[go: up one dir, main page]

WO2025075265A1 - 신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2025075265A1
WO2025075265A1 PCT/KR2024/008959 KR2024008959W WO2025075265A1 WO 2025075265 A1 WO2025075265 A1 WO 2025075265A1 KR 2024008959 W KR2024008959 W KR 2024008959W WO 2025075265 A1 WO2025075265 A1 WO 2025075265A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
depression
strain
group
lactobacillus plantarum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/008959
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
백현동
이나경
복현지
이혜원
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Original Assignee
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University filed Critical University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Publication of WO2025075265A1 publication Critical patent/WO2025075265A1/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating neurological diseases, comprising a novel strain of Lactobacillus plantarum KU210152, a culture thereof or a killed cell thereof.
  • Probiotics are live bacteria that enter the body and have a beneficial effect on health. Their known effects include antioxidant activity, anti-inflammatory activity, cholesterol-lowering activity, and anti-diabetic activity. It is reported that the above characteristics differ depending on the strain.
  • non-patent literature 1 it is disclosed that the composition of the intestinal microbiota community of patients with depression is different from that of healthy people.
  • the intestinal microbiota community of patients with depression is deficient in beneficial strains such as bifidobacteria and lactobacillus, and related studies suggest that changes in the intestinal microbiota community may affect the occurrence of depression and may also be related to psychological stress.
  • the present invention confirmed the possibility that the novel strain Lactobacillus plantarum KU210152 isolated from kimchi, as a probiotic, has a neuroprotective effect in a neural cell line and an antidepressant effect through animal testing, thereby confirming its potential to contribute to the treatment of neurological diseases.
  • Non-patent document 001 Barandouzi ZA et al, Altered Composition of Gut Microbiota in Depression: A Systematic Review. Front Psychiatry. 2020 Jun 10;11:541.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for improving, preventing or treating neurological diseases using a novel strain, Lactobacillus plantarum KU210152.
  • the present invention provides a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain comprising a DNA sequence encoding 16S rRNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating neurological diseases, comprising the novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof or a killed cell thereof.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving neurological diseases, comprising a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof, or a killed cell thereof.
  • the present invention also provides an animal feed additive composition for preventing or improving neurological diseases, comprising a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof, or a killed cell thereof.
  • the present invention relates to a composition for improving, preventing or treating neurological diseases, comprising the Lactobacillus plantarum KU210152 strain deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof or a killed cell thereof, wherein the Lactobacillus plantarum KU210152 strain according to the present invention exhibits: i) acid resistance, cholera resistance and intestinal adhesion; ii) production of ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase; iii) reduction in ROS production; iv) increase in BDNF and TH expression; v) increase in mRNA expression of TPH-1, SERT and HTR2A; vi) increase in sucrose preference; vii) maintenance of serum corticosterone; viii) increase in Bacteroides spp.
  • strains Or ix
  • It has the effect of increasing the synthesis of acetic acid, propionic acid and butyric acid, so it can be utilized as a pharmaceutical or food composition and an animal feed additive composition for degenerative neurological diseases or mental disorders caused by nerve cell death.
  • Figure 1 is an experimental design for inducing depression in a mouse model through restraint stress.
  • Figure 2 is a phylogenetic tree obtained through partial sequencing of a portion of the DNA sequence encoding 16S rRNA of the novel strain Lactobacillus plantarum KU210152.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the neurotoxicity of strain-derived metabolites (conditioned medium, CM) confirmed through MTT analysis.
  • Figure 4 shows the results of measuring cell viability according to H 2 O 2 concentration.
  • Figure 5 shows the results of measuring the neuronal cell survival rate of strain-derived CM confirmed through MTT analysis.
  • Figure 6 shows the results of comparing the morphological changes in SH-SY5Y cells treated with strain-derived CM and H 2 O 2 .
  • Figure 7 shows the results comparing ROS production in SH-SY5Y cells treated with strain-derived CM and H 2 O 2 .
  • Figure 8 shows the results of measuring the expression levels of BDNF and TH using RT-PCR when human colon cancer cells were treated with Lactobacillus bacteria.
  • Figure 9 shows the results of measuring the gene expression levels of BDNF and TH in nerve cells treated with CM derived from a strain that induces toxicity with H 2 O 2 .
  • Figure 10 shows the results of the gene expression ratio of Bax and Bcl-2 in nerve cells treated with strain -derived CM and H2O2 .
  • Figures 11(A) and 11(B) show the results of measuring the activities of caspase-9 and caspase-3, respectively, after treating nerve cells with strain-derived CM and H2O2 .
  • Figures 12(A), 12(B), and 12(C) show the results of measuring changes in pH, titratable acidity, and number of viable cells during the fermentation time of soy milk yogurt, respectively.
  • Figures 13(A), 13(B), and 13(C) show the results of measuring changes in pH, titratable acidity, and number of viable cells during the storage period of soy milk yogurt, respectively.
  • Figure 14 shows the results of evaluating the neurotoxicity of soy milk yogurt using MTT analysis.
  • Figure 16 shows the results of the neuroprotective effect of soy milk yogurt measured by MTT analysis.
  • Figure 17 shows the results comparing the morphological changes of SH-SY5Y cells treated with soy milk yogurt and H 2 O 2 .
  • Figure 18 shows the results comparing ROS production in SH-SY5Y cells treated with soy milk yogurt and H 2 O 2 .
  • Figure 20 shows the results of comparing sucrose preference according to intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 21 shows the results of the tail suspension test according to the intake of selected strains in the restraint stress depression model.
  • Figure 22 shows the results of open field tests according to the intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 23 shows the results of the elevated plus maze test according to the intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 24 shows the results of measuring the expression level of SERT mRNA in the small and large intestine tissues according to the intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 25 shows the results of measuring the expression level of TPH-1 mRNA in the small and large intestine tissues according to the intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 26 shows the results of measuring the expression levels of HTR2A and SERT mRNA in the prefrontal cortex tissue according to the intake of selected strains in a restraint stress depression model.
  • Figure 30 shows the genome map of the Lactobacillus plantarum KU210152 strain.
  • administration means placing a substance into a subject or a method that results in at least partial localization to a desired site in the subject. Administration can be accomplished by methods known in the art.
  • dead cells in this specification refers to a form manufactured through heat treatment of a live cell cultured with a strain, and is a form in which the activity of the strain is prevented, and may include cytoplasm, antibacterial active substances such as bacteriocin, and organic acids.
  • the present invention provides a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain comprising a DNA sequence encoding 16S rRNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the above strain was assigned the accession number KCCM 13371P by the Korea Microbiological Conservation Center on July 25, 2023.
  • the above strain (KCCM 13371P) is a strain of Lactobacillus plantarum.
  • Lactobacillus plantarum is a gram-positive rod-shaped bacterium with slightly aerobic properties and is one of the most widely distributed lactic acid bacteria in nature.
  • Lactobacillus plantarum undergoes normal lactic acid fermentation and is a representative kimchi lactic acid bacteria that ferments arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, sucrose, dextran, etc. to produce lactic acid.
  • the strain does not produce ⁇ -glucuronidase and N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase, which are enzymes that induce cancer in the human body, and is characterized by having antibiotic resistance to gentamicin, kanamycin, streptomycin, and cislofloxacin, and antibiotic susceptibility to ampicillin, tetracycline, chloramphenicol, and doxycycline.
  • the above strain can be produced as a live cell, dead cell or culture medium, but is preferably produced as a dead cell by culturing at 25°C to 45°C for 10 to 50 hours and then optimally heat treating at 70°C to 90°C for 10 minutes to 1 hour, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating neurological diseases, comprising the novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof or a killed cell thereof.
  • the above neurological disease may be, but is not limited to, a degenerative neurological disease or mental disorder caused by nerve cell death.
  • the above-mentioned neurodegenerative disease is at least one selected from the group consisting of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, brain dysfunction due to abnormal immune system, progressive neurodegenerative disease, metabolic encephalopathy, Niemann-Pick disease, and dementia due to cerebral ischemia and cerebral hemorrhage, and the above-mentioned mental disorder may be at least one selected from the group consisting of anxiety, depression, insomnia, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, intellectual disability, stress, memory impairment, and cognitive impairment, but is not limited thereto.
  • the above neuronal cell death may be induced by, but is not limited to, oxidative stress.
  • the above strain may comprise a DNA sequence encoding 16S rRNA represented by the base sequence of sequence number 1.
  • the composition may additionally have one or more characteristics selected from the group consisting of, but not limited to, i) acid resistance, cholera resistance and intestinal adhesion; ii) production of ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase; iii) reduction of ROS production; iv) increase in BDNF and TH expression; v) increase in mRNA expression of TPH-1, SERT and HTR2A; vi) increase in sucrose preference; vii) maintenance of serum corticosterone; viii) increase in Bacteroides spp. strains; or ix) increase in acetic acid, propionic acid and butyric acid synthesis.
  • characteristics selected from the group consisting of, but not limited to, i) acid resistance, cholera resistance and intestinal adhesion; ii) production of ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase; iii) reduction of ROS production; iv) increase in BDNF and TH
  • the strain has excellent acid resistance and bile resistance, it can safely reach the intestines when ingested, and if it has excellent intestinal adhesion, it can stably settle in the intestines.
  • ⁇ -glucosidase or ⁇ -galactosidase is an enzyme that plays a key role in the metabolism of carbohydrates and the survival and function of lactic acid bacteria.
  • ⁇ -glucosidase decomposes glucosides found in various plant foods, and ⁇ -galactosidase mainly plays a role in decomposing lactose, and is an enzyme essential for the survival and growth of lactic acid bacteria.
  • ROS is a reactive oxygen species, and because it has a high chemical reactivity, it reacts with various substances that make up cells, such as genes, proteins, and lipids, and changes the cellular functional substances, preventing them from functioning properly and causing cell damage. These reactive oxygen species act as a factor that worsens various diseases, such as cancer, diabetes, and degenerative neurological diseases.
  • BDNF is a brain-derived neurotrophic factor, one of the neurotrophic factors that are part of the growth factor group.
  • the expression of BDNF tends to decrease in cases of depression, schizophrenia, obsessive-compulsive disorder, dementia, Alzheimer's disease, Rett syndrome, Huntington's disease, anorexia nervosa, bulimia, and epilepsy.
  • tyrosine hydroxylase a major factor that regulates the synthesis of dopamine. For example, when Parkinson's disease symptoms worsen, tyrosine hydroxylase tends to be expressed less.
  • TPH-1 tryptophan hydroxylase-1
  • TPH-1 is mainly expressed in the intestines and sensory nerve cells, and is an enzyme that synthesizes tryptophan into the neurotransmitter serotonin, so it can be used as an indicator of the level of serotonin expression in the brain.
  • Serotonin also known as 5-hydroxytryptamine (5-HT)
  • 5-hydroxytryptamine 5-HT
  • Deficiency of serotonin can cause depression.
  • the above HTR2A is 5-Hydroxytryptamine Receptor 2A, one of the subtypes of 5-HT receptors (5HTRs), a protein that binds to serotonin and transmits signals.
  • 5-HTRs 5-HT receptors
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • compositions according to the present invention can be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and can also be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in an appropriate combination.
  • Carriers, excipients, and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate mixtures, and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations can be manufactured by mixing at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., with the pharmaceutical composition.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc., and in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, suspending agents, emulsions, lyophilized preparations, and preservatives can be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents can include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Suppository bases that can be used include witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, laurin butter, and glycerogelatin.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving neurological diseases, comprising a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain comprising a DNA sequence encoding 16S rRNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof, or a killed cell thereof.
  • the above neurological disease may be, but is not limited to, a degenerative neurological disease or mental disorder caused by nerve cell death.
  • the above-mentioned neurodegenerative disease is at least one selected from the group consisting of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, brain dysfunction due to abnormal immune system, progressive neurodegenerative disease, metabolic encephalopathy, Niemann-Pick disease, and dementia due to cerebral ischemia and cerebral hemorrhage, and the above-mentioned mental disorder may be at least one selected from the group consisting of anxiety, depression, insomnia, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, intellectual disability, stress, memory impairment, and cognitive impairment, but is not limited thereto.
  • Foods to which the food composition according to the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, and other functional foods.
  • the foods in the present invention include, but are not limited to, special nutritional foods (e.g., formulated milk, infant food, etc.), processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles (e.g., ramen, noodles, etc.), bread, health supplements, seasoned foods (e.g., soy sauce, soybean paste, red pepper paste, mixed sauce, etc.), sauces, confectionery (e.g., snacks), candies, chocolates, gum, ice cream, processed dairy products (e.g., fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, pickled foods (various kimchi types, pickled vegetables, etc.), beverages (e.g., fruit drinks, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, etc.), and natural seasonings (e.g., ramen soup, etc.).
  • the above health functional food refers to a food group or food composition that has been processed to sufficiently express the body's regulatory functions, such as regulating the biological defense rhythm, disease prevention, and recovery, through physical, biochemical, or bioengineering techniques to provide added value to the food so that the food's function can be performed and expressed for a specific purpose.
  • the above functional food may include a food additive acceptable from a food science perspective, and may further include one or more of suitable carriers, additives, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the above health functional food may be formulated as one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, and liquid formulations, and may further include at least one of a carrier, a diluent, an excipient, and an additive.
  • Foods to which the extract of the present invention may be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, etc.
  • At least one component selected from the group consisting of natural carbohydrates, flavoring agents, nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents (synthetic flavoring agents, natural flavoring agents, etc.), coloring agents, fillers (cheese, chocolate, etc.), factic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, antioxidants, glycerin, alcohol, carbonating agents, and fruit pulp may be used.
  • natural carbohydrates are monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc., common sugars, and sugar alcohols, such as xylitol, sorbitol, erythritol, etc.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the health functional food of the present invention may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • the composition according to the present invention may contain fruit pulp for the production of natural fruit juice and vegetable beverages. These ingredients may be used independently or in combination.
  • the food contained in the food composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), natural carbohydrates, flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and fillers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, and fruit pulp, and the above components may be used independently or in combination.
  • the present invention also provides an animal feed additive composition for preventing or improving neurological diseases, comprising a novel Lactobacillus plantarum KU210152 strain comprising a DNA sequence encoding 16S rRNA represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 deposited under the accession number KCCM13371P, a culture thereof, or a killed cell thereof.
  • the above-mentioned neurodegenerative disease is at least one selected from the group consisting of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, brain dysfunction due to abnormal immune system, progressive neurodegenerative disease, metabolic encephalopathy, Niemann-Pick disease, and dementia due to cerebral ischemia and cerebral hemorrhage, and the above-mentioned mental disorder may be at least one selected from the group consisting of anxiety, depression, insomnia, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, intellectual disability, stress, memory impairment, and cognitive impairment, but is not limited thereto.
  • feed additive composition can be added to feed, and "feed” can mean any natural or artificial diet, meal, etc., or a component of the meal, which is suitable for an animal to eat, ingest, and digest.
  • the type of the feed is not particularly limited, and feed commonly used in the relevant technical field can be used.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feed such as grains, roots, fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, fats, starches, meal, or grain by-products; animal feed such as proteins, inorganic substances, fats, minerals, fats, single-cell proteins, zooplankton, or food.
  • the above feed additive composition may be in the form of a dry or liquid formulation, and may further contain other non-pathogenic microorganisms in addition to the above strain.
  • various grains and soybean proteins as well as peanuts, peas, sugar beets, pulp, grain by-products, animal viscera powder, and fish meal powder, can be used as feed raw materials, and these can be used without limitation in an unprocessed or processed form.
  • Lactobacillus rhamnosus GG strain was used as a standard strain. Lactobacillus plantarum KU210152 was isolated from kimchi using MRS medium. Streptococcus thermophilus P206 strain isolated from the commercial starter ABT-B was used as a starter in the production of soy milk yogurt.
  • SEQ ID NO: 1 GAATTGACGGGGGCCGCCCCAAGCGGTGGAGCTGTGGTTAATTCCAACCTCCCAAGAACCTTACCGGCTTTGAATCTATTCAAATT
  • the phylogenetic diagram of the above strain is as shown in Fig. 2, and it was assigned the accession number KCCM 13371P by the Korea Microbiological Conservation Center on July 25, 2023.
  • Acid resistance of the strain was determined by inoculating the strain into MRS liquid medium containing 0.3% pepsin, adjusting the pH to 2.5, and comparing the number of bacteria after culturing at 37°C for 3 hours with the initial number of inoculated bacteria.
  • Bile resistance was determined by inoculating the strain into MRS liquid medium containing 0.3% bile acid, and comparing the number of bacteria after culturing at 37°C for 24 hours with the initial number of inoculated bacteria.
  • HT-29 cell line a human intestinal epithelial cell line
  • Lactobacillus plantarum KU210152 strain 8 log CFU/mL
  • the cells were washed three times with PBS to remove bacteria not attached to the cells, and the bacteria attached to the cells were detached from the cells with a 1% Triton X-100 solution.
  • the bacteria were diluted to an appropriate multiple and plated on MRS agar medium, and the number of attached bacteria was measured after culturing at 37°C.
  • the intestinal adhesion capacity was calculated by comparing the number of initially inoculated bacteria and the number of attached bacteria.
  • Lactobacillus plantarum KU210152 acid resistance and bile resistance were measured.
  • the comparative strain Lactobacillus rhamnosus GG showed 98.67%
  • Lactobacillus plantarum KU210152 showed 99.36%
  • Lactobacillus rhamnosus GG the comparative strain
  • the comparative strain showed 98.35%
  • Lactobacillus rhamnosus GG showed 94.99%
  • Lactobacillus plantarum KU210152 showed 96.68%.
  • Lactobacillus plantarum KU210152 produces useful or harmful enzymes.
  • Lactobacillus rhamnosus GG nor Lactobacillus plantarum KU210152 produced ⁇ -glucuronidase, which is known to be a carcinogenic enzyme.
  • both strains produced ⁇ -glucosidase, which is beneficial for soymilk fermentation, and ⁇ -galactosidase, which is beneficial for lactose decomposition (Table 2).
  • CM conditioned medium
  • Lactobacillus strains were cultured in MRS medium for 24 hours. After washing twice with PBS, they were heat-treated at 80°C for 30 minutes to prepare dead cells.
  • Human intestinal epithelial cells HT-29 were inoculated into 6-well plates (5 ⁇ 10 5 cells/mL) and cultured for 5 days, and then dead Lactobacillus cells (1 ⁇ 10 9 CFU/mL) were inoculated and cultured for 24 hours. The supernatant was collected, centrifuged at 14,000 ⁇ g , 4°C for 10 minutes, and then filtered using a 0.45 ⁇ M filter to prepare strain-derived metabolites (conditioned medium; CM).
  • CY soy milk yogurt fermented with starter only
  • GY represents soy milk yogurt fermented with starter and Lactobacillus rhamnosus GG
  • PY represents soy milk yogurt fermented with starter and Lactobacillus plantarum KU210152.
  • the viable cell count, pH, and titratable acidity were measured during the fermentation time and storage period of soy yogurt.
  • the viable cell count was confirmed by spreading a plate on MRS medium.
  • the pH and titratable acidity were measured using a pH meter.
  • the titratable acidity was calculated by measuring the amount of 0.1N sodium hydroxide (NaOH) titrated until the pH increased to 8.3 after mixing 10 g of soy yogurt with 10 mL of distilled water.
  • the titratable acidity was calculated according to Equation 1 below.
  • Soy yogurt was stored for 21 days and its characteristics were checked every 7 days.
  • the pH of the three yogurts was maintained constant at approximately 4.5 for CY, approximately 4.3 for GY, and approximately 4.4 for PY, and the titratable acidity was maintained at approximately 0.47%, 0.61%, and 0.52% for CY, GY, and PY, respectively.
  • the viable cell count decreased during the storage period. CY changed from 8.80 log CFU/mL to 8.45 log CFU/mL, GY changed from 8.92 log CFU/mL to 8.24 log CFU/mL, and PY changed from 8.62 log CFU/mL to 7.96 log CFU/mL (see Fig. 13).
  • a soy yogurt supernatant was prepared for use in cell experiments. 10 g of yogurt was mixed with 2.5 mL of sterilized distilled water, and centrifuged at 14,240 ⁇ g, 4°C for 5 minutes. The obtained supernatant was adjusted to pH 7.0 with 1 M NaOH, centrifuged again, and the supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ M filter.
  • SH-SY5Y cells 1 ⁇ 106 cells/mL were cultured in 96-well plates for 24 hours. To evaluate the toxicity of the sample, the sample was treated and cultured for 24 hours. To confirm the neuroprotective effect, the sample was cultured for 4 hours and H2O2 for 20 hours. After that, the medium was removed and MTT (5 mg/mL) was treated for 4 hours. The reacted MTT solution was removed, and 100 ⁇ L of DMSO solution was added and reacted for 20 minutes to dissolve the crystals. After that, the absorbance was measured at 570 nm, and the cell viability was calculated according to Equation 2 below.
  • the cytotoxicity of the strain-derived CM was evaluated by performing an MTT assay. Neither strain showed toxicity to the nerve cells (see Fig. 3).
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • oxidative stress agent an oxidative stress agent
  • SH-SY5Y cells (1 ⁇ 10 6 cells/mL) were cultured for 24 hours, and then treated with the sample for 4 hours and H 2 O 2 for 20 hours, and the morphology of the cells was confirmed under a microscope (see Fig. 6).
  • MTT assay was performed to evaluate the cytotoxicity of soy yogurt samples. Soy yogurt samples were divided into three concentrations. The original solution of the sample was judged to be toxic because it showed a cell viability of less than 40%. The 1/2 dilution and 1/4 dilution of the three yogurts showed a viability of close to 100% for the nerve cells, so it was judged to be non-toxic. Therefore, the 1/2 dilution and 1/4 dilution were used in the subsequent experiments (see Fig. 14).
  • the MTT assay was performed by treating soy milk yogurt samples and H 2 O 2 to nerve cells (see Fig. 16).
  • the negative control group that was not treated with H 2 O 2 was set as 100%, the viability of cells treated only with H 2 O 2 was 45.68%.
  • CY, GY, and PY showed 22.93%, 37.81%, and 57.38%, respectively, and in the 1/4 dilution, CY, GY, and PY showed 46.54%, 54.05%, and 63.57%, respectively.
  • CY did not show a neuroprotective effect
  • the 1/4 dilution showed a higher cell viability.
  • PY showed a high neuroprotective effect in the 1/4 dilution. Therefore, the 1/4 dilution concentration was used in the subsequent experiments.
  • SH-SY5Y cells (1 ⁇ 10 6 cells/mL) were cultured in 12-well plates for 24 hours, and then treated with samples for 4 hours and H 2 O 2 for 20 hours. After washing the cells with PBS, DCF-DA reagent was added and reacted at 37°C for 30 minutes. After the reaction, the cells were washed with PBS and ROS generation was observed through a fluorescence microscope.
  • RT-PCR was performed to determine whether brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and TH (tyrosine hydroxylase) increased or decreased when lactic acid bacteria were treated in colon cancer cells, and whether BDNF, TH, Bax, and Bcl-2 increased or decreased when strain-derived CM was treated in nerve cells (see Figure 8).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • TH tyrosine hydroxylase
  • HT-29 cells were cultured in 6-well plates at 5 ⁇ 10 5 cells/mL, treated with killed lactic acid bacteria, and cultured for 24 hours.
  • SH-SY5Y cells were cultured in 6-well plates at 1 ⁇ 10 6 cells/mL, reacted with strain-derived CM for 4 hours, and H 2 O 2 for 6 hours. After that, RNA was extracted from each cell, converted to cDNA, and RT-PCR was performed to compare the gene expression levels.
  • the strain -derived CM and H2O2 were treated, and then the changes in the Bax gene, an apoptosis inducer, and the Bcl-2 gene, an apoptosis inhibitor, were measured by RT-PCR and expressed as the Bax/Bcl- 2 ratio (see Fig. 10).
  • the Bax/Bcl-2 ratio increased 1.83-fold compared to the control group, but when treated with CM derived from Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus plantarum KU210152, the ratio decreased to 0.95-fold and 0.91-fold, respectively.
  • mice C57BL/6 mice (WIKIM IACU 202140).
  • Four-week-old mice weighing 14-17 g were purchased from Jibio Co., Ltd. (Gwangju, Korea), and the experiment was conducted after a one-week acclimatization period.
  • Fluoxetine Sigma, MO, USA
  • the positive control group used in the experiment was suspended in PBS and administered at 20 mg/kg.
  • Lactic acid bacteria and PBS were administered for 7 weeks, and restraint stress and fluoxetine were administered 5 days a week for 4-7 weeks until sacrifice (Fig. 1). Restraint stress was created using a 50 mL conical tube, and depression was induced by restraining for 4 hours per day (Fig. 1).
  • mice with depression induced by restraint stress was measured every week after wearing (see Figure 19). Lactic acid bacteria and PBS were administered orally every day for 4 weeks, and depression was induced by stress by restraint every day from the 4th week. Changes in body weight were confirmed from the 5th week, one week after restraint.
  • the group that received restraint stress and PBS showed a significantly decreased preference for sucrose compared to the control and fluoxetine groups (p ⁇ 0.05), and the preference for sucrose was confirmed to be high in the Lactobacillus plantarum KU210152 group.
  • mice were moved to the cages 1 hour before the behavioral analysis test to acclimate them to the laboratory lighting and environment.
  • a climbstopper was attached to the tail of the mouse, and the tail was taped 20-25 cm from the nose to the floor.
  • the immobility time was measured by adding up the total for 360 seconds after recording for 6 minutes.
  • the open field used was a closable box measuring 45 cm (l) X 45 cm (w) X 40 cm (h) (TSE Systems LTD, Germany), and the noise level inside the open field was maintained at 10 db before the experiment. Mice were placed in the open field, and videotaped for 10 minutes to measure the time in center, time in periphery, and time looking around with both paws raised.
  • the EPM test is a behavioral analysis method for anxiety and depression symptoms. It measures the time and distance spent on the open arm and the close arm, and can be used as an indicator to confirm the induction of depression.
  • the time spent in the open arm was significantly shorter in the group in which depression was induced by restraint stress compared to the control group.
  • the group administered with the selected lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum KU210152 showed a slightly improved retention time in the open arm compared to the positive control group, fluoxetine.
  • TPH-1 tryptophan hydroxylase-1
  • SERT serotonin transporter
  • ChgA chromogranin A
  • 5HTRs 5-HT transporters
  • RNA concentration was measured with Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA), and cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (TOPscriptTM, Daejeon, Korea) using 1 ng of RNA.
  • TOPscriptTM cDNA synthesis kit
  • the synthesized cDNA was subjected to real-time quantitative PCR (Bio-Rad CFX-96, CA, USA) analysis using TOPreal qPCR 2 ⁇ premix (Enzynomics, Korea).
  • the primer sequences are shown in Table 3.
  • ChgA_F AGGTCTCTTCCCCCAAGGCG(SEQ ID NO: 2) Xie et al. (2020) ChgA_R TCTGAAGCCATAGGCGCGGG (SEQ ID NO: 3) Tryptophan hydrolase-1 Tph1_F AAGAAATTGGCCTGGCTTC(SEQ ID NO: 4) Tph1_R GTTTGCACAGCCCAAACTC(SEQ ID NO: 5) Serotonin transporter SERT_F TATCCAATGGGTACTCCGCAG(SEQ ID NO: 6) SERT_R CCGTTCCCCTTGGTGAATCT(SEQ ID NO: 7) 5-HT receptor 2A 5HTR2A_F CGAAGCCTCGAACTGGACAAT(SEQ ID NO: 8) 5HTR2A_R CCGCAATGGTGAGAATAATCACG (SEQ ID NO: 9) 5-HT receptor 4 5HTR4_F AGTTCCAACGAGGGTTTCAGG(SEQ ID NO: 9) 5-HT receptor 4 5
  • the expression level of TPH-1 mRNA in the small intestine tissue was significantly higher in the Lactobacillus plantarum KU210152 group compared to the restraint group, similar to the results of the SERT expression level.
  • the expression level of TPH-1 in the large intestine tissue was measured to be the highest in the control group, and the expression level of the Lactobacillus plantarum KU210152 group showed no significant difference compared to the control group, and the expression level of the Lactobacillus plantarum KU210152 group was significantly higher compared to the restraint group (see Fig. 25).
  • HTR2A one of the serotonin receptors, is a serotonin receptor in brain tissue and is a receptor that is often analyzed in depression research.
  • Lactobacillus plantarum KU210152 The selected strain, Lactobacillus plantarum KU210152, was found to have high mRNA expression levels of SERT and HTR2A in the prefrontal cortex of mice induced with depression. Based on these results, it is believed that Lactobacillus plantarum KU210152 affects the mechanism of serotonin synthesis and uptake.
  • hypothalamic-pituitary-adrenal gland axis a part of the neuroendocrine system that regulates the response to stress and various physiological activities, is activated, causing corticosterone levels in the adrenal cortex to increase.
  • corticosterone in serum blood was collected when mice were sacrificed and the serum was separated by centrifugation. The amount of corticosterone in the serum was measured by ELISA analysis (MyBioSource, Inc., CA, USA).
  • mice induced with depression by restraint stress were measured to be lower in the control group and fluoxetine group, which suggests that they were less stressed than the restraint group.
  • the restraint group and the group administered Lactobacillus brevis KU15152 had significantly higher serum corticosterone levels.
  • the group administered Lactobacillus plantarum KU210152 showed no significant difference from the control group (Fig. 27).
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • the increase in the Bacteroides genus was minimal or absent in the normal group and the depression-induced group, but compared to the entire microbial community, the Lactobacillus plantarum KU210152 intake group increased by 17.6%, confirming the possibility of improving depression in all test groups that ingested lactic acid bacteria, and in particular, it is judged that the improvement effect will be the highest in the Lactobacillus plantarum KU210152 intake group (Fig. 28).
  • Short-chain fatty acids are small organic compounds produced by anaerobic fermentation of carbohydrates that serve as food for bacteria in the cecum and colon, and are related to digestive, immune, and central nervous system functions.
  • the most commonly produced SCFAs are acetic acid, propionic acid, and butyric acid, and it has been reported that the higher the level of these fatty acids, the better the depression is alleviated (Gen Psychiatr. 2024 Feb 19;37(1):e101374.).
  • SCFAs short-chain fatty acids
  • Calprotectin is an inflammatory protein present in the cytoplasm of neutrophils, macrophages, and monocytes, and it is known that lowering the level of calprotectin in the intestine alleviates inflammatory bowel disease and depression (Medicina (Kaunas). 2023 Jul; 59(7): 1240).
  • the control group, restraint group, fluoxetine group, Lactobacillus brevis KU15152 intake group, Lactobacillus buchneri KU200793 intake group, and Lactobacillus plantarum KU210152 group were orally administered to mice.
  • the chromosome of Lactobacillus plantarum KU210152 strain is circular, and the entire base sequence of the circular chromosome was reconstructed through genome sequence analysis.
  • the antioxidant-related peroxiredoxin gene was identified, which shows antioxidant function related to cognitive function and depression.
  • the gene of glutamate decarboxylase (GAD) was identified, and since GAD is a key enzyme in GABA synthesis, it can be known that it can affect GABA production related to brain health.
  • Lactobacillus plantarum KU210152 strain was confirmed to be compliant with the Ministry of Food and Drug Safety guidelines.
  • the present invention confirmed the probiotic properties of Lactobacillus plantarum KU210152, a novel strain isolated from kimchi, through confirmation of acid resistance, bile resistance, intestinal adhesion ability, and enzyme production ability, the neuroprotective effect in a neuronal cell line, and the depression alleviating effect through an animal model induced by restraint stress depression.
  • the present invention is an invention carried out through the following tasks.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 김치에서 분리된 신규한 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 상기 조성물은 내산성, 내담즙성 및 장부착능과 같은 프로바이오틱 특성을 나타내며, 산화 스트레스에 대한 신경 보호 효과 및 우울증 완화 효과가 탁월하여 다양한 신경 질환 및 우울증의 증상 완화, 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 체내에 들어가 건강에 유익한 효과를 주는 살아 있는 균을 의미하며, 효능으로는 항산화능, 항염증능, 콜레스테롤 저하능, 항당뇨 등이 알려져 있고, 상기 특성은 균주마다 차이가 있는 것으로 보고되고 있다.
뇌의 기능 변화는 장의 생리적 기능에 영향을 주고, 이 영향은 장내 미생물총까지 미칠 수 있다. 한편, 장내미생물총이 생산하는 대사물은 혈중으로 뇌혈관장벽을 통과해 뇌 기능에 영향을 줄 수 있다고 보고되고 있다. 이렇게 장에 존재하는 신경세포들은 뇌를 포함한 중추신경계와 지속적으로 양방향 소통을 이루게 되는데, 이를 장-뇌 축(gut-brain axis)이라고 부른다.
비특허문헌 1에 따르면, 우울증 환자의 장내 미생물 군집의 구성이 건강한 사람들과 다르다고 개시되어 있다. 특히, 우울증 환자의 장내 미생물 군집에서 유익한 균주인 비피도박테리아와 락토바실러스가 부족한 걸로 보고되고 있으며, 관련 연구들은 장내 미생물 군집의 변화가 우울증 발생에 영향을 미칠 수 있으며 심리적 스트레스와도 관련이 있는 가능성을 제기하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명에서는 김치에서 분리한 신규 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주의 프로바이오틱스로서의 특징인 신경세포주에서 신경 세포 보호 효과 및 동물실험을 통한 우울증 완화 효과를 확인함으로써 신경 질환 치료에 기여할 수 있는 가능성을 확인하였다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 001) Barandouzi ZA et al, Altered Composition of Gut Microbiota in Depression: A Systematic Review. Front Psychiatry. 2020 Jun 10;11:541.
본 발명의 목적은 신규 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152 를 이용하여 신경질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명은 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주는 ⅰ) 내산성, 내담즙성 및 장부착능; ⅱ) β-글루코시다아제(β-glucosidase) 또는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 생성; ⅲ) ROS 생성 감소; ⅳ) BDNF 및 TH 발현 증가; ⅴ) TPH-1, SERT 및 HTR2A의mRNA 발현 증가; ⅵ) 자당 선호도 증가; ⅶ) 혈청 코르티코스테론 유지; ⅷ) 박테로이데스 속 균주 증가; 또는 ⅸ) 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 및 부티르산(butyric acid) 합성 증가 효과를 가져, 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애를 위한 약학적 또는 식품 조성물 및 동물 사료 첨가제 조성물로 활용이 가능하다.
도 1은 구속 스트레스를 통해 마우스 모델에 우울증을 유도하는 실험 디자인이다.
도 2는 신규 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152의 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열 일부의 염기서열 분석(partial sequencing)을 통한 계통도이다.
도 3은 MTT 분석을 통해 확인한 균주 유래 대사 산물(conditioned medium, CM)의 신경 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 4는 H2O2 농도에 따른 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 5는 MTT 분석을 통해 확인한 균주 유래 CM의 신경 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 6은 균주 유래 CM과 H2O2를 처리한 SH-SY5Y 세포의 형태적 변화를 비교한 결과이다.
도 7은 균주 유래 CM과 H2O2를 처리한 SH-SY5Y 세포의 ROS 생성을 비교한 결과이다.
도 8은 인간 유래 대장암 세포에 락토바실러스 사균체를 처리했을 때 BDNF와 TH 발현량을 RT-PCR을 이용해 측정한 결과이다.
도 9는 H2O2로 독성을 유도한 균주 유래 CM을 처리한 신경 세포의 BDNF와 TH의 유전자 발현량을 측정한 결과이다.
도 10은 균주 유래 CM과 H2O2를 처리한 신경 세포의 Bax와 Bcl-2의 유전자 발현 비율을 나타낸 결과이다.
도 11의 (A) 및 도 11의 (B)는 각각 신경 세포에 균주 유래 CM과 H2O2를 처리한 후 카스파제-9(Caspase-9) 및 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 측정한 결과이다.
도 12의 (A), 도 12의 (B) 및 도 12의 (C)는 각각 두유 요거트를 발효하는 시간 동안 pH, 적정 산도 및 생균수 변화를 측정한 결과이다.
도 13의 (A), 도 13의 (B) 및 도 13의 (C)는 각각 두유 요거트의를 저장하는 기간 동안 pH, 적정 산도 및 생균수 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 MTT 분석으로 측정한 두유 요거트의 신경 세포 독성 평가 결과이다.
도 15는 H2O2 농도에 따른 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 16은 MTT 분석으로 측정한 두유 요거트의 신경 세포 보호 효과 결과이다.
도 17은 두유 요거트와 H2O2를 처리한 SH-SY5Y 세포의 형태적 변화를 비교한 결과이다.
도 18은 두유 요거트와 H2O2를 처리한 SH-SY5Y 세포의 ROS 생성을 비교한 결과이다.
도 19는 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 시간 당 체중 변화를 비교한 결과이다.
도 20은 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 자당 선호도를 비교한 결과이다.
도 21은 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 꼬리 현수 시험 결과이다.
도 22는 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 개방장 검사 결과이다.
도 23은 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 십자형 높은 미로 시험 결과이다.
도 24는 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발균주 섭취에 따른 소장 및 대장 조직의 SERT mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 25는 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발균주 섭취에 따른 소장 및 대장 조직의 TPH-1 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 26은 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발균주 섭취에 따른 전액골 피질조직의 HTR2A 및 SERT mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
도 27은 구속 스트레스 우울증 모델에서 선발 균주 섭취에 따른 혈청 내 코르티코스테론 함량 측정 결과이다.
도 28은 구속 스트레스 우울증 모델에서 박테로이드 속의 구성을 비교한 결과이다.
도 29는 구속 스트레스 우울증 모델에서 칼프로텍틴 수치를 분석한 결과이다.
도 30은 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주의 게놈 지도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 어느 구성요소 또는 어느 단계를 "포함한다"고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소 또는 다른 단계를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소 또는 다른 단계를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "투여"는 개체의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 개체 내로 소정의 물질을 배치 하는 것을 의미한다. 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 신경질환 관련 증상이 호전될 수 있도록 하거나, 이롭게 될 수 있도록 하는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "사균체"는 균주를 배양한 생균체의 열처리를 통해 제조되는 형태를 의미하는 것으로, 균주의 활성이 일어나지 못하도록 한 형태로 서, 세포질, 박테리오신 등의 항균 활성 물질, 유기산 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주를 제공한다.
[규칙 제91조에 의한 정정 22.08.2024]
상기 균주는 2023년 7월 25일자로 한국미생물보존센터로부터 수탁번호 KCCM 13371P를 부여받았다. 상기 균주(KCCM 13371P)는 락토바실러스 플란타룸의 으로서, 락토바실러스 플란타럼은 그람양성의 간균으로 약간의 호기성을 띄는 균주로 자연계에서 가장 분포가 넓은 유산균 중 하나이다. 락토바실러스 플란타럼은 정상 유산 발효를 하며 대표적인 김치 유산균으로서 아라비노스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 슈크로스, 덱스트란 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 유제품이나 피클이나 김치와 같은 침채 류, 토마토 등에서 분리되며 특히 김치의 발효 후기에 김치의 발효가 많이 되어 신맛이 날 때 주로 생장하여 우점하게 되면서 다른 종의 생육을 억제하는 균으로 통상적으로 내산성, 내담즙성 및 장부착능이 우수한 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 균주는 인체 내에서 암을 유발하는 효소인 β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)를 생산하지 않으며, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 시스로플록사신에 대한 항생제 내성과 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜 및 독시사이클린에 대한 항생제 감수성을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양액으로 제조될 수 있지만, 25℃내지 45℃에서 10시간 내지 50시간동안 배양한 후, 70℃내지 90℃에서 10분 내지 1시간 동안 최적 열처리 하여 사균체로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 신경 세포 사멸은 산화적 스트레스에 의해 유도된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 1 X 106 CFU/mL 내지 1 X 1011 CFU/mL의 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 X 108 CFU/mL 내지 1X 1010 CFU/mL의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 ⅰ) 내산성, 내담즙성 및 장부착능; ⅱ) β-글루코시다아제(β-glucosidase) 또는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 생성; ⅲ) ROS 생성 감소; ⅳ) BDNF 및 TH 발현 증가; ⅴ) TPH-1, SERT 및 HTR2A의 mRNA 발현 증가; ⅵ) 자당 선호도 증가; ⅶ) 혈청 코르티코스테론 유지; ⅷ) 박테로이데스 속 균주 증가; 또는 ⅸ) 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 및 부티르산(butyric acid) 합성 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
균주의 내산성 및 내담즙성이 우수한 경우, 섭취 시 장내에 무사히 도달할 수 있으며, 장부착능이 우수한 경우, 장내에 안정적으로 정착될 수 있다.
상기 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 또는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)는 탄수화물의 대사 및 유산균의 생존과 기능에 핵심적인 역할을 하는 효소로, β-글루코시다아제는 다양한 식물성 식품에 있는 글루코사이드를 분해하고, β-갈락토시다아제는 주로 락토오스를 분해하는 역할을 하며, 유산균의 생존과 성장에 필수적인 효소이다.
상기 ROS는 활성산소(Reactive Oxygen Species)로, 화학적 반응도가 높아 세포를 구성하고 있는 유전자, 단백질, 지질 등 여러 물질들과 반응해 세포 기능 물질들을 변화시켜 제 기능을 하지 못하게 하고 세포 손상을 가져오게 만든다. 이러한 활성산소는 암, 당뇨병, 퇴행성 신경 질환 등 여러 가지 질병을 악화시키는 요인으로 작용하고 있다.
상기 BDNF는 뇌 유래 신경 영양인자(Brain-derived neurotrophic factor)로, 성장요소의 일부인 신경 영양인자(neurotrophic factor) 집단 중 하나이다. 우울증, 조현병, 강박장애, 치매, 알츠하이머병, 레트 증후군, 헌팅턴병, 신경성 식욕부진증, 폭식증, 뇌전증을 가진 경우 BDNF의 발현이 감소되는 경향이 있다.
상기 TH는 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)로, 도파민의 합성을 조절하는 주요 인자이다. 일례로, 파킨슨병 증상이 악화되는 경우 티로신 수산화효소가 적게 발현되는 경향이 있다.
상기 TPH-1(tryptophan hydroxylase-1)은 주로 장관이나 감각신경세포에서 발현되며, 트립토판을 세로토닌이라는 신경전달물질로 합성하는 효소로써 뇌의 세로토닌 발현 정도의 지표로 사용될 수 있다.
세로토닌(serotonin)은 5-히드록시트립타민(5-HT; 5-Hydroxytryptamine)이라고도 불리는 모노아민 신경전달 물질 중 하나로, 트립토판에서 유도되는 신경전달물질이다. 세로토닌이 결핍되는 경우 우울증이 유발될 수 있다.
상기 SERT(serotonin transporter)는 세로토닌 수송체로, 세로토닌의 신호 전달 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 세로토닌은 중추 신경계에서 다양한 신경 전달 작용을 담당하는데, 그 중 일부는 수용체에 결합하여 신호를 전달하는 것이다. 세로토닌 수송체는 세포막에 존재하며 세로토닌의 수준 및 신호 전달을 조절한다.
상기 HTR2A는 5-하이드록시트립타민 수용체 2A(5-Hydroxytryptamine Receptor 2A)로, 세로토닌이 결합하여 신호 전달을 수행하는 단백질인 5-HT 수용체(5HTRs; 5-HT receptors)의 서브 유형 중 하나이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합할 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 혼합물 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우진지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 식품용 조성물에서의 식품은 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 첨가제, 부형제 및 희석제 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제 (합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정되는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 식품 조성물이 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 천연 탄수화물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 및 과육 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 사료첨가제 조성물은 사료에 첨가될 수 있으며, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단 세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다.
상기 사료 첨가제 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다.
상기 사료 첨가제 조성물이 동물 사료용 첨가제로 사용되는 경우, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 재료 및 방법
1-1. 사용된 균주
락토바실러스 람노서스 GG균주를 표준균주로 사용하였다. 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 김치로부터 MRS 배지를 이용하여 분리하였다. 상업용 스타터인 ABT-B에서 분리한 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) P206 균주를 두유 요거트 제조 시 스타터로 사용하였다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 균주의 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열 일부의 염기서열을 분석(partial sequencing)하여 나온 결과는 다음과 같다.
서열번호1: GAATTGACGGGGGCCGCCCAAGCGGTGGAGCTGTGGTTAATTCCAACCTCCCAAGAACCTTACCGGCTTTGAATCTATTCAAATT
상기 균주의 계통도는 도 2에 도시된 바와 같으며, 2023년 7월 25일자로 한국미생물보존센터로부터 수탁번호 KCCM 13371P를 부여받았다.
1-2. 내산성, 내담즙성 및 장부착능 측정
균주의 내산성은 0.3% 펩신을 포함하는 MRS 액체배지를 pH 2.5로 조정한 후 균주를 접종하고 37℃에서 3시간 배양한 후의 균 수를 초기 접종 균 수와 비교하였다. 내담즙성은 0.3% 담즙산을 포함하는 MRS 액체배지에 균주를 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후의 균 수를 초기 접종 균 수와 비교하였다.
인간유래 장 상피세포인 HT-29 세포주를 24-웰 플레이트에 접종하여(1Х105 cells/mL) 배양한 후, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주(8 log CFU/mL)를 접종하였다. 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 세포에 부착되지 않은 균을 제거하기 위해 PBS로 세 번 세척하고, 세포에 부착된 균은 1%의 트리톤 X-100 용액으로 세포로부터 분리시켰다. 균을 적정배수로 희석하여 MRS 한천배지에 평판 도말한 후, 37℃에서 배양하여 부착된 균 수를 측정하였다. 초기 접종 균 수와 부착한 균 수를 비교하여 장부착능을 계산하였다.
락토바실러스 플란타럼 KU210152의 프로바이오틱 특성을 평가하기 위해 내산성 및 내담즙성을 측정하였다. 0.3% 펩신 (pH 2.5) 조건에서 3시간 배양 시, 비교균주인 락토바실러스 람노서스 GG는 98.67%, 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 99.36% 그리고 비교 균주인 락토바실러스 람노서스 GG는 98.35%로 나타났다. 0.3% 담즙산에서 24시간 처리 시, 락토바실러스 람노서스 GG는 94.99%, 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 96.68%로 나타났다.
락토바실러스 플란타럼 KU210152의 장부착능은 5.58% 이고, 이는 1.71%를 보인 락토바실러스 람노서스 GG보다 우수한 수준으로 나타났다(표 1).
L. rhamnosus GG L. plantarum KU210152
인공 위산에 대한 내성(Tolerance to artificial gastric acid) 98.67±1.82% 100.12±1.30%
인공 담즙염에 대한 내성(Tolerance to artificial bile salt) 94.99±0.78% 96.68±0.53%
부착능(Adhesion ability) 1.71±0.26% 5.58±0.12%
1-3. 효소 생산능 측정
[규칙 제91조에 의한 정정 22.08.2024]
API ZYM 키트를 사용하여 균의 효소 생산능을 평가하였다. 24시간 배양한 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152를 PBS에 9 log CFU/mL로 희석한 후 사용하였다. 효소 활성도는 색 변화 강도에 따라 평가하였다.
락토바실러스 플란타럼 KU210152가 유용 혹은 유해 효소를 생산하는지 알아보기 위해 효소 생성능 실험을 진행하였다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 모두 발암효소로 알려져 있는 β-글루쿠론산분해효소(β-glucuronidase)를 생성하지 않았다. 더하여 두가지 균 모두 두유 발효에 유익한 β-글루코시다아제(β-glucosidase)와 유당 분해에 유익한 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 생성하였다(표 2).
효소 L. rhamnosu s GG L. plantarum KU210152
대조군(Control) 0 0
알칼리 염산염(Alkaline phosphate) 2 2
에스테레이스(Esterase) 1 1
에스테레이스 지방분해효소(Esterase lipase) 1 1
지방분해효소(Lipase) 1 1
류신 아릴아미다제(Leucine arylamidase) 3 4
발린 아릴아미다제(Valine arylamidase) 4 3
시스틴 아릴아미다제(Cystine arylamidase) 2 2
트립신(Trypsin) 0 0
α- 키모트립신(α- Chymotrypsin) 0 0
산성 포스파타제(Acid phosphatase) 3 3
나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제 (Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase) 2 2
α-갈락토시다아제(α-Galactosidase) 1 1
β-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 4 4
β-글루쿠론산분해효소(β-Glucuronidase) 0 0
α-글루코시다제(α-Glucosidase) 1 1
β-글루코시다제(β-Glucosidase) 3 3
N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase) 4 4
α-만노시다제(α-Mannosidase) 0 0
α-푸코시다제(α-Fucosidase) 0 0
0, 0 nM; 1, 5 nM; 2, 10 nM; 3, 20 nM; 4, 30 nM; and 5,≥40 nM
실시예 2: 신경 세포주에서 신경 세포 보호능 관련 실험
2-1. 사균체 및 균주 유래 대사산물(conditioned medium; CM)의 제조
락토바실러스 균주를 MRS 배지에서 24시간 배양한다. PBS로 2번 세척한 뒤, 80℃에서 30분 동안 열처리하여 사균체를 제조하였다. 인간유래 장 상피세포 HT-29를 6-웰 플레이트에 접종하여(5Х105 cells/mL) 5일 동안 배양한 후, 락토바실러스 사균체(1Х109 CFU/mL)를 접종하여 24시간 배양한다. 상등액을 수거하여 14,000Хg, 4℃에서 10분 원심분리한 후 0.45 μM 필터를 사용해 필터링하여 균주 유래 대사산물(conditioned medium; CM)을 제조하였다.
2-2. 두유 요거트 제조 및 생균수, pH, 적정산도 측정
두유를 90℃에서 10분 가열하여 살균한 후, 42℃까지 식혔다. 스타터로 사용된 스트렙토코커스 써모필러스 P206을 MRS 배지에서 18시간 배양한 후, 각 요거트에 1%씩 접종하였다. 프로바이오틱 두유 요거트는 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균을 각각 1% 접종하였다. pH 값이 4.5에 도달할 대까지 42℃에서 발효하였고, 제조된 요거트는 21동안 4℃에서 보관하였다. CY는 스타터로만 발효한 두유 요거트, GY는 스타터와 락토바실러스 람노서스 GG로 발효한 두유 요거트, PY는 스타터와 락토바실러스 플란타럼 KU210152로 발효한 두유 요거트를 나타낸다.
두유 요거트의 발효시간과 저장기간 동안 생균수, pH, 적정산도를 측정하였다. 생균수는 MRS 배지에 평판 도말하여 확인하였다. pH와 적정산도는 pH 미터를 사용하여 측정하였다. 적정산도는 10 g의 두유 요거트를 10 mL의 증류수와 혼합한 뒤 pH 8.3으로 증가할 때까지 적정한 0.1N 수산화나트륨(NaOH) 양을 측정하여 계산하였다. 적정산도는 하기 식 1에 따라 계산하였다.
[식 1]
Figure PCTKR2024008959-appb-img-000001
스타터와 락토바실러스 균주 2종을 사용하여 세가지 두유 요거트를 제조하였다. 세가지 요거트 CY, GY, PY는 모두 발효 6시간 동안 초기 pH 약 6.7에서 발효가 끝난 후 각각 pH 4.6, 4.4, 4.5의 값을 나타냈다. 적정산도는 점진적으로 증가하였다. CY는 0.10%에서 0.47%, GY는 0.10%에서 0.60%, PY는 0.10%에서 0.50%로 증가를 보였다. 생균수도 발효 동안 증가하였다. CY는 7.22-8.87 log CFU/mL, GY는 7.47-9.00 log CFU/mL, PY는 7.54-9.00 log CFU/mL의 변화를 보였다(도 12 참조).
두유 요거트를 21일 동안 저장하며 7일마다 특성을 확인하였다. 세가지 요거트의 pH는 CY는 약 4.5, GY는 약 4.3, PY는 약 4.4 정도로 일정하게 유지되었고, 적정산도의 경우 CY, GY, PY는 각각 약 0.47%, 0.61%, 0.52% 정도로 유지되었다. 생균수는 저장기간동안 감소하였다. CY는 8.80 log CFU/mL에서 8.45 log CFU/mL, GY는 8.92 log CFU/mL에서 8.24 log CFU/mL, PY는 8.62 log CFU/mL에서 7.96 log CFU/mL로 변화를 나타내었다(도 13 참조).
2-3. 요거트 상등액 제조
세포실험에 사용하기 위하여 두유 요거트 상등액을 제조하였다. 요거트 10 g을 멸균 증류수 2.5 mL와 혼합한 후, 14,240Хg, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 얻어낸 상등액을 1M NaOH를 사용하여 pH 7.0까지 조정하였고 다시 원심분리하여 상등액을 얻어내어 0.45 μM 필터로 여과하였다.
2-4. 신경 세포 사멸 보호 효과 측정
신경 세포 SH-SY5Y에 대한 샘플의 세포 독성 여부와 산화적 스트레스인 H2O2에 대한 세포 보호 효과를 측정하기 위해 MTT 분석을 시행하였다. SH-SY5Y 세포(1Х106 cells/mL)를 96-웰 플레이트에 24시간 배양했다. 샘플의 독성 여부를 평가하기 위하여 샘플을 처리한 후, 24시간 배양했다. 신경 세포 보호 효과를 확인하기 위하여 샘플을 4시간, H2O2를 20시간 처리하여 배양한다. 이후 배지를 제거하고 MTT (5 mg/mL)를 4시간 동안 처리한다. 반응한 MTT 용액을 제거하고 100 μL의 DMSO 용액을 첨가하여 20분간 반응시켜 결정을 녹여 주었다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 식 2에 따라 세포 생존율을 계산하였다.
[식 2]
Figure PCTKR2024008959-appb-img-000002
1) 균주 유래 CM의 신경 세포 사멸 보호 효과 및 세포의 형태적 변화 측정
균주 유래 CM의 신경 세포 사멸 보호 효과를 확인하기 전, MTT 분석을 수행하여 균주 유래 CM의 세포 독성 여부를 평가하였다. 두 가지 균 모두 신경 세포에 대하여 독성을 보이지 않았다(도 3 참조).
산화적 스트레스인 과산화수소(H2O2)를 0에서 300 μM 농도로 처리하여 세포 생존률을 확인하였다. 150 μM에서 50.92%의 생존률을 보였기 때문에 차후 균주 유래 CM 실험에서 이 농도를 사용하였다(도 4 참조).
신경 세포에 균주 유래 CM과 산화적 스트레스를 유발하는 H2O2를 처리하여 신경 세포 보호 효과를 측정하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 설정하였을 때, H2O2만을 처리한 세포의 생존율은 52.85%를 나타냈다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM과 H2O2를 처리하였을 때는 각각 58.75%, 73.38%의 생존율을 보였다(도 5 참조).
샘플의 보호 효과를 확인하기 위하여 신경 세포의 형태적 변화를 관찰하였다. SH-SY5Y 세포(1Х106 cells/mL)를 24시간 배양한 후, 샘플 4시간, H2O2를 20시간 처리하여 현미경으로 세포의 형태를 확인하였다(도 6 참조).
H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군 세포는 세포체와 신경돌기가 선명하게 관찰된다. H2O2를 처리한 양성 대조군 세포에서는 세포의 응집과 수축이 발견된다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM을 처리한 경우 세포 손상이 약화되어 음성 대조군과 유사한 모습을 보였다.
2) 두유 요거트의 신경 세포 사멸 보호 효과 및 세포의 형태적 변화
두유 요거트의 신경 세포 보호 효과를 확인하기 전, MTT 분석을 진행하여 두유 요거트 샘플의 세포 독성 여부를 평가하였다. 두유 요거트 샘플을 3가지 농도로 나누어 진행하였다. 샘플의 원액은 40% 이하의 세포 생존률을 보여 독성이 나타내는 것으로 판단하였다. 세가지 요거트의 1/2 희석액, 1/4 희석액은 신경 세포에 대하여 100%에 가까운 생존률을 보였기 때문에 독성이 없는 것으로 판단하였다. 따라서 차후 실험에서 1/2 희석액과 1/4 희석액을 사용하였다(도 14 참조).
산화적 스트레스인 H2O2를 0에서 300 μM 농도로 처리하여 세포 생존률을 확인하였다. 200 μM 농도에서 48.32%의 생존률을 보였기 때문에 차후 실험에서 이 농도로 실험을 진행하였다(도 15 참조).
신경 세포에 두유 요거트 샘플과 H2O2를 처리하여 MTT 분석을 진행하였다(도 16 참조). H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군을 100%로 설정했을 때, H2O2만을 처리한 세포의 생존률은 45.68% 였다. 1/2 희석액에서는 CY, GY, PY가 각각 22.93%, 37.81%, 57.38%를 보였고, 1/4 희석액에서는 CY, GY, PY가 각각 46.54%, 54.05%, 63.57%를 보였다. 전반적으로 CY는 신경보호 효과를 나타내지 않았으며, 1/4 희석액이 더 높은 세포 생존률을 보였다. 특히 PY는 1/4 희석액에서 높은 신경 보호 효과를 보였다. 따라서 차후 실험에서 1/4 희석 농도를 사용하여 진행하였다.
H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군의 경우에는 신경돌기가 관찰된다. H2O2를 처리한 양성 대조군에서는 세포의 손상이 발견된다. 이러한 손상은 GY와 PY처리 이후 약화된 모습을 볼 수 있다(도 17 참조).
2-5. 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성 측정
신경 세포에 샘플은 처리한 후, 활성산소종 생성을 현미경 촬영을 통해 확인하였다. SH-SY5Y 세포(1Х106 cells/mL)를 12-웰 플레이트에 24시간 배양한 후, 샘플 4시간, H2O2 20시간 동안 처리한다. PBS로 세포를 세척한 후, DCF-DA 시약을 넣고 37℃에서 30분 반응시켰다. 반응이 끝난 세포를 PBS로 세척하고 형광현미경을 통해 ROS 생성을 관찰하였다.
1) 균주 유래 CM 처리 후 신경 세포에서의 ROS 생성
H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군 세포에서는 ROS 생성이 발견되지 않았지만, H2O2를 처리한 양성 대조군에서는 ROS 생성이 증가한 것을 관찰할 수 있다. 이러한 ROS 생성은 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM 처리 이후 현저히 감소한 모습을 보였다(도 7 참조).
2) 두유 요거트의 신경 세포에서의 ROS 생성
H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군 세포에서는 ROS 생성이 거의 없었다. H2O2를 처리한 양성 대조군에서는 ROS 생성이 증가하였다. GY와 PY를 처리한 이후에는 이러한 ROS 생성이 감소한 것을 확인할 수 있다(도 18 참조).
2-6. 인간 유래 대장암세포 및 신경 세포에 대한 유전자 발현 조사
RT-PCR을 진행하여, 대장암세포에 유산균을 처리했을 때 뇌유래신경영양인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), TH(티로신 수산화효소, tyrosine hydroxylase)의 증감 여부와 균주 유래 CM을 신경 세포에 처리했을 때 BDNF, TH, Bax, Bcl-2의 증감 여부를 확인하였다(도 8 참조). HT-29 세포를 5Х105 cells/mL 로 6-웰 플레이트에 배양하고 유산균 사균체를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. SH-SY5Y 세포를 1Х106 cells/mL 로 6-웰 플레이트에 배양하여 균주 유래 CM을 4시간, H2O2를 6시간동안 반응시켰다. 이후 각 세포에서 RNA를 추출한 후 cDNA로 전환하고, RT-PCR을 진행하여 유전자 발현량을 비교하였다.
1) 인간 유래 대장암세포 HT-29의 BDNF 발현량
대장암세포 HT-29 세포에 락토바실러스 사균체를 처리했을 때 BDNF와 TH 유전자의 발현량을 측정하기 위하여 RT-PCR을 진행하였다. 대조군은 유산균 사균체 대신 PBS를 처리하여 실험을 진행하였다. 세포에 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152를 처리했을 때, BDNF 발현량은 각각 대조군에 비해 1.31배, 1.35배 증가하였다. TH 발현량은 각각 1.15배, 1.54배를 나타내었다.
2) 과산화수소로 산화적 스트레스가 유도된 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y에 대한 BDNF와 TH 발현량
균주 유래 CM의 신경 세포 보호 효과를 측정하기 위해 SH-SY5Y에 균주 유래 CM과 H2O2처리 후 BDNF와 TH의 변화량을 RT-PCR을 진행하여 평가하였다(도 9 참조).
H2O2만을 처리한 양성 대조군의 경우 BDNF 발현량이 H2O2를 처리하지 않은 음성 대조군에 비해 0.81배로 감소하였다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM을 처리한 이후 이는 각각 1.36배, 1.93배로 발현되었다. TH 발현량에서는 H2O2만을 처리한 경우 발현량이 0.74배로 감소하였지만, 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM을 처리한 경우 각각 1.42배, 3.25배로 발현량을 나타내었다. 이 결과를 통해 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM이 H2O2로 인한 BDNF와 TH의 감소를 완화시키는 것을 알 수 있었다.
3) 과산화수소로 산화적 스트레스가 유도된 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y에 세포사멸 관련 유전자들(Bax, Bcl-2)에 대한 발현량 측정
균주 유래 CM의 신경 세포 보호 효과를 측정하기 위해 균주 유래 CM과 H2O2를 처리한 후, 세포사멸 유발 인자인 Bax와 세포사멸 억제 인자인 Bcl-2 유전자의 변화량을 RT-PCR로 측정하여 Bax/Bcl-2 비율로 나타내었다(도 10 참조). 신경 세포에 H2O2만을 처리한 양성 대조군의 경우 Bax/Bcl-2 비율이 대조군에 비해 1.83배 증가하였으나, 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM을 처리했을 경우 각각 0.95배, 0.91배로 비율이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM이 산화적 스트레스로 인한 세포사멸 유도 작용을 완화시키는 것을 확인할 수 있다.
2-7. Caspase-9 및 Caspase-3 활성 측정
Caspase-9 분석 키트(colorimetric)와 Caspase-3 분석 키트(colorimetric)를 사용하여 카스파제 활성을 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 1Х106 cells/mL 로 6-웰 플레이트에 배양하여 균주 유래 CM을 4시간, 이후에 H2O2를 6시간 처리하였다. 세포 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 세포를 용해시킨 후, 10,000Хg에서 1분 원심분리 하여 용해물을 얻어내었다. 각 용해된 샘플의 단백질을 정량하여 100 μg의 단백질을 포함하는 용해물을 세포 라이시스 버퍼에 희석하였다. 희석한 용액 50 μL에 10 mM DTT를 포함하는 2Х반응 버퍼(reaction buffer) 50 μL를 넣어주었다. Caspase-9 확인을 위하여 5 μL의 4 mM LEHD-pNA 기질을 넣었고, Caspase-3 확인을 위하여 5 μL의 4 mM DEVD-pNA 기질을 넣었다. 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 400 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 확인하였다(도 11 참조).
신경 세포에 H2O2만을 처리한 양성 대조군의 경우 caspase-9의 활성이 대조군과 비교하여 156.26%로 증가하였다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM은 각각 101.74%, 92.37%의 효소 활성을 나타내었다. Caspase-3의 활성은 양성 대조군에서 173.37%를 나타냈다. 락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 플란타럼 KU210152 유래 CM 처리 이후 각각 116.86%, 99.55%의 활성을 나타내었다. 이를 통하여 락토바실러스 람노서스 GG 및 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주 유래 CM을 처리한 경우 신경 세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실시예 3: 우울증 완화 효과 확인 실험
3-1. 실험 동물
신규 프로바이오틱스 선발을 위한 구속 스트레스 우울증 유도 동물모델의 수립을 위하여 C57BL/6 마우스를 이용하여 연구를 진행하였다(WIKIM IACU 202140). 실험동물은 4주령의 체중 14-17 g 마우스를 ㈜지바이오(Gwangju, Korea)에서 구입하여 이용하였고, 1주일간의 순화기간 후 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 양성대조군인 플루옥세틴(Sigma, MO, USA)은 PBS에 현탁하여 20 mg/kg으로 투여하였다.
실험동물은 대조군(PBS 투여, n=10), restraint군(구속+PBS투여, n=8), 플루옥세틴군(구속+플루옥세틴, n=8), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) KU210152군(109 CFU/200 μL, n=8)으로 나누어 경구 투여하였다. 실험에 사용된 양성대조군인 플루옥세틴(Sigma, MO, USA)은 PBS에 현탁하여 20 mg/kg의 농도로 설정하였다.
7주간 유산균 및 PBS를 투여하고, 구속 스트레스와 플루옥세틴의 투여는 4-7주간 희생 전까지 주 5일간 진행하였다(도 1). 구속 스트레스는 50 mL 코니칼 튜브를 이용하여 제작하였고, 1일 4시간씩 구속하여 우울증을 유도하였다(도 1).
3-2. 구속 스트레스로 유도한 우울증 모델의 체중 변화
많은 연구에서 구속 스트레스가 체중 감소를 유도하는 것으로 보고되어 있고, 이를 통하여 우울증 유도를 확인할 수 있다. 구속 스트레스로 유도한 우울증 마우스는 입고 후, 매주 체중을 측정하였다(도 19 참조). 유산균과 PBS는 4주간 매일 경구투여하였고, 4주차부터 매일 구속하여 스트레스로 우울증을 유도하였다. 체중은 구속 1주일 후인 5주차부터 변화가 확인되었다.
우울증 환자의 경우 체중이 감소되며, 섭취 장애, 사회활동 감소 등이 원인으로 알려져 있다. 본 실험 결과, 대조군이 가장 높은 체중 변화가 확인되었고, 양성 대조군인 플루옥세틴군이 다음으로 높았다. 5주차에 대조군과 비교해서 플루옥세틴군을 제외하고, 나머지 구속 스트레스 군과 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) KU210152 투여군의 경우 체중의 변화를 확인할 수 없었다. 대조군의 체중 증가 결과를 통해 우울증이 유도되었음을 알 수 있으며, 체중의 변화가 완화된 결과를 통해 우울증이 완화되었음을 알 수 있다.
3-3. 자당 선호도 검사(Sucrose Preference Test, SPT)
SPT는 72시간 동안 똑같은 튜브에 각각 1%(w/v)의 자당(sucrose)과 물을 제공하면서 불규칙한 시간으로 위치를 교체해주는 것으로 자당과 물의 위치에 대한 학습을 배제 시켰다. 72시간 후, LPS와 PBS를 체중에 비례하여 복강투여하고, 24시간 동안 절식시킨 마우스를 케이지 당 1마리로 분리하였다. 4시간 동안 1%(w/v)의 자당과 물을 제공하면서 2시간마다 튜브의 위치를 교체하였다. 튜브는 제공 전과 후에 무게를 측정하여 식 3을 통해 자당 선호도를 측정하였다.
[식 3]
자당 선호도 (%) = 자당 섭취량/(물 섭취량 + 자당 섭취량)Х100
자당 선호도 검사를 통하여 구속 스트레스로 인하여 자당의 선호도 감소로 우울증 유도를 확인하였고, 선발 유산균의 자당 선호도를 확인하여 우울증 완화 효과를 확인하였다(도 20 참조).
구속 스트레스와 PBS를 섭취한 군(Restraint)은 대조군과 플루옥세틴군에 비해 자당의 선호도가 유의적으로 감소한 것으로 측정되었고(p<0.05), 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군에서 자당의 선호도가 높은 것이 확인되었다.
본 결과를 통하여 자당 선호도 검사에서 구속 스트레스로 인하여 우울증이 유도된 것을 확인할 수 있었고, 선발 유산균인 락토바실러스 플란타럼 KU210152를 투여한 군에서 우울증 완화효과가 확인되었다.
3-4. 꼬리현수 시험(Tail Suspension Test, TST)
마우스의 케이지는 행동분석 시험 1시간 전에 미리 실험실의 조명과 환경에 익숙해지도록 옮겨두었다. 마우스의 꼬리에 클라임스토퍼(climbstopper)를 끼우고, 마우스 코에서 바닥까지 20-25 cm에 꼬리를 테이프로 부착하였다. 6분간 촬영하여 360초 동안 부동시간을 합산하여 측정하였다.
TST 시험에서 동물의 부동시간을 측정하여 구속 스트레스로 인한 우울증의 유도와 선발 유산균의 우울증 완화 효과를 확인하였다. TST 시험에서 구속 스트레스와 PBS를 섭취한 군(Restraint)이 대조군과 플루옥세틴군에 비해 부동시간이 유의적으로 높게 측정되었고(p<0.05), 대조군과 선발 유산균주 투여 군간의 부동시간은 유의적 차이가 없었다(도 21 참조).
TST 결과를 통하여 구속 스트레스로 인한 우울증이 유도되었고, 선발 유산균 투여군은 대조군과 양성대조군인 플루옥세틴 투여군간 부동시간의 차이가 없는 것으로 확인되어 선발 유산균이 우울증 완화에 효과가 있음을 확인하였다.
3-5. 개방장 검사(Open Field Test, OFT)
사용된 개방장은 45 cm (l) Х 45 cm (w) Х 40 cm (h)의 크기를 갖는 개폐형 박스를 이용하였고(TSE Systems LTD, Germany), 개방장 내의 실험 전 소음 수준은 10 db로 유지하였다. 마우스를 개방장에 넣고, 10분간 촬영하여 중심부(time in center), 주변부에 머무른 시간(time in periphery)과 두 발을 든 채 주변을 살피는 시간(rearing time)을 측정하였다.
OFT에서 중심부에 머무르는 시간과 주변부에 머무름 시간을 측정하여 구속 스트레스로 우울증이 유도되었는지 확인하였고, 선발 유산균의 우울증 완화 효과를 확인하였다.
중심부에 머무르는 시간은 대조군이 가장 높았고, 구속 스트레스를 준 나머지 군들은 대조군에 비해 중심부에 머무르는 시간이 낮았다. 대조군과 비교하였을 때, 락토바실러스 플란타럼 KU210152를 투여한 군이 유의적인 차이가 없었고, 주변부에 머무르는 시간은 군에 따른 유의적인 차이를 볼 수 없었다(도 22 참조).
3-6. 십자형 높은 미로 시험(Elevated plus maze, EPM)
EPM 시험은 불안 및 우울증상의 행동분석법으로서 오픈 암(open arm)과 클로즈 암(close arm)에 머무르는 시간과 거리를 측정하여, 우울증 유도를 확인할 수 있는 지표로 사용될 수 있다.
분석에 사용된 EPM은 검정색의 아크릴로 제작되었고, 바닥에서 50 cm 높이에 설치된 십자형(+) 미로로서, 4개의 통로 가운데 마주보는 2개(길이 25 cm, 폭 5 cm)는 개방되어 있고, 크기가 동일한 다른 2개의 통로는 높이 16 cm의 벽으로 구성되어 있다. 중심 플랫폼은 가로 5 cm 및 세로 5 cm로 하였고, 미로 중앙부 천장에서 6분간 촬영을 진행하여 분석하였다.
Open arm에 머무르는 시간은 대조군에 비해 구속 스트레스로 우울증을 유도한 군에서 유의적으로 적게 머무르는 것을 확인하였다. 그러나 선발 유산균인 락토바실러스 플란타럼 KU210152을 투여한 군은 open arm에 머무르는 시간이 양성대조군인 플루옥세틴과 비교하여 좀 더 개선된 머무름 시간을 나타내었다.
본 결과를 통하여 EPM 시험에서 구속 스트레스로 인하여 우울증이 유도된 것을 확인할 수 있었고, 선발 유산균인 락토바실러스 플란타럼 KU210152을 투여한 군에서 open arm과 close arm에 머무르는 시간이 유의적 차이가 없는 것으로 보아 우울증 완화 효과가 있음이 확인되었다(도 23 참조).
3-7. 장 조직 내 우울증 관련 유전자의 mRNA 발현량 확인
마우스를 희생시킨 뒤, 소장과 대장을 분리하여 트립토판 수산화효소-1(tryptophan hydroxylase-1, TPH-1), 세로토닌 수송체(serotonin transporter, SERT), 크로모그라닌(chromogranin A, ChgA), 5-HT 수송체(5HTRs)의 mRNA 발현량을 조사하였다.
조직은 프리필드 구슬 튜브(pre-filled beads tube, Lysing Matrix E, MP Biomedicals, CA, USA)에 옮기고 조직 50-100 mg당 TRIzol 시약(Invitrogen, MA, USA) 1 mL을 첨가하여 비즈 비터(beads beater, BEADBLASTER 24, Benchmark Scientific, NJ, USA)를 이용하여 40초간 2번 진행하였다. 실온에서 5분 간 정치하고, TRIzol 1 mL당 클로로포름 0.2 mL을 첨가하여 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상등액에 이소프로판올 0.5 mL를 첨가하여 4℃, 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 75%(v/v) 에탄올 1 mL 첨가 후 원심분리 5분간 진행하였다. 상등액을 제거하고 30분 내지 1시간 동안 건조한 후, 뉴클라아제 프리 워터(nuclease-free water, Noble Bio, Gyeonggi, Korea)를 0.2-0.3 mL에 RNA를 용해하여 사용하였다.
RNA의 농도는 Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, USA)으로 측정하였고, cDNA의 합성은 1 ng에 해당하는 RNA를 사용하여 cDNA 합성 키트(TOPscriptTM, Daejeon, Korea)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 TOPreal qPCR 2Х premix(Enzynomics, Korea)를 이용하여, 실시간 정량 PCR(Bio-Rad CFX-96, CA, USA) 분석을 진행하였다. 프라이머 염기서열은 표 3과 같다.
유전자 이름 서열 출처
Chromogranin A ChgA_F AGGTCTCTTCCCCCAAGGCG(서열번호 2) Xie et al. (2020)
ChgA_R TCTGAAGCCATAGGCGCGGG(서열번호 3)
Tryptophan hydrolase-1 Tph1_F AAGAAATTGGCCTGGCTTC(서열번호 4)
Tph1_R GTTTGCACAGCCCAAACTC(서열번호 5)
Serotonin transporter SERT_F TATCCAATGGGTACTCCGCAG(서열번호 6)
SERT_R CCGTTCCCCTTGGTGAATCT(서열번호 7)
5-HT receptor 2A 5HTR2A_F CGAAGCCTCGAACTGGACAAT(서열번호 8)
5HTR2A_R CCGCAATGGTGAGAATAATCACG(서열번호 9)
5-HT receptor 4 5HTR4_F AGTTCCAACGAGGGTTTCAGG(서열번호 10)
5HTR4_R CAGCAGGTTGCCCAAGATG(서열번호 11)
5-HT receptor 7 5HTR7_F TAGCCTACTCCAGTGCCAGT(서열번호 12)
5HTR7_R TCCCACAGTGGTCACAGTTT(서열번호 13)
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH_F GGTGAAGGTCGGTGTGAACG(서열번호 14)
GAPDH_R CTCGCTCCTGGAAGATGGTG(서열번호 15)
소장 조직에서 락토바실러스 플란타럼 KU210152을 섭취한 군에서 SERT mRNA의 발현량이 가장 높게 측정되었고, 가장 낮은 발현량을 보이는 restraint 군과 유의적인 차이를 보였다. 대장 조직에서 SERT의 발현량은 모든 군에서 유사하게 나타나 유의미한 결과는 확인되지 않았다(도 24 참조).
소장 조직에서 TPH-1 mRNA 발현량은 SERT 발현량의 결과와 유사하게 restraint 군과 비교하였을 때 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군에서 유의적으로 높게 확인되었다. 대장 조직에서 TPH-1의 발현량은 대조군에서 가장 높게 측정되었고, 대조군과 비교하였을 때 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군의 발현량이 유의적인 차이를 보이지 않았고, restraint 군과 비교하였을 때 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군의 발현량이 유의적으로 높게 나타났다(도 25 참조).
선발 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 우울증 유도 마우스의 장 조직에서 SERT 및 TPH-1의 mRNA 발현량이 높게 확인되었다. 이 결과는 선발 2균주가 세로토닌 합성 및 흡수 기작에 영향을 미침으로써 우울증 완화에 효과가 있는 것으로 판단되었다.
3-8. 뇌 조직 내 우울증 관련 유전자의 mRNA 발현량 확인
BDNF는 신경성장촉진인자 중 하나로서 신경 발달 시 성장과 분화를 유도하는 등 신경계통의 유지와 발달에 중요한 역할을 하고, BDNF가 우울증의 병태생리적 기전과 관련이 있다. 뇌 조직을 얻고, mRNA 발현을 위해 BDNF 프라이머의 서열은 F-CAC TTT TGA GCA CGT CAT CGA A, R-CAC CCG GGA AGT GTA CAA GTC-R를 이용하여 발현량을 분석하였다.
전액골피질(Prefrontal cortex) 조직에서 HTR2A와 SERT의 mRNA 발현량을 측정한 결과, HTR2A의 mRNA 발현량은 대조군, 플루옥세틴군, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군의 발현량이 다른 군 대비 높았으나 SERT의 발현 패턴과 유사하여 유의적 차이는 보이지 않았다(도 26 참조).
SERT의 발현량은 플루옥세틴군이 가장 높게 나타났고, 대조군과 락토바실러스 플란타럼 KU210152 군이 유사하게 나타났다. 이는 장 조직에서의 SERT mRNA 발현량 결과와 유사하였으나, 유의미한 차이는 보이지 않았다. 세로토닌 수용체 중 하나인 HTR2A는 뇌 조직의 세로토닌 수용체로서 우울증 연구에서 많이 분석되는 수용체다.
[규칙 제91조에 의한 정정 22.08.2024]
선발 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 우울증 유도 마우스의 전액골피질(prefrontal cortex)에서 SERT 및 HTR2A의 mRNA 발현량이 높게 확인되었다. 이 결과를 통하여 락토바실러스 플란타럼 KU210152는 세로토닌 합성 및 흡수 기작에 영향을 미치는 것으로 판단된다.
3-9. 혈청 코르티코스테론 측정
신체가 스트레스에 노출되는 경우 스트레스에 대한 반응과 여러 생리 활동을 조절하는 신경 내분비계의 일부인 시상하부-뇌하수체-부신 축(HPA-axis; Hypothalamus-pituitary-adrenal gland axis)이 활성화되며 부신 피질에서 코르티코스테론 수치가 증가하게 된다.
혈청 내의 코르티코스테론 분석을 위하여 마우스 희생 시 혈액을 채혈한 후, 원심분리를 통하여 혈청을 분리하였다. 혈청에 포함된 코르티코스테론의 양을 ELISA 분석(MyBioSource, Inc., CA, USA)으로 측정하였다.
구속 스트레스로 우울증을 유도한 마우스의 혈청 내 코르티코스테론의 함량은 대조군 및 플루옥세틴군에서 코르티코스테론의 함량이 낮게 측정되었으며, 이는 restraint군과 달리 스트레스를 적게 받은 것으로 판단된다. 대조군과 비교하였을 때, restraint군과 락토바실러스 브레비스 KU15152를 섭취한 군은 혈청 코르티코스테론이 유의적으로 높게 측정되었다. 그러나 락토바실러스 플란타럼 KU210152를 투여한 군은 대조군과 유의적인 차이가 없음을 확인하였다(도 27).
상기 실험을 통해 구속 스트레스로 인하여 우울증 유도가 되었음을 확인하였고, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 투여한 군에서 혈청 코르티코스테론의 함량이 대조군 및 플루옥세틴군에서 유의적인 차이가 없어 우울증 및 스트레스 완화 효과가 있음을 확인하였다.
3-10. 우울증 관련 마이크로바이옴 분석
우울증이 있는 경우 γ-아미노부티르산(GABA; γ-aminobutyric acid)의 기능이 변형될 가능성이 높으며, 그람 음성균인 박테로이드 프라질리스균(Bacteroides fragilis)은 GABA의 생성 경로를 활발하게 하여 박테로이드 프라질리스균이 증가할수록 우울증과 관련된 뇌 신호가 줄어드는 것으로 알려져 있다(Nat Microbiol. 2019 March; 4(3): 396-403.). 박테로이드 속의 변화를 확인하기 위해 우울증 마우스 모델을 통해 얻은 분변에서의 마이크로바이옴을 분석하였다.
구분 플루옥세틴
섭취군 		KU15152
섭취군 		KU200793
섭취군 		KU210152
섭취군
섭취전 29.91% 32.07% 29.86% 27.2%
섭취후 33.27% 34.19% 39.07% 44.8%
유의차 3.36 2.12 9.21 17.6
본 미생물 군집 결과에서 정상군과 우울증 유발군에서는 박테로이드 속의 증가가 미비하거나 없지만 전체 미생물 군집에 대비하여 락토바실러스 플란타럼 KU210152 섭취군은 17.6% 증가하여 유산균을 섭취한 모든 시험군에서 우울증 개선에 대한 가능성을 확인하였으며 특히 락토바실러스 플란타럼 KU210152 섭취군에서 개선 효과가 가장 높을 것으로 판단된다(도 28).
3-11. 단쇄지방산(SCFAs 분석)
단쇄지방산(SCFAs; Short-chain fatty acids)은 맹장 및 결장에서 균주의 먹이가 되는 탄수화물의 혐기성 발효를 통해 생성되는 작은 유기 화합물로, 소화, 면역 및 중추 신경계 기능과 관련이 있다. 가장 많이 생성되는 단쇄지방산은 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 및 부티르산(butyric acid)이며, 상기 지방산이 많을수록 우울증이 완화된다고 보고된다(Gen Psychiatr. 2024 Feb 19;37(1):e101374.).
멀티오믹스 분석 중 단쇄지방산(SCFAs; Short-chain fatty acids)은 한국의과학연구원에 의뢰하여 총 49개의 맹장으로 분석했으며, 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 및 부티르산(butyric acid)은 락토바실러스 브레비스 KU15152 섭취군에서 restraint군보다 아세트산의 합성량이 증가하였다.
샘플 SCFAs 농도 (μmol/g)
아세트산 프로피온산 부티르산
대조군 65.31 10.04 65.97
Restraint군 62.41 7.60 60.83
플루옥세틴군 46.45 5.48 55.31
L. brevis KU15152 51.63 7.48 38.56
L. plantarum KU210152 67.30 6.80 53.96
3-12. 칼프로텍틴 분석
칼프로텍틴은 호중구, 대식구, 단구 세포질에 존재하는 염증성 단백질로, 장내 칼프로텍틴 수치를 낮추는 경우 염증성 장 질환과 우울증이 완화되는 것으로 알려져 있다(Medicina (Kaunas). 2023 Jul; 59(7): 1240).
대조군, Restraint군, 플루옥세틴군, 락토바실러스 브레비스 KU15152 섭취군, 락토바실러스 부크너리 KU200793 섭취군 및 락토바실러스 플란타럼 KU210152군을 마우스에 경구 투여하였다.
실험 결과, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 섭취군이 0.170 ng/g에서 0.122 ng/g로 칼프로텍틴 수치가 0.048 ng/g 감소한 것을 확인하였다(도 29). 따라서, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 섭취군에서 우울증을 개선하는 것을 알 수 있다.
3-13. 전장 유전체 분석
락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주의 염색체는 원형 형태이며, 유전체 서열 분석을 통해 원형 염색체의 전체 염기 서열을 재구성하였다. 분석 결과, 항산화 관련 페록시레독신(peroxiredoxin) 유전자가 확인되었으며 이는 인지 기능 및 우울증 관련 항산화 기능을 나타낸다. 또한, 글루탐산 탈탄산효소 (GAD; glutamate decarboxylase)의 유전자가 확인되었으며 GAD는 GABA 합성의 핵심적인 효소이므로, 뇌건강과 관련된 GABA 생산에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다.
[규칙 제91조에 의한 정정 22.08.2024]
Figure WO-DOC-TABLE-6
3-14. 프로바이오틱 안전성
건강기능식품 기능성 원료 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드에 따른 프로바이오틱스 안전성 분석 결과, 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주는 식품의약품안전처 가이드라인에 적합한 것으로 확인되었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 22.08.2024]
Figure WO-DOC-TABLE-7
본 발명은 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 김치로부터 분리한 신규 균주인 락토바실러스 플란타럼 KU210152의 내산성, 내담즙성, 장부착능 및 효소 생산능 확인을 통한 프로바이오틱 특성, 신경 세포주에서 신경 세포 보호 효과 및 구속 스트레스 우울증 유도 동물 모델을 통해 우울증 완화 효과를 확인하였다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것 이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적 인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(KCCM)
기탁기관 주소 : 03641 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내2가길 45 유림빌딩 3F
수탁번호 : KCCM13371P
수탁일자 : 20230725
본 발명은 아래와 같은 과제를 통해 수행되는 발명이다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호]1545027078
[과제번호]321035053SB010
[부처명]농림축산식품부
[과제관리(전문)기관명]농림식품기술기획평가원
[연구사업명]고부가가치식품기술개발
[연구과제명]마이크로바이옴 타겟 프로바이오틱스 발굴 및 소재화 기술
개발
[기여율]1/1
[과제수행기관명]건국대학교 산학협력단
[연구기간]2021.04.01 ~ 2025.12.31

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는　신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주.
  2. 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애인, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 신경 세포 사멸은 산화적 스트레스에 의해 유도된 것인, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 1X106 CFU/mL 내지 1X1011 CFU/mL의 농도로 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 하기 ⅰ) 내지 ⅵ) 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는, 신경 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    ⅰ) 내산성, 내담즙성 및 장부착능;
    ⅱ) β-글루코시다아제(β-glucosidase) 또는 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 생성;
    ⅲ) ROS 생성 감소;
    ⅳ) BDNF 및 TH 발현 증가;
    ⅴ) TPH-1, SERT 및 HTR2A의mRNA 발현 증가;
    ⅵ) 자당 선호도 증가;
    ⅶ) 혈청 코르티코스테론 유지;
    ⅷ) 박테로이데스 속 균주 증가; 및
    ⅸ) 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 및 부티르산(butyric acid) 합성 증가.
  9. 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애인, 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 식품 조성물.
  12. 수탁번호 KCCM13371P로 기탁된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 16S rRNA를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 신규 락토바실러스 플란타럼 KU210152 균주, 이의 배양물 또는 이의 사균체를 포함하는 신경 질환의 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신경 질환은 신경 세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경 질환 또는 정신장애인, 동물 사료 첨가제 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 상기 정신장애는 불안, 우울증, 불면증, 강박 장애, 공황 장애, 지능 장애, 스트레스, 기억 장애 및 인지 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 동물 사료 첨가제 조성물.
PCT/KR2024/008959 2023-10-06 2024-06-27 신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물 Pending WO2025075265A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2023-0133766 2023-10-06
KR20230133766 2023-10-06
KR10-2024-0083582 2024-06-26
KR20240083582 2024-06-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025075265A1 true WO2025075265A1 (ko) 2025-04-10

Family

ID=95283485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2024/008959 Pending WO2025075265A1 (ko) 2023-10-06 2024-06-27 신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025075265A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499263A (zh) * 2019-07-12 2019-11-26 华东理工大学 一种植物乳杆菌x7022及其应用
CN111110705A (zh) * 2019-12-27 2020-05-08 河北一然生物科技有限公司 植物乳杆菌lp45在制备改善记忆力、缓解焦虑和缓解抑郁的产品中的应用
KR102265538B1 (ko) * 2018-02-02 2021-06-16 주식회사 고바이오랩 락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102265538B1 (ko) * 2018-02-02 2021-06-16 주식회사 고바이오랩 락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도
CN110499263A (zh) * 2019-07-12 2019-11-26 华东理工大学 一种植物乳杆菌x7022及其应用
CN111110705A (zh) * 2019-12-27 2020-05-08 河北一然生物科技有限公司 植物乳杆菌lp45在制备改善记忆力、缓解焦虑和缓解抑郁的产品中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDOLI MOHSEN; GUIONNET THOMAS; RAULET MICKAEL; KULUPANA GOSALA; BLASI SAVERIO: "Decoder-Side Intra Mode Derivation For Next Generation Video Coding", 2020 IEEE INTERNATIONAL CONFERENCE ON MULTIMEDIA AND EXPO (ICME), IEEE, 6 July 2020 (2020-07-06), pages 1 - 6, XP033808189, DOI: 10.1109/ICME46284.2020.9102799 *
BOCK HYUN-JI, LEE HYE-WON, LEE NA-KYOUNG, PAIK HYUN-DONG: "Probiotic Lactiplantibacillus plantarum KU210152 and its fermented soy milk attenuates oxidative stress in neuroblastoma cells", FOOD RESEARCH INTERNATIONAL, ELSEVIER, AMSTERDAM , NL, vol. 177, 1 February 2024 (2024-02-01), Amsterdam , NL , pages 113868, XP093300390, ISSN: 0963-9969, DOI: 10.1016/j.foodres.2023.113868 *
CHOI GA-HYUN, BOCK HYUN-JI, LEE NA-KYOUNG, PAIK HYUN-DONG: "Soy yogurt using Lactobacillus plantarum 200655 and fructooligosaccharides: neuroprotective effects against oxidative stress", JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, SPRINGER (INDIA) PRIVATE LTD., INDIA, vol. 59, no. 12, 1 December 2022 (2022-12-01), India , pages 4870 - 4879, XP093300389, ISSN: 0022-1155, DOI: 10.1007/s13197-022-05575-1 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019066599A2 (ko) 신규 유산균 및 이의 용도
WO2018143678A1 (ko) 신규 유산균 및 이의 용도
WO2015122717A1 (ko) 비만 억제 효능을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
WO2021182829A1 (ko) 장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주
WO2017047962A1 (ko) 신규 유산균 및 퇴행성 뇌질환 또는 인지기능 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2023055188A1 (ko) 신규 프로바이오틱스 및 이의 용도
WO2022265431A1 (ko) 대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 조절 t 세포의 병용 투여 용도
WO2017047968A1 (ko) 다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도
WO2017204374A1 (ko) 혈당 조절 효능을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
WO2021221398A1 (ko) 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스
WO2021066549A1 (ko) 락토바실러스 애시도필러스 kbl409 균주 및 그 용도
WO2025063597A1 (ko) 락토바실러스 플란타룸 hac03 균주 및 루틴을 포함하는 비만 또는 인슐린 저항성 증후군 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2024136615A1 (ko) 대장염 예방 또는 치료활성 및 장내 유해균에 항균활성을 지닌 락토바실러스 및 그의 용도
WO2022240224A1 (ko) 젤란검을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선용 조성물 및 이를 포함하는 대사성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2018004224A2 (ko) 신규 스포리치아과 미생물 및 그의 용도
WO2024172621A1 (ko) 신규 락토코커스 락티스 아종 락티스 균주 및 이의 용도
WO2024136036A1 (ko) 락토바실러스 브레비스 ku15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물
WO2024096389A1 (ko) 락토바실러스 퍼멘텀 srk414 균주를 포함하는 인지기능장애 및 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2025075265A1 (ko) 신규 락토바실러스 플란타럼 균주를 포함하는 신경질환 또는 우울증 예방 또는 치료용 조성물
WO2025023787A1 (ko) 락토바실러스 부크너리 200793 균주를 포함하는 우울증 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2022005035A1 (ko) 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주 및 이의 사균체 id-bbr4401
WO2021225363A1 (ko) 해양 유래 진균 페니실리움 글라브룸 sf-7123의 대사체를 포함하는 항염증 또는 항당뇨용 조성물
WO2024117700A1 (en) Food and pharmaceutical composition containing novel aldehyde dehydrogenase for improving memory and cognitive function
WO2024038980A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 ku15120 균주 또는 이의 용도
WO2021020700A1 (ko) 락토바실러스 가세리 swpm102를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24874824

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1