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WO2025083364A1 - Composition cosmetique comprenant des protozoaires - Google Patents

Composition cosmetique comprenant des protozoaires Download PDF

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Publication number
WO2025083364A1
WO2025083364A1 PCT/FR2024/051361 FR2024051361W WO2025083364A1 WO 2025083364 A1 WO2025083364 A1 WO 2025083364A1 FR 2024051361 W FR2024051361 W FR 2024051361W WO 2025083364 A1 WO2025083364 A1 WO 2025083364A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
skin
hair
composition according
aging
cosmetic composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/FR2024/051361
Other languages
English (en)
Inventor
Fabrice PLASSON
Sandrine TROUSSIEUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amoeba SA
Original Assignee
Amoeba SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amoeba SA filed Critical Amoeba SA
Publication of WO2025083364A1 publication Critical patent/WO2025083364A1/fr
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition for the care of the skin or hair comprising protozoa, in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia.
  • the skin is an important organ of the human body because it constitutes the first mechanical, chemical and biological barrier against external aggressions and participates in thermoregulation.
  • the skin is composed of 3 main layers: the epidermis, the superficial and thin layer; the dermis, the thicker layer and the hypodermis, the deepest layer.
  • the outer layer is mainly composed of keratinocytes, melanocytes and corneocytes, as well as collagen fibers and elastin fibers that help keep the cells organized, and contribute to the elasticity and firmness of the skin.
  • the dermis is a connective tissue mainly composed of the extracellular matrix produced by fibroblasts, the main dermal cell population.
  • the skin can undergo different forms of alterations, including the formation of fine lines and wrinkles, a natural process due to the slowing down of skin regeneration and the deterioration of the extracellular matrix.
  • This alteration mainly due to age, is accelerated by exposure to UV rays which denature the DNA of skin cells and promote the formation of age spots due to the multiplication of melanocytes. Alteration can also be promoted by other factors such as diet, pollution, stress or the quality of skin hydration.
  • hair can undergo alterations, including depigmentation, slowed growth or increased hair loss during aging.
  • This alteration, as with skin, can be encouraged by diet, pollution, stress, or hormonal disruption.
  • the cosmetics market offers a multitude of products for hair care (anti-hair loss, moisturizing, repairing, stimulating keratin production) and for skin care (anti-aging, moisturizing, regenerating, protecting against photoaging or anti-wrinkle).
  • This segment is a growing industry that has been challenged in recent years due to the origin and impact of its ingredients and manufacturing techniques. With a focus on reducing carbon dioxide emissions and improving product degradability, many conventional ingredients are being rejected to meet more stringent regulations and consumer demands.
  • Biotechnology is one of the solutions to support and stimulate more sustainable growth for the cosmetics industry. Indeed, many functional compounds derived from microorganisms such as bacteria, fungi or algae have been developed in recent years, presenting benefits for the skin thanks to their emulsifying, antimicrobial or antioxidant properties and for the hair thanks to their nourishing or hair growth stimulating properties (Prabhuddha L. Gupta et al. Nat. Prod. Bioprospect. 9, 267-278 (2019)).
  • a current trend is to offer cosmetic compositions combining several cosmetic effects. Examples include compositions that are both moisturizing and regenerating. The solution to achieve such a result is to multiply the active ingredients in the composition.
  • protozoa and in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia, strongly induce, in epithelial cells, the expression of genes involved in cell renewal, slowing down of cell death, protection against oxidative stress and ultraviolet (UV) rays, and more moderately induce healing and protection of the skin against infectious agents.
  • UV ultraviolet
  • protozoa protect the skin from intrinsic and extrinsic aging, in particular related to age and exposure to ultraviolet rays.
  • protozoa of the amoebic genus Willaertia can be used in hair cosmetic compositions and strongly induce the expression of genes involved in pigmentation, growth and prevention of hair loss.
  • a cosmetic composition for the care of the skin or hair preferably for preventing or reducing one or more signs of aging of the skin or hair comprising protozoa of the amoebic genus Willaertia and one or more active ingredients and one or more cosmetically acceptable excipients.
  • the protozoa belong to the species Willaertia magna, preferably said protozoa correspond to the strain deposited under number PTA 7824 at the ATCC.
  • said protozoa are in lysed form.
  • said acceptable cosmetic excipients are chosen from the group consisting of: water, an aqueous component, a fatty substance, a surfactant, a colorant, a texturizing agent, a preservative, a humectant, an emulsifier, an antioxidant, a perfume and a solvent.
  • the composition may be in the form of a lotion, milk, solution, suspension, emulsion, mousse, balm, oil, cream, gel, mask, liquid soap or solid soap.
  • the non-therapeutic use of the composition described above as an anti-aging agent preferably for preventing or reducing one or more signs of skin aging, in particular skin aging related to exposure to ultraviolet radiation, preferably by increasing the thickness of the epidermis, the differentiation of the stratum granulosum or the stratum corneum and/or by increasing the quality and quantity of the extracellular matrix present in the skin, in a more preferred embodiment, to promote skin regeneration, slow cell death in the skin or protect against oxidative stress such as that induced by exposure to ultraviolet radiation.
  • the sign(s) of skin aging may be chosen from the group consisting of: the appearance of wrinkles or fine lines on the skin, sagging of the skin, loss of elasticity, firmness or density of the skin.
  • FIG. 1 shows the expression level of TLR2, HAS, and FBL5 genes in human epithelial cells (ATCC CCL-2) treated with Willaertia amoeba lysate (PTA-7824) (lot 22.LY0.040) at different dilutions.
  • the control corresponds to the expression level in untreated cells.
  • FIG. 2 shows the expression level of BCL2, PIWI1L, F0X01 and SGK1 genes in human epithelial cells (ATCC CCL-2) treated with Willaertia amoeba lysate (PTA-7824) (lot 22.LY0.040) at different dilutions.
  • the control corresponds to the expression level in untreated cells.
  • FIG. 3 shows the histological analysis of hematoxylin, phloxine, and saffron (HPS) staining of untreated young (left) or aged (right) 3D skin models (control conditions). Scale bar: 50 pm.
  • FIG. 4 shows the histological analysis of hematoxylin, phloxine, and saffron (HPS) staining of aged 3D skin models untreated (control on the left) or treated with Willaertia amoeba lysate (PTA-7824) at two concentrations. Scale bar: 50 pm.
  • FIG. 5 shows the HPS histological analysis (A) and Warthin Starry staining (B) of untreated, unexposed (left) and exposed (right) ultraviolet (UV) 3D skin models. Scale bar: 50 pm.
  • FIG. 6 shows the HPS histological analysis (A) and Warthin Starry staining (B) of 3D models of untreated (left) and Willaertia amoeba lysate (PTA-7824)-treated ultraviolet (UV) skin at two concentrations. Scale bar: 50 pm.
  • protozoa and in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia can be used in cosmetic compositions and strongly induce (2 to 5 times more than the control) the expression of genes involved in skin regeneration, slowing down cell death in the skin, protection against oxidative stress, in particular against the effects of ultraviolet rays, but also the expression of genes involved in pigmentation, growth and prevention of hair loss. More particularly, it has shown in a 3D skin model that protozoa of the amoebic genus Willaertia reduce several signs of skin aging, in particular linked to exposure to ultraviolet rays.
  • the present application relates to a cosmetic composition for the care of the skin or hair, in particular for treating or preventing a non-pathological alteration of the skin or hair, preferably for preventing or reducing one or more signs of aging of the skin or hair, said composition comprising protozoa of the amoebic genus Willaertia.
  • Protozoa are motile heterotrophic protists that ingest their food by phagocytosis. Amoebas are among the free-living forms of protozoa. [0027] Preferably, the protozoa used belong to the species Willaertia magna.
  • the protozoa used in the context of the invention correspond to the strain deposited on August 21, 2006 under number PTA 7824 at the ATCC, this strain having been deposited in the names of the CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16/France and UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex/France. Said deposited strain is also described in the publication of international application PCT WQ2008/043969.
  • the cosmetic composition of the present application preferably comprises a lysate of protozoa of the amoebic genus Willaertia as described previously.
  • a lysate commonly refers to a material obtained following the destruction or dissolution of biological cells by a phenomenon of cell lysis carried out for example by physical, chemical or biological agents, thus causing the release of intracellular biological constituents naturally contained in the cells of the microorganism in question.
  • the lysate can be obtained by any method well known to those skilled in the art, such as high-pressure homogenization or grinding.
  • protozoa of the amoebic genus Willaertia are cultured in bioreactors, harvested by centrifugation to remove the culture medium, and then lysed by mechanical grinding with a high-pressure or propeller homogenizer.
  • the lysate may then be dehydrated by lyophilization or atomization or any other drying process.
  • the cosmetic composition comprises less than 1% (w/v) of dehydrated lysate.
  • the cosmetic composition of the present application may also comprise at least one acceptable cosmetic excipient.
  • acceptable cosmetic excipient is meant a substance devoid of cosmetic or biological effect as such, but useful for the incorporation of the active agent into the cosmetic composition, for the shaping of said composition, or even for its stability over time.
  • the excipient is advantageously chosen from solvents, co-solvents (ethanol, glycerol, benzyl alcohol), thickeners, diluents, antioxidants, colorants, chemical or physical filters against UVA and UVB solar radiation such as synthetic filters associated or not with filters consisting of particles capable of attenuating the effects of this radiation on the skin, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, humectants, odor absorbers, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, trace elements, film-forming polymers, chemical or mineral filters, moisturizing agents or thermal waters, natural polymers such as polysaccharides or polypeptides, cellulose derivatives, or even synthetic polymers, and optionally in addition at least one other cosmetic active agent.
  • solvents such as polysaccharides or polypeptides, cellulose derivatives, or even synthetic polymers, and optionally in addition at least one other cosmetic active agent.
  • the cosmetic composition according to the invention advantageously comprises an aqueous phase and can advantageously be presented in all the forms normally used for topical application, in the form of an aqueous, hydroalcoholic or oily solution, an oil-in-water or water-in-oil emulsion, an aqueous gel, or in any other form for topical application.
  • This composition may be more or less fluid and have the appearance of a cream, an ointment, a milk, a lotion, a solution, a suspension, an emulsion, a balm, an oil, a serum, a paste, a mousse, a gel, a liquid or solid soap. It may optionally be applied to the skin in the form of an aerosol or by means of a patch or a mask or an applicator.
  • the cosmetic composition of the present application may also comprise other active ingredients which may be chosen in particular from moisturizing agents such as hyaluronic acid or glycerol, smoothing agents or anti-wrinkle agents such as adenosine, complexes of natural or synthetic polymers producing tightening films on the skin at the time of application to the skin, or even anti-aging active ingredients, more particularly plant extracts obtained by methods known to those skilled in the art and which act on biological targets of the superficial or deep layers of the skin, in particular the epidermis and the dermis, to maintain the elasticity of the skin, produce a plumping effect, ensure the renewal or repair of tissues, the maintenance of the skin barrier or acting on the complexion of the skin. It may also be lightening or whitening active ingredients acting on the spots which may appear with age, in particular on the hands.
  • moisturizing agents such as hyaluronic acid or glycerol
  • smoothing agents or anti-wrinkle agents such as adenosine
  • anti-aging agent is meant a cosmetic agent having a biological activity making it possible to prevent or reduce one or more signs of aging of the skin or hair.
  • Skin aging is a non-pathological alteration of the skin, that is to say a normal physiological process, involving intrinsic factors (genetic, hormonal, diseases, etc.) and extrinsic factors (UV, stress, climatic aggression, pollution, etc.), and which increases over the course of an individual's life due to a decline in their defense system and their increasing need for antioxidants.
  • the inventors have shown that the treatment of aged skin or skin exposed to UV rays with protozoa, in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia, makes it possible to increase the thickness of the epidermis, to increase the terminal differentiation of the stratum granulosum and/or the stratum corneum, thus improving the skin barrier function, and to increase the quality and quantity of the extracellular matrix present in the skin, thus improving the elasticity, density and firmness of the skin.
  • protozoa in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia
  • the protozoa in particular the protozoa of the amoebic genus Willaertia as described above, therefore find applications in the cosmetic field as an anti-aging agent for preventing or reducing one or more signs of skin aging, in particular aging linked to exposure to ultraviolet rays, preferably by increasing the thickness of the epidermis, the differentiation of the stratum granulosum or the stratum corneum and/or by increasing the quality and quantity of the extracellular matrix present in the skin.
  • protozoa in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia as described above, can be used to prevent or reduce sagging of the skin, improve the elasticity, firmness or density of the skin or prevent or reduce wrinkles and fine lines of the skin.
  • protozoa in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia, make it possible to induce in epithelial cells the expression of the following genes: HAS (for “hyaluronan synthase 1”, Gene ID: 3036, updated on September 7, 2023) involved in the synthesis of hyaluronic acid, BCL2 (for “BCL2 apoptosis regulator” Gene ID: 596, updated on September 17, 2023) involved in the inhibition of cell death, PIWIL1 (for “piwi like RNA-mediated gene silencing 1”, Gene ID: 9271, updated on September 7, 2023) involved in cell renewal and F0X01 (for “Forkhead box 01”, Gene ID: 2308, updated on September 17, 2023) and SGK1 (for “serum/glucocorticoid regulated kinase 1, Gene ID: 6646, updated September 17, 2023) involved in protection against the effects of
  • the present application relates to the use of the cosmetic composition as described previously for:
  • skin cell regeneration or “skin regeneration” means the process by which the cells of the epidermis continually renew themselves to maintain the protective and aesthetic function of the skin. This process involves the formation of new cells in the basal layer of the epidermis, their migration to the surface of the skin, their keratinization and their desquamation. The average duration of the skin cell renewal cycle is 28 days, but it can vary depending on age, skin type and environmental factors. Skin cell regeneration is essential to maintain the health, hydration, elasticity and radiance of the skin.
  • the term “cell death in the skin” means the process of apoptosis which contributes to the homeostasis of the skin, by regulating the renewal of epidermal cells. Excessive apoptosis can lead to cell loss, a decrease in epidermal thickness, a reduction in the production of collagen and elastin and an increase in wrinkles and spots.
  • oxidative stress we mean in particular stress resulting from the toxic effects of dicarbonyl compounds (e.g. glyoxal and methylglyoxal) on proteins.
  • dicarbonyl compounds e.g. glyoxal and methylglyoxal
  • ROS reactive oxygen species
  • An additional object according to the invention is a cosmetic method for preventing or reducing one or more signs of skin aging in an individual, comprising administering an effective cosmetic amount of protozoa, in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia as described above, preferably topically, to said individual.
  • the protozoa are typically applied to the skin to be treated, for example on the face, neck, chest or hands.
  • the protozoa are present in a cosmetic composition as described above, and are therefore applied in the form of a cosmetic composition, for example in the form of a cream.
  • the inventors in this application have shown that protozoa of the amoebic genus Willaertia also make it possible to prevent or reduce one or more signs of hair aging and can be used in hair care.
  • the hair follicle is a tubular invagination of the epidermis that extends down to the deep layers of the dermis.
  • the lower part, or hair bulb itself has an invagination in which the dermal papilla is located.
  • the lower part of the bulb is a zone of cellular proliferation where the precursors of the keratinized cells constituting the hair are located. The ascending cells from these precursors gradually keratinize in the upper part of the bulb, and this collection of keratinized cells forms the hair shaft.
  • Hair aging is a non-pathological alteration of the hair, that is to say a normal physiological process, involving intrinsic factors (genetic, hormonal, diseases, etc.) and extrinsic factors (UV, stress, climatic aggression, pollution, etc.), and which increases over the course of an individual's life due to a decline in their defense system and their increasing need for antioxidants.
  • the protozoa of the present application make it possible to reduce or prevent loss of hair pigmentation, hair loss and/or promote hair growth.
  • hair loss or "alopecia” means an attack on the hair follicle resulting in hair loss which may be temporary or permanent and which is due to a non-pathological alteration of the hair, for example following pregnancy (postpartum hair loss), malnutrition, a dietary imbalance, or aging of the hair.
  • Hair growth or hair growth refers to the production of hair fiber from the hair bulb, which is located at the lower end of the follicle.
  • the active growth phase of hair is also called the anagen phase.
  • hair depigmentation means an attack on the hair follicle which no longer produces melanocytes resulting in the appearance of white or gray hair. According to the present application, hair depigmentation is due to a non-pathological alteration of the hair, for example due to aging of the hair.
  • the protozoa in particular the protozoa of the amoebic genus Willaertia as described above, therefore find applications in the cosmetic field as an anti-aging agent for preventing or reducing one or more signs of hair aging, in particular for reducing or preventing loss of hair pigmentation, hair loss and/or promoting hair growth.
  • protozoa in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia, make it possible to induce in hair follicles the expression of the following genes: MLPH (for "melanophilin”, Gene ID: 79083, updated on September 17, 2024), TYRP1 (for "tyrosine-related protein 1", Gene ID: 7306, updated on September 17, 2024) involved in the synthesis of melanin, the regulation of melanogenesis, the formation and transport of melanosomes; MC1R (Melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte stimulating hormone receptor), Gene ID: 4157, updated on 17 September 2024), POMC (Proopiomelanocortin, Gene ID: 5443, updated on 17 September 2024) involved in the regulation of melanogenesis; PTGS1 (Prostaglandin-endoperoxide synthase 1, Gene ID: 5742, updated on 17 September 2024), PTGS2 (
  • the present application relates to the use of the cosmetic composition as described previously for:
  • - promote hair growth or prevent or reduce hair loss in particular by inducing the expression of EGFR, FGF7, IGF1, VDR, and/or CTNNB1 genes in hair follicles.
  • An additional object according to the invention is a cosmetic method for preventing or reducing one or more signs of hair aging in an individual, comprising the administration of an effective cosmetic quantity of protozoa, in particular protozoa of the amoebic genus Willaertia as described above, preferably topically, to said individual.
  • the protozoa are typically applied to the hair to be treated.
  • the protozoa are present in a cosmetic composition as described above, and are therefore applied in the form of a cosmetic composition.
  • the composition may be in the form of an aqueous, alcoholic or hydroalcoholic solution; in the form of a lotion, milk, cream, gel, mask, emulsion, mousse; in the form of an aerosol composition.
  • Example 1 Determination of the biological activity of Willaertia magna Lysate (ATCC strain PTA-7824)
  • the cytotoxicity analysis is carried out on human lymphocyte cells (ATCC CCL-240) in culture.
  • lymphocyte cells / well (48-well plate, flat bottom) are cultured in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/mL, 5000pg/mL respectively), at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere, in the presence or absence of dilutions of the amoeba lysate.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • amoeba lysate was diluted 1/10, 1/100, 1/500, 1/1000 (successive dilution method) in RPMI 1640 medium supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/mL, 5000pg/mL respectively).
  • amoeba lysate shows no toxicity at a dilution of 1/500 and 1/1000.
  • Target gene induction analysis is performed on human epithelial cells (ATCC CCL-2) cultured in Dubelcco's Modified Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) (GibCo-BRL) supplemented with fetal bovine serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/mL, 5000pg/mL respectively), at 37°C, and under 5% CO2 atmosphere.
  • Dubelcco's Modified Eagle medium Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM
  • fetal bovine serum fetal bovine serum
  • penicillin and streptomycin 5000U/mL, 5000pg/mL respectively
  • Human epithelial cells are stimulated or not with amoeba lysate (dilution 1/100, 1/500, 1/1000) for 8 hours at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere.
  • Total RNAs are extracted according to the Qiagen RNAeasy protocol, quantified by nanodrop (260 nm) and normalized to 100 ng/pL (stored at -20°C). When quantifying total RNAs, the 260/280 nm ratio is defined. The 260/280 ratio allows the detection of protein contamination of nucleic acids. Its value varies between 2.0 and 2.2 for total RNA. The 260/280 ratio must be between 2.0 and 2.2. Only samples with the ratio mentioned above were used for the analyses.
  • RNAs contained in the total RNA samples are transformed into cDNA by reverse transcription using a single-stranded 18-mer oligonucleotide primer, oligo(dt) 18, and then stored at -20°C.
  • the constitutive gene or control gene is the GAPDH gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and the target genes are: TLR2 (immunity), TGF-beta (cell multiplication, anti-inflammation), RUNX1 (cell multiplication, tissue cohesion, cell differentiation), PIWILI (cell renewal), SGK1 (UV protection, anti-oxidative stress, photo-aging), F0X01 (UV protection, anti-oxidative stress, photo-aging), BCL2 (anti-cell death), HMMR (hyaluronic acid receptor, cell mobility), HAS (hyaluronic acid synthesis), COLA1 (collagen synthesis), FBLS (healing).
  • a reading of [Table 2] indicates that the 7 genes: BCL2 (anti-cell death), FBL5 (healing), F0X01 (UV protection, anti-oxidative stress, photo-aging), SGK1 (UV protection, anti-oxidative stress, photo-aging), HAS (hyaluronic acid synthesis), PIWIL1 (cell renewal), TLR2 (immunity) are upregulated (Fc greater than or equal to 1.5) by treatment with amoeba lysate, and therefore may be of cosmetic interest.
  • genes whose expression was increased by at least 1.5 times by treatment with amoeba lysate were considered. These genes were separated into two categories in order to carry out a more detailed analysis: genes whose expression increase was between 1.5 and 1.99, and genes whose expression increase was greater than or equal to 2.
  • the lysate of the amoeba Willaertia magna (strain ATCC PTA-7824) is non-cytotoxic from a dilution of 1/500.
  • Amoeba lysate moderately stimulates the expression of cellular healing functions, the synthesis of hyaluronic acid, and anti-infectious immunity (viruses and bacteria) which are of cosmetic interest.
  • amoeba lysate very strongly induces the expression of the following cellular functions of importance in cosmetics: protection against cell death, cell renewal, and UV protection, anti-oxidative stress and photo-aging.
  • the expressions measured are 2 to 5 times higher compared to the control.
  • amoeba lysate can therefore be used for the following cosmetic uses:
  • Example 2 Evaluation of the effect of a Willaertia magna amoeba lysate (ATCC PTA-7824 strain) on a 3D skin model aged (intrinsic aging) or exposed to UV radiation (extrinsic aging)
  • Keratinocytes normal human epidermal keratinocyte: NHEK
  • melanocytes normal human epidermal melanocyte: NHEM
  • normal human epidermal melanocyte normal human epidermal melanocyte: NHDF
  • the LabSkin 3D model (LabSkin Creations) of full-thickness reconstructed skin was obtained by culturing NHDFs (>40 years) in a matrix composed of collagen, glycosaminoglycans, and chitosan (LabSkin matriXTM) for 21 days under cell culture conditions optimized for extracellular matrix (ECM) neosynthesis, as previously described (Dos Santos M. et al., 2005, Tissue Engineering, 2005 May-Jun;11(5-6)).
  • ECM extracellular matrix
  • NHEKs were then seeded onto the top of the dermis-equivalent constructs and elevated to the air/liquid interface to allow formation of the epidermal compartment.
  • the LabSkin 3D model (LabSkin Creations) of full-thickness reconstructed skin was obtained by culturing NHDFs ( ⁇ 5 years) in a matrix composed of collagen, glycosaminoglycans and chitosan (LabSkin matriXTM) for 21 days under cell culture conditions optimized for ECM neosynthesis, as previously described (Back Santos M. et al., 2005, Tissue Engineering, 2005 May-Jun; 11(5-6)). NHEK and NHEM cells were then seeded on top of the equivalent dermal constructs and elevated to the air/liquid interface to allow formation of the pigmented compartment of the epidermis.
  • HPS hematoxylin-phloxine-saffron
  • HPS and Warthin-Starry stained specimens were observed using an Axioskop 2 Plus optical microscope (Zeiss), and images were captured using the DS-Ri 1 CCD camera (Nikon) and NIS-Elements software (Nikon). The 16-bit images were saved in an uncompressed image file format (tiff). Nine representative images were captured for each condition in the same manner.
  • the overall structure of the aged reconstructed skin is consistent at the epidermal and dermal levels, with a multi-stratified epidermis, well differentiated from the basal layer to the stratum corneum, well anchored above the dermal equivalent filled with fibroblasts and a neosynthesized extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • the extracellular matrix is less dense and abundant and is disorganized, impacting tissue elasticity and hydration.
  • the thickness of the epidermis is reduced with fewer layers of living cells.
  • terminal differentiation is interrupted with less stratum granulosum and stratum corneum, impacting barrier function (Fig. 3).
  • the overall structure of the reconstructed skin exposed to UVB is consistent at the epidermal and dermal levels, with a multi-stratified epidermis, well differentiated from the basal layer to the stratum corneum, well anchored at the top of the dermal equivalent filled with fibroblasts and a neosynthesized ECM.
  • the dermo-epidermal junction appears cohesive and regular.
  • UVB stress impacts both the dermal and epidermal compartments.
  • the extracellular matrix is less dense and less abundant and is disorganized, impacting tissue elasticity and hydration.
  • the extracellular matrix is also disorganized.
  • the epidermal thickness is reduced with fewer living cell layers, impacting barrier function (Fig. 5.A).
  • UVB stress stimulates melanocytes to produce melanin pigments compared to the non-UVB exposed state (Fig. 5. B).
  • Example 3 Evaluation of the effect of a Willaertia magna amoeba lysate (ATCC PTA-7824 strain) applied to the half-face of an adult subject
  • Example 4 Effect of Willaertia amoeba lysate on gene expression in ex vivo hair follicles. [0155] In the present study, the effects of Willaertia amoeba lysate were evaluated in the ex vivo culture model of hair bulbs isolated from human scalp.
  • the ex vivo human hair follicle culture model derived from the validated and well-described model of Philpott et al. (Philpott M.P., Green M.R. and Kealey T. Human hair growth in vitro. Journal of Cell Science, 1990, 97, p.463-471) is a model allowing the evaluation of compounds capable in particular of modulating hair growth and survival.
  • This model consists of a complete isolated organ and represents a "natural" model of co-culture of skin cells such as keratinocytes, but also fibroblasts, melanocytes and stem cells.
  • the hair bulbs were placed in 24-well plates (1 hair bulb per culture well) and incubated in culture medium containing or not (control) the test compound for 48 hours. For each condition, an excess of bulbs was prepared in order to reach the target value of 11 selected follicles/condition in the end.
  • the follicles were rinsed with a PBS solution then frozen and stored at -80°C until RNA extraction.
  • RNA quality was assessed by capillary electrophoresis (4200 TapeStation System, Agilent technologies). RNA quantity was assessed using a spectrophotometer (Synergy H1, BioTek Instruments).
  • Complementary DNA (cDNA) was synthesized by reverse transcription of total RNA in the presence of oligo(dT) and the enzyme “Transcriptor Reverse Transcriptase” (Roche). The cDNA quantities were then adjusted before the PCR step.
  • PCR polymerase chain reaction
  • reaction mixture (10 pL final) for each sample contained:
  • the number of cycles is determined from the "exit" points of the fluorescence curves. For the same marker analyzed, the later a sample exits (higher number of cycles), the lower the initial number of copies of the mRNA.
  • the relative expression value is determined according to the formula: (i/2 number of cycles ) x 10 6 .
  • the PCR array used in this study contains 2 housekeeping genes (GAPDH and RPS28). These housekeeping genes were used for data normalization because they are constitutively expressed and their expression level is theoretically stable. Therefore, for all the conditions tested, the normalization of the expression level of the target markers was carried out by comparing their expression level to the average expression of these 2 housekeeping genes. 2.
  • FGF7 An increase in the expression of the FGF7 gene, encoding a growth factor that promotes the proliferation of keratinocytes, which are the main cells constituting hair follicles.
  • FGF7 growth factors
  • IGF1 growth factor 1
  • EGFR EGFR
  • VDR Vitamin D receptor

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Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique pour le soin de la peau ou du cheveu comprenant des protozoaires, en particulier des protozoaires du genre amibien Willaertia.

Description

Description
Titre : COMPOSITION COSMETIQUE COMPRENANT DES PROTOZOAIRES
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne une composition cosmétique pour le soin de la peau ou du cheveu comprenant des protozoaires, en particulier des protozoaires du genre amibien Willaertia.
Technique antérieure
[0002] La peau est un organe important du corps humain car elle constitue la première barrière mécanique, chimique et biologique face aux agressions extérieures et participe à la thermorégulation. La peau est composée de 3 couches principales : l’épiderme, couche superficielle et mince ; le derme, couche plus épaisse et l’hypoderme, couche la plus profonde.
[0003] La couche externe, l’épiderme, est principalement composée de kératinocytes, de mélanocytes et de cornéocytes, ainsi que des fibres de collagène et des fibres d’élastine qui participent à maintenir les cellules organisées, à l’élasticité et à la fermeté de la peau. Le derme est un tissu conjonctif principalement composé de la matrice extracellulaire produite par des fibroblastes, la principale population cellulaire dermique.
[0004] La peau peut subir différentes formes d’altérations, notamment la formation de ridules et rides, processus naturel dû au ralentissement de la régénération de la peau et à la détérioration la matrice extracellulaire. Cette altération, due principalement à l’âge, est accélérée par l’exposition aux rayons UV qui dénaturent l’ADN des cellules de la peau et favorisent la formation des tâches de vieillesse en raison de la multiplication des mélanocytes. L’altération peut également être favorisée par d’autres facteurs comme le régime alimentaire, la pollution, le stress ou la qualité de l’hydratation de la peau.
[0005] Ce vieillissement cutané peut être atténué par l’application de produits cosmétiques induisant :
- une régénération de la peau par l’amélioration de la qualité et de l’abondance de la matrice extracellulaire de la peau,
- un ralentissement de la mort des cellules de la peau,
- une amélioration du renouvellement cellulaire,
- une protection de la peau aux UV.
[0006] De la même manière, le cheveu peut subir des altérations, notamment une dépigmentation, une croissance ralentie ou une chute accrue lors du vieillissement. Cette altération comme pour la peau peut être favorisée par le régime alimentaire, la pollution, le stress, ou une perturbation hormonale.
[0007] Le marché des produits cosmétiques propose une multitude de produits pour le soin du cheveu (antichute, hydratant, réparateurs, stimulant la production de kératine) et pour le soin de la peau (anti-âge, hydratants, régénérants, protégeant du photo-vieillissement ou anti-rides). Ce segment est une industrie en pleine croissance qui a été remise en question ces dernières années en raison de l'origine et de l'impact de ses ingrédients et de ses techniques de fabrication. En mettant l'accent sur la réduction des émissions de dioxyde de carbone et l'amélioration de la dégradabilité des produits, de nombreux ingrédients conventionnels sont rejetés pour répondre aux réglementations plus exigeantes et aux exigences des consommateurs.
[0008] La biotechnologie est une des solutions pour soutenir et stimuler une croissance plus durable pour l'industrie cosmétique. En effet, de nombreux composés fonctionnels issus de microorganismes comme les bactéries, champignons ou algues ont été développés ces dernières années, présentant des avantages pour la peau grâce à leurs propriétés émulsifiantes, antimicrobiennes ou antioxydantes et pour le cheveu grâce à leurs propriétés nourrissantes ou de stimulation de la croissance capillaire (Prabhuddha L. Gupta et al. Nat. Prod. Bioprospect. 9, 267-278 (2019)).
[0009] Une tendance actuelle est de proposer des compositions cosmétiques alliant plusieurs effets cosmétiques. On peut citer à titre d’exemple des compositions étant à la fois hydratantes et régénérantes. La solution pour obtenir un tel résultat est de multiplier les principes actifs dans la composition.
[0010] La multiplication des principes actifs présente toutefois des inconvénients :
- les différents principes actifs peuvent poser des problèmes de formulation ;
- la multiplication des actifs sensibilise la peau et pose des problèmes de tolérance aux peaux les plus sensibles et atopiques ;
- ces principes sont généralement d’origine synthétique et chimique ; et
- le coût de la composition s’en trouve considérablement augmenté.
[0011] Il existe donc un besoin de mettre sur le marché des compositions cosmétiques, à base de principe cosmétique naturel, permettant d’obtenir des résultats rapides et satisfaisants. Il est également nécessaire de développer des compositions cosmétiques qui soient efficaces sans avoir à multiplier les ingrédients.
Résumé
[0012] Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence, de façon totalement inattendue, que les protozoaires, et notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia induisent fortement, dans les cellules épithéliales, l’expression de gènes impliqués dans le renouvellement cellulaire, le ralentissement de la mort cellulaire, la protection contre le stress oxydant et les ultraviolets (UV), et induisent plus modérément la cicatrisation et la protection de la peau contre les agents infectieux. Ils ont également montré en utilisant un modèle de peau 3D que les protozoaires protègent la peau du vieillissement intrinsèque et extrinsèque, en particulier lié à l’âge et à l’exposition aux ultraviolets. Ainsi, ces résultats montrent l’intérêt de l’utilisation des protozoaires pour le soin de la peau. Par ailleurs, les inventeurs ont également montré que les protozoaires du genre amibien Willaertia peuvent être utilisés dans des compositions cosmétiques capillaires et induisent fortement l’expression de gènes impliqués dans la pigmentation, la croissance et la prévention de la chute des cheveux. [0013] Il est proposé une composition cosmétique pour le soin de la peau ou des cheveux, de préférence pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau ou des cheveux comprenant des protozoaires du genre amibien Willaertia et un ou plusieurs ingrédients actifs et un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptables. De préférence, les protozoaires appartiennent à l’espèce Willaertia magna, de préférence lesdits protozoaires correspondent à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l’ATCC. Dans un mode de réalisation préféré, lesdits protozoaires sont sous forme lysée.
[0014] Dans un mode de réalisation particulier, lesdits excipients cosmétiques acceptables sont choisis parmi le groupe consistant en : l’eau, un composant aqueux, un corps gras, un tensio-actif, un colorant, un agent de texture, un conservateur, un humectant, un émulsifiant, un anti-oxydant, un parfum et un solvant. La composition peut être sous la forme d’une lotion, lait, solution, suspension, émulsion, mousse, baume, huile, crème, gel, masque, savon liquide ou savon solide.
[0015] Selon un autre aspect, il est proposé l’utilisation non-thérapeutique de la composition décrite précédemment en tant qu’agent anti-âge, de préférence pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau, en particulier du vieillissement de la peau lié à l’exposition aux ultraviolets, de préférence en augmentant l’épaisseur de l’épiderme, la différenciation du stratum granulosum ou du stratum corneum et/ou en augmentant la qualité et la quantité de la matrice extracellulaire présente dans la peau, dans un mode de réalisation encore préféré, pour favoriser la régénération de la peau, ralentir la mort cellulaire dans la peau ou protéger contre le stress oxydant tel que celui induit par l’exposition aux rayonnements ultraviolets. Selon la présente divulgation, le ou les signes de vieillissements de la peau peuvent être choisis parmi le groupe constitué par : l’apparition de rides ou ridules sur la peau, un relâchement de la peau, une perte d’élasticité, de fermeté ou de densité de la peau. Selon un autre aspect, il est proposé l’utilisation non thérapeutique de la composition décrite précédemment pour prévenir ou réduire plusieurs signes du vieillissement des cheveux, en particulier pour prévenir ou réduire une altération non-pathologique du cheveu, de préférence une altération de la pigmentation ou croissance du cheveu ou pour prévenir ou réduire la chute des cheveux.
Brève description des dessins
[0016] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0017] [Fig. 1] montre le niveau d’expression des gènes TLR2, HAS, et FBL5 dans les cellules humaines épithéliales (ATCC CCL-2) traitées avec un lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) (lot 22.LY0.040) à différentes dilutions. Le contrôle correspond au niveau d’expression dans les cellules non traitées.
Fig. 2
[0018] [Fig. 2] montre le niveau d’expression des gènes BCL2, PIWI1L, F0X01 et SGK1 dans les cellules humaines épithéliales (ATCC CCL-2) traitées avec un lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) (lot 22.LY0.040) à différentes dilutions. Le contrôle correspond au niveau d’expression dans les cellules non traitées.
Fig. 3
[0019] [Fig. 3] montre l’analyse histologique de la coloration à l’hématoxyline, phloxine et au safran (HPS) de modèles de peau 3D jeune (à gauche) ou âgée (à droite) non traitées (conditions contrôle). Barre d’échelle : 50 pm.
Fig. 4
[0020] [Fig. 4] montre l’analyse histologique de la coloration à l’hématoxyline, phloxine et au safran (HPS) de modèles de peau 3D âgée non traitée (contrôle à gauche) ou traitée avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à deux concentrations. Barre d’échelle : 50 pm.
Fig. 5
[0021] [Fig. 5] montre l’analyse histologique HPS (A) et de la coloration Warthin Starry (B) des modèles 3D de peau non traités, non exposées (à gauche) et exposées (à droite) aux ultraviolets (UV). Barre d’échelle : 50 pm.
Fig. 6
[0022] [Fig. 6] montre l’analyse histologique HPS (A) et de la coloration Warthin Starry (B) des modèles 3D de peau exposée aux ultraviolets (UV) non traitée (à gauche) et traitée avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à deux concentrations. Barre d’échelle : 50 pm.
Description des modes de réalisation
[0023] La demanderesse a montré de manière inattendue que les protozoaires et notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia peuvent être utilisés dans des compositions cosmétiques et induisent fortement (2 à 5 fois plus que le contrôle) l’expression de gènes impliqués dans la régénération de la peau, le ralentissement de la mort cellulaire dans la peau, la protection contre le stress oxydant, notamment contre les effets des ultraviolets, mais également l’expression de gènes impliqués dans la pigmentation, la croissance et la prévention de la chute des cheveux. Plus particulièrement, elle a montré dans un modèle de peau 3D que les protozoaires du genre amibien Willaertia réduisent plusieurs signes du vieillissement de la peau, notamment lié à l’exposition aux ultraviolets.
[0024] Composition cosmétique
[0025] Dans un premier aspect, la présente demande concerne une composition cosmétique pour le soin de la peau ou du cheveu, en particulier pour traiter ou prévenir une altération non- pathologique de la peau ou du cheveu, de préférence pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau ou du cheveu, ladite composition comprenant des protozoaires du genre amibien Willaertia.
[0026] Les protozoaires sont des protistes hétérotrophes mobiles qui ingèrent leur nourriture par phagocytose. Les amibes font parties des formes libres de protozoaires. [0027] De préférence, les protozoaires utilisés appartiennent à l’espèce Willaertia magna.
[0028] De manière encore plus préférentielle, les protozoaires utilisés dans le cadre de l’invention correspondent à la souche déposée le 21 août 2006 sous le numéro PTA 7824 à l’ATCC, cette souche ayant été déposée aux noms du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16/France et UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex/France. Ladite souche déposée est également décrite dans la publication de la demande internationale PCT WQ2008/043969.
[0029] La composition cosmétique de la présente demande comprend de préférence un lysat de protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment.
[0030] Un lysat désigne communément un matériau obtenu à l’issue de la destruction ou dissolution de cellules biologiques par un phénomène de lyse cellulaire exercé par exemple par des agents physiques, chimiques ou biologiques provoquant ainsi la libération des constituants biologiques intracellulaires naturellement contenus dans les cellules du microorganisme considéré. Le lysat peut être obtenu par n’importe quelle méthode bien connue de l’homme du métier, telle que l’homogénéisation à haute pression, ou le broyage.
[0031] En particulier, les protozoaires du genre amibien Willaertia (e.g. ATCC PTA-7824) sont cultivés en bioréacteurs, récoltés par centrifugation pour éliminer le milieu de culture, puis lysés par broyage mécanique avec un homogénéiseur à haute pression ou à hélice. Dans un mode particulier, le lysat peut être ensuite déshydraté par lyophilisation ou atomisation ou tout autre procédé de séchage.
[0032] De préférence, la composition cosmétique comprend moins de 1 % (p/v) de lysat déshydraté. La composition cosmétique de la présente demande peut également comprendre au moins un excipient cosmétique acceptable.
[0033] Par « excipient cosmétique acceptable », on entend une substance dépourvue d’effet cosmétique ou biologique en tant que telle, mais utile à l’incorporation de l’agent actif dans la composition cosmétique, à la mise en forme de ladite composition, ou encore à sa stabilité au cours du temps.
[0034] L’excipient est avantageusement choisi parmi des solvants, des co-solvants (l’éthanol, le glycérol, l'alcool benzylique), des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres chimiques ou physiques contre les rayonnements solaires de type UVA et UVB tels que les filtres de synthèse associés ou non à des filtres constitués de particules capables d’atténuer les effets de ce rayonnement sur la peau, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, humectant, des absorbeurs d’odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des oligoéléments, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales, des polymères naturels tels que des polysaccharides ou des polypeptides, des dérivés de cellulose, ou encore des polymères synthétiques, et de façon optionnelle en outre au moins un autre agent actif cosmétique.
[0035] La composition cosmétique selon l’invention comprend avantageusement une phase aqueuse et peut avantageusement se présenter sous toutes les formes normalement utilisées pour une application topique, sous forme d’une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d’une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile, d’un gel aqueux, ou sous toute autre forme pour application topique.
[0036] Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l’aspect d’une crème, d’une pommade, d’un lait, d’une lotion, d’une solution, d’une suspension, d’une émulsion, d’un baume, d’une huile, d’un sérum, d’une pâte, d’une mousse, d’un gel, d’un savon liquide ou solide. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d’aérosol ou au moyen d’un patch ou d’un masque ou d’un applicateur.
[0037] La composition cosmétique de la présente demande peut également comprendre d’autres ingrédients actifs qui peuvent être notamment choisis parmi des agents hydratants tels que l’acide hyaluronique ou le glycérol, des agents lissants ou encore des agents anti-rides tels que l’adénosine, des complexes de polymères naturels ou synthétiques produisant sur la peau des films tenseurs au moment de l’application sur la peau, ou bien encore des actifs anti-âge, plus particulièrement des extraits de plantes obtenus par des procédés connus de l’homme du métier et qui agissent sur des cibles biologiques des couches superficielles ou profondes de la peau en particulier, l’épiderme, et le derme, pour maintenir l’élasticité de la peau, produire un effet repulpant, assurer le renouvellement ou la réparation des tissus, le maintien de la barrière cutanée ou agissant sur le teint de la peau. Il peut également s’agir d’actifs éclaircissants ou blanchissants agissant sur les tâches pouvant apparaître avec l’âge, notamment sur les mains.
[0038] Utilisation cosmétique
[0039] Les inventeurs dans cette demande ont montré que les protozoaires du genre amibien Willaertia permettaient de prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau ou du cheveu et pouvaient être utilisés comme un agent anti-âge.
[0040] Par « agent anti-âge », on entend un agent cosmétique ayant une activité biologique permettant de prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau ou du cheveu.
[0041] Le vieillissement de la peau est une altération non-pathologique de la peau, c’est-à-dire un processus physiologique normal, impliquant des facteurs intrinsèques (génétique, hormonal, maladies...) et extrinsèques (UV, stress, agressions climatiques, pollution...), et qui s’amplifie au cours de la vie d’un individu du fait d’un déclin de son système de défense et de son besoin croissant en antioxydants.
[0042] Les modifications au niveau de la couche cornée, de l’épiderme, de la jonction épidermique et du derme varient en fonction de l’âge de l’individu et se manifestent par des « signes visibles » du vieillissement, qui progressent avec l’âge, plus ou moins vite en fonction de l’individu et de son environnement (facteurs intrinsèques et extrinsèques). [0043] Le vieillissement cutané, qu'il résulte d'un phénomène normal de sénescence ou qu'il soit accentué par un facteur extérieur tel que l'exposition aux radiations UV, implique des dysfonctionnements de la différenciation et/ou du renouvellement cellulaire se traduisant par une atrophie de l'ensemble des assises de la peau.
[0044] D'un point de vue histologique, on observe, entre autres, une diminution de la qualité du derme avec une perte de consistance de la matrice extracellulaire, une diminution de l'épaisseur de l'épiderme et une altération de la couche basale contenant les kératinocytes proliférants.
[0045] D'un point de vue esthétique, ces altérations se traduisent par une modification de l'aspect de la peau et de ses propriétés mécaniques : la peau est moins lisse et peut présenter des ridules, pouvant conduire avec le temps à la formation de rides profondes. La peau présente également une perte d'élasticité, de densité et de fermeté, pouvant conduire à un affaissement tissulaire et une accentuation des rides. Le vieillissement cutané peut entraîner également l'apparition de tâches pigmentaires.
[0046] En particulier, les inventeurs ont montré que le traitement d’une peau âgée ou exposée aux UV par des protozoaires, notamment de protozoaires du genre amibien Willaertia, permettait d’augmenter l’épaisseur de l’épiderme, d’augmenter la différenciation terminale du stratum granulosum et/ou du stratum corneum, améliorant ainsi la fonction de barrière cutanée, et d’augmenter la qualité et la quantité de la matrice extracellulaire présente dans la peau, améliorant ainsi l’élasticité, la densité et la fermeté de la peau.
[0047] Au regard de ces résultats, les protozoaires, notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment, trouvent donc des applications dans le domaine cosmétique en tant qu’agent anti-âge pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau, en particulier du vieillissement lié à l’exposition aux ultraviolets, de préférence en augmentant l’épaisseur de l’épiderme, la différenciation du stratum granulosum ou du stratum corneum et/ou en augmentant la qualité et la quantité de la matrice extracellulaire présente dans la peau.
[0048] Ainsi, les protozoaires, notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment peuvent être utilisés pour prévenir ou réduire le relâchement de la peau, améliorer l’élasticité, la fermeté ou la densité de la peau ou prévenir ou réduire les rides et ridules de la peau.
[0049] En particulier, les inventeurs ont montré que les protozoaires, notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia permettaient d’induire dans les cellules épithéliales, l’expression des gènes suivants: HAS (pour «hyaluronan synthase 1 », Gene ID : 3036, mis à jour le 7 septembre 2023) impliqué dans la synthèse de l’acide hyaluronique, BCL2 (pour « BCL2 apoptosis regulator » Gene ID : 596, mis à jour le 17 septembre 2023) impliqué dans l’inhibition de la mort cellulaire, PIWIL1 (pour « piwi like RNA-mediated gene silencing 1 », Gene ID : 9271 , mis à jour le 7 septembre 2023) impliqué dans le renouvellement cellulaire et F0X01 (pour « Forkhead box 01 », Gene ID : 2308, mis à jour le 17 septembre 2023) et SGK1 (pour « serum/glucocorticoid regulated kinase 1 , Gene ID : 6646, mis à jour le 17 septembre 2023) impliqués dans la protection contre les effets des ultraviolets et du stress oxydatif.
[0050] Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la présente demande concerne l’utilisation de la composition cosmétique telle que décrite précédemment pour :
- favoriser la régénération de la peau, de préférence en améliorant le renouvellement cellulaire, en particulier en induisant l’expression du gène PIWIL1 dans les cellules de la peau,
- réduire la mort cellulaire dans la peau, en particulier en induisant l’expression du gène BCL2 dans les cellules de la peau,
- protéger de la peau contre le stress oxydatif tel que l’exposition aux rayonnements ultraviolets, en particulier en induisant l’expression des gènes F0X01 et SGK1 dans les cellules de la peau.
[0051] On entend par « régénération cellulaire de la peau » ou « régénération de la peau » selon la présente demande, le processus par lequel les cellules de l’épiderme se renouvellent continuellement pour maintenir la fonction protectrice et esthétique de la peau. Ce processus implique la formation de nouvelles cellules dans la couche basale de l’épiderme, leur migration vers la surface de la peau, leur kératinisation et leur desquamation. La durée moyenne du cycle de renouvellement cellulaire de la peau est de 28 jours, mais elle peut varier selon l’âge, le type de peau et les facteurs environnementaux. La régénération cellulaire de la peau est essentielle pour préserver la santé, l’hydratation, l’élasticité et l’éclat de la peau.
[0052] On entend par « mort cellulaire dans la peau » selon la présente demande, le processus d’apoptose qui contribue à l’homéostasie de la peau, en régulant le renouvellement des cellules de l’épiderme. L’apoptose excessive peut entrainer la perte de cellules, une diminution de l’épaisseur de l’épiderme, une réduction de la production de collagène et d’élastine et une augmentation des rides et des taches.
[0053] Par « stress oxydant » selon la présente demande, on entend notamment un stress résultant des effets toxiques de composés dicarbonylés (ex : glyoxal et méthylglyoxal) sur les protéines. On parle plus généralement de stress oxydant généré par le fonctionnement normal de notre organisme et par des éléments extérieurs (pollution, rayonnement UV), qui se caractérise par la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO ou ROS) qui peuvent réagir avec tous les composants cellulaires, en particulier les protéines et l’ADN, entraînant leur modification par oxydation.
[0054] Un objet supplémentaire selon l'invention est un procédé cosmétique pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau chez un individu, comprenant l'administration d'une quantité cosmétique efficace de protozoaires, notamment de protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment, de préférence par voie topique, audit individu.
[0055] Les protozoaires sont typiquement appliqués sur la peau à traiter, par exemple au niveau du visage, du cou, du thorax ou des mains. De préférence, les protozoaires sont présents dans une composition cosmétique telle que décrite précédemment, et sont donc appliqués sous la forme d'une composition cosmétique, par exemple sous la forme d'une crème. [0056] Les inventeurs dans cette demande ont montré que les protozoaires du genre amibien Willaertia permettaient également de prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement du cheveu et pouvaient être utilisés dans un soin capillaire.
[0057] Le follicule pileux est une invagination tubulaire de l'épiderme qui s'enfonce jusqu'aux couches profondes du derme. La partie inférieure, ou bulbe pileux, comporte elle-même une invagination dans laquelle se trouve la papille dermique. La partie inférieure du bulbe est une zone de prolifération cellulaire où se trouvent les précurseurs des cellules kératinisées constituant le cheveu. Les cellules en ascension issues de ces précurseurs se kératinisent progressivement dans la partie supérieure du bulbe, et cet ensemble de cellules kératinisées forme la tige pilaire.
[0058] Le vieillissement du cheveu est une altération non-pathologique du cheveu, c’est-à-dire un processus physiologique normal, impliquant des facteurs intrinsèques (génétique, hormonal, maladies...) et extrinsèques (UV, stress, agressions climatiques, pollution...), et qui s’amplifie au cours de la vie d’un individu du fait d’un déclin de son système de défense et de son besoin croissant en antioxydants.
[0059] D'un point de vue esthétique, ces altérations se traduisent par une modification de l'aspect du cheveu : la dépigmentation du cheveu, une augmentation de la chute des cheveux et une réduction de la croissance des cheveux.
[0060] Les protozoaires de la présente demande permettent de réduire ou prévenir la perte de pigmentation du cheveu, la chute des cheveux et/ou favoriser la croissance des cheveux.
[0061] On entend par « chute du cheveu » ou « alopécie » dans la présente demande, une atteinte du follicule pileux ayant pour conséquence la perte de cheveu qui peut être temporaire ou définitive et qui est due à une altération non-pathologique du cheveu, par exemple qui fait suite à une grossesse (chute du cheveu post-partum), une dénutrition, un déséquilibre alimentaire, ou au vieillissement du cheveu.
[0062] On entend par « croissance du cheveu » ou « pousse du cheveu », la production de la fibre capillaire à partir du bulbe pilaire qui se situe à l'extrémité inférieure du follicule. La phase de croissance active du cheveu est également appelée phase anagène.
[0063] On entend par « dépigmentation du cheveu », une atteinte du follicule pileux qui ne produit plus de mélanocytes ayant pour conséquence l’apparition de cheveux blancs ou gris. Selon la présente demande, la dépigmentation du cheveu est due à une altération non-pathologique du cheveu, par exemple au vieillissement du cheveu.
[0064] Les protozoaires, notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment, trouvent donc des applications dans le domaine cosmétique en tant qu’agent antiâge pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement du cheveu, en particulier pour réduire ou prévenir la perte de pigmentation du cheveu, la chute des cheveux et/ou favoriser la croissance des cheveux. [0065] En particulier, les inventeurs ont montré que les protozoaires, notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia permettaient d’induire dans les follicules pileux, l’expression des gènes suivants: MLPH (pour «melanophilin », Gene ID : 79083, mis à jour le 17 septembre 2024), TYRP1 (pour « tyrosine-related protein 1 », Gene ID : 7306, mis à jour le 17 septembre 2024) impliqués dans la synthèse de mélanine, la régulation de la mélanogenèse, la formation et le transport des mélanosomes ; MC1R (Melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte stimulating hormone receptor), Gene ID : 4157, mis à jour le 17 septembre 2024), POMC (Proopiomelanocortin, Gene ID : 5443, mis à jour le 17 septembre 2024) impliqués dans la régulation de la mélanogenèse ; PTGS1 (Prostaglandin-endoperoxide synthase 1 , Gene ID : 5742, mis à jour le 17 septembre 2024), PTGS2 (Prostaglandin-endoperoxide synthase 2, Gene ID : 5743, mis à jour le 17 septembre 2024) impliqués dans l’inflammation et dans la régulation de la croissance des cheveux (prolongation de la phase anagène), via la production de PGE2 ; EGFR (epidermal growth factor receptor, Gene ID : 1956, mis à jour le 17 septembre 2024), FGF7 (fibroblast growth factor 7, Gene ID : 2252, mis à jour le 17 septembre 2024), IGF1 (insulin-like growth factor 1 , Gene ID : 3479, mis à jour le 17 septembre 2024), VDR (Vitamin D (1 ,25- dihydroxyvitamin D3) receptor, Gene ID : 7421 , mis à jour le 17 septembre 2024) qui sont des facteurs de croissance, CTNNB1 (Catenin (cadherin-associated protein), beta 1 , 88kDa, Gene ID : 1499, mis à jour le 17 septembre 2024) impliqué dans la différenciation cellulaire, la morphogenèse du follicule pileux, le processus du cycle pilaire et la régulation positive du facteur de croissance des fibroblastes.
[0066] Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la présente demande concerne l’utilisation de la composition cosmétique telle que décrite précédemment pour :
- réduire ou prévenir la dépigmentation du cheveu, en particulier en induisant l’expression des gènes MLPH, TYRP1, MC1R et/ou POMC dans les follicules pileux,
- favoriser la croissance des cheveux, en particulier en induisant l’expression du gène PTGS1 et/ou, PTGS2, dans les follicules pileux et/ou
- favoriser la croissance des cheveux ou prévenir ou réduire la chute des cheveux, en particulier en induisant l’expression des gènes EGFR, FGF7, IGF1, VDR, et/ou CTNNB1 dans les follicules pileux.
[0067] Un objet supplémentaire selon l'invention est un procédé cosmétique pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement du cheveu chez un individu, comprenant l'administration d'une quantité cosmétique efficace de protozoaires, notamment de protozoaires du genre amibien Willaertia tels que décrits précédemment, de préférence par voie topique, audit individu.
[0068] Les protozoaires sont typiquement appliqués sur les cheveux à traiter. De préférence, les protozoaires sont présents dans une composition cosmétique telle que décrite précédemment, et sont donc appliqués sous la forme d'une composition cosmétique. Pour une application locale sur les cheveux ou le cuir chevelu, la composition peut être sous forme de solution aqueuse, alcoolique ou hydroalcoolique; sous forme de lotion, lait, crème, de gel, de masque, d'émulsion, de mousse; sous forme de composition pour aérosol. Exemples
[0069] Les exemples ci-après permettent d’illustrer l’invention mais n’ont aucun caractère limitatif.
[0070] Exemple 1 : Détermination de l’activité biologique du Lysat Willaertia magna (souche ATCC PTA-7824)
[0071] 1. Lysat d’amibe
[0072] Le lysat d'amibe Willaertia magna (souche ATCC PTA-7824) a été conservé à -20°C.
[0073] 2. Tests de cytotoxicité
[0074] - Matériel et méthodes
[0075] L'analyse de cytotoxicité est effectuée sur des cellules lymphocytaires humaines (ATCC CCL- 240) en culture.
[0076] Brièvement, 1.103 cellules lymphocytaires / puits (plaque de 48 puits, fond plat) sont mises en culture dans du milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/mL, 5000pg/mL respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2, en présence ou non des dilutions du lysat d’amibe.
[0077] Toutes les 24 heures, la viabilité des cellules lymphocytaires est évaluée par mesure d'exclusion du bleu Trypan (dilution 1/2). La numération est réalisée sur lame de comptage Kova Glasstic, avec un microscope optique Leica DMI 3000B. Les résultats sont exprimés en pourcentage (%) de viabilité (n=3, moyenne +/- déviation).
[0078] Le lysat d’amibe a été dilué au 1/10, 1/100, 1/500, 1/1000 (méthode des dilutions successives) dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/mL, 5000pg/mL respectivement).
[0079] - Résultats
[0080] [Tableau 1]
Figure imgf000013_0001
[0081] [Tableau 1] : % de viabilité moyenne (n=3, moyenne +1- déviation standard) pour une dilution donnée du lysat d’amibe en fonction du temps.
[0082] Le lysat d’amibe présente une absence de toxicité pour une dilution au 1/500 et au 1/1000. [0083] 3. Test d’induction des gènes d’intérêt
[0084] L'analyse d'induction des gènes cibles est effectuée sur des cellules humaines épithéliales (ATCC CCL-2) cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dubelcco (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM) (GibCo-BRL) complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/mL, 5000pg/mL respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2.
[0085] Brièvement, 1.106 cellules humaines épithéliales / puits sont mises en culture dans du milieu DMEM complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/mL, 5000pg/mL respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2.
[0086] Les cellules humaines épithéliales sont stimulées ou non avec du lysat d’amibe (dilution 1/100, 1/500, 1/1000) pendant 8 heures à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2.
[0087] Les ARN totaux sont extraits suivant le protocole RNAeasy de Qiagen, quantifiés par nanodrop (260 nm) et normalisés a 100 ng/pL (stockés a -20°C). Lors de la quantification des ARN totaux, le ratio 260/280 nm est défini. Le ratio 260/280 permet de détecter une contamination des acides nucléiques par des protéines. Sa valeur varie entre 2,0 et 2,2 pour de l'ARN total. Le ratio 260/280 doit se situer entre 2,0 et 2,2. Seuls les échantillons présentant le ratio cité ci-dessus ont été utilisés pour les analyses.
[0088] Les ARNm contenu dans les échantillons d'ARN totaux sont transformés en ADNc par reverse transcription en utilisant une amorce oligonucléotidique simple brin 18-mer, oligo(dt) 18, puis stockés a -20°C. La PCR quantitative est réalisée sur CFX96 Bio-rad, méthode syber-green en utilisant les amorces spécifiques des gènes d'intérêt cibles. Les résultats sont exprimés en facteur multiplicatif (Fc pour en anglais « fold change ») selon la formule ci-dessous moyennée (n=3, moyenne +/- écart type).
[0089] Fc = 2A(-AACt) avec AACt = (Ct gène cible - Ct gène constitutif^ - (Ct gène cible - Ct gène constitutif)contrôle
[0090] Le gène constitutif ou gène contrôle est le gène GAPDH codant la glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase et les gènes cibles sont: TLR2 (immunité), TGF-beta (multiplication cellulaire, anti-inflammation), RUNX1 (multiplication cellulaire, cohésion tissulaire, différentiation cellulaire), PIWILI (renouvellement cellulaire), SGK1 (protection UV, anti stress oxydatif, photo vieillissement), F0X01 (protection UV, anti stress oxydatif, photo vieillissement), BCL2 (anti-mort cellulaire), HMMR (récepteur acide hyaluronique, mobilité cellulaire), HAS (synthèse acide hyaluronique), COLA1 (synthèse de collagène), FBLS (cicatrisation).
[0091] [Tableau 2]
Figure imgf000015_0001
[0092]
[Tableau 2] : Les résultats présentent les Fc (n=3, moyenne +/- écart type) en fonction de la dilution. Les « fold change » supérieurs ou égaux à 1,5 sont indiqués en gras.
[0093] Une lecture du [Tableau 2] indique que les 7 gènes : BCL2 (anti-mort cellulaire), FBL5 (cicatrisation), F0X01 (protection UV, anti stress oxydatif, photo-vieillissement), SGK1 (protection UV, anti stress oxydatif, photo-vieillissement), HAS (synthèse acide hyaluronique), PIWIL1 (renouvellement cellulaire), TLR2 (immunité) sont régulés positivement (Fc supérieur ou égal à 1 ,5) par le traitement avec le lysat d’amibe, et par conséquent peuvent présenter un intérêt cosmétique.
[0094] Il a été considéré pour le reste de l'analyse les gènes ayant leur expression augmentée d’au moins 1 ,5 fois par le traitement avec le lysat d’amibe. Ces gènes ont été séparés en deux catégories, afin de procéder à une analyse plus fine: les gènes dont l'augmentation de l'expression est comprise 1 ,5 et 1 ,99, et les gènes dont l'augmentation de l'expression est supérieure ou égale à 2.
[0095] - Les gènes dont l'augmentation de l'expression est comprise entre 1.5 et 1.99. [0096] Le traitement avec le lysat d’amibe stimule modérément, dans les cellules humaines, l'expression des fonctions cellulaires suivantes : la cicatrisation (FBL5), la synthèse de l'acide hyaluronique (HAS), l'immunité anti-infectieuse : virus et bactéries (TLR2) (Fig. 1 ).
[0097] - Les gènes dont l'augmentation de l'expression est supérieure ou égale à 2.
[0098] Le traitement avec le lysat d’amibe stimule très fortement, dans les cellules humaines, l'expression des fonctions cellulaires suivantes : protection contre la mort cellulaire (BCL2), renouvellement cellulaire (PIWIL1), protection UV, anti stress oxydatif, photo-vieillissement (F0X01 et SGK1). Les expressions mesurées sont 2 à 5 fois supérieures au contrôle (Fig. 2). Le maximum d'expression de la protection contre la mort cellulaire (BCL2) se manifeste pour une dilution au 1/1000 du lysat d’amibe. Les maximums d'expressions pour les 3 autres gènes se manifestent pour la dilution 1/500 du lysat d’amibe.
[0099] Conclusion
[0100] Le lysat d’amibe Willaertia magna (souche ATCC PTA-7824) est non cytotoxique à partir d'une dilution au 1/500.
[0101] Le lysat d’amibe stimule modérément l'expression des fonctions cellulaires de cicatrisation, la synthèse de l'acide hyaluronique, et l'immunité anti-infectieuse (virus et bactéries) qui présentent un intérêt cosmétique.
[0102] Le lysat d’amibe induit très fortement l'expression des fonctions cellulaires d'importance en cosmétique suivante : protection contre la mort cellulaire, renouvellement cellulaire, et protection UV, anti stress oxydatif et photo-vieillissement. Les expressions mesurées sont 2 à 5 fois supérieures par rapport au contrôle.
[0103] Le lysat d’amibe peut donc être utilisé pour les usages cosmétiques suivants :
- protection contre la mort cellulaire des cellules de la peau,
- le renouvellement cellulaire des cellules de la peau,
- protection contre les effets des UV,
- anti-stress oxydatif,
- protection contre le photo-vieillissement.
Exemple 2: Evaluation de l'effet d'un lysat d'amibe Willaertia magna (souche ATCC PTA-7824) sur un modèle de peau 3D âgée (vieillissement intrinsèque) ou exposée à des radiations UV (vieillissement extrinsèque)
[0104] 1. Matériel et méthodes
[0105] 1.1 Isolement des cellules cutanées
[0106] Le tissu cutané humain a été prélevé conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki et son utilisation a été déclarée au ministère français de la Recherche (déclaration n° DC-2020-4346). Un consentement éclairé écrit a été obtenu du donneur conformément à la loi française de bioéthique de 2014 (loi 94-954 du 29 Juillet 1994).
[0107] Des cultures primaires de fibroblastes, de kératinocytes et de mélanocytes humains ont été établies à partir d'une biopsie de peau saine obtenue chez un nourrisson (< 5 ans) ou un adulte (> 40 ans). Les kératinocytes (normal human epidermal kératinocyte : NHEK) et mélanocytes (normal human epidermal melanocyte : NHEM) de l'épiderme humain normal et les fibroblastes dermiques (normal human dermal fibroblast : NHDF) ont été isolés de la peau humaine comme décrit précédemment (Germain L. et al, 1993).
[0108] 1.2 Préparation de produits cosmétiques
[0109] Le lysat d'amibe Willaertia magna (souche ATCC PTA-7824) a été conservé a -20°C. Avant d'être testé sur un modèle de peau en 3D, le lysat d'amibe a fait l'objet d'essais de cytotoxicité afin de vérifier la viabilité des cellules à la concentration recommandée.
[0110] 1.3 Peau reconstruite en 3D et traitement
[0111] - Vieillissement intrinsèque
[0112] Le modèle LabSkin 3D (LabSkin Creations) de peau reconstruite sur toute l'épaisseur a été obtenu en cultivant des NHDF (> 40 ans) dans une matrice composée de collagène, de glycosaminoglycanes et de chitosane (LabSkin matriXTM) pendant 21 jours dans des conditions de culture cellulaire optimisées pour la néosynthèse de la matrice extra-cellulaire (MEC), comme décrit précédemment (Dos Santos M. et al., 2005, Tissue Engineering, 2005 May-Jun;11(5-6)).
[0113] Les NHEK ont ensuite été ensemencées sur la partie supérieure des constructions équivalentes au derme et élevées à l'interface air/liquide pour permettre la formation du compartiment épidermique.
[0114] Du dixième jour jusqu'à la fin de la culture au 42ème jour, les échantillons de peau 3D ont été traités de manière systémique avec du lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à 0.2E-03 % ou 0,1 E- 03 %. Les traitements ont été renouvelés à chaque renouvellement de milieu, soit 3 fois par semaine.
[0115] Des échantillons équivalents de peau récoltés au 42ème jour de la culture cellulaire totale ont été immédiatement fixés dans du formol tamponné neutre 4% (Diapath) pendant 24 heures et inclus dans de la paraffine ou dans un composé OCT (pour en anglais : Optimal cutting temperature) et congelés à -80°C, pour analyse histologique et analyse immuno-histologique, respectivement.
[0116] Pour chaque condition de culture cellulaire et chaque analyse, des équivalents de peau en 3D ont été produits en trois exemplaires.
[0117] - Vieillisement extrinsèque
[0118] Le modèle LabSkin 3D (LabSkin Creations) de peau reconstruite sur toute l'épaisseur a été obtenu en cultivant des NHDF (< 5 ans) dans une matrice composée de collagène, de glycosaminoglycanes et de chitosane (LabSkin matriXTM) pendant 21 jours dans des conditions de culture cellulaire optimisées pour la néosynthèse de la MEC, comme décrit précédemment (Dos Santos M. et al., 2005, Tissue Engineering, 2005 May-Jun; 11(5-6)). Les cellules NHEK et NHEM ont ensuite été ensemencées sur le dessus des constructions dermiques équivalentes et élevées à l'interface air/liquide pour permettre la formation du compartiment pigmenté de l'épiderme.
[0119] Du 10ème jour jusqu'à la fin de la culture au 42èmejour, les échantillons de peau reconstruite en 3D ont été traités de manière systémique avec du lysat d'Amibe comme suit : 0.45E-03 % ou 0.2E-03 %. Les traitements ont été renouvelés à chaque renouvellement de milieu, soit 3 fois par semaine.
[0120] Au 42ème jour, les constructions tissulaires ont été exposées à 100 mJ/cm2 UVB.
[0121] Des échantillons équivalents de peau prélevés au 42ème jour de la culture cellulaire totale ont été immédiatement fixés dans du formol tamponné neutre à 4 % (Diapath) pendant 24 heures et inclus dans de la paraffine ou dans un composé OCT et congelés a -80°C, pour analyse histologique et analyse immuno-histologique, respectivement.
[0122] Pour chaque condition de culture cellulaire et chaque analyse, des équivalents de peau en 3D ont été produits en trois exemplaires.
[0123] 1.4 Analyse histologique
[0124] - Coloration a l'hématoxyline, à la phloxine et au safran
[0125] Pour évaluer la structure cutanée globale des échantillons, une coloration à l'hématoxyline- phloxine-safran (HPS) a été réalisée. Des coupes en paraffine de 5pm de chaque condition ont été réalisées. Après déparaffinage et réhydratation, les échantillons ont été colorés à l'HPS. Après rinçage, les coupes ont été déshydratées avant le montage des lames avec un milieu de montage hydrophobe.
[0126] - Coloration de Warthin-Starry
[0127] Pour évaluer la synthèse de la mélanine, une coloration argentée de Warthin-Starry a été réalisée. Après déparaffinage et réhydratation, les sections ont été incubées avec une solution de nitrate d'argent à 6 % pendant 20 minutes en suivant les instructions du kit du fournisseur (Merck). Le développement de l'argent a été stoppé par une étape de lavage à l'eau. Ensuite, les sections ont été incubées avec un mélange d'hydroquinone et de gélatine. Cette étape a permis le développement des granules de mélanine en brun foncé à noir et la contre-coloration des sections équivalentes de peau en jaune à orange.
[0128] 1.5 Acquisition des images
[0129] Les spécimens colorés au HPS et au Warthin-Starry ont été observés à l'aide d'un microscope optique Axioskop 2 Plus (Zeiss), et les images ont été capturées à l'aide de la caméra CCD DS-Ri 1 (Nikon) et du logiciel NIS-Elements (Nikon). Les images de 16 bits ont été sauvegardées dans un format de fichier d'image non compressé (tiff). Neuf images représentatives ont été capturées pour chaque condition de la même manière.
[0130] 1.6 Analyse statistique [0131] Les données ont été évaluées à l'aide d'un test de Student à sens unique, et les différences statistiquement significatives sont indiquées par des astérisques comme suit : *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001.
[0132] 2. Résultats
[0133] Vieillissement intrinsèque
[0134] 2.1.1 Analyse histologique du modèle de peau vieillissante 3D non traitée.
[0135] L'analyse histologique du modèle 3D de peau jeune ou vieillissante non-traitée est présentée dans la (Fig. 3).
[0136] La structure globale de la peau reconstruite âgée est cohérente aux niveaux épidermique et dermique, avec un épiderme pluristratifié, bien différencié de la couche basale au stratum corneum, bien ancré au-dessus de l'équivalent dermique rempli de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire (MEC) néosynthétisée. La jonction dermo-épidermique semble cohésive et régulière. Cependant, par rapport au modèle de peau jeune, le vieillissement a une incidence sur les compartiments épidermiques et dermiques. La matrice extracellulaire est moins dense et abondante et est désorganisée, ce qui a un impact sur l’élasticité du tissu et l’hydratation. L’épaisseur de l’épiderme est réduite avec moins de couches de cellules vivantes. De plus, la différenciation terminale est interrompue avec moins de stratum granulosum et stratum corneum ce qui a un impact sur la fonction barrière (Fig. 3).
[0137] 2.1.2 Analyse histologique d'un modèle 3D de peau vieillissante traité au lysat d'amibe
[0138] L'analyse histologique du modèle de peau vieillissante en 3D traité avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) est présentée dans la (Fig. 4). Par rapport à la condition âgée non traitée, le traitement avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à 0.2E-03 % a augmenté l'épaisseur de l'épiderme.
[0139] De plus, il y a eu une récupération de la différenciation terminale après le traitement par rapport à la condition non traitée. En ce qui concerne le compartiment dermique, le traitement au lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) a amélioré la qualité et l'abondance de la matrice extracellulaire (Fig. 4). Des effets similaires ont été observés avec le traitement au lysat d'amibe à 0.1 E-03 %.
[0140] 2.2 Vieillissement intrinsèque
[0141] 2.2.1 Analyse histologique d’un modèle 3D de peau non traitée dans des conditions d'exposition aux UVB
[0142] L'analyse histologique du modèle 3D de peau pigmentée exposée aux UVB est présentée dans la (Fig. 5).
[0143] La structure globale de la peau reconstruite exposée aux UVB est cohérente au niveau épidermique et dermique, avec un épiderme pluristratifié, bien différencié de la couche basale au stratum corneum, bien ancré au sommet de l'équivalent dermique rempli de fibroblastes et d'une MEC néosynthétisée. La jonction dermo-épidermique semble cohésive et régulière. Cependant, par rapport à la condition non exposée, le stress UVB a un impact sur les compartiments dermique et épidermique. La matrice extracellulaire est moins dense et moins abondante et est désorganisée, ce qui a un impact sur l'élasticité et l'hydratation des tissus. La matrice extracellulaire est également désorganisée. L'épaisseur de l'épiderme est réduite avec moins de couches de cellules vivantes, ce qui a un impact sur la fonction de barrière (Fig. 5.A).
[0144] En ce qui concerne la coloration de Warthin Starry, le stress UVB stimule les mélanocytes qui produisent des pigments de mélanine par rapport à l'état non exposé aux UVB (Fig. 5. B).
[0145] L'analyse histologique du modèle 3D de peau pigmentée exposée aux UVB et traité avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) est présentée dans la (Fig. 6).
[0146] Comparé aux conditions non traitées et exposées aux UVB, le traitement avec le lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) 0.45E-03 % améliore la qualité et l'abondance de la MEC. De plus, le traitement induit une augmentation de l'épaisseur de l'épiderme (Fig. 6.A). Des effets similaires sont observés avec le traitement au lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à 0.2E-03 %.
[0147] En ce qui concerne la coloration de Warthin Starry, le traitement au lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) à 0.45E-03 % induit une stimulation modérée des mélanocytes par rapport à la condition non traitée et à la condition exposée aux UVB. Aucune différence n'a été observée entre la condition non traitée et la condition traitée avec 0.2E-03 % de lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) après le stress UVB (Fig. 6. B).
[0148] Conclusions
[0149] Dans l'ensemble, les résultats histologiques ont démontré des effets bénéfiques du lysat d’amibe Willaertia (PTA-7824) sur le vieillissement intrinsèque et extrinsèque du modèle de peau reconstruite en 3D.
Exemple 3 : Evaluation de l'effet d'un lysat d'amibes Willaertia magna (souche ATCC PTA- 7824) appliqué en hémi-visage chez le sujet adulte
1. Produit expérimental
- PLACEBO (réf. : AM-CV-1.04 - Batch Labo 040-24)
- FORMULE ACTIVE 0,05% (réf. : AM-CV-1.05 - Batch Labo 047-24) contenant 0,05% w/v de Lysat de Willaertia magna C2c Maky
- FORMULE ACTIVE 0,1% (réf. : AM-CV-1.06 - Batch Labo 048-24) contenant 0,1%w/vde Lysat de Willaertia magna C2c Maky
2. Protocole
Figure imgf000021_0001
3. Résultats
[0150] Les applications répétées du de la "FORMULE ACTIVE 0,05%" effectuées deux fois par jour, pendant 8 semaines, dans les conditions normales d'utilisation, sur la moitié du visage (l'autre moitié du visage étant traitée par le produit "PLACEBO" ou la "FORMULE ACTIVE 0.1 %" - 2 produits expérimentaux par sujet selon une randomisation), par 21 sujets adultes féminins, âgés de 46 à 60 ans, présentant tous les types de peau du visage et répondant aux critères d'inclusion prédéfinis, ont abouti à :
- une augmentation statistiquement et cliniquement significative de l’éclat de la peau (J28 : +8%, J56 : +12%) et de l'élasticité de la peau (J28 : +12%, J56 : +14%), après 4 et 8 semaines d'utilisation, associée à une augmentation statistiquement et cliniquement significative de la finesse de la peau (texture de la peau) (J56 : +10%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux évaluations initiales (JO), sur la base d'une évaluation clinique effectuée par un évaluateur qualifié;
- une amélioration statistiquement significative des paramètres densité du derme profond (J28 : +3%, J56 : +4%) et densité des structures échogéniques du derme (J28 : +2%, J56 : +4%), après 4 et 8 semaines d'utilisation, associée à une augmentation statistiquement significative du paramètre densité du derme superficiel (J56 : +3%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base d'une évaluation instrumentale (mesures échographiques analysées par Orion Concept) ;
- une diminution statistiquement significative du paramètre volume (J56 : -17%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base de répliques de peau en silicone analysées par image vidéo (Quantilines ™).
- une augmentation proche de la significativité de la finesse de la peau (texture de la peau) (J28 : +6%), après 4 semaines d'utilisation, par rapport aux évaluations initiales, sur la base d'une évaluation clinique réalisée par un évaluateur qualifié ;
- une amélioration proche de la significativité du paramètre densité superficielle du derme (J28 : +2%), après 4 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base d'une évaluation instrumentale (mesures échographiques analysées par Orion Concept) ;
- une diminution proche de la significativité du paramètre profondeur totale (J28 : -8%), après 4 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base des répliques de peau en silicone analysées par image vidéo (Quantirides™) ;
- une augmentation non favorable proche de la significativité du paramètre ra : rugosité moyenne arythmétique (J28 : +3%), après 4 semaines d'utilisation, associée à une diminution favorable proche de la significativité du paramètre rp (paramètre douceur - profondeur) (J56 : -5%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base de répliques de peau en silicone analysées par image vidéo (Quantilines™).
[0151] L'évaluation clinique réalisée par un évaluateur qualifié, à partir de photographies numériques de 21 sujets adultes de sexe féminin, âgés de 46 à 60 ans, qui ont testé le produit expérimental "FORMULE ACTIVE 0,05%" sur la moitié du visage (l'autre moitié du visage étant traitée avec "PLACEBO" ou "FORMULE ACTIVE 0,1 %" - 2 produits expérimentaux par sujet selon une randomisation) a conduit à une diminution statistiquement et cliniquement significative des rides sous les yeux (J56 : -15%) et des rides de la patte d'oie (J56 : -12%), après 8 semaines d'applications répétées de formule active 0,05% (produit b) sur la moitié du visage, en comparaison avec les évaluations initiales.
[0152] A noter une diminution proche de la significativité des rides sous les yeux (J28 : -9%) et des rides de la patte d'oie (J28 : -6%), après 4 semaines d'utilisation, par rapport aux évaluations initiales.
[0153] De la même manière, les applications répétées du produit expérimental désigné sous le nom de "FORMULE ACTIVE 0,1 %" deux fois par jour, pendant 8 semaines, dans les conditions normales d'utilisation, sur la moitié du visage (l'autre moitié du visage étant traitée par "PLACEBO" ou "FORMULE ACTIVE 0,05%" - 2 produits expérimentaux par sujet selon une randomisation), par 21 sujets adultes de sexe féminin, âgés de 33 à 60 ans, de tous types de peau du visage et présentant des critères d'inclusion prédéfinis, ont conduit à :
- une augmentation statistiquement et cliniquement significative de l’éclat de la peau (J28 :+8% ; J56 : +16%), de la fermeté de la peau (J28 : +6%, J56 : +1 1 %) et de l'élasticité de la peau (J28 : +9%, J56 : +14%), après 4 et 8 semaines d'utilisation, associée à une augmentation statistiquement et cliniquement significative de la finesse de la peau (texture de la peau) (J56 : 12%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux évaluations initiales, sur la base d'une évaluation clinique effectuée par un évaluateur qualifié ;
- une amélioration statistiquement significative de la densité des structures échogéniques du derme (J28 : +2%, J56 : +4%), après 4 et 8 semaines d'utilisation, associée à une amélioration statistiquement significative de l'épaisseur du derme (J28 : +1 1 %) après 4 semaines d'utilisation seulement et une amélioration statistiquement significative de la densité du derme superficiel (J56 : +5%), de la densité du derme profond (J56 : +4%) et de l'âge du derme (J56 : -6%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base d'une évaluation instrumentale (mesures échographiques analysées par Orion Concept).
- une augmentation proche de la significativité de la finesse de la peau (texture de la peau) (J28 : +5%), après 4 semaines d'utilisation, par rapport aux évaluations initiales, sur la base d'une évaluation clinique réalisée par un évaluateur qualifié ;
- une amélioration proche de la significativité des paramètres surface totale des rides (J56 : -17%) et profondeur totale des rides (J56 : -13%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base de répliques de peau en silicone analysées par image vidéo (Quantirides™)
- une diminution proche de la significativité du paramètre rp : douceur - profondeur (J56 : -5%), après 8 semaines d'utilisation, par rapport aux valeurs initiales, sur la base de répliques de peau en silicone analysées par image vidéo (Quantilines™).
[0154] L’évaluation clinique réalisée par un évaluateur qualifié, à partir de photographies numériques de 21 femmes adultes, âgées de 33 à 60 ans, qui ont testé le produit expérimental "formule active 0,1 %" sur la moitié du visage (l'autre moitié du visage étant traitée avec "placebo" ou "formule active 0,05 %" - 2 produits expérimentaux par sujet selon une randomisation), a conduit à une diminution statistiquement et cliniquement significative des rides de la patte d'oie (J28 : -12% ; J56 : -16%), après 4 et 8 semaines d'applications répétées de « formule active 0,1 % » en hémi-visage, associée à une diminution statistiquement et cliniquement significative des rides sous les yeux (J56 : -11 %), après 8 semaines d'utilisation, en comparaison avec les évaluations initiales.
Exemple 4. Effet du lysat d’amibe Willaertia sur l’expression de gènes dans des follicules de cheveux ex vivo. [0155] Dans la présente étude, les effets du lysat d’amibe Willaertia ont été évalués dans le modèle de culture ex vivo de bulbes de cheveux isolés de scalp humain.
[0156] Le modèle de culture ex vivo de follicules de cheveux humains, dérivé du modèle validé et bien décrit de Philpott et al. (Philpott M.P., Green M.R. and Kealey T. Human hair growth in vitro. Journal of Cell Science, 1990, 97, p.463-471) est un modèle permettant l’évaluation de composés capables notamment de moduler la croissance et la survie des cheveux. Ce modèle consiste en un organe isolé complet et représente un modèle « naturel » de co-culture de cellules cutanées telles que des kératinocytes, mais aussi des fibroblastes, des mélanocytes et des cellules souches.
[0157] Dans cette étude, les effets du composé ont été évalués sur un profil d’expression de gènes spécifique par RT-qPCR. L’ARNm extrait a été analysé à l’aide d’une PCR array ciblant des gènes importants dans la physiologie du cheveu (dont 2 gènes de ménage ou housekeeping genes).
1. Matériel et méthode
1.1. Modèle biologique
- Type cellulaire : Bulbes de cheveux isolés par microdissection au niveau de l’hypoderme de fragments de peau humaine, lifting (chirurgie plastique), Donneur féminin n° E2274 de 55 ans.
- Conditions de culture : 37°C, 5% CO2
- Milieu de culture : Milieu E de Williams liquide optimisé pour l’essai, complémenté avec Insuline et Hydrocortisone
1.2. Composé testé
Figure imgf000024_0001
Tableau 3 : Composé testé
1.3. Culture et traitement
[0158] Dès l’isolement, les bulbes de cheveux ont été placés en plaques 24 puits (1 bulbe de cheveu par puits de culture) et incubés en milieu de culture contenant ou non (témoin) le composé à l’essai pendant 48 heures. Pour chaque condition, un excès de bulbes a été préparé afin d’atteindre la valeur-cible de 11 follicules sélectionnés/condition au final.
[0159] A la fin de l’incubation, les follicules ont été rincés avec une solution de PBS puis congelés et stockés à -80°C jusqu’à l’extraction des ARN.
1.4 Analyse de l’expression différentielle
[0160] L’expression des marqueurs a été analysée par RT-qPCR sur les ARN totaux extraits des cheveux de chaque condition à l’essai. L’analyse des transcrits a été réalisée en n=2 à l’aide d’une PCR array ciblant des gènes importants dans la physiologie du cheveu (dont 2 gènes de ménage ou housekeeping genes).
[0161] Les échantillons ont été mécaniquement broyés à l’aide d’un pilon, puis soniqués avant extraction des ARN totaux de chaque échantillon à l’aide de TriPure Isolation Reagent®. La qualité des ARN a été évaluée par électrophorèse capillaire (4200 TapeStation System, Agilent technologies). La quantité des ARN a été évaluée à l’aide d’un spectrophotomètre (Synergy H1 , BioTek Instruments). Les ADN complémentaires (ADNc) ont été synthétisés par transcription inverse des ARN totaux en présence d’oligo(dT) et de l’enzyme « Transcriptor Reverse Transcriptase » (Roche). Les quantités d’ADNc ont ensuite été ajustées avant l’étape de PCR.
[0162] Les réactions de PCR (polymerase chain reaction) ont été réalisées par PCR quantitative (Light Cycler ; Roche Molecular Systems Inc.) et selon les procédures recommandées par le fournisseur.
[0163] Le mélange réactionnel (10 pL final) pour chaque échantillon contenait :
- 2,5 pL d’ADNc, les amorces des différents marqueurs utilisés, le mélange réactionnel (Ozyme) contenant l’enzyme Taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green I et du MgCl2.
[0164] Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel.
[0165] L’incorporation de fluorescence dans l’ADN amplifié est mesurée en continu au cours des cycles de PCR. Ces mesures permettent d’obtenir des courbes d’intensité de la fluorescence en fonction des cycles de PCR et d’évaluer ainsi une valeur d’expression relative pour chaque marqueur.
[0166] Le nombre de cycles est déterminé à partir des points de « sortie » des courbes de fluorescence. Pour un même marqueur analysé, plus un échantillon sort tard (nombre de cycles élevé), plus le nombre initial de copies de l’ARNm est faible. La valeur d’expression relative est déterminée selon la formule : (i/2nombre de cycles) x 106.
[0167] La PCR array utilisée dans cette étude contient 2 gènes de ménage (GAPDH et RPS28). Ces gènes de ménage (ou housekeeping genes) ont été utilisés pour la normalisation des données car ils sont exprimés de façon constitutive et leur niveau d’expression est en théorie stable. Par conséquent, pour l’ensemble des conditions testées, la normalisation du niveau d’expression des marqueurs cibles a été réalisée en comparant leur niveau d’expression à la moyenne d’expression de ces 2 gènes de ménage. 2. Résultats et conclusions
[0168] Dans les conditions expérimentales de cette étude, le lysat d’amibe Willaertia, testé à la concentration de 10-3 %, a globalement modulé le profil d’expression des gènes analysés dans les follicules pileux (Tableau 1).
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Tableau 4 : Effets du lysat d’amibe Willaertia sur l’expression des gènes dans des follicules de cheveux ex vivo
[0169] A la concentration testée (10-3 %), le composé a induit :
Une augmentation de l’expression des gènes MLPH, TYRP1, MC1R et POMC impliqués dans la synthèse de mélanine, la régulation de la mélanogénèse ainsi que la formation et le transport des mélanosomes. Une diminution de l’expression de certains gènes de cette famille peut affecter la pigmentation des cheveux.
Une augmentation de l’expression de gènes PTGS1 et PTGS2 qui codent des enzymes jouant un rôle dans la médiation de la réponse inflammatoire et impliquées dans la régulation de la croissance des cheveux (prolongation de la phase anagène), via la production de PGE2.
Une augmentation de l’expression du gène FGF7, codant un facteur de croissance qui favorise la prolifération des kératinocytes qui sont les principales cellules constituant les follicules pileux.
Une augmentation de l’expression de gènes codant des facteurs de croissance (FGF7, IGF1) ou leur récepteur (EGFR).
Une augmentation de l’expression du gène Vitamin D receptor (VDR) essentiel à l'homéostasie du follicule pileux, sa carence entraînant la chute des cheveux.
Une augmentation de l’expression du gène CTNNB1 codant la bêta-caténine, impliquée dans la signalisation Wnt importante pour la régulation de la croissance des cheveux, dans la différenciation cellulaire, la morphogenèse du follicule pileux, le processus du cycle pilaire et la régulation positive du facteur de croissance des fibroblastes.
Référence à du matériel biologique déposé
[0170] Dans la présente demande, il est fait référence au matériel biologique suivant et à la souche: - référence d’identification « Amoeba Willaertia magna : Will.C2c.Maky » et numéro d’enregistrement « PTA-7824 » déposée à l’American Type Culture Collection (ATCC), aux Etats-Unis, le 21 août 2006 par CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16/France et UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex/France.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Composition cosmétique non thérapeutique comprenant des protozoaires du genre amibien Willaertia et au moins un excipient cosmétique acceptable.
[Revendication 2] Composition cosmétique selon la revendication 1 pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau ou du cheveu.
[Revendication 3] Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les protozoaires appartiennent à l’espèce Willaertia magna, de préférence lesdits protozoaires correspondent, à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l’ATCC.
[Revendication 4] Composition selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que lesdits protozoaires sont sous forme lysée.
[Revendication 5] Composition selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptables choisis parmi le groupe consistant en : l’eau, un composant aqueux, un corps gras, un tensio-actif, un colorant, un agent de texture, un conservateur, un humectant, un émulsifiant, un anti-oxydant, un parfum et un solvant.
[Revendication 6] Composition selon l’une des revendications 1 à 5 sous la forme d’une lotion, lait, solution, suspension, émulsion, mousse, baume, huile, crème, gel, savon liquide ou savon solide.
[Revendication 7] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 en tant qu’agent anti-âge.
[Revendication 8] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 pour prévenir ou réduire une altération non-pathologique de la peau, de préférence un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau.
[Revendication 9] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 pour prévenir ou réduire un ou plusieurs signes du vieillissement de la peau lié à l’exposition aux ultraviolets, de préférence en augmentant l’épaisseur de l’épiderme, la différenciation du stratum granulosum ou du stratum corneum et/ou en augmentant la qualité et la quantité de la matrice extracellulaire présente dans la peau.
[Revendication 10] Utilisation non-thérapeutique selon l’une des revendications 7 à 9 d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6, pour favoriser la régénération de la peau, ralentir la mort cellulaire dans la peau ou protéger contre le stress oxydatif tel que celui induit par l’exposition aux rayonnements ultraviolets.
[Revendication 11] Utilisation non-thérapeutique selon l’une des revendications 8 à 10, d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6, dans laquelle le ou les signes de vieillissements de la peau sont choisis parmi le groupe constitué par : l’apparition de rides ou ridules sur la peau, un relâchement de la peau, une perte d’élasticité, de fermeté ou de densité de la peau.
[Revendication 12] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 pour prévenir ou réduire une altération non-pathologique du cheveu, de préférence un ou plusieurs signes du vieillissement du cheveu.
[Revendication 13] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 pour prévenir ou réduire une altération de la pigmentation du cheveu.
[Revendication 14] Utilisation non-thérapeutique d’une composition cosmétique selon l’une des revendications 1 à 6 pour favoriser la croissance du cheveu et/ou pour prévenir ou réduire la chute des cheveux.
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