FR3049461A1

FR3049461A1 - Utilisation d'un extrait vegetal du fruit de pouteria lucuma dans une composition costique

Info

Publication number: FR3049461A1
Application number: FR1652957A
Authority: FR
Inventors: Anne-Laure Andre; Fabienne Venturoli
Original assignee: Jafer Enterprises R&D SL
Current assignee: Jafer Enterprises R&D SL
Priority date: 2016-04-05
Filing date: 2016-04-05
Publication date: 2017-10-06
Anticipated expiration: 2036-04-05
Also published as: FR3049461B1

Abstract

L'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique d'au moins une quantité efficace d'un extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe, comme principe actif destiné à apporter un effet énergisant à la peau, à prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané et à hydrater la peau. L'invention concerne également le procédé de préparation d'un extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe, et l'extrait obtenu par le dit procédé. L'invention concerne encore une composition cosmétique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable une quantité efficace d'un extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe fraiche ou séchée. L'invention concerne aussi un procédé de traitement cosmétique.

Description

UTILISATION D’UN EXTRAIT VÉGÉTAL DU FRUIT DE POUTERIA LUCUMA DANS UNE COMPOSITION COSMÉTIQUE.

La présente invention se situe dans le domaine cosmétique. L’invention concerne un extrait végétal en tant que principe actif et son utilisation dans une composition cosmétique. L’invention concerne plus précisément l’utilisation d’un extrait du fruit de Pouteria lucuma comme actif cosmétique pour apporter un effet énergisant à la peau, pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané et pour hydrater et améliorer la fonction barrière de la peaur

Dans nos sociétés, l'esthétisme et l'apparence prennent une place de plus en plus importante. Pour améliorer leur image, beaucoup de gens ont tendance à vouloir paraître jeunes le plus longtemps possible et cherchent à estomper les manifestations visibles du vieillissement de la peau. C'est pourquoi l'objectif de la présente invention est de proposer un produit cosmétique permettant de pallier aux effets néfastes du soleil et du temps sur la peau humaine.

Les inventeurs de la présente demande de brevet ont découvert de manière surprenante qu’un extrait de plante particulier permet, intégré dans une composition cosmétique, de procurer un effet énergisant à la peau, de lutter efficacement contre le vieillissement cutané et limiter l'apparition des effets néfastes qui en découlent et de favoriser la fonction barrière de la peau pour améliorer l’hydratation cutanée.

Pouteria lucuma (Lucuma) est un arbre de la famille des Sapotaceae, indigènes du Pérou, qui donne un fruit connu sous le nom de lucuma dans les Andes. La lucuma (le fruit) est apprécié dans les desserts, particulièrement sous forme de glace, produits laitiers ou de gâteau. La lucuma comprend une peau, un noyau et de la pulpe. C’est la pulpe qui est communément utilisée sous forme de poudre ou de tranches séchées dans les diverses compositions alimentaires.

Il est connu que la lucuma est une bonne source d'hydrates de carbone, de vitamines (niacine, bêta-carotène)\ de sels minéraux (fer) et de fibres alimentaires^.

On connaît également des demandes de brevet US20110318403 et EP2352489 un procédé de préparation d'un extrait de Pouteria lucuma, lequel procédé comprend l'extraction d'huile à partir du noyau. L'huile du noyau de Lucuma est décrite comme efficace pour induire une migration cellulaire, améliorer une régénérescence tissulaire et améliorer une cicatrisation de plaie. Ce document divulgue par conséquent que l’huile du noyau de Lucuma est utile pour l'entretien thérapeutique ou cosmétique de la peau et du cuir chevelu.

Contre toute attente, les inventeurs ont constaté qu’un extrait de peau et/ou de pulpe du fruit de Lucuma dans une composition cosmétique permet efficacement d’apporter un effet énergisant à la peau, de prévenir el/ou lutter contre le vieillissement cutané et d’hydrater la peau.

La peau est un organe vital composé de plusieurs couches (derme, couches prolifératives et stratum corneum) qui recouvre toute la surface du corps et assure essentiellement une fonction de barrière vis-à-vis du milieu extérieur. Cette fonction barrière repose en particulier sur la qualité de l'épiderme qui dépend notamment de l’état du stratum corneum et de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation des kératinocytes épidermiques.

Les kératinocytes sont des cellules constituant 90% de la couche superficielle de la peau (épiderme) et des phanères (ongles, cheveux, poils). Ils synthétisent la kératine, une protéine fibreuse et insoluble dans l’eau, qui assure à la peau sa propriété d’imperméabilité et de protection extérieure. L'épiderme est divisé en quatre couches basées sur la morphologie des kératinocytes, lesquels passent progressivement de la couche basale vers les couches supérieures par différenciation cellulaire jusqu'au stratum corneum ou ils forment une couche de cellules mortes nommées squames, par apoptose. Cette couche constitue une barrière de protection et réduit la perte d'eau de l'organisme. Les kératinocytes sont en perpétuel renouvellement. Us mettent environ 1 mois pour aller de la couche basale au stratum corneum mais ce processus peut être accéléré en cas d'hyperprolifération de kératinocytes (psoriasis).

La modulation de la différenciation des kératinocytes est un processus biologique qui peut intervenir dans le traitement des manifestations du vieillissement cutané, que ce soit tant dans la fonction barrière de la peau que dans la formation des rides. Comme actif inhibant la différentiation des kératinocytes on peut citer les rétinoïdes (rétinol, acide rétinoïque entre autres) qui sont reconnus comme principes actifs cosmétiques et dermatologiques agissant contre de nombreux problèmes cutanés tels que le psoriasis, l’acné et les rides.^’"^ Cependant, les rétinoïdes induisent une inflammation de la peau incitant des laboratoires de recherche a investiguer de nouveaux actifs rétinoïde-like inhibiteurs de la différenciation des kératinocytes non inflammatoires.^

Les fibroblastes sont des cellules présentes dans le tissu conjonctif, elles sont parfois appelées cellules de soutien. Ce sont notamment des cellules résidentes du derme qui en assurent la cohérence et la souplesse. Elles sécrètent des protéoglycanes et des glycoprotéines. Elles sécrètent notamment du collagène, de l’élastine et des fibrillines dont la fibrilline 1.

La fibrilline 1 est une glycoprotéine qui appartient à une famille de protéines comprenant trois membres, dont leur régulation reste mal connue aujourd’hui. Elle est sécrétée à la fois par les fibroblastes et par les kératinocytes. Elle constitue l’élément majeur des microfibrilles dans les matrices extracellulaires élastiques et non élastiques. La fibrilline 1 participe donc à la formation des fibres et leurs propriétés fonctionnelles et structurales jouent un rôle primordial dans l’élasticité du tissu conjonctif, notamment au niveau de la jonction dermo-épidermique. En effet, elle permet un ancrage des cellules épidermiques aux fibres élastiques du derme.

Au niveau du derme, on observe avec l'âge une diminution d'activité des fibroblastes avec une baisse de leur prolifération, de biosynthèse et d'échanges avec la matrice extracellulaire, ainsi qu'une altération des fibres de soutien tant qualitative que quantitative.

Au niveau de la jonction dermo-épidermique apparaît un aplatissement qui entraîne une diminution de la cohésion entre ces deux zones (derme et épiderme), avec raréfaction des éléments du derme et ainsi que des fibres d'ancrage, ce qui a pour conséquence une baisse des échanges métaboliques et la formation des rides.

La fibrilline 1 est citée, parfois avec l’élastine, comme protéine impliquée dans les processus de fermeté et d’élasticité^’’, agissant dans le mécanisme anti-âge*’^’^*’’^^’^^’^'’, et est notamment utilisée comme biomarqueur de l’accélération du vieillissement par les rayons ultra-viol ets^^’^"^’*^, et/ou pour le traitement de certains processus cicatriciels comme pour les vergetures. L’activation de la synthèse de la fibrilline 1 permettrait ainsi de traiter les peaux vieillies intrinsèquement, dit génétiquement programmé ou chronologique, ou extrinsèquement, notamment dues à un stress oxydatif comme les UV, le tabac ou la pollution et de traiter les cicatrices de la peau.

Ainsi, les fibroblastes et les kératinocytes jouent un rôle primordial dans le processus biologique de la peau notamment par la sécrétion de la fibrilline 1, pour réguler la fermeté, l’élasticité, la cohésion cellulaire et dans le processus de cicatrisation et du vieillissement de la peau.

Au cours du vieillissement cutané, la peau devient sèche. Ainsi, il est très souvent constaté chez les sujets âgés, et notamment de plus de 50 ans, la manifestation d'une xérose ou d’une sécheresse des muqueuses, liée à une moindre sécrétion de sébum, à des modifications hormonales ou à des ralentissements du flux hydrique à travers l’épiderme. La peau est alors le siège de démangeaisons et de tiraillements, deux symptômes caractéristiques d'une peau sèche. Parmi les pathologies acquises se traduisant par une sécheresse de la peau, on peut citer la xérose induite par la photo-chimiothérapie et l’eczéma. Parmi les pathologies acquises provoquant une sécheresse de la bouche, ou xérostomie, on peut citer le syndrome de Sjogren ou la radiothérapie du cou. Enfin, parmi les pathologies impliquant une sécheresse des muqueuses, on peut citer les sécheresses oculaires ou vaginales.

Pour pallier à ces problèmes de sécheresse et vieillissement de la peau, il est communément utilisé des produits par voie topique destinés à restaurer la barrière cutanée. On peut citer les agents humectants, les agents filmogènes, les molécules de type rétinoïde et les agents capables de reconstruire la barrière cutanée comme le squalène par exemple.

Dans la présente invention, un extrait naturel de peau et/ou de pulpe du fruit de Lucuma est avantageusement utilisé dans une composition cosmétique et permet efficacement d’apporter un effet énergisant à la peau. Il est ainsi démontré dans la présente invention qu’un extrait de Lucuma selon l’invention stimule l’activité de la chaîne respiratoire de la mitochondrie et augmente la production d’ATP (adénosine triphosphate) sans pour autant produire des radicaux libres de type ROS (Reactive Oxygen Species) connus pour causer des dommages significatifs aux cellules.

La mitochondrie est vitale à la cellule car elle agit comme une pile et fournit l’énergie pour le fonctionnement des cellules sous forme d’ATP. L’extrait de Lucuma selon l’invention revitalise la mitochondrie et apporte une énergie renouvelée aux cellules en stimulant le taux de consommation d’oxygène et le niveau d’ATP cellulaire.

Il est par ailleurs démontré dans la présente invention que l’extrait de Lucuma selon l’invention permet de; - limiter le vieillissement en augmentant l’expression des protéines principales impliquées dans le phénotype du vieillissement tel que le collagène-1 et Télastine, - limiter le photo vieillissement cutané en aidant à réduire le vieillissement prématuré de la peau induit par les UV (ultra-violet) en agissant sur la fibrilline-1, - limiter Tépivieillissement en réduisant le taux de méthylation de l’ADN.

Dans la présente invention, on entend par : ^ « quantité efficace » la quantité nécessaire d’un extrait de la peau et/ou de la pulpe du fruit de Pouteria lucuma pour obtenir le résultat recherché. “extrait végétal de Lucuma” ou “extrait du fruit de Lucuma” l’extrait de la peau et/ou de la pulpe de Lucuma selon l’invention. Il s’agit de l’extrait global comprenant le solvant. “L’extrait sec” ou “matière sèche” représente une partie de l’extrait végétal. L’extrait séché est l’extrait végétal ayant subi une étape de séchage. « application topique », le fait d’appliquer ou d’étaler le principe actif selon l’invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau, d’une muqueuse ou des phanères. « cosmétiquement acceptable», que l’extrait végétal selon l’invention, ou une composition le contenant, est approprié pour entrer en contact avec la peau ou une muqueuse sans provoquer de réactions de toxicité ou d’intolérance. « milieu physiologiquement acceptable », une solution aqueuse ou hydro alcoolique, une émulsion eau-dans-huile, une émulsion huile-dans-eau, une microémulsion, un gel aqueux, un gel anhydre, un sérum, une dispersion de vésicules, une poudre. Ce milieu physiologiquement acceptable forme ce que l'on appelle classiquement l'excipient de la composition. « vieillissement de la peau», toutes modifications de l’aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d’élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, la décoloration des cheveux ou les taches sur les ongles, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) que l’on nomme photo-vieillissement, toute dégradation de l’ADN par méthylation de ce dernier que l’on nomme épivieillissement. « Effet énergisante à la peau » humaine, un effet ou activité augmentant le métabolisme énergétique cellulaire par stimulation de la chaîne respiratoire de la mitochondrie des cellules et augmentation de la production d’ATP.

La démonstration des activités de l’extrait de Lucuma selon l’invention est donnée : - pour l’activité prévention et/ou lutte contre le vieillissement, ou activité rajeunissante, dans l’exemple 5 avec les cibles collagène I, élastine et fibrilline 1. Les tableaux présentent les résultats obtenus sur ces différentes cibles. La méthylation de l’ADN a été testée également dans l’exemple 5 et les résultats sont donnés dans le tableau. - pour l’effet énergisant, dans l’exemple 6. Sont quantifiées la consommation de dioxygène (02), le niveau d’ATP cellulaire et le potentiel pro-oxydant de l’extrait de Lucuma dans les cellules vivantes. Les résultats sont donnés dans les figures lA, IB, IC et ID. - pour l’activité hydratation cutanée, dans l’exemple 7.

Les exemples 1 à 4 présentent différentes préparations d’un extrait de Lucuma selon l’invention.

Les exemples 8 à 20 sont différentes formes cosmétiques des compositions selon l’invention.

Ainsi, un premier objet selon l’invention concerne l’utilisation, dans une composition cosmétique, d’au moins une quantité efficace d’un extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe, comme principe actif destiné à apporter un effet énergisant à la peau, pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané et pour hydrater la peau.

Dans la présente invention, la peau et la pulpe du fruit de Lucuma peuvent être utilisée seule ou en mélange et peuvent être de constitution fraiche ou sêchêe pour la mise en œuvre du procédé de préparation de l’extrait.

Dans un mode de réalisation préférentiel, l’extrait du fruit de Pouteria lucuma est un extrait obtenu à partir de la pulpe du fruit séchée.

Dans un autre mode de réalisation préférentielle selon l’invention, la quantité efficace est une teneur en extrait végétal allant lO'"^ à 5% en poids, plus préférentiellement de 10" ^ à 3% en poids, et plus préférentiellement encore de 10'^ à 3% en poids par rapport au poids total de la composition.

La quantité efficace d’extrait végétal correspond à la quantité nécessaire pour obtenir le résultat recherché, à savoir, procurer un effet énergisant à la peau, améliorer l’hydratation de l’épiderme et prévenir et/ou à lutter contre les manifestations du vieillissement cutané.

Un second objet selon l’invention est le procédé de préparation d’un extrait végétal constitué de la peau et/ou la pulpe du fruit de Pouteria lucuma comprenant les étapes successives suivantes : (a) dispersion et extraction dans un solvant aqueux et/ou alcoolique et/ou glycérolique et/ou glycolique de peau et/ou de pulpe de fruit de Pouteria lucuma, (b) décantation et/ou centrifugation et/ou filtration clarifiante de l’extrait obtenu suite à l’étape (a) ; (c) microfiltration de l’extrait obtenu à l’étape (b) ; (d) récupération de l’extrait de fruit de Lucuma ; (e) le cas échéant, ultrafiltration et/ou nanofiltration de l’extrait obtenu à l’étape (c) ; puis (f) séchage éventuel de l’extrait obtenu à l’étape (e) avec ou sans support de séchage.

La peau et la pulpe du fruit de Lucuma peuvent être utilisée seule ou en mélange.

Le procédé de préparation de l’extrait est effectué sur la peau et/ou la pulpe fraîche ou séchée du fruit de Lucuma.

Dans un mode de réalisation préférentiel, lors de l’étape (a), on utilise de la poudre de peau et/ou pulpe du fruit de Pouteria lucuma et plus particulièrement la pulpe, dans les proportions suivantes : entre 0,1 et 20% en poids de matière sèche de poudre, et préférentiellement entre 1 et 15%, typiquement entre 5 et 10%, les pourcentages étant exprimés en poids de matière sèche par rapport au poids total mis en œuvre (poudre de pulpe + solvant). L’extraction de l’étape (a) se fait avantageusement sous agitation, classiquement ou avec ultrasons.

Lors de l’étape (a), on utilise avantageusement les solvants seuls ou en mélange tels que l’eau, l’éthanol, le glycérol ou le propanediol, dans une proportion avantageusement comprise entre 10% et 90% de ces solvants dans l’eau et plus avantageusement entre 50 et 80% dans l’eau (les % sont exprimés en poids du solvant par rapport au poids total solvant+eau).

De manière plus avantageuse encore, la poudre de pulpe de fruit séchée sera utilisée. Les fruits mûrs sont désinfectés, pelés et égrainés avant d’être déshydratés à l’air chaud puis broyés ou cryobroyée à l’aide d’un broyeur tel qu’un broyeur à couteaux ou à marteaux. L’extrait de Lucuma est obtenu par extraction solide-liquide de la peau et/ou la pulpe de fruit séchée et broyée de Pouteria lucuma dans un solvant choisi dans le groupe constitué par l’eau, les alcools tels que l’éthanol, le glycérol, les glycols tels que le propanediol, et leurs mélanges tels que des mélanges binaires, dans des proportions comprises entre 0% et 100% d’eau par rapport aux autres solvants.

Dans un mode de réalisation préféré selon l’invention, l’extrait de Lucuma est obtenu par extraction solide-liquide de la pulpe de fruit séchée et broyée de Pouteria lucuma dans un solvant choisi dans le groupe constitué par l’eau, les alcools tels que l’éthanol, le glycérol, les glycols tels que le propanediol, et leurs mélanges tels que des mélanges binaires, plus avantageusement dans des proportions comprises entre 0% et 90% d’eau par rapport aux autres solvants.

De manière particulièrement avantageuse, on utilise des mélanges binaires de solvant du type eau et un solvant choisi parmi l’éthanol, le glycérol ou le propanediol.

Dans un mode de réalisation très préférentiel, le solvant d’extraction est un solvant hydro-alcoolique, tel qu’un mélange eau-éthanol, et/ou hydro-glycérolique, et/ou hydro-glycolique, tel qu’un mélange eau propanediol, avantageusement dans une proportion comprise entre 30 et 90% d’alcool, et/ou de glycérol, et/ou de glycol dans l’eau.

Plus particulièrement, dans le cadre de l’extraction solide-liquide de la pulpe de fruit séchée de Pouteria lucuma, on introduit entre 0,1 et 20% en poids (matière sèche) de partie de plante souhaitée dans le solvant d’extraction, et préférentiellement entre 1 et 15% en poids, typiquement entre 5 et 10% en poids (les % étant exprimés en poids de la matière sèche par rapport au poids total mis en œuvre). En particulier, en présence d’éthanol, on choisit une proportion comprise entre 0 et 100% d’éthanol dans l’eau, préférentiellement entre 10 et 90% d’éthanol, et avantageusement entre 60 et 80% (les % sont exprimés en poids d’éthanol par rapport au poids total eau+éthanol).

En particulier, en présence de glycérol, on choisit une proportion comprise entre 0 et 100% de glycérol dans l’eau, préférentiellement entre 30 et 90% de glycérol, et avantageusement entre 50 et 80% (les % sont exprimés en poids de glycérol par rapport au poids total eau+glycérol).

En particulier, en présence de glycol et plus particulièrement de propanediol, on choisit une proportion comprise entre 0 et 100% de propanediol dans l’eau, préférentiellement entre 10 et 90% de propanediol, et avantageusement entre 50 et 70% (les % sont exprimés en poids de propanediol par rapport au poids total eau+ propanediol).

La température d’extraction est avantageusement comprise entre 4°C et 100°C, et préférentiellement entre 10°C et 80°C, et plus particulièrement entre 20°C et 50°C. Le chauffage peut être assuré par circulation d’un fluide thermique dans une double enveloppe ou par microondes.

La durée d’extraction varie avantageusement de 10 minutes à 4 heures, et préférentiellement de 30 minutes à 3 heures, et plus avantageusement de 1 à 2 heures. L’extraction peut être réalisée avantageusement sous vide, à pression atmosphérique ou sous pression, préférentiellement à pression atmosphérique ou sous pression, et avantageusement à pression atmosphérique. L’extraction s’effectue toujours sous agitation permettant ainsi une dispersion et une homogénéisation du solide dans le liquide, améliorant efficacement la diffusion du soluté dans le solvant. A l’issue de l’extraction, la matière végétale résiduelle et épuisée en composés d’intérêt est avantageusement séparée de la phase liquide, par exemple par décantation, par centrifugation ou par filtration clarifiante. La phase liquide obtenue peut être microfiltrée à l’aide de médias filtrants de porosité adaptée afin d’obtenir une solution limpide et exsangue de particules solides végétales.

Ces premières étapes de séparation liquide-solide peuvent-être suivies d’étapes de purification, par exemple par filtration, ultrafiltration et/ou nanofiltration, permettant de concentrer les composés d’intérêt au dépend d’autres tels que des traces de protéines, des minéraux, ainsi que le solvant ou mélange de solvants. L’extrait obtenu pourra se présenter sous forme liquide mais également sous forme solide après une étape de séchage selon les méthodes connues de l’homme de l’art telles que Γatomisation, la lyophilisation ou la zéodratation par exemple, avec ou sans support de séchage tel que de la maltodextrine.

Un troisième objet selon l’invention est l’extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe fraîche ou séchée, obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon le second objet de l’invention. L’extrait de Lucuma, sous forme liquide ou sèche, selon l’invention comprend principalement pour 100 grammes d’extrait sec les ingrédients suivants :

Glucose : 5-40 g Fructose : 5-40 g Saccharose : 0,5-20 g Maltose : Traces Protéines : 1 g Polyphénols : 1 g

Un quatrième objet selon l’invention est une composition cosmétique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable une quantité efficace de l’extrait du fruit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe fraîche ou séchée, selon l’invention.

Dans un mode de réalisation préférentiel selon l’invention, la quantité efficace dans la composition cosmétique est une teneur en extrait végétal allant lO'"^ à 5 % en poids, plus préférentiellement de 10'^ à 3 % en poids, et plus préférentiellement encore de 10'* à 3 % en poids par rapport au poids total de la composition.

La composition doit donc contenir un milieu cosmétiquement acceptable, c’est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsions multiples, solutions, suspensions, gels, laits, lotions, sticks ou encore de poudres, et adaptées à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, antioxydants, colorants, conservateurs, parfums. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau.

Les compositions cosmétiques selon l’invention comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc. L’INCI Dictionary & Handbook ("International Nomenclature of Cosmetic Ingrédients ISème Ed. 2010) publié par "the Personal Care Products Council, Inc.", Washington, D.C.) décrit une grande variété, sans limitation, d'ingrédients cosmétiques habituellement utilisés dans l'industrie du soin de la peau, qui conviennent pour être utilisés comme ingrédients additionnels dans les compositions selon la présente invention.

Des exemples non limitatifs de ces classes d'ingrédients additionnels incluent : les agents cicatrisants, les agents anti-âge, les agents anti-rides, les agents anti-atrophie, les agents hydratants, les agents adoucissants, les agents antibactériens, les agents antiparasitaires, les agents antifongiques, les agents fongicides, les agents fongistatiques, les agents bactéricides, les agents bactériostatiques, les agents antimicrobiens, les agents anti-inflammatoires, les agents anti-prurigineux, les agents anesthésiques, les agents antiviraux, les agents kératolytiques, les agents anti-radicaux libres, les agents anti-séborrhéiques, les agents anti-pelliculaires, les agents modulant la différenciation, la prolifération ou la pigmentation cutanée, les agents accélérateurs de pénétration, les agents desquamants, les agents stimulant ou inhibant la synthèse de mélanine, les agents blanchissants, dépigmentants, ou éclaircissants, les agents propigmentants, les agents auto bronzants, les agents inhibant la NO-synthase, les agents antioxydants, les agents piégeurs de radicaux libres et/ou anti-pollution atmosphérique, les agents anti-glycation, les agents raffermissants, les agents stimulant la synthèse des macromolécules dermiques ou épidermiques et/ou les agents capables de prévenir ou inhiber leur dégradation, les agents stimulant la synthèse de collagène, les agents stimulant la synthèse d'élastine, les agents stimulant la synthèse de décorine, les agents stimulant la synthèse de laminine, les agents stimulant la synthèse de défensine, les agents stimulant la synthèse de chaperon, les agents stimulant la synthèse de d'aquaporine, les agents stimulant la synthèse d'acide hyaluronique, les agents stimulant la synthèse de lipides et de composants du stratum corneum (céramides, acides gras, ...), les agents inhibant la dégradation du collagène, les agents inhibant la dégradation de l'élastine, les agents stimulant la prolifération des fibroblastes, les agents stimulant la prolifération des kératinocytes, les agents stimulant la prolifération des adipocytes, les agents stimulant la prolifération des mélanocytes, les agents stimulant la différenciation des kératinocytes, les agents stimulant la différenciation des adipocytes, les agents inhibant l'acétylcholinestérase, les agents stimulant la synthèse des glycosaminoglycanes, les agents réparant l'ADN, les agents protégeant l'ADN, les agents anti-démangeaison, les agents pour le traitement et/ou le soin de la peau sensible, les agents raffermissants, les agents anti-vergetures, les agents astringents, les agents régulant la production du sébum, les agents dermo-relaxants, les agents adjuvants de guérison, les agents stimulant la réépithélialisation, les agents adjuvants de réépithélialisation, les facteurs de croissance de cytokine, les agents calmants, les agents anti-inflammatoires, les agents agissant sur la circulation et/ ou microcirculation capillaire, les agents stimulant l'angiogénése, les agents inhibant la perméabilité vasculaire, les agents agissant sur le métabolisme cellulaire, les agents destinés à améliorer la jonction dermo-épidermique, les agents induisant la pousse des cheveux et/ou des poils, les agents inhibant ou ralentissant la pousse des cheveux et/ou des poils, les agents myorelaxants, les agents anti-pollution et/ou anti-radical ai res, les agents stimulant la lipolyse, les agents amincissants, les agents anti-cellulite, les agents agissant sur la microcirculation, les agents agissant sur le métabolisme des cellules, les agents nettoyants, les agents de coiffage du cheveu, les stimulants de la pousse des cheveux, les écrans solaires, les écrans totaux, les agents de maquillage, les détergents, les produits pharmaceutiques, les agents émulsifiants, les émollients, les solvants organiques, les agents antiseptiques, les actifs déodorants, les milieux physiologiquement acceptables, les surfactants, les agents abrasifs, les absorbants, les composants esthétiques comme les parfums, les pigments, les teintures, colorants et colorants naturels, les huiles essentielles, les agents de toucher, les astringents cosmétiques, les agents anti-acné, les agents anti-coagulation, les agents anti-mousse, les antioxydants, les liguants, les additifs biologiques, les enzymes, les inhibiteurs enzymatiques, les inducteurs enzymatiques, les coenzymes, les agents chélatants, les extraits végétaux et dérivés de plantes, les huiles essentielles, les extraits marins, les agents venant d'un procédé de biofermentation et/ou de biotechnologie, les sels minéraux, les extraits cellulaires, les écrans solaires (les agents photoprotecteurs organiques ou minéraux qui sont actifs contre les rayons ultraviolets A et/ou B) les céramides, les peptides, les tampons, les agents de volume, les agents chélatants, les additifs chimiques, les colorants, les biocides cosmétiques, les dénaturants, les astringents médicinaux, les analgésiques externes, les agents filmogénes, comme les polymères, pour exacerber les propriétés filmogénes et la substantivité de la composition, les dérivés quaternaires, les agents augmentant la substantivité, les agents opacifiants, les ajusteurs et régulateurs de pH (ex. triethanolamine), les propellants, les agents réducteurs, les séquestrants, les agents décolorants et/ou éclaircissants de la peau, les agents conditionnant de la peau (i.e., humectants, incluant miscellanées et occlusifs), les substances retenant l'humidité, les alpha hydroxy acides, les béta hydroxy acides, les hydratants, les enzymes hydrolytiques épidermiques, les agents apaisants et/ou cicatrisants, les agents traitant la peau, les agents anti-rides, les agents capables de réduire ou traiter les poches sous les yeux, les agents exfoliants, les épaississants, les adoucissants, les polymères gélifiants, les vitamines et leurs dérivés, les agents mouillants, les agents pelants, les agents calmants, les agents curatifs de la peau, les lignanes, les conservateurs (i.e.phenoxyethanol et parabens), les anti-UV, les agents cytotoxiques, anti néoplasiques, agents modifiant la viscosité, les solvants non volatils, des agents perlants, les agents antitranspirants, les dépilatoires, vaccins, eau parfumée, agent restructurant la peau, les excipients, les charges, les minerais, les agents anti-mycobactériens, les agents anti-allergéniques, les antihistaminiques H1 ou H2, les anti-irritants, les agents stimulant le système immunitaire, les agents inhibant le système immunitaire, les agents répulsifs d'insectes, les lubrifiants, les pigmentants ou colorants, les agents hypopigmentants, les agents photo-stabilisants, et leurs mélanges, tant qu'ils sont physiquement et chimiquement compatibles avec les autres ingrédients de la composition et spécialement avec les actifs de la présente invention.

Par ailleurs, la nature de ces ingrédients additionnels ne doit pas altérer de manière inacceptable les bénéfices des actifs de l'invention. Ces ingrédients additionnels peuvent être synthétiques ou naturels comme par exemple les extraits de plantes ou venir d'un procédé de biofermentation. Des exemples additionnels peuvent être trouvés dans l’ESiCI Dictionary & Handbook

De tels ingrédients additionnels peuvent être choisis dans le groupe comprenant : les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl- glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acétyl galactosamine, vitamine B3 et ses dérivés, le niacinamide, déhydro-acétate de sodium, l'acide déhydroacétique et ses sels, phytosterols, composés d'acide salicylique, hexamidines, composés dihydroxyproline de dialkanoyl, extraits et dérivés de soja, equol, isoflavones, flavonoïdes, phytantriol, famesol, géraniol, bisabolol, peptides et leurs dérivés, di -, tri -, tétra -, penta -, et hexapeptides et leurs dérivés, lys-thr-thr-lys-ser, palmitoyl-lys-thr-thr-lys-ser, camosine, composés d'acide aminé N-acyl, rétinoïdes, propionate de rétinyl, rétinol, palmitate de rétinyl, acétate de rétinyl, rétinal, acide rétinoïque, vitamines hydrosolubles, ascorbates, vitamine C, glucoside ascorbyl, palmitate ascorbyl, magnésium ascorbyl phosphate, sodium ascorbyl phosphate, vitamines et leurs sels et dérivés, provitamines et leurs sels et dérivés, ethyl panthenol, vitamine B et ses dérivés, vitamine Bl, vitamine B2, vitamine B6, vitamine B12, vitamine K et ses dérivés, acide pantothénique et ses dérivés, éther éthylique de pantothenyl, panthenol et ses dérivés, panthenol ethylique, dexpanthenol, biotine, acides aminés et leurs sels et les dérivés, acides aminés hydrosolubles, asparagine, alanine, indol, acide glutamique, vitamines insolubles dans l'eau, vitamine A, vitamine E, vitamine F , vitamine D et ses composés, mono-, di -, et triterpénoïdes, bêta-ionol, cedrol, et leurs dérivés, acides aminés insolubles dans l'eau, tyrosine, tryptamine, matériaux particulaires, hydroxytoluène butylé, hydroxyanisole butylé, allantoine, nicotinate de tocophérol, tocophérol, esters de tocophérol, palmitoyl-gly-his-lys, phytostérol, hydroxy acides, acide glycolique, acide lactique, acide lactobionique, kétoacides, acide pyruvique, acide phytique. acide lysophosphatidique, stilbenes, cinnamates, resveratrol, kinétine, zeatin, dimethylaminoethanol, peptides naturels, les peptides de soja, sels de sucres acides, gluconate de manganèse, gluconate de zinc, olamine de piroctone, 3,4,4'- trichlorocarbanilide, triclocarban, pyrithione de zinc, hydroquinone, acide kojique, acide ascorbique, magnésium ascorbyl phosphate, ascorbyl glucoside, pyridoxine, l'aloe vera, les alcools de terpène, allantoine, bisabolol, glycyrrhizinate dipotassique, acide de glycérol, de sorbitol, de pentaerythritol, de pyrrolidone et ses sels, dihydroxyacetone, erythrulose, glycéraldéhyde, tartaraldehyde, l'essence de clou de girofle, le menthol, le camphre, l'essence d'eucalyptus, eugénol, le lactate de menthyle, le distillât d'hamamélis, copolymére d'eicosene et vinyl pyrrolidone, iodopropyl butylcarbamate, un polysaccharide, un acide gras essentiel, un salicylate, un acide glycyrrhétinique, des caroténoïdes, des céramides et des pseudo-céramides, un lipide complexe, les huiles en générale d'origine naturelle telles le beurre de karité, l'huile d'abricot, l'huile d'onagre, l'huile de pruneau, l'huile de palme, l'huile de monoi, l’huile de kahai, hydroquinone, l'HEPES, la procystéine, l'O-octanoyl-6-D-maltose, le sel disodique d'acide méthyl glycine diacétique, les stéroïdes tels que la diosgénine et les dérivés de la DHEA, la DHEA déhydroépiandrostérone et/ou un précurseur ou dérivé chimique ou biologique, le N-éthylcarbonyl-4-para-aminophénol, les extraits de myrtille, les phytohormones, les extraits de levure Saccharomyces cerevisiae, les extraits d'algues, les extraits de soja, de lupin, de maïs et/ou de pois, l'alvérine et ses sels, en particulier le citrate d'alvérine, les extraits de petits houx et de marron d'inde et leurs combinaisons, un inhibiteur de métalloprotéinases, les extraits de Schinus molle.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition cosmétique selon l’invention.

Un dernier objet selon l’invention est un procédé de traitement cosmétique destiné à procurer une effet énergisant, à prévenir et/ou lutter contre la sécheresse de la peau et des muqueuses, à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photovieillissement, par application topique sur la peau et les muqueuses à traiter d’une composition cosmétique telle que décrite précédemment. D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif Dans les exemples qui suivent et les figures associées, l’abréviation « Elu » signifie « extrait de Lucuma ».

Exemple 1 ; Préparation d’un extrait vé2étal aqueux à partir de poudre de pulpe du fruit Pouteria lucuma

La poudre de pulpe de fruit de Pouteria lucuma (200 g) est placée dans un réacteur en verre, muni d’une agitation et d’un chauffage par double enveloppe en présence d’un fluide caloporteur.

Le solvant utilisé pour la macération est de l’eau déminéralisée (1800 g).

La poudre de pulpe de Lucuma est dispersée dans le solvant pendant 2 heures à 30°C puis le mélange est centrifugé et le surnageant est filtré. L’extrait aqueux ainsi obtenu peut être utilisé tel quel ou évaporé au rotavapor afin d’éliminer la majeure partie du solvant, puis lyophilisé en présence de maltodextrine (50%) afin d’obtenir un solide qui sera ensuite broyé et tamisé.

Il est ainsi obtenu 150 g d’extrait de pulpe de lucuma en poudre. Les teneurs massiques respectives en chaque sucre sont de 8,3 g/100 g de fructose, 11,0 g/100 g de glucose et 3,5 g/100 g de saccharose.

Exemple 2 : Préparation d’un extrait vé2étal hvdro-alcoolique à partir de poudre de pulpe du fruit Pouteria lucuma

Le solvant utilisé pour la macération est un mélange eau (30%) / éthanol (70%) (1800 g).

La poudre de pulpe de Lucuma est dispersée dans le solvant pendant 2 heures à 55°C puis le mélange est filtré sur Büchner afin d’éliminer le culot. Le filtrat est récupéré. L’extrait hydro alcoolique ainsi obtenu est évaporé au rotavapor afin d’éliminer le solvant.

Il est ainsi obtenu 48 g d’extrait de pulpe de lucuma en poudre.

Les teneurs massiques respectives en chaque sucre sont de 31,0 g/IOO g de fructose, 23,2 g/IOO g de glucose et 26,5 g/IOOg de saccharose.

Exemple 3 : Préparation d’un extrait végétal alcoolique à partir de poudre de peau du fruit Pouteria lucuma

La poudre de peau de fruit de Pouteria lucuma (100 g) est introduite dans une cartouche en cellulose. La cartouche est placée dans un extracteur de type Soxhlet.

Le solvant utilisé pour l’extraction est de l’éthanol 96%, placé dans un ballon en verre (900 ml). La cartouche subit une vingtaine de cycles d’extraction au solvant. L’extrait alcoolique ainsi obtenu est évaporé au rotavapor afin d’éliminer le solvant.

Il est ainsi obtenu 20 g d’extrait de peau du fruit en poudre de lucuma contenant 69% de sucres totaux.

Les teneurs massiques respectives en chaque sucre sont de 23,5 g/100 g de fructose, 21,6 g/100 g de glucose et 1,3 g/100 g de saccharose.

Exemple 4 : Préparation d’un extrait vé2étal hydro-glvcoliaue à partir de poudre de pulpe du fruit Pouteria lucuma

Le solvant utilisé (1800 g) pour la macération est un mélange de 60% de 1,3-propanediol et 40% d’eau déminéralisée.

La poudre de pulpe de Lucuma est dispersée dans le solvant pendant 2 heures à 30°C puis le mélange est séparé sur décanteur centrifuge afin d’éliminer le culot et le surnageant est récupéré puis filtré. L’extrait en milieu solvant ainsi obtenu, soit 1540 g, contient 3,73% d’extrait sec. Les teneurs massiques respectives en chaque sucre sont de 1,1g de fructose, 1,1 g de glucose et 0,5 g de saccharose pour 100 grammes d’extrait végétal liquide.

Exemple 5 : Tests démontrant l’activité anti-â2e et rajeunissante de l’extrait de Lucuma

Le derme fournit à l’épiderme un support solide, c’est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d’une matrice extracellulaire composée majoritairement de collagènes, d’élastine et d’une substance, dite substance fondamentale. Ces composants sont synthétisés par les fibroblastes. La cohésion entre l’épiderme et le derme est assurée par la jonction dermo-épidermique.

Les collagènes sont les protéines majoritaires des matrices extracellulaires de la peau. A ce jour, 20 types de collagènes sont identifiés et notés de I à XX. Les collagènes majoritairement présents dans l’ensemble du derme sont les collagènes de type I et III qui forment la matrice extracellulaire de l’ensemble du derme (ce sont ces collagènes qui constituent 70-80 % du poids sec du derme). Avec le vieillissement, le derme s’aminçit et des rides apparaissent à la surface de la peau. En conséquence, compte tenu du rôle important du collagène au niveau de l’intégrité de la peau et de sa résistance aux agressions externes de type mécaniques, la stimulation de la synthèse de ces collagènes, et notamment du collagène de type I, apparaît comme un moyen efficace pour pallier les signes du vieillissement cutané (revue par Tzaphlidou M., Micron 35 (2004) 173-177). L’étude qui suit a permis d’étudier l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression du collagène I, de l’Elastine et de la Fibrilline 1, constituants essentiels de la matrice extracellulaire du derme, afin d’évaluer son activité anti-vieillissante et anti-photo-vieillissante ainsi que rajeunissante. Cette dernière activité a également été évaluée en étudiant l’effet de l’extrait de Lucuma sur la méthylation de l’ADN, cible de l’épigénétique.

Au cours du vieillissement les fibres de collagène et les fibres élastiques sont altérées du fait d’une synthèse réduite et d’une dégradation accrue, ayant pour conséquence une qualité de peau amoindrie, moins tonique et en perte d’élasticité.

Pour permettre de démontrer le rajeunissement cellulaire nous avons quantifié l’expression des protéines impliquées dans la structure de ces fibres au sein de cellules vieillies de manière intrinsèque (senescence réplicative) dans le cas du Collagène I et de l’Elastine, ou extrinsèque par irradiations UV répétées (photo vieillissement) dans le cas de la Fibrilline 1.

Afin de comprendre le mécanisme de réactivation de l’expression des protéines observée, nous avons procédé à une analyse de la méthylation de l’ADN sur cellules vieillies de manière intrinsèque. En effet l’une des signatures de la sénescence cellulaire est l’accumulation de zones méthylées au sein de l’ADN, au niveau des Cytosines contenues dans les dinucléotides CpG. Ceci entraine l’inactivation de promoteurs et la diminution de l’expression de certains gènes. • Evaluation préalable de la cytotoxicité

La cytotoxicité des molécules a été évaluée sur les NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts). L’extrait de Lucuma utilisé dans ce test est celui obtenu de l’exemple 1 décrit précédemment.

La cytotoxicité a été réalisée sur la concentration maximale testée soluble en solution aqueuse à 0.1% DMSO ainsi qu’à 7 dilutions de % log en % log.

Le composé a été mis en contact avec les cellules pendant 24 heures. Durant les 3 dernières heures un test colorimétrique prêt à l’emploi (WSTl de Roche®) a été introduit dans le milieu.

Ce réactif contient des sels de tétrazolium, un indicateur violet. Ce réactif est clivé en formazan, un indicateur jaune, par les cellules métaboliquement actives. Le niveau de coloration jaune est donc proportionnel au nombre de cellules vivantes. La mesure de l’absorbance se fait à 450nm. Le test considère qu'une valeur inférieure à 90% du témoin indique une cytotoxicité du produit éventuelle. Cela peut aussi indiquer que l'on diminue l'activité métabolique des cellules. Une valeur inférieure à 75% indique une cytotoxicité significative .

Par ailleurs les cellules ont été observées au microscope pour observer et comparer leur physionomie. L’extrait de Lucuma présente une cytotoxicité à 10000 ppm (75% de cellules vivantes) et devient non cytotoxique à partir de 2000 ppm (100% de cellules vivantes)

Concentrations retenues pour être testées : L’Extrait de Lucuma est testé aux concentrations suivantes 500 - 250 - 125 ppm, correspondant respectivement à 0.05, 0.025 et 0.0125 %.

- Cibles Collagène I

Le Collagène I est le Collagène majoritaire qui apporte à la peau sa résistance mécanique.

Cette protéine représente 90% du collagène d’un vertébré. H constitue la trame de l’os (à comparer aux armatures du béton armé), et plus généralement des tissus conjonctifs banals. Il se trouve dans les os, la peau, les tendons, la cornée et les organes internes. • Méthode d’évaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression du

Collagène I

Les NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts) jeunes ou vieillis par sénescence réplicative ont été ensemencés en plaque 96 puits et incubées 24h à 37°C, 5%C02.

Les cellules ont été traitées 24h en présence des produits d’essai.

Les cellules ont ensuite été fixées avec de la formaline et l’expression des protéines a été détectée par immunofluorescence.

Les marquages fluorescents ont été imagés et quantifiés par microscopie automatisée (Arrayscan CellomicsTM). La fluorescence a été quantifiée par la bioapplication Compartimentai Analysis.

• Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression du Collagène I

Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous

L’extrait de Lucuma permet de réactiver l’expression de Collagène I par rapport aux cellules vieillies. • Conclusion L’extrait de Lucuma, est un ingrédient qui agit sur le collagène I, cible du vieillissement cutané, en relançant l’expression protéique par rapport à des cellules vieillies non traitées et en la rétablissant partiellement en comparaison aux témoins jeunes. - Cible Elastine L’élastine est une glycoprotéine structurale (comme la laminine et la fibronectine) entrant dans la composition de la MEC. L'élastine est une protéine de la famille des protéines fibreuses de type structural. Sécrétée par les fibroblastes essentiellement durant la période de croissance, elle possède des propriétés élastiques. Sa synthèse diminue avec l'âge et l'élastine se trouve remplacée par du collagène inextensible. Les vergetures sont un exemple visible de ce processus, qui est lié à des contraintes mécaniques. Le vieillissement cutané en est un deuxième exemple. Dans la matrice extracellulare l'élastine est synthétisée et sécrétée dans l’espace extracellulaire par les fibroblastes d'abord en proélastine, puis en tropoélastine. L’élastine est la composante majeure (jusqu’à 90 %) des fibres élastiques auxquelles s’ajoute la fibrilline. Donc, le collagène, associé à l’élastine et la fibrilline qui forment les fibres élastiques, par des liaisons transversales covalentes, sont les principaux constituants de la matrice extracellulaire. La production totale d’élastine s’arrête autour de la puberté. Après quoi, la quantité d'élastine disponible diminuera avec le temps.

La dégradation de l’élastine est liée à l’action de l’élastase, une enzyme sécrétée par les fibroblastes. L’action enzymatique de l’élastase est inhibée par l’al-antitrypsine. L'inhibition de la dégradation crée un équilibre augmentant la stabilité de l'élastine.

Des traits distinctifs caractérisent l’élastine : l'élastine permet aux cellules de se lier et permet aux tissus biologiques de se former. Ainsi, le bon fonctionnement de la peau, des poumons, des vaisseaux sanguins, des tissus conjonctifs, de certains tendons et cartilages est étroitement lié aux caractéristiques de l’élastine. Comme son nom l’indique, l’élastine est élastique. À diamètre égal, elle est 5 fois plus élastique qu'un élastique. Elle peut s’étirer jusqu’à 150% de sa longueur au repos avant de se briser. Ainsi, elle permet aux tissus de s’étirer et de retrouver leur état initial après l’étirement, ce qui leur donne de la souplesse. L’élastine se retrouve dans le derme de la peau, celui-ci agissant en tant que soutien. Au cours du vieillissement, par exemple, la perte d’élasticité et de tonicité du derme qui ne peut plus s’opposer aux effets de contraction des muscles sous-jacents donne lieu à l’apparition des rides. Par ailleurs, l’exposition aux ultraviolets augmente la dégradation de l’élastine. • Méthode d’évaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression de l’Elastine

Les cellules ont été traitées 24h en présence des produits d’essai.

Les marquages fluorescents ont été imagés et quantifiés par microscopie automatisée (Arrayscan CellomicsTM). La fluorescence a été quantifiée par la bioapplication Compartimentai Analysis. • Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression de l’Elastine Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous :

L’extrait de Lucuma permet de réactiver l’expression de l’Elastine par rapport aux cellules vieillies. • Conclusion L’extrait de Lucuma, est un ingrédient qui agit sur l’Elastine, cible du vieillissement cutané, en relançant l’expression protéique par rapport à des cellules vieillies non traitées et en la rétablissant partiellement en comparaison aux témoins jeunes. - Cible Fibrilline 1

La Fibrilline 1 est une protéine qui constitue les microfibrilles, lesquelles sont associées aux fibres élastiques et participent à leur assemblage. • Méthode d’évaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression de la Fibrilline 1

Les NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts) jeunes ou vieillis extrinsèquement par irradiations ont été ensemencés en plaque 96 puits et incubées 24h à 37°C, 5%C02.

Les cellules destinées au vieillissement extrinsèque ont été irradiées 3 fois aux UVA avec 24h entre chaque irradiation ou aux 2 fois aux UVB avec 48h entre chaque irradiation.

Les cellules ont été traitées 24h en présence des produits d’essai.

Les marquages fluorescents ont été imagés et quantifiés par microscopie automatisée (Arrayscan CellomicsTM). La fluorescence a été quantifiée par la bioapplication Compartimentai Analysis. ♦ Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression de la fibrilline 1

Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous :

L’extrait de Lucuma permet de réactiver l’expression de la Fibrilline 1 par rapport aux cellules vieillies. • Conclusion L’extrait de Lucuma, est un ingrédient qui agit sur la Fibrilline 1, cible du vieillissement cutané, en relançant l’expression protéique par rapport à des cellules vieillies non traitées et en la rétablissant partiellement en comparaison aux témoins jeunes.

- Cible Méthylation de l’ADN

La méthylation est une modification des extrémités N-terminales des histones. Elle peut s’effectuer soit sur des lysines soit sur des arginines et peut se concrétiser par l'ajout d'un, de deux ou de trois groupements méthyles. Selon les résidus méthylés et le nombre de groupements ajoutés elle est associée à une activation ou une répression de la transcription. Longtemps considérée comme statique, la méthylation des histones s'avère être une modification réversible impliquée dans un processus dynamique, bien que plus stable que l'acétylation et la phosphorylation. Un nombre croissant d'histones déméthylases sont identifiés. De manière générale, ce type de modifications est antagoniste à l’acétylation, et la désacétylation des lysines doit précéder leur méthylation. Cet antagonisme entraîne la mise en place d'un certain équilibre dynamique entre les territoires hétérochromatiniens (généralement non exprimables et méthylés sur certains acides aminés clés) et euchromatiniens (généralement exprimables et acétylés). Par exemple, la Lysine 9 de l'histone H3 est connue pour être associée à une répression de la chromatine environnante lorsqu'elle est méthylée. Cette méthylation est reconnue par une protéine, HPl, qui se fixe donc sur H3 méthylée. A son tour, HPl attire la protéine Suv39, une Histone MethylTransférase, qui pourra méthyler la lysine 9 de l'histone H3 du nucléosome voisin, et ainsi de suite. On voit donc, comment, de proche en proche, les histones H3 seront méthylées et la chromatine sera condensée. Cependant, cette invasion hétérochromatinienne sera stoppée si la lysine 9 de H3 rencontrée est déjà acétylée. Ainsi se met en place un équilibre compétitif entre domaines chromatiniens exprimés et réprimés. Les modifications des queues d'histones jouent le rôle de « marques » épigénétiques qui entraînent le recrutement de différentes classes de protéines, puisque les lysines acétylées ou méthylées sont reconnues par des domaines protéiques différents. De plus, le recrutement de certains facteurs au niveau de la chromatine nécessite l’existence préalable de modifications d’histones et de protéines déjà liées. Le code des histones est donc interprété dans le contexte d’autres facteurs associés à la chromatine et c’est la combinaison d’interaction entre les histones modifiées et d’autres facteurs qui détermine si une protéine est recrutée à la chromatine. Tous les tissus des organismes sont affectés par le vieillissement. Ce processus est lié aux modifications épigénétiques telles que les changements de méthylation au niveau de résidus cytosine spécifiques de l’ADN, tel que décrit dans de nombreuses publications^'^'^\ Le rôle des modifications épigénétiques sur le vieillissement, l’accumulation de divisions cellulaires et de macromolécules détériorées contribuent à un phénotype âgé. Les évènements environnementaux et aléatoires peuvent de plus modifier ce phénotype par l’intermédiaire de mécanismes épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN et la méthylation et l’acétylation des histones. La potentielle réversibilité des modifications épigénétiques fait d’eux des cibles attractives pour le traitement des pathologies liées au vieillissement.

• Méthode d’évaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur la méthylation de l’ADN

Les cellules ont été traitées 24h en présence des produits d’essai.

Les cellules ont ensuite été décollées en présence de trypsine et lysées. L’ADN génomique a été précipité à l’Ethanol.

Le taux de méthylation de l’ADN a été dosé par ELISA en utilisant le kit Enzo : 5-Methylcytosine DNA ELISA kit. Les valeurs sont représentées à partir de 50% pour une meilleure visibilité des résultats. • Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur la méthylation de l’ADN Les résultats sont donnés dans le tableau ci-dessous :

L’extrait de Lucuma permet de ramener le taux de méthylation dans les NHDF vieillis par réplication à hauteur de celui observé dans les cellules jeunes à 500 et 125ppm. • Conclusion L’extrait de Lucuma, est un ingrédient qui agit sur la diminution du taux de méthylation de l’ADN, cible de l’épivieillissement, et possède donc une activité rajeunissante. - Conclusion générale sur l’activité anti-âge et rajeunissante Au cours du vieillissement les fibres de collagène et les fibres élastiques sont altérées du fait d’une synthèse réduite et d’une dégradation accrue. Pour démontrer que l’extrait de Lucuma agit sur le rajeunissement cellulaire, ont été quantifiées dans les exemples précédents l’expression des protéines impliquées dans la structure de ces fibres au sein de cellules vieillies de manière intrinsèque (senescence réplicative) dans le cas du Collagène I et de l’Elastine, ou extrinsèque par irradiations UV répétées (photo vieillissement) dans le cas de la Fibrilline 1.

Les résultats obtenus démontrent que l’extrait de Lucuma permet de relancer l’expression des 3 marqueurs.

Dans le cadre de l’analyse de la méthylation de l’ADN, l’extrait de Lucuma présente des résultats homogènes dans cette expérience, il diminue la méthylation aux 3 concentrations testées. Cet effet donne une information sur le mode d’action de l’extrait permettant de réactiver l’expression de protéines de la matrice extracellulaire, lui conférant son effet rajeunissant. L’extrait de Lucuma est par conséquent un principe actif présentant une activité biologique anti-âge, antivieillissement et rajeunissant. H agit de manière cohérente sur 3 cibles du vieillissement cutané en relançant l’expression protéique par rapport à celle observée dans les cellules vieillies. Il présente également une activité novatrice sur l’épigénétique comme le démontre son action sur la méthylation de l’ADN au sein de cellules matures. Enfin, il démontre une action anti-âge en profondeur par son efficacité sur la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire.

Exemple 6 ; Evaluation de l’activité éner2isante de l’extrait de Lucuma

La présente étude a permis d’étudier l’effet de l’extrait de Lucuma à différentes concentrations, sur la balance bioénergétique mitochondriale de fibroblastes primaires humains normaux (NHDF). L’extrait de Lucuma utilisé dans l’évaluation décrite ici est celui de l’exemple 2 décrit précédemment.

La récente compréhension que la dépréciation des mitochondries est centrale pour décrire le processus du vieillissement*’ *^ *^ a suscité un intérêt considérable dans une nouvelle approche anti-vieillissement qui implique le développement de nouvelles molécules cibles impliquées dans le dysfonctionnement des mitochondries. Dans ce but l’étude menée ici génère des outils permettant l’évaluation des ingrédients actifs présents dans l’extrait de Lucuma démontrant un impact sur l'amélioration des processus mitochondriaux impliqués dans le vieillissement de la peau.

Plusieurs analyses peuvent être effectuées de manière isolée ou en combinaison pour déterminer la viabilité cellulaire : suivi de la production d'oxygène de l'espèce, la production d'ATP, la consommation d'oxygène, la peroxydation des lipides, ainsi que l'épuisement de l’ADN mitochondrial (ADNmt). riD ri 1 ri ri

Le stress oxydatif généré par des facteurs environnementaux comme les UV ’ ’ et la pollution ’ ’ ’ est une cause fondamentale du déclin progressif des fonctions de tissus associé à l'âge ’ ’ , notamment une diminution progressive de l'énergie cellulaire et du métabolisme.

Par conséquent, il est intéressant d'évaluer in vitro la capacité d’ingrédients actifs à revitaliser le métabolisme cellulaire et notamment le renouvellement de la peau, par le biais de la stimulation de la respiration cellulaire, devenue ainsi une clé dans le développement de cosmétiques nouvelle génération.

Dans cet exemple sont quantifiées la consommation de dioxygène (02), le niveau d’ATP cellulaire et le potentiel pro-oxydant de l’extrait de Lucuma dans les cellules vivantes. • Evaluation préalable de la cytotoxicité

La cytotoxicité des molécules a été évaluée sur des NHDF en monocouche, pré-incubés pendant 24h avec soit du solvant DMSO à 0.5%, soit avec l’extrait de Lucuma à 5 concentrations différentes (0.1, 0.5, 1.5 et 10%).

La viabilité cellulaire a ensuite été mesurée par absorbance à 540 nm en utilisant le réactif MTT. Les résultats obtenus sont donnés dans la figure 1 A. L’extrait de Lucuma présente une cytotoxicité totale à 10%, moyenne à 5% et devient non cytotoxique à 0.1, 0.5 et 1%.

Concentrations retenues pour être testées :

Pour la suite de l’étude l’Extrait de Lucuma est testé aux concentrations suivantes : 0.05 - 0.25 -0.5 %. - Cible Mitochondrie

Une mitochondrie est un organite cellulaire dont le rôle physiologique est primordial. Elle est considérée comme la « centrale énergétique » de la cellule, car c'est là que se déroulent les dernières étapes du cycle respiratoire qui convertit l'énergie des molécules organiques issues de la digestion (glucose) en énergie directement utilisable par la cellule (ΓΑΤΡ). En cas d'absence d'oxygéne la cellule utilise la fermentation dans le cytoplasme pour produire l'énergie nécessaire à son fonctionnement, mais c'est un système bien moins efficace, qui dégrade le substrat de façon incomplète. L'augmentation de la concentration en ions dans les cellules musculaires est une des raisons de la fatigue après une activité intense. En effet, ces ions changent le pH intracellulaire et modifient de fait les conditions de fonctionnement enzymatiques de la cellule qui ne peut plus travailler correctement. • Description de l’étude Mitosafe® Bioenergetic Balance Screen (BBS)

La technologie Mitosafe® utilisée dans cette étude offre une alternative aux tests biochimiques actuels pour analyser et cribler des ingrédients naturels en fonction de leurs performances à l'égard cellulaire et / ou cibles mitochondriales.

Ces dosages génèrent des résultats décrivant l'équilibre énergétique mitochondrial, l'état redox et mitochondrial en réponse à la biogenèse des composés actifs. Ds permettent d’identifier et de détecter les dysfonctionnements mitochondriaux mais aussi d'apporter rapidement des informations pertinentes sur le potentiel des composés à protéger les mitochondries des agressions et des dysfonctionnements. L’extrait de Lucuma est dilué aux concentrations de 0.05, 0.25 et 0.5% (v/v) en présence de 0.5% de DMSO et 4 essais de chaque concentration sont testés.

En parallèle sont testés aussi des composés de référence, permettant de vérifier le bon fonctionnement de l’étude (contrôles positif et négatif et référence Coenzyme QIO). L'analyse Mitosecure BBS a été réalisée selon les procédures opératoires standard ME-MO-29 ("BBS Fibroblastes"). Elle consiste en la quantification multiple de la consommation de dioxygène et le niveau d'ATP cellulaire en ce qui concerne la viabilité cellulaire.

Après lavage, les cellules sont incubées avec chaque concentration d'éléments de test pendant 120 minutes au cours de l'essai, tandis que leur consommation de dioxygène dynamique est mesurée en utilisant une sonde fluorescente. Le signal fluorescent est enregistré en utilisant un lecteur de microplaques (Varioskan -Thermo). Les cellules sont maintenues à 37 ° C au cours de la boucle cinétique. Après la mesure de la consommation de dioxygène, la viabilité cellulaire est mesurée en utilisant un colorant fluorescent pénétrant. La troisième étape consiste à mesurer le niveau de ΓΑΤΡ cellulaire en chimiluminescence. Le contrôle négatif est Tessai qui consiste à traiter les cultures avec le véhicule seul (DMSO 0,5%). Les traitements avec la roténone et le FCCP (p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) constituent les témoins positifs sont utilisés comme une validation de l'expérience. Tous les éléments d'essai sont testés en quatre exemplaires. L’effet de l'extrait de Lucuma a été comparé à la fois au témoin négatif et à celui du composé de référence d'excitation.

Les données sont traitées au préalable pour exprimer le potentiel cytotoxique pour chaque ingrédient actif. Les effets des ingrédients actifs sont exprimés comme un rapport par rapport au témoin négatif.

Les données sont ensuite traitées pour exprimer la consommation d'02 par cellule, le niveau ATP cellulaire par cellule et le niveau de lactate extracellulaire par cellule pour chaque condition expérimentale.

Selon les procédures opératoires standard, tous les critères de validation sont remplis. Les expériences sont considérées comme validées. L'analyse du test de Student a été réalisée pour déterminer le niveau d'importance de l'amplitude des variations enregistrées dans les différents paramètres mesurés dans les conditions expérimentales testées en ce qui concerne les témoins négatifs et positifs. Toutes les données statistiques ont été générées à l'aide du logiciel SPSS. • Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur le taux de consommation de dioxygène (02)

Les résultats sont donnés dans la figure IB.

Les NHDF sont incubés en plaque 96 puits avec soit la coenzyme QIO à 0,000086% soit l’extrait de Lucuma à 0,05, 0,25 et 0,5%, tandis que la consommation d’Oi dynamique était mesurée pendant 120 minutes. Les niveaux de consommation d'Oi sont directement réfléchis par les variations de la valeur de durée de vie de la sonde. Pour obtenir les valeurs de la consommation d’Oi par la cellule, les pentes du profil de cinétique sont enregistrées et sont calculées par cellule pour chaque puits et chaque condition expérimentale. L'analyse t-test de Student a montré des différences significatives entre les conditions expérimentales effectuées. • Conclusion

En présence du composé de référence énergisant, le coenzyme QIO à 0,000086%, le taux de consommation d'02 dans les fibroblastes primaires humains a été significativement augmenté de près de 3,3 fois par rapport au contrôle négatif (p = 0,004). L’extrait de Lucuma a montré un effet en forme de cloche sur le taux de consommation d'02, augmentant de manière significative la consommation d'oxygène par rapport aux cellules non traitées. À 0,25%, l'effet de l’extrait de Lucuma était maximale, augmentant le taux de consommation d'02 de près de 4,4 fois par rapport aux cellules non traitées. Globalement, l'effet de l’extrait de Lucuma aux trois concentrations testées est comparable à celle de la coenzyme QIO à 0,000086%. Le tableau ci-dessous résume les effets des différents essais de l’extrait de Lucuma sur le taux de consommation d'oxygène.

• Evaluation de l’effet de l’extrait de Lucuma sur le niveau d’ATP cellulaire

Les résultats sont donnés dans la figure IC.

Les NHDF sont incubés soit avec le coenzyme QIO à 0,000086% soit avec l’extrait de Lucuma à 0,05, 0,25 et 0,5% pendant 120 minutes. Le niveau d’ATP cellulaire est mesuré par chimiluminescence. Une régression linéaire est réalisée pour produire des concentrations d'ATP cellulaires en utilisant une courbe standard validée correspondante (le coefficient de corrélation était plus élevé que 0,95 (R^ = 0,99872)). L'analyse t-test de Student montre des différences significatives entre les conditions expérimentales effectuées. • Conclusion

Le composé de référence, la coenzyme QIO à 0,000086%, augmente de façon significative le niveau d'ATP cellulaire de près de 1,4 fois par rapport aux cellules non traitées (p = 0,015). Dans les fibroblastes primaires humains, l'ingrédient actif de l’extrait de Lucuma à 0,05, 0,25 et 0,5%, augmente de manière significative le niveau d'ATP cellulaire de près de 1,4 fois par rapport au témoin négatif, à un niveau comparable à celui de la coenzyme QIO. Le tableau ci-dessous résume les effets des différentes concentrations de l’extrait de Lucuma sur le niveau d’ATP cellulaire.

• Evaluation du potentiel pro-oxydant de l’extrait de Lucuma au niveau cellulaire

Le test consiste en la quantification du potentiel pro-oxydant de l’extrait de Lucuma en comparaison à une référence pro-oxydante, c’est-à-dire la mesure de la production de dérivés réactifs de l'oxygène cellulaire ((DROc) en utilisant un colorant fluorescent. L'analyse est effectuée selon les procédures opératoires standard ME-MO-22 (« DRO cellulaire dans les fibroblastes »). Les cellules sont pré-incubées avec la sonde fluorescente à 37 ° C pendant 30 minutes. Après lavage, les cellules sont incubées avec les éléments de test à des concentrations déterminées et le composé de référence pro-oxydant, H202 à 100 um. La production de DRO cellulaire dynamique est immédiatement enregistrée pendant 60 minutes. La fluorescence est enregistrée toutes les cinq minutes en utilisant un lecteur de microplaques (Varioskan-Thermo). Les cellules sont maintenues à 37 ° C au cours de la cinétique en boucle. L'analyse de l'activité pro-oxydant est multiple pour la mesure de la viabilité des cellules par spectrophotométrie. Les expériences comprennent un blanc et des contrôles négative et positif. Le contrôle négatif est constitué par les cultures traitées avec le véhicule seulement. Le positif consiste au traitement des cultures avec le composé de référence pro-oxydant : 1Ή202. L'ingrédient actif de l’extrait de Lucuma, sera testé à 0,05%, 0,25% et 0,5% (v / v), en présence de 0,5% de DMSO indépendamment du véhicule.

Les différentes concentrations de l’extrait de Lucuma sont testées en quatre exemplaires. Leurs effets seront comparés par rapport à la fois aux témoins négatifs et positifs.

Les résultats sont donnés dans la figure ID L'analyse t-test de Student est faite pour déterminer le niveau d'importance de 1’ amplitude de variation des différents paramètres mesurés et potentiellement observés dans toutes les conditions expérimentales en ce qui concerne les témoins négatifs et positifs. Toutes les données statistiques sont générées à l'aide du logiciel SPSS. - Conclusion L'effet du contrôle positif a été validé dans les NHDF. L’H202 à 100 uM induit une augmentation de 3,4 fois significative du taux cellulaire de production de DRO par rapport aux cellules non traitées (p<0.0001). À toutes les doses testées et après une courte incubation de 1 heure, l’extrait de Lucuma n'a pas stimulé la production de DRO cellulaire dans les NHDF et a laissé ce niveau inchangé par rapport à celui des cellules non traitées. Ainsi, dans les présentes conditions expérimentales, l’extrait de Lucuma est démontré comme n’étant pas un composé pro-oxydant. - Conclusion générale sur l’activité énergisante de l’extrait de Lucuma L'étude complète a montré que l’extrait de Lucuma aux 3 concentrations testées, affiche le profil d'un composé énergisant chez les NHDF, comparable à celui du coenzyme QIO en stimulant la phosphorylation oxydative, augmentant à la fois la consommation d'oxygène et la production d’ATP, tout en ne générant pas de déchets (dérivés réactifs oxygénés) responsables de l’oxydation cellulaire. L’extrait de Lucuma selon l’invention stimule la chaîne respiratoire, stimulant ainsi la fonction énergétique de la mitochondrie, siège de la production d’ATP impliquée dans les processus cellulaires vitaux, en respectant la balance d'oxydoréduction restant ainsi équilibrée. L’extrait de Lucuma démontre ainsi une activité énergisante^^ sur la peau humaine, comparable à la coenzyme QIO.

Exemple 7 : Evaluation de l’activité hydratante de l’extrait de Lucuma L'épiderme forme une barrière physique et perméable. Cette barrière est continuellement régénérée par la différenciation des kératinocytes, processus connu sous le nom de kératinisation. Dans l'épiderme, il y a plusieurs composants importants pour la fonction de barrière dont des protéines comme Claudine, involucrine, filaggrine agissant sur la prévention des pertes en eau,-des lipides comme les céramides contribuant aux propriétés perméables de la barrière et d'autres éléments comme l'aquaporine 3 agissant sur le transport des solutés ou la hyaluronane synthase 3 impliquée dans la synthèse d'acide hyaluronique.

Lorsque la barrière cutanée fonctionne correctement, l'èpiderme empêche la perte d'eau.

Une étude évaluant l’effet de l’extrait de Lucuma sur l’expression de marqueurs dans des modèles de fibroblastes in vitro est ainsi menée ici sur 16 gènes spécifiques de la fonction barrière cutanée. L’extrait de Lucuma utilisé dans l’évaluation décrite ici est celui de l’exemple 2 décrit précédemment.

Le tableau 1 ci-dessous récapitule les gènes testés, classés par groupes en fonction de leur fonction biologique.

Tableau 1

L’étude consiste en une analyse par RT-qPCR du profil d’expression en ARNm des gènes.

Parmi eux, le gène de la filaggrine (FLG), celui de la sphyngomyéline phosphodiestérase 1 (SMPDl) ainsi que le gène de l’arachidonate lipoxygénase 12 (ALOX12).

La filaggrine est la protéine localisée dans la couche granuleuse et dans la couche cornée dont la quantité est associée à l’état d’hydratation de la peau. Seul, ce marqueur peut être suivi pour évaluer l’état d’hydratation de la peau à la place d’une mesure du TEWL (Trans Epiedermal

Water Loss). Dans des situations pathologiques où l’on observe une xérose ou sécheresse de la peau (dermatite atopique, ichtyosis vulgaris), une diminution de la profilaggrine et/ou de la fllaggrine a été détectée ’ .Selon Proksch et al, le suivi de l’expression de la filaggrine est un bon moyen de suivre la fonction barrière et/ou le niveau d’hydratation du Stratum Comeum.

La sphyngomyeline est un sphingolipide constitué d'une unité céramide liée à un résidu de choline ou d'éthanolamine par une liaison phosphodiester. Chez l'Homme, les sphingomyélines constituent environ 85 % de tous les sphingolipides et serait le seul phospholipide qui ne soit pas un phosphoglycéride.

La protéine codée par ce gène SMPDl est une sphingomyélinase acide lysosomale qui convertit la sphingomyéline en céramide, molécule abondante dans les membranes cellulaires. Les céramides ne jouent pas qu'un rôle structurel dans les membranes biologiques, et peuvent également revêtir des fonctions de signalisation lipidique. Leurs actions les mieux comprises vont de la différenciation cellulaire à l'apoptose en passant par la prolifération cellulaire et la mort cellulaire programmée.

La protéine codée par le gène SMPDl a également une activité de phospholipase C. Les défauts de ce gène sont une cause de la maladie de Niemann-Pick de type A et B, dues à un déficit en sphingomyélinase acide lysosomiale^^ aboutissant à l'accumulation de sphingomyéline, puis de cholestérol dans les monocytes, voire dans le cerveau (type A).

La lipoxygénase est un type de protéine enzymatique qui catalyse l'oxydation des acides gras ou autres alcènes. Il en existe de multiples sortes. L’arachidonate 12-lipoxygénase ALOX12 convertit l’acide arachidonique, acide gras polyinsaturé oméga-6 à 20 atomes de carbone, présent dans les phospholipides (notamment les phosphatidyléthanolamines, les phosphatidylcholines et les phosphatidylinositols) et constituant les membranes cellulaires de l'organisme. Cette enzyme intéragit aussi avec la kératine 5, cytokératine spécifiquement exprimée dans la couche basale de l'épiderme^^. • Matériel et méthode Kératinocytes épidermiques humain normaux (NHEK) - Type cellulaire : NHEK, Référence ^AOalternatives K341, utilisés au 3e passage

- Conditions de culture : 37°C, 5% CO 2 - Milieu de culture : Kératinocyte-SFM complémenté avec

Epidermal Growth Factor (EGF) 0.25 ng/ml Extrait Pituitaire (EP) 25 pg/ml Gentamycine 25 pg/ml - Milieu d’essai : Kératinocyte-SFM complémenté avec

Gentamycine 25 pg/ml • Evaluation préalable de la cytotoxicité

Les kératinocytes sont ensemencés et cultivés en milieu de culture pendant 24 heures. Le milieu est ensuite remplacé par le milieu d’essai contenant ou non (témoin) les composés à l’essai ou la référence (chlorure de calcium à 1.5 mM) et les cellules sont incubées pendant 24 heures. Toutes les conditions sont réalisées en n=3. A la fin du traitement, les cellules sont incubées en présence de MIT (sel de tétrazolium) dont la transformation en cristaux bleus de formazan est proportionnelle à l'activité de la succinate deshydrogénase (enzyme mitochondriale). Après dissociation des cellules et solubilisation du formazan par ajout de DMSO, la densité optique (DO), représentative du nombre de cellules vivantes et de leur activité métabolique, est mesurée avec un lecteur de microplaques à 540 nm (VERSAmax, Molecular Devices).

Concentrations retenues pour être testées : 0.0003, 0.001 et 0.003% • Culture et traitement

Les kératinocytes sont ensemencés et cultivés en milieu de culture pendant 24 heures. Le milieu est ensuite remplacé par le milieu d’essai contenant ou non (témoin) les composés à l’essai ou la référence CaCli (chlorure de calcium à 1.5 mM) et les cellules sont incubées pendant 24 heures. Toutes les conditions sont réalisées en n=3. A la fin de l’incubation, les surnageants de culture sont éliminés et les tapis cellulaires sont rincés avec une solution de PBS. Les plaques sont immédiatement congelées à sec à -80°C.

• Analyse de l’expression différentielle - série PCR L’expression des marqueurs est évaluée par RT-qPCR sur les ARN messagers (ARNm) extraits des tapis cellulaires de chaque traitement (les réplicats sont poolés avant l’extraction de TARN). L’analyse de l’expression des gènes est réalisée en n=2 à l’aide de 2 « série PCR » contenant 16 gènes dont 2 gènes de référence, pour la vérification du test (dits « de ménage »), dédiés à la recherche et adaptés au format « screening ». • Transcription inverse

Les ARN totaux de chaque échantillon sont extraits à l’aide de TriPure Isolation Reagent® selon le protocole préconisé par le fournisseur. La quantité et la qualité des ARNs sont évaluées par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer 2100, Agilent). Les contrôles qualité des ARN sont présentés en annexe.

Les traces d’ADN potentiellement contaminant sont éliminées par traitement avec le système DNA-free (Ambion). Les ADN complémentaires (ADNc) sont synthétisés par transcription inverse des ARN totaux en présence d’oligo(dT) et de l’enzyme « Transcriptor Reverse Transcriptase » (Roche). L’ADNc obtenu est quantifié par spectrophotométrie (Nanovue ; GE Healthcare), puis les quantités ADNc sont ajustées. • PCR Quantitative

Les réactions de PCR (polymerase chain reactions) sont réalisées par PCR quantitative (Light Cycler ; Roche Molecular Systems Inc.) et selon les procédures recommandées par le fournisseur.

Le mélange réactionnel (10 μ1 final) pour chaque échantillon contient : - 2.5 μ1 d’ADNc, - les amorces des différents marqueurs utilisés, - le mélange réactionnel contenant l’enzyme taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green I et du MgC12. • Traitement des données de PCR quantitative

Les données brutes sont transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel. L’incorporation de fluorescence dans TADN amplifié est mesurée en continu au cours des cycles de PCR. Ces mesures permettent d’obtenir des courbes d’intensité de la fluorescence en fonction des cycles de PCR et d’évaluer ainsi une valeur d’expression relative (ER) pour chaque marqueur.

Le nombre de cycles est déterminé à partir des points de « sortie » des courbes de fluorescence. Pour un même marqueur analysé, plus un échantillon sort tard (nombre de cycles élevé), plus le nombre initial de copies de TARNm est faible.

La valeur d’ER (expression relative) est exprimée en unités arbitraires (UA) selon la formule suivante: (l/2nombre de cycles ) x 106

La série PCR « mQPA-NHEK-BARRIER-16 » contient 2 gènes de références (gènes de ménage ) utilisés pour la normalisation des données. Les gènes RPS28 (Ribosomal protein S28) et GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), sont exprimés de façon constitutive et leur niveau d’expression n’est pas ou peu impacté par les traitements. Ainsi le niveau d’expression de chaque marqueur est comparé à la moyenne d’expression de ces 2 gènes de référence.

Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant :

Tableau 2

L’incubation des kératinocytes épidermiques humains normaux avec la référence CaCL a augmenté l’expression des ARNm codant pour des marqueurs de la synthèse des lipides (SULT2B1 et ALOX12) et de la différenciation des kératinocytes (FLG, FVL et TGMl). Ces résultats étaient attendus et ont permis de valider l’essai. L’extrait de Lucuma, testé à 0.0003, 0.001 et 0.003%, a stimulé de façon similaire l’expression des marqueurs SMPDl et ALOX12 aux trois concentrations testées ainsi que celle de la FLG aux 2 concentrations les plus basses. • Conclusion L’extrait de Lucuma augmente l’expression des marqueurs de la synthèse des lipides et de la différentiation kératinocytaire (marqueurs liés à l’hydratation) démontrant que l’extrait de Lucuma selon l’invention améliore la fonction de barrière cutanée et ainsi améliore l’hydratation de la peau.

Exemple 8 : Composition cosmétique - Crème de jour pour le visage

Mode opératoire:

Peser la phase A et laisser gonfler sans agitation pendant 30 mn. Mettre la phase A à chauffer à 75 °C au bain-marie. Peser et mélanger la phase B. Peser la phase C et mettre à chauffer à 75°C au bain-marie. Rajouter la phase B dans la phase A. Bien mélanger. Sous agitation verser la phase C dans la phase A+B. Bien homogénéiser. Rajouter la phase D, extemporanément. Rajouter la phase E, bien homogénéiser. Rajouter la phase F, bien homogénéiser.

Exemple 9 ; Composition cosmétique - Forme 2cl pour le visa2e

Mode opératoire :

Disperser la Phase A sous agitation. Saupoudrer TUltrez 10 dans l'eau, laisser gonfler 30 minutes. Chauffer la Phase C jusqu'à dissolution complète. Mélanger la Phase A avec la Phase B. Rajouter C dans la Phase (B+A). Ajouter la Phase D, sous agitation, dans la Phase (A+B+C). Rajouter la Phase E. Neutraliser avec la Phase F. Ajouter la Phase G et mélanger.

Exemple 10 : Composition cosmétique - Forme sérum

Mode opératoire :

Phase A : Saupoudrer le carbomer dans l'eau, laisser gonfler 15 minutes. Mélanger la Phase B. Verser la Phase B dans la Phase A, homogénéiser. Puis Peser la Phase C, mélanger et rajouter dans la Phase A+B, sous agitation. Laisser gonfler 1 heure. Extemporanément rajouter la Phase D dans la phase précédente sous agitation. Neutraliser avec la Phase E. Mettre sous agitation. Ensuite rajouter la Phase F. Laisser mélanger au moins 1 heure sous agitation puis rajouter la Phase G. Bien mélanger.

Exemple 11 : Crème de nuit pour visage

Mode opératoire : Peser Phase A and laisser gonfler pendant 30 minutes. Chauffer Phase A dans un bain d’eau à 75°C ; Chauffer Phase B jusqu’à solubilisation complète. Ajouter Phase B à Phase A. Chauffer Phase C dans un bain d’eau à 75°C. Ajouter la Phase C à la Phase A+B sous agitation. Ajouter Phase D et bien homogénéiser. Neutraliser avec Phase E à 55°C. Ajouter Phase F puis Phase G et bien homogénéiser.

Exemple 12 : Crème pour le corps.

Mode opératoire : Peser Phase A et laisser gonfler pendant 30 minutes. Chauffer Phase A dans un bain d’eau à 75°C. Chauffer Phase B jusqu’à solubilisation complète. Ajouter Phase B à Phase A. Chauffer Phase C dans un bain d’eau à 75°C. Ajouter Phase C à Phase A+B sous agitation. Ajouter Phase D et bien homogénéiser. Neutraliser avec Phase E à 55°C. Ajouter Phase F puis Phase G et bien homogénéiser.

Exemple 13 : Lotion

Mode opératoire : Peser Phase A. Peser Phase B et mélanger. Ajouter Phase B à Phase A sous agitation pendant 30 minutes. Peser Phase C, mélanger jusqu’à obtenir un mélange homogène. Ajouter Phase C à Phase A+B sous agitation. Ajouter Phase au mélange précédent. Ajouter Phase E au mélange précédent sous agitation. Bien homogénéiser. Peser Phase F, mélanger et ajouter au mélange précédent. Mélanger de manière insistante.

Exemple 14 : Crème de jour

Mode opératoire : Phase A : Verser Ultrez 10 dans l’eau et laisser gonfler pendant 30 minutes. Peser Phase B et laisser fondre à 60 °C. Chauffer Phase A dans un bain d’eau à 75°C. Peser Phase C et chauffer à 75°C dans un bain d’eau. Sous agitation (Starvo v=500 t/min), ajouter Phase C à Phase A. Ajouter arbitrairement Phase B et Phase D dans Phase A+B puis y ajouter Phase E. Bien homogénéiser. Refroidir à 45°C et ajouter Phase F. A 35°C, ajouter Phase G, bien homogénéiser. Ajouter Phase H, bien homogénéiser.

Exemple 15 : Fluide pour le corps.

Mode opératoire : Phase A : Verser Ultrez 10 dans l’eau et laisser gonfler pendant 30 minutes. Sous agitation à hélice (300 t/min), verser Phase B et laisser gonfler pendant Ih. Ajouter Phase A dans Phase B sous agitation à hélice (300 t/min), bien homogénéiser. Peser et mettre sous agitation Phase C, peser Phase D et mélanger. Ajouter Phase C à Phase A+B. Ajouter Phase D à Phase A+B+C. Bien homogénéiser. Ajouter Phase E puis Phase F et G et enfin Phase H. pH = 6.2.

Exemple 16 : Crème de nuit

Mode opératoire : Phase A : Verser Ultrez 10 dans l’eau et laisser gonfler pendant 30 minutes. Sous agitation à hélice (300 t/min), verser Phase B et laisser gonfler pendant Ih. Ajouter Phase A dans Phase B sous agitation à hélice (300 t/min), bien homogénéiser. Peser et mettre sous agitation Phase C, peser Phase D et mélanger. Ajouter Phase C à Phase A+B sous agitation à couteau (300 t/min). Ajouter Phase D à Phase A+B+C. Bien homogénéiser. Ajouter Phase E puis Phase F et G et enfin Phase H. Bien homogénéiser.

Exemple 17 : Lotion pour cheveux.

Exemple 18 : Maquillage hydratant.

Exemple 19 : Baume à lèvre.

Mode opératoire : Chauffer Phase A à 85°C. Mélanger Phase B et chauffer à 85°C. Ajouter doucement Phase A à Phase B sous agitation (Staro v=3000 t/min puis 1200 t/min). Ajouter Phase C préchauffée à 80°C, homogénéiser. Ajouter Phase D à 35°C. Verser.

Exemple 20 : Spray protecteur cheveux.

Mode opératoire : Peser et mélanger la Phase A avec un agitateur à couteau v = 300 t/min. Ajouter la Phase B, mélanger puis ajouter la Phase C. Ajuster le pH entre 5,0 et 5,5 avec la Phase D. Références bibliographiques 1. Erazo, S. G.; Escobar, A.; Olaeta, J. A.; Undurraga, P. Alimentos 1999, 24, 67-75) 2. Glorio, P.; Repo-Carrasco, R.; Velezmoro, C.; Anticona, S.; Huaranga, R.; Martinez, P.; Melgarejo, S.; Astuhuaman, L.; Huaman, N. E.; Icochea, J. C.; Pena, J. C. Rev. Soc. Quim. Peru 2008, 74, 46-56. 3. Repair of photoaged dermal matrix by topical application of a cosmetic anti-ageing product The British journal of dermatology Volume 158 Issue 3 Pages 472-477 ,2008 4. Salicyloyl-phytosphingosine: a novel agent for the repair of photoaged skin International Journal of Cosmetic Science Volume 29 Issue 4 Pages 319-329 Journal 2007 5. A cosmetic 'anti-ageing' product improves photoaged skin: a double-blind, randomized controlled trial British Journal of Dermatolosy Volume 161 Issue2 Pages 419-426 Journal 2009 6. Direct inhibition of elastase and matrix metalloproteinases and stimulation of biosynthesis of fibrillar collagens, elastin, and fibrillins by xanthohumol {Journal of Cosmetic Science, Volume 61, Issue 2, Pagesl25-132, Journal 2010.) 7. From elastin to elastic fibers, part I. The in vitro effects of a natural dipeptide on the biological cascade. 8. A novel anti-ageing mechanism for retinol: induction of dermal elastin synthesis and elastin fibre formation International Journal of Cosmetic Science Volume 33 Issue 1 Pages 62-69 Journal 2011 9. Matrix proteins of the papillary dermis - primary targets of intrinsic dermal aging? Global Ingrédients & Formulations Guide 2009 Pagesl31-142 Conférence 2009 10. Matrix proteins of the papillary dermis - primary targets of intrinsic dermal aging? IF SCC Magazine Volume 11 Issue 3 Pages 225-229 Journal 2008 11. Fibrillines et fibrillinopathies, Gwenaëlle Collod et al.. Médecine et Science n°10, vol. 12, p. 1077 -1086, octobre 1996 12. Les filaments perlés : structure, fonctions et maladies associées, Eric Hanssen et al.. Médecine et Science n°3, vol. 17, p. 327 -335, mars 2001 13. Stiff skin syndrome cause found, P.J. Couke et al., 18 mars 2010 14. Fibrillin Assembly Requires Fibronectin, L. Sabatier et al., Molecular Biology of the Cell, Vol. 20, 846-858, February 1, 2009. 15. Dissecting the Fibrillin Microfibril: Structural Insights into Organization and Function, S. A. Jensen et al.. Structure Review 20, Cell Press, February 8, 2012 16. A new wrinkle on old skin: the rôle of elastic fibres in skin ageing, Langton A K; Sherratt M J; Griffiths C E M; Watson R E B International journal of cosmetic science Journal; Article; (JOURNAL ARTICLE) 2010 17. Balaban, R.S., S. Nemoto, and T. Finkel, Mitochondria, oxidants, and aging. Cell, 2005. 120(4): p. 483-95. IS.Wallace, D.C., et al.. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. Biofaetors,1998. 7(3): p. 187-90. 19. Finkel, T. and N.J. Holbrook, Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Natnre,2000. 408(6809): p. 239-47.) 20. Bossi, O., et al., UV irradiation increases ROSproduction via PKCdelta signaling in primary murine fibroblasts. J Cell Biochem, 2008. 105(1): p. 194-207. 21. Paz, M.L., et al.. Mitochondrial dysfunction and cellular stress progression afler ultraviolet B irradiation in human kératinocytes. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2008. 24(3): p. 115-22. 22. Aitken, G.R., et al.. Direct monitoring ofUV-induced free radical génération in HaCaT kératinocytes. Clin Exp Dermatol, 2007. 32(6): p. 722-7.) 23. Wan, G., et al., Real-world exposure of airborneparticulate matter triggers oxidative stress in an animal model. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol, 2010. 2(1): p. 64-68. 24. Becker, S., et al., Seasonal variations in air pollution particle-induced inflammatory mediator release and oxidative stress. Environ Health Perspect, 2005. 113(8): p. 1032-8. 25. Lanuti, E.L. and R.S. Kirsner, Effects of pollution on skin aging. J Invest Dermatol, 2010. 130(12): p. 2696. 26. Vierkotter, A., et al., Airborne partie le exposure and extrinsic skin aging. J Invest Dermatol, 2010. 130(12): p. 2719-26. 27. Stadtman, E.R., Protein oxidation and aging. Science, 1992. 257(5074): p. 1220-4. 28. Ginger RS et al., Arch Dermatol Res 297 :235-241, 2005. 29. Rawlings AV and Matts PJ, JID, 124 :1099-1110, 2005. 30. Proksch E et al, Exp Dermatol, 17 :1063-1072, 2008. 31. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6609 32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3852 33. http://blog.nutrilifeshop.com/coenzyme-qlO-une-nouvelle-panacee- cosmetique/#sthash.blgTxnGy.A0QKv24d.dpuf

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d’un extrait du finit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe, comprenant les étapes successives suivantes : (a) dispersion et extraction dans xin solvant aqueux et/ou alcoolique et/ou glycérolique et/ou glycolique de peau et/ou de pulpe de finit de Pouteria lucuma, (b) décantation et/ou centrifugation et/ou filtration clarifiante de l’extrait obtenu suite à l’étape (a) ; (c) microfiltration de l’extrait obtenu à l’étape (b) ; (d) récupération de l’extrait de finit de Lucuma ; (e) le cas échéant, ultrafiltration et/ou nanofiltration de l’extrait obtenu à l’étape (c) ; puis (f) séchage éventuel de l’extrait obtenu à l’étape (e) avec ou sans support de séchage.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce la préparation de l’extrait du finit de Pouteria lucuma est effectuée à partir de la pulpe séchée.
3. Extrait du finit de Pouteria lucuma, constitué de la peau et/ou de la pulpe finiche ou séchée, susceptible d’être obtenu par le procédé selon la revendication 1 ou 2 .
4. Composition cosmétique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable une quantité efficace d’un extrait du finit de Pouteria lucuma constitué de la peau et/ou de la pulpe finiche ou séchée selon la revendication 3.
5. Composition cosmétique selon la revendication 4 caractérisée en ce que la quantité efficace est ime teneur en extrait végétal allant de lO"^ à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
6. Procédé de traitement cosmétique destiné à procurer un effet énergisant cutané, à prévenir et/ou lutter contre la sécheresse de la peau et des muqueuses, à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieilHssement, caractérisé en ce que l’on applique topiquement sur la peau, les muqueuses et les phaières à traiter, ime composition telle que définie selon la revendication 4.
7. Utilisation dans ime composition cosmétique d’au moins ime quantité efficace d’un extrait du finit de Pouteria lucuma selon la revendication 3 comme principe actif pour apporter im effet énergisant à la peau, pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement cutané et pour hydrater la peau.
8. Utilisation cosmétique selon la revendication 7 caractérisée en ce que l’extrait du finit de Pouteria lucuma est un extrait de la pulpe du finit séchée.
9. Utilisation cosmétique selon l’une des revendications 7 et 8 caractérisée en ce que la quantité efficace est une teneur en extrait végétal allant de lO"^ à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.