO* s<*J>. U jednom izvođenju, antitelo se veže za TWBAK, npr., humani TWEAK»sa afinitetom i/ili kinetikom sličnom (na pr., između faktora pet ili deset) monoklonainom antitelu P2D10, ili njegovim modifikovanim oblicima, npr, njegovim himemim oblicima ili humaniziranim oblicima (npr., ovde opisanim humaniziranim oblicima). Afinitet i kinetika vezivanja anii-TWEAK antitelamože biti testirana, npr. korišćenjem tehnologije hiosenzora (BIACORE™).

[808!?] U jednom izvođenju, antitelo je fragment pune dužine antitela koji se veže za antigen, npr. Fab, F(ab')2, Fv i h jeđnolančani Fv fragment. Tipično je antitelo pune dužine. Antitelo može biii monoklonaino antitelo ili mono-speciftčno antitelo. Na primer, antitelo je u kompoziciji koja obuhvata manje od 20 drugih vrsta anti-TWEAK antitela, npr., u kompoziciji koja ne uključuje druge vrste anii-TWEAK antitela*

[801(1] Antitelo može biti efikasno humano. "Efikasno humano" antitelo je antitelo koje uključuje dovoljan broj humanih aminokiselinskih položaja tako da antitelo ne izaziva imunogeni odgovor kod normalnih ljudi. Poželjno, protein ne izaziva odgovor neutralizacije autitelima, npr.bđgovor humanog anii-mišijeg antitela (HAMA. - the human anti-murine antibođy). HAMA može biti problematična u brojnim situacijama, npr. ukoliko je poželjno da antitela budu davana više puta, npr. u lecenju stanja Kroničnih bolesti ili bolesti koje se vraćaj«. HAMA odgovor može učiniti ponovljeno davanje antitela potencijalno neeilksasmm zbog povećanog kiirausa antitela iz seruma (videti, npr., Saieh etat, Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)) i takođe zbog potencijalnih ajergijskih -reakcija (videti, npr.. EoBuglio et al (1986)Hyhridoma, 5:5117-5123),

|66H ] Na primer, antitelo može biti humano, humanizovano, C'DE-grafiovano, himerno, rnutirano, afmitetno razvijeno, đeimunizirano, sintetičko ili na drugi načininvf/ro-stvoreno antitelo i njegove kombinacije. U jednom izvođenju, anti~TWBAK antitelo je humanizovano antitelo.

[0012]Teški i laki lanci anti~TWEAK antitela mogu biti u suštini pune dužine. Protein može uključivati bar jedan i poželjno dva, kompletna teška lanca i bar jedan, a poželjno dva, kompletno laka lanca) ili može uključivati fragment koji vezilje antigen (npr., Fabf F(ab?)2J Fv ili jeđnolaričani Fv fragment). U još jednom izvođenju, antitelo ima konstantan region teškog lanca izabran od npr. igGl, igG2, IgG3, Ig04, Ig&f, IgAl, lgA2JIgD, i IgE; naročito, izabran od, npr., fgOl, IgG2, IgG3, i IgG4, određenije, IgGi (npr., humani IgGi). Tipično, konstantan region teškog lanca je human ili mođifikovan oblik humanog konstantnog regiona. U drugom izvođenju, antitelo ima konstantni region lakog lanca izabran od, npr,, kapa ili iambđa, naročito, kapa (npr.. humani kapa).

10013]U jednom izvođenju, protein uključuje bar jedan, dva i poželjno tri CĐRs iz varjabilnog regiona lakog ili teškog lanca ovde opisanog antitela, npr,, P2D10. U ovom kontekstu, CDRs se odnosi na CDRs kao Stoje đefinisano Chothia hipervarjabilnim petljama. Na primer, protein uključuje, u sekvenci promenjivog domena teškog lanca, bar jednu, dve ili tri sleđece sekvence u okviru CDR regiona;

GFTf SRYAMS (CDR1) (SEQIDbr:l),

EISSGGS^POTĐTVTS(CĐR2) (SEQ ID br:2),

VLYY DYDGDRIB VMDY (CDR.3) (SEQ ID hr:3), ili CDR ima sekvence amino kiselina koje se razlikuju, ali ne više od 4, 3. 2.5, 2, i .5, L ili 0.5 prome.ua (npr.. supstitucije, insercije ili đelecije) na svakih 10 amino kiselina (npr., broj razlika je proporcijalan dužini CDR) u odnosu na gore navedene sekvence, npr. bar jedna promena, ali ne više od dve, tri ili četiri po CDR. Sekvenca promenjivog domena, teškog lanca može uključivati one CDR sekvence naročito u CDR3, ili bar dva CDRs, npr., CDR i i CDR3, CDR2 i CDR3, ili u sva tri CDRs,

fOO.14]Protein može uključivati, u sekvenci promenjivog domena teškog lanca, bar jednu, dve ili tri sleđeće sekvence u okviru CDR regiona (amino kiseline u zagradama

.predstavljaju alternative za odgovarajuće položaje):

(i) G-(YF)'CN'i>F<STDN)-(RY)-Y-A-(MlL)-(eS); (SEQ ID bn4),iil 00 Y-Y-(PV)-D-CfS)-V-CiX)-G; (SEQ ID br:5) i

(iii}(VL)-(IL)-(YF)-{Y!')-D-(YF)-Đ; (SEQ ID br:6) ili (DE)~(RK)-(ILVM)-(EQD)-(VAL)~M-(DE) ;.(SJ3Q ID br:7).

(8015] Protein može uključivali, u sekvenci promenjivog domena lakog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona:

RSSQSLVSSKGMTYLH; (CDRl) (SEQ ID br:S),

KVSNRFS; (CDR2) (SEQ ID br;9), i

SQSTHFPRT; (CDR3) (SEQ ID br? 10), ili CDR ima amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje ali ne više od 4,3,2.5.2,1,5,1, ili 0.5 promena (npr., supstitucija, inserclja ili đelecija.) na svakih 10 amino kiselina (npr., broj razlika je proporcionalan dužini CDR) u odnosu na gore navedenu sekvencu, npr., bar jedna promena, ali ne više od dve, tri ili četiri po CDR. Sekvenea promenj tvog domena lakog lanca može uključivati ove CDR sekvence naročito u CDR3, ili bar u dva CDRs, npr, CDR l i C0R3, CDR2 i CDR3, ili u sva tri CDRs.

[0016] Protein može obuhvatati, sekvencu promenjivog regiona lakog lanca, bar jednu, dve ili tri sledeće sekvence u okviru CDR regiona (amino kiseline u zagradama predstavljaju promene za odgovarajući položaj): (i) CRK>S-S-Q-S<LIMKV)-S-S-(^ (SEQ ID

bntl), ili (RK)~S-S-Q-S-(LI)~V-S-S-(K:RVC-N-CrN)-Y--L-H; (SEQ ID br;l2)

(ii) (KE)~(LVI)-S-(NYS)-<RW)-(FAD)-S; (S.EQ ID br;!3), ili K(EV1)-S-(NYS)~R-(FAĐ)-S; (SEQ IP br:l4), i (iii) (SM)-Q<GSA)^ST)-(HEQ)-(FWL)-P; (SEQ ID br:15) iii S-Q-(GSA>{Sn>

(HEQ)-F-P; (SEQ ID br;16).

[0017] U jednom poželjnom izvođenu, protein uključuje svih šest CĐR's iz P2D10 ili blisko povezanih CDRs, npr., CDRs koji su identični ili koji imaju bar jednu amino kiselinsku alternaciju, ali ne više ođ dve, tri ili četiri promene (npr., supstitucije, đelecije ili insercije), ili druge ovde opisane CDR,

[00J8] U još jednom primeru, protein uključuje bar jedan, dva ili tri CDR regiona koji imaju istu kanonsku strukturu i odgovaraju Chothia CDR regionima P2DI0, npr,.

iste kanonske strukture kao bar CDRl i/ili CDR2 promenjivih domena teških i/ili lakih lanaca P2D10.

[0019] Protein može obuhvatati jednu od sleđećih sekvenci:

ili sekvencu koja.ima manje ođ osam, sedam, šest, pet, četiri, tri ili dve promene (npr., supstitucije, insercije ili đelecije, npr., konzervativne supstitucije ili supstitucije .amino kiseliu&kog ostatka u odgovarajućem položaju u P2Đ10, huP2D10-LI , ili huP2DI 0-1.2). Primeri supstitucija su u jednom, ođ sledećih Kabat položaja; 2,4,6, 35,36,38,44,47, 49,62,64-69,85, 87,98, 99,101, i 102. Supsituteije mo<gu>, na primer, supstitnjsati jednu ili više amino kiselina iz P2D10 u odgovarajuće položaje u 'framevvork<*>re<g>ionti. npr., humani 'frarnework<5>region, npr., u FR2 (npr, u položaju 46 do Phe prema konsekutivnom brojanju) i u FR3 (npr, u položaju 87 do Phe). j'0020] Protein može uključivati jednu od sledećih sekvenci u promenjivom domenu teškog lanca:

ili sekvence koje imaju manje od osam, sedam, šest, pet, četiri, tri ili dve promene (npr., supstituicije, insercije ili đelecije, npr., konzervativne supstitucije ili supstitucije ammokiselinskog ostatka u odgovarajućem položaju u P2D10). Primeri supstitucija su u jednom od sledećih Kabat pložaja: 2,4, 6,25,36,37,39,47,48,93,94,103,104, 106, i

107. Supstitucije mogu, na primer, supstituisati jednu ili više amino kiselina iz P2D10 u odgovarajuće položaje u *framewofk' regionu, npr.. humanom 'framevvork<*>regionu.|0021jU jednom izvođenju,<*>framework<5>teškog lanca (npr., FR 1, PR2, FR3, individualno ili sekvenea obuhvata FR 1, FR2, i FR3, ali izuzimajući CDRs) uključuje amino kiselinsku sekvencu koja je bar80%, 85%, 90%, 95 %,97%, 98%, 99% ili više

identična<*>:frame%vork' teškog lanca jedne od sledećih segmenta sekvence V germinativne linije: DP-25, DP-J, DP~12, DP-9, ĐP-7, DP-3I, DP-32, DP-33, ĐP-58, DP-54, đrugaVH l pođgrupa sekvence germinativne linije, druga VH III pođgrupa sekvence germinativne linije, iii drugi V gen koji je kompatibilan sa kanonskim strukturama klase ! -3 (viđeti, npr., Chothia etal. (1992)7. Mol BioL 227:799-817;Tomlinson et al(1992),/ Mol Biol227:776-798), Drugi 'framevvorks' kompatibilni sa kanonskim, strukturama klase 1-3 uključuju 'fTam.evvorks' sa jednim ili više sledećih ostataka prema Kabat numeraciji: Aia, Glv, Thr, ili. Val u položaju 26; Giy u položaju 26: Tyr, Phe, ili Gly a položaju 27: Phe, Val, Ile, ili Leu u položaju 29; Met, Ue, Leu, Val, Ilir, Trp, ili lle u položaju 34; Arg, Thr, Ala, Lys u položaju 94; Gly, Ser, Asu, ili Asp u položaju 54; i Arg u položaju 71.

(0022) U jednom izvođenju, 'framevvork' lakog lanca (npr., FR!, FR2, FR3, individualno ili sekvenea koja obuhvata FR i, FR2, i FR3, ali isključuje CDRs) uključuje amino kiselinsku sekvencu, koja je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%,99%iii više identična \t>amework' lakog lanca Vk II podgrupe sekvence germinativne linije ili jedne od sledećih segmenta sekvenci germinativne linije V A17, Al, A18, A2, A19/A3, A23, Vk I podgrupe sekvenci genninativne linije (npr., DPK9 sekvenea), ili drugi V gen koji je kompatibilan sa kanonskim strukturama klase 4-1 (videti, npr., Tomlinson etal.

(1995) EMBOJ.14:4628). Drugi<t>trame\¥orks' kompatibilni sa kanonskom strukturom kalse 4-1 obuhvata] u 1frameworky sa jednim i li više sledećih ostataka prema Rabat numeraciji: Val ili Leu ili Ile u položaju 2; Ser ili Pro u položaju 25; lle ili Leu u položaju 27b; Glv u položaju 29; Phe ili Leu u položaju 33; i Phe u položaju 71. Dalje, prema Rabat numeraciji, položaj 48 može biti Ile ili Val.

(0023]U još jednom izvođenju, *framework' lakog lanca (npr., FRI, FR2, FR3, pojedinačno ili sekvenea obuhvata, FR 1, FR2, i FR3, ali isključujući CDRs) obuhvate

amino kiselinsku sekvencu, koja je. bar 80%, 85%, 90%, 95%,.97%, 98%, 99% iii više identična sa *iramework* lakog lanca sekvence VkI podgrupe germinativne linije, npr, DPK9 sekvenea.

{0024] U jednom izvođenju, promenjivi<4>framework' lakog iii teškog lanca (npr., region obuhvata bar PRI, FR2, FR3, i opciono FR4) može biti izabran od: (a) pix>menjivog 'femevvork<*>lakog ili teškog lanca koji uključuje bar 80%, 90%, 95%, ili poželjno 100% amino kiselinskih ostataka iz humanog<p>romenjiv<og>>firamew<p>rk<>>lakog ili teškog lanca, npr., ostatak promenjivog<*>framework' lakog ili teškog lanca iz humanog sazrelog antitela, humane sekvence germinativne linije, humane konsezusne sekvence ili ovde opisanog humanog antitela; (b) promenjivi 'framework' lakog ili teškog lanca uključuje ođ 20% do 80%, 40% do 60%, 60% do 90%, ili 70% do 95% amino kiselinskih ostataka iz promenjivog 'framevrork* humanog lakog ili teškog lanca, npr., ostatak promenjivog<<>framework<t>lakog ili teškog lanca humanog sazrelog antitela, humane sekvenea germinativnelinije,humane konsezusne sekvence; (c) nehumani 'frameNvork*

(np.r.5a<*>j5amework<*>glodara); ili (đ) nehumani 'Iramevvork ' koji je moditlkovan, npr., da ukloni antigene ili citotoksične determinante, npr. đeinumizlrane, ili đelimieno humanizovane. U jednom izvođenju, promenjive đomenske sekvence teškog lanca obuhvataju humane ostatke ili ostatke humane konsezusne sekvence u jednom ili više sledećih položaja (poželjno bar pet, deset, dvanaest ili sve); (u FR promenjivog domena lakog lanca) 4L, 35L,36L, 3SL,43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L67L,68L, 69L, 70L, 71L, 731,, 85L, 87L, 981, i/ili (u FR promenjivog domena, teškog lanca) 2H, 4H, 24B, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, S8H, 60H, 6?H,68H, 69H, 70H, 73R 74H, 75F1, 78H,9111,92H, 93H, i/ili 103H (prema Kabat numeraciji).

(0025}U jednom izvođenju, protein uključuje bar jedan nehumani CDR, npr., misiji CDR, npr,, CDR iz P2D10, ili njegov mutant, i bar jedan ^framevvork' koji se razlikuje od P2D10 u bar jednoj amino kiselini, npr,, bar 5, 8,10,12,1.5, ili 18 amino kiselina. Na primer, proteini uključuju jedan, dva, tri, četiri, pet ili set takvih nehumanih CDR's i uključuje bar jednu amino kiselinsku razliku u bar tri HC FRi, HC FR2, HC FR3, LC FR1 s LC FR2, i LC FR3.

{0026}U jednom izvođenju, sekvenea promenjivog domena teškog iii lakog lanca proteina uključuje amino kiselinsku sekvencu, koja je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% iii više identična sa sekvencom promenjivog domena ovđe opisanog antitela npr., P2DH), hiiP2P'10~I> iii huP2Đl0~2; ili koji se razlikuju u bar 1 ili 5 ostataka, ali manje ođ40,30,20, ili 10 ostataka, od sekvence promenjivog domena ovde opisanog antitela, npr., P2D10, huP2Đ10-l, iii huP2IM0-2.

{00271U jednom izvođenju, jedan ili oba promenjiva domena uključuju amino kiselinske položaje u ' framevvork' region u. koji su ■■različito izveden i i z oba, milijeg antitela (npr., P2D10) i huraanizovanog antitela (npr,, 56~84m i K.I07) ili sekvence germinativne linije. Na primer, promenjivi domeni će uključivati brojne položaje u kojima je amino kiselina identična u oba, i mišjem antitelu i humanom antitelu (ili sekvenci. germinativne linije) jer su ta dva identična u tom. položaju. Od ostalih

'frarnev^ork' položaja gde se mišiji i humani razliku, bar 50,60,70,80, ili 90% položaja promenjivog domena su poželjno identični humanom antitelu (ili sekvenci germinativne Unije) pre nego milije. Nijedan, iii bar jedan, dva, tri ili Četiri od preostalih<4>framevvork<!>položaja mogu biti identični mišijem antitelu pre nego humanom antitelu. Na primer, u HC FRJ, jedan ili dva takva položaja mogu biti misiji; u HC FR2, jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji; u FR3, jedan, dva, tri ili Četiri takva položaja mogu biti mišiji; u LC FIU, jedan, dva, tri ili četiri takva položaja mogu biti mišiji; u LC FR2, jedan ili dva tak va položaja mogu biti mišiji; u LC FR3, jedan ili dva takva položaja mogu biti mišiji.

{Q92${l) jednom izvođenju, sekvenea varjabilnog domena teškog ili lakog lanca proteina obuhvata amino kiselinske sekvence kodirane ovde opisanom sekvencom nukleinske kiseline ili nukleinskom kiselinom koja hibridizuje sa ovde opisanom sekvencom nukleinske kiseline (npr., specifična sekvenea nukleinske kiseline ili sekvenea nukleinske kiseline koja kodira ovde opisanu amino kiselinsku sekvencu) ili njegov kompiement npr, pod uskmma niskog sparivanja, srednjeg sparivanja, visokog sparivanja, iii veoma visokog sparivanja,

\{ W29\ Anti-TWEAK antitela mogu biti đerivaiizovana ili povezana za drugi funkcionalni molekui, npr.. drugi peptiđ, protein ili jeđinjenje. Na primer, antitelo može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili na drugi način) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, između ostalih kao što su druga antitela (npr., biospecifično ili mtvltispeciEčno antitelo), toksini, rađioizotopi, polimeri, citotoksična ili citostatička sredstva,

[0630} U drugom aspektu, opis obezbeđuje kompozicije, npr. farmaceutske kompozicije, koje uključuju tannaceutski prihvatljive nosače i antl-TWEAK aniiteb. npr., ovde opisano anti-TVVEAK. antitelo.

(003.1J U još j ednom izvođenju, anti~TWEAK antitelo (npr., njihova.farmaceutska kompozicija) se daje subjektu kome je potrebna, terapija anti-TWEAK antitela iliČije stanje bi bilo ublaženo sa antltelorn. Na primer, anti-TWEAK. antitelo .može biti davano subjektu koji ima ili je u opasnosti od zapaijenskog poremećaja, imunog poremećaja, autoimunog poremećaja, neumnskog poremećaja, neoplastičnog poremećaja, ili drugog ovde opisanog poremećaja. U jednom izvođenju, ovde opisana anii-TWEAK antitela su korišeeaa za đobijanje lekazatečenje zapaijenskog poremećaja, imunog poiemečaja, autoimunog poremećaja, neuronskog poremećaja, neoplastičnog poremećaja il| drugog ovde opisanog poremećaja.

[0032] U drugom aspektu, opis predstavlja postupak tretiranja subjekta sa poremećajem u vezi sa TVVEAK. Postupak uključuje: davanje subjektu anti-TWEAK. antitela, u količini dovoljnoj da leći (npr., poboljša ili spreči) poremećaj u vezi sa TWBAK, Anti~TWBAK antitela mogu biti davana subjektu, satna ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim postupcima kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, subjekat je sisar, npr. čovek, npr, eovek koji ima poremećaj u vezi sa JWEAK, npr,, ovde opisani poremećaj. Antitelo može biti koriŠćeno da ublaži jedan ili više simptoma takvih poremećaja, Izraz 'tretiranje' odnosi se na davanje terapije u količini, na način i/ili u režimu efikasanom da poboljša ili spreči stanje, simptom ili parametar u vezi sa poremećajem (npr., ovde opisani poremećaj) ili da spreči početak, progresiju ili pogoršanje poremećaja, ili do statističkog značajnog stupnja ili đo stupnja koji se može detefctovati od strane osobe 12. struke. Prema tome, iečenjem se mogu postići terapeutske t/ili profilaktičke koristi. Efikasna količina, način ili režim mogu varirati u zavisnosti ođ subjekta i mogu biti prilagođeni subjektu. U jednom izvođenju, ovde opisano anti-TWEAK antitelo je korišćeno za dobijanje leka m lečenje poremećaja u vezi sa TWEAK.

[0033] U još jednom aspektu, opis predstavlja postupak modelovanja interakcije između TWEAK i proteina receptora TVVE AK. Na primer, anti«TWEAK antitelo može biti korišćeno da smanji ili inhibira vezivanje, između TVVEAK i TWEAK receptora, kao šio je Fnl4. Postupak sadrži dovođenje u kontakt TWEAK Ili kompleksa- koji sadrži TVVEAK sa antitelima. Postupak može biti koriščen na ćelijamain vitronpr., u kulturi, npr.in vitroiliex vivo.Na primer, ćelije koje eksprimiraju TWEAK receptor mogu biti kuitivisanein vitrou medij umu za kul turu i kontaktni stupanj se može postići dodavanjem an.ti-TWEAK. antitela u međijura za kulturu. Alternativno, postupak može biti izveden na ćelijama prisutnim na subjektu, npr., kao đeoin vivo(npr., terapeutskog ili profilaktičkog) protokola. Na primer, anti~TWEAK antitelo može biti davano lokalno ili sistemski. U jednom izvođenju, ovde opisano anti-TWEAK antitelo je korišteno za dobijanje leka za interakciju mođulovanja između TWEAK i proteina receptora TWEAK.

f0034] Postupak može uključivati dovođenje u kontakt- TWEAK sa kompleksom receptora TVVEAK, ili njegove podjeđinice, pod -ustavima koji omogućavaju interakciju između TVVEAK i kompleksa receptora TWEAK, ili njegove podjeđinice, da izazovu, da se. tako obrazuje smeša T vVEAK/TWEAK receptora. Generalno, anti- IVVE AK antitelo je obezbeđeno u efikasnoj količini, npr. tako da se dovodi u kontakt smeša TWEAK7TWEAK receptora sa moduliranim anti-TVVEAK antitelima, npr., utiče na (npr,, inhibira, blokira ili na drugi način ređukuje) interakcije između TWEAK i proteinskog receptora ili bar jedne funkcijeTWEAK, npr., signaliziranje posredovano sa

TVVEAK..

[0035| Opis takođe pređstavlj a nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence, koje kodiraju prornenjive regione teškog i. lakog lanca npr,, ovde opisanih anti-TWEAK. antitela. Na primer, opis predstavlja prvu i drugu mikleinsku kiselinu koja

kodira odgovarajuće promenjive regione teškog i lakog lanca P2D10. U drugom aspektu, opis predstavlja, ćelije domaćina i vektore koji sadrže ovde opisane nukleinske kiseline.

{0036|Opis takođe predstavlja epitop TWEAK, npr., humani TWBAK, koji prepoznaje P2ĐI0 i proteine sposobne da reaguju sa epitopom. Na primer, proteini i peptiđi koji uključuju epitop mogu bitt korisceni da stvore ili za odabir drugih jedinjenja koja se vezuju i koja reaguju sa epitopom, npr. proteini kao što su antitela ili mali molekuli. Na primer, peptidi koji uključuju epitop moga'biti korišćeni kao irnunogen ili meta za odabir ekspresione biblioteke. Takođe je moguće da se proceni sposobnost jedinjenja da reaguje sa peptiđom, ili mapiranjem ili određivanjem strukture, da bi se procenila sposobnost jedinjenja da reaguju sa epitopom, npr, u kontekstu, zrelosti TVVEAK.. Primer proeene uključuje određivanje da Ujedinjenje može da reaguje sa TWEAK u prisustvu kompetitivnog P2D10 antitela.

[0037)Takođe su opisani postupci za davanje ili ciljanje sredstva., npr. terapeutskog (uključujući genetsko sredstvo) ili ci to toksičnog sredstva, sa anti-TWEAK antitelom (npr., P2D10 ili drugo ovde opisano antitelo) u ćeliju koja eksprimira TVVEAK ili strukturum vivo.

[0038]Ovde korišćen izraz * antitelo' odnosi se im protein, koji obuhvata bar jedan promenjivi deo imiraoglohulina, npr., amino kiselinsku sekvencu koja obezbeđuje promenjivi đeo imunoglobuiina ili sekvencu promenjivog domena imunoglobulina, Na primer, antitelo može da uključuje promenjivi region teškog (H) lanca (skraćeno ovde VH), i promenjivi region lakog (L) lanca (skraćeno ovde VL). U drugom primeru, antitelo uključuje promenjive regione dva teška lanca (H)1promenjive regione dva laka (L) lanca, izraz "antitelo" obuhvata fragmente antitela koji se vezuju za antigen (npr., antitela jednog lanca, Pab fragmente, F(ab'jjfragmente, Fđ fragmente, Fv fragmente, i dAb fragmente) kao i antitela pune dužine, npr.. imunoglobuline tipova IgA, IgC) (npr., IgGi, IgG2, lgG3, Ig04), IgE, IgD, igM (kao i njihove podtipove) pune dužine.. Izraz "antitelo pune dužine" odnosi se na antitelo koje ima bar 96% dužine prirodnog, antitela koje je obrađeno da ukloni bilo koju signalnti sekvencu. Antitela pune dužine mogu uključivati prirodno antitelo pune dužine, npr., ostatke od amino terminalnog ostatka prirodnog antitela (npr, a IgGi, IgG2, IgCB, IgG4) do njegovog karboksi-terminainog ostatka.

{0039f"Sekvenea promenjivog domena imunoglobuiina" odnosi se na amino kiselinsku sekvencu koja može obrazovati strukturu promenjivog domena imunoglobulina. Na primer, sekvenea može uključivati sve ili đeo amino kiselinske sekvence promenjivog domena koji se javlja u prirodi. Na primer, sekvenea može ili ne mora uključivati jedan, dva ili više N- ili C-terminakih amino kisleina, ili može uključivati druge promene koje su kompatibilne sa obrazovanjem proteinske strukture.

jl0040|"izolovana kompozicija" odnosi se na kompoziciju koja je uklonjena od bar 90% bar jedne komponente prirodnog uzorka iz kojeg izolovana kompozicija može biti dobijena. Veslački proizvedene kompozicije ili prirodne mogu biti. "kompozicije bar" ižvesnog stepena čistoće ukoliko vrste ili populacija, vrste od interesa je bar 5, 10, 25, 50, 75, 80,90, 95,98., ili 99% čista u odnosu na težinu.

{0041 j"Epitop"se odnosi na mesto na ciljnom jeđinjenju koje se veže za antitelo. U slučaju gđe je ciljno jedinjenje protein, na primer, epitop se može odnositi na amino kiseline (naročito na amino kiselinske bočne lance) koje su vezane od strane antitela. Preklapajući epitopi uključuju bar jeđnan običan ostatak amino kiseline, npr„ bar 2,3,4 ili 5 običnih ostataka amino kiselina.

[0042]Ovde fcoriščen izraz 'liibridiziraju pri uslovima niskog sparivanja, srednjeg sparivanja, visokog sparivanja, ili vrlo visokog sparivanja" opisuju uslove za hibriđizaciju. i ispiranje. Uputstvo za izvođenje reakcija hibridizacije mogu biti nađeni kodCurrmi Prgtocols- in Mokctđar Bmiogy, JohnWUey & Sons, N,Y. (1989), 6.3.1-6.3,6. U toj referenci opisat« su vodeni i. nevodeni postupci ijeđani i drugi mogu biti korižćeni. Specifični uslovi hibridizacije na koje se ovde poziva su su sieđeći: i) uslovi hibridizacije za nisko sparivanje u 6X natrijum moriđtk'natrijmTi ciiratu (SSC) na oko 45°C, praćeno sa d va ispiranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na bar S0<*>C (temperatura ispiranja može biti povećana na 55*C za uslove niskog sparivanja); 2) hibridizacioni uslovi za srednje sparivanje u 6X SSC na oko 45°C, praćeno sa jednim ili vise ispiranja u 0,2X SSC,0A%SDS na 60°C; 3).hibridizaeioni uslovi za visoko sparivanje u 6X SSC na oko 45°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 0.2X SSC, 0.1 % SDS na 65°C; i poželjno 4) hibridizaeioni uslovi za veoma visoko sparivanje su 0.5M natrijuro fosfat, 7% SDS na 65°C, praeano sa jednim i li više ispiranja na Q.2X SSC, 1% SDS na 6S°C, Uslovi. visokog sparivanja (3) su poželjni uslovi koji treba đa su korišceni ukoliko drugačije nije navedeno.

10043] "Poremećaj u vezi sa TWEAR" je bilo koji poremećaj u kome TWEAK doprjnosi etlologiji ili poremećaju čiji uslovi, simptomi, ili rizik početka su menjani određivanjem sredstva koje blokira TWEAK"

{0044|Ukoliko nije drugačije đefinisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde koriščeni imaj u i sto značenje koje je uobičajeno za prosečnog stmčnjaka iz oblasti tehnike u koju ovaj pronalazak, spada. Mada su postupci i matarijaH slični ili ekvivalentni onima ovde opisanim mogu biti kori sceni u praksi ili ovde opisanom testiranju, dole su opisani pogodni postupci i materijali. Pored toga, izvođenja pronalaska opisanih u odnosu na Chothia CDRs mogu takođe biti implementirani korišcenjern Kabat CDRs.

{0045]Sve ovde pomenute objave, patentne prijave, patenti i druge reference uključene su ovde kao referenca u svojoj eeioviiosti. U slučaju sukoba interesa, prikazani opis, uključujući definicije će biti odlučujući. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nemaju nameru da budu ograničavajući.

DETALJNI OPIS

{0046]P2D10 je primer mišijeg antitela koje se specifično veže za humani TVVEAK i inhibira TWEAK funkciju. Varijante P2Đ10 antitela su takođe opisane, uključujući primeve humaniziranih varijanti. Ova antitela, drugačija od anti~T\VEAK antitela, i drugačija od sredstava koji blokiraju TVVEAK mogu biti korišćena u lefienju ili prevenciji poremećaja u kojima posreduje TVVEAK, npr., zapaijenski poremećaji, i dragi ovde opisani poremećaji.

10047] Anti- TWBAK antitela

(6048)Ovaj opis uključuje sekvence specifičnih primera anti-TWEAK antitela, kao što su P2D! 0, huP2D10-l, i huP2Đ10~2, Određena aniiteia, kao Sto su ova, mogu biti

■napravljena, na primer pripremanjem i eksprimiranjera sintetičkih gena koji kodiraju navedene amino kiselinske sekvence ili muiiranjem humanih gena germinati vne linije da bi se dobio gen koji kodira navedene amino kiselinske sekvence. Povrh toga, ova antitela i draga anti-TW.EAK antitela mogu biti proizvedena, npr., korišćenjem jednog ili više sledećih postupaka.

[00491Dostupni su brojni postupci za dobij anj e antitela, naročito humanih antitela. Jedan primer postupka uključuje odabiranje proteinske ekspresione biblioteke, npr. ispoljenih biblioteka faga ili ribozoma. Ispoljeoi fag je opisan, na primer, U.S. 5,223,409; Smith (1985)Science 228:1335-1317; WO 92/18619; WO91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; i W0 90/02809. Npr., u U.S. Pat. Nos. 5,658,727; 5,667,988; i 5,885,793 opisan je ispoljeni Fab\s na fagu.

[OOSOjPored upotrebe ispoljenih biblioteka, mogu biti korišćeni drugi postupci za dobijanje antitela koje vezuje TVVEAK. Na primer, TVVEAK. protein ili njegov pepttđ mogu biti korišeni kao antigen u nehumanoj životinji, npr., a glodani, npr., mišu, hrčku, ili pacovu..

[OOSt jU jednom izvođenju, nehumana životinja obuhvata bar deo humanih imunogiobuliitskih gena. Na primer, moguće, je isplanirati vrstu miša koja je deficijentna u proizvodnji mišljih antiela sa velikim fragmentima humanogIglokusa. Koristeći tehnologiju hibriđonia, mogu biti proizvedena i odabrana antigen-specifična monoklonalna antitela koja potiču od gena sa željenom speeiličnošco, Videti, npr., XENOMOUSi:i™, Green et ai (1994)Netun Genetics7:13-21, U.S. 2003-0070185, WO 96/34096, i VVO 96/33735.

[0052]U drugom izvođenju, monoklonal.no antitelo je dobij eno iz životinje koja nije eovek, i zatim mođifikovana, npr., humanizovana ili deimunizirana, VVinter opisuje primer postupka CDR-grailovanja koji može biti koriŠćen za pripremanje ovde opisanih huroamzovaniihaniiteia (U.S. 5,225,539). Svi iii neki od CDRs određenog humanog anitela mogu biti zamenjena sa bar delom nehumanog antitela. Može samo biti neophodno zameniti potrebne CDRs za vezivanje ili vezujuće determinante takvih CDRs da bi se došlo do korisnih humanizovanih antitela koja se vezuju za TWEAK.

(0053)Humanizovana antitela mogu biti stvorena zamenom sekvenci. Fv promenjivog regiona koji nisu direktno uključeni u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv promenjivih regiona, OpM postupci za stvaranje humanizovanih antitela su đobijeni ođ, S, L. (1985)Science229:1202-1207, ođOi et ai.

(1986) SioTechmgms4:214, i od US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,2(15; i US 6,407,213. Ovi postupci uključuju izolovanje, manipulisanjei eksprimovanje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo Fv promenji vih regiona imunoglobulina. bar jednog teškog ili lakog lanca. Izvori takvih nukleinskih kiselina su dobro poznati osobama iz struke i na primer, mogu biti. đobi jeni iz hibriđoma koji proizvodi antitelo proti v prethodno određenog cilja, kao sto je gore opisano, od imunoglobulinskih gena germinativne linije, ili iz sintetskih konstrukta. Rekombinant.no DNK kodiranje htunanizovanog antitela može zatim biti klonirano u odgovarajući eksperes i oni vektor.

(6054) Humane sekvence germinativne linije, na primer, su opisane u TomKnson, l.A. et al.. (1992)J. Mol Biol.227;?76~?98; Cook, G, F. et al. (1995)immunol. Today16: 237-242;Chothia, D. et ai. (.1992) J, Mol Bio.227:799-817; i Tomlinson et al. (1995)EMBOJ14:4628-4638. V BASE direktorij um ohezbeđrij e potpuni đirektorijum sekvenci promenjivog regiona humanog imunoglobulina (sastavljen od Tomlinson, l.A.et al.MRC Centre for Protein Engineermg, Cambridge, UK). Ove sekvence mogu biti korišćene kao izvor humanih sekvenci, npr. za <iramework" regione i C DRs. Kansezusni humani '.framewo.rk' regioni mogu takođe biti korišćeni, npr,, kao što je opisano u U.S. Pat. No. 6,300,064.

[0055] Nehumano antitelo koje veže TWEAK-može takođe biti mođifikovano specifičnim brisanjem humanih cpitopa T-čelija ili ^deimunizacijom" sa postupcima opisanim u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, promenjivi regioni teškog i lakog lanca antitela mogu biti analizirani na peptide koji se vezuju za MHC. Klasa li; ovi peptidi predstavljaj« potencijalne epitope T-ćelija (kao što je đeimisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T-ćelija, može biti korišeen prilaz kompjuterskog mođeJovanja pod nazivom "peptidno namotavanje" ('peptide threading'}, i dodatno može biti pretraživana baza podataka humanih proteina koji se vežu za MHC klase 11, na motive prisutne u sekveneama Yh i Vi, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih■alotipova MHC klase 1.1 DR, i prema tome grade potencijalne epitope T ćelija. Epitopi potencijalnih T-ćelija mogu biti eliminisani zamenom malog broja amino kiselinskih ostataka u promettji vim regionima, ili poželjno, jednostavnim amino kiseiinsklm supstitucijama, Koliko god je moguće, učinjene su konzervativne supstitucije, često, ali ne isključivo, može biti korišćena uobičajena amino kiselina u položaja sekvence antitela humane genninativene linije. Pošto su deimimizlrajuće promene iđentiftkovane. nukelinska kiselina koja kodira Vhi Vi., može biti konstruisana mutagenezom ili drugim sintetičkim postupcima (npr., de novo sintezom, kasetnom zamenom, i tako dalje). Mutageoezirane promenjive sekvence mogu, opeiono biti spojene za humani konstantni region, npr. humani IgGi ili kapa konstantne regione.

{00561 ^ nekim slučajevima, potencijalni epitop T-ćelija će uključivati ostatke koji su poznati ili predviđeni kao važni za funkciju antitela. Na primer, potencijalni epitopi T ćelija su uglavnom naklonjeni CDRs. Pored toga, potencijalni epitopi T ćelija se- mogu javiti u Tramesvork' ostatcima važnim za strukturu antitela i vezivanje, Promene eiiminisanja ovih potencijalnih epitopa će u nekim slučajevima zahtevati veći nadzor, npr., pripremanjem i testiranjem lanaca sa i bez izmerie. Gdc je moguće, potencijalni epitopi T ćelija koji se preklapaju CDRs mogu biti eliminisani supstitucijom van CDRs, U nekim slučajevima, alternacija između CDR je jedina opcija i prema tome varijante saibez ove susptitucije mogu biti testirane, U'drugim slučajevima, supstitucija neophfKina da ukloni potencijalne epitope T ćelija je položaju ostatka u okviru 'iramevvork' koji može biti kritičan za vezivanje antitela. U ovim slučajevima, testirane su. varijante sa i bez supstitucije. Prema tome, u nekim slučajevima napravljeno je nekoliko varijanti đeimunizlranih promenjivih regiona teških i lakih lanaca i testirane su različite kombinacije teškog/lakog lanca da se identitikuju optimaiana deimunizirana antitela.

Izbor krajnjeg đeiniuniziranog antitela može biti napravljen uzimanjem u obzir afiniteta vezivanja različitih varijanti u konjukciji sa obimom đeimunizacije, naročito, broja potencijalnih epitopa T ćelija koji ostaje u promenjivom regionu. Deimunizacija može biti korišćena da mođiiikuje bilo koje antitelo, npr. antitelo koje uključuje nehumanu sekvencu, npr., sintetičko antitelo, misije antitelo drugačije od drugog nehumanog monokionamog antitela ili antitela izoiovanog izispoljene biblioteke.

[0057]Takođe mogu biti korišćeni drugi .postupci za humanizovnje anti tela, Na primer, drugi postupci mogu objašnjavati trodimenzionalnu strukturu antitela, 'framevrark' položaja koji su u trodimenzionalnoj blizini determinanti koje se vezuju i imunogenske peptidne sekvence, Videti, npr., WO90/07861; U.S.Pat, Nos. 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; i 6,407,213; Tempest et ai. (1991)Biatechno! o®>9:266-271. Još jedan postupak nazvan humaniziranje" i opisan je , na primer u U.S. 2005-008625.

[0058]Antitelo može uključivati humani Fc region, npr,, prirodni Fc region ili Fc region koji uključuje jednu, ili više alternacija U jednom izvođenju, konstanti region je menjan, na pr. mutimn, da se modiiikuju osobine antitela (npr,, da se poveća ili smanji jedna ili više od; Fc vezivanja receptora, glikozilacije antitela, broja cisiemskih ostataka, efektom ćeiijskih funkcija ili kompiementnih funkcija). Na primer, humani IgGi konstantni region može biti mutirao na jednom ili više ostataka, npr., jedan ili više ostataka 234 i 237. Antitela mogu imati mutacije u C112 regionu teškog lanca koji smanjuje ili menja funkciju efektora, npr., Fc receptorsko vezivanje i komplementarnu aktivaciju. Na primer, antitela mogu imati mutacije kao što su one opisane u U.S. Patent Nos. 5,624,821 i 5,648,260. Antitela mogu takođe imati mutacije koje stabiHzuju đisolfidnu vezu između dva teška lanca imunoglobulina, kao što su mutacije u zavisnom regionu igG4, kao Stoje opisano u stanju tehnike (npr., Angai et ai.(1993) Mol Immunal30:105»08). Videti takođe, npr., U.S, 2005-0037000.

(0059] Sazrevanje afiniteta.U jednom izvođenju, anti-TWEAK antitelo je mođifikovano, npr., mutagenezom, đa bi se obezbedio skup modifikovanih antitela. Mođifikovana antitela su. proeenjivana da iđentifikuju jedno ili vise antitela koja imaju

promenjive firnkcionaiene osobine (npr., poboljšano vezivanje, poboljšanu stabilnost smanjenu antigenost ili povećanu stabilnostin vivo),U jednom ostvarenju, tehnologija ispoljene biblioteke je korišćena za selektovanje ili proveru skupa modifikovamh antitela. Antitela višeg afiniteta su zatim identiflkovanaizdruge biblioteke, npr. korištenjem većeg sparivanja ili kompetitivnijih uslova vezivanja i ispiranja. Takođe- mogu biti korišćene druge tehnike provere.

[0060] U nekim ostvarenjima, mutageneza je ciljana u poznate regione ili. koj i su verovatno na kontaktnoj.površini vezivanja. Ukoliko su, na primer, iđenttfikovani vezujući proteini antitela, onda mutageneza može biti usmerena u CDR regione teških ili lakih lanaca kao sto je ovde opisano. Dalje, mutageneza može biti usmerena na

<*>feamewor<k>' regione u blizini ili suseđne CDRs, npr,, <jrameworkT regioni, naročito između 10, 5, ili 3 amino kiselina CDR. spoja. U slučaju antitela, mutageneza takođe može biti ograničena na jedan ili nekoliko CDRs, npr., da se naprave poboljšanja u stupnjevima,

10061] U jednom izvođenju, mutageneza je korišćena đa se napravi antitelo sličnije jednoj ili više sekvenci germinativne linije. Jedan postupak germinativne linije kao primer može uključivati: identifikovanje jedne ili više sekvenci germinativne linije koje su slične (npr., najsličinje u odgovarajućoj bazi podataka) sekvenci izolovanog antitela. Deset mutacija (na amino kiseiinskom nivou) može biti učinjeno u izolovanom antitelu, ili inkrementno, u kombinaciji, ili oboje. Na primer, napravljena je biblioteka nukleinske kiseline koja uključuju sekvence koje kodiraju neke ili sve moguće mutacije germinativne linije. Mutirana antitela su zatim proc-enjivana, npr., da identifikuju antitelo koje ima jedan ili više dodatnih ostataka germinati vne linije u odnosu na izolova.no antitelo, a koje je još uvek korisno (npr., ima funkcionalnu aktivnost). U jednom izvođenju, u izolovano antitelo je uncto onoliko ostataka germinati vne linije koliko je moguće,

{0©62j U jednom izvođenju, mutageneza je korišćena da se zameni ili uroetne jedan ili više ostataka germinativne lije u CDR regionu. Na primer, CDR ostatak germinativne linije može biti iz sekvence germinativne linije koja je slična (npr. najsličnija)

promenjivom region« koji je mođifikovan. Posle mutageneze, aktivnost (npr. vezivanje ili druga funkeionala aktivnost) antitela može biti procenjivana đa bi se odredilo da li ostatak ili ostatci germinativne linije su tolerisani. Slično mutageneza može biti izvedena u 'framevvork<*>regionima.

[0063]Selektovanje sekvence germinativne linije može biti izvedeno na različite načine. Na primer, sekvenea germinativne linije može biti odabrana ukoliko ispunjava prethodno određene kriterij ume selekti vnosti il i sličnosti, npr. bar izvesan procent identičnosti, npr. bar 75, 80, 85, 90,91, 92,93, 94,95,96, 97, 98,99, ili 99.5% identičnosti, u odnosu na đonora nehumanog arititela. Odabir može bi ti izveden korištenjem bar 2, 3,5, ili 10 sekvenci germinativne linije,Uslučaju CDRl i CDR2, iđentitikovauje slične sekvence germinativne lini je može uključivati selekciju jedne takve sekvence. U slučaju CDR3, iđentifikovanje slične sekvence germinativne linije može uključivati jednu takvu sekvencu, ali može uključivati korištenje dve sekvence germinativne linije koje odvojeno doprinose amino terminalnom defu i karboksi terminalnom delu. U drugim ostvarenjima, više od jedne ili dve sekvence genninativne linije su korišćene, npr. za obrazovanje konsezusne sekvence.

[0064]U drugim izvođenjima, antitelo može biti mođifikovano da ima izmenjem glikozilacioni uzorak (tj. izmenjeni u odnosu na originalni ili prirodni glikozilacioni uzorak). Kao stoje korišeno a ovom kontekstu, "izmenjen" označava đa su jedan ili više ugljovodoničnih rađikala izbrisani, i/ili imaju jedno ili više giikozilacionih mesta đođatih originalnom antitelu. Dodavanje giikozilacionih mesta u sada opisana antitela može biti postignuto menjanjem amino kiselinske sekvence da sadrži sekvencu konsezusnu sa giikoziiaeionim raestom; takve tehnike su dobro poznate u tehnici. Drugi način za povećavanje broja ugljovodoničnih rađikala na antitelu je kemijsko ili enzimsko kuplovanje glikozida za ostatak amino kiseline antitela. Ovi postupci su opisani u, npr., WO 87/05330, i Aplin and Wrision (1981)CRC Crit. i?*v. Biockem. 22:259-306.Uklanjanje bilo kog ugijovođoftičnog rađikala prisutnog u antitelima hemijski ili enzimski kao što je opisano u tehnici (Hakimuđđin et al.( l9$ 7) Arch Btochem. Biophys.259:52: Eđge et al. (1981)Anal Biochem,118:131: and Thotakura et ai, (1987)Meth. Enzymol138:350). Videti, npr., U.S. Pat. Ho. 5,869,046 za modifikaciju koja povećavain vivopolu život obezheđivanjem opravdanog i iskorištenog epitopa za vezivanje receptora,

{0065] U jednom izvođenju, antitelo ima CDR sekvence koje se nesuštinski razlikuju od onih P2Đ10. Nesuštinske razlike uključuju manje amino kiselinske promene, kao što su supstitucije 1 ili 2 od bilo kojih tipičnih 5-7 amino kiselina u sekvenci CDR, npr., Chothia ili Kabat CDR. Tipično amino kiselina je supstituisana srodnim amino kiselinama koje imaju slično naelektrisanje, hiđrofobnost ili stereohemijske karakteristike* Take supstitucije bi bile u okviru umešnosti prosečnog stručnjaka. Drugačije od CDRs, sušUnskijc razlike u strukturi fraroevvork regiona (FRs) mogu biti učinjene bez suprotnog đelovanja na osobine vezivanja antitela. izmene FRs uključuju, ali bez ograničenja, humanižovanje 4immework' koji nije humani ili konstruisanje izvesuih<4>framework<>>ostataka koji su važni za kontakt antigena ili stabilizaciju mesta vezivanja, npr.menjanjem klase ili pođkiase konstatnog regiona, menjanje specifičnih amino kiselinskih ostataka koji mogu menjati funkciju efektora kao vezivanje Fc receptora (Lunđ et al. (1991)</. Jmmim.147:2657-62; Morgan et ai. (1995)Immuwbgy86:319-24), ili menjanje vrsta iz kojih potiče konstanti region.

[0066] Anti-TWEAK antitela mogu biti u obliku antitela pune dužine, ili u obliku fragmenata antitela, na pr., Fab, F(alr h, Fđ, dAb, i scFv fragmenti. Dodatni oblici uključuju protein koji uključuje pojedinačni promenjivi đomen, na pr., kamilin ili kamelizovani đomen. Videti na pr,, U.S. 2005-00795741 Davies et al. (1996)Protein

Eng. 9(6}:531-7.

{0067} Proizvodnja antitela. Neka antitela, na pr., Fab's, mogu biti proizvedeni u bakterijskim ćelijama, na pr., ćelijama£ coliAntitela mogu takođe biti proizvedena u eukariotskim ćelijama. U jednom izvođenju, antitela (na pr., scFv !s) su eksprimovani u ćelijama kvasca kao sto jePichia (videti,npr,., Poveers et al,,(2001) J Immunol Methođs.

251:123-35), HcmseuHa,ili<$>accharamycćs.

|O068j U jednom izvođenju, antitela su prolzvođena u ćelijama sisata. Primer ćelije domaćina sisani za eksprimiranje antitela obuhvata ćelije jajnika kineskog brčka (Chinese Hamster Ovary (CHO ćelije) (uključujućidhfrCHO ćelije, opisane u Uriaub and Chasin

(1980) Proa Nad Acad Sci USA77:4216-4220, korištene sa DHFR selektivnim markerom, na pr. kao Šio je opisano uKaufman and Sharp (1982)Mol Bio!,159:601-621), Ćelijske linije Imfocita, na pr., ćelije NSO mieloma i ŠP2 ćelije, COS ćelije, i ćelije transgenskih životinja, na pr, transgenskog sisara. Na primer, ćelija je epitelna ćelija mlečne žkzđe.

[6069] Pored toga sekvenea nuklenske kiseline kodira raznoliki imunoglohuSinski đomen, rekombinantni ekspresioni vektori mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regiusu replikaeiju vektora u ćelijama domaćina (na pr., porekla replikacije) i selektivne marker gene. Selektivni marker gen olakšava odabir ćelija domaćina u koje će vektor biti unei (vieti na pr„ U.S. Pat. Nos. 4,399,216,4,634,665 i 5,179,017). Na primer, tipično selektivni marker gen daje otpornost na Jekove, kao što je G418, higromicin, ili metotreksat, na ćeliji domaćinu u koj« je bio unet vektor.

[0070] U jednom primeru sistema za ekspresiju antitela, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira oba lanca antitela i teški i laki je unet udhfr "CHO ćelije transfekcijom u kojoj je posredovao kalcij um fosfat. Između rekombinantnog ekspresionog vektora, geni lakog i teškog lanca aniteia su svaki operativno vezani za pojaeivaeke/promoterne regulatorne elemente (na pr., koji potiču od SV40, CMV, ađenovirusa i slično, kao što su CMV pojačivač/AđMLP promoter regulatomog elementa ili SV40 pojačivač/AđMLP promoter regulatornog elementa), a da dovede do visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR. gene, koji omogućavaju selekciju CHO ćelija koje su bile transfektvane sa vektorom korištenjem metotreksat seiekcije/ainpiiftkacije. Selektovane irasfbrmisane ćelije domaćina su kultivisane da se omogući ekspresija teškog i lakog lanca antitela i antitelo je regenerisano iz međijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije su koriščenezadobijanje rekorabinantnth ekpresionih vektora, iransfektovanih ćelija domaćina, odabranih trjmsfomianata, kuliivisanje ćelija domaćina i regeneraeijn antitela iz međijuma kulture. Na primer, neka antitela mogu bi ti izolovana afinitetnom hromatografijom na matriksu sa kuplovanim proteinom A ili proteinom G, [0071)Za antitela koja uključuju Fc đomen, sistem za proizvodnju antitela poželjno sinteiizuje antitela u kojima je Fc region glikozilovan. Na primer, Fc domen IgG molekula je glikozilovan na asparaginu 297 u CH2 domenu, Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju sa oligosahariđima hiantenaraog tipa. Dokazano je da je glikozilacija potrebna za efektorske funkcije u kojima posreduje Fc<y>recepior i komplernent Clq (Button andWoof(t992) Adv, fmtnuml,51:1-84; Jefferis et: al. (1998)hnmtmoi Rev,163:59-76). U jednom izvođenju, Fc đomen je proizveden u ekspresionom sistemu sisara koji se odgovarajuće giikoziluje ostatak koji odgovara asparaginu 297. Fc domen ili ostali regioni antitela mogu takođe uključivati ostale eukarioteke post-translaeione modifikacije.

|0072j Antitela mogu takođe biti proizvedena ođ strane transgenskih životinja. Na primer, U.S. Pat, No. 5,849,992 opisuje postupak ekspresije antitela u mlečnim žlezdama transgenskih. životinja.<T>rans<g>en. je konstraisan da uključuje promoter za mleko i nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ođ interesa i signalnu sekvencu za sekreeiju. Mleko proizvedeno ođ strane ženki takvih transgenskih sisara uključuje, u njima tučena, antitela od interesa. Antitelo može biti prečišćeno iz mleka, ili za neke primene. koriscen.o direktno.

[0073] Karaklerizacija

{0074J Osobine vezivanja antitela mogu biti mecene bilo kojim standardnim posiupkom, na pr. jednim od sledećih postupaka: BIACORE™ analizom, ELlSA-testom (Enzvme Linkeđ Imimmosorbeni Assay-ELISA), transferom fluorescentne rezonantne energije (Fluorescen.ee .Resonance Energv Transfer - FRET), kristalograiljom x-zracirna. analizom sekvence i skaniranjem mutagenaze. Sposobnost proteina da inhibira jedno ili dva đejstva TVVEAK može biti proeenjenain vitroili na životinjskom modelu poremećaja na pr. ovde opisanog poremećaja, Poželjno, antitela imaju statistički značajan efekat koji ukazuje da antitelo inhibira jedno ili više đejstava. TWBAK,

[0075] 0 jednom izvođenju, antitelo je procenjeno u odnosu na inhibieiju sposobnosti IVVEAK da stimuliše proizvodnjuRA,MMP-1, PGF2, II..-6, IP-10 i RANTES u dennatoim JSbroblastuna. Videti Chicbeportiche et al, (2002)ArthrUk- Res,4(2): 126-133 za pogodne uslove testiranja,

10076] U drugom izvođenju, antitelo je proeenjeno u odnosu na njegovu sposobnost da inhibira TWEAK stimulacijom proliferacije enđotelijalnih ćelija, Videti na pr., U.S. 2003-0211 ()(>3 koji opisuje test proliferacije (kao i drugi korisni testovi) kao što sledi: HVEC su zasejani na niifcrotitarske ploče sa 96-bunarčiča pri subkoniluenci (4000 ćelija po bunareiću) i kultivisani su u toku noći u CS-C Medijumu bez dodavanja dodataka za rast od. strane snabđevača. Međijum je zamenjen sa kompletnim medijumom i li bazalnim medijumom. Ćelije su kultivisane u bazalnom medijumu sa ili bez TVVEAK (100 ng/mi), bFGF 'korištenjem 1/500 do 1 /l000. razblaženja bFGF dodatka za rast. (Cionetics) ili 1 ng/ml (R&D Systems), VEGF (10 ng/ml?ili kombinacije ovih faktora. Gđe je naglašeno, testirano je 10 pg/rnl antitela ili je takođe đođavano kontrolno antitelo. Ćelije su inkubirane na 37°G sa 5% COjza tri dana i proliferaeija je merena pulsno sa<3>H-timidinom u toku bar 10 sati kultivisarrja. Radioaktivnost vezana za ćeliju može biti merena sa BETAPLATE™ (EG&G Wallac, Gaithersburg, Md.), Pad u proiiferactji u kojoj je posredovao TWEArC ili kombinacija TWEAK i bFGF može ukazati da je antitelo efikasno u blokiranju TVVEAK aktivnosti.

(0077j Površinska plazmon rezonanaca (Surface Plasmon Resonanee - SPR), interakcije vezivanja proteina, od interesa i supstrata (na pr., TVVEAK.) mogu biti analizirane korišćenem SPR. SPR ili Test biomolekularnih interakcija (Biomoleeular Interaction Analvsis (BIA)) detektuje biospecitične interakcije u stvaranom vremenu, bez obeležavauja bilo kog učesnika u interakciji. Promene u masi na površini vezivanja (indikativne za slučaj vezivanja) kođ BIA Čipa dovode do promena indeksa refrakcije svetla blizu površine (optička pojava površinske plazmon rezonance (SPR)), 'Promene u refraktivnosti stvaraju đetektabilni signal, koji je meren kao indikacija reakcija u stvaranom vremenu između bioloških molekula. Opisani su postupci za koriščenje SPR, na primer, u U.S. Pat. 'No. 5,641,640; Raether (1988)Surface PiasmohsSpringer Verlag; Sjolander and Urbamezky( 199i). Anal Chem.63:2338-2345; Sssafeoet al. (1995)Carr. Opm. Struci Biol5:699-705 i 'on-line' izvori obezbeđeni od BTAcore International AB (Uppsala, Sweden). Informacije iz SPR mogu biti korišćeni đa obezbeđe tačne i

kvantitativne mere ravnotežne konstante disocijaeije (Kd), i kinetičkih parametara, uključujući K0r>i Koif,mvezivanje biomolekuia žacilj.

[0078]Epitopi mogu takođe biti direktno mapirani prpcenjivanjem sposobnosti razUčtitih antitela đa se takmiče jedan sa. drugim za vezivanje za TVVEAK (na pr,, humani TVVEAK, naročito rastvomi humani TVVEAK) koirštenjem BlAcore hroinatografskih tehnika (Pharmacia BIAteclmol<pg>y Hanđbook, "Epitope Mapping", Šection 6.3.2. (May 1994); videti takođe Johne etai.(1993) X ImmuttOl Meifmđs,160:191-198). Dodatno opšte navođenje za procenjivanje antitela, na pr. u testovima Westem blots i imunoprecipitacije, mogu biti nađeniu Antihođks: - A Laboratory MatmaLeđ. by Harlovv and Lane, Colđ Spring Harbor press (1988)).

[0079]Po remećaji u vezi ga TWEAK- om

10080}Anti~TWEAK antitela (kao Sto su ovde opisana aniiela) mogu biti korišćena za lečenje razUčtitih poremećaja, kao što su poremećaji u vezi sa TW EAR-om, Na primer, antitela mog biti korišćena za lečenje inflamatorih, imunih ili autoimunih poremećaja kod pacijenata, kao i neoplastičnih poremećaja. Primeri inflamatornih poremećaja u vezi sa TWEAK.~om uključuju reumatoklni artritis, psorijatički artritis,

ankilozni sponđiiitis, inflamatorau bolest ćreva (uključujući uleerozm kolitis i Crohn-ovu bolest), psorijazu, ili inilamatorni miozitis. Drugi primeri inilamatomih poremećaja koji mogu biti lečeni uključuju histioeitozu Langerhans-ovib ćelija, adultni respirotami distres sindrom /bronhiolitis obliterans, Wegener-ovu granulomatozu, vaskulitis. kateksiju, stornatitis, idiopatsku pulmonarta rilbrozu, dermatomiozitis ili polimioziiis, ne-inlektivni skleritis, hroničnu sarkoiđozu sa plućnim komplikacijama, mieiođispia<s>tični sindromi'refraktorna anemija sa viškom Masla, ulcerozni kolitis, umerene do ozbiljne hronične plućne bolesti i arteritis giganskih ćelija.

(0081]Subjektu koji je u opasnosti, ili sa dijagnozom ili ima jedno od ovih poremećaja mogu biti davana anti- TVVEAK antitela u količini i toku vremena đa se obezbedi eelokupni. terapeutski efekat, Anti-TWEAK antitelo može biti davano samo ih u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, USSN 60/679,518 opisuje postupke za davanje sredstva za bolokiranje TVVEAK u kombinaciji sa sredstvima za blokiranje

TNF-OE. U slučaju komblnovane terapije, količine i vreme davanja .mogu biti takva da obezbede na pr., sinergijski terapeutski efekat. Dalje, davanje sredstava za. blokiranje TVVEAK (sa ili bez drugog sredstva) može biti .korišteno kao primarno, na pr., prva linija lečenja, ili kao sekundarno lečenje, na pr., za subjekte koji ima neodgovarajući odgovor na prethodno davanu terapiju (tj., terapiju koja je drugačija nego ona sa sredstvom za blokiranje TWEAK).

(0082) Reurnatoidni artritis ( RA)

|00S3jAnti-TWEAK antitelo (kao šio je ovde opisano antitelo) može biti korišteno za lečenje reurnatoiđnog artritisa i srodnih pcremeea. Reumatoidni artritis ("RA") je hronična inflamaioraa bolest koja izaziva bol, otok, ukočenost i gubitak funkcije,

primarno u zglobovima, RA često počinje u slnovijalnoj membrani, koja okružuje zglob obrazujući zaštitnu kesu, Kod mnogo pojedinaca koji pate ođ RA, leukociti se infiltriraju iz krvnog sistema u sinovijalnu membranu izazivajući kontinuaina abnormalna zapaljeni a (napr., sinovitis). Zbog toga, sinovijalna membrana postaje upaljena izazivajući toplotu, crvenilo, naticanje i boL Kolagen u hrskavici se postepeno uništava, sužavajući prostor u zglobu i eventualno oštećujući kost, Zapaljenje izaziva erozivno oštećenje kosti u

oštećenoj zoni. U toku ovog postupka, ćelije sinovijalne membrane rastu i dele se abnormalno, Čineći normalno tanku sinovijalnu membranu debelom i dovodeći do zgloba koji natiče i koji je naduven na dodir.

[0084]Kako RA napreduje, abnormalne sinovijalne ćelije mogu napasti i uništiti hrskavicu i kost u zglobu. Okolni mišići, ligamenti, i tetive koje podržavaju i stabilizuju zglob mogu postati slabe i nesposobne đa rade normalno. RA takođe može izazvati opsti gubitak kosti koji može voditi đo osteoporoze, čineći kosti lomijivijim i sklonijim lomljenju. Svi ovi. efekti izazivaju boi, pogoršanja i đefbrmitete u vezi sa RA. Regioni koji mogu biti ugroženi uključuju ručne zglobove, članke, kolena i đelove stopala ispod palca. Cesto, mnogo zglobova može biti uključeno i čak i kičma može biti ugrožena, U oko 25% ljudi sa RA, zapaljenja malih krvnih sudova može izazvati reumatoiđne čvoriće, ili izrasline, ispod kože, koje Često obrazuju blizu zglobova. Kako bolest napreduje, tecnost se takođe može akumulirati, naročito u nožnim člancima. Kod mnogo pacijenata sa RA takođe se razvija anemija, ili pad u normalnom broju crvenih krvnih zrnaca.

{0085]RA obuhvata brojne potlpove bolesti, kao sto je Felty~jev sindrom, seronegativni RA, "klasičan" RA, progresivni i/Bi povratni RA, i RA sa vasknUtisom. Neki eksperti klasifikuju bolest u tip 1 ili tip 2. Tip 1, manje uobičajeni oblik, traje •najviše nekoliko mesec! i ne ostavlja trajne posledice. Tip 2 je hroničnt i traje godinama, a nekad doživotno. RA se može takođe manifesiovati kao potkožni reumatoiđni čvorići, visceralni čvorići, vaskulitis koji izaziva čireve na nozi ili mononemitts tnultipleks, pieuralno ili'pedkarđijaino izlivatrje, limfađenopatija, Felty~ijev sindrom, Sjogren-ov sindrom i episkleritis. Podtipovi ove bolesti l takođe subjekti koji imaju jedan ili više gornjih simptoma mogu biti tretirani korištenjem ovde opisanih antitela,

{0086) RA može biti procenjivan različitim kliničkim merenjima. Neki primeri pokazatelja uključuju ukupan Sharp-ov rezultat (TSS), rezultat Sharp-ove erozije, i HAQ indeks onesposobljenosti. Ovi postupci mogu biti korišćeni za postizanje poboljšanja za bar jedan od ovih pokazatelja. Terapeatske osobine a«ti-TWEAK. antitela. za tretiranje

RA mogu biti proeenjeni na životinjskom modelu, na pr., korištenjem modela izazivanja kod miša artritisa u vezi sa kolagenom (mouse collagen-inđuceđ arthritis (mCIA)) (videti napr.,StuartetaL<ZClin. Invest.69:673-683 (1982).

(0087] Mttltiple skleroza

|0088] Anti-TWEAK antitelo (kao što je ovde opisano -antitelo) može biti korišteno u lečenju muitiple skleroze (MS) i srodnih poremećaja. MS je bolest centralno<g>nervnog sistema koja je karakterisana zapalj enjem i gubitkom mijelinskdg omotača.

|0089] Pacijenti koji imaju MS mogu biti identitlfcovani kriterijuma.ro postavljanja klinički nedvosmislene dijagnoze MS kao što je đeftnisano praktično na dijagnozi MS (Poser et al.,Ann, NeumL(1983) 13:227), Ukratko, pojedinac sa klinički nedvosmislenom MS ima dva napada i klinički dokaz ili dve lezije ili klinički dokaz jedne lezije i parakiinički dokaz drugih odvojenih lezija, Definitivni MS mogu takođe biti đijagnostiftkovani dokazom dva napada i oligoklonalnih traka IgG u cerebrospinalnoj tečnosti ili kombinacijom napada, kliničkih dokaza dve lezije i oligoklonalnih traka IgG u cerebrospinalnoj tečnosti,

|0090]Efikasan tretman multiple skleroze može biti ispitivan na nekoliko drugačijih načina. Sieđeći parametri mogu biti korišćeni za merenje efikasnosti lečenja. Korišćena. su tri različita kriterij uma; EDSS (skala stanja produžene onesposobi jenosti), izgled egzacerebracija ili MRI (snimanje magnetnom rezonancom). EDSS ceni klinička pogoršanja na osnovu MS (Kurtzke( 19Z3)' Neur0logy' 3% A444),Osam funkcionalnih sistema je procenjivano na tip i ozbiljnost neuroloških pogoršanja.. Ukratko, pre lečenja, pacijenti suprocenjivani na pogoršanja u sledećim sistemima: piramidalno, cereberalno, moždani sišem, čulno, creva i beŠika, vizualno, cerebralno, i drugo. Ispitivanja su izvođenja u đefmisaniin in tervalima. Skala je bila u obimu od 0 (normalno) do 10 (smrt usledMS). Pad u'EĐSS ukazuje na eilkasano lečenje(Kurtzke (J 994) Am. MsuroL36:573-79).

[0091]Primer modela na životinji za multiple sklerozu je eksperimentalni model aut imunog eneefalitisa na mišu (EAE), na pr., kao Sto je opisano kod Tuohv et al.( J, ImmunoL(1988) \ 4h 1126-1130), Sobel et al.U ImmunoL(1984) i 32: .2393-2401), i Traugott( CeJI ImmunoL(1989) 1.19: 114-129), Mišu se može davati ovde opisano antitelo pre izazivanja EAE. Miševi su procenjivani za karakteristične kriterij ume da bi se odredila efikasnost antitela.

(0092] Moždani udar

[0093]Anri~TWEAK antitela (kao što su ovde opisana antitela) mogu biti korišćena u iečenju subjekata koji su. imali moždani udar, na pr., tromboembolični ili hemoralgični moždani .udar {na pr., između bar 48,24, 12,8, ili 2 sata), ili đa spreče moždani udar, na pr.fkod subjekta koji je u opasnosti od moždanog .udara. Postupci kao primer su opsani u USSN 60/653,811. Moždani udar je opšti termin za akutno oštećenje mozga koji nastaje kao posieđica bolesti krvnih''sudova. Moždani udar može biti klasitlkovan u bar dve glavne kategorije: hemoralgični moždani udar (prouzrokovan izlivom krvi iz normalnih krvnih sudova) i ishemiski moždani udar (cerebralnalshemija itsleđ nedostatka snabdevenosti krvi). Neka stanja mogu izazvati isheniijski moždani udar uključujući trombozu, emboliju i sistemsku Mpoperfuziju (sarezultujućoro ishemijom i hipoksijom),

[0094]Moždani udar generalno izaziva neuronsku smrt i oštećenja u mozgu usleđ nedostatka kiseonika i sekundarnih poslediea. Deo mozga koji umire kao rezultat nedostatka snabdevenosti krvlju iii drugog oštećenja se naziva infarkt. U nekim slučajevima, ovde opisana lečenja mogu biti korišćena da smanje ili minimiziraju veličinu .infarkta, na pr. smanjivanjem sekundarnih događaja koji izazivaju neuronsku smrt ili oštećenja,

[8095]Ohstrukcija cerehrane arterije koja je poslediea tromba koja je nastao na zidu moždane arterije se generalno naziva cerebralna trom boza, U cerebralnoj emboliji, okulzivni materijal blokira cerebralnu arteriju mzbođno u krvotoku (na pr, ugrušakje nošen kroz cerebralnu arteriju od srca). Teško je razlikovati da li je moždani udar izazvan trombozom ili embolijom, izraz tromboembolija se koristi da pokrije oba ova tipa moždanog udara. Sistemska hipoperfuzija može nastati kao poslediea sniženog krvnog pritiska, smanjenih hematokrita, niskog krvnog pritiska ili nemogućnosti srca đa pumpa krv ađskvantno.

[0096]Dalje, anti-TWEAK antitelo može biti davano kao profilaktička terapija protiv moždanog udara, ili njegove komponenta, na pr,, subjektu koji je imao prolazni ishemijski napad (transient tschemic attack - TLA) ili pokazuje simptome T1A.

|O097J Neuronski poremećaji

[0098}Anti-TVVEAK. antitela (kao Sto su ovde opisana anđela) mogu biti korišćena za lečenje ili'sprečavanje neuronskih poremećaja kao što su neuronske traume i neurođegenerativni poremećaji. Primeri mehaničkih neuronskih trauma uključuju povrede kičmene moždine (spinal cord injury - SCI) i traumatske povrede mozga (traumatic braininjury - TBI), Primeri neurođegenerativnih poremećaja uključuju aminotroiičnu leteralnu sklerozu (am<y>otro<p>hic lateral sclerosis - ALS), progresivnu bulbarnu paralizu (progressive bulbar palsv - PBP), primarnu lateralnu sklerozu (priffiary lateral sclerosis -PLS), progresivnu mišićnu atrofiju (progressive muscular atrophy - PMA), Parkinson-ovu bolest, l luniington-ovu bolest (HĐ),lAlzheimer-ovu bolest. Videti, na pr., USSN 60/653,813. U jednom izvođenju, neuronski poremećaj je primamo karakterisan uništenjem ili smrću nervnih ćelija, na pr. motornih neurona (na pr., ALS),

striami neuroni nazalnih ganglija i/ili kordkalni neuroni (na pr.. Huntingtoo-onova bolest), neuroni crne supstance (subsiantia nigra) (na pr,, Parkinsojvova bolest),

[0099] Kancer

[6100] TWBAK i njegovi receptori mogu biti uključeni u razvoj bar nekih tipova kancera, na pr,, kancer pankreasa. Anti-TWE AK antitela (kao što je antielo ovde opisano) mogu biti korišćeni u ieeenju ili sprečavanju kancera (na pr,, ađenokareinoma) i drugih neoplastičnih bolesti. Videtiha pr, TREATMENT OF CANCER," USSN 60/685,465, pođnetu maja 27, 2005.

{01011 Farmaceutske kompozicije

|0102| Anti-TWEAK. antitelo (kao što je ovde opisano antitelo) može biti fornmiisano kao farmaceutska kompozicija za davanje subjektu, na pr., đa se leci ovde opisani poremećaj. Tipično, farmaceutska kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde korišćen izraz;, "farmaceutski, prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, prevlake, antibakterijska i antigljiviena sredstva, izotonična i apsorpeiona sredstva za odlaganje i slično koja su fizološki kompatibilna. Kompozicija može uključiti farmaceutski prihvatljivu so, na pr, kiselu ađicionu so ili baznu ađicionu so ( videti na pr., Berge, S.M .,et ai (1977) J. Phorm, Sci,66:1-19).

[0103] Farmaceutka fonnulacija je dobro ustanovljena u praksi i dalje opisana u na pr, Oennaro(eđ.), Remmgton: Tka Science cmđ Pracliceo/ Piutnnaey,20* ed., Lippincott, Williams & VVilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et ai.,Pkarmaceuticat Đosage Forms oni Drug Belmry Systems)7<tf>>Eđ., Lippincott WiUiams & Wiikins Publishers (1.999) (ISBN: 0683305727); and Kibbe (ed.),Hamibaok of Pharmoceuticai Bccipimts American Pharm' aceutfcal Association, 3f*ed. (2000) (ISBN: 09.1733096X).

f0104] Farmaceutske kompozicije mogu biti u različitim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečne, polu čvrste i čvrste dozne oblike, kao Sto su tečni rastvori (na pr,, injektibilne i infuzibilne rastvore), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškove, lipozome i supozitorije. Poželjni oblik može zavisiti od namenjenog načina davanja i

terapeutske primene. Tipično kompozicije ovde opisanih sredstava se. u obliku mjektibilnih ili infuzionih rastvora.

{0105] U jednom izvođenju, anti»TWEAK antitelo je formuiisano sa materijalima ekscipijenata, kao stoje natrij um hloriđ, natrij um đtbazni fosfat heptahidarai, natrij um monobazni fosfat i stabilizator. Na primer može biti dobijen u puierisanom rastvoru pri pogodnim koncentracijama i može biti čuvan na 2-8<3C,

[0106] Takve kompozicije mogu biti davane paranteralno (na. pr., intravenskom, subkutanoznom, intraperitonealnorn, ili intramuskukmom injekcijom). Fraze "parenteralno davanje" i "davano parenteral.no" ovde koriščeno označava načine davanja koji su drugačiji od enteralne i lokalne primene, uglavnom injekcijom, i ukljuCuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, iniratekalnu, intrakapsularnu, intraorhitalnu, intrakarđijačnu, intradertnalnu, intraperitonealnu, traheainu, subkulanoznu, subkutikulamu. intraartlkularnu, subkapsularnu, subarahnoiđnu, intraspinalnu, epiđuralnu i intrastemalnu injekciju ili in&ziju.

|0107| Kompozicija može biti fortnulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, iipozom ili druge uređene strukture pogodne za stabilno skladištenje u visokim koncentracijama. Sterilni mjektibi.ini rastvori mogu biti pripremljeni ugradnjom ovde opisanih sredstava u željenu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, ako je potrebno, praćeno sterilizacijom eeđenjem. Generalno, disperzije su pripremljene ugradnjom ovde opisanog sredstva u sterilno sredstvo koje sadrži osnovni disperzioni medij um i potrebne ostale sastojke onih gore nabrojanih. U slučaju sterilnog praška za dobijanje sterilnih mjektibilnih rastvora, poželjni postupci đobijanja su sušenje u vakumu i sušenje smrzavanjem koje daje prašak ovde opisanog sredstva plus bilo koji željeni sastojak iz ranijih rastvora sterilno proceđenih. Pogodna Ouiđnost rastvora može biti održavana, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih sredstava. Produžena apsorpcija mjektihilmh kompozicija može biti dovedena uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želaiin.

[0.108]U izvesnim izvođenjima, anti-TWEAK. antitelo može biti pripremljeno sa nosačem koji će štititi jeđinjenje protiv brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa konlrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i sisteme za mikroinkapsulirano davanje, BiođegrađabiJni, biokompatibilni polimeri mogu biti korišćeni, kao Što je etilen vinil acetat, polianhiđriđi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za dobijanje takvih formulacija su patentirani i. opite poznati. Videti na pr.,Smtaineđ and ControUed Rekoše Drug Delivery SystemsiJ'.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1.978).

[0109]Anti-TWEAKantitelo može biti modifikovano, na pr„ sa đeiom koji poboljšava njegovu stabilizaciju i/ili zadržavanje u krvotoku, napr., u krvi, serumu, ili drugim tkivima, na pr„ bar 1.5,2,5,10, ili 50 puta, Mođifikovana antitla mogu biti procenjena da H dolaze do mesta zapaljenja na pr. zglobova.

{0110] Na primer, anli-TWEAK antitelo može biti u vezi sa (na pr,, konj ugovano za) polimerora, na pr., suštinski ne-antigenskim polimerom, kao Stoje polialkilen oksid ili poiietilen oksid, Pogodni polimeri će suštinski varirati u težini Mogu biti korišćeni polimeri imaju prosečnu molekulsku težine od oko 200 do oko 35,000 đaitona (ili oko 1,000 do oko 15,000, i 2,000 do oko 12,500),

[0111 ]Ha primer, anti-TWEAK antitelo može biti konjugovan sa vodorastvornim polimerom, na pr., hidrofllni polivinil polimer, na pr., poiivinilaikohoi iii poliviriil<pi>roliđon Primeri takvih polimera uključuju poHalkilen oksid homopolimere kao što su polietilen giikol (PEG) ili polipropilen glikole, polioksietilenovane poiiole, njihove kopolimere i njihove blok kopolimere, uz uslov daje rastvotljivost blok kopolimera u vođi održana. Dodatni korisni polimeri uključuju polioksiaikilene kao Što su poiioksietiien, poiioksipropilen i blok kopolimeri rx>iioksietilena i polioksipropilena, polimetakrilaia, karbomera i razgranatih ili nerazgranatih polisahaiida.

[01.12]U nekim primenama, an.ti-TWEAK antitelo može takođe biti kuplovano ili na drugi način povezano sa sredstvom za obeleŽavanje ili drugim sredstvom, na pr., drugim terapeutskim sredstvom kao što je citotoksično ili citostatičko sredstvo, mada, u mnogo izvođenj a, ova. konfiguracija ulje potrebna. Primeri citotoksičnih i hemo terapeutskih

sredstava uključuju takso.!, citohalasin B, gramickiin Đ, vinblastin, doksorahiein. đaunorubiđn, maitaminoiđ (na pr., niaitan.si.noi iii ĐM.1 rnaitansmoiđ, derivat maitansina koji sadrži sulfhidril), mkoksantron, mitranucm, aktinomiein P, Hlehiđrotestosteron, glukokortikoiđi, prokain, taksmt, tetrakain, liđokatn, propranolol, i.puromicih i .njihovi analozi ili homolozi.

(0113]Kada je anti-TWEAK antitelo korišćeno u kombinaciji sa drugim sredstvom (napr, anti-TNF-a antiteiom iii drugim sredstvom), dva sredstva mogu biti fbrmulisana odvojeno ili zajedno. Sredstva mogu biti formulisana ih na drugi način korišćena u sinergijski efiksanim količinama. Takođe je moguđe da se koristi jedno ili oba sredstva u količinama manjim ođ onih što bi bile korišćene u mono-ierapijf Na primer, odgovarajuće farmaceutske kompozicije mogu biti pomešane, na pr. upravo pre davanja i mogu biti davane zajedno ili odvojeno, na primer istovremeno ili odvojeno.

|0tl4] Takođe je moguće korisćenje drugih TWE AK blokirajućih sredstava, na pr,, sredstava opisanih u USSN 60/679,518. Sredstvo može biti bilo koji tip jedinjenja (na primali organski ili neorganski molekul, nukleinska kiselina,.protein ih mimetički peptid) koji može biti davan subjektu. U jednom izvođenju, sredstvo za blokiranje je biološko, na pr. protein ima molekulsku težinu između S-300 kDa. Na primer, IVVEAK blokirajuee sredstvo može inhibirati vezivanje TWEAK za TVVEAK receptor. Primeri TWEAK blokirajućih sredstava, drugačijih od antitela koja se vežu za TWEAK, uključuju antitela koja se vežu za-TWEAK-Ri rastvorite oblike TvVEAK-R (na pr., Fnl 4) koji se takmiče sa ćelijskorn površinom. TWEAK-R za vezivanje za TVVEAK. Druga ovde opisana terapeutska sredstva mogu takođe biti obezbeđena kao farmaceutske kompozicije, na pr. standardnim postupcima ili ovde opisanim postupcima.,

flMJSJ Davanje

|0116]Anti-TWEAK antitelo može biti davano subjektu, na pr., humanom subjektu, različitim postupcima. Za mnoge primene, način davanja je jedan ođ: hifravenskom injekcijom ili infuzijom (IV), subleutanoznom injekcijom (SC), mtraperitonealno (IP), ili intramuscularnom injekcijom. Takođe je moguće korisćenje intra-artikularnog davanja. Takođe mogu biti korišćeni. drugi načini parenterainog davanja. Primeri takvih načina

ukuljueuju: intraarteriainu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakarđijačriu, intrađermatau, Iransirahealnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoiđnu, intraspinalnu, i epidurainu i intrasternalnu injekciju. U nekim slučajevima, davanje može biti direktno na mesto upale, na primer u zglob ili drugo upaljeno mesto.

[0117}Put i/ili način davanja antitela takođe može biti prilagođen individualnom slučaju, na pr., posmatranjem subjekta, na pr., korišćenjcm tomografskog stiimanja, neurološkog testa i standardnih parametara koji su u vezi sa odgovarajućim poremećajem, na pr., kriterijum za procenti reumatoiđnog artritisa.

[0118]Antitelo može biti davano u fiksnoj dozi ili u dozi mg/kg. Doza može takođe biti izabrana da snižava IH izbegava dobijanje antitela protiv anti-TWEAK antitela. Đozni režimi su prilagođeni da obezbeđuju željeni odgovor, na pr. terapeutski odgovor ili kombinovani terapeutski efekat. Generalno, doze anti-TWEAK antitela (i opciono drugog sredstva) mogu biti kori scene u cilju obezbeđivanja subjekta sa sredstvom u biođostispnim količinama. Na primer, mogu biti davane doze u opsegu OJ -100 mg/kg, 0.S-100 mg/kg, I mg/kg --100 mg/kg, 0.5-21) mg/kg, 0.1-10 mg/kg, ili 1-10 mg/kg. Takođe mogu biti korišćene i druge doze.

[0119]Dozni jedinični oblik ili "fiksna doza" koji. se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se lece, svaka jedinica sadrži prethodno određenu--količinu aktivnog jedinjenja izračunatog đa proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa poželjnim farmaceutskim nosačem i opciono zajedno sa drugim sredstvima. Mogu biti davane pojedinačne ili višestruke doze. Alternati vno ili pored toga, antitelo može biti davano kontinualnom infuzijom.

[0120] Doza anti-TWEAK antitela može biti davana, na pr., -u periodičnim intervalima u toku vremenskom periodu (u toku lečenja) dovoljnog đa obuhvati bar 2 doze,'3 doze, 5 doza, 10 doza, ili više, na pr., jednom ili d va puta dnevno, ili oko jednom đo četiri puta nedeij.no,, ili poželjno neđeljno, u dve neđeljne, meseČtio, na pr.. za između oko Ido 12 neđelja, poželjno između 2 đo 8 neđelja, poželjnije između oko 3 do 7 neđelja, i čak poželjnije u toku bar- 4, 5, ili 6 neđelja. Faktori koji mogu uticati na dozu i vreme potrebno da efikasno tretiraju subjekta uključuju, na pr., ozbiljnost bolesti ili poremećaja, formulacije, načina davanja, ranijih tretmana, opšteg zdravlja i/ili godina subjekta i drugih prisutnih bolesti. Povrh svega, lečenje subjekta sa terapeutski efikasnom količinom jedinjenja može uključivati jedno lečenje ili poželjno, može uključivati serije tretmana. Životinjski modeli mogu takođe biti korišćeni da se odrede korisne doze, na pr. inicijalne doze ili režim.

{0121} Ukoliko postoji rizik da se kod subjekta razvije zapaljeitski poremećaj ili đatgi ovde opisan poremećaj, antitelo može biti davano pre potpunog početka poremećaja na pr., kao preventivne mere. Trajanje takvih preventivnih tretmana može biti jedinična doza antitela ili lečenje se može nastaviti (na pr„ višestrukim doziranjem). Na primer, subjekat koji je u opasnosti od poremećaja ili koji ima predispoziciju za poremećaj može biti tretirana sa antiteiom u toku dana, neđelja, mescci ili čak godina tako đa spreči da se poremećaj javi ili pojavi u velikom intenzitetu.

{0122] Farmaceutska kompozicija može uključivati "terapeutski efikasnu količinu'" ovde opisanog sredstva. Takva efikasna količina može biti određena na. osnovu, efekta datog sredstva ili kombinovanog efekta sredstva ukoliko je korišćeno više od jednog sredstva, Terapeutski efikasna količina može takođe variarati prema faktorima kao što su bolesno stanje, godine, pol i težina pojedinaca i sposobnosti jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinaca, m pr. ublažavanjem bar-jednog parametra poremećaja ili ublažavanjem bar jednog simptoma bolesti. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični iii štetni efekti kompozicije su bili važniji od terapeutski korisnih efekata.

{0123] Uređaji i kitovi za terapi ju

10.1.24] Farmaceutske kompozicije koje uključuju anti»TWBAK. antitelo mogu biti davane sa medicinskim uređajem. Uređaj može imati karakteristike kao šio su prenosi vost, skladištenje na sobnoj temperaturu i lakoća upotrebe tako da mogu biti korišćeni u hitnim situacijama, na pr. od strane neobučenog subjekta ili osoblja hitne pomoći na terenu, van medicinskih ustanova i druge medicinske opreme. Uređaj može uključivati, na pr. jedno ili više spremišta za čuvanje farmaceutskih preparata .koji

uključuju anti-TWBAK antitela, i mogu biti koniigurisane đa se daju jedna ili više đoznih jedinica antitela, Uređaj može biti dalje konfigurisan za davanje drugog sredstva, na pr, anii-TNF-a antitela, ili kao pojedinačna farmaceutska kompozicija koja takođe uključuje anti-TWEAK antitelo ili dve odvojene farmaceutske kompozicije.

{0125]Na primer, farmaceutska kompozicija može se davati uređajem za hipođemiičku inekciju bez igle, kao što su uređaji opisani u US 5,399,163 ; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula uključuju: US 4,487,603, koji opisuje implantibilne mikro-infuzione pumpe za davanje leka kontrolisanom brzinom; US 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za davanje Jekova preko kože; US 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu za lek za davanje lekova preciznom mfuzionom brzinom; US 4,447,224, koji opisuje različite protoke implantiranog infuzionog preparata za kontinualno davanje leka; US 4,439,196. koji opisuje osmotski sistem za davanje leka koji imaodeijke sa više komora; i US 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem za davanje leka. Takođe je poznato mnogo drugih uređaja, Implantata, sistema za davanje i modula .

|0126J Anti~TWH AK antitelo©može biti u obliku kita. U jednom izvođenju, kit obuhvata (a) sud koji sadrži kompoziciju koja uključuje anti-<T>VvEAK antitelo, i opciono (b) inlbrmacioni materijal. Infbrmacioni materijal može biti opis, uputstvo, propagandni ili drugačiji materijal koji se odnosi na ovđe opisane postupke i/iil upotrebu sredstava u terapeutske svrhe.

{0127}U jednom izvođenju, kit takođe uključuje drugo sredstvo za tretiranje bolesti zapaljenja, na pr. anti- TNF-a antitelo. Na primer, kit uključuje prvi sud koji sadrži kompozicije koje uključuju antš-TVVEAK antitelo, i drugi sud koji uključuje drugo sredstvo.

(0128}Infbrmacioni materijal kitova nije ograničen njegovim oblikom. U jednom izvođenju, mformacioni materijal može uključivati informaciju oko proizvodnje jedinjenja, molekulske težine jedinjenja, koncentracije, datuma trajanja, serije proizvodnje ili informacije o mestu proizvodnje itd. U jednom izvođenju, informacioni materijal odnosi se na postupke davanja anti-TWEAK antitela, na pr,, pogodne doze.

doznšm oblicima, ili načinima davanja (na pr., doza, dozni oblik ili način ovde opisan davanja), za lečenje subjekta koji je imao ili koji je u opasnosti od zapaljenskog poremećaja ili drugih ovde opisanih poremećaja. Informacija može biti obezbeđena u različitim oblicima, uključujući štampani tekst, materijal koji se može čitati na kompijutertL video zapis ili audio zapis ili informacija koja obezheđuje vezu ili adresu za osnovni materijal, na pr. naInternetu.

10129]Pored antitela, kompozicija u kitu može uključivati druge sastojke, kao sto su rastvarač ili pufer, stabilizator ili sredstvo za održavanje. Antitelo može biti ohezbeđeno u obliku, na pr, tečnosti, osušenom ili liofilkovanom obliku, poželjno suštinski Čistom,

i/ili sterilnom. Kada su sredstva obezbeđena u tečnom rastvoru, tečni rastvor poželjno je vodeni rastvor. Kada su sredstva obezbeđena u suvoro obliku, generalno rekonstrukcija je dodavanjem pogodnog rastvarača. Rastvarač, na pr. sterilna voda Hi pufer, može opciono biti obezbeđen u kitu.

|0I30| Kit može uključivati jedan ili više posuda koji sadrže sredstvo. U nekim izvođenjima, kit sadrži odvojene sudove, pregrade ili odeljke za kompozicije i informacioni materijal. Na primer, kompozicija može biti u boci, fioii ili špricu i informacioni materijal može biti u plastičnoj navlaci ili paketu. U đrugm izvođenjima, odvojeni elementi kita su u jednom neizđeijenom sudu. Na primer, kompozicija se nalazi u boci, floli. ili špricu za koji je prikačen informacioni materijal u obliku nalepnice. U nekim izvođenjima, kit uključuje više (na pr., paket) individualnih sudova, od kojih svaki sadrži jedan ili više doznih oblika (na pr., ovde opisanih đoznih oblika) sredstava, Sud može uključivati kombinovanu doznu jedinicu, rta pr. jedinicu koja sadrži i anti-TWEAK antitelo i drugo sredstvo, na pr. u željenom odnosu. Na primer, kit uključuje mnogo špriceva, ampula, paketa u foliji, blister paketa ili medicinskih uređaja na pr., svaki sadrži jednu kombinaciju jedinične doze. Sudovi u kitovima mogu biti nepropusni za vazđuh, vođootpomi (na pr. nepropusne za promenu u vlazi ili isparavanje), i/ili zaštićeni ođ sveti a.

(»1311Kit opciono «k!jučuje uređaj pogodan za davanje kompozicije, na pr., špric iii drugi pogodni uređaj. Uređaj može biti prethodno napunjen sa jednim iii dva sredstva ili može biti prazan, ali pogodan za punjenje.

{0132}Ciljanje TW EAK- ekspresionih ćelija

[0133]Ovde opisana anti~TWEAK. antitela mogu biti. korišćena đa ciljano đeluju na ćelije koje eksprimiraju TVVEAK ili druga tkiva iii strukturu koji su u vezi sa TWEAK. Na primer, antitela mogu biti vezana za virus iii čestice slične virusu koje mogu dostavljati egzogene gene (na pr., za gensku terapiju) iii za lipozom, na pr. lipozom koji. inkapsulira terapeutska sredstva ili egzogene gene. Primer postupka korišcenja antitela za ciljni virus opisan je uR.oux et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:9079-9083, See also, e.g.,Cutr Gene Ther,(2005) 5:63-70 andHum Gene Ther.(2004) 15:1034-1044.

[61.34]Anti«TWBAKAbs prema ovom pronalasku, mogu takođe biti vezana za lipozome koji sadrže ierapeu tsko sredstvo kao stoje hemoterapeutsko sredstvo. Vezivanje anitela za lipozome može biti postignuto bilo kojim poznatim sredstvom za umrežavanje kao su heterobifuakcionalna sredstva za urmežavanje koja su široko korišćena za kuplovanje toksina ili hemoterapeutskih sredstva za antitela za ciljano davanje. Na primer, konjugaeijazalipozome može biti postignuta korišćenjem karbohiđrat usmerenog umreženog reagensa za umrežavanje hiđraziđa 4-(4« maleimidofenil) buteme kiseline (MPBH) (Duzgunes et al. (1992),/.Cell. Biockem.Abst Suppl. 16.E 77). Antitela koja sadrže lipozome mogu takođe biti pripremljena dobro poznatim postupcima (videti na pr. DE 3,218,121; Epstein et al. (1985)Prpe. Natl Acad. Sci, USA,82:3688-92 ; Hvvang et al. (1980)Proc. Natl Acad. Sci. USA,77:4030-34: U.S. 4,485,045 and 4,544,545),

[0135]Dij agnostičke upotrebe

[0136]Anii-TWEAK antitela mogu biti korišćena u dijagnostičke svrhe za đctektovanje prisustva TAVEAK,in vitro(na pr,, biološki uzorak, kao sto je tkivo, biopsija) iliin vivo(na pr.,in vivosnimanje subjekta). Na primer, humana ili efikasna "humana anti-TVVEAK antitela mogu biti davana subjektu da đetekfuju IVVEAK unutar subjekta. Na primer, antitelo može biti obeleženo, na pr., sa MRI đetektabilnim oznakama iii radioaktivnim oznakama. Ovaj subjekat može biti procenjivan korišćenjem sredstava za đetektovanje đetektabilnih oznaka. Na primer, subjekt može biti procenjivan korišćenjem đetektabilnih oznaka. Na primer. subjekat može biti skeniran da bi se skemrao položaj antitela u subjektu. Na primer, subjekat je sniman, na pr., sa NMR ili drugim tomograiskim sredstvima,

{0137) Primeri označivaća korisnih za dijagnostičko slikanje ■uključujući radioaktivne obeleživače kao što suml!UIn,ml,**"5Tc5 32P, 33P,i2%%i4C,i<!aa>Rh, fluorescentne označivači kao što su fluorescin i rođamin, označivače aktivni na nuklearnu magnetnu rezonancu, izotope koji emituju pozifrone koji se mogu detektovafi skenerom pozitronske emisione tomografije ("PET") scanner, hemiluminiscentna sredstva kao što je iuciferin, i enzimske markere kao što su peroksidaze ili fosfaiaze. Mogu takođe biti korišćeni radioaktivni emiteri kratkog dometa, kao Što su izotopi đetektabilni sa detektorima kratkog dometa. Proteinski iiand može biti obeležen sa takvim reagensima korišćenjem poznatih tehnika. Na primer, videti Wensel I Meares (1983)Rađioimmunoimaging and Radioimtmmotherapv,Elsevier, New York za tehnike koje su u vezi sa riulioobeležavanjem antitela iet al ( l 986) Meth, Enzymol121; 802-816.

101383 Subjekt može biti "sniman"in vivokorišćenjem poznatih tehnika kao što su rađionukiearno skeniranje korijenjem na pr., gama kamera ili emisione tomografije. Videti na pr., A.R. Brađwellet alf"Deveiopments in AntihođyImaging'V Momdoml Antibođmfar Caneer Detection andTherapv,R.W. Balđvvin et ai., (eds.), pp 65-85 (Academic Press 1985). Alternativno, skener pozitronske emisione trasafcsijaine tomografij e, kao Što je okačen sa Pet VI smešten u Brookhaven National Labomtorv, može biti korišćen gđe radioaktivni obeleživači emituju pozitrone fna pr,,<U>C,<lS>F,,<5>0, i ,3N).

{0139J MRIkontrastnasredstva.Snimanje magenetne rezonance (MRI) koristi NMR da bi vizuaiizovao unutrašnje karakteristike živih subjekata i koristan je za prognozu, dijagnosticiranje, lečenje i operaciju, MRI može biti korišćen bez jedinjenja radioaktivnih indikatora za očiglednu korist. Neke MRI tehnike su ukratko izložene u

EPO 502 8.14 A. Generalno, razlike u vezi sa konstantama relaksacionog vremena TI i T2 protona vode u različitim okolinama je korišćen đa stvori sliku. Međutim, razlike mogu biti nedovoljne đa se obezbedile oštre slike visokea rezolucija.

[0140]Razlike u ovim relaksacionim vremenskim konstantama mogu biti povećane kontrastnim sredstvima. Primeri takvih kontrastnih sredstava uključuju, brojna magnetna sredstva, paramagnetna sredstva (koja primarno menjaju TI) i feromagnetana ili supermagnetna sredstva (koja primamo menjaju T2 odgovor), fieiati (na pr., EDTA, DTPA i NTA helati) mogu biti korišćeni za vezivanje (i smanjivanje toksičnosti) nekih paramagnetnih susptanei (napr., Mn2*, Gđ<3>~), Druga sredstva mogu biti u obliku čestica, na pr. manjim od 10 um do oko 10 nm u prečniku). čeiice mogu imati feromagnetne, anti-fett>magnetne ili superparamagnetne osobine. Čestice mogu obuhvatati, na pr. magnetit. (Fe-jO*), y~ ¥e?Q^ ferite i druga magnetna mineralna jedinjenja prelaznih elemenata. Magnetne čestice mogu uključivati jedan ili više magnetnih kristala sa ili bez nemagnetnih materijala. Nemagnetm<*>materijal može obuhvatati sintetičke li prirodne polimere kao sto su sefaroza, đekstran, đekstrin, škrob i slično).

[0141]Anti-T WEAK antitela mogu takođe biti oheležena sa grupom indikatorom koja sadrži NMR-aktivan<i9>F atom, ili više takvih atoma pošto (i) suštinski svi prirodni atomi fluora su izotop<!>'¥ i prema tome, sva jedinjenja koja sadrže fluor su NMR-aktivna; (ii) mnogo hemijski aktivnih polifluorovanih jedinjenja kao što je anhiđriđ trifluorosirćetne kiseline su komercijalno dostupni po relativno niskoj eeni, i (iii) ustanovljeno je da je mnogo fluorovanih jedinjenja medicinski prihvatljivo za humanu upotrebu kao što su perfluorovani poHetri korišćeni da nose kiseonik kao zamena za hemoglobin, Posle nekog vremena za inkubaciju, izveden je MRI celog tela korišćenjem aparata kao što je onaj opisan kod Pvkett(1982) Sckntiifc American,.246:7$~$& đa se locira i snimi raspoređenost TVVEAK.

[014.2]U drugom aspektu, opis obezbeđuje postupak detektovanja prisustva TVVEAK u uzorkuin vitro(na pr., biološkom uzorku, kao stoje serum, plazma, tkivo, biopsija). Predmetni postupak može biti korišćen za dijagnosticiranje poremećaja, na pr. poremećaja u vezi sa imunim ćelijama. Postupak uključuje: (i) dovođenje u kontakt

uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-TWEAK antitelotn; i (ii) prccenivanje uzorka na prisustvo TWEAK, «a pr,, detekfovanjem obrazovanog kompleksa između anti-TWEAK antitela i TWEAK, ili đetektovanjem prisustva antitela ili TWEAK. Na primer, antitelo može biti imobilizovano, na pr. na nosaču, đetektovano je zadržavanje antigena na nosaču i /iii obnuto, Kontrolni uzorak može biti uključen, Statistički značajna promena u obrazovanju kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak može biti indikativna za prisustvo TWEA& u uzorku. Generalno. anti-T\VEAK antitelo može biti korišćen© u prijavama koje obuhvataju iloreseentnu polarizaciju, mikroskopiju. ELISA, centrifugiranje, hromatografiju i ćelijsko sortiranje (na pr., fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje).

[0143]Pr imer 1

[0144]Sekvenea promenjivog domena teškog lanca mtštjeg P2D10, sa podvučenim CDRs, je:

[0145]Ovo je podgupa 3D mišijeg promenjivog domena teškog lanca.

[0146] Sekvenea promenjivog domena lakog lanca mišijeg P2Đ10, sa podvučenim CDRs, je:

[0147]Ovo je pođgrupa 2 kapa milijeg lakog lanca.

[0148]Sleđeći humani akeeptoi r"framevvorks5 su izabrani za huP2Đ10; Humana 56"~S4m pođgrupa 3 promenjivog domena teškog lanca (pristupni broj NC8! baze podataka GL33318898, Scamurra et al,, direktno podnošenje), Sekvenea sa podvučenim CDRs je sleđeea.: {0149}Sekvenea 'humane Kl 07 podgrupe 2 promenjivog domena lakog lanca (pristupni broj NCBI baze podataka. 01: 21669075, Akahori etal, direktno podnošenje), sa podvučenim C DRs je:

(0150).0 prikazanoj sekvenci humanog akceptora, CDRs (koji su podvučeni) su iste dužine i kanoničkih klasa kao one u promenjivim đomenirna muP2D10.

{015.1.JDole je prikazano poravnavanje promenjivih domena teškog lanca mišijeg P2D10 (gornji) i humanog akceptora 56-84ra (donji) (identičnost 68.8%):

[0152|Dole je prikazano poravnavanje promenjivih domena lakog lanca milijeg P2Đ10 (gornji) i humani akceptora Kl07 (donji) (identičnost 75,9%);

[8153] Postoje dve verzije huP20i 0 lakog lane« (LI i L2).. Antitelo huP2D 10-1 odnosi se na antitelo koje uključuje huP2D10 10 i huP2D10 l/L Antitelo huP2ĐI0-2 odnosi se na antitelo koje uključuje huP2D 10 lil i huP2D10 L2.

[0.154] Dole je prikazano poravnavanje<p>romenjivih domena teškog lanca 56-84m humanog akceptora (gornji) i huP2Đ!Q Hl (donji):

J0155}CDRs su podvučeni. huP2D10 teški lanac jeRivnolančani CDR graft (tjne postoje povratne mutacije u<<>rramework").

[01 S6|Dole je prikazano poravnavnje promenjivih domena lakog lanca K10? humanog kapa akceptora (gornji) i huP2D10 Li (donji):

[0157]CDRs su podvučem. huP2D10 LI laki lanac ima dve povratne mutacije koje su pokazane u donjem slučaju u gore pokazanom 'fiamevvork':' L46F u FR2 i YS7F u FR3.

{0159] CDRs su podvučeni. huP2Dl0 L2 laki lanac je ravno lančani CDR graft (bez povratnih muatacija u ;framework'~u).£01.60]Ovo je primer amino kiselinske sekvence teškog .lanca zrelog huP2D10 H l IgGi:

[0161]Kabat numeracija za VH segment promenjivog domena teškog lanca (SED ID br:65) je prikazana dole:

[0162]Ovo je primer amino kiselinske sekvence lakog lanca zrelog huP2D10 LI:

[0163]Kabat numeracija za ovajVisegment je dole prikazana (SEQ ID br:67):

[0.164] Ovo je primer amino kiselinske sekvence lakog lanca zrelog huP2D 10 L2: (0165}Kabat numeracija za ovaj VL je dole prikazana (S'EQ ID br. :69);

10166]Primer 2

[0167]Blokiranje monoklonalnog antitela za TWEAK, mP2Đl 0, značajno smanjuje kliničku jačinu na modelima multiple skelroze, moždanog udara i reumatoidnog artritisa. Podeša vana je farmakokinetika (PK) anti*TWEAK monoklonalnog antitela, mP2Đ10f posle intravenskog (IV) davanja,

(0168}mP2D 10 je davan mišu u količini 1,10 ili 100 mg/kg pomoću IV injekcije. Koncentracije mP2D 1 Ou serumu su određene korišćenjem ELISA. PK profil koncentracija-vreme je analiziran korišćenjem modela sa dva ođeijka sa eliminacijom prvog reda ili Mihaelis-Mentenovom eliminacijom iz centralnog ođeijka zapremine V L Konstante brzine između dva ođeijka su bile K l 2 (izlazeći iz ođeijka I u 2) i K2I (Izlazeći iz odeljka 2 u i). Za model eliminacije prvog reda, brzina eliminacione konstante je bila K10. Za Mihaelis-NMentenov model eliminacije, lek je uklonjen brzinom Vm<*>Cl/(Km-t-Cl), u kojoj, CI je bila koncentracija mP2I>10 u centralnom odeljku, Vm i Km su konstante. Podaci su uklapani sa AĐAPTII softverom (D'Argeuio, DJSL and A,Schumitzkv* ADAPTII User' s Guide: Phf& macoMmtic. •/ P' kwmac& dynamk. Systems Analysti &/htweBiomeđical Simulations Resouree, Los Angeies, 1997.) korišćenjem postupka procenjivanja maksimalne verpvatnoće.

10169]Za model dva odeljka sa linearnom eliminacijom, VI je bio 23.2 mL/kg, Kl 0 je bio 0.0096 h-1, Kl2 je bio 2,501 i K21 je bio 1.053. Veličina površine ispod krive (AIC) je bila 298 i Scb\varz-ova vređnost je bila 304,2. Za model dva odeljka linearne eliminacije.Vi je bio 0.0235. Vm je bio 9,22 mg/kg/hr. Krn je bio 484.2 pg/ml, K I2 je

bio 2.348 h-l5 i K21 je bio 0.966 h~1. AfC vrednostje bila 269 i Sehwarz-ova vrednostje bila 276, PK od mP2D10 je bolje predviđena sa nelinearnim modelom nego linearnim modelom.

[01.70] Profili koncentraeija-vreme mP2D 10 su bolje predviđeni sa modelom sa dva ođeijka sa Mihaelis-Mentenovom ejiminacjom nego eliminacijom prvog reda.

(0171]Ljudi Iz struke će zanati, ili biti u mogućnosti đa korišćenjem samo rutinskih ekperimenata dođu đo mnogih ekvivalenta ovde opisanih specifičnih izvođenja.

Claims (1)

1. f. Izolovani protein koji sadrži sekvencu promenjivog domena teškog lanca imunoglobulina i sekvencu promenjivog domena lakog lanca imunoglobulina, koji mogu obrazovati vezujuće mesto antigena koji se veže za humani TVVEAIC (slabi izazivač apoptoze sličan TNF) r gde

   (a) sekvenea promenjivog domena teškog lan<q>a proteina sadrži sledeće regione koji određuju komplementarnost (CDRs); CDRHl koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: GFTFSRYAMS (SEQ ID br: IX CDRH2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: CDRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

   (b) sekvenea promenjihvog domena lakog lanca proteina sadrži sledeće CDRs: CDRL1 koji sadrži arninokisetinsku sekvencu: CDRL2koji sadrži amino kiselinsku sekvencu: KVSNRFS (SEQ ID br.: 9); i CDRL3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu: 2. Protein prema zahtevu 1, gde je proten rekombmant, pune dužine IgG. 3. Protein prema zahtevu 1, gde protein sadrži humani Fc region. 4. Protein prema zahtevu 1, gde protein sadrži humani Fc region sa jednom ih više aminokisetinskih supstitucija u prirodnoj airjinokiseJinskoj sekvenci Fc regiona. 5. Protein prema zahtevu , gde je protein Fah sli $cFv. 6. Protein prema zahtevu 1, gde protein sadrži 'framevvork' regione koji su bar 90% identičan! 'framework* regionima humane genninativne linije. 7. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea varjabilnog domena lakog lanca proteina sadrži<4>framework<*>regione koji su bar 95% identični sekvenci Vtcl podgrupe genninativne linije. 8. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea varjabilnog domena lakog lanca proteina sadrži ,rrerneworkt regione koji su bar 95% identični DPK9 sekvenci. 9. Protein prema zahtevu i, gde sekvenea varjabilnog domena lakog lanca proteina sadrži<l>Varaework' regione koji su bar 95% identični sekvenci izabranoj od sekvenci prikazanih kao SBQ ID br.: 17,19, 22,23, 25, 26, 51,61 i 63. 10. Protein prema zahtevu i, gde sekvenea varjabilnog domena lakog lanca proteina sadrži TrarnetvonV regione koji su identični sekvenci izabranoj od sekvenci prikazanih kao SEQ ID br,: 17, 19, 22, 23,25, 26, 51, 61 i 63. 11. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea varjahitnog domena lakog lanca proteina sadrži<f>framework' regione koji su bar 95% identični sekvenci VHI podgrupe germinativne linije. 12. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea varjabilnih domena teškog lanca proteina sadrži 4 rratneworicr regione koji su bar 95% identični sekvenci DP-54 germinativne linije. 13. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži 'frame\vork<!>re<g>ione koji su bar 95% identični sekvenci izabranoj ođ sekvenci prikazanih kao SEQ ID br.: 27-43, 46-50 i 59. 14. Protein prema zahtevu i, gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži 'trainevrark* regione koji su identični sekvenci izabranoj od sekvenci prikazanih kao SEQ ID br: 27-43, 46-50 i 59. 15. Protein prema zahtevu I, gde sekvenea varjabilnog domena teškog lanca proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 95% identična sekvenci prikazanoj kaoSE<?IDbr.59. 16. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95% identičnu sekvenci đatoj kao SEQ ID br.:61 ili 63. 17. Protein prema zahtevu L gde sekvenea promenjivog domena teškog lanca proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95% identičnu sekvenci đatoj kao SEQ ID br.:59; i gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95% identičnu sekvenci prikazanoj kao SEQ ID br.:6.1 ili 63. 18. Protein prema zahte\*u 1, gde sekvenea promenjivog domena teškog laneni proteina sadrži sekvencu datu kao SEQ ID br.:59; I gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID br,:6L 19. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea promenjivog domena teškog lanca proteina sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID br.:59; i gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži sekvencu prikazan« kao SEO ID br.:63. 20. Protein prema zahtevu 1, gde sekvenea promenjivog domena teškog lanca proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID br.:64; i gde sekvenea promenjivog domena lakog lanca proteina sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ I'D br.:66 iii SBQ.1D br.68, 21. Protein prema zahtevu 20, gđe sekvenea lakog lanca proteina sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID br. 66, 22. Protein prema zahtevu 20, gde sekvenea lakog lanca proteina sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID fer. 68. 23. Protein prema zahtevu 1, gde je protein lunkcionalno povezan sa jeđvnim ili više drugih molekulskih entiteta. 24. Protein prema zahtevu 23, gde jedan ili više drugih molekulskih eniteta su antitela ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen. 25. Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein prema bilo kom od prethodnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač. 26. Izolovani polraukleoiiđ Hi polinukleotidi, koji kodiraju protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva. 27. Izolovani vektor ili vektori, koji sadrže polinukieotid ili poltnukleotlde prema zahtevu 26. 28. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži polinukieotid ili polinukleotide prema zahtevu 26, ili vektor ili vektore prema zahtevu 27. 29. Postupak đohijanja proteina prema bilo kom ođ zahteva 1 -23, gđe postupak obuhvata: (i) dobijanje ćelije domaćina koja sadrži sekvence rekombinantnih nukleinskih kiselina za eksprimovanje proteina; i (ii) održavanje ćelije pod uslovima pri kojima se protein eksprirauje. 30. Postupak prema zahtevu 29, Sto dalje obuhvata izolovanje proteina i forrnuiisanje proteina sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, 3 1. Protein prema bilo kom ođ zahteva 1 -23 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 25, za upotrebu u tečenja autoimunog poremećaja. 32. Protein prema bilo kom ođ zahteva !-23 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 25, za upotrebu u lećnju reurnatoiđnog artritisa. 33. Protein prema bilo kom ođ zahteva 1-23 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 25, za upotrebu u tečenju muttiple skleroze. 34. Protein prema bilo kom od zahteva 1 -23 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 25, za upotrebu u tečenju moždanog udara.