MD3600363T2

MD3600363T2 - Compoziții cuprinzând tulpini bacteriene

Info

Publication number: MD3600363T2
Application number: MDE20200143T
Authority: MD
Inventors: Imke Elisabeth MULDER; Anna Ettorre; Suaad Ahmed; Parthena Fotiadou; Joseph Roby Iringan Urcia; Helene Savignac
Original assignee: 4D Pharma Res Ltd
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2021-05-31
Also published as: LT3600363T; US20200171102A1; SMT202100069T1; HRP20210205T1; RS61367B1; EP3600363A1; CN115813955A; ES2855701T3; NZ760637A; JP6840272B2; IL271152B; BR112019026477A2; JP2021080269A; AU2018285445A1; CN111107859B; AU2020204265A1; TWI767013B; SI3600363T1; PL3600363T3; KR20200015574A

Abstract

Invenţia furnizează compoziţii cuprinzȃnd tulpini bacteriene pentru tratatrea şi prevenirea unei tulburări neurodegenerative.

Description

DOMENIUL TEHNIC

Această invenţie este în domeniul compoziţiilor cuprinzând tulpini bacteriene izolate din tractul digestiv de mamifer şi utilizarea de astfel de compoziţii în tratamentul bolilor.

FUNDAL INVENŢIEI

Se crede că intestinul uman este steril în utero, dar este expus la o largă varietate de microbi maternali şi din mediu imediat după naştere. Apoi, are loc o perioadă dinamică de colonizare şi succesiune microbiană, care este influenţată de factori cum ar fi metodele de livrare, mediul, dieta şi genotipul gazdei, din care toate impactează asupra compoziţiei microbiotei intestinale, în special în primii ani de viaţă. Ulterior, microbiota se stabilizează şi devine asemănătoare cu cea adultă [1]. Microbiota intestinului uman conţine mai mult de 500-1000 de filotipuri diferite aparţinând în mod esenţial la două divizii bacteriene majore, Bacteroidetes şi Firmicutes [2]. Reacţiile simbiotice de succes care apar din colonizarea bacteriană a intestinului uman au dat o largă varietate de funcţii metabolice, structurale, protectoare şi alte funcţii benefice. Activităţile metabolice sporite ale intestinului colonizat asigură că, componente alimentare altfel nedigerabile, sunt degradate cu eliberarea produselor secundare furnizând o sursă nutrientă importantă pentru gazdă. În mod similar, importanţa imunologică a microbiotei intestinale este bine recunoscută şi este exemplificată la animalele fără germeni care au un sistem imunitar alterat care este reconstituit funcţional dupa introducerea bacteriei comensale [3-5].

Modificări dramatice în compoziţia microbiotei au fost documentate în tulburările gastrointestinale cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD). De exemplu, nivelurile de bacterii CIVa în clusterul Clostridium sunt reduse la pacienţii cu IBD în timp ce numărul de E. coli este crescut, sugerând o deplasare în echilibrul simbionţilor şi patobionţilor în intestin [6-9].

În recunoaşterea potenţialului efect pozitiv pe care anumite tulpini bacteriene îl pot avea asupra intestinului animalului, au fost propuse diferite tulpini pentru utilizare în tratamentul diferitelor boli (vezi, de exemplu, [10-13]). De asemenea, anumite tulpini, incluzând mai ales tulpinile Lactobacillus şi Bifidobacterie, au fost propuse pentru utilizare în tratarea diferitelor boli inflamatorii şi autoimune care nu sunt direct legate de intestin (vezi [14] şi [15] pentru revizii). Totuşi, relaţia între diferite boli şi diferite tulpini bacteriene, şi efectele precise ale tulpinilor bacteriene particulare asupra intestinului şi la un nivel sistemic şi pe orice tip particular de boli sunt slab caracterizate, în special pentru tulburările neurodegenerative.

Recent, în domeniu, a crescut interesul cu privire la alterările din microbiomul intestinal care poate juca un rol patofiziologic în bolile creierului uman [16]. Dovada preclinică şi clinică sugerează puternic o legătură între dezvoltarea creierului şi microbiotă [17]. Un corp în creştere din literatura preclinică a demonstrat semnalizare bidirecţională între creier şi microbiomul intestinal, implicȃnd multiple sisteme de semnalizare neurocrine şi endocrine. Într-adevăr, nivelurile crescute de specii Clostridium în microbiom au fost legate de tulburările creierului [18], şi un dezechilibru al filei Bacteroidetes şi Firmicutes a fost de asemenea implicat în dezvoltarea tulburărilor creierului [19]. Sugestiile că nivelurile alterate ale comensalelor intestinale, inclusiv cele de Bifidobacterie, Lactobacillus, Sutterella, Prevotella şi Ruminococcus genera şi ale familiei Alcaligenaceae sunt implicate în tulburările sistemului nervos central (CNS) mediate imun, sunt chestionate prin studii sugerând o lipsă a alterării în microbiotă între pacienţi şi subiecţii sănătoşi [10]. Parabacteroides distasonis au fost propuse pentru tratarea unei varietăţi de tulburări incluzând astmul, artrita reumatoidă şi scleroza multiplă [20].

Ca şi astmul şi artrita reumatoidă, scleroza multiplă este în primul rând mediată de sistemul imunitar. Sistemul imunitar atacă axonii mielinaţi în sistemul nervos central, distrugȃnd plăcile sau leziunile denumite mielină. Demielinarea apare în particular în nervii optici, măduva spinării subpială, trunchiul cerebral, cerebel, şi regiunile materiei albe juxtacorticale şi periventriculare.

Ca atare, scleroza multiplă are o patologie diferită de a altor boli neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson, boala Alzheimer sau demenţa. De exemplu, scleroza multiplă este diagnosticată în mod obişnuit la pacienţi de 20 ani şi de 30 ani, în timp ce multe alte boli neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson, Alzheimer şi demenţa, sunt diagnosticate predominant la pacienţi cu vȃrste de peste 65 ani.

Boala Parkinson, la fel ca multe boli neurodegenerative, este în primul rând mediată de acumularea de proteină pliată greşit. Boala Parkinson este o sinucleinopatologie care implică acumularea de α-sinucleină, care se agregă ca fibrile insolubile în corpi Lewy în citoplasma corpului neuronal. Acumularea de α-sinucleină este toxică şi afectează funcţiile mitocondriilor, lisozomilor, şi reticulului endoplasmatic, şi interferează cu transportul microtubulelor.

Medicamentele antiinflamatorii nonsteroidiene (NSAID) cum ar fi ibuprofenul, au fost testate pentru eficacitatea lor în tratarea unei varietăţi de boli neurologice, dar impactul clinic al NSAID asupra bolilor neurodegenerative cum ar fi boala Parkinson rămâne neclar. În timp ce unele studii au arătat că utilizarea NSAID cronică este protectoare împotriva bolii Parkinson, alte studii nu ar putea confirma existenţa unei relaţii semnificative. O meta analiză recentă a indicat că utilizarea de NSAID neaspirinice, în special ibuprofen, reduce riscul de PD cu 15% în timp ce utilizarea aspirinei nu a prezentat nici un efect [21].

În prezent, efectul practic al legăturii între microbiom şi bolile creierului uman este slab caracterizat. Corespunzător, sunt necesare studii analitice mai directe pentru a identifica impactul terapeutic al alterării microbiomului asupra tulburărilor neurodegenerative.

Există o cerinţă în domeniu pentru noi metode de tratare a tulburărilor neurodegenerative. Există de asemenea o cerinţă pentru efecte potenţiale ale bacteriei intestinale de a fi caracterizată astfel încât să poată fi dezvoltate noi terapii utilizând bacteria intestinală.

WO2016/203220 descrie compoziţii cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides pentru utilizare într-o metodă de tratament sau prevenire a bolilor inflamatori şi autoimune mediate de IL-17 sau de calea Thl7. Yang Fang şi colab. (Int J Clin Exp Med 2016;9(9):17946-17951) descriu niveluri mai ridicate de citokine în sângele periferic al pacienţilor cu boala Parkinson în comparaţie cu un grup de control sănătos. Waisman Ari şi colab. (Acta Neuropathol 2015; 129:625-637) descriu IL-17 şi rolul său în sistemul nervos central.

REZUMATUL INVENŢIEI

Inventatorii au dezvoltat noi terapii pentru tratarea şi prevenirea tulburărilor neurodegenerative. Inventatorii au identificat că tulpinile bacteriene din genul Parabacteroides pot fi eficiente pentru tratarea bolilor neurodegenerative. Cum s-a descris în exemple, administrarea compoziţiilor cuprinzând Parabacteroides distasonis poate proteja împotriva speciilor reactive de oxigen şi preveni inflamaţia, care acţionează astfel ca neuroprotector. Inventatorii au identificat de asemenea că tratamentul cu Parabacteroides distasonis poate reduce activarea de molecule proinflamatoare, cum ar fi NFκB şi IL-6, prin LPS şi α-sinucleina mutantă A53T. Inventatorii au identificat că tratamentul cu Parabacteroides distasonis poate reduce activitatea de deacetilare histonă şi peroxidare lipidă in vitro, care poate ajuta la reducerea morţii celulei şi apoptozei. Inventatorii au identificat de asemenea că Parabacteroides distasonis poate produce indol care poate atenua inflamaţia şi stresul oxidativ. Mai mult, inventatorii au demonstrat că tratamentul cu Parabacteroides distasonis poate creşte nivelurile de kinurenine.

Inventatorii au descoperit de asemenea că tratamentul cu Parabacteroides distasonis creşte activarea de BDNF. BDNF este un factor neurotrofic de creştere care a dovedit că sporeşte diferenţierea şi supravieţuirea neuronilor. Astfel, compoziţiile invenţiei pot fi utilizate într-o metodă de amplificare a supravieţuirii celulei nervoase în tratamentul sau prevenirea bolilor neurodegenerative.

Invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a unei boli sau afecţiuni selectate din grupul constând din: boală Parkinson, inclusiv paralizie supranucleară progresivă, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicament; boală Alzheimer, inclusiv sindrom Benson; boală Huntington; scleroză laterală amiotrofică; boală Lou Gehrig; boală a neuronului motor; boală prion; ataxie spinocerebrală; atrofie musculară spinală; demenţă, inclusiv corpi Lewy, demenţă vasculară şi frontotemporală; afazie progresivă primară; depreciere cognitivă uşoară; depreciere cognitivă asociată cu HIV şi degenerare corticobazală.

În realizările preferate, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii Parkinson, cum ar fi din mediu, familial sau Parkinson asociat cu stări inflamatorii generale. Inventatorii au identificat că tratamentul cu tulpini Parabacteroides poate reduce activarea moleculelor proinflamatoare, cum ar fi NFκB şi IL-6, prin LPS şi α-sinucleina mutantă A53T în modelele in vitro de Parkinson din mediu şi familial. În realizările preferate, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană a speciilor Parabacteroides distasonis, pentru utilizare în tratamentul bolii Parkinson. Compoziţiile utilizând Parabacteroides distasonis pot fi în special eficiente pentru tratarea Parkinsonului.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii neurodegenerative cu debut timpuriu. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare într-o metodă de prevenire sau întȃrziere a debutului sau progresului unei tulburări neurodegenerative.

În realizările preferate ale invenţiei, tulpina bacteriană din compoziţie este de Parabacteroides distasonis. Pot fi de asemenea utilizate tulpinile strâns asociate, cum ar fi tulpinile bacteriene care au o secvenţă ARNr 16S care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu secvenţa ARNr 16S a unei tulpini bacteriene de Parabacteroides distasonis. Preferabil, tulpina bacteriană are o secvenţă ARNr 16S care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8 sau 9. Preferabil, identitatea de secvenţă este cu SEQ ID NO:9. Preferabil, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are secvenţa ARNr 16S reprezentată de SEQ ID NO:9.

În anumite realizări, compoziţia invenţiei este pentru administrare orală. Administrarea orală a tulpinilor invenţiei poate fi eficientă pentru tulburările neurodegenerative. De asemenea, administrarea orală este convenabilă pentru pacienţi şi practicieni şi permite livrarea la şi/sau colonizarea parţială sau totală a intestinului.

În anumite realizări, compoziţia invenţiei cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi acceptabili farmaceutic sau purtători.

În anumite realizări, compoziţia invenţiei cuprinde o tulpină bacteriană care a fost liofilizată. Liofilizarea este o tehnică eficientă şi convenabilă pentru prepararea compoziţiilor stabile care permit livrarea bacteriei.

În anumite realizări, invenţia furnizează un produs alimentar cuprinzând compoziţia cum s-a descris mai sus.

În anumite realizări, invenţia furnizează o compoziţie de vaccin cuprinzând compoziţia cum s-a descris mai sus.

În anumite realizări ale invenţiei, compoziţia este pentru utilizare în tratarea leziunii creierului. Activitatea neuroprotectoare a compoziţiilor invenţiei şi abilitatea lor de a reduce nivelurile de activitate de deacetilază histonă (HDAC) le poate face utile pentru tratarea leziunii creierului. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral, cum ar fi tratarea leziunii creierului care rezultă dintr-un accident vascular cerebral.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

Figura 1: Viabilitatea celulară a celulelor neuroblastom

Figura 2A: Reglare negativă a secreţiei IL-6 Figura 2B: Reglare negativă a secreţiei IL-8

Figura 3: Inhibarea secreţiei IL-6 şi IL-8 α- sinucleină

Figura 4: Inhibarea de α- sinucleină indusă de activarea promotorului NFκB

Figura 5: Inhibarea de LPS indusă de activarea promotorului NFκB

Figura 6: Modificare în capacitatea antioxidantă

Figura 7: Modificare în capacitatea antioxidantă totală (oxidare lipidă)

Figura 8: Modificare în activitatea de deacetilază histonă (HDAC)

Figura 9: Nivel de producţie de indol

Figura 10: Nivel de producţie de kirunenine

Figura 11: Neuroprotecţie - viabilitate celulară. Figura 11 prezintă aceleaşi date ca Figura 1.

Figura 12: Niveluri de producţie de metaboliţi - neurotransmiţători în creier

Figura 13: Niveluri de producţie de metaboliţi - acizi organici în supernatantul

Figura 14: Efect asupra funcţionării barierei intestinale

Figura 15: Nivel de producţie BDNF

Figura 16: Modificare în nivelurile ROS în (A) celule U373, (B) celule SH-SY5Y

Figura 17: Producţie de neurotransmiţători în creier

Figura 18: Modificări în expresia receptorului hipocampal - A) receptor oxitocin, B) receptor vasopresin, C) receptor glucocorticoid şi D) receptor mineralocorticoid

Figura 19: Modificări în expresia hipocampală a A) hormonului de eliberare a corticotropinei (CRH), B) expresiei BDNF şi C) TLR4

Figura 20: A) Modificări în expresia receptorului 1 al hormonului de eliberare a corticotropinei hipocampale (CRFR1) şi B) expresia receptorului 2 al hormonului de eliberare a corticotropinei (CRFR2)

Figura 21: Modificări în expresia hipocampală a A) factorului de necroză tumorală, B) interleukinei 1b şi C) IL-6

Figura 22: A) Modificări în expresia alfa M integrinei hipocampale (CD11b) şi B) modificări în expresia receptorului 1A de serotonină hipocampală (receptor 5-HT1A)

Figura 23: A) Modificări în expresia subunităţii 2A de tip NMDA a receptorului ionotropic glutamat hipocampal (Grin2A) şi B) subunităţii 2B de tip NMDA a receptorului ionotropic glutamat (Grin2B)

Figura 24: Modificări în expresia hipocampală a A) receptorului 2 al acidului A gama-aminobutiric (GABA A2), B) receptorului 1 al acidului B gama-aminobutiric (GABA BR1) şi C) receptorului 1 de dopamină (DRD1)

Figura 25: Modificări în expresia receptorului de amigdală - A) receptor oxitocin, B) receptor vasopresin, C) receptor glucocorticoid şi D) receptor mineralocorticoid

Figura 26: Modificări în expresia amigdală de A) factor neurotrofic derivat din creier (BDNF), B) receptor 4 de tip Toll (TLR-4), C) receptor 1 al hormonului de eliberare a corticotropinei (CRFR1) şi D) receptor 2 al hormonului de eliberare a corticotropinei (CRFR2)

Figura 27: Modificări în expresia amigdală de A) alfa M integrină (CD11b), B) Interleukină-6 (IL-6), C) subunitate 2A de tip NMDA a receptrorului ionotropic glutamat (Grin2A) şi D) subunitate 2B de tip NMDA a receptorului ionotropic glutamat (Grin2B)

Figura 28: Modificări în expresia amigdală de A) subunitate alfa 2 a receptorului GABA-A (GABRA2), B) subunitate a receptorului 1 de tip B al GABA-A (GABBR1) şi C) receptor 1 de dopamină (DRD1)

Figura 29: Modificări în expresia cortexului prefrontal al A) receptorului oxitocin, B) factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF), C) receptorului mineralocorticoid şi D) receptorului glucocorticoid

Figura 30: Modificări în expresia cortexului prefrontal al A) receptorului 4 de tip Toll (TLR-4), B) receptorului 1 al hormonului de eliberare a corticotropinei (CRFR1), C) receptorului 2 al hormonului de eliberare a corticotropinei (CRFR2) şi alfa M integrinei (CD11b)

Figura 31: Modificări în expresia cortexului prefrontal al A) Interleukinei-6 (IL-6), B) subunităţii 2A de tip NMDA a receptorului ionotropic glutamat (Grin2A), C) subunităţii 2B de tip NMDA a receptorului ionotropic glutamat (Grin2B) şi D) subunităţii alfa 2 a receptorului GABA-A (GABRA2)

Figura 32: Modificări în expresia cortexului prefrontal al A) subunităţii 1 a receptorului de tip B al receptorului GABA-A (GABBR1) şi B) receptorului 1 de dopamină (DRD1)

Figura 33: Modificări în expresia colonului de A) Triptofan Hidroxilază-1 (Tph1) şi B) Indolamină2,3-Dioxigenază-1 (IDO1)

Figura 34: Modificări în expresia ileumului de A) Triptofan Hidroxilază-1 (Tph1) şi B) Indolamină2,3-Dioxigenază-1 (IDO1)

Figura 35: Modificări în circulaţia nivelurilor metabolite de triptofan A) kinurenine, B) triptofan şi C) indice de metabolism kinurenine/triptofan

Figura 36: Efect asupra producţiei de interferon-γ de la splenocitele de şoarece de la şoareci alimentaţi cu MRx0005 şi MRx0029

Figura 37: Efect asupra producţiei de interleukină-1β de la splenocite

Figura 38: Efect asupra producţiei de interleukină-6 de la splenocite

Figura 39: Efect asupra producţiei de factor de necroză tumorală de la splenocite

Figura 40: Efect asupra producţiei de interleukină-10 de la splenocite

Figura 41: Efect asupra producţiei de chemoatractant CXCL1 de la splenocite

Figura 42: Modificări în nivelurile de acid gras ale catenei scurte cecale

Figura 43: Modificări induse de MRx0029 şi MRX005 în nivelurile de expresie ale genei de Actină, Villin, Occludin TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 şi NSE.

Figura 44: Diferenţiere celulară SHSY5Y indusă de MRx0005 şi MRx0029. (A-C) Imagini reprezentative de celule imuno etichetate cu Phalloidin şi MAP2. (D-F) Imaginile A-C îmbinate cu imagini DAPI. (G-I) Celule imunoetichetate cu tubulină β3. (J-L) îmbinate cu imagini DAPI. Amplificare x630. J-K) Analiză de culoare Western a efectelor tratamentului cu MRx0005 şi MRx0029 asupra celulelor SHSY5Y. Membranele colorate Western au fost sondate cu anticorpi la MAP2 (M) şi tubulină β3 (N). Actina a fost utilizată ca control de încărcare. Panourile de jos: culori reprezentative de la unul pȃnă la şase experimente separate; panourile de sus: intensitate densitometrică relativă.

DIVULGAREA INVENŢIEI

Tulpini bacteriene

Compoziţiile invenţiei cuprind o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides. Exemplele demonstrează că bacteriile din acest gen sunt utile pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative. Tulpinile bacteriene preferate sunt ale speciilor Parabacteroides distasonis.

Exemple de specii Parabacteroides pentru utilizare în invenţie includ Parabacteroides distasonis, Parabacteroides goldsteinii, Parabacteroides merdae şi Parabacteroides johnsonii. Parabacteroides seamănă cu Bacteroides şi sunt gram-negative, obligatoriu anaerobe, care nu formează spori, nemotile şi în formă de tijă, şi de dimensiuni 0,8-1,6Ч1,2-12µm. Parabacteroides distasonis este una dintre cele mai comune specii în excrementele umane. Tulpina de tip P. distasonis este JCM 5825T (=CCUG 4941T=DSM 20701T=ATCC 8503T). Numerele de acces GenBank/EMBL/DDBJ pentru secvenţele genetice ARNr 16S de tulpini P. distasonis JCM 5825T, JCM 13400, JCM 13401, JCM 13402, JCM 13403 şi JCM 13404 şi de tulpini P. merdae JCM 9497T şi JCM 13405 sunt AB238922-AB238929, respectiv (divulgate aici ca SEQ ID NO:1-8). Exemple de tulpini sunt de asemenea descrise în [22].

Bacteria Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382 a fost testată în exemple şi este de asemenea cea la care se face referire în acest document ca tulpină 755 sau MRx0005. O secvenţă ARNr 16S pentru tulpina 755 care a fost testată este prevăzută în SEQ ID NO:9. Tulpina 755 a fost depozitată cu autoritatea de depozitare internaţională NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland) de GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland) pe 12 martie 2015 ca „Parabacteroides sp 755» şi i-a fost asignat numărul de acces NCIMB 42382. GT Biologics Ltd. şi-a modificat ulterior numele în 4D Pharma Research Limited.

WO 2016/203220 descrie administrarea tulpinei 755 la şoareci şi arată că ea poate afecta procesele bolii în exteriorul intestinului (cum ar fi astm şi artrită). Tulpina 755 afectează de asemenea procesele bolii în exteriorul intestinului în tratamentul tulburărilor neurodegenerative descrise aici.

O secvenţă genom pentru tulpina 755 este prevăzută în SEQ ID NO:10 din WO2018229189. Această secvenţă a fost generată utilizând platforma PacBio RS II.

Se aşteaptă de asemenea ca tulpinile bacteriene strâns asociate cu tulpina testată în exemple să fie eficiente pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative. În anumite realizări, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu secvenţa ARNr 16s a unei tulpini bacteriene de Parabacteroides distasonis. Preferabil, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau 9. Preferabil, identitatea de secvenţă este ca SEQ ID NO:9. Preferabil, tulpină bacteriană pentru utilizare în invenţie are secvenţa ARNr 16s reprezentată de SEQ ID NO:9.

Tulpinile bacteriene care sunt biotipuri de bacterii depozitate sub numărul de acces 42382 sunt de asemenea de aşteptat să fie eficiente pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative. Un biotip este o tulpină strȃns asociată care are aceleaşi sau foarte similare caracteristici fiziologice şi biochimice.

Tulpinile care sunt biotipuri ale bacteriilor depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 şi care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie pot fi identificate prin secvenţierea altor secvenţe de nucleotidă pentru bacteriile depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382. De exemplu, substanţial întregul genom poate fi secvenţiat şi o tulpină biotip pentru utilizare în invenţie poate avea cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identitate de secvenţă de-a lungul a cel puţin 80% din întregul său genom (de exemplu de-a lungul a cel puţin 85%, 90%, 95% sau 99%, sau de-a lungul întregului său genom). Alte secvenţe adecvate pentru utilizare în identificarea tulpinilor biotip pot include hsp60 sau secvenţe repetitive cum ar fi BOX, ERIC, (GTG)s, sau REP sau [23]. Tulpinile biotip pot avea secvenţe cu cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identitate de secvenţă cu secvenţa corespunzătoare a bacteriei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382.

În anumite realizări, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are un genom cu identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189. În realizările preferate, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are un genom cu cel puţin 90% identitate de secvenţă (de exemplu cel puţin 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identitate de secvenţă) cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de- a lungul a cel puţin 60% (de exemplu cel puţin 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100%) din SEQ ID NO:10 din WO2018229189. De exemplu, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie poate avea un genom cu cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 70% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 80% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 90% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 100% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 70% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 80% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 90% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 100% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 98% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 70% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 98% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 80% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 98% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 90% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189, sau cel puţin 98% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:10 din WO2018229189 de-a lungul a 100% din SEQ ID NO:10 din WO2018229189.

Alternativ, tulpinile care sunt biotipuri de bacterii depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 şi care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie pot fi identificate prin utilizarea analizei fragmentului de depozit şi restricţie cu numărul de acces NCIMB 42382 şi/sau analizei PCR, de exemplu prin utilizarea polimorfismului cu lungimea fragmentului amplificată fluorescent (FAFLP) şi a amprentei (rep)-PCR a elementului ADN repetitiv, sau a profilului proteinei, sau a secvenţierii ADNr parţiale 16S sau 23S. În realizările preferate, astfel de tehnici pot fi utilizate pentru a identifica alte tulpini Parabacteroides distasonis.

În anumite realizări, tulpinile care sunt biotipuri de bacterii depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 şi care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie sunt tulpini care furnizează acelaşi tipar ca bacteriile depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 când s-au analizat prin analiză de restricţie ADN ribozomală amplificată (ARDRA), de exemplu când se utilizează enzima de restricţie Sau3AI (pentru exemple de metode şi ghidări vezi, de exemplu [24]). Alternativ, tulpinile biotip sunt identificate ca tulpini care au aceleaşi tipare de fermentare a carbohidraţilor ca bacteriile depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382.

Alte tulpini Parabacteroides care sunt utile în compoziţiile şi metodele invenţiei, cum ar fi biotipurile de bacterii depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382, pot fi identificate utilizând orice metodă sau strategie adecvată, inclusiv testele descrise în exemple. De exemplu, tulpinile pentru utilizare în invenţie pot fi identificate prin cultivare cu celule neuroblastom şi apoi evaluȃnd nivelurile citokinelor şi nivelurile de neuroprotecţie sau neuroproliferare. În particular, tulpinile bacteriene care au tipare de creştere similare, antigeni de tip metabolic şi/sau de suprafaţă cu bacteriile depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 pot fi utile în invenţie. O tulpină utilă va avea activitate modulatoare imună comparabilă cu tulpina NCIMB 42382. În particular, o tulpină biotip va declanşa efecte comparabile asupra modelelor neurodegenerative de boală şi efecte comparabile asupra nivelurilor citokinelor cu efectele prezentate în exemple, care pot fi identificate prin utilizarea protocoalelor de cultivare şi administrare descrise în exemple.

O tulpină în special preferată divulgată aici este tulpina Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382. Acesta este exemplul de tulpină 755 testat în exemple şi prezentat a fi eficient pentru tratarea bolii. Prin urmare, divulgarea furnizează o celulă, cum ar fi o celulă izolată, de tulpină Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382, sau un derivat al acesteia. Divulgarea furnizează de asemenea o compoziţie cuprinzând o celulă de tulpină Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382, sau un derivat al acesteia. Divulgarea furnizează de asemenea o cultură biologic pură de tulpină Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382. Invenţia furnizează de asemenea o celulă de tulpină Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382, pentru utilizare în terapie pentru bolile descrise aici.

Un derivat al tulpinei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 poate fi o tulpină fiică (descendentă) sau o tulpină cultivată (subclonată) din original. Un derivat de tulpină al invenţiei poate fi modificat, de exemplu la nivel genetic, fără ablaţia activităţii biologice. În particular, o tulpină derivată a invenţiei este activă terapeutic. O tulpină derivată va avea activitate modulatoare imună comparabilă cu tulpina NCIMB 42382 originală. În particular, o tulpină derivată va declanşa efecte comparabile pe modelele de boli neurodegenerative şi efecte comparabile pe nivelurile citokinelor cu efectele prezentate în exemple, care pot fi identificate prin utilizarea protocoalelor de cultivare şi administrare descrise în exemple. Un derivat al tulpinei NCIMB 42382 va fi în general un biotip de tulpină NCIMB 42382.

Referirile la celulele de tulpină Parabacteroides distasonis depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382 cuprind orice celule care au aceleaşi caracteristici de siguranţă şi eficacitate terapeutică ca tulpinile depozitate sub numărul de acces NCIMB 42382, şi astfel de celule sunt cuprinse în invenţie.

În realizările preferate, tulpinile bacteriene din compoziţiile invenţiei sunt viabile şi capabile de colonizarea parţială sau totală a intestinului.

Inventatorii au descoperit că tulpinile Parabacteroides distasonis reduc secreţia de citokine proinflamatorii cum ar fi IL-6 şi IL-8. IL-8 au fost implicate în formarea tecii de mielină. Inflamaţie cronică indusă de IL-6 poate conduce în final la moartea celulei. Prin urmare, tulpinile bacteriene ale invenţiei sunt în special utile în tratamentul sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative. În unele realizări, tulpinile bacteriene sunt utile în tratamentul afecţiunilor caracterizate prin activarea sporită de IL-6. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea bolilor neurodegenerative caracterizate prin demielinare. Multe boli neurodegenerative sunt caracterizate de demielinare. Demielinarea împiedică propagarea de acţiune potenţială cu neuronii, afectȃnd comunicaţia eficientă în sistemul nervos. S-a arătat că IL-8 contribuie pozitiv la formarea şi repararea tecii de mielină. MRx0029 creşte per se secreţia de IL-8. Prin urmare, compoziţiile invenţiei sunt în special benefice în tratamentul sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative caracterizate prin demielinare.

Inventatorii au descoperit de asemenea că tulpinile bacteriene ale invenţiei cresc activarea de BDNF. BDNF este un factor neurotrofic de creştere care s-a dovedit că sporeşte diferenţierea şi supravieţuirea neuronilor. Astfel, compoziţiile invenţiei pot fi utilizate într-o metodă de amplificare a supravieţuirii celulei nervoase în tratamentul sau prevenirea bolilor neurodegenerative.

O bacterie suplimentară care poate fi utilizată în compoziţiile invenţiei este specia Megasphaera massiliensis. Exemplele demonstrează că Parabacteroides distasonis şi Megasphaera massiliensis au ambele activităţi neuroprotectoare, dar produc metaboliţi diferiţi şi pot avea mecanisme de acţiune diferite şi activităţi neuroprotectoare specifice. Prin urmare, aceste specii pot fi în special eficiente când sunt utilizate în combinaţie. În realizările preferate, compoziţia cuprinde o tulpină a speciilor Parabacteroides distasonis şi o tulpină a speciilor Megasphaera massiliensis.

Bacteria Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382 a fost testată în exemple şi este de asemenea cea la care se face referire în acest document ca tulpină MRx0005. MRX0005, MRX005, MRx005 şi MRx0005 sunt utilizate aici interschimbabil. O secvenţă ARNr 16S pentru tulpina MRx0005 care a fost testat este prevăzută în SEQ ID NO:9. Tulpina MRx0005 a fost depozitată cu autoritatea de depozitare internaţională NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland) de GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland) pe 12 martie 2015 ca „Parabacteroides sp 755» şi i-a fost asigat numărul de acces NCIMB 42382. GT Biologics Ltd. şi-a modificat ulterior numele în 4D Pharma Research Limited.

Tulpina Megasphaera massiliensis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42787 este exemplul de tulpină MRx0029 testat în exemple şi prezentată a fi eficientă pentru tratarea bolii. Tulpina NCIMB 42787 a fost depozitată cu autoritatea de depozitare internaţională NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland) de 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland) pe 26 iulie 2017 ca „Megasphaera massiliensis MRx0029» şi i-a fost asignat numărul de acces NCIMB 42787. Prin urmare, divulgarea furnizează o celulă, cum ar fi o celulă izolată, de tulpină Megasphaera massiliensis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42787, sau un derivat al acesteia. Divulgarea furnizează de asemenea o compoziţie cuprinzând o celulă de tulpină Megasphaera massiliensis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42787, sau un derivat al acesteia. Divulgarea furnizează de asemenea o cultură biologic pură de tulpină Megasphaera massiliensis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42787. Divulgarea furnizează de asemenea o celulă de tulpină Megasphaera massiliensis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42787, sau un derivat al acesteia, pentru utilizare în terapie, în particular pentru bolile descrise aici.

În unele realizări, divulgarea furnizează o compoziţie cuprinzând tulpina depozitată la NCIMB sub numărul de acces NCIMB 42787, sau un derivat sau biotip al acesteia, şi tulpina depozitată la NCIMB sub numărul de acces NCIMB 42382, sau un derivat sau biotip al acesteia, preferabil pentru utilizare în terapie, preferabil pentru utilizare în tratarea unei boli neurodegenerative cum ar fi boala Parkinson.

Utilizări terapeutice

După cum s-a demonstrat în exemple, compoziţiile bacteriene ale invenţiei sunt eficiente pentru tratarea tulburărilor neurodegenerative. În particular, tratamentul cu compoziţiile invenţiei creştere neuroproliferarea şi acţionează ca neuroprotector împotriva agenţilor care distrug neuronii dopaminergici. Prin urmare, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative care sunt rezultatul morţii neuronilor.

Compoziţiile invenţiei pot scade activarea promotorului NFκB, care activează producţia de citokine, de exemplu IL-1β, IL-1α, IL-18, TNFα şi IL-6. Tratarea celulelor cu α-sinucleină mutantă este un model pentru Parkinsonul familial. O mutaţie punctuală la poziţia 53 din adenină la treonină conduce la plierea greşită a α-sinucleinei. α-sinucleina pliată incorect se agregă ulterior în fibrile insolubile care formează corpi Lewy. Prin urmare, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative care sunt rezultatul neuroinflamaţiei, plierii inadecvate a proteinei şi/sau expunerii la mediu. Compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru tratamentul Parkinsonului familial. Activarea promotorului NFκB este mediată prin ligandul TLR4. TL4 este cunoscut pentru medierea morţii celulei pe modelul MPTP la şoarece, care simulează boala Parkinson. Compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru a inhiba abilitatea de semnalizare TLR4 pentru a activa promotorul NFκB. De o relevanţă particulară pentru PD, ambii TLR2 şi TLR4 au fost găsiţi ca fiind reglaţi pozitiv în creierele pacienţilor cu PD [25]. Mai mult, α-syn a fost descris ca ligand pentru TLR2 [26] şi am demonstrat că α-syn este de asemenea un ligand pentru TLR4 utilizând celule HEK-TLR4.

Compoziţiile invenţiei scad secreţia de citokine proinflamatorii cum ar fi IL-6, care poate fi indusă de lipopolizaharidă (LPS). Tratamentul celulelor cu LPS simulează Parkinsonul cauzat de factori din mediu. Compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru a scădea secreţia de IL-6. Compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru tratamentul Parkinsonului din mediu.

S-a postulat că cemokinele au funcţii importante în sistemul nervos central (CNS), în plus faţă de rolul lor principal de migraţie direcţională a leucocitelor. Într-o linie celulară de tip precursor de oligodendrocite murine cemokinele MCP-1 nu au crescut proliferarea precursorului de oligodendrocite. În culturile de mielinare primară MCP-1 nu a sporit formarea segmentului de mielină în acest sistem. Inventatorii au descoperit că MRx0005 promovează nivelurile MCP-1. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în creşterea nivelurilor MCP-1 în tratamentul bolii.

Bolile neurodegenerative pentru a fi tratate cu compoziţiile invenţiei includ: boală Parkinson, inclusiv paralizie supranucleară progresivă, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicament; boală Alzheimer, inclusiv sindrom Benson; boală Huntington; scleroză laterală amiotrofică; boală Lou Gehrig; boală a neuronului motor; boală prion; ataxie spinocerebrală; atrofie musculară spinală; demenţă, incluzând corpi Lewy, demenţă vasculară şi frontotemporală; afazie progresivă primară; depreciere cognitivă uşoară; depreciere cognitivă asociată cu HIV, şi degenerare corticobazală. O boală neurodegenerativă suplimentară pentru a fi tratată cu compoziţiile divulgate aici este neuropatia inflamatorie progresivă.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot fi eficiente pentru tratarea tulburărilor neurodegenerative care apar la pacienţii în vîrstă. Exemplele arată că compoziţiile invenţiei pot tratata boala Parkinson care este predominant diagnosticată la pacienţii peste 65 ani. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru tratarea pacienţilor de 65 ani sau mai în vȃrstă. În alte anumite realizări, pacienţii sunt între 40 până la 65 ani. În alte realizări, pacienţii sunt mai în vȃrstă de 40 ani. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei boli asociate cu vârsta înaintată, de exemplu, o boală diagnosticată după vȃrsta de 50 ani.

În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în tratarea unei tulburări neurodegenerative mediate sau caracterizate de acumularea de proteină, în particular de proteină pliată greşit.

În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în tratarea unei tulburări neurodegenerative asociate cu pierderea neuronală a materiei gri. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru tratarea unei tulburări neurodegenerative care nu este asociată cu leziunile materiei albe.

În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în tratarea unei tulburări neurodegenerative asociate cu simptome permanente.

În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în tratarea unei tulburări neurodegenerative care nu este o tulburare autoimună. În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în tratarea unei tulburări neurodegenerative care nu este scleroză multiplă.

În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în reducerea morţii neuronilor, în particular, în tratamentul tulburărilor neurodegenerative. În anumite realizări, compoziţiile divulgate în acest document sunt pentru utilizare în protejarea neuronilor, în particular în tratamentul tulburărilor neurodegenerative.

Proprietăţile neuroprotectoare ale compoziţiilor invenţiei, aşa cum se arată în exemple, înseamnă că, compoziţiile pot fi în special eficiente pentru prevenirea sau întârzierea debutului sau progresului tulburărilor neurodegenerative. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în întȃrzierea debutului sau progresului unei tulburări neurodegenerative.

Compoziţiile invenţiei pot creşte secreţia de IL-8. S-a arătat că IL-8 joacă un rol în mielinarea neuronală. În unele realizări, compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru a creşte secreţia de IL-8.

Compoziţiile terapeutice ale invenţiei pot creştere activarea de BDNF. BDNF acţionează pe anumiţit neuroni ai sistemului nervos central pentru a susţine supravieţuirea neuronilor existenţi şi ajuta la creşterea şi dezvoltarea de noi neuroni şi sinapse. BDNF este activ în hipocampus, cortex şi antecreierul bazal, şi este important pentru memoria pe termen lung. Compoziţiile invenţiei pot fi prin urmare utilizate pentru a creşte secreţia de BDNF. Compoziţiile pot fi prin urmare utilizate în tratamentul bolilor neurodegenerative asociate cu deprecierea memoriei pe termen lung. Compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru îmbunătăţirea memoriei pe termen lung, în particular pentru îmbunătăţirea memoriei pe termen lung care este alterată de o boală neurodegenerativă.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei cresc activitatea metabolică a mitocondriilor în celulele neuronale.

Modularea axei microbiotă-intestin-creier

Comunicaţia între intestin şi creier (axa microbiotă-intestin-creier) are loc printr-un sistem de comunicaţie neurohumoral bidirecţional. Dovezi recente arată că microbiota care rezidă în intestin poate modula dezvoltarea creierului şi produce fenotipuri comportamentale prin axa microbiotă-intestin-creier. Într-adevăr, un număr de revizii sugerează un rol al axei microbiotă-intestin-creier în menţinerea funcţionalităţii sistemului nervos central şi au implicat disfuncţia axei microbiotă-intestin-creier în dezvoltarea tulburărilor şi afecţiunilor sistemului nervos central [16-27].

Comunicaţia bidirecţională între creier şi intestin (adică axa -intestin-creier) include sistemul nervos central, sistemele neuroendocrine şi neuroimunitare, incluzând axa hipotalamus-pituitar-adrenal (HPA), braţele simpatice şi parasimpatice ale sistemului nervos autonom (ANS), inclusiv sistemul nervos enteric (ENS) şi nervul vag, şi microbiota intestinală.

După cum s-a demonstrat în exemple, compoziţiile prezentei invenţii pot modula axa microbiotă-intestin-creier şi reduce moartea celulei asociate cu tulburările neurodegenerative. Corespunzător, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative, în particular a acelor tulburări şi afecţiuni asociate cu disfuncţia axei microbiotă-intestin-creier.

Compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea unei boli sau afecţiuni selectate din grupul constând din: boală Parkinson, inclusiv paralizie supranucleară progresivă, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicamente; boală Alzheimer, inclusiv sindrom Benson; boală Huntington; scleroză laterală amiotrofică; boală Lou Gehrig; boală a neuronului motor; boală prion; ataxie spinocerebrală; atrofie musculară spinală; demenţă; incluzând corpi Lewy; demenţă vasculară şi frontotemporală; afazie progresivă primară; depreciere cognitivă uşoară; depreciere cognitivă asociată cu HIV şi degenerare corticobazală.

Compoziţiile invenţiei pot fi în special utile pentru tratarea sau prevenirea bolii cronice, tratarea sau prevenirea bolii la pacienţii care nu au răspuns la alte terapii (cum ar fi tratamentul cu Levodopa, agonişti de dopamină, inhibitori MAO-B, inhibitori COMT, antagonişti Glutamat, şi/sau anticolinergice), şi/sau tratarea sau prevenirea deteriorării ţesutului şi simptomele asociate cu disfuncţia axei microbiotă-intestin-creier.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează CNS. În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează sistemul nervos autonom (ANS). În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează sistemul nervos enteric (ENS). În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează axa hipotalamică, pituitară, adrenală (HPA). În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează calea neuroendocrină. În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează calea neuroimună. În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează CNS, ANS, ENS, axa HPA şi/sau căile neuroendocrine şi neuroimune. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de metaboliţi comensali şi/sau permeabilitatea gastrointestinală a unui subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot fi utilizate pentru a modula sistemul dopaminergic.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de către sistemele neurale. Corespunzător, în unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea în sistemele neurale. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea sistemului nervos central. În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea în neuronii senzoriali. În alte realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea în neuronii motori. În unele realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea în ANS. În unele realizări, ANS este sistemul nervos parasimpatic. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea nervului vag. În alte realizări, ANS este sistemul nervos simpatic. În alte realizări, compoziţiile invenţiei modulează semnalizarea în sistemul nervos enetric. În anumite realizări, semnalizarea neuronilor ANS şi ENS răspunde direct la conţinuturile luminale ale tractului gastrointestinal. În alte realizări, semnalizarea neuronilor ANS şi ENS răspunde indirect la substanţele neurochimice produse de bacteria luminală. În alte realizări, semnalizarea neuronilor ANS şi ENS răspunde la substanţele neurochimice produse de bacteria luminală sau de celulele enteroendocrine. În anumite realizări preferate, neuronii aferenţilor vagali care activează ENS, influenţează funcţiile CNS. În unele realizări, compoziţiile invenţiei reglează activitatea celulelor enterocromafine.

Boli neurodegenerative

Tauopatiile sunt boli neurodegenerative asociate cu agregarea patologică a proteinei tau în încȃlcirile neurofibriliare sau gliofibriliare din creierul uman. Boala Alzheimer este un exemplu al unei tauopatologii. Sinucleinopatiile (denumite de asemenea α-Sinucleinopatii) sunt boli neurodegenerative caracterizate prin acumularea anormală de agregate de α-sinucleină în neuroni, fibre nervoase sau celule gliale. Boala Parkinson este un exemplu al unei sinucleinopatologii.

Există suprapunere clinică şi patologică între aceste două patologii. Pacienţii cu boală Parkinson au frecvent demenţă şi pacienţii cu boală Alzheimer manifestă adesea parkinsonism [28]. De exemplu, paralizia supranucleară progresivă (cunoscută de asemenea ca sindrom Steele-Richardson-Olszewski) are o tauopatologie, dar conduce de asemenea la parkinsonism proeminent [29]. Mutaţiile în LRRK2 cunoscute că cauzează parkinsonism sunt asociate cu acumularea de sinucleină, tau, nici una, sau ambele proteine [30].

Boala cu corpi Lewy (LBD) este o boală neurodegenerativă care este una dintre cauzele cele mai comune de demenţă la vârstnici. LBD exemplifică existenţa unui continuu între patologiile tau şi sinucleină. LBD partajează caracteristicile clinice şi patologice cu boala Parkinson, demenţa bolii Parkinson şi boala Alzheimer [28].

În realizări particulare, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea tauopatiilor şi/sau sinucleinopatiilor. În realizări particulare, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea tauopatiilor. În realizări particulare, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea sinucleinopatiilor. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea unei boli sau afecţiuni selectate din grupul constând din: boală Parkinson, inclusiv paralizia supranucleară progresivă, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicamente; boală Alzheimer, inclusiv sindrom Benson; şi demenţă; incluzând corpi Lewy; demenţă vasculară şi frontotemporală.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea bolii Parkinson, inclusiv a paraliziei supranucleare progresive, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicamente. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea bolii Alzheimer, inclusiv sindrom Benson. În alte realizări preferate, compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea demenţei; incluzând corpi Lewy; demenţă vasculară şi frontotemporală.

Boala Parkinson

Boala Parkinson este o boală neurodegenerativă comună caracterizată neuropatologic prin degenerarea populaţiilor eterogene de celule neurale (celule producătoare de dopamină). Diagnosticul clinic al bolii Parkinson necesită bradikinezie şi cel puţin unul dintre următoarele simptome cheie: tremur în repaus; rigiditate musculară şi deprecierea reflexelor posturale. Alte semne şi simptome care pot fi prezente sau dezvoltate în timpul progresului bolii sunt tulburările autonome (sialoree, seboree, constipaţie, tulburări de micţiune, funcţionare sexuală, hipotensiune ortostatică, hiperhidroză), tulburări de somn şi tulburări în sens de miros sau în sens de temperatură. Boala Parkinson este o boală neurodegenerativă care se poate dezvolta sau persista din cauza disfuncţiei axei microbiotă-intestin-creier. Prin urmare, în realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea sau prevenirea bolii Parkinson la un subiect.

În alte realizări preferate, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii Parkinson. Compoziţiile cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides pot îmbunătăţi funcţiile motoare şi cognitive în modele bolii Parkinson. Tratamentul cu tulpini Parabacteroides poate modula semnalizarea în sistemele nervoase central, autonomic şi enteric; poate modula activitatea căii axei HPA; poate modula căile neuroendocrine şi/sau neuroimune; şi poate modula nivelurile de metaboliţi comensali, markeri inflamatori şi/sau permeabilitatea gastrointestinală a unui subiect, din care toate sunt implicate în neuropatologia bolii Parkinson. În realizările preferate, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană a speciilor Parabacteroides distasonis pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii Parkinson. Compoziţiile utilizând Parabacteroides distasonis pot fi în special eficiente pentru tratarea bolii Parkinson.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează unul sau mai multe simptome ale bolii Parkinson la un subiect. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează unul sau mai multe simptome cheie ale bolii Parkinson la un subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează bradikinezia la un subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează tremurul în repaus; rigiditatea musculară şi/sau deprecierea reflexelor posturale la un subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează unul sau mai multe simptome asociate cu progresul bolii Parkinson selectat dintre perturbările autonome (sialoree, seboree, constipaţie, tulburări de micţiune, funcţionare sexuală, hipotensiune ortostatică, hiperhidroză), perturbări de somn şi perturbări în sens de miros sau în sens de temperatură.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează simptomele depresive comorbide cu boala Parkinson. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc memoria verbală şi/sau funcţiile executive. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc atenţia, memoria de lucru, fluenţa verbală şi/sau anxietatea.

În alte realizările preferate, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează disfuncţiile cognitive comorbide cu boala Parkinson.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează progresul bolii Parkinson. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează complicaţiile motoare mai târzii. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează fluctuaţiile motoare mai tȃrzii. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează pierderea neuronală. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele de demenţă ale bolii Parkinson (PDD). În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează deprecierea funcţiei executive, atenţiei şi/sau memoriei de lucru. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc neurotransmiterea dopaminergică. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează neurotransmiterea dopaminergică alterată.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele bolii Parkinson în conformitate cu o scală simptomatică sau de diagnoză. În anumite realizări, testele pentru evaluarea îmbunătăţirii simptomatice a funcţionării motoare în boala Parkinson este Scala de Notare Unificată a Bolii Parkinson. În particular, UPDRS II ia în considerare activitatea vieţii zilnice şi UPDRS III ia în considerare examinarea motoare.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele asociate PDD în conformitate cu un test şi/sau scală simptomatice sau de diagnoză. În anumite realizări, testul sau scala sunt selectate dintre Testul de Învăţare Verbală Hopkins - Revizuit (HVLT-R); Sistemul Funcţiei Executive Delis-Kaplan (D-KEFS) Testul de Interefrenţă Culoare-Cuvânt; Scala de Notare a Depresiei Hamilton (HAM-D 17; depresie); Scala de Notare a Anxietăţii Hamilton (HAM-A; anxietate) şi Scala de Notare Unificată a Bolii Parkinson (UPDRS; severitatea simptomului PD).

În unele realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc scala de Impresie Clinică Globală - Îmbunătăţire Globală (CGI-I) pentru evaluare psihiatrică şi tulburări neurologice. În unele realizări, compoziţiile invenţiei afişează un efect pozitiv asupra deprecierii sociale globale şi ocupaţionale a subiectului cu boală Parkinson.

Boala Alzheimer şi demenţa

În DSM-5, termenul demenţă a fost înlocuit cu termenii tulburare neurocognitivă majoră şi tulburare neurocognitivă uşoară. Tulburarea neurocognitivă este o clasă eterogenă de boli psihiatrice. Cea mai comună tulburare neurocognitivă este boala Alzheimer, urmată de demenţa vasculară sau forme amestecate ale celor două. Alte forme de tulburări neurodegenerative (de exemplu boală cu corpi Lewy, demenţă frontotemporală, demenţă Parkinson, boală Creutzfeldt-Jakob, boală Huntington, şi sindrom Wernicke-Korsakoff) sunt însoţite de demenţă.

Boala Alzheimer şi demenţa sunt de asemenea caracterizate prin pierdere neuronală, astfel că efectele neuroprotectoare şi neuroproliferative prezentate în exemple pentru compoziţiile invenţiei au indicat că ele pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea acestor afecţiuni.

Criteriile simptomatice pentru demenţa sub DSM-5 sunt dovada scăderii cognitive semnificative de la un nivel de performanţă anterior în unul sau mai multe domenii cognitive selectate dintre: învăţare şi memorie; limbaj; funcţie executivă; atenţie complexă; cogniţie perceptual-motoare şi socială. Deficitul cognitiv trebuie să interfere cu independenţa în activităţile zilnice. În plus, deficitul cognitiv nu apare exclusiv în contextul unui delir şi nu este mai bine explicat de o altă tulburare mentală (de exemplu MDD sau schizofrenie).

În plus faţă de simptomul primar, subiecţii cu tulburări neurodegenerative afişează simptome comportamentale şi psihiatrice incluzând agitare, agresiune, depresie, anxietate, apatie, psihoză şi tilburări în ciclul somn-veghe.

Tulburările neurodegenerative se pot dezvolta sau persista din cauza disfuncţiei axei microbiotă-intestin-creier. Prin urmare, în realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative la un subiect. În realizările preferate, tulburarea neurodegenerativă este boala Alzheimer. În alte realizări, tulburarea neurodegenerativă este selectată dintre demenţă vasculară; forme amestecate de boală Alzheimer şi demenţă vasculară; boală cu corpi Lewy; demenţă frontotemporală; demenţă Parkinson; boală Creutzfeldt-Jakob; boală Huntington; şi sindrom Wernicke-Korsakoff.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează unul sau mai multe simptome ale tulburărilor neurodegenerative la un subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează apariţia scăderii cognitive la un subiect. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc nivelul de performanţă al unui subiect cu tulburări neurodegenerative în unul sau mai multe domenii cognitive selectate dintre: învăţare şi memorie; limbaj; funcţie executivă; atenţie complexă; cogniţie perceptual-motoare şi socială. În unele realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează apariţia unuia sau mai multor simptome comportamentale şi psihiatrice asociate cu tulburările neurodegenerative selectate dintre agitare, agresiune, depresie, anxietate, apatie, psihoză şi tulburări ale ciclului somn-veghe.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn, reduc sau atenuează boala simptomatică prin intervenţia în mecanismele patogene suspectate la un stadiu preclinic. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc modificarea bolii, cu încetinirea sau oprirea progresului simptomului. În unele realizări, încetinirea sau oprirea progresului simptomului se corelează cu dovada de întȃrziere a procesului neuropatologic de bază. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele tulburărilor neurodegenerative cuprinzând sporirea cognitivă şi înbunătăţirea funcţională. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele comportamentale şi psihiatrice de demenţă (BPSD).

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc abilitatea unui subiect cu tulburare neurodegenerativă de a întreprinde activităţi zilnice.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc atȃt cogniţia cȃt şi funcţionarea la un subiect cu boală Alzheimer. În unele realizări, compoziţia invenţiei îmbunătăţeşte obiectivul cognitiv la un subiect cu boală Alzheimer. În unele realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc obiectivul funcţional la un subiect cu boală Alzheimer. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc obiectivele cognitive şi funcţionale la un subiect cu boală Alzheimer. În încă alte realizări preferate, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc răspunsul clinic global (obiectivul global) la un subiect cu boală Alzheimer.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc simptomele tulburărilor neurodegenerative în conformitate cu un test simptomatic sau de diagnoză. În anumite realizări, testele pentru evaluarea simptomatică a îmbunătăţirii bolii Alzheimer (şi a altor tulburări neurodegenerative) sunt selectate dintre obiectivul cognitiv, activităţile vieţii zilnice, evaluarea globală a modificării, teste de calitatea vieţii asociate cu sănătatea şi teste de evaluare comportamentală şi simptome psihiatrice de tulburări neurodegenerative.

În anumite realizări, testele obiectivului cognitiv pentru evaluarea îmbunătăţirii simptomatice utilizează subscala cognitivă a Scalei de Evaluare a Bolii Alzheimer (ADAS-cog) şi scala ADAS clasică. În anumite realizări, înbunătăţirea simptomatică a cogniţiei este evaluată utilizând Bateria de Teste Neurofiziologice pentru utilizare în boala Alzheimer (NTB).

În unele realizări, evaluarea globală a testelor de modificare utilizează scala de Impresie Clinică Globală - Îmbunătăţire Globală (CGI-I) pentru evaluare psihiatrică şi tulburări neurologice. În unele realizări, scala globală este Impresia pe Bază de Interviu a Clinicianului a Modificării plus (CIBIC-plus). În unele realizări, scala globală este Impresia Globală a Unităţii de Studiu Cooperativ al Bolii Alzheimer a Clinicianului a Modificării (ADCS-CGIC).

În anumite realizări, măsurătorile de calitate a vieţii asociată cu sănătatea sunt QOL asociată cu Boala Alzheimer (ADRQL) şi QOL Bolii Alzheimer (QOL-AD).

În anumite realizări, testele de evaluare a simptomelor comportamentale şi psihiatrice ale tulburărilor neurodegenerative sunt selectate dintre patologia comportamentală în Scala de Notare a Bolii Alzheimer (BEHAVE-AD); Scala de Notare Comportamentală pentru Demenţă (BRSD); Inventarul Neuropsihiatric (NPI); şi Inventarul de Agitare Cohen-Mansfield (CMAI).

În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt în special eficiente la prevenirea, reducerea sau atenuarea tulburărilor neurodegenerative când sunt utilizate în combinaţie cu o altă terapie pentru tratarea tulburărilor neurodegenerative. În anumite realizări, astfel de terapii includ inhibitori acetilcolinesterază incluzând donepezil (Aricept®), galantamină (Razadyne®) şi rivastigmină (Exelon ®), şi memantină.

Factori neurochimici, neuropeptide şi neurotransmiţători şi axa microbiotă-intestin-creier

Cum s-a evidenţiat mai sus, axa microbiotă-intestin-creier este modulată de către un număr de diferite sisteme fiziologice. Axa microbiotă-intestin-creier este modulată de către un număr de molecule de semnalizare. Alterările în nivelurile acestor molecule de semnalizare conduc la boli neurodegenerative. Experimentele efectuate de inventatori au indicat că administrarea de specii Parabacteroides, şi în particular Parabacteroides distasonis, poate modula nivelurile de indol şi kinurenine. Dereglarea acestor metaboliţi poate conduce la boli neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de monoamine ale creierului şi metaboliţii acestora. În realizările preferate metabolitul este kinurenina. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează kinurenina, care este principala cale de metabolism a triptofanului, care serveşte ca cale de producţie a dinucleotidei adenină nicotinamidă (NAD+). Kinureninele pot fi metabolizate la compuşi neuroactivi cum ar fi acidul kinurenic (KYNA) şi 3-hidroxi-1-kinurenina (3-OH-1-KYN), şi în etape suplimentare la acidul chinolinic (QUIN). Dereglarea căii kinurenine poate conduce la activarea sistemului imunitar şi la acumularea de compuşi potenţial neurotoxici. Alterările în metabolismul kinureninelor pot fi implicate în dezvoltarea bolii Parkinson. S-a demonstrat că nivelurile de kinurenine sunt scăzute în cortexul frontal, putamen şi substantia nigra pars compacta ale pacienţilor cu PD [31]. Prin urmare, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în creşterea nivelurilor de kinurenine în tratamentul bolii Parkinson.

În anumite realizări ale invenţiei, compoziţiile invenţiei pot creşte nivelurile de kinurenină. S-a demonstrat că nivelurile crescute de kinurenină atenuează moartea celulei neuronale indusă de MPP+- in vitro într-o linie celulară neuroblastom dopaminergică umană [32]. În anumite realizări kinurenina şi acidul kinurenic, pot activa receptorul de hidrocarbură aril GI (Ahr) şi receptorii GPR35. Activarea receptorului Ahr induce producţia de IL-22, care poate inhiba inflamaţia locală. Activarea GPR35 induce producţia de inozitol trifosfat şi mobilizarea Ca2+.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de indol. În realizările preferate metabolitul este kinurenina. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează căile kinurenine, care constituie calea principală a metabolismului de triptofan.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de niveluri de factori neurochimici, neuropeptide şi neurotransmiţători. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de factori neurochimici, neuropeptide şi neurotransmiţători. Corespunzător, în anumite realizări preferate, compoziţiile invenţiei alterează direct biochimia CNS.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de niveluri de acid γ-aminobutiric (GABA). Corespunzător, în realizările preferate, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de GABA. GABA este un neurotransmiţător inhibitor care reduce excitabilitatea neuronală. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei cresc nivelurile de GABA. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei scad nivelurile de GABA. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei alterează neurotransmiterea GABAergică. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelul de transcripţie GABA în diferite regiuni ale sistemului nervos central. În anumite realizări, derivatele comensale GABA traversează bariera hematoencefalică şi afectează direct neurotransmiterea. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei conduc la o reducere a GABA în hipocampus, amigdală şi/sau locus coeruleus. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei conduc la o creştere a GABA în regiunile corticale.

Răspuns imun

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de către alterările în răspunsul imun şi factori şi markeri inflamatori. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot modula răspunsul imun. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile sistemice ale moleculelor de semnalizare neuroimune în circulaţie. În anumite realizări preferate, compoziţiile invenţiei modulează producţia şi inflamaţia de citokine proinflamatorii. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează starea inflamatorie. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei scad producţia şi secreţia de IL-6. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei scad activarea promotorului NFκB. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt capabile să moduleze activarea producţiei de IL-6 prin lipopolizaharida endotoxină proinflamatorie potentă (LPS). În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt capabile să moduleze activarea promotorului NFκB prin proteine LPS şi α-sinucleină mutantă cum ar fi A53T. Nivelurile crescute în circulaţie de citokine sunt strâns asociate cu diferite tulburări neurodegenerative, incluzând Parkinson, demenţă şi Alzheimer. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în reducerea nivelurilor IL-6 şi/sau nivelurilor NFκB în tratamentul unei tulburări neurodegenerative.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei cresc secreţia de IL-8. S-a arătat că IL-8 induce formarea tecii de mielină şi reface sau conservă comunicaţia neuronală eficientă. Astfel, în unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în inducerea formării tecii de mielină în tratamentul bolilor neurodegenerative. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în refacerea comunicaţiei neuronale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în conservarea comunicaţiei neuronale.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de niveluri de metaboliţi comensali. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile sistemice de metaboliţi ai microbiotei. În anumite realizări preferate, compoziţiile invenţiei modulează nivelul de acizi graşi cu catenă scurtă (SCFA). În anumite realizări nivelul de SCFA este crescut sau scăzut. În unele realizări, SCFA este acidul butiric (BA) (sau butiratul). În unele realizări, SCFA este acidul propionic (PPA). În unele realizări, SCFA este acidul acetic. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează abilitatea SCFA de a traversa bariera hematoencefalică.

Acetilarea şi deacetilarea histonă sunt regulatori epigenetici importanţi ai expresiei genei. Un dezechilibru în acetilarea şi deacetilarea histonă poate conduce la apoptoză. Dereglarea de astfel de acetiltransferaze histone a fost implicată în patogeneza asociată cu bolile neurodegenerative asociate cu vârsta, cum ar fi boala Parkinson, boala Huntington, boala Alzheimer, scleroza laterală amiotrofică şi scăderea cognitivă [33]. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot modula activitatea de deacetilază histonă. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot reduce activitatea de deacetilază histonă. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot reduce activitatea de acetilază histonă.

Pacienţii cu boli neurodegenerative, incluzând boala Parkinson, boala Huntington, boala Alzheimer şi scleroza laterală amiotrofică, prezintă niveluri ridicate de peroxidare lipidă. Lipidele sunt vulnerabile la oxidare cu specii reactive de oxigen, şi creierul este bogat în acizi graşi polinesaturaţi. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot modula peroxidarea lipidă. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei poate reduce peroxidarea lipidă. Reducerea deteriorării oxidative cauzate de speciile reactive de oxigen poate fi utilizată pentru a ţinti din timp stadiile de boli neurodegenerative. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea stadiului timpuriu de neurodegenerare. De asemenea corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în prevenirea dezvoltării unei tulburări neurodegenerative. În astfel de realizări, compoziţiile invenţiei pot fi pentru utilizare la un pacient care a fost identificat cu risc de a dezvolta o tulburare neurodegenerativă.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de niveluri de permeabilitate gastrointestinale. Corespunzător, în unele realizări, compoziţiile invenţiei alterează integritatea epiteliului tractului gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează permeabilitatea tractului gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează funcţionarea barierei şi integritatea tractului gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează motilitatea tractului gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează translocarea metaboliţilor comensali şi moleculelor inflamatorii de semnalizare în fluxul sanguin din lumenul tractului gastrointestinal.

Semnalizarea axei microbiotă-intestin-creier este modulată de către compoziţia microbiomei în tractul gastrointestinal. Corespunzător, în anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează compoziţia microbiomei tractului gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn disbioza microbiomei şi creşterea asociată în metaboliţi toxici (de exemplu LPS). În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile de Clostridium în tractul gastrointestinal. În realizările preferate, compoziţiile invenţiei reduc nivelul de Clostridium în tractul gastrointestinal. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc nivelurile de Campilobacter jejuni. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează proliferarea de bacterii anaerobe nocive şi producţia de neurotoxine produsă de aceste bacterii. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile microbiome de Lactobacillus şi/sau Bifidobacterium. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei modulează nivelurile microbiome de Sutterella, Prevotella, Ruminococcus genera şi/sau ale familiei Alcaligenaceae. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei cresc nivelul de Lactobacillus plantarum şi/sau Saccharomyces boulardii.

Leziunea creierului

Exemplele demonstrează că compoziţiile invenţiei sunt neuroprotectoare şi au activitate inhibitoare HDAC. HDAC2 este o ţintă crucială pentru recuperarea funcţională dintr-un accident vascular cerebral [34] şi inhibarea HDAC poate preveni leziunea materiei albe [35], astfel încȃt compoziţiile invenţiei pot fi utile în tratamentul leziunii creierului.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului. În unele realizări, leziunea creierului este o leziune traumatică a creierului. În unele realizări, leziunea creierului este o leziune a creierului dobândită. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă din traumă. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă dintr-o tumoare. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă dintr-un accident vascular cerebral. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă dintr-o hemoragie a creierului. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă din encefalită. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă din hipoxie cerebrală. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului care rezultă din anoxie cerebrală.

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral. Efectele prezentate în exemple sunt în special relevante pentru tratamentul unui accident vascular cerebral. Accidentul vascular cerebral are loc când curgerea sângelui la cel puţin o parte din creier este întreruptă. Fără o alimentare adecvată cu sânge pentru a furniza oxigen şi nutrienţi la ţesutul cerebral şi pentru a îndepărta deşeurile produse din ţesutul cerebral, celulele creierului încep rapid să moară. Simptomele accidentului vascular cerebral sunt dependente de regiunea creierului care este afectată de curgerea inadecvată a sângelui. Simptomele includ paralizie, amorţeală sau slăbiciune a muşchilor, pierderea echilibrului, ameţeală, dureri bruşte severe de cap, deprecierea vorbirii, pierderea memoriei, pierderea abilităţii de motivare, confuzie bruscă, deprecierea vederii, comă sau chiar moarte. Un accident vascular cerebral este de asemenea referit ca atac cerebral sau accident cerebrovascular (CVA). Simptomele accidentului vascular cerebral pot fi scurte dacă curgerea adecvată a sângelui este refăcută într-o perioadă scurtă de timp. Totuşi, dacă curgerea inadecvată a sângelui continuă pe o perioadă semnificativă de timp, simptomele pot fi permanente.

În unele realizări, accidentul vascular cerebral este ischemia cerebrală. Ischemia cerebrală rezultă când există o curgere insuficientă a sângelui la ţesuturile creierului pentru a îndeplini cererea metabolică. În unele realizări, ischemia cerebrală este ischemia cerebrală focală, adică localizată la o regiune specifică a creierului. În unele realizări ischemia cerebrală este ischemie cerebrală globală, adică cuprinzând o zonă largă a ţesutului cerebral. Ischemia cerebrală focală are loc în mod obişnuit când un vas cerebral devine blocat, fie parţial sau complet, reducȃnd fluxul de sânge la o regiune specifică a creierului. În unele realizări ischemia cerebrala focală este accidentul vascular cerebral ischemic. În unele realizări, accidentul vascular cerebral ischemic este trombotic, adică cauzat de o tromboză sau cheag de sânge, care se dezvoltă într-un vas cerebral şi restricţionează sau blochează curgerea sângelui. În unele realizări accidentul vascular cerebral ischemic este un accident vascular cerebral trombotic. În unele realizări, accidentul vascular cerebral ischemic este embolic, adică cauzat de o embolie, sau o masă neataşată care circulă prin fluxul sanguin şi restricţionează sau blochează curgerea sângelui la un loc distant faţă de punctul său de origine. În unele realizări accidentul vascular cerebral ischemic este un accident vascular cerebral embolic. Ischemia cerebrală globală are loc în mod obişnuit când curgerea sângelui la creier ca întreg este blocată sau redusă. În unele realizări ischemia cerebrală globală este cauzată de hipoperfuzie, adică din cauza şocului. În unele realizări ischemia cerebrală globală este un rezultat al unui stop cardiac.

În unele realizări subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o ischemie cerebrală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o ischemie cerebrală focală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un accident vascular cerebral ischemic. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un accident vascular cerebral trombotic. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un accident vascular cerebral embolic. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o ischemie cerebrală globală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit hipoperfuzie. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un stop cardiac.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea ischemiei cerebrale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea ischemiei cerebrale focale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral ischemic. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral trombotic. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral embolic. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea ischemiei cerebrale globale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea hipoperfuziei.

În unele realizări, accidentul vascular cerebral este accident vascular cerebral hemoragic. Accidentul vascular cerebral hemoragic este cauzat de sȃngerarea în, sau în jurul creierului conducând la umflarea, presiunea şi deteriorarea celulelor şi ţesuturilor creierului. Accidentul vascular cerebral hemoragic este în mod obişnuit un rezultat al unui vas de sȃnge slăbit care se rupe şi sȃngerează împrejurul creierului. În unele realizări, accidentul vascular cerebral hemoragic este o hemoragie intracerebrală, adică cauzată de sȃngerarea în ţesutul cerebral însuşi. În unele realizări hemoragia intracerebrală este cauzată de o hemoragie intraparenchimală. În unele realizări hemoragia intracerebrală este cauzată de o hemoragie intraventriculară. În unele realizări accidentul vascular cerebral hemoragic este o hemoragie subarahnoidă adică sȃngerare care apare în exteriorul ţesutului cerebral dar încă în cavitatea craniană. În unele realizări, accidentul vascular cerebral hemoragic este un rezultat al angiopatiei amiloide cerebrale. În unele realizări, accidentul vascular cerebral hemoragic este un rezultat al unui anevrism cerebral. În unele realizări, accidentul vascular cerebral hemoragic este un rezultat al malformării arteriovenoase cerebrale (AVM).

În unele realizări subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un accident vascular cerebral hemoragic. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o hemoragie intracerebrală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o hemoragie intraparenchimală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o hemoragie intraventriculară. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o hemoragie subarahnoidă. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit o angiopatie amiloidă cerebrală. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un anevrism cerebral. În unele realizări, subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un AVM cerebral.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral hemoragic. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei hemoragii intracerebrale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei hemoragii intraparenchimale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei hemoragii intraventriculare. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei hemoragii subarahnoide. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unei angiopatii amiloide cerebrale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unui naevrism cerebral. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea AVM cerebral.

Refacerea curgerii adecvate a sângelui la creier după o perioadă de întrerupere, deşi eficientă în atenuarea simptomelor asociate cu accidentul vascular cerebral, poate conduce paradoxal la deteriorarea în continuare a ţesutului cerebral. În timpul perioadei de întrerupere, ţesutul afectat suferă de lipsa oxigenului şi nutrienţilor, şi refacerea bruscă a curgerii sângelui poate conduce la inflamaţie şi deteriorare oxidativă prin inducerea de stres oxidativ. Aceasta este cunoscută ca leziune de reperfuzie, şi este bine documentată nu numai după accidentul vascular cerebral, ci şi de asemenea după un atac de cord sau altă deteriorare a ţesutului când alimentarea cu sânge se întoarce la ţesut după o perioadă de ischemie sau lipsă de oxigen. În unele realizări subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit de leziune de reperfuzie ca rezultat al accidentului vascular cerebral. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii de reperfuzie ca rezultat al accidentului vascular cerebral.

Un atac ischemic tranzitoriu (TIA), referit adesea ca miniaccident vascular cerebral, este un semnal de alarmă recunoscut pentru un accident vascular cerebral mai serios. Subiecţii care au suferit unul sau mai multe TIA sunt prin urmare la un risc mai mare de accident vascular cerebral. În unele realizări subiectul diagnosticat cu leziunea creierului a suferit un TIA. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea unui TIA. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului la un subiect care a suferit un TIA.

Presiunea sanguină ridicată, colesterolul marit în sânge, un istoric familial al accidentului vascular cerebral, boala de inimă, diabetul, anevrismele cerebrale, malformaţiile arteriovenoase, boala celulei seceră, vasculita, tulburările de sȃngerare, utilizarea unor medicamente antiinflamatoare nonsteroidiene (NSAID), fumatul, consumul unor cantităţi mari de alcool, utilizarea ilegală a medicamentelor, obezitatea, lipsa de activitate fizică şi o dietă nesănătoasă sunt toţi consideraţi a fi factori de risc pentru accidentul vascular cerebral. În particular, scăderea presiunii sanguine s-a dovedit a fi conclusivă pentru a preveni atȃt accidentul vascular cerebral ischemic cȃt şi hemoragic [36, 37]. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în tratarea leziunii creierului la un subiect care are cel puţin un factor de risc pentru accidentul vascular cerebral. În unele realizări subiectul are doi factori de risc pentru accidentul vascular cerebral. În unele realizări subiectul are trei factori de risc pentru accidentul vascular cerebral. În unele realizări subiectul are patru factori de risc pentru accidentul vascular cerebral. În unele realizări subiectul are mai mult de patru factori de risc pentru accidentul vascular cerebral. În unele realizări subiectul are presiune sanguină ridicată. În unele realizări subiectul are colesterol mărit în sȃnge. În unele realizări subiectul are un istoric familial al accidentului vascular cerebral. În unele realizări subiectul are o boală de inimă. În unele realizări subiectul are diabet. În unele realizări subiectul are un anevrism cerebral. În unele realizări subiectul are malformaţii arteriovenoase. În unele realizări subiectul are vasculită. În unele realizări subiectul are boala celulei seceră. În unele realizări subiectul are o tulburare de sȃngerare. În unele realizări subiectul are un istoricul de utilizarea a unor medicamente antiinflamatoare nonsteroidiene (NSAID). În unele realizări subiectul fumează. În unele realizări subiectul consumă cantităţi mari de alcool. În unele realizări subiectul utilizează medicamente ilegale. În unele realizări subiectul este obez. În unele realizări subiectul este supraponderal. În unele realizări subiectul are o lipsă de activitate fizică. În unele realizări subiectul are o dietă nesănătoasă.

Exemplele au indicat că compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea leziunii creierului şi ajută la recuperare când sunt administrate înainte să apară evenimentul leziunii. Prin urmare, compoziţiile invenţiei pot fi în special utile pentru tratarea leziunii creierului când sunt administrate subiecţilor cu risc de leziune a creierului, cum ar fi accidentul vascular cerebral.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în reducerea deteriorării cauzate de o potenţială leziune a creierului, preferabil de un accident vascular cerebral. Compoziţiile pot reduce deteriorarea cauzată când ele sunt administrate înainte ca potenţiala leziune a creierului să aibă loc, în particular când se administrează unui pacient identificat cu risc de leziune a creierului.

Exemplele au indicat că compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea leziunii creierului şi ajutorarea recuperării când sunt administrate după ce evenimentul de leziune a avut loc. Prin urmare, compoziţiile invenţiei pot fi în special utile pentru tratarea leziunii creierului când sunt administrate subiecţilor după o leziune a creierului, cum ar fi accidentul vascular cerebral.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin reducerea deteriorării motorii. În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin îmbunătăţirea funcţiei motoare. În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin îmbunătăţirea rezistenţei muşchilor. În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin îmbunătăţirea memoriei. În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin îmbunătăţirea recunoaşterii sociale. În unele realizări, compoziţiile invenţiei tratează leziunea creierului prin îmbunătăţirea funcţionării neurologice.

Tratamentul leziunii creierului se poate referi la, de exemplu, o ameliorare a severităţii simptomelor. Tratamentul leziunii creierului se poate referi de asemenea la o reducere a deprecierii neurologice după accidentul vascular cerebral. Compoziţiile invenţiei pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral pot fi furnizate către subiect înaintea debutului accidentului vascular cerebral, de exemplu la un pacient identificat ca fiind cu risc de accident vascular cerebral. Compoziţiile invenţiei pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral pot fi furnizate după ce un accident vascular cerebral a avut loc, de exemplu, în timpul recuperării. Compoziţiile invenţiei pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral pot fi furnizate în timpul fazei acute de recuperare (adică până la o săptămână după accidentul vascular cerebral). Compoziţiile invenţiei pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral pot fi furnizate în timpul fazei subacute de recuperare (adică de la o săptămână până la trei luni după accidentul vascular cerebral). Compoziţiile invenţiei pentru utilizare în tratarea accidentului vascular cerebral pot fi furnizate în timpul fazei cronice de recuperare (de la trei luni după accidentul vascular cerebral).

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în combinaţie cu un agent activ secundar. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în combinaţie cu aspirina sau ţesutul activator plasminogen (tPA). Alţi agenţi secundari includ alte antitrombocite (cum ar fi clopidogrel), anticoagulanţi (cum ar fi heparine, warfarine, apixaban, dabigatran, edoxaban sau rivaroxaban), antihipertensive (cum ar fi diuretice, inhibitor ai ACE, blocanţi ai canalelor de calciu, beta-blocanţi sau alfa-blocanţi) sau statine. Compoziţiile invenţiei pot îmbunătăţi răspunsul pacientului la agentul activ secundar.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc efectul ischemiei pe ţesuturi. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc cantitatea deteriorată la ţesuturile cauzate de ischemie. În anumite realizări, ţesuturile deteriorate de ischemie sunt ţesuturi cerebrale. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc necroza sau numărul de celule necrotice. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc apoptoza sau numărul de celule apoptotice. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei reduc numărul de celule necrotice şi apoptotice. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn moartea celulei prin necroză şi/sau apoptoză. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei previn moartea celulei prin necroză şi/sau apoptoză cauzate de ischemie. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc recuperarea ţesutului deteriorat prin ischemie. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc viteza de eliminare a celulelor necrotice şi/sau a celulelor apoptotice. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc eficacitatea de eliminare a celulelor necrotice şi/sau a celulelor apoptotice. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc înlocuirea şi/sau regenerarea celulelor în ţesuturi. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc înlocuirea şi/sau regenerarea celulelor în ţesuturile deteriorate de ischemie. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei îmbunătăţesc histologia globală a ţesutului (de exemplu după o biopsie).

Moduri de administrare

Preferabil, compoziţiile invenţiei trebuie să fie administrate la tractul gastrointestinal pentru a permite livrarea la şi / sau colonizarea parţială sau totală a intestinului cu tulpina bacteriană a invenţiei. În general, compoziţiile invenţiei sunt administrate oral, dar ele pot fi administrate rectal, intranazal, sau pe cale bucală sau sublinguală.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei poate fi administrate ca spumă, ca pulverizator sau ca gel.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei pot fi administrate ca supozitoare, cum ar fi un supozitor rectal, de exemplu sub forma unui ulei de teobrom (unt de cacao), grăsime dură sintetică (de exemplu suppocire, witepsol), glicero-gelatină, polietilen glicol, sau compoziţie de glicerină cu săpun.

În anumite realizări, compoziţia invenţiei este administrată la tractul gastrointestinal printr-un tub, cum ar fi un tub nazogastric, un tub orogastric, un tub gastric, un tub de jejunostomie (tub J), gastronomie endoscopică percutanată (PEG), sau un port, cum ar fi un port al peretelui toracic care furnizează acces la stomac, jejun şi alte porturi de acces adecvate.

Compoziţiile invenţiei pot fi administrate odată, sau ele pot fi administrate secvenţial ca parte a unui regim de tratament. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei trebuie să fie administrate zilnic.

În anumite realizări ale invenţiei, tratamentul conform invenţiei este însoţit de evaluarea microbiotei intestinului pacientului. Tratamentul poate fi repetat dacă livrarea de şi/sau colonizarea parţială sau totală cu tulpina invenţiei nu este obţinută astfel încât eficacitatea nu este observată, sau tratamentul poate fi oprit dacă livrarea şi/sau colonizarea parţială sau totală este cu succes şi eficacitatea este observată.

În anumite realizări, compoziţia invenţiei poate fi administrată unui animal gestant, de exemplu un mamifer cum ar fi un om pentru a preveni dezvoltarea unei boli inflamatorii sau autoimune la copilul acestuia în utero şi sau după ce este născut.

Compoziţiile invenţiei pot fi administrate la un pacient care a fost diagnosticat cu o boală neurodegenerativă, sau care a fost identificat ca fiind cu risc de o boală neurodegenerativă. Compoziţiile pot fi de asemenea administrate ca măsură profilactică pentru a preveni dezvoltarea de boli neurodegenerative la un pacient sănătos.

Compoziţiile invenţiei pot fi administrate unui pacient care a fost identificat ca având o microbiotă intestinală anormală. De exemplu, pacientul poate avea o colonizare redusă sau absentă cu Parabacteroides, şi în particular cu Parabacteroides distasonis.

Compoziţiile invenţiei pot fi administrate ca produs alimentar, cum ar fi un supliment nutriţional.

În general, compoziţiile invenţiei sunt pentru tratamentul oamenilor, deşi ele pot fi utilizate pentru a trata animale incluzând mamifere monogastrice cum ar fi păsări de curte, porci, pisici, câini, cai sau iepuri. Compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru sporirea creşterii şi performanţei animalelor. Dacă se administrează la animale, poate fi utilizat gavajul oral.

Compoziţii

În general, compoziţia invenţiei cuprinde bacterii. În realizările preferate ale invenţiei, compoziţia este formulată în formă criodesicată. De exemplu, compoziţia invenţiei poate cuprinde granule sau capsule de gelatină, de exemplu capsule de gelatină tari, cuprinzând o tulpină bacteriană a invenţiei.

Preferabil, compoziţia invenţiei cuprinde bacterii liofilizate. Liofilizarea bacteriei este o procedură bine stabilită şi ghidarea relevantă este disponibilă în, de exemplu, referirile [38-40].

Alternativ, compoziţia invenţiei poate cuprinde o cultură bacteriană vie, activă.

În unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei nu a fost inactivată, de exemplu, nu a fost inactivată termic. În unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei nu a fost ucisă, de exemplu, nu a fost ucisă termic. În unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei nu a fost atenuată, de exemplu, nu a fost atenuată termic. De exemplu, în unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei nu a fost ucisă, inactivată şi/sau atenuată. De exemplu, în unele realizări, tulpină bacteriană din compoziţia invenţiei este vie. De exemplu, în unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei este viabilă. De exemplu, în unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei este capabilă de colonizarea parţială sau totală a intestinului. De exemplu, în unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţia invenţiei este viabilă şi capabilă de colonizarea parţială sau totală a intestinului.

În unele realizări, compoziţia cuprinde un amestec de tulpini bacteriene vii şi tulpini bacteriene care au fost ucise.

În realizările preferate, compoziţia invenţiei este încapsulată pentru a permite livrarea tulpinei bacteriene la intestin. Încapsularea protejează compoziţia de degradare până când livrarea la locaţia ţintă prin, de exemplu, ruperea cu stimuli chimici sau fizici cum ar fi presiunea, activitatea enzimatică, sau dezintegrarea fizică, care poate fi declanşată de modificări în pH. Poate fi utilizată orice metodă de încapsulare adecvată. Exemple de tehnici de încapsulare includ captarea într-o matrice poroasă, ataşarea sau adsorbţia pe suprafeţe purtătoare solide, autoagregarea prin floculare sau cu agenţi de reticulare, şi conţinutul mecanic după o membrană microporoasă sau o microcapsulă. Ghidarea despre încapsulare care poate fi utilă pentru prepararea compoziţiilor invenţiei este disponibilă în, de exemplu, referirile [41] şi [42].

Compoziţia poate fi administrată oral şi poate fi sub forma unei tablete, capsule sau pulberi. Produsele încapsulate sunt preferate deoarece Parabacteroides sunt anaerobe. Alte ingrediente (cum ar fi vitamina C, de exemplu), pot fi incluse ca eliminatori de oxigen şi subtraturi prebiotice pentru a îmbunătăţi livrarea şi/sau colonizarea şi supravieţuirea parţială sau totală in vivo. Alternativ, compoziţia probiotică a invenţiei poate fi administrată oral ca aliment sau produs nutriţional, cum ar fi lapte sau zer pe bază de produse lactate fermentate, sau ca produs farmaceutic.

Compoziţia poate fi formulată ca probiotic.

O compoziţie a invenţiei include o cantitate eficientă terapeutic dintr-o tulpină bacteriană a invenţiei. O cantitate eficientă terapeutic dintr-o tulpină bacteriană este suficientă pentru a exercita un efect benefic asupra unui pacient. O cantitate eficientă terapeutic dintr-o tulpină bacteriană poate fi suficientă pentru a conduce la livrarea la şi/sau colonizarea parţială sau totală a intestinului pacientului.

O doză zilnică adecvată de bacterie, de exemplu pentru un adult human, poate fi de la aproximativ 1 x 103 până la aproximativ 1 x 1011 unităţi de formare a coloniilor (CFU); de exemplu, de la aproximativ 1 x 107 până la aproximativ 1 x 1010 CFU; într-un alt exemplu de la aproximativ 1 x 106 până la aproximativ 1 x 1010 CFU.

În anumite realizări, compoziţia conţine tulpină bacteriană într-o cantitate de la aproximativ 1 x 106 până la aproximativ 1 x 1011 CFU/g, în raport cu greutatea compoziţiei; de exemplu, de la aproximativ 1 x 108 până la aproximativ 1 x 1010 CFU/g. Doza poate fi, de exemplu, de 1 g, 3g, 5g, şi 10g.

De obicei, un probiotic, cum ar fi compoziţia invenţiei, este opţional combinat cu cel puţin un compus prebiotic adecvat. Un compus prebiotic este uzual un carbohidrat nedigerabil cum ar fi o oligo sau polizaharidă, sau un alcool din zahăr, care nu este degradat sau absorbit în tractul digestiv superior. Prebioticele cunoscute includ produse comerciale cum ar fi inulina şi transgalacto-oligozaharidele.

În anumite realizări, compoziţia probiotică a prezentei invenţii include un compus prebiotic într-o cantitate de la aproximativ 1 până la aproximativ 30% din masă, în raport cu greutatea totală a compoziţiei, (de exemplu de la 5 până la 20% din masă). Carbohidraţii pot fi selectaţi din grupul constând din: fructo-oligozaharide (sau FOS), fructo-oligozaharide cu catenă scurtă, inulină, izomalt-oligozaharide, pectine, xilo-oligozaharide (sau XOS), chitosan-oligozaharide (sau COS), beta-glucani, amidonuri modificate din gumă arabilă şi rezistente, polidextroză, D-tagatoză, fibre acacia, roşcovă, ovăz, şi fibre citrice. Într-un aspect, prebioticele sunt fructo-oligozaharide cu catenă scurtă (pentru simplitate arătate aici mai jos ca FOSs-c.c); respectivele FOSs-c.c. nu sunt carbohidraţi digerabili, obţinuţi în general prin conversia sfeclei de zahar şi incluzând o moleculă zaharoză la care sunt legate trei molecule de glucoză.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt utilizate în combinaţie cu un alt compus terapeutic pentru tratarea sau prevenirea tulburării neurodegenerative. În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt administrate cu supliment nutriţional care modulează neuroprotecţia sau neuroproliferarea. În realizările preferate, suplimentele nutriţionale cuprind sau constau din vitamine nutriţionale. În anumite realizări, vitaminele sunt vitamina B6, magneziu, dimetilglicină (vitamina B16) şi vitamina C. În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt administrate în combinaţie cu un alt probiotic.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în amplificarea efectului unui agent secundar asupra unei boli neurodegenerative. Efectele modulatoare imune ale compoziţiilor invenţiei pot face creierul mai susceptibil la terapiile convenţionale cum ar fi Levodopa, agonişti de dopamină, inhibitori MAO-B, inhibitori COMT, antagonişti Glutamat, sau anticolinergice, care sunt exemple de agenţi secundari pentru a fi administraţi în combinaţie (secvenţial sau simultan) cu compoziţiile invenţiei.

Compoziţiile invenţiei pot cuprinde excipienţi acceptabili farmaceutic sau purtători. Exemple de astfel de excipienţi adecvaţi pot fi găsite în referinţa [43]. Purtătorii sau diluanţii acceptabili pentru utilizare terapeutică sunt bine cunoscuţi în domeniul farmaceutic şi sunt descrişi, de exemplu, în referinţa [44]. Exemple de purtători adecvaţi includ lactoză, amidon, glucoză, metil celuloză, stearat de magneziu, manitol, sorbitol şi altele asemenea. Exemple de diluanţi adecvaţi includ etanol, glicerol şi apă. Alegerea purtătorului farmaceutic, excipientului sau diluantului poate fi selectată cu referire la calea de administrare intenţionată şi practica farmaceutică standard. Compoziţiile farmaceutice pot cuprinde ca, sau în plus faţă de, purtător, excipient sau diluant orice lianţi, lubrifianţi, agenţi de punere în suspensie, agenţi de acoperire, agenţi de solubilizare adecvaţi. Exemple de lianţi adecvaţi includ amidon, gelatină, zaharuri naturale cum ar fi glucoză, lactoză anhidră, lactoză liber curgătoare, beta-lactoză, îndulcitori din porumb, gume naturale şi sintetice, cum ar fi acacia, tragacant sau alginat de sodiu, carboximetil celuloză şi polietilen glicol. Exemple de lubrifianţi adecvaţi includ oleat de sodiu, stearat de sodiu, stearat de magneziu, benzoat de sodiu, acetat de sodiu, clorură de sodiu şi altele asemenea. Conservanţii, stabilizatorii, coloranţii şi chiar agenţii de aromatizare pot fi furnizaţi în compoziţia farmaceutică. Exemple de conservanţi includ benzoat de sodiu, acid sorbic şi esteri ai acidului p-hidroxibenzoic. Pot fi de asemenea utilizaţi antioxidanţi şi agenţi de punere în suspensie.

Compoziţiile invenţiei pot fi formulate ca produs alimentar. De exemplu, un produs alimentar poate asigura beneficiu nutriţional în plus faţă de efectul terapeutic al invenţiei, cum ar fi un supliment nutriţional. În mod similar, un produs alimentar poate fi formulat pentru a ameliora gustul compoziţiei invenţiei sau pentru a face compoziţia mai atractivă pentru consum, fiind mai similară cu un articol alimentar comun, mai degrabă decât cu o compoziţie farmaceutică. În anumite realizări, compoziţia invenţiei este formulată ca produs pe bază de lapte. Termenul „produs pe bază de lapte» înseamnă orice produs pe bază de lapte sau zer, lichid sau semisolid având un conţinut de grăsime variabil. Produsul pe bază de lapte poate fi, de exemplu, lapte de vacă, lapte de capră, lapte de oaie, lapte degresat, lapte integral, lapte recombinat din lapte praf şi zer fără nici o procesare, sau un produs procesat, cum ar fi iaurtul, laptele covăsit, caşul, laptele acrit, laptele integral acrit, caimacul din lapte şi alte produse din lapte acrit. Un alt grup important include băuturile din lapte, cum ar fi băuturi din zer, lapte fermentat, lapte condensat, lapte pentru nou născuţi sau copii; lapte aromat, îngheţată; lapte conţinând alimente cum ar fi dulciurile.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind una sau mai multe tulpini bacteriene din genul Parabacteroides şi nu conţin bacterii din nici un alt gen, sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevente biologic dintr-un alt gen. Astfel, în unele realizări, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând una sau mai multe tulpini bacteriene din genul Parabacteroides, care nu conţine bacterii din nici un alt gen sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-un alt gen, pentru utilizare în terapie.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind una sau mai multe tulpini bacteriene ale speciilor Parabacteroides distasonis şi nu conţin bacterii din nici o altă specie, sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă specie. Astfel, în unele realizări, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând una sau mai multe tulpini bacteriene ale speciilor Parabacteroides distasonis, care nu conţine bacterii din nici o altă specie sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă specie, pentru utilizare în terapie.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind una sau mai multe tulpini bacteriene ale speciilor Parabacteroides distasonis şi nu conţin bacterii din nici o altă specie Parabacteroides, sau care cuprind numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă specie Parabacteroides. Astfel, în unele realizări, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând una sau mai multe tulpini bacteriene ale speciilor Parabacteroides distasonis, care nu conţine bacterii din nici o altă specie Parabacteroides sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă specie Parabacteroides, pentru utilizare în terapie.

În anumite realizări, compoziţiile invenţiei conţin o singură tulpină bacteriană sau specie şi nu conţin nici o altă tulpină bacteriană sau specie. Astfel de compoziţii pot cuprinde numai de minimis sau cantităţi irelevante biologic din alte tulpini bacteriene sau specii. Astfel de compoziţii pot fi o cultură care este substanţial fără alte specii de organisme.

În unele realizări, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o singură tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, care nu conţine bacterii din nici o altă tulpină sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă tulpină pentru utilizare în terapie.

În unele realizări, invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o singură tulpină bacteriană a speciilor Parabacteroides distasonis, care nu conţine bacterii din nici o altă tulpină sau care cuprinde numai de minimis sau cantităţi de bacterii irelevante biologic dintr-o altă tulpină pentru utilizare în terapie.

În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind mai mult de o tulpină bacteriană. De exemplu, în unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind mai mult de o tulpină din aceleaşi specii (de exemplu mai mult de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 sau 45 tulpini), şi, opţional, nu conţin bacterii din nici o altă specie. În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind mai puţin de 50 tulpini din aceleaşi specii (de exemplu mai puţin de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 sau 3 tulpini), şi, opţional, nu conţin bacterii din nici o altă specie. În unele realizări, compoziţiile invenţiei cuprind 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, sau 31-50 tulpini din aceleaşi specii şi, opţional, nu conţin bacterii din nici o altă specie. Invenţia cuprinde orice combinaţie a celor anterioare.

În unele realizări, compoziţia cuprinde un consorţiu microbian. De exemplu, în unele realizări, compoziţia cuprinde tulpina bacteriană Parabacteroides ca parte a unui consorţiu microbian. De exemplu, în unele realizări, tulpina bacteriană Parabacteroides este prezentă în combinaţie cu una sau mai multe (de exemplu cel puţin 2, 3, 4, 5, 10, 15 sau 20) alte tulpini bacteriene din alte genuri cu care ea poate vieţui simbiotic in vivo în intestin. De exemplu, în unele realizări, compoziţia cuprinde o tulpină bacteriană de Parabacteroides în combinaţie cu o tulpină bacteriană din genuri diferite. În unele realizări, consorţiul microbian cuprinde două sau mai multe tulpini bacteriene obţinute dintr-o mostră de excremente a unui singur organism, de exemplu un om. În unele realizări, consorţiul microbian nu este găsit împreună în natură. De exemplu, în unele realizări, consorţiul microbian cuprinde tulpini bacteriene obţinute din mostre de excremente de la cel puţin două organisme diferite. În unele realizări, cele două diferite organisme sunt din aceeaşi specie, de exemplu de la doi oameni diferiţi. În unele realizări, cele două organisme diferite sunt un nou nşacut uman şi un adult uman. În unele realizări, cele două organisme diferite sunt un om şi un mamifer neuman.

În unele realizări, compoziţia invenţiei cuprinde suplimentar o tulpină bacteriană care are aceleaşi caracteristici de siguranţă şi eficacitate terapeutică ca tulpina MRX005, dar care nu este MRx0005, sau care nu este o Parabacteroides distasonis.

În unele realizări în care compoziţia invenţiei cuprinde mai mult de o tulpină bacteriană, specii sau genuri, tulpini bacteriene individuale, speciile sau genurile pot fi pentru administrare separată, simultană sau secvenţială. De exemplu, compoziţia poate cuprinde toate dintre mai mult de o tulpină bacteriană, specii sau genuri, sau tulpinile bacteriene, speciile sau genurile pot fi depozitate separat şi administrate separat, simultan sau secvenţial. În unele realizări, mai mult de o tulpină bacteriană, specie sau gen sunt depozitate separat dar sunt amestecate împreună înainte de utilizare.

În unele realizări, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie este obţinută din excremente de adult uman. În unele realizări în care compoziţia invenţiei cuprinde mai mult de o tulpină bacteriană, toate dintre tulpinile bacteriene sunt obţinute din excremente de adult uman sau dacă alte tulpini bacteriene sunt prezente, ele sunt prezente numai în cantităţi de minimis. Se poate ca bacteria să fi fost cultivată după ce a fost obţinută din excremente de adult uman şi să fie utilizată într-o compoziţie a invenţiei.

În unele realizări, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie este obţinută din excremente de nou născut uman. În unele realizări în care compoziţia invenţiei cuprinde mai mult de o tulpină bacteriană, toate dintre tulpinile bacteriene sunt obţinute din excremente de nou născut uman sau dacă alte tulpini bacteriene sunt prezente, ele sunt prezente numai în cantităţi de minimis. Se poate ca bacteria să fi fost cultivată după ce a fost obţinută din excremente de nou născut uman şi să fie utilizată într-o compoziţie a invenţiei.

Cum s-a menţionat mai sus, în unele realizări, una sau mai multe tulpini bacteriene Parabacteroides este/sunt singurul agent activ terapeutic într-o compoziţie a invenţiei. În unele realizări, tulpina bacteriană din compoziţie este singurul agent activ terapeutic dintr-o compoziţie a invenţiei.

Compoziţiile pentru utilizare conform invenţiei pot sau pot să nu necesite aprobarea de piaţă.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care respectiva tulpină bacteriană este liofilizată. În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care respectiva tulpină bacteriană este pulverizată uscat. În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care tulpina bacteriană este liofilizată sau pulverizată uscat şi în care este vie. În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care tulpina bacteriană este liofilizată sau pulverizată uscat şi în care este viabilă. În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care tulpina bacteriană este liofilizată sau pulverizată uscat şi în care este capabilă de colonizarea parţială sau totală a intestinului. În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care tulpina bacteriană este liofilizată sau pulverizată uscat şi în care este viabilă şi capabilă de colonizarea parţială sau totală a intestinului.

În unele cazuri, tulpina bacteriană liofilizată este reconstituită înainte de administrare. În unele cazuri, reconstituirea este prin utilizarea a unui diluant descris aici.

Compoziţiile invenţiei pot cuprinde excipienţi acceptabili farmaceutic, diluanţi sau purtători.

În anumite realizări, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând: o tulpină bacteriană a invenţiei; şi un excipient acceptabil farmaceutic, purtător sau diluant; în care tulpina bacteriană este într-o cantitate suficientă pentru a trata o tulburare neurodegenerativă când se administrează unui subiect care are nevoie de aceasta.

În anumite realizări, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând: o tulpină bacteriană a invenţiei; şi un excipient acceptabil farmaceutic, purtător sau diluant; în care tulpina bacteriană este într-o cantitate suficientă pentru a trata sau preveni o tulburare neurodegenerativă.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care cantitatea de tulpină bacteriană este de la aproximativ 1 × 103 până la aproximativ 1 × 1011 unităţi de formare ale coloniilor pe gram faţă de o greutate a compoziţiei.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care compoziţia este administrată la o doză de 1 g, 3 g, 5 g sau 10 g.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mei sus, în care compoziţia este administrată printr-o metodă selectată din grupul constând din orală, rectală, subcutanată, nazală, bucală, şi sublinguală.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un purtător selectat din grupul constând din lactoză, amidon, glucoză, metil celuloză, stearat de magneziu, manitol şi sorbitol.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un diluant selectat din grupul constând din etanol, glicerol şi apă.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un excipient selectat din grupul constând din amidon, gelatină, glucoză, lactoză anhidră, lactoză liber curgătoare, beta-lactoză, îndulcitor din porumb, acacia, tragacant, alginat de sodiu, carboximetil celuloză, polietilen glicol, oleat de sodiu, stearat de sodiu, stearat de magneziu, benzoat de sodiu, acetat de sodiu şi clorură de sodiu.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând în plus cel puţin un conservant, un antioxidant şi un stabilizator.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un conservant selectat din grupul constând din benzoat de sodiu, acid sorbic şi esteri ai acidului p-hidroxibenzoic.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care repectiva tulpină bacteriană este liofilizată.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care când compoziţia este depozitată într-un recipient etanşat la aproximativ 4°C sau la aproximativ 25°C şi recipientul este plasat într-o atmosferă având 50% umiditate relativă, cel puţin 80% din tulpina bacteriană după cum s-a măsurat în unităţi de formare ale coloniilor, rămâne după o perioadă de cel puţin aproximativ: 1 lună, 3 luni, 6 luni, 1 an, 1,5 ani, 2 ani, 2,5 ani sau 3 ani.

În unele realizări, compoziţia invenţiei este furnizată într-un recipient etanşat cuprinzând o compoziţie cum s-a descris aici. În unele realizări, recipientul etanşat este un pliculeţ sau sticlă. În unele realizări, compoziţia invenţiei este furnizată într-o seringă cuprinzând o compoziţie cum s-a descris aici.

Compoziţia din prezenta invenţie poate, în unele realizări, să fie furnizată ca formulare farmaceutică. De exemplu, compoziţia poate fi urnizată ca tabletă sau capsule. În unele realizări, capsula este o capsulă de gelatină („gel-cap»).

În unele realizări, compoziţiile invenţiei sunt administrate oral. Administrarea orală poate implica înghiţirea, astfel încât compusul intră în tractul gastrointestinal, şi/sau administrarea bucală, linguală, sau sublinguală prin care compusul intră în fluxul sanguin direct din gură.

Formulările farmaceutice adecvate pentru administrare orală includ dopuri solide, microparticule solide, semisolide şi lichide (incluzând sisteme cu faze multiple sau dispersate) cum ar fi tabletele; capsule moi sau tari conţinând multi sau nanoparticule, lichide (de exemplu soluţii apoase), emulsii sau pulberi; pastile (inclusiv umplute cu lichid; gume; geluri; forme de dozare cu dispersare rapidă; filme; ovule; pulverizatoare; şi plasturi bucali/mucoadezivi.

În unele realizări formularea farmaceutică este o formulare enterică, adică o formulare gastrorezistentă (de exemplu, rezistentă la pH-ul gastric) care este adecvată pentru livrarea compoziţiei invenţiei în intestin prin administrare orală. Formulările enterice pot fi în special utile când bacteria sau o altă componentă a compoziţiei este sensibilă la acid, de exemplu predispusă la degradare sub condiţii gastrice.

În unele realizări, formularea enterică cuprinde o acoperire enterică. În unele realizări, formularea este o formă de dozare acoperită enteric. De exemplu, formularea poate fi o tabletă acoperită enteric sau o capsulă acoperită enteric, sau altele asemenea. Acoperirea enterică poate fi o acoperire enterică convenţională, de exemplu, o acoperire convenţională pentru o tabletă, capsulă, sau altele asemenea pentru livrare orală. Formularea poate cuprinde un film de acoperire, de exemplu, un strat subţire de film al unui polimer enteric, de exemplu un polimer insolubil în acid.

În unele realizări, formularea enterică este intrinsec enterică, de exemplu, gastrorezistentă fără a necesita o acoperire enterică. Astfel, în unele realizări, formularea este o formulare enterică care nu cuprinde o acoperire enterică. În unele realizări, formularea este o capsulă făcută dintr-un material termogel. În unele realizări, materialul termogel este un material celulozic, cum ar fi metilceluloza, hidroximetilceluloza sau hidroxipropilmetilceluloza (HPMC). În unele realizări, capsula cuprinde o carcasă care nu conţine nici un film de formare a polimerului. În unele realizări, capsula cuprinde o carcasă şi carcasa cuprinde hidroxipropilmetilceluloză şi nu cuprinde nici un film de formare a polimerului (vezi de exemplu [45]). În unele realizări, formularea este o capsulă enterică intrinsecă (de exemplu, Vcaps® de la Capsugel).

În unele realizări, formularea este o capsulă moale. Capsulele moi sunt capsule care pot, din cauza adăugări de agenţi de înmuiere, cum ar fi, de exemplu, glicerol, sorbitol, maltitol şi polietilen glicoli, prezenţi în carcasa capsulei, avea o anumită elasticitate şi moliciune. Capsulele moi pot fi produse, de exemplu, pe bază de gelatină sau amidon. Capsulele moi pe bază de gelatină sunt disponibile comercial de la diferiţi furnizori. Depinzând de metoda de administrare, cum ar fi, de exemplu, orală sau rectală, capsulele moi poate avea diferite forme, ele putȃnd fi, de exemplu, rotunde, ovale, alungite sau în formă de torpilă. Capsulele moi pot fi produse prin procedee convenţionale, cum ar fi, de exemplu, prin procedeul Scherer, procedeul Accogel sau procedeul de picurare sau suflare.

Metode de cultivare

Tulpinile bacteriene pentru utilizare din prezenta invenţie pot fi cultivate utilizând tehnici de microbiologie standard cum s-a detaliat în, de exemplu, referirile [46-48].

Mediul solid sau lichid utilizat pentru cultură poate fi agar YCFA sau mediu YCFA. Mediul YCFA poate include (pe 100ml, valorile aproximative): Casitonă (1,0 g), extract de drojdie (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteină (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4 · 7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurin (0,1 mg), hemin (1 mg), biotină (1 µg), cobalamin (1 µg), acid p-aminobenzoic (3 µg), acid folic (5 µg), şi piridoxamină (15 µg).

Tulpini bacteriene pentru utilizare în compoziţiile pentru vaccin

Inventatorii au identificat că tulpinile bacteriene ale invenţiei sunt utile pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor neurodegenerative. Acest lucru este probabil un rezultat al efectului pe care tulpinile bacteriene ale invenţiei îl au asupra sistemului imunitar al gazdei. Prin urmare, compoziţiile invenţiei pot fi de asemenea utile pentru prevenirea tulburărilor neurodegenerative, când sunt administrate ca compoziţii pentru vaccin. În anumite astfel de realizări, tulpinile bacteriene ale invenţiei pot fi ucise, inactivate sau atenuate. În anumite astfel de realizări, compoziţiile pot cuprinde un adjuvant de vaccin. În anumite realizări, compoziţiile sunt pentru administrare prin injecţie, cum ar fi prin injecţie subcutanată.

General

Practica din prezenta invenţie va utiliza, dacă nu se indică altfel, metode convenţionale de chimie, biochimie, biologie moleculară, imunologie şi farmacologie, în competenţele domeniului. Astfel de tehnici sunt explicate complet în literatură. Vezi, de exemplu, referirile [49] şi [50- 56], etc.

Termenul „cuprinzând» cuprinde „incluzând» precum şi „constând» de exemplu o compoziţie „cuprinzând» X poate consta exclusiv din X sau poate include altceva suplimentar de exemplu X + Y.

Termenul „aproximativ» în raport cu o valoare numerică x este opţional şi înseamnă, de exemplu, x±10%.

Cuvântul „substanţial» nu exclude „complet» de exemplu o compoziţie care este „substanţial fără» Y poate fi complet fără Y. Unde este necesar, cuvântul „substanţial» poate fi omis din definiţia invenţiei.

Referirile la un procentaj de identitate de secvenţă între două secvenţe de nucleotidă înseamnă că, atunci când sunt aliniate, acel procentaj de nucleotide este acelaşi în compararea celor două secvenţe. Această aliniere şi procentele de omologie sau identitate de secvenţă pot fi determinate utilizând programe software cunoscute în domeniu, de exemplu cele descrise în secţiunea 7.7.18 din ref. [57]. O aliniere preferată este determinată prin algoritmul de căutare a omologiei Smith-Waterman utilizând o căutare de gol afin cu o penalitate de deschidere a golului de 12 şi o penalitate de extensie a golului de 2, matricea BLOSUM de 62. Algoritmul de căutare a aomologiei Smith-Waterman este divulgat în ref. [58].

În afară de cazul când se declară specific, un procedeu sau metodă cuprinzând numeroase etape poate cuprinde etape suplimentare la începutul sau sfȃrşitul metodei, sau poate cuprinde etape de intervenţie suplimentare. De asemenea, etapele pot fi combinate, omise sau efectuate într-o ordine alternativă, dacă este adecvat.

Sunt descrise aici diferite realizări ale invenţiei. Se va aprecia că, caracteristicile specificate în fiecare realizare pot fi combinate cu alte caracteristici specificate, pentru a furniza alte realizări. În particular, realizările evidenţiate aici ca fiind adecvate, tipice sau preferate pot fi combinate una cu cealaltă (cu excepţia faptului când ele se exclud reciproc).

MODURI PENTRU EFECTUAREA INVENŢIEI

Exemplul 1 - Eficacitatea inoculării bacteriene de a acţiona ca neuroprotector

Rezumat

Celulele neuroblastom au fost tratate cu compoziţii cuprinzând tulpinile bacteriene conform invenţiei. Celulele neuroblastom SH-SY5Y utilizate sunt producătoare de dopamină şi bine stabilite ca un model in vitro pentru studierea bolilor neurodegenerative. S-a observat abilitatea tulpinilor bacteriene de a creşte neuroproliferarea. Celulele neuroblastom au fost tratate de asemenea cu 1-metil-4-fenilpiridin neurotoxin dopaminergic tratat (MPP), care induce simptoame permanente ale bolii Parkinson în celulele neuroblastom. A fost investigată abilitatea tulpinilor bacteriene de a acţiona ca neuroprotector împotriva MPP.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis, Megasphaera massiliensis MRx0029

Linie celulară

Celulele neuroblastom SH-SY5Y au fost cumpărate de la ECCACC (Nr. cat.: 94030304) şi au fost crescute în MEM (Sigma Aldrich, cat n. M2279) suplimentat cu amestec de nutrient F-12 Ham (Sigma Aldrich, cat n. N4888).

Metodă

Odată crescute, celulele neuroblastom SH-SY5Y au fost placate pe placă cu 96 de godeuri la 11.000 celule/godeu şi incubate timp de 2 zile. Celulele au fost apoi transferate în mediu de diferenţiere (care conţine FBS la 1%) şi acid retinoic 10 uM (Sigma Aldrich, cat. n. R2625-100MG). Mediul de diferenţiere a fost înlocuit în fiecare altă zi şi celulele au fost recoltate în ziua 7 de diferenţiere. Celulele au fost pretratate cu sau fără MPP (Sigma Aldrich, cat. n. D048-1G) timp de 8 ore. Ulterior, celulele au fost tratate cu supernatant bacterian 10% şi incubate peste noapte. Viabilitatea celulară a fost măsurată utilizând reactiv CCK-8 (Sigma Aldrich, Trusă de Numărare a Celulelor - 8, cat. n. 96992-3000TESTS-F) şi citită la 450nm lungime de undă.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figura 1. Tratamentul celulelor neuroblastom cu MRx0005 sau MRx0029 a condus la o creştere în proliferarea de neuroni. Celulele neuroblastom care au fost tratate cu MPP împreună cu tulpina bacteriană au avut o viabilitate celulară crescută în comparaţie cu celulele tratate cu MPP singur (care au avut o viabilitate scăzută). Aceste date arată că tulpinile bacteriene pot acţiona ca neuroprotector.

Exemplul 2A - Eficacitatea inoculării bacteriene de a reduce secreţia de IL-6.

Rezumat

Activarea citokinelor proinflamatoare a fost asociată cu deteriorarea neuronului în boala neurodegenerativă. Lipopolizaharida (LPS) este un stimulator cunoscut al citokinelor proinflamatoare IL-6. Celulele astrocitom glioblastom umane au fost tratate cu compoziţii cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei în combinaţie cu LPS pentru a observa abilitatea lor de a modula nivelurile de IL-6.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

Linie celulară

MG U373 este un astrocitom glioblastom uman derivat dintr-o tumoare malignă şi au fost cumpărate de la Sigma-Aldrich (cat n. 08061901-1VL). Celulele de asrtocitom glioblastom umane MG U373 au fost crescute în MEM (Sigma Aldrich, cat n. M-2279) suplimentat cu 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, soluţie aminocidă neesenţială IX MEM şi piruvat de sodiu IX.

Metodă

Odată crescute, celulele MG U373 au fost placate pe placă cu 24 de godeuri la 100.000 celule/godeu. Celulele au fost tratate cu LPS (1ug/mL) singur sau cu 10% supernatant de bacterie din MRx0005 timp de 24 ore. Un control a fost de asemenea efectuat unde celulele au fost incubate în mediu netratat. După aceea supernatanţii fără celule au fost colectaţi, centrifugaţi la 10.000g timp de 3min la 4°C. IL-6 a fost măsurat utilizând trusa ELISA umană IL-6 de la Peprotech (cat n.#900-K16) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figura 2A. Tratamentul celulelor neuroblastom cu LPS şi tulpina bacteriană a condus la o scădere în nivelul de IL-6 secretat.

Exemplul 2B - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru a modula secreţia de IL-8.

Rezumat

Deoarece neuroinflamaţia joacă un rol pivotal în bolile neurodegenerative şi IL-8 s-a dovedit că are efecte neuropozitive, a fost evaluat efectul compoziţiilor cuprinzând tulpinile bacteriene ale invenţiei şi LPS asupra activării IL-8. Celulele astrocitom glioblastom umane au fost tratate cu compoziţii cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei în combinaţie cu LPS pentru a observa abilitatea lor de a modula nivelurile de IL-8.

Material şi Metode

Tulpini bacteriene

Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005

Linie celulară

MG U373 este un astrocitom glioblastom uman derivat dintr-o tumoare malignă şi a fost cumpărat de la Sigma-Aldrich (cat n. 08061901-1VL). Celulele astrocitom glioblastom umane MG U373 au fost crescute în MEM (Sigma Aldrich, cat n. M-2279) suplimentat cu 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, soluţie aminoacidă neesenţială IX MEM şi piruvat de sodiu IX.

Metodă

Odată crescute, celulele MG U373 au fost placate pe placă cu 24 de godeuri la 100.000 celule/godeu. Celulele au fost tratate cu LPS (1ug/mL) singur sau cu 10% supernatant de bacterie din MRX0029 timp de 24 ore. După aceea supernatanţii fără celule au fost colectaţi, centrifugaţi la 10.000g timp de 3min la 4°C. IL-8 a fost măsurat utilizând trusa ELISA umană IL-8 de la Peprotech (cat n.#900-K18) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figura 2B.

Exemplul 2C - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru a reduce inflamaţia indusă de α-sinucleină.

Rezumat

Neuroinflamaţia joacă un rol pivotal în boala Parkinson şi α-sinucleina s-a dovedit că induce neuroinflamaţia in vivo. Prin urmare, a fost evaluată abilitatea tulpinei bacteriene a invenţiei de a inhiba neuroinflamaţia indusă de α-sinucleină. O cocultură de celule astrocitom glioblastom umane şi celule neuroblastom a fost expusă la α-sinucleină de tip sălbatic şi izoformele mutante E46K şi A53T şi tratată cu compoziţii cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei. A fost apoi testată abilitatea tulpinilor bacteriene de a inhiba secreţia de IL-6 indusă de α-sinucleină.

Material şi Metode

Tulpini bacteriene

Megasphaera massiliensis MRX0029; Parabacteroides distasonis MRX0005

Linie celulară

SH-SY5Y este o linie celulară neuroblastom umană derivată dintr-un neuroblastom malign şi poate fi cumpărată de la Sigma-Aldrich (cat n. 94030304-1VL). Celulele au fost crescute în 50 % MEM şi 50% mediu cu amestec de nutrient F-12 Ham suplimentat cu 2mM L-Glutamină, FBS inactivat termic 10%, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină. Celulele pe mediul de creştere au fost placate pe placă cu 96 de godeuri la 11.000 celule/godeu şi plasate în incubator. După 2 zile, mediul a fost înlocuit cu mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând FBS 1%) şi acid retinoic 10 µM. Mediul de diferenţiere a fost înlocuit în fiecare altă zi şi celulele au fost utilizate după 7 zile de diferenţiere.

Metodă

Celulele SHSY5Y au fost placate pe plăci cu 12 godeuri la o densitate de 50.000 celule/godeu. Celulele au fost crescute în 50 % MEM şi 50% mediu cu amestec de nutrient F-12 Ham suplimentat cu 2mM L-Glutamină, FBS inactivat termic 10%, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină. Celulele pe mediul de creştere au fost placate pe placă cu 96 de godeuri la 11.000 celule/godeu şi plasate în incubator. După 2 zile, mediul a fost înlocuit cu mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând 1% FBS) şi 10 µM acid retinoic. Mediul de diferenţiere a fost înlocuit în fiecare altă zi şi celulele au fost utilizate după 7 zile de diferenţiere. U373 au fost placate pe plăci cu 12 transgodeuri (membrană de poliester de 0,4µm, Costar) la o densitate de 50.000celule/godeu timp de 72 ore. Celulele au fost cocultivate împreună timp de 24 ore înainte de tratament în mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând 1% FBS fără acid retinoic).

Apoi celulele au fost tratate cu 25µg/ml α-sinucleină (Wt, A53T, E46K) în prezenţa sau absenţa a 10% supernatant de bacterie timp de 48 ore. Supernatanţii fără celule au fost colectaţi, centrifugaţi la 10000g timp de 3 min la 4°C, alicotaţi şi depozitaţi la -80°C. IL-6 şi IL-8 umane au fost măsurate cum s-a descris mai sus.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figura 3. Tratamentul celulelor cu α-sinucleină de tip sălbatic şi izoformele mutante E46K şi A53T a indus o secreţie moderată de IL-6. Secreţia indusă de α-syn de IL-6 a fost inhibată în celulele tratate cu tulpinile bacteriene.

Exemplul 3 - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru a reduce activarea NFκβ

Rezumat

Activarea promotorului NFκB conduce la producţia de citokine proinflamatoare incluzând IL-1β, IL-1α, IL-18, TNFα şi IL-6. Promotorul NFκB poate fi activat de α-sinucleină şi LPS prin stimularea ligandului TLR4. Mutaţiile în α-sinucleină, cum ar fi α-sinucleină A53T, sunt implicate în Parkinsonul familial. Tratamentul celulelor neuronale cu LPS simulează Parkinsonul cauzat de factorii din mediu. A fost investigată abilitatea compoziţiilor cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei de a inhiba activarea promotorului NFκB.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

Linie celulară

TLR4 albastre Hek umane au fost cumpărate de la InvivoGen (cat n. hkb-htlr4). TLR4 albastre Hek umane au fost crescute în glucoză bogată în DMEM (Sigma Aldrich, cat n. D-6171) suplimentată cu 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, Normocin şi soluţie de selecţie albastră IX HEK.

Metodă

Odată crescute, celulele albastre Hek umane au fost placate în plăci cu 96 de godeuri la 25.000 celule/godeu în 4 replicate. Un set al celulelor a fost tratat cu α-sinucleină A53T (1ug/mL) singură sau cu 10% supernatant de bacterie din MRx0005 timp de 22 ore. Al doilea set al celulelor a fost tratat cu LPS (10 ng/mL, din serotip enteric de Salmonella Typhimurium, Sigma Aldrich, cat n. L6143) singur sau cu 10% supernatant de bacterie din MRx0005 timp de 22 ore. Celulele au fost ulterior centrifugate şi 20ul de supernatant au fost amestecate cu 200ul de reactiv albastru Quanti (InvivoGen, cat n. rep-qb2), incubate timp de 2 ore şi absorbanţa citită la 655nm.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figurile 4 şi 5. Figura 4 arată că activarea promotorului NFκB de către α-sinucleină este inhibată de MRx0005. Figura 5 arată că activarea promotorului NFκB de către LPS este inhibată de MRx0005.

Exemplul 4 - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru alterarea capacităţii antioxidante

Rezumat

Abilitatea compoziţiilor cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei de a altera capacitatea antioxidantă. Capacitatea antioxidantă a tulpinei bacteriene a fost stabilită utilizând bine cunoscutul test ABTS (acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic)).

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

Metodă

Celulele bacteriene (106 sau mai multe) au fost colectate şi centrifugate. Ele au fost resuspendate în tampon de testare (utilizând de trei ori volumul peletului). Suspensia a fost sonicată pe gheaţă timp de 5 minute şi apoi centrifugată la 12.000 x g timp de 10 minute. Supernatantul a fost îndepărtat şi măsurat utilizând trusa de test ABTS produsă de Sigma Aldrich (cod CS0790), în conformitate cu instrucţiunile fabricantului.

Rezultate

Rezultatele acestor experimente sunt prezentate în Figura 6. Figura 6 arată că MRx0005 are o capacitate antioxidantă de aproximativ 0,5mM în comparaţie cu Trolox.

Exemplul 5 - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru alterarea nivelurilor de peroxidare lipidă

Rezumat

A fost investigată abilitatea compoziţiilor cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei de a altera nivelurile de peroxidare lipidă. A fost utilizat testul substanţelor reactive tiobarbiturice (TBAR) pentru a măsura produsele secundare de peroxidare lipidă.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

Metodă

Celulele bacteriene (106 sau mai multe) au fost colectate şi centrifugate, a fost efectuată o etapă de spălare cu soluţie salină izotonică înainte ca peletul să fie resuspendat în tampon de testare de clorură de potasiu. Suspensia a fost sonicată pe gheaţă timp de 10 minute şi apoi centrifugată la 10.000 x g timp de 10 minute. Supernatantul a fost îndepărtat şi nivelul de peroxidare lipidă evaluat utilizând testul substanţelor reactive tiobarbiturice.

Rezultate

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figura 7. Figura 7 arată că MRx0005 este capabil să inhibe peroxidarea lipidă cu aproximativ 20 %, care este o capacitate antioxidantă mai ridicată decât controlul pozitiv, hidroxitoluen butilat (1% m/v).

Exemplul 6 - Eficacitatea inoculării bacteriene asupra activităţii de deacetilază histonă

Rezumat

A fost investigată abilitatea compoziţiilor cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei de a altera activitatea de deacetilază histonă. Dereglarea deacetilazei histone a fost implicată în patogeneza asociată cu bolile neurodegenerative asociate cu vârsta.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

Linie celulară

A fost utilizată linia celulară HT-29 deoarece este prezentă deacetilaza histonă.

Metodă

Supernatanţii fără celule de culturi bacteriene de fază staţionară au fost izolaţi prin centrifugare şi filtrare într-un filtru de 0,22 uM. Celulele HT-29 au fost utilizate la 3 zile post confluenţă şi au fost coborȃte în 1 mL DTS cu 24 ore înainte de începerea experimentului. Celulele HT-29 au fost provocate cu 10 % supernatant fără celule diluat în DTS şi acestea au fost lăsate să incubeze timp de 48 ore. Proteinele nuclează au fost apoi extrase utilizând trusa de extragere Sigma Aldrich Nuclease şi mostrele au fost congelate instantaneu înainte de măsurarea activităţii HDAC. Activitatea HDAC a fost evaluată fluorometric utilizând trusa Sigma Aldrich (UK).

Rezultate

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figura 8. Figura 8 arată că MRx0005 este capabil să reducă nivelurile activităţii de deacetilază histonă.

Exemplul 7 - Nivelul producţiei de indol în bacterie

Rezumat

A fost investigată abilitatea bacteriei invenţiei de a produce indol. Indolul a fost implicat în atenuarea inflamaţiei şi stresului oxidativ.

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

ATCC 11775 este o tulpină bacteriană de referinţă care este cunoscută că produce indol.

Metodă

Celulele bacteriene intacte în fază staţionară au fost incubate cu 6mM Triptofan timp de 48 ore. Speciile bacteriene care posedă enzima triptofanază vor utiliza triptofanul ca substrat pentru a produce indol. După o perioadă de incubare de 48 ore, supernatantul a fost îndepărtat şi s-a adăugat la reactiv Kovac pentru cuantificarea indolului. Standardele, soluţiile stoc şi reactivii au fost preparaţi utilizând metode standardizate validate intern.

Rezultate

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figura 9. Figura 9 arată că MRx0005 are capacitatea de a produce indol din triptofan, la concentraţii de aproximativ 0,2mM.

Exemplul 8 - Nivelul producţiei de kinurenine în bacterie

Rezumat

A fost investigată abilitatea bacteriei invenţiei de a produce kinurenină. Dereglarea căii kinurenine poate conduce la activarea sistemului imunitar şi acumularea de compuşi potenţial neurotoxici. Alterările în metabolismul kinureninelor pot fi implicate în dezvoltarea bolii Parkinson.

Tulpină bacteriană

755: Parabacteroides distasonis

DSM 17136 este o tulpină de Bacteroides copricola care este cunoscută că produce kinurenine.

Metodă

Supernatanţii fără celule de culturi bacteriene de fază staţionară au fost izolaţi prin centrifugare şi filtraţi într-un filtru de 0,22 uM şi congelaţi până la utilizare. Standardele de kinurenine, soluţiile stoc şi reactivii au fost preparaţi utilizând metode standardizate validate intern. Mostra a fost tratată cu acid tricloroacetic şi centrifugată la 10.000xg timp de 10 minute la 4°C. Supernatantul a fost colectat şi dispensat într-o placă cu 96 godeuri. S-a utilizat reactivul Ehrlich pentru detecţia kinureninei şi s-a adăugat la un raport de 1:1.

Rezultate

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figura 10. Figura 10 arată că MRx0005 are capacitatea de a produce kinurenine la o concentraţie de aproximativ 70 µM.

Exemplul 9 - neuroprotecţia

Celulele SHSY-5Y diferenţiate RA au fost tratate cu MPP+, metabolitul activ al MPTP, utilizat chimic pe larg pentru a imita in vitro şi in vivo unele din caracteristicile patologiei PD. Viabilitatea celulară a fost măsurată ca rată de mitocondrii respirate (Figura 11). Ambele MRx0005 şi MRx0029 au prezentat efecte semnificative şi promovează per se o creştere a activităţii metabolice a mitocondriilor în celulele SHSY-5Y. Protecţia MRx0005 a fost de aproximativ 20% în comparaţie cu mostra tratată cu YCFA-MPP+, aproximativ aceeaşi observată pentru controlul pozitiv cu quercetin (Fig. 11).

Exemplul 10 - Producţie de metaboliţi - metaboliţi în creier

Fundal

Metaboliţi prezenţi în supernatanţii bacteriei pot influenţa direct răspunsul gazdei la stresul oxidativ, comunicaţia celulă-cu-celulă şi neuroprotecţia. Metaboliţii care joacă un rol cheie în procesele neurologice au fost măsuraţi în timpul ex vivo screening-ului în ţesutul cerebral al şoarecilor hrăniţi cu MRx0005 şi MRx0029.

Metode

Animale

Şoarecii masculi adulţi BALBc (Envigo, UK) au fost găzduiţi în grup sub un ciclu lumină-întuneric de 12 ore; mȃncarea standard pentru rozătoare şi apa au fost disponibile ad libitum. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Recomandările Europene după aprobarea de către University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee. Animalele au fost în vȃrstă de 8 săptămâni la începerea experimentului.

Conceperea studiului

Animalele au fost lăsate să habiteze în camera lor de deţinere timp de o săptămână după sosirea în unitatea pentru animale. Ele primesc gavaj oral (doză de 200µL) de bioterapeutice vii la o doză de 1 X 109 CFU timp de 6 zile consecutive între 15:00 şi 17:00. În ziua 7, animalele sunt decapitate, şi ţesuturile sunt recoltate pentru experimentare.

Colectarea ţesutului

Animalele au fost sacrificate într-o manieră aleatoare cu privire la tratament şi afecţiunea testată; luarea unei mostre a avut loc între 9,00 a.m. şi 1:00 p.m. Sângele recoltat a fost colectat în tuburi EDTA (Acid acetic tetra diamin etilenic) de potasiu şi centrifugat timp de 15 min la 4000 g. Plasma a fost izolată şi depozitată la -80°C pentru analiză ulterioară. Creierul a fost repede excizat, disecat şi fiecare regiune a creierului a fost congelată instantaneu pe gheaţă uscată şi depozitată la -80°C pentru analiză ulterioară. Splina a fost îndepărtată şi procesată imediat după eliminare pentru stimulare imună ex-vivo. Ţesut intestinal (segmentele de ileum şi colon de 2 cm cele mai apropiate de cecum au fost excizate, şi cel mai îndepărtat 1cm de ţesut faţă de cecum au fost utilizate) a fost montat în camere de utilizare pentru testul de permeabilitate intestinală. Cecumul a fost îndepărtat, cântărit şi depozitat la -80°C pentru analiza SCFAs.

Analiza monoamină

Concentraţia neurotransmiţătorului a fost analizată prin HPLC pe mostre din trunchiul cerebral. Pe scurt, ţesutul trunchiului cerebral a fost sonicat în 500 µl de fază mobilă răcită presărată cu 4 ng/40 µl de N-Metil 5-HT (Sigma Chimic Co., UK) ca standard intern. Faza mobilă a conţinut 0,1 M acid citric, 5,6 mM acid octan-1-sulfonic (Sigma), 0,1 M fosfat diacid de sodiu, 0,01 mM EDTA (Alkem/Reagecon, Cork) şi 9% (v/v) metanol (Alkem/Reagecon) şi a fost ajustată la pH 2,8 utilizând 4 N hidroxid de sodiu (Alkem/Reagecon). Omogenaţii au fost apoi centrifugaţi timp de 15 min la 22,000 Ч g la 4°C şi 40 µl de supernatant injectat pe sistemul HPLC care a constat dintr-un controler de sistem SCL 10-Avp, un detector electrochimic LECD 6A (Shimadzu), o pompă LC-10AS, un cuptor CTO-10A, un autoinjector SIL-10A (cu mostra mai rece menţinută la 40°C) şi un degazor online Gastorr (ISS, UK). O coloană cu fază inversă (Kinetex 2,6 u C18 100 × 4,6 mm, Phenomenex) menţinută la 30°C a fost utilizată în separare (debit 0,9 ml/min). Electrodul de lucru din carbon sticlos a fost combinat cu un electrod de referinţă Ag/AgCl (Shimdazu) operat la +0,8 V şi cromatogramele generate au fost analizate utilizând software-ul de Clasă-VP 5 (Shimadzu). Neurotransmiţătorii au fost identificaţi prin timpii lor de retenţie caracteristici după cum s-a determinat prin injecţii standard, care rulează la intervale regulate în timpul analizei mostrei. Rapoartele înălţimilor maxime ale analitului versus standardul intern au fost măsurate şi comparate cu injecţia standard. Rezultatele au fost exprimate ca ng de neurotransmiţător pe g de greutate proaspătă de ţesut.

Analiza metabolitului

Pentru analiza GC-metabolitului, mostrele de supernatanţi bacterieni au fost derivate cu cloroformiat de metil utilizând o versiune puţin modificată din protocolul descris de Smart şi colab. (DOI: 10,1038/nprot,2010,108). Toate mostrele au fost analizate într-o ordine aleatoare. Analiza a fost efectuată utilizând GC (7890B, Agilent) cuplat cu un detector cvadrupol (59977B, Agilent). Sistemul a fost controlat prin ChemStation (Agilent). Seria de date a fost convertită la formatul netCDF utilizând Chemstation (Agilent), înainte ca datele să fie importate şi procesate în Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) utilizând software-ul PARADISe descris de Johnsen şi colab. (DOI: 10,1016/j.chroma.2017.04.052).

Pentru analiza acidului gras, mostrele au fost acidulate utilizând acid clorhidric, şi s-au adăugat standarde interne marcate cu deuteriu. Toate mostrele au fost analizate într-o ordine aleatoare. Analiza a fost efectuată utilizând o coloană cu polaritate ridicată (coloană Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) instalată într-un GC (7890B, Agilent) cuplat cu un detector cvadrupol (59977B, Agilent). Sistemul a fost controlat prin ChemStation (Agilent). Seria de date a fost convertită la formatul netCDF utilizând Chemstation (Agilent), înainte ca datele să fie importate şi procesate în Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) utilizând software-ul PARADISe descris de Johnsen şi colab (DOI: 10,1016/j.chroma.2017.04.052).

Rezultate - producţia de neurotransmiţători

Rezultatele sunt prezentate în Figura 12, care arată că în creierele şoarecilor alimentaţi cu MRx0029, nivelurile de noradrenalină sunt crescute (p=0,0507), însoţite de o uşoară creştere de serotonină şi 5-HIAA. Aceste date susţin analiza metabolitului prezentată mai jos, sugerând că MRx00029 este un producător major de acid 4-hidroxifenilacetic, un cunoscut antioxidant (Weon şi colab, 2016). Mai important, acidul 4-hidroxifenilacetic este un intermediar sintetic de dopamină şi norepinefrină şi o importantă moleculă bioactivă (Huot şi colab, Parkinson's Disese 2015). De fapt, în PD, modificările degenerative se extind dincolo de sistemul dopaminergic, afectând în mod egal sistemele serotonergic şi noradrenergic, care conduc în schimb la niveluri scăzute de serotonină (5-hidroxitriptamină, 5-HT) şi noradrenalină (norepinefrină) în ambele structuri striatală şi extra-striatală (Scatton B, Javoy-Agid F, Rouquier L, Dubois B, Agid Y Creier Res. 1983 Sep 26; 275(2):321-8.). L-DOPA ţinteşte în principal caracteristicile asociate cu dopamina ale PD, totuşi nu adresează scăderile în ambele 5-HT şi noradrenalină. În plus faţă de acest lucru este că cu cȃt mai lungă este durata tratamentului cu L-DOPA, cu atȃt mai vizibilă este gama complicaţiilor motoare şi nonmotoare (de exemplu dischinezie, simptome psihiatrice) (Hely MA, Morris JG, Reid WG, Trafficante R, Mov Disord. 2005 Feb; 20(2):190-9.) Prin urmare, aceste date demonstrează că bacteriile care produc acizi organici, cum ar fi acidul 4-hidroxifenilacetic sau acidul succinic, pot fi utile în terapie, în particular în tratamentul bolilor neurodegenerative.

Rezultate - producţia de metaboliţi

Metaboliţi prezenţi în supernatanţii bacterieni pot influenţa direct răspunsul gazdei la stresul oxidativ, comunicaţia celulă-cu-celulă şi neuroprotecţia în principal. Metaboliţii din supernatantul de culturi de MRX0029 şi MRX0005 au fost analizaţi şi rezultatele sunt prezentate în Figura 13.

Câţiva metaboliţi au prezentat o diferenţă frapantă între cele două tulpini analizate. Concentraţia de acid succinic a fost în special ridicată la MRx0005. Interesant, raportul mostră/mediu pentru acidul 4-hidroxifenilacetic a fost semnificativ mai ridicat la MRx0029 (Fig. 13).

Analiza acidului gras în supernatanţi a dezvăluit o dihotomie interesantă la cele două tulpini: MRx0005 a produs în principal acid acetic şi propanoic, în timp ce MRx0029 a produs acid butanoic, pentanoic şi hexanoic, atȃt în formele liniare cȃt şi în formele ramificate (Fig. 14B). Cele două tulpini au părut foarte diferite şi în particular, producţia de acid succinic şi acid 4-hidroxifenilacetic de către MRx0005 şi MRx0029 respectiv a fost notabilă (Figura 14A). Mai mult, se pare că MRx0005 produce mai mulţi acizi graşi cu catenă scurtă C2 şi C3, în timp ce MRx00029 produse mai mulţi acizi graşi cu catenă medie atȃt liniară cȃt şi ramificată, C4 (butirat), incluzând acidul hexanoic.

Acidul succinic este un metabolit ciclic Krebs implicat în fosforilarea oxidativă. Complexul de fosforilare oxidativă este o etapă cheie pentru traficul sinaptic al proteinelor şi veziculelor la regiunile proximală şi distală (Budd SL şi Nichols, 1998). Disfuncţia sa a fost raportată în tulburările neurodegenerative incluzând boală Alzheimer, boală Parkinson şi ataxie spinocerebrală de tip 1 (Manczak M şi colab. 2004; Ebadi şi colab., 2001). Aceste descoperiri sunt în special interesante deoarece acidul succinic poate augmenta activitatea mitocondriilor şi susţine neuronii vulnerabili în boala neurodegenerativă asociaţi cu proteinele pliate anormal incluzând PD (Ferro şi colab, Plos one, 2017). BDNF şi acidul succinic au ambii o activitate protectoare similară nu numai în neurodegenerare ci de asemenea şi în tulburările mentale ca depresie şi anxietate, care sunt destul de comune printre pacienţi diagnosticaţi cu PD sau AD.

Figura 14B demonstrează de asemenea că MRX0029 este un producător de butirat (acid butanoic). Acest lucru poate fi semnificativ deoarece butiratul are un rol cunoscut de reducere a impermeabilităţii barierei hematoencefalice, care are un efect neuroprotector [59]. Această proprietate a MRx0029 (şi a altor bacterii neuroprotectoare) poate contribui la eficacitatea sa.

Exemplul 11 - Modularea expresiei ARNm a proteinelor cu joncţiune strânsă

Deoarece dovezi recente sugerează că disfuncţia şi inflamaţia intestinală sunt simptome nonmotoare asociate cu PD, a fost investigată abilitatea tulpinilor bacteriene ale invenţiei de a cauza orice disfuncţie a barierei intestinale. Monostraturile celulare care produc HT29-mtx epitelial, mucin (Gagnon şi colab, J Microbiological Methods, 2013) au fost utilizate ca un model in vitro pentru a evalua întreruperea barierei intestinale şi stimularea imună după tratamentul cu MRx0005 şi MRx0029. Celulele HT29-mtx diferenţiate expuse la forbol 12-miristat-13-acetat (PMA) au secretat o cantitate semnificativă de IL-8; în contrast, tratamentul timp de 24 ore cu supernatanţi bacterieni MRx005 şi MRx0029, a indus o secreţie chiar mai scăzută de IL-8 comparativ cu ambele celule netratate şi tratate cu YCFA (Fig. 14A).

A fost apoi investigată abilitatea MRx0005 şi MRx0029 de a regla permeabilitatea epitelială prin modificarea transducţiei semnalului intracelular implicată în expresia şi localizarea proteinelor implicate în formarea barierei intestinale.

ARN a fost izolat şi analiza RT-PCR cantitativă (qRT-PCR) a fost efectuată pentru a caracteriza modificările în expresia genei proteinelor cu joncţiune strânsă în timpul incubării cu MRx0005 şi MRx0029. Administrarea de MRx0029 a sporit expresia ARNm de Occludin, Vlillin, proteină 1 şi 2 cu joncţiune strânsă (respectiv TJP1 şi TJP2) după 2 ore de incubare (Fig. 14B). În contrast, expunerea la MRx0005 nu a alterat expresia genei proteinelor cu joncţiune strânsă aratȃnd că cele două tulpini acţionează diferenţial asupra barierei intestinale.

Rezultatele in vitro au fost comparate cu date din analiza paralelă ex vivo pe intestinul şoarecilor alimentaţi cu MRx0005 şi MRx0029. Expresia genei de TJP2 şi occludin a fost cuantificată în colon şi ileum. Datele ex vivo oglindesc perfect datele in vitro deoarece MRx0029 a fost capabilă să regleze pozitiv semnificativ TJP1 şi Occludin (p=0,073) în regiunea colonului intestinului murin (Fig. 14C+14D). MRx0029 a fost de asemenea capabilă să scadă funcţia de permeabilitate în colonul aceloraşi şoareci (Fig. 14E+14F).

Materiale şi metode - extragerea ARN şi analiza qPCR

ARN total a fost extras utilizând mini trusa RNeasy (Qiagen, Manchester, JUK) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului, şi concentraţia ARN determinată prin absorbanţă la 260/280 nm utilizând un spectrofotometru (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE). Pentru analiza expresiei ARNm, ADNc a fost preparat din 2000 ng din ARN total utilizând trusa de transcripţie inversă ADNc de capacitate ridicată (Thermo Fisher, Loughborough) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului. Reacţiile de transcipţie inversă au fost efectuate într-un termociclator (Biometra, Germania) la 25°C timp de 10 min, 37°C timp de 120 min, şi 85°C timp de 5 min. ADNc rezultat a fost amplificat în duplicate prin testul SYBR-Green PCR, şi produsele au fost detectate pe o maşină PCR în timp real QuantStudio 7 (Applied Biosystems, UK) utilizând un profil standardizat (denaturare iniţială de 95°C timp de 10 minute, urmată de 40 cicluri de 10 secunde de denaturare la 95°C şi 30 secunde de recoacere/extensie la 60°C). S-a adăugat o etapă de disociere după 40 cicluri pentru a genera o curbă de topire. Analiza a fost efectuată utilizând software-ul Applied Biosystems QuantStudio Real-Time PCR v1.2. Secvenţele iniţiatoare pentru Actină, Villin, Occludin TJP1 şi TJP2 sunt furnizate în lista de secvenţe.

Exemplul 12 - Nivelul secreţiei de BDNF în celulele SHSY-5Y

Fundal

Factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF) este o moleculă omniprezentă în creier asociată cu dezvoltarea neurală, neuroprotecţia şi neuroregenerarea. BDNF nu numai că protejează împotriva neurodegenerării ci de asemenea şi împotriva tulburărilor mentale ca depresia şi anxietatea, care sunt destul de comune printre pacienţi diagnosticaţi cu PD sau AD.

Metode

SH-SY5-SY au fost placate pe placă cu 24 de godeuri la densitatea de 60.000 celule/godeu şi plasate în incubator. După 24 ore, mediul a fost înlocuit cu mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând 1% FBS) şi 10 µM acid retinoic. Mediul de diferenţiere a fost înlocuit în fiecare altă zi şi celulele au fost utilizate în ziua 10 de diferenţiere. Pentru tratament, mediul de diferenţiere a fost îndepărtat şi înlocuit cu 450ul de mediu de creştere deplin şi s-au adăugat 50 µl de bacterii SN la godeurile tratate sau s-a adăugat YCFA+ ca control negativ.

Rezultate

Rezultatele sunt prezentate în Figura 15, care arată că administrarea de MRX0005 în combinaţie cu acidul retinoic creşte secreţia de BDNF din celulele neuroblastom diferenţiate.

Exemplul 13 - Eficacitatea inoculării bacteriene pentru reducerea nivelurilor oxidative în celule

Fundal

Generarea de specii reactive de oxigen contribuie la patologia bolilor neurodegenerative. A fost investigată abilitatea tulpinilor bacteriene de a proteja celulele diferenţiate SHSY-5Y şi U373 din specii reactive de oxigen (ROS) generate prin tratamentul cu peroxid de hidrogen terţ-butil (TBHP).

Material şi Metode

Tulpină bacteriană

Megasphaera massiliensis MRX0029

Metodă

Celulele SHSY-5Y au fost placate pe o placă neagră cu fund plat cu 96 de godeuri la densitatea de 5000 celule/godeu şi plasate în incubatorul CO2. După 24 ore, mediul au fost înlocuit cu mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând 1% FBS) şi 10 µM acid retinoic. Mediul de diferenţiere a fost înlocuit în fiecare altă zi. În ziua 10 mediul de diferenţiere a fost îndepărtat şi celulele au fost spălate cu PBS preîncălzit şi colorate cu 10uM sondă moleculară DCFDA timp de 20 minute în mediu de creştere conţinând 1% FBS. Apoi celulele au fost spălate din nou cu PBS preîncălzit şi tratate cu 100uM TBHP în prezenţa sau absenţa a 10% supernatant bacterian timp de 2 ore. Intensitatea fluorescenţei a fost măsurată utilizând cititorul de placă TECAN la Ex/Em 485/530 nm.

Rezultate

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figura 16. Figura 16b arată că MRX0005 este capabilă să inhibe producţia de ROS în celulele neuroblastom SHSY-5Y diferenţiate. MRX0005 reduce de asemenea generarea de ROS în celulele astroglioblastom (Figura 16a). Acest lucru arată că MRX0005 are activitate generală antioxidantă.

Exemplul 14 - Testarea stabilităţii

O compoziţie descrisă aici conţinând cel puţin un tulpină bacteriană descrisă aici este depozitată într-un recipient etanşat la 25°C sau 4°C şi recipientul este plasat într-o atmosferă având 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% sau 95% umiditate relativă. După 1 lună, 2 luni, 3 luni, 6 luni, 1 an, 1,5 ani, 2 ani, 2,5 ani sau 3 ani, cel puţin 50%, 60%, 70%, 80% sau 90% din tulpina bacteriană va rămâne după cum s-a măsurat în unităţi de formare ale coloniilor determinate prin protocoale standard.

Exemplul 15

Metode

Animale

Animalele şi conceperea studiului utilizate au fost aceleaşi ca pentru Exemplul 10.

Tulpini bacteriene

• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)

• Megasphaera massiliensis (MRX0029)

Colectarea ţesutului

Animalele au fost sacrificate într-o manieră aleatoare cu privire la tratament şi afecţiunea testată; luarea mostrei a avut loc între 9,00 a.m. şi 2:30 p.m. Sângele recoltat a fost colectat în tuburi EDTA (Acid acetic tetra diamin etilenic) de potasiu şi centrifugat timp de 15 min la 4000 g. Plasma a fost izolată şi depozitată la -80°C pentru analiză ulterioară. Creierul a fost repede excizat, disecat şi fiecare regiune a creierului a fost congelată instantaneu pe gheaţă uscată şi depozitată la -80°C pentru analiză ulterioară. Splina a fost îndepărtată, colectată în 5 mL mediu RPMI (cu L-glutamină şi bicarbonat de sodiu, R8758 Sigma + 10 % FBS (F7524, Sigma) + 1% Pen/Strep (P4333, Sigma)) şi procesată imediat după sacrificare pentru stimulare imună ex-vivo. Ţesutul intestinal (2-3 cm de segmente de ileum şi colon cele mai apropiate de cecum au fost excizate, şi cei mai îndepărtaţi 1cm 2cm de ţesut din cecum au fost utilizaţi) a fost montat în camere de utilizare pentru testul de permeabilitate intestinală. Cecumul a fost îndepărtat, cântărit şi depozitat la -80°C pentru analiza SCFAs.

Analiza monoamină

Concentraţia neurotransmiţătorului a fost analizată cum s-a descris în Exemplul 10

Test de citokine ale splinei

Splinele au fost colectate imediat în 5mL mediu RPMI după sacrificare şi cultivate imediat. Celulele din splină au fost mai întȃi omogenizate în acest mediu RPMI, urmate de 5 minute incubare cu 1ml tampon de lizare RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). S-au adăugat 10 ml suplimentari de mediu RPMI, urmaţi de 200G centrifugare timp de 5 minute. Supernatantul a fost apoi filtrat printr-un filtru de 40um. Celulele au fost numărate şi însămânţate (mediu 4.000.000/mL). După 2,5 ore de adaptare, celulele au fost stimulate cu lipopolizaharidă (LPS-2 µg/ml) sau concanavalin A (ConA-2,5 µg/ml) timp de 24 ore. După stimulare, supernatanţii au fost recoltaţi pentru a evalua eliberarea citokinelor utilizând trusa V-PLEX cu Panou 1 Proinflamator (şoarece) (Meso Scale Discovery, Mariland, SUA) pentru TNFα, IL-10, IL-1β, Interferon γ, CXCL2 şi IL6. Analizele au fost efectuate utilizând MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600.

Analiza expresiei genelor

ARN total a fost extras utilizând trusa de izolare ARNmi mirVana™ (Ambion/Llife technologies, Paisley, UK) şi tratat cu DNase (Turbo ADN-free, Ambion/Life Technologies) în conformitate cu recomandările fabricantului. ARN a fost cuantificat utilizând spectrofotometrul NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, SUA) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului. Calitatea ARN a fost evaluată utilizând bioanalizorul Agilent (Agilent, Stockport, UK) în conformitate cu procedura fabricantului şi a fost calculat un număr de integritate ARN (RIN). ARN cu valoarea RIN >7 a fost utilizat pentru experimentele ulterioare. ARN a fost transcris invers la ADNc utilizând trusa ADNc de capacitate ridicată Applied Biosystems (Applied Biosystems, Warrington, UK) în conformitate cu instrucţiunile fabricantului. Pe scurt, transcriptaza inversă Multiscribe (50 U/µL) (1)(2)(1)(10) a fost adăugată ca o parte din amestecul de bază RT, incubată la 25°C timp de 10 min, 37°C timp de 2 ore, 85°C timp de 5 min şi depozitată la 4°C. A fost efectuată PCR cantitativă utilizând sonde (6 carboxi fluoresceină - FAM) concepute de Applied Biosystems la genele de şoarece ţintite specific, în timp ce utilizează β-actina ca un control endogen. Reacţiile de amplificare au conţinut 1 µl ADNc, 5 µl de amestec de bază 2X PCR (Roche), 900 nM din fiecare iniţiator şi au fost aduse la un total de 10 µl prin adăugarea de apă fără RNase. Toate reacţiile au fost efectuate în triplicat utilizând plăci cu 96 de godeuri pe sistemul LightCycler®480. Condiţiile de termociclare au fost după cum s-a recomandat de fabricant (Roche) pentru 55 cicluri. Pentru a verifica contaminarea ampliconului, fiecare rulare nu a conţinut nici un control de tipar în triplicat pentru fiecare sondă utilizată. Valorile pragului de ciclu (Ct) au fost înregistrate. Datele au fost normalizate utilizând β-actină şi transformate utilizând metoda 2-ΔΔCT şi prezentate ca modificare de pliere vs. grupul de control.

Analiza acizilor graşi cu catenă scurtă în conţinutul cecal

Conţinutul de cecum a fost amestecat şi vortexat cu apă MilliQ şi incubat la temperatura camerei timp de 10 min. Supernatanţii au fost obţinuţi prin centrifugare (10000 g, 5 min, 4°C) la bacteriile peletului şi a altor solide şi filtrare la 0,2µm. A fost transferat la o fiolă GC limpede şi s-a utilizat acid 2-Etilbutiric (Sigma) ca standard intern. Concentraţia de SCFA a fost analizată utilizând un sistem de ionizare cu flamă Varian 3500 GC, ajustat cu o coloană ZB-FFAP (30 m x 0,32 mm x 0,25 mm; Phenomenex). A fost construită o curbă standard cu diferite concentraţii ale unui amestec standard conţinând acetat, propionat, izo-butirat, n-butirat, izovalerat şi valerat (Sigma). Maximele au fost integrate utilizȃnd software-ul staţiei de lucru Varian Star Chromatography versiunea 6.0. Toate datele SCFA sunt exprimate ca µmol/g.

Analiza statistică

Datele normal distribuite sunt prezentate ca medie ± SEM; seturile de date neparametrice sunt prezentate ca medie cu interval inter-cvartilă. S-a aplicat testul t neîmperecheat bidirecţional pentru a analiza datele parametrice şi testul Mann-Whitney a fost utilizat pentru datele neparametrice. Coeficientul de corelare a gradului Spearman a fost utilizat pentru analiza de corelaţie în seturile de date grupate. O valoare p < 0,05 a fost considerată semnificativă în toate cazurile.

Rezultate - Producţia de neurotransmiţători

Rezultatele din Figura 17 prezintă efectul tratamentului cu MRx005 asupra concentraţiei de neurotransmiţători în creierul şoarecilor. Cel mai notabil, tratamentul cu MRx005 conduce la o scădere în dopamină.

Rezultate - Expresia genei

Expresia genelor pentru receptorii neurotransmiţători [receptor de serotonină 1a(5-HTR1a), receptor D1 de dopamină, subunitatea B1 a receptorului GABA, receptorul GABAA, receptorii NMDA2A (Grin2A) şi NMDA2B (Grin2b)], markerii inflamatori [IL-1β, IL6, CD11b, TNFα şi TLR4], şi markerii endocrini [factor de eliberare al corticosteronului (CRF), receptorii 1 şi 2 ai factorului de eliberare al corticosteronului (CRFR1, CRFR2), factor neurotrofin derivat din creier (BDNF), receptor vasopresin, receptor oxitocin, receptor glucocorticoid şi receptor mineralocorticoid] au fost analizaţi în ţesutul cerebral din hipocampus, amigdală şi cortexul prefrontal.

Figurile 18-32 prezintă modificările în expresia genei după tratamentul cu MRX005 sau MRX0029 în hipocamp, amigdală şi cortexul prefrontal. Tratamentul cu MRx0029 a condus la o creştere în expresia receptorului glucocorticoid în amigdală (Figura 25C). Figura 26A arată că MRx005 a crescut semnificativ expresia de BDNF în amigdală, în timp ce tratamentul cu MRx0029 a crescut semnificativ expresia de TLR4 în amigdală (Figura 26B).

Ambele MRx005 şi MRx0029 pot creşte expresia de CD11b în amigdală (Figura 27A), în timp ce expresia de IL-6, Grin2a şi Grin2b este redusă după tratamentul cu MRx005 (Figurile 27B-D). În plus, MRx005 şi MRx0029 au crescut semnificativ expresia de GABRA2 şi au crescut expresia de GABBR1 în amigdală.

Tratamentul cu MRx005 a condus la o creştere semnificativă în expresia de BDNF în cortexul prefrontal (Figura 29B).

Discuţie

Administrarea de MRx005 şi MRx0029 a cauzat modificări în expresia genei, în special în amigdală.

Rezultate - Efect asupra expresiei de Tph1 şi IDO-1

Figura 33 arată că MRx0029 poate creşte semnificativ expresia de triptofan hidroxilază-1 (Tph1) în colon şi că tratamentul cu MRX005 poate creşte expresia de IDO-1 în colon. Tratamentul cu MRX005 a crescut expresia de Tph1 şi IDOl în ileum, în timp ce MRX029 nu a avut efect asupra expresiei acestor gene în ileum (Figura 34).

Indolamina-pirol 2,3-dioxigenază-1 (IDO-1) este prima enzimă şi limitatoare de rată în calea triptofan/kinurenină în timp ce triptofan hidroxilaza 1 (Tph1), o izoformă a enzimei triptofan hidroxilază, este responsabilă pentru sinteza serotoninei. Aceste date sugerează că MRx0029 şi MRx005 pot afecta nivelurile de serotonină şi calea triptofan/kinurenină.

Rezultate - Efectul asupra nivelurilor de metaboliţi triptofan

Figura 35 prezintă efectul tratamentului cu MRx005 asupra nivelurilor de kinurenină şi triptofan în circulaţie.

Rezultate - Efectul asupra expresiei de citokine din splenocite

Testul de splenocite ex-vivo implică provocarea splenocitelor (celule izolate din splină - un organ principal implicat în apărarea imună), cu o provocare bacterio sau viral mimetică.

MRX005 a redus semnificativ nivelurile de interferon-y în splenocite după o provocare cu LPS (Figura 36). În plus, MRX005 a redus nivelurile de interleukină-6 şi factorul de necroză tumorală după o provocare cu LPS (Figurile 38 şi 39, respectiv). Tratamentul cu MRx0029 a condus la o reducere de interferon-y, interleukină-1β şi interleukină-6 după o provocare cu LPS (Figurile 36, 37 şi 38, respectiv).

Tratamentul cu MRx005 şi MRx0029 a condus la o creştere în nivelurile de chemoatractant CXCL1 (Figura 41).

Rezultate - Efect asupra nivelurilor de acizi graşi cu catenă scurtă cecali

Acizii graşi cu catenă scurtă (SCFAs) sunt produşi când fibrele nedigerabile din dietă sunt fermentate de bacterii în intestin. Efectele administrării de MRX005 sunt prezentate în Figura 42.

Exemplul 16 - Analiza suplimentară a modificărilor MRX029 şi MRX005 în expresia nivelurilor genei

Metode

Linie celulară

Celule SH-SY5Y

Tulpini bacteriene

• 755: Parabacteroides distasonis (MRX005)

• Megasphaera massiliensis (MRX0029)

qPCR

SH-SY5Y au fost placate în plăci Petri de 10 cm la o densitate de 2x106 celule. După 24 ore celulele au fost tratate în mediu de diferenţiere (mediu de creştere conţinând 1% FBS fără RA) cu 10% supernatanţi bacterieni sau YCFA+, 10uM RA, 200uM acid hexanoic sau 200uM acid valproic, timp de 17 ore. După aceea au fost luate imagini reprezentative utilizând microscopul de bază EVOS XL cu contrast de fază la o amplificare de 40X/0,65. Celulele au fost colectate, şi ARN total a fost izolat în conformitate cu protocolul mini trusei RNeasy (Qiagen). ADNc-urile au fost făcute utilizând trusa de transcripţie inversă ADNc de capacitate ridicată (Applied Biosystems). Expresia genei a fost măsurată utilizând qPCR. GAPDH a fost utilizat ca control intern. Modificarea plierii a fost calculată în conformitate cu metoda 2(-ΔΔct). Secvenţele iniţiatoare pentru MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 şi NSE sunt furnizate în lista de secvenţe.

Imuno-marcarea şi imagistica celulară

Celulele au fost însămânţate pe lamele cameră cu 8 godeuri (Marienfeld Laboratory Glassware) la 5x104 celule/godeu peste noapte şi au fost tratate cu 10% supernatant bacterian timp de 24 ore. Pentru diferenţiere, celulele au fost tratate cu 10 nM RA timp de 5 zile înainte de tratarea cu supernatant bacterian fără celule timp de 24 ore. După aceea, celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 20 minute la temperatura camerei (RT). Celulele fixate au fost spălate cu PBS, şi permeabilizate cu 1% Triton X-100 în PBS timp de 10 minute. După spălarea cu PBS, lamelele au fost incubate cu tampon de blocare (4% BSA/PBS) timp de 1 oră la RT înainte de adăugarea de anticorp anti-MAP2 sau β3-tubulină (sc-74421 şi sc-80005 respectiv, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluat în 1% BSA/PBS timp de 12 ore la 4°C. Ele au fost apoi spălate de două ori cu PBS, urmată de incubare cu Alexa Flour 488 conjugat anti-şoarece (Molecular Probes Inc) şi Alexa Flour 594 conjugat Phalloidin (ab176757, Abcam) timp de 1 oră la RT. După spălarea 3X cu PBS, lamelele au fost colorate cu DAPI şi montate cu Vectashield® (Vector Laboratories). Lamelele au fost vizualizate utilizând un microscop Axioskop 50 (Zeiss) echipat cu un obiectiv 63x/1,2 W Korr şi s-au utilizat seturi de filtre adecvate pentru detecţia fluorocromului. Timpii de expunere manuali pentru achiziţia digitală de imagini imuno-etichetate cu MAP-2 au fost ţinuţi constanţi permiţând comparaţia între diferite godeuri şi tratamente. Timpii de expunere Phalloidin (F-actină) şi DAPI au variat pentru a se potrivi cȃmpului vizual. Domeniile vizuale aleatoare au fost obţinute utilizând o cameră QImaging controlată prin software-ul Image Pro Plus. Imaginile au fost salvate ca fişiere TIFF şi deschise în Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Imaginile MAP-2, DAPI şi imaginile Phalloidin au fost apoi suprapuse şi îmbinate. Imaginile reprezentative au fost selectate pentru a ilustra diferenţele în abundenţă şi locaţie ale proteinelor examinate.

Imunocolorare

Celulele SH-SY5Y cultivate sub condiţiile indicate descrise mai sus, tratate cu MRx0005 şi MRx0029 timp de 24 ore şi apoi lizate în tampon RIPA conţinând amestec de inhibitori de protează (Roche Diagnostics, UK). Concentraţia de proteină a fost estimată utilizând trusa de testare a proteinei BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), separată cu SDS-PAGE şi transferată la o membrană PVDF. Membranele au fost apoi blocate cu 5% lapte uscat fără grăsime sau 5% BSA şi incubate peste noapte la 4°C cu anticorpi primari (respectiv MAP2 şi β3-tubulină). Petele au fost apoi incubate cu anticorp secundar conjugat cu peroxidază din hrean adecvată (HRP), şi proteinele au fost detectate cu trusa de detecţie a chemiluminiscenţei (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Pentru ambele MAP2 şi β3-tubulină, β-actina a servit ca control pentru a monitoriza variabilitatea de încărcare a proteinei printre mostre.

Rezultate şi discuţie

Expresia genei

Figura 43 prezintă modificările induse de MRx0029 şi MRX005 în nivelurile de expresie de Actină, Villin, Occludin TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 şi NSE.

Rezultate - Microscopie şi imunocolorare

Figura 44 prezintă modificarea în nivelul de expresie al MAP2 în celulele SHSY5Y după cum s-a determinat prin microscopia confocală. Nivelurile de expresie ale MAP2 şi B3-tubulinei au fost de asemenea cuantificate prin analiză de imunocolorare. Rezultatele prezentate în figura 44M şi N au indicat că MRX029 induce o creştere în expresia nivelului de MAP2.

Secvenţe

Iniţiatori suplimentari utilizaţi în qPCR (cu SEQ ID NO în paranteze)

ID genă Secvenţă directă Secvenţă inversă NSE CCCTGTATCGTAAGAACGGT (30) GCCACCATTGATCACGTTGA (31) PINK1 CCCAAGCAACTAGCCCCTC (32) GGCAGCACATCAGGGTAGTC (33) PARK7 GTAGCCGTGATGTGGTCATTT (34) CTGTGCGCCCAGATTACCT (35) SYP CTCGGCTTTGTGAAGGTGCT (36) GGCTTCATGGCATCAACTTCA (37)

Secvenţe

SEQ ID NO:10 (secvenţă genom a tulpinei 755) - vezi lista de secvenţe electronică din WO2018229189.

Iniţiatori utilizat pentru qPCR (cu SEQ ID NO în paranteză)

Nume Secvenţă directă Secvenţă inversă ACTB GATCAAGATCATTGCTCCTC (12) TTGTCAAGAAAGGGTGTAAC (13) GAPDH GGTATCGTGGAAGGACTCATG (14) ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC (15) MAP2 CTCAGCACCGCTAACAGAGG (16) CATTGGCGCTTCTCTCCTC (17) Occludin AAGAGGAATTTTGACACTGG (18) GCCATGTACTCTTCACTTTC (19)

TJ1 AAGTCACACTGGTGAAATCC (20) CTCTTGCTGCCAAACTATCT (21) TJP2 CCCTCCCCTGGATCAGGAT (22) GCCATCAAACTCGTCCATCA (23) Villin CATTACCTGCTCTACGTTTG (24) AGATGGACATAAGATGAGGTG (25)

REFERIRI

[1] Spor şi colab. (2011) Nat Rev Microbiol. 9(4):279-90.

[2] Eckburg şi colab. (2005) Science. 10;308(5728):1635-8.

[3] Macpherson şi colab. (2001) Microbes Infect. 3(12):1021-35

[4] Macpherson şi colab. (2002) Cell Mol Life Sci. 59(12):2088-96.

[5] Mazmanian şi colab. (2005) Cell 15;122(1):107-18.

[6] Frank şi colab. (2007) PNAS 104(34):13780-5.

[7] Scanlan şi colab. (2006) J Clin Microbiol. 44(11):3980-8.

[8] Kang şi colab. (2010) Inflamm Bowel Dis. 16(12):2034-42.

[9] Machiels şi colab. (2013) Gut. 63(8):1275-83.

[10] WO 2013/050792

[11] WO 03/046580

[12] WO 2013/008039

[13] WO 2014/167338

[14] Goldin şi Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suppl 2:S96-100.

[15] Azad şi colab. (2013) BMJ. 347:f6471.

[16] Mayer şi colab (2014) The Journal of Neuroscience 34(46):15490 -15496

[17] Cryan şi Dinan (2015) Neuropsychofarmacology, 40: 241-2.

[18] Zhou şi Foster (2015) Neuropsychiatric Disease and Treatment 11: 715-723.

[19] Wang şi Kasper (2014) Brain Behav Immun. 38: 1-12.

[20] WO2016/203220

[21] Capitol 38 - Nonsteroidal anti-inflammatory drugs exposure and the central nervous system (2014) Handbook of Clinical Neurology 119, 577-584

[22] Sakamoto şi Benno (2006) Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 7):1599-605.

[23] Masco şi colab. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.

[24] Srůtkovб şi colab. (2011) J. Microbiol. Methods, 87(1):10-6.

[25] Pal R şi colab, Neurol Res 2016, 38(12):1111-1122

[26] Daniele SG şi colab, Sci Signal 2015, 8(376):ra45

[27] Wang şi colab. (2016) J Neurogastroenterol Motil 22: 589-605.

[28] Foguem & Manckoundia (2018) Current Neurology and Neuroscience Reports, 18: 24

[29] Ludolph şi colab. (2009) Eur J Neurol. 16(3): 297-309.

[30] Galpern & Lang (2006) Neurological Progress 59 (3) 449-458

[31] Zadori şi colab (2012) Journal of Neural Transmission, 119, 2, 275-283

[32] Lee şi colab (2008) Europaan J. Cell Biology 87:389-397

[33] Pirooznia şi Elefant (2013) Front Cell Neurosci. 7: 30.

[34] Tang, şi colab. (2017) JAm Heart Assoc, 6(10).

[35] Wang şi colab. (2015) PNAS 112(9):2583-2858

[36] Psaty şi colab. (2003) JAMA, 289(19):2534-44

[37] Lancet. (1995) 346(8991-8992):1647-53

[38] Miyamoto-Shinohara şi colab. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.

[39] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. de Day şi McLellan, Humana Press.

[40] Leslie şi colab. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61, 3592-3597.

[41] Mitropoulou şi colab. (2013) J Nutr Metab. (2013) 716861.

[42] Kailasapathy şi colab. (2002) Curr Issues Intest Microbiol. 3(2):39-48.

[43] Handbook of Pharmaceutical Excipients, ediţia a 2-a, (1994), editat de A Wade şi PJ Weller

[44] Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)

[45] US 2016/0067188

[46] Handbook of Microbilological Media, ediţia a patra (2010) Ronald Atlas, CRC Press.

[47] Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press

[48] Strobel (2009) Methods Mol Biol. 581:247-61.

[49] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. A 20-a ediţie, ISBN: 0683306472.

[50] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream şi colab., eds., 1998, Academic Press).

[51] Methods In Enzymology (S. Colowick şi N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)

[52] Handbook of Experimental Immunology, Volumele I-IV (D.M. Weir şi C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)

[53] Sambrook şi colab. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ediţia a 3-a (Cold Spring Harbor Laborator Press).

[54] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)

[55] Ausubel şi colab. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, ediţia a 5-a (Current Protocols).

[56] PCR (Introduction to Biotechniques Series), ed. a 2-a (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)

[57] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel şi colab., eds., 1987) Supliment 30

[58] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489.

[59] Michel şi Prat (2016) Ann Transl Med. 4(1): 15.

LISTĂ DE SECVENŢE

<110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED

<120> COMPOZIŢII CUPRINZВND TULPINI BACTERIENE

<130> P070771EP

<141> 2018-06-14

<150> GB 1709465,7

<151> 2017-06-14

<150> GB 1709526,6

<151> 2017-06-15

<150> GB 1805990,7

<151> 2018-04-11

<150> GB 1805989,9

<151> 2018-04-11

<150> GB 1806780,1

<151> 2018-04-25

<150> GB 1805991,5

<151> 2018-04-11

<150> GB 1806779,3

<151> 2018-04-25

<160> 25

<170> SeqWin2010, versiunea 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 1

<210> 2

<211> 1486

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 2

<210> 3

<211> 1486

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 3

<210> 4

<211> 1486

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 4

<210> 5

<211> 1486

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 5

<210> 6

<211> 1486

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 6

<210> 7

<211> 1492

<212> ADN

<213> Parabacteroides merdae

<400> 7

<210> 8

<211> 1492

<212> ADN

<213> Parabacteroides merdae

<400> 8

<210> 9

<211> 1403

<212> ADN

<213> Parabacteroides distasonis

<400> 9

<210> 11

<211> 1398

<212> ADN

<213> Megasphaera massiliensis

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 12

gatcaagatc attgctcctc 20

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 13

ttgtcaagaa agggtgtaac 20

<210> 14

<211> 21

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 14

ggtatcgtgg aaggactcat g 21

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 15

atgccagtga gcttcccgtt c 21

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 16

ctcagcaccg ctaacagagg 20

<210> 17

<211> 19

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 17

cattggcgct tctctcctc 19

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 18

aagaggaatt ttgacactgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 19

gccatgtact cttcactttc 20

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 20

aagtcacact ggtgaaatcc 20

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 21

ctcttgctgc caaactatct 20

<210> 22

<211> 19

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 22

ccctcccctg gatcaggat 19

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 23

gccatcaaac tcgtccatca 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 24

cattacctgc tctacgtttg 20

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Iniţiator

<400> 25

agatggacat aagatgaggt g 21

Claims

1. O compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a unei tulburări neurodegenerative selectată din grupul constând din boală Parkinson, incluzând paralizie supranucleară progresivă, sindrom Steele-Richardson-Olszewski, hidrocefalee cu presiune normală, parkinsonism vascular sau arteriosclerotic şi parkinsonism indus de medicamente; boală Alzheimer, incluzând sindrom Benson; boală Huntington; scleroză laterală amiotrofică; boală Lou Gehrig; boală a neuronului motor; boală prion; ataxie spinocerebrală; atrofie musculară spinală; demenţă, incluzând corpi Lewy, demenţă vasculară şi frontotemporală; afazie progresivă primară; depreciere cognitivă uşoară; depreciere cognitivă asociată cu HIV şi degenerare corticobazală.

2. Compoziţia pentru utilizare conform revendicării 1, în care compoziţia este pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii Parkinson.

3. Compoziţia pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 1-2, în care compoziţia este pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a debutului timpuriu al bolii neurodegenerative.

4. Compoziţia pentru utilizare conform cu oricare din revendicările precedente, în care compoziţia este pentru utilizare într-o metodă de prevenire sau întȃrziere a debutului sau progresului unei tulburări neurodegenerative.

5. O compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană din genul Parabacteroides, pentru utilizare într-o metodă de tratare a leziunii creierului.

6. Compoziţia pentru utilizare conform revendicării 5, în care leziunea creierului este accident vascular cerebral, cum ar fi ischemie cerebrală, ischemie cerebrală focală, accident vascular cerebral ischemic sau accident vascular cerebral hemoragic.

7. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană este de Parabacteroides distasonis.

8. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu secvenţa ARNr 16s a unei tulpini bacteriene de Parabacteroides distasonis.

9. Compoziţia pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările 1-7, în care tulpina bacteriană are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8 sau 9.

10. Compoziţia pentru utilizare conform revendicării 9, în care tulpina bacteriană are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO:9, sau în care tulpina bacteriană are secvenţa ARNr 16s reprezentată de SEQ ID NO:9.

11. Compoziţia pentru utilizare conform revendicării 1, în care compoziţia cuprinde o tulpină bacteriană a speciilor Parabacteroides distasonis, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a bolii Parkinson.

12. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care compoziţia este pentru administrare orală; şi/sau în care compoziţia cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi acceptabili farmaceutic sau purtător; şi/sau în care tulpina bacteriană este liofilizată.

13. Un produs alimentar cuprinzând compoziţia oricăreia din revendicările precedente, pentru utilizarea oricăreia din revendicările precedente.

14. O celulă de tulpină Parabacteroides distasonis depozitată sub numărul de acces NCIMB 42382, pentru utilizare în tratarea sau prevenirea unei tulburări neurodegenerative, în care celula este pentru utilizare într-o metodă definită în oricare dintre revendicările 1-4.

15. Celula conform revendicării 14, în care tulburarea neurodegenerativă este boala Parkinson.