WO2023090427A1

WO2023090427A1 - シート状網膜組織の製造方法

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Publication number: WO2023090427A1
Application number: PCT/JP2022/042876
Authority: WO
Inventors: 道子万代; 政代高橋; 優山▲崎▼; 茉莉堀内
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd; RIKEN
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-05-25
Anticipated expiration: 2024-05-19
Also published as: IL312856A; KR20240103018A; EP4428227A4; CA3238664A1; AU2022390766A1; EP4428227A1; TW202330906A; US20250019652A1; CN118302517A; JPWO2023090427A1

Abstract

層構造を有する網膜組織を含む細胞凝集体の製造方法であって、分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養することを含み、上記網膜系細胞集団が、網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む、製造方法。

Description

シート状網膜組織の製造方法

　本発明は、シート状網膜組織の製造方法及びシート状網膜組織に関する。

　近年、マウス生体の正常な網膜において、適切な分化段階の視細胞前駆細胞を移植すると、機能的に生着することが報告され（非特許文献１）、網膜色素変性等の視細胞の変性疾患に対する移植治療の可能性が示された。

　自己組織化培養による多能性幹細胞から立体網膜組織への分化誘導方法が多数報告されており、層構造を有する立体網膜組織を製造し移植することが可能になりつつある。例えば、多能性幹細胞から多層の網膜組織を得る方法（非特許文献２及び特許文献１）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、得られた凝集体を基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することによって、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献３及び特許文献２）、及び、多能性幹細胞の凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することによって網膜組織を得る方法（非特許文献４及び特許文献３）等が報告されている。しかし、これらの網膜組織は、スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状の細胞凝集体として製造されており、シート状の（平坦化した）網膜組織を製造する方法は知られていない。

　一方、ニワトリにおいて、Ｗｎｔ２ｂが網膜の上皮構造形成に効果を示すことが報告されているが（非特許文献５）、ニワトリ以外の生物における同様の効果は報告されていない。

国際公開第２０１１／０５５８５５号国際公開第２０１３／０７７４２５号国際公開第２０１５／０２５９６７号

Maclaren RE et al., "Retinal Repair by Transplantation of Photoreceptor Precursors", Nature, 444, 203-207, (2006) Eiraku M. et al., "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture", Nature, 472, 51-56, (2011) Nakano T. et al., "Self-formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina From Human ESCs" Cell Stem Cell, 10(6), 771-785, (2012) Kuwahara A. et al., "Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue" Nature Communications, 6, 6286, (2015) Nakagawa, S. et al., "Identification of the laminar-inducing factor Wnt-signal from the anterior rim induces correct laminar formation of the neural retina in vitro." Developmental Biology, 260, 414-425, (2003)

　そこで、本発明は上記事情に鑑みて、網膜系細胞から網膜組織の神経上皮構造を再形成させる方法及び当該方法を応用したシート状網膜組織の製造方法、並びにシート状網膜組織を提供することを目的とする。また、副次的に、出発細胞としてより好ましい網膜前駆細胞の精製方法、及び、上記により製造した広いシート状網膜組織の剥離方法の提供も目的とする。

　本発明者らは、分散した網膜系細胞を出発細胞として、神経上皮構造を再形成させ、シート状網膜組織を製造することを着想した。しかし、網膜系細胞を分散化することで細胞のＡｐｉｃａｌ－Ｂａｓａｌの極性が崩れてしまい、神経上皮構造が再形成されないという課題があることが判明した。

　この課題に対し、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、分散化した網膜系細胞にＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加することで、上記課題が解決することがわかった。また、より良好な神経上皮構造を再形成させるために、本発明者らは、鋭意研究を行った。その結果、（１）ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及び／又は線維芽細胞増殖因子をさらに添加すること、（２）特にシート状での良好な神経上皮構造の再形成のためには細胞接着の足場となる細胞外マトリクスをコーティングした培養プレート上で培養すること、並びに（３）出発細胞として網膜前駆細胞の純度を向上させることにより、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）などの不純細胞が除去されることをさらに見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
［１］
　上皮構造を有する網膜組織の製造方法であって、
　分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養することを含み、
　上記網膜系細胞集団が、網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む、製造方法。
［２］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質である、［１］に記載の製造方法。
［３］
　上記培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
　上記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、［３］に記載の製造方法。
［５］
　上記ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質が、ＳＡＧ、ＰＭＡ及びＳＨＨからなる群から選択される１以上の物質である、［３］又は［４］に記載の製造方法。
［６］
　上記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である、［３］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養することを含み、上記上皮構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織である、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
　上記接着培養が、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を用いて行われる、［７］に記載の製造方法。
［９］
　上記培養容器の培養面が、上記温度感受性ポリマーでコーティングされ、上記温度感受性ポリマーの上面が、上記細胞外マトリクスでコーティングされる、［８］に記載の製造方法。
［１０］
　上記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル及びビトロネクチンからなる群から選択される１以上の物質である、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］
　上記温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、上記シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程をさらに含む、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
　網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む細胞凝集体を分散させて、上記分散された網膜系細胞集団を得る工程を含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
　多能性幹細胞を分化させて、上記網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む細胞凝集体を得る工程を含む、［１２］に記載の製造方法。
［１４］
　上記分散された網膜系細胞集団を浮遊培養又は接着培養する前に、上記分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程をさらに含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
　網膜色素上皮細胞の混入又は分化が抑制される、［１４］に記載の方法。
［１６］
　上記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、上記分散された網膜系細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原を発現する細胞集団を得る工程を含む、［１４］又は［１５］に記載の製造方法。
［１７］
　上記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、上記分散された網膜系細胞集団を、さらにＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程を含む、［１６］に記載の製造方法。
［１８］
　上記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、以下の工程を含む、［１４］～［１７］のいずれかに記載の製造方法：
（１）多能性幹細胞をＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体作用物質からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、細胞凝集体を製造する工程、
（２）細胞凝集体を網膜前駆細胞へ分化誘導させる工程、
（３）細胞凝集体を分散させ、ＣＤ３９に結合する物質と接触させる工程。
［１９］
　上記網膜前駆細胞及び／又は上記視細胞前駆細胞が、上記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の５０％以上を占める、［１］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
　上記網膜前駆細胞及び／又は上記視細胞前駆細胞が、上記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の８０％以上を占める、［１］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
　上記浮遊培養又は接着培養の開始時から、上記分散された網膜系細胞集団を、上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養する、［１］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］
　上記上皮構造において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている、［１］～［２１］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］
　浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造を有する網膜組織を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含む、［１］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］
　前記上皮構造が、多層構造である、［１］～［２３］のいずれか一項に記載の製造方法。
［２５］
　多層構造を有する網膜系細胞層からなるシート状網膜組織であって、
（１）当該多層構造を有する網膜系細胞層が基底面及び頂端面の極性を有し、
（２）上記多層構造を有する網膜系細胞層が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（３）上記網膜系細胞層の各層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっており、かつ、
（４）直径が８ｍｍ以上である、シート状網膜組織。
［２６］
　上記多層構造を有する網膜系細胞層が、上記網膜系細胞層に接合しているシート状網膜色素上皮細胞をさらに含み、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、上記網膜系細胞層の頂端面と上記シート状網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、かつ、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とは両者の間に存在する接着因子により接合している、［２５］に記載のシート状網膜組織。
［２７］
　上記接着因子が細胞外マトリクス又はハイドロゲルである、［２６］に記載のシート状網膜組織。
［２８］
　上記接着因子が、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質である、［２７］に記載のシート状網膜組織。
［２９］
　上記接着因子が、ゼラチン又はフィブリンである、［２７］に記載のシート状網膜組織。
［３０］
　［２５］～［２９］のいずれかに記載のシート状網膜組織を含む、医薬組成物。
［３１］
　［２５］～［２９］のいずれかに記載のシート状網膜組織を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の、治療方法。
［３２］
　網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９f、ＣＤ５７、ＣＤ７３、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ３４０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法。
［３３］
　上記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程を含む、［３２］に記載方法。
［３４］
　上記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程をさらに含む、［３２］又は［３３］に記載の方法。
［３５］
　ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも１つの因子が陽性であり、かつ、Ｒｘ陽性である網膜前駆細胞を、細胞集団の全細胞数に対して９０％以上含む、細胞集団。
［３６］
　上記網膜前駆細胞が、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原が陰性である、［３５］に記載の細胞集団。
［３７］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療に使用するための、［２５］～［２９］のいずれかに記載のシート状網膜組織。
［３８］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬の製造における、［２５］～［２９］のいずれかに記載のシート状網膜組織の使用。

　本発明によれば、網膜系細胞から網膜組織の層構造を再形成させる方法及び当該方法を応用したシート状網膜組織の製造方法、並びにシート状網膜組織を提供することが可能となる。

実施例１において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目の凝集体の再形成状態を示す明視野顕微鏡写真である。実施例１において、１２３１Ａ３由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目の凝集体の再形成状態を示す明視野顕微鏡写真である。実施例２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に再形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。実施例２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後７日目に再形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。実施例２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１４日目に再形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。実施例２において、ＫｈＥＳ－１由来の単一細胞が再形成された凝集体の面積をＩｍａｇｅ　Ｊにて計測した結果を示すグラフである。（Ａ）は播種後１日目、７日目及び１４日目の凝集体の面積を示し、（Ｂ）は播種後１日目の凝集体の面積に対する、７日目及び１４日目の凝集体の面積の比（面積比）を示す。実施例２において、１２３１Ａ３由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１４日目に形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ、Ｃｈｘ１０）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（β-ｃａｔｅｎｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｃｈｘ１０、Ｋｉ６７、Ｐａｘ６）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いてＲｘ::Ｖｅｎｕｓの蛍光を観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ、ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｃｈｘ１０、Ｋｉ６７、Ｐａｘ６）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＣＲＸ、ＲｘＲｇ、ＮＲＬ、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｉｓｌｅｔ－１、Ｂｒｎ３、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例４において、分化日数が１８日目、２５日目、４０日目、６１日目、及び７５日目のＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後３日目、１５日目、２１日目に再形成された凝集体の状態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例５において、分化日数が４０日目のＫｈＥＳ－１由来の凝集体（ＢＭＰ４＋／ＢＭＰ４－）を単一細胞に分散し、播種後３日目、１５日目、２１日目に再形成された凝集体の状態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ）写真である。実施例６において、各種凍結保存液にて凍結保存された分散された網膜系細胞を播種して１日後及び７日後に形成された凝集体の形態を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例６において、各種凍結保存液にて凍結保存された分散された網膜系細胞を起眠した後の生細胞率（Ａ）、及び起眠した網膜系細胞を用いて再形成された凝集体の面積（Ｂ）を示すグラフである。実施例７において、浮遊培養で形成された網膜組織において発現している基底膜を免疫染色した切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。実施例７において、マウスの胎児神経網膜組織において発現しているＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームを調べた結果を示す免疫組織染色像である。実施例８において、条件１～３において、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養でのシート状網膜組織の再形成を確認した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例８において、条件１～３において、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養でのシート状網膜組織の再形成を確認した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例９において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成に対する各種因子の効果を確認した結果を示す明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。実施例９において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成における各種因子の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１０において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度及び添加期間を検討した結果を示す明視野顕微鏡写真、蛍光顕微鏡写真及び共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１０において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度及び添加期間を検討した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１１において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種時の足場を検討した結果を示す明視野顕微鏡写真、明視野及び蛍光顕微鏡写真、並びに、蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１３において、各種因子による網膜細胞の維持効果を検討した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。実施例１４において、網膜前駆細胞の維持培養に有効な条件の検討結果を示す蛍光顕微鏡写真である。実施例１５において、コラーゲン上にて再シート化した結果を示す実体顕微鏡写真である。実施例１６において、再シート化した網膜細胞シートから作製した移植用グラフトを示す蛍光顕微鏡写真である。実施例１６において、移植後網膜の眼底を観察した結果を示す蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例１７において、単一細胞に分散された細胞集団からＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の画分をＳｏｒｔｉｎｇするためのＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。（Ａ）はドットプロットであり、（Ｂ）はヒストグラムプロットである。実施例１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した実体顕微鏡及び蛍光実体顕微鏡写真である。実施例１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇした細胞集団を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例１８において、各種タンパク質を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例１８において、各種低分子化合物を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例１８において、異なる濃度のＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例１９において、Ｓｏｒｔｉｎｇ及びＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例１９において、Ｓｏｒｔｉｎｇ及びＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真並びにＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。実施例１９において、ＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真並びにＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。実施例２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化時の影響を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化時の影響を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真及びＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。実施例２１において、再シート化した網膜シートの継時変化を示す実体顕微鏡、蛍光実体顕微鏡写真である。実施例２２において、表面抗原スクリーニングにおいて着目したマーカーを示す図である。実施例２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。実施例２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。実施例２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。実施例２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。実施例２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。実施例２３において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄへの分化状態を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例２３において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄへの分化状態を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２３において、でＢｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄでのＣＤ３９及びＣＤ７３、ＣＸＣＲ４の発現についてのＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧによる分化誘導の結果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧによる分化誘導後のＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現についてのＦＡＣＳ解析結果並びに数字化したグラフである。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧによる後のＣＤ３９及びＢＶ４２１の発現についてのＦＡＣＳ解析結果並びに異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。実施例２５において、ＣＤ３９の発現を増強し得る物質の検討結果を示すＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。実施例２５において、ＣＤ３９の発現を増強し得る物質の検討結果を示すＦＡＣＳ解析結果を数字化したグラフである。（Ａ）はＣＤ３９陽性かつＲＸ：：ｖｅｎｕｓ陽性の結果であり、（Ｂ）ＣＸＣＲ４陰性かつＲＸ：：ｖｅｎｕｓ陽性の結果である。実施例２６において、ＦＧＦ８－及びＦＧＦ８＋で作製したＩｓｌｅｔ－１　ＫＯ　ｈＥＳＣ－網膜シート（ｄｄ７４）を観察、移植用グラフトを切り出す工程を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例２７において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと対比して、ＮＲの各種表面抗原のスクリーニングの結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例２７において、ＮＲの各種表面抗原のスクリーニングの結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例２８において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９の発現の経時変化の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例２９において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９及びＳＳＥＡ－１の発現を解析した結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。実施例３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すグラフである。実施例３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示す写真である。実施例３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示す写真である。実施例３１において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９及びＳＳＥＡ－１の発現の経時変化の結果を示すＦＡＣＳ図である。実施例３２において、ゼラチンを用いたＲＰＥシート及び網膜シートの複合化検討を行った過程を示す模式図である。実施例３２において、ゼラチンを用いた複合化に用いたトランズウェル上で培養したＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜をトランズウェルから剥離させ、ゼラチンを添加する過程を示す実体顕微鏡写真である。実施例３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜にゼラチンを添加する過程を示す実体顕微鏡写真である。実施例３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後ピンセットを用いて持ち上げていることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後、ハサミを用いて切り出していることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３２において、複合化ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を切り出した断面を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３２において、切り出した複合化ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜の吸引・吐出を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、Ｆｉｂｒｉｎを用いた複合化に用いたトランズウェル上で培養したＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜をトランズウェルから剥離させる複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、回収したＲＰＥシート及び再シート化に対してＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ及びＴｈｏｒｏｍｂｉｎを添加する複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後ピンセットを用いて持ち上げていることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた状態を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３３において、ＲＰＥシートをトランズウェルのメッシュから剥離させる複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３４において、セルシフターを用いた不要なハイドロゲルの排出検討結果を示す模式図及び写真である。実施例３５において、温度感受性培養皿上で平面化シートを作製し、剥離する過程を示す写真である。

〔定義〕
　「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

　「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。

　１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞凝集体をフィーダー細胞上又はｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株及びＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ株（いずれもＫｈＥＳ－１由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。

　「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。

　人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。

　人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。

　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

　また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ１４細胞及びＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。

　本明細書において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。

　本明細書において、多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞であり、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。

　ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。

　「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、末梢神経、前脳、後脳、終脳、間脳等の、神経系細胞によって構成される組織を意味する。神経組織は、層構造をもつ上皮構造（神経上皮）を形成することがあり、細胞凝集体中の神経上皮は光学顕微鏡を用いた明視野観察により存在量を評価することができる。

　「神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、下述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＴｕＪ１、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等をマーカーとして同定することができる。

　「神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ・Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌ）」は、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ等の幼若神経細胞マーカー、及び／又は、Ｍａｐ２、ＮｅｕＮ等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。

　「神経系前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌ）」は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア産生能をもつ。神経系前駆細胞はＮｅｓｔｉｎ、ＧＬＡＳＴ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｐａｘ６等をマーカーとして同定することができる。あるいは、神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。

　「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する網膜系細胞が、一種類又は複数種類、一定の秩序に従い存在する組織を意味し、「神経網膜（Ｎｅｕｒａｌ　Ｒｅｔｉｎａ）」は、網膜組織であって、後述する網膜層のうち網膜色素上皮層を含まない内側の神経網膜層を含む組織を意味する。

　「網膜系細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。網膜系細胞には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞等）、神経網膜前駆細胞、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。網膜系細胞のうち、神経網膜層を構成する細胞（神経網膜細胞又は神経網膜系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ）ともいう）として、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、及びこれらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）等の細胞が挙げられる。すなわち、神経網膜系細胞には網膜色素上皮細胞及び毛様体細胞が含まれない。

　「成熟した網膜系細胞」とは、ヒト成人の網膜組織に含まれ得る細胞を意味し、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体細胞等の分化した細胞を意味する。「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜前駆細胞等）を意味する。

　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

　「網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮前駆細胞等のいずれの未成熟な網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟した網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。「神経網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞等のいずれの未成熟な神経網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞等のいずれの成熟した神経網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。神経網膜前駆細胞は、網膜色素上皮細胞への分化能は有しない。

　「視細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｅｌｌ）」とは、生体においては網膜の視細胞層に存在し、光刺激を吸収し電気信号へと変換する役割を持つ。視細胞には、明所で機能する錐体（ｃｏｎｅ）と暗所で機能する杆体（又は桿体、ｒｏｄ）の２種類がある（それぞれ、錐体視細胞、杆体視細胞という）。また、錐体視細胞としては、Ｓ－ｏｐｓｉｎを発現し青色光を受容するＳ錐体視細胞、Ｌ－ｏｐｓｉｎを発現し赤色光を受容するＬ錐体視細胞、及びＭ－ｏｐｓｉｎを発現し緑色光を受容するＭ錐体視細胞を挙げることができる。視細胞は視細胞前駆細胞から分化し、成熟する。細胞が視細胞若しくは視細胞前駆細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、視細胞で発現するリカバリン（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）、成熟視細胞で発現するロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ等）の発現、外節構造の形成等により容易に確認できる。一態様において、視細胞前駆細胞はＣｒｘ陽性細胞であり、視細胞はロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、桿体視細胞はＮＲＬ及びＲｈｏｄｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、Ｓ錐体視細胞はＳ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、Ｌ錐体視細胞はＬ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、及びＭ錐体視細胞はＭ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。

　神経網膜系細胞の存在は、神経網膜系細胞関連遺伝子（以下、「神経網膜系細胞マーカー」、又は「神経網膜マーカー」という場合がある。）の発現の有無によって確認することができる。神経網膜系細胞マーカーの発現の有無、又は細胞集団若しくは組織における神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の割合は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、抗体を用いた手法、核酸プライマーを用いた手法、シーケンス反応を用いた手法が挙げられる。抗体を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのタンパク質の発現を、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫染色等の手法によって、特定の神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の数を全細胞数で除することにより確認することができる。核酸プライマーを用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、ＰＣＲ法、半定量ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法（例：リアルタイムＰＣＲ法）で確認することができる。シーケンス反応を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、核酸シーケンサ（例：次世代シーケンサ）を用いて確認することができる。

　神経網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＲｘ、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０（Ｖｓｘ２とも言う）、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１等が挙げられる。また、双極細胞で強発現するＣｈｘ１０、双極細胞で発現するＰＫＣα、Ｇｏα、ＶＳＸ１及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＨＰＣ－１、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、桿体細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するＮｒｌ、錐体視細胞で発現するＳ－ｏｐｓｉｎ及びＬＭ－ｏｐｓｉｎ、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するＲＸＲ－γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞又はその前駆細胞で発現するＴＲβ２、ＯＴＸ２及びＯＣ２、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するＰａｘ６等が挙げられる。本願実施例において同定された網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の表面抗原を、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞のマーカーとして用いることもできる。詳細は後述する。

　「陽性細胞」とは、特定のマーカーを細胞表面上又は細胞内に発現している細胞を意味する。例えば、「Ｃｈｘ１０陽性細胞」とは、Ｃｈｘ１０タンパク質を発現している細胞を意味する。

　「網膜色素上皮細胞」とは、生体網膜において神経網膜の外側に存在する上皮細胞を意味する。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（ＭＩＴＦ、Ｐａｘ６、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＴＲＰＭ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＧＰＮＭＢ、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１、ＴＴＲ等）の発現や、メラニン顆粒の存在（黒褐色）、細胞間のタイトジャンクション、多角形・敷石状の特徴的な細胞形態等により容易に確認できる。細胞が網膜色素上皮細胞の機能を有するか否かは、ＶＥＧＦ及びＰＥＤＦ等のサイトカインの分泌能や視細胞外節の貪食能等により容易に確認できる。一態様において、網膜色素上皮細胞はＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞である。

　「網膜色素上皮細胞シート」とは、網膜色素上皮細胞が少なくとも二次元の方向に生物学的結合により互いに接着し、単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層のシート状の構造体を意味する。

　「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。

　「神経網膜層」とは、神経網膜を構成する各層を意味し、具体的には、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。「視細胞層」とは、神経網膜の最も外側に形成され、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を多く含む網膜層を意味する。視細胞層以外の各層を内層という。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。

　視細胞又は視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層を「ニューロブラスティックレイヤー（neuroblastic layer）」といい、inner neuroblatic layerとouter neuroblastic layerが存在する。当業者であれば周知の方法、例えば明視野顕微鏡の下では、色の濃淡（outer neuroblastic layerが薄く、inner neuroblatic layerが濃い）により判断することができる。

　「毛様体」は、発生過程及び成体の「毛様体」、「毛様体周縁部」、「Ｃｉｌｉａｒｙ　ｂｏｄｙ」を含む。「毛様体」のマーカーとしては、Ｚｉｃ１、ＭＡＬ、ＨＮＦ１ｂｅｔａ、ＦｏｘＱ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ１、ＧＰＲ１７７、ＡＱＰ１及びＡＱＰ４があげられる。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎａｌｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。「毛様体周縁部様構造体」とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。

　「大脳組織」とは、胎児期又は成体の大脳を構成する細胞（例、大脳神経系前駆細胞（cortical neural precursor cell）、背側大脳神経系前駆細胞、腹側大脳神経系前駆細胞、大脳層構造特異的神経細胞（ニューロン）、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、グリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）、これらの前駆細胞など）が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。胎児期の大脳は、前脳又は終脳とも呼ばれる。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。

　「大脳層」とは、成体大脳又は胎児期大脳を構成する各層を意味し、具体的には、分子層、外顆粒層、外錐体細胞層、内顆粒層、神経細胞層（内錐体細胞層）、多型細胞層、第一層、第二層、第三層、第四層、第五層、第六層、皮質帯、中間帯、脳室下帯、及び、脳室帯（ventricular zone）を挙げることができる。

　「大脳神経系前駆細胞」としては、ニューロン前駆細胞、第一層ニューロン前駆細胞、第二層ニューロン前駆細胞、第三層ニューロン前駆細胞、第四層ニューロン前駆細胞、第五層ニューロン前駆細胞、第六層ニューロン前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞等を挙げることができる。それぞれの細胞は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及び、オリゴデンドロサイトへの分化が決定付けられている前駆細胞である。

　「大脳神経系前駆細胞」は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及び、オリゴデンドロサイトのうちの少なくとも複数の分化系譜への分化能（多分化能）をもつ複能性幹細胞（複能性神経幹細胞、multi-potent neural stem cell）を含む。

　「大脳層特異的神経細胞」とは、大脳層を構成する細胞であって大脳層に特異的な神経細胞を意味する。大脳層特異的神経細胞としては、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、大脳興奮性ニューロン、大脳抑制性ニューロン等を挙げることができる。

　大脳細胞マーカーとしては、大脳細胞で発現するＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、大脳神経系前駆細胞で発現するＳｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎ、背側大脳神経系前駆細胞で発現するＰａｘ６及びＥｍｘ２、腹側大脳神経系前駆細胞で発現するＤｌｘ１、Ｄｌｘ２及びＮｋｘ２．１、ニューロン前駆細胞で発現するＴｂｒ２、Ｎｅｘ、Ｓｖｅｔ１、第六層ニューロンで発現するＴｂｒ１、第五層ニューロンで発現するＣｔｉｐ２、第四層ニューロンで発現するＲＯＲβ、第三層ニューロン又は第二層ニューロンで発現するＣｕｘ１又はＢｒｎ２、第一層ニューロンで発現するＲｅｅｌｉｎなどが挙げられる。

　「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ　Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定はなく、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞凝集体には、特定の組織を形成している場合も含まれる。

　「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体」は、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数融合して形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２～４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成する形を示す）が挙げられる。一態様において、凝集体のコア部は、小胞性層状構造を有し、明視野顕微鏡の下では、中央部が暗く外縁部分が明るく観察されるという特徴を有する。

　「上皮組織」とは、体表面、管腔（消化管など）、体腔（心膜腔など）などの表面を細胞が隙間なく覆うことで形成される組織である。上皮組織を形成している細胞を上皮細胞という。上皮細胞は、細胞が頂端（ａｐｉｃａｌ）－基底（ｂａｓａｌ）方向の極性を持つ。上皮細胞は、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）及び／又は密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により上皮細胞同士で強固な結合をつくり、細胞の層を形成できる。この細胞層が、１ないし十数層重なってできた組織が上皮組織である。上皮組織を形成し得る組織には、胎児期及び／又は成体の網膜組織、脳脊髄組織、眼球組織、神経組織等も含まれる。本明細書における神経網膜も上皮組織である。「上皮構造」とは、上皮組織が特徴的に有する構造（例：基底面及び頂端面の極性を有する）を意味する。

　「連続上皮組織」とは、連続上皮構造を有する組織である。連続上皮構造とは、上皮組織が連続している状態のことである。上皮組織が連続しているとは、例えば、上皮組織に対する接線方向に１０細胞～１０^７細胞、好ましくは接線方向に３０細胞～１０^７細胞、さらに好ましくは１０^２細胞～１０^７細胞、並んでいる状態のことである。

　例えば、網膜組織において形成される連続上皮構造は、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層（外顆粒層）等と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に１０細胞以上、好ましくは３０細胞以上、より好ましくは１００細胞以上、さらに好ましくは４００細胞以上の視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。

　一態様において、上皮組織は極性化して「頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）」と「基底面」及び「基底膜」ができる。「基底膜」とは、上皮細胞が産生した基底（ｂａｓａｌ）側の層（基底膜）のことをいい、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含み、５０～１００ｎｍの厚さを有する。「基底面」は「基底膜」側に形成される表面（表層面）のことをいう。「頂端面」は、「基底膜」と反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、「頂端面」は視細胞又は視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー（例：ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ（以下、「ａＰＫＣ」と略す）、Ｔｉｇｈｔ　Ｊｕｎｃｔｉｏｎマーカー（Ｚｏ－１）、ＥＲＭタンパク質であるＥｚｒｉｎ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。

〔細胞凝集体の製造方法〕
　本発明の一態様は、分散された網膜系細胞集団から、上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を含む細胞凝集体（本明細書において、「網膜組織を含む細胞凝集体」を単に「網膜組織」という場合がある）を製造するための製造方法である。該方法は、分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養することを含む。ここで、分散された網膜系細胞集団は、網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む。網膜組織は上記に定義されているとおりである。一態様として、網膜組織は神経網膜組織を含み、また、神経網膜組織と網膜色素上皮組織の両方を含んでもよい。

　網膜系細胞は、上記に定義されているとおりであり、一態様において、網膜系細胞は網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、他に視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞等の細胞を含んでもよい。網膜系細胞は神経網膜系細胞であることが好ましい。使用される網膜系細胞集団は、生体組織由来のものであっても多能性幹細胞由来のものであってもよく、多能性幹細胞を分化誘導して得られたものであることが好ましい。

　生体組織由来の網膜系細胞は、当業者であれば、周知技術により生体由来の網膜組織から調製することができる。例えば、眼摘後、ＲＰＥと剥離させて、回収する方法や、直接神経網膜を摘出する方法がある。

　本発明の一態様は、分散された神経系細胞集団から、上皮構造（又は多層構造）を有する神経組織（例：大脳（終脳）組織）を含む細胞凝集体の製造方法である。該方法は、分散された神経系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養又は浮遊培養することを含む。神経系細胞は神経系前駆細胞（例：大脳神経系前駆細胞）を含んでいることが好ましい。使用される神経系細胞集団は、生体組織由来のものであっても多能性幹細胞由来のものであってもよく、多能性幹細胞を分化誘導して得られたものであることが好ましい。

（出発細胞としての網膜系細胞集団の分化誘導方法）
　本発明の製造方法の出発細胞としての多能性幹細胞由来の網膜系細胞は、多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。一態様として、分化誘導因子を用いて多能性幹細胞を分化誘導して網膜系細胞の凝集体を得ることができる。分化誘導因子として、基底膜標品、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＩＧＦシグナル伝達経路作用物質などが挙げられる。一態様として、自己組織化による網膜系細胞の凝集体の製造方法が挙げられる。自己組織化とは、細胞の集団が自律的に複雑な構造を生み出す機序をいう。例えば、ＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｆｌｏａｔｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｉｅｓ－ｌｉｋｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法（ＷＯ２００５／１２３９０）やＳＦＥＢｑ法（ＷＯ２００９／１４８１７０）により、自己組織化を行うことができる。

　具体的な分化誘導方法として、ＷＯ２０１１／０５５８５５、ＷＯ２０１３／０７７４２５、ＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１６／０６３９８６、ＷＯ２０１７／１８３７３２、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１０　Ｊａｎ　２０；５（１）：ｅ８７６３．、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．　２０１１　Ａｕｇ；２９（８）：１２０６－１８．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　Ｊｕｎ　１０；１１１（２３）：８５１８－２３、又はＮａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１４　Ｊｕｎ　１０；５：４０４７に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。

　具体的な一態様として、下記工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む方法によって網膜系細胞の凝集体を調製することができる。
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに浮遊培養する工程。

　なお、工程（Ａ）は、さらにＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい。

　また、工程（Ｂ）は、後述するように、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、及び／又はＷｎｔシグナル伝達阻害物質を含んでいてもよい。

　本方法は、例えばＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２を参照することが可能である。

　網膜系細胞の凝集体の調製に使用する培地は、特段の記載がない限り、細胞増殖用基礎培地（基礎培地とも呼ぶ）を使用することができる。細胞増殖用基礎培地は細胞の培養が可能な限り特に限定はなく、適宜細胞増殖用培地として市販されている基礎培地を用いることができる。具体的には、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、補助培地であるＮ２培地を添加した培地を用いてもよい。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーによって伝達される、シグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、ＬＹ－３６４９４７、ＳＢ５０５１２４、Ａ－８３－０１等）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１等）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例：ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等）を挙げることができる。これらの物質は市販されており入手可能である。

　ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」又は「ＳＨＨ」と記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＳＨＨ、ＳＨＨの部分ペプチド、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ）等が挙げられる。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えば、ＳＢ４３１５４２は、通常０．１～２００μＭ、好ましくは２～５０μＭの濃度で使用される。Ａ－８３－０１は、通常０．０５～５０μＭ、好ましくは０．５～５μＭの濃度で使用される。ＬＤＮ１９３１８９は、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～３００ｎＭの濃度で使用される。ＳＡＧは、通常、１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。

　未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４やＦＧＦ８）が挙げられる。また、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＮｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）を培養する場合、工程（Ａ）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、ｂＦＧＦを含む。

　工程（Ａ）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、具体的には、フィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてｂＦＧＦを用いる場合、その濃度は、通常４～５００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは３０～１５０ｎｇ／ｍＬ程度である。

　未分化維持因子を含み、多能性幹細胞を培養するために使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／Ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／Ｌ）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（５４３ｍｇ／Ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／Ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、８、４２４－４２９（２０１１））。その他市販のフィーダーフリー培地としては、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００８　Ｓｅｐ　９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）が挙げられる。上記工程（Ａ）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。これら培地を使用することで、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養をおこなうことが可能である。工程（Ａ）で使用する培地は、一例として、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれも添加されていない無血清培地である。

　工程（Ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２８，６１１－６１５，（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　３，１２３６，（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９，９７１－９７４，（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。

　工程（Ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例：１００ｎＭ～７００ｎＭ）の存在下で培養する場合、工程（Ｂ）において形成される細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５～１４４時間である。一態様において、好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～４８時間、さらに好ましくは１２～４８時間、よりさらに好ましくは１８～２８時間（例、２４時間）である。

　工程（Ｂ）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地が挙げられる。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。

　凝集体の形成に際しては、まず、工程（Ａ）で得られた細胞の分散操作により、分散された細胞を調製する。分散操作により得られた「分散された細胞」とは、例えば７割（好ましくは８割以上）以上が単一細胞であり２～５０細胞の塊が３割以下（好ましくは２割以下）存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態が挙げられる。

　分散された細胞の懸濁液を培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。一態様として、９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて１個の凝集体が形成される（ＳＦＥＢｑ法）。９６ウェルプレートを用いて細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０^３から約１×１０^５細胞（好ましくは約３×１０^３から約５×１０^４細胞、約４×１０^３から約２×１０^４細胞）となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。

　一態様において、工程（Ｂ）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。
　すなわち、具体的な一態様として、下記工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む方法によって網膜系細胞の凝集体を調製することができる：
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、かつ任意でＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい、未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに浮遊培養する工程。
　工程（Ｂ）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを上述の濃度（例：１０ｎＭ～３００ｎＭ）で用いることができる。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例、Ｙ－２７６３２）を添加してもよい。培養時間は例えば、１２時間～６日間である。工程（Ｂ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

　工程（Ｂ）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することにより、後述する網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞（Ｒｘ陽性細胞）の細胞表面マーカーであるＣＤ３９の発現が増加する。一態様として、工程（Ｂ）の浮遊培養開始時（Ｄａｙ０）から高濃度（１００ｎＭ～１０００ｎＭ、例：３００ｎＭ）のＳＡＧを添加することにより、ＣＤ３９の発現が増加する。当該方法を用いることにより、ＣＤ３９を用いた網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の純化工程を行う場合に、より多くのＣＤ３９陽性細胞を純化することができ、製造効率が向上する。なお、ＳＡＧを３００ｎＭ添加して得られたＣＤ３９陽性細胞を含む組織は、Chx10 陽性かつLhx2 陽性、NKX2.1陰性であることから、網膜組織である。特に腹側（CoupTF1 陽性）の網膜組織が誘導される。なお、工程（Ｂ）においてＳＡＧを添加せずに得られた網膜組織は、背側（ALDH1A1 陽性）の網膜組織が誘導される。

　工程（Ｂ）において、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ－ＰＮＰなど）及びＡ２Ａ受容体アゴニスト（アデノシン、CGS 21680（3-[4-[2-[[6-amino-9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(ethylcarbamoyl)-3,4-dihydroxy-oxolan-2-yl]purin-2-yl]amino]ethyl]phenyl]propanoicacid）など）からなる群から選択される１以上を含む培地で培養することによっても、誘導される組織中のＣＤ３９陽性細胞の割合が増加する。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４若しくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。

　工程（Ｃ）において用いられる培地は、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）が挙げられる。無血清培地、血清培地は上述の通り準備することができる。工程（Ｃ）において用いられる培地は、一例において、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。また、工程（Ｃ）において用いられる培地は、一例において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加されていない培地である。また、工程（Ｃ）において用いられる培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が添加されていてもよい培地である。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトＢＭＰ４タンパク質の場合は、約０．０１ｎＭ～約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１０ｎＭ、さらに好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）の濃度となるように培地に添加する。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ａ）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目～１５日目までの間、より好ましくは１日目～９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。

　具体的な態様として、例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後１～９日目、好ましくは１～３日目に、培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換し、ＢＭＰ４の終濃度を約１～１０ｎＭに調製し、ＢＭＰ４の存在下で例えば１～１２日、好ましくは２～９日、さらに好ましくは２～５日間培養することができる。ここにおいて、ＢＭＰ４の濃度を、同一濃度を維持すべく、１回若しくは２回程度培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換することができる。又はＢＭＰ４の濃度を段階的に減じることもできる。例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後２～１０日目までＢＭＰシグナル伝達経路作用物質（ＢＭＰ４）の濃度を維持した後、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後６～２０日目まで段階的にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質（ＢＭＰ４）の濃度を減じてもよい。

　上記工程（Ａ）～工程（Ｃ）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃～約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％～約１０％、好ましくは約５％である。

　上記工程（Ｃ）における培養期間を変動させることによって、細胞凝集体に含まれる網膜系細胞として、様々な分化段階の網膜系細胞を製造することができる。すなわち、未成熟な網膜系細胞（例：網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞）と成熟した網膜系細胞（例：視細胞）とを様々な割合で含む、細胞凝集体中の網膜系細胞を製造することができる。工程（Ｃ）の培養期間を延ばすことによって、成熟した網膜系細胞の割合を増やすことができる。

　上記工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）は、ＷＯ２０１７／１８３７３２に開示された方法を使用することもできる。すなわち、工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質をさらに含む培地で浮遊培養し、細胞凝集体を形成することができる。

　工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）に用いる、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、タンパク質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Ｗｎｔにより媒介されるシグナルは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）及びＬＲＰ５／６（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５／６）のヘテロ二量体として存在するＷｎｔ受容体を介して伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体に直接作用する物質（抗Ｗｎｔ中和抗体、抗Ｗｎｔ受容体中和抗体等）、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質（可溶型Ｗｎｔ受容体、ドミナントネガティブＷｎｔ受容体等、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質等）、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質［ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）、並びに、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセタミド）等の低分子化合物等］等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。ＣＫＩ－７、Ｄ４４７６、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ－２等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが用いられる。

　工程（Ｂ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、さらに好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　工程（Ｂ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、早い方が好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始から、通常６日以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部若しくは全部の培地交換を行うことができる。工程（Ａ）で得られた細胞を、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、工程（Ｂ）終了時（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加直前）まで作用させる。さらに好ましくは、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、網膜組織が形成されるまで作用させてもよい。

　工程（Ｃ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いることができるが、好ましくは、工程（Ｂ）で用いたＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程（Ｃ）において使用する。

　工程（Ｃ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、さらに好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（Ｃ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度を１００としたとき、好ましくは５０～１５０、より好ましくは８０～１２０、さらに好ましくは９０～１１０であり、工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞若しくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、工程（Ｃ）開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して（即ち、工程（Ｂ）の開始時から）培地中に含まれる。さらに好ましくは、工程（Ｂ）の浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して培地中に含まれる。例えば、工程（Ｂ）で得られた培養物（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にＢＭＰシグナル伝達作用物質（例、ＢＭＰ４）を添加すればよい。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、２日間から３０日間、より好ましくは６日間から２０日間、８日間から１８日間、１０日間から１８日間、又は１０日間から１７日間（例えば、１０日間）である。別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは３日間から１５日間（例えば、５日間、６日間、７日間）であり、より好ましくは６日間から１０日間（例えば、６日間）である。

　上述した方法で得た細胞凝集体をＷｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間程度の期間培養（工程（Ｄ））後、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で３０日間～２００日間程度（３０日間～１５０日間、５０日間～１２０日間、６０日間～９０日間）培養する（工程（Ｅ））ことによって、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造することもできる。

　一態様として、工程（Ａ）～（Ｃ）で得られた細胞凝集体であって、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後６～３０日目、１０～２０日目（１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目又は２０日目）の細胞凝集体から、上記工程（Ｄ）及び工程（Ｅ）により、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造できる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）を挙げることができる。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭの範囲を挙げることができる。

　ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８等が挙げられる。例えばＳＵ－５４０２の場合、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

　工程（Ｄ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

　上記工程（Ｅ）の一部又は全部の工程は、ＷＯ２０１９／０１７４９２に開示された連続上皮組織維持用培地を用いて培養することができる。すなわち、連続上皮組織維持用培地を用いて培養することにより、神経網膜の連続上皮構造を維持することができる。一例として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、２１１０３０４９）にＢ２７サプリメント（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５８７０１０）を配合した培地を連続上皮組織維持用培地として挙げることができる。

　上記工程（Ｅ）における培養は、網膜系細胞（特に視細胞）の分化及び／又は成熟化と、連続上皮構造の維持を両立させるために、段階的に連続上皮組織維持用培地に交換することが好ましい。例えば、始めの１０日間～３０日間を細胞増殖用基礎培地（例：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％牛胎仔血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）、次の１０日間～４０日間を細胞増殖用基礎培地と連続上皮組織維持用培地の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％牛胎仔血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地と、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に、１０％牛胎仔血清、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、及び１００μＭタウリンが添加された培地を１：３の比率で混合した培地）、次の２０日間～１４０日間を連続上皮組織維持用培地（例：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に、１０％牛胎仔血清、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）、を用いて培養することができる。

　上記工程（Ｅ）の一部又は全部の工程において、細胞増殖用基礎培地、連続上皮組織維持用培地又はこれらの混合培地のいずれの培地を用いている場合であっても、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質をさらに含んでよい。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することにより、神経網膜に含まれる双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞又は水平細胞等の割合が低く、かつ視細胞前駆細胞の割合を増大させた網膜系細胞の凝集体の製造が可能となる。

　本明細書において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質とは、甲状腺ホルモンにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質であり、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路を増強し得るものであれば特に限定はない。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、トリヨードサイロニン（以下、Ｔ３と略すことがある）、サイロキシン（以下、Ｔ４と略すことがある）、甲状腺ホルモン受容体（好ましくはＴＲβ受容体）アゴニスト等が挙げられる。

　また、当業者に周知の甲状腺ホルモン受容体アゴニストとして、国際公開第９７／２１９９３号パンフレット、国際公開第２００４／０６６９２９号パンフレット、国際公開第２００４／０９３７９９号、国際公開第２０００／０３９０７７号パンフレット、国際公開第２００１／０９８２５６号パンフレット、国際公開第２００３／０１８５１５号パンフレット、国際公開第２００３／０８４９１５号パンフレット、国際公開第２００２／０９４３１９号パンフレット、国際公開第２００３／０６４３６９号パンフレット、特開２００２－０５３５６４号公報、特開２００２－３７０９７８号公報、特開２０００－２５６１９０号公報、国際公開第２００７／１３２４７５号パンフレット、国際公開第２００７／００９９１３号パンフレット、国際公開第２００３／０９４８４５号パンフレット、国際公開第２００２／０５１８０５号パンフレット又は国際公開第２０１０／１２２９８０号パンフレットに記載のジフェニルメタン誘導体、ジアリールエーテル誘導体、ピリダジン誘導体、ピリジン誘導体若しくはインドール誘導体等の化合物を挙げることができる。

　甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ３を用いる場合には、例えば、０．１～１０００ｎＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、１～５００ｎＭ；より好ましくは１０～１００ｎＭ；さらに好ましくは３０～９０ｎＭ；さらにより好ましくは６０ｎＭ前後の濃度のＴ３に相当する甲状腺ホルモンシグナル伝達亢進活性を有する濃度が挙げられる。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ４を用いる場合には、例えば、１ｎＭ～５００μＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、５０ｎＭ～５０μＭ；より好ましくは５００ｎＭ～５μＭの範囲である。その他の甲状腺ホルモン受容体アゴニストを用いる場合、上述の濃度のＴ３又はＴ４が示すアゴニスト活性と同程度の活性を示す濃度であればよい。

　工程（Ｅ）において用いられる培地は、適宜、Ｌ－グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。工程（Ｅ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

　具体的な一態様として、下記工程（Ａ）～（Ｅ）を含む方法によって網膜系細胞の凝集体を調製することができる：
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含み、かつ任意でＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい培地で培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい培地中で浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに浮遊培養する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間程度の期間培養する工程、及び、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい無血清培地又は血清培地中で３０日間～２００日間程度培養する工程。

　具体的な一態様として、下記工程（Ａ’）～（Ｅ’）を含む方法によって網膜系細胞の凝集体を調製することができる：
（Ａ’）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含み、かつＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で１２時間～４８時間培養する工程、
（Ｂ’）工程（Ａ’）で得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で、１２時間～７２日間（２４時間～４８時間）浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ’）工程（Ｂ’）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに８日間～１５日間（１０日間～１３日間）浮遊培養する工程、
（Ｄ’）工程（Ｃ’）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間培養する工程、及び、
（Ｅ’）工程（Ｄ’）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい無血清培地又は血清培地中で１０日間～２００日間程度培養する工程。

　ここで工程（Ｅ’）は１０日間～３０日間細胞増殖用基礎培地で培養し、次いで１０日間～４０日間細胞増殖用基礎培地と甲状腺ホルモンシグナル伝達作用物質を含む連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養し、さらに２０日間～１４０日間甲状腺ホルモンシグナル伝達作用物質を含む連続上皮組織維持用培地で培養する工程を含んでいてもよい。

　一態様において、工程（Ｅ’）は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質の存在下に２０日間～６０日間（３０日間～５０日間）培養することを含む。

　一態様において、工程（Ｂ’）～工程（Ｅ’）までの培養期間は、７０日間～１００日間（８０日間～９０日間）である。

　出発細胞としての網膜系細胞を含む網膜組織の回収時期は、当該網膜組織中に網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む時期であれば特に限定されない。当該網膜組織中に網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞を多く含む時期が好ましい。上述した方法において、例えば、浮遊培養開始後１０日～１００日後（好ましくは、９日～４５日後）の網膜組織から、後述する通り出発細胞としての分散された網膜系細胞集団を調製すればよい。

（出発細胞としての神経系細胞集団の分化誘導方法）
　本発明の製造方法の出発細胞としての多能性幹細胞由来の神経系細胞は、多能性幹細胞を分化誘導させることにより誘導することができる。多能性幹細胞の凝集体を浮遊培養により、神経系細胞又は神経組織に誘導する方法としては、多くの方法が報告されている。例えばWO2005/123902、WO2009/148170、WO2008/035110、WO2011/055855、WO2016/063985、Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)、Nature,472, 51-56 (2011)、Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)、Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009)、ProcNatl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013)等に記載された方法が知られているが、これらに限定されない。このような種々の神経系細胞又は神経組織の誘導方法を、工程（Ｂ）で得られた凝集体に適用し、工程（Ｂ）で得られた凝集体を、適切な神経分化誘導条件下で培養することにより、神経系細胞もしくは神経組織を含む凝集体を製造することが出来る。

　本発明の製造方法の出発細胞としての神経細胞（例：大脳細胞(大脳組織)）の製造方法の一例を下記に示す。

　下記工程（Ａ’’）～（Ｃ’’）を含む、大脳組織の製造方法である：
　（Ａ’’）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
　（Ｂ’’）工程（Ａ’’）で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる工程、及び
　（Ｃ’’）工程（Ｂ’’）で得られた凝集体を、分化誘導剤（例：ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質）の非存在下、又は分化誘導剤（例：ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質）の存在下に浮遊培養し、神経組織（大脳組織）を含む凝集体を得る工程。

　工程（Ａ’’）及び（Ｂ’’）は、上述した網膜組織の製造方法の工程（Ａ）及び（Ｂ）と同様に実施することができる。

　工程（Ｃ’’）においては、分化誘導剤、例えばＢＭＰシグナル伝達経路作用物質などの特定のシグナル伝達を活性化し、又は、阻害する物質を添加しない培地中で培養してもよい。工程（Ａ’’）及び（Ｂ’’）により当該細胞凝集体は神経に分化する運命にあるため、基礎培地中で培養することにより自発的に神経（例：大脳）に分化する。

　工程（Ｃ’’）においては、分化誘導剤として、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質又はＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を単独で培地に添加してもよいが、両者を組み合わせる方が好ましい。工程（Ｂ’’）からこれら分化誘導因子を加えてもよい。

　工程（Ｂ’’）及び（Ｃ’’）に用いる、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。これらの因子は上述した因子と同じである。ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１又はＬＤＮ１９３１８９である。

　工程（Ｂ’’）及び（Ｃ’’）に用いる、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、蛋白質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Ｗｎｔにより媒介されるシグナルは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）及びＬＲＰ５／６（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５／６）のヘテロ二量体として存在するＷｎｔ受容体を介して伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体に直接作用する物質（抗Ｗｎｔ抗体、抗Ｗｎｔ受容体抗体等）、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質（可溶型Ｗｎｔ受容体、ドミナントネガティブＷｎｔ受容体等、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白等）、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質［ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）　（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）、並びに、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセタミド）等の低分子化合物等］等が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＫＩ－７、Ｄ４４７６、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ　（ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ－２等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが挙げられる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の大脳細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、更に好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ１ｅの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　かかる培養により、工程（Ｂ’’）で得られた凝集体を形成する細胞から大脳神経系前駆細胞への分化が誘導され、大脳神経系前駆細胞を含む凝集体を得ることが出来る。大脳神経系前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、大脳神経系前駆細胞のマーカーであるＦｏｘＧ１、Ｌｈｘ２、ＰＡＸ６、Ｅｍｘ２等を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。工程（Ｃ’’）の実施態様の一つとして、工程（Ｂ’’）で形成された凝集体を、ＦｏｘＧ１遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する工程、を挙げることができる。一態様において、凝集体に含まれる細胞の２０％以上（好ましくは、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上）が、ＦｏｘＧ１を発現する状態となるまで、工程（Ｃ’’）の培養が実施される。

　出発細胞としての神経系細胞を含む神経組織の回収時期は、当該神経組織（大脳組織）中に神経系前駆細胞又は大脳神経系前駆細胞を含む時期であれば特に限定されないが、当該組織中にこれらの細胞を多く含む時期が好ましい。上述した方法において、例えば、浮遊培養開始後１０日～１００日後（好ましくは、１５日～４０日後）の神経組織（大脳組織）から、後述する通り出発細胞としての分散された神経系細胞集団を調製すればよい。

（分散された網膜系又は神経系細胞集団）
　「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片又は細胞の集合体（Cell clump）（２細胞以上１００細胞以下、好ましくは５０細胞以下、３０細胞以下、２０細胞以下、１０細胞以下、５細胞以下；例えば２～５個の細胞の集合体）又は単一細胞まで分離させることをいう。分散された細胞集団とは、細胞片若しくは細胞の集合体又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。「分散された網膜系細胞集団」とは、分散された状態の細胞集団を意味し、生体組織又は細胞凝集体等の細胞の集合体を分散することによって得ることができる。分散された網膜系細胞集団は、好ましくは、上記の網膜系細胞の凝集体を分散することによって得ることが好ましい。

　一態様において、分散方法は、細胞を生きたままに分散できる方法であればよく、例えば機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。

　機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。

　細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）やＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、神経細胞分散液（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を用いることもできる。

　細胞を分散する際に、細胞保護剤で処理することにより、細胞の細胞死を抑制してもよい。細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＩＧＦシグナル伝達経路作用物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死（特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死）を抑制するために、分散の際に、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ（「ＲＯＣＫ」又は「Ｒｈｏキナーゼ」）の阻害物質（ＲＯＣＫ阻害剤）又はＭｙｏｓｉｎの阻害物質を添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２等を挙げることができる。Ｍｙｏｓｉｎの阻害物質としてはＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。

　分散された網膜系細胞集団（又は神経系細胞集団）は、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ）を含み、例えば細胞集団の全細胞数に対して７０％以上、好ましくは８０％以上が単一細胞であり、また、２～５０細胞の塊が細胞集団の全細胞数に対して３０％以下、好ましくは２０％以下存在する状態が挙げられる。分散された網膜系細胞集団（又は神経系細胞集団）において、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなっている。また、分散された網膜系細胞集団（又は神経系細胞集団）は、できるだけ単一細胞からなることより好ましく、このような分散された網膜系細胞集団（又は神経系細胞集団）は、分散処理後、単一細胞になっていない細胞の塊を除去することによって得ることができる。細胞の塊の除去方法は特に限定されないが、例えばメンブレンフィルター（セルストレーナー）による塊の除去等が挙げられる。一態様において、分散された細胞とは、細胞－細胞間結合（例えば、接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。

　網膜組織から出発細胞としての網膜系細胞集団を準備する場合、網膜色素上皮細胞などの不要な細胞が網膜組織に含まれる場合がある。例えば、生体から網膜組織を採取した場合や、上述した多能性幹細胞からの網膜組織の製造方法における工程（Ｄ）及び工程（Ｅ）を実施した場合などが挙げられる。この場合、網膜色素上皮細胞など不要な細胞が存在する領域を切り離した上で、網膜系細胞集団を分散させればよい。網膜色素上皮細胞の場合は、形態や色素により判別可能であり、当業者であれば容易に切除可能である。

　後述するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に、後述の通り網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の純度を高めるための工程（純化工程）を実施してもよく、さらに分散された網膜系細胞集団（又は神経系細胞集団）の維持・拡大培養を実施してもよい。培地は、網膜系細胞（又は神経系細胞）が生存及び増殖可能な培地（ＤＭＥＭ培地など）であれば特に限定されない。凍結融解した網膜系細胞集団を本発明の製造方法の出発細胞として用いることもできるため、分散された網膜系細胞集団を凍結保存しておくことも可能である。凍結保存液は特に問わず、市販の凍結保存液を用いることができる。

〔網膜前駆細胞の純化〕
　上述した分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に、分散された網膜系細胞集団に対し、網膜前駆細胞の割合（純度）、好ましくは神経網膜前駆細胞の割合（純度）を高める工程（純化工程）を実施してもよい。純化工程では、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞で発現する特定のマーカーを用いたセルソーティング等の操作を実施してもよい。セルソーティングは、ＦＡＣＳやＭＡＣＳなどの周知技術を用いて実施することができる。網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の純化工程を実施することにより、本明細書に記載の製造方法においてＲＰＥ細胞や目的外細胞の混入を減少させることが可能である。分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程によって、網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制される。網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されたか否かは、分散された網膜系細胞集団を後述する培養方法により培養した後に、上述した網膜色素上皮細胞のマーカーや形態、性質等に基づき網膜色素上皮細胞が生成したか否かで判断すればよい。網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されるとは、上記培養後の全細胞数に対する網膜色素上皮細胞の割合が、網膜前駆細胞の割合を高める工程を実施しなかった場合と比較して、抑制されていればよい。段落０１７５に記載されている程度の網膜色素上皮細胞の割合であれば、網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されたと判断できる。

　網膜前駆細胞の細胞のマーカー（ポジティブマーカー）として、ＲｘやＣｈｘ１０などがよく知られている。しかしながら、これら遺伝子は細胞内で発現しているため、例えば遺伝子組換え技術により当該遺伝子と蛍光タンパク質と連結した細胞、又は当該遺伝子を蛍光タンパク質で置き換えた細胞を用いるなどの工夫が必要である（例：Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ細胞）。そこで、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞のポジティブマーカーの探索を行い、ＣＤ９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７６９．４、ＮＭ＿００１３３０３１２．２）、ＣＤ２４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１２９１７３７．１、ＮＭ＿００１２９１７３８．１、ＮＭ＿００１２９１７３９．１、ＮＭ＿００１３５９０８４．１、ＮＭ＿０１３２３０．３）、ＣＤ２９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２１１．４、ＮＭ＿０３３６６８．２、ＮＭ＿１３３３７６．２）、ＣＤ３９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１０９８１７５．２、ＮＭ＿００１１６４１７８．１、ＮＭ＿００１１６４１７９．２、ＮＭ＿００１１６４１８１．１、ＮＭ＿００１１６４１８２．２、ＮＭ＿００１１６４１８３．２、ＮＭ＿００１３１２６５４．１、ＮＭ＿００１３２０９１６．１、ＮＭ＿００１７７６．６）、ＣＤ４７（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７７７．３、ＮＭ＿１９８７９３．２）、ＣＤ４９ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２０３．４）、ＣＤ４９ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２０４．４）、ＣＤ４９ｆ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿０００２１０．４、ＮＭ＿００１０７９８１８．３、ＮＭ＿００１３１６３０６．２、ＮＭ＿００１３６５５２９．２、ＮＭ＿００１３６５５３０．２）、ＣＤ５７（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１３６７９７３．１、ＮＭ＿０１８６４４．３、ＮＭ＿０５４０２５．３）、ＣＤ７３（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１２０４８１３．１、ＮＭ＿００２５２６．４）、ＣＤ８２（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１０２４８４４．２、ＮＭ＿００２２３１．４）、ＣＤ９０（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１３１１１６０．２、ＮＭ＿００１３１１１６２．２、ＮＭ＿００１３７２０５０．１、ＮＭ＿００６２８８．５）、ＣＤ１６４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１１４２４０１．２、ＮＭ＿００１１４２４０２．２、ＮＭ＿００１１４２４０３．３、ＮＭ＿００１１４２４０４．２、ＮＭ＿００１３４６５００．２、ＮＭ＿００６０１６．６）、ＣＤ２００（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＭ＿００１３１８８２６．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＭ＿００１３１８８３０．１、ＮＭ＿００１３６５８５１．２、ＮＭ＿００１３６５８５２．１、ＮＭ＿００１３６５８５３．１、ＮＭ＿００１３６５８５４．１、ＮＭ＿００１３６５８５５．１、ＮＭ＿００５９４４．７）、ＣＤ３４０（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００５８６２．２、ＮＭ＿００１２８９９３６．１、ＮＭ＿００１２８９９３７．１、ＮＭ＿００１２８９９３８．１、ＮＭ＿００４４４８．３）及びＣＸＣＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００８５４０．２、ＮＭ＿００１３４８０５６．２、ＮＭ＿００１３４８０５９．２、ＮＭ＿００１３４８０６０．２、ＮＭ＿００３４６７．３）が、これらの細胞の細胞表面で発現していることを見出した。好ましい細胞表面マーカーとして、例えば、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４が挙げられる。一態様として、前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体、ペプチドなど）と接触させ陽性画分を分取する工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法を、上述したＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に実施してもよい。当該方法により、本明細書に記載の製造方法においてＲＰＥ細胞の混入を減少させることが可能である。

　さらに、これらの細胞のネガティブマーカー、すなわちこれらの細胞での発現が認められないマーカーとして、ＳＳＥＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２０３３．３）、ＣＤ６６ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１８１６．４）、ＣＤ６９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７８１．２）及びＣＤ８４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１１８４８７９．２、ＮＭ＿００１１８４８８１．２、ＮＭ＿００１１８４８８２．１、ＮＭ＿００１３３０７４２．２、ＮＭ＿００３８７４．４）等を見出した。上述したポジティブマーカーと組み合わせることにより、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の純度をより高めることが可能である。一態様として、前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）、好ましくはさらに、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）と接触させ、前者のマーカーの陽性画分及び後者のマーカーの陰性画分を分取する工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に実施してもよい。上記分散された網膜系細胞集団を、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）と接触させ、これらのマーカーの陰性画分を分取する工程においては、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程である。ここで、基準値は、当業者が任意に設定することができる。例えば、蛍光標識したアイソタイプコントロール抗体を細胞集団に処理した場合の蛍光強度と同等の強さの蛍光標識した上記抗原に対する抗体を細胞集団に処理した細胞集団を得ることで、陰性の画分を分取することができる。

　なお、上述したポジティブマーカー及びネガティブマーカーに結合する物質（例：抗体）を用いた、細胞集団における網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の割合を向上させる方法は、本明細書に記載の製造方法の一工程としての方法に限定されない。細胞表面マーカーを用いた網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の割合を向上させる方法は、例えば他の網膜組織の製造方法の一工程としても用いることができる。

　一態様において、分散された網膜系細胞集団において、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞は、例えば全細胞数の３０％以上を占めていてよく、全細胞数の５０％以上を占めていることが好ましく、全細胞数の８０％以上を占めていることがより好ましく、全細胞数の９０％以上を占めることがさらに好ましい。さらに、例えば、分散された網膜系細胞集団において、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーが陽性であり、かつ、Ｒｘ及び／又はＣｈｘ１０陽性である細胞（網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞）を、細胞集団の全細胞数に対して５０％以上含み、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上含む。さらに、上記細胞集団は、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上、好ましくは２以上、３以上又は全部の抗原が陰性であることが好ましい。ここでいう陰性とは、上述した基準値以下であればよい。

　一実施形態において、網膜前駆細胞の割合を高める工程（純化工程）が、以下の工程を含む：
（１）多能性幹細胞をＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体作用物質からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、細胞凝集体を製造する工程、
（２）細胞凝集体を網膜前駆細胞へ分化誘導させる工程、
（３）細胞凝集体を分散させ、ＣＤ３９に結合する物質（例：抗体）と接触させる工程。
工程（１）及び（２）の詳細は、「出発細胞としての網膜系細胞集団の分化誘導方法」に記載の通りである。

（分散された網膜系細胞集団又は神経系細胞集団の培養による層構造の再形成）
　本発明に係る網膜組織の製造方法は、分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養又は浮遊培養することを含む。いずれの培養方法によっても、分散された網膜系細胞集団から上皮構造（多層構造）を再形成させることが可能である。上皮構造（又は多層構造）を有するシート状網膜組織を製造するためには、接着培養が好ましい。本発明に係る製造方法は、分散された神経系細胞集団を出発細胞としても同様に実施ことができる。以下、分散された網膜系細胞集団を出発細胞として用いた場合について記載するが、特別の記載がない限り、分散された神経系細胞集団を出発細胞とした場合でも同様である。

　分散された網膜系細胞集団の培養に用いられる培地は、網膜系細胞が生存及び増殖可能な培地であれば特に限定されない。一態様において、分散された網膜系細胞集団の培養に用いられる培地としては、連続上皮組織維持用培地が挙げられる。一例として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、２１１０３０４９）にＢ２７サプリメント（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５８７０１０）を配合した培地を連続上皮組織維持用培地として挙げることができる。

　培地中に含まれるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、Ｗｎｔタンパク質であるＷｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３ａ等、及びその部分ペプチド等を挙げることができ、１つの物質であってもよく、２つ以上の物質であってもよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質、２以上の物質、又は３以上の物質である。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、分散された網膜系細胞集団を再凝集化させる過程において、凝集体を大きくするとともに、頂端面／基底膜の極性を有する上皮構造（又は多層構造）を再形成させることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質により、ロゼット様構造形成も抑制できる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、所望の細胞凝集体の形成（例えば、上皮構造（又は多層構造）の再形成）を誘導可能な濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合には、０．０１μＭ～１００μＭであってよく、好ましくは０．１μＭ～１０μＭ、より好ましくは１μＭ～１０μＭである。その他のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同程度のＷｎｔシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えばβ-Ｃａｔｅｎｉｎの発現の確認等の方法により測定可能である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、再シート化のための浮遊培養又は接着培養開始後できるだけ早い時期に添加する方が好ましい。一態様として、培養開始時からＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養日数は、頂端面／基底膜の極性を有する上皮構造（又は多層構造）を再形成させる効果が認められる範囲で特に限定されないが、例えば、１日間～１４日間である。

　一態様において、培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含んでいてよい。例えば、ＲＯＣＫ阻害剤の添加によって、分散された網膜前駆細胞集団の再凝集化を促進する効果が認められ、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質の添加によって、細胞凝集体の増殖を促進し、細胞凝集体を大きくする効果が認められ、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質（例：ＦＧＦ２、ＦＧＦ８）添加によって、細胞のダメージを軽減し、またＲＰＥ細胞への分化誘導が抑制される効果が認められる。

　ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ－２７６３２（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983(2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284(2000)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Uenata et al., Nature 389:990-994(1997)参照）、Ｈ－１１５２（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232(2002)参照）、Ｗｆ－５３６（例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324(2003)参照）及びそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくはＹ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質を含んでいる。

　ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、分散された網膜前駆細胞集団の再凝集化を促進することが可能な濃度であればよい。例えばＹ－２７６３２を用いる場合、０．１μＭ～１ｍＭであってよく、好ましくは１μＭ～１００μＭ、より好ましくは５μＭ～２０μＭである。Ｙ－２７６３２以外のＲＯＣＫ阻害剤を用いる場合には、上述した濃度のＹ－２７６３２と同程度のＲＯＣＫ阻害作用を示す濃度であればよい。ＲＯＣＫ阻害作用は、当業者であれば、例えばＭＬＣ２のリン酸化の発現解析等の方法により測定可能である。

　ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質とは、ＳＨＨ（Ｓｈｈと記載することもある）によって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白質（例えば、ＳｈｈやＩｈｈ）、ＳＨＨ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ；９－シクロヘキシル－Ｎ－［４－（４－モルホリニル）フェニル］－２－（１－ナグタレニルオキシ）－９Ｈ－プリン－６－アミン）、又はＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ；Ｎ－メチル－Ｎ’－（３－ピリジニルベンジル）－Ｎ’－（３－クロロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボニル）－１，４－ジアミノシクロヘキサン）等が挙げられる。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳｈｈ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００１９３、ＮＰ＿０００１８４）、ＳＡＧ又はＰＭＡからなる群から選択される１以上の物質である。

　ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、細胞凝集体を大きくする効果が認められる範囲の濃度であればよい。例えば、ＳＡＧは、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。ＳＨＨは、通常４～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬで使用される。その他のＳＨＨシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＳＡＧと同程度のＳＨＨシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。ＳＨＨシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えば下流のシグナル（ＳＭＯやＧＬＩ）の発現解析等の方法により測定可能である。

　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８及びＦＧＦ９）が挙げられる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である。

　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、ＲＰＥ細胞への分化誘導が抑制される効果が認められる範囲の濃度であればよい。例えば、ＦＧＦ２、４又は８を用いる場合、４～５００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは２５～１００ｎｇ／ｍＬ程度である。その他のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＦＧＦ８等と同程度のＦＧＦシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。ＦＧＦシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えば下流のシグナル（Ａｋｔ、ＭＥＫ）の発現解析等の方法により測定可能である。

　ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、培養開始時からＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。これらの物質は同時に培地に添加されることが好ましく、さらに、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質と同時に培地に添加されることが好ましい。一態様として、１日～１４日間、これらの物質を含む培地において分散された網膜系細胞を培養すればよい。

　浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７等）又はリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。

　浮遊培養は、例えば、分散された網膜系細胞を出発細胞として、ＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｆｌｏａｔｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｉｅｓ－ｌｉｋｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法（ＷＯ２００５／１２３９０）やＳＦＥＢｑ法（ＷＯ２００９／１４８１７０）を用いることにより行うことができる。

　接着培養とは、細胞を培養容器へ接着の状態で培養することであり、特に限定されないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理されている培養容器等を使用して行うことができる。接着培養は、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器等を用いて行われることが好ましい。一実施形態の網膜組織の製造方法として、温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程を含む。

　細胞外マトリクスでコーティングされた培養容器上で接着培養することにより、後述するシート状網膜組織を製造することができる。

　細胞外マトリクス存在下で培養することにより、細胞が基底膜側を認識することができるため、頂端面が形成されやすく、また、細胞が層方向に対して凡そ垂直方向に向き、より良好な層構造を有する網膜組織が得られる。温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器等を用いることにより、温度変化のみによって、形成された上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を容易に培養容器等から剥がすことができ、酵素処理が不要であり、そのため酵素処理により細胞間の結合が弱くなることなく、丈夫なシート状の網膜組織を回収することができる。そのため、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマー、特に細胞外マトリクス及び温度感受性ポリマーの両方によりコーティングされた培養容器等を用いることが好ましく、例えば、培養容器の培養面が、上記温度感受性ポリマーでコーティングされ、そのポリマーの上面が、上記細胞外マトリクスでコーティングされることが挙げられる。ここで、培養面とは、培養容器において、細胞が接着する面を指し、ポリマーの上面とは、ポリマーコーディングの培養面に接する面と反対の面を指す。

　細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子を意味し、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質、これらのタンパク質のフラグメント、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカン又はプロテオグリカン、マトリゲル等が挙げられる。細胞外マトリクスは、好ましくは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン及びこれらのタンパク質のフラグメントからなる群から選択される１以上の物質である。ラミニンフラグメントとして、例えば、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｉＭａｔｒｉｘ－４１１、ｉＭａｔｒｉｘ－２２１などの市販品が挙げられる。

　マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈｏｌｍ　Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルは、例えばＵＳ　ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．４８２９０００に開示された方法により調製することができ、市販のものを購入することもできる。マトリゲルの主成分はラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンである。

　温度感受性ポリマーとは、温度の変化によりポリマーの性質が変化するポリマーである。すなわち、水中で下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution temperature, LCST）を有し、ある温度を境にそれより高い温度ではその分子内、或いは分子間の疎水結合が強まりポリマー鎖が凝集し、逆に、低い温度ではポリマー鎖が水分子を結合し水和する相転移挙動を示す。具体的には、例えば、培養温度（約３７℃）においては器材表面の疎水性の状態を保ち、培養温度よりも低い温度、例えば２０～３０℃程度においては器材表面が親水性に変化し、培養細胞がはがれやすくなる温度感受性ポリマーが挙げられる。従って、細胞剥離において酵素処理を必要とせず、酵素処理による細胞への細胞と細胞の間にあるタンパク質を壊さず一枚の大きなシートとしても回収することが可能である。このような温度感受性ポリマーとしては、例えばポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）（ＬＣＳＴが３２℃）好ましく用いられる。通常細胞培養は約３７℃の条件下で行われ、低温による細胞へのダメージも考慮すると、ＬＣＳＴが約２０℃～３５℃の範囲の温度感受性ポリマーが好ましい。市販品として、温度感受性ポリマーが表面に固定された細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材（セルシード社：ＵｐＣｅｌｌ（登録商標））なども入手可能である。

　培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２～５％である。

　シート状網膜組織における層構造の形成及び、特に頂端面/基底面（Ａｐｉｃａｌ/Ｂａｓａｌの極性）の形成には、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が必要である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、層構造及び頂端面を有するシート状網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合には、０．０１μＭ～１００μＭであってよく、好ましくは０．１μＭ～１０μＭ、より好ましくは１μＭ～１０μＭである。その他のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同程度のＷｎｔシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。層構造が形成されているか否かは、当業者であれば、例えば顕微鏡での観察や、ＯＣＴ等の装置による厚みを計測することにより容易に判断することができる。頂端面が形成されているかどうかは、例えば抗Ｚｏ－１抗体や抗Ｅｚｒｉｎ抗体、抗ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ抗体を用いて染色することにより確認することができる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、接着培養開始後できるだけ早い時期に添加する方が好ましい。一態様として、培養開始時からＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養日数は、頂端面／基底膜の極性を有する多層構造（又は多層構造）を再形成させる効果が認められる範囲で特に限定されないが、例えば、１日間～１５日間、好ましくは１日間～９日間である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質等を除いた培地で培養を継続してもよい。培養を継続することにより、層構造は厚くなり、網膜系細胞の分化は進む。培養期間は、特に限定されず、播種した分散された網膜系細胞集団が増殖し、少なくとも上皮構造（又は多層構造）が形成されるまでの期間であればよく、目的とする分化段階のシート状網膜組織が製造されるまで培養すればよい。上皮構造（又は多層構造）の形成の観点から培養は、少なくとも７日間行われることが望ましい。培養期間は例えば、７日間から６０日間以下であってよく、４０日間以下、３０日間以下、２０日間以下、１６日間以下（例えば１６日間）であってもよい。

　上皮構造（又は多層構造）が形成された後においても、細胞を増殖させ、分化又は成熟させるために、さらに培養を継続してもよい。更なる培養に用いる培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はインテグリン伝達経路作用物質を含んでいても含まなくてもよい。

　「多層構造」とは、基底膜側と頂端側の極性を有する（すなわち上皮構造を有する）組織において、細胞が同一方向に並んでいる細胞層が２以上重ね合わせてできた構造であり、異なる層同士がそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行している構造である。当該多層構造は、基底面及び頂端面の極性を有する方が好ましく、基底膜及び一態様において、多層構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織であってよく、多層構造を有する網膜組織を含む細胞凝集体は、シート状細胞凝集体であってよい。また、一態様において、細胞層が神経網膜前駆細胞層、神経節細胞層、又は視細胞層であってよい。

　本発明の一態様では、多層構造において、細胞の向きが凡そ層方向に対して垂直方向になっていてよい。ここで、「細胞の向き」とは、核の形、細胞体の向きが、基底膜側と頂端側に伸びている方向性を示す。また、層方向に対して凡そ垂直方向とは、多層構造における層において一つ一つの細胞が接して並んでいる方向（すなわち、層の表面の接線方向）に直交する方向のことをいい、層に対して垂直方向又は縦方向のことをいう。

　本発明の一態様では、浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織（特にシート状網膜組織）を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含んでもよい。例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて切り出すことができる。

　一方、上述の方法でシート状網膜組織を製造した場合、一定の割合でＲＰＥ細胞が製造され混入するという課題を見出した。これらＲＰＥ細胞は目視により確認することができ、除去することもできるが、品質や製造効率の観点で当初からＲＰＥ細胞は含まれない方が好ましい。そこで、当該課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下に開示する方法を用いることにより、ＲＰＥ細胞の混入を大幅に減少させることが可能になった。

〔シート状網膜組織〕
　本発明の一態様は、上皮構造を有するシート状網膜（神経網膜）組織である。該シート状網膜組織の一態様は、多層構造を有する網膜系細胞層からなり、当該多層構造が基底面及び頂端面の極性を有し、上記多層構造を有する網膜系細胞層が網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、上記網膜系細胞層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている。ここで、「シート状」とは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層の構造体をいう。

　用いる培養器材に応じて、任意の大きさのシート状網膜組織を製造することができる点が、本発明の一つの利点である。すなわち、これまでに製造できなかった大きさのシート状網膜組織を製造することが可能であり、広い範囲に疾患が及ぶ場合に、１つのシートの移植により治療が可能となる。

　一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の長径（直径ともいう）は、例えば２ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上、７．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上である。一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の短径は、例えば２ｍｍ以上、３ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上である。原理上、長径及び短径に上限はないが、培養に用いるディッシュ等の大きさが限度になる。一態様として、長径は、１０ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、１ｃｍ以下であってよい。一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の高さは、例えば５０μｍ～１５００μｍであってよく、好ましくは２００μｍ～７００μｍである。

　シート状網膜組織の長径、短径及び高さを測定する方法は、特に限定されず、例えば、顕微鏡下で撮像した画像から測定すればよい。例えば、シート状網膜組織について、頂端面を対物レンズ側に向けた状態で撮像した正面画像と、切断面が対物レンズから見て垂直になるよう傾けた状態で撮像した横面画像とを、実体顕微鏡で撮像し、撮像した画像から測定できる。ここで、長径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。短径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分で長径と直交する線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。高さとは、該シート断面に直交する線分で、該シート断面との交点と網膜シートの頂点を端点とする線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。

　基底面及び頂端面は上述の定義に記載した通りである。「多層構造が基底面及び頂端面の極性を有し」とは、多層構造の一方に基底面が存在し、他方に頂端面が存在することを意味する。基底面上には、基底膜が存在していてもよい。

　「細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向」とは、網膜系細胞層の各層に存在する細胞の長径が、層方向に対し凡そ垂直方向を向いていることを意味する。凡そ垂直方向とは、層方向と細胞の長径がなす鋭角が、凡そ７５°（又は８０°）以上９０°以下である。本明細書において、各層に存在する細胞の約５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上が、層方向に対して凡そ垂直方向に向いていれば、「細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている」と判断する。

　シート状網膜組織はＲＰＥ細胞を含まない方が好ましい。一態様において、シート状網膜組織における総細胞数に対するＲＰＥ細胞数の割合は、１０％以下、好ましくは９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下である。シート状網膜組織における総細胞数に対するＲＰＥ細胞数の割合は、例えば上述したＲＰＥ細胞のマーカーを発現する細胞の割合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）等を用いて測定することが可能である。一態様において、シート状網膜組織の総面積におけるＲＰＥ細胞の面積の占める割合は、１０％以下、好ましくは９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下である。ＲＰＥ細胞は黒色を呈するため、シート状網膜組織の総面積におけるＲＰＥ細胞の面積の占める割合は、顕微鏡下において黒色を示す面積の割合から算出することが可能である。また、ＲＰＥ細胞のマーカーを発現する細胞を、ＰＣＲ等によって検出することも可能である。なお、シート状網膜（神経網膜）組織におけるＲＰＥ細胞の割合を減少させる方法は上述した通りである。

　一実施形態の多層構造を有する網膜系細胞層からなるシート状網膜組織は、
（１）当該多層構造を有する網膜系細胞層が基底面及び頂端面の極性を有し、
（２）上記多層構造を有する網膜系細胞層が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（３）上記網膜系細胞層の各層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっており、かつ、
（４）直径が８ｍｍ以上である。

（シート状網膜系細胞層（神経網膜）－網膜色素上皮細胞の複合体（複合シート））
　本発明の一態様として、上記多層構造を有する網膜系細胞層が、上記網膜系細胞層に接合しているシート状網膜色素上皮細胞をさらに含んでもよく、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、上記網膜系細胞層の頂端面と上記シート状網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、かつ、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とは両者の間に存在する接着因子により接合している複合体（複合シート）が挙げられる。シート状神経網膜は、神経網膜シート又はＮＲシートともいい、シート状網膜色素上皮細胞は、網膜色素上皮細胞シート又はＲＰＥ細胞シート（ＲＰＥシート）ともいう。すなわち、本発明の一態様は、神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート）も提供する。本発明の別態様として、シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）の頂端面側に、分散された網膜色素上皮細胞が接着因子により接合した、複合体（複合シート）も挙げられる。

　本明細書の複合体において、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞シートとは、それぞれ接線方向が凡そ平行している。「接線方向が凡そ平行している」とは、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートの向かい合った面の接線方向が平行していることを意味する。また、本発明に係る複合体において、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っている。すなわち、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが近接した状態で存在する。

　神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート）は、後述する通り、接着因子の存在下で、シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）とＲＰＥ細胞シート若しくは分散されたＲＰＥ細胞とを接合させることで準備することができる。シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）は、上述の上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を含む細胞凝集体の製造方法によって製造することができる。ＲＰＥ細胞シートは、後述の網膜色素上皮細胞シートの製造方法によって製造することができる。

（網膜色素上皮細胞シートの製造方法）
　網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、多能性幹細胞由来であり、具体的に多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。網膜色素上皮細胞を製造する方法は、ＷＯ２００５／０７００１１、ＷＯ２００６／０８０９５２、ＷＯ２０１^１／０６３００５、ＷＯ２０１２／１７３２０７号、ＷＯ２０１５／０５３３７５号、ＷＯ２０１５／０５３３７６号、ＷＯ２０１５／０６８５０５号、ＷＯ２０１７／０４３６０５、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２（２），　２０５－２１８　（２０１４）及びＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　１０（６），　７７１－７８５　（２０１２）に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。また、上述したＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法を改良することで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞シートを調製することも可能である。網膜色素上皮細胞は、細胞シート又はスフェア状細胞凝集体として製造されてもよい。スフェア状細胞凝集体として製造された場合、例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製可能である。

　ＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法の改良法としては、上述した方法のうち、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）分化誘導一日前にＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、２）分化誘導開始時にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を処理しない条件で培養する。その後、上述した工程（Ｂ）及び（Ｃ）を行う。さらに、上記工程（Ｄ）の開始時期を早める方が好ましい。具体的には、工程（Ｂ）の浮遊培養開始９日前後（例：７日、８日、９日、１０日、１１日後）に工程（Ｄ）を開始する。その後、上述した工程（Ｅ）を実施すればよい。本方法により、スフェア状のＲＰＥ細胞の細胞凝集体が得られる。当該細胞凝集体を分散させて細胞懸濁液にしてもよいし、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。分散させた細胞懸濁液を接着培養で培養することにより、ＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。また、ＲＰＥ細胞シート又はＲＰＥ細胞の凝集体の分散により、分散されたＲＰＥ細胞を得ることもできる。

　網膜色素上皮細胞シートは、神経網膜の細胞凝集体と接触させる前に、多角形又は敷石状の細胞形態を有するまでさらに培養してもよい。この場合の培地は、特に限定されないが、網膜色素上皮細胞の維持培地（以下、ＲＰＥ維持培地と記載することもある。）に交換し、さらに培養することもできる。それにより、さらにはっきりとメラニン色素沈着細胞群や基底膜に接着する多角扁平状の形態を有する細胞群を観察することができる。ＲＰＥ維持培地による培養は、網膜色素上皮細胞の性質が維持されたまま増殖するコロニーが形成される限り限定されないが、例えば３日に１回以上の頻度で全量培地交換を行いながら５日以上（例：５～２０日間程度）培養を行う。当業者であれば、当該形態を確認しながら、培養期間を容易に設定することができる。網膜色素上皮細胞の維持培地は、例えばＩＯＶＳ，Ｍａｒｃｈ２００４，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．３、ＭａｓａｔｏｓｈｉＨａｒｕｔａら，ＩＯＶＳ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２０１１，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１２、Ｏｋａｍｏｔｏら，ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１２２（１７）、ＦｕｍｉｔａｋａＯｓａｋａｄａｒら，ｅｂｒｕａｒｙ２００８，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．２、Ｇａｍｍらに記載のものを使用することができる。

　網膜色素上皮細胞シートの長径はシート状網膜組織（神経網膜シート）の長径と同じであってもよい。一態様において、網膜色素上皮細胞シートの長径は、例えば３ｍｍ～５０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。

　網膜色素上皮細胞シートの短径はシート状網膜組織（神経網膜シート）の短径と同じであってもよい。一態様において、網膜色素上皮細胞シートの短径は、例えば２ｍｍ～４０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。

　網膜色素上皮細胞シートのメラニン色素沈着の程度は特に限定されない。網膜色素上皮細胞シート中に含まれる網膜色素上皮細胞におけるメラニン色素沈着の程度は、細胞間で同程度である方が好ましい。一態様として、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、２０ｐｇ／細胞未満、１５ｐｇ／細胞未満、１０ｐｇ／細胞未満、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、１ｐｇ／細胞未満であってよい。また、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、０．１ｐｇ／細胞以上、０．５ｐｇ／細胞以上、１ｐｇ／細胞以上、２ｐｇ／細胞以上、５ｐｇ／細胞以上であってもよい。

　網膜色素上皮細胞シート中のメラニン含有量は、例えば、網膜色素上皮細胞シートを分散させた後、ＮａＯＨなどを用いて抽出した細胞抽出物を用いて、分光光度計等を用いて測定することができる。平均メラニン含有量は、メラニン含有量を網膜色素上皮細胞シートに含まれる総細胞数で除することにより求めることができる。

　上述の複合体は、神経網膜シートと分散されたＲＰＥ細胞又はＲＰＥ細胞シートを接合させることによって製造することができる。神経網膜シートとＲＰＥ細胞シートを接合させた複合シートの方が好ましい。上述の神経網膜シート及びＲＰＥ細胞シートは、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いることにより、培養器材より容易に取り出すことができる。取り出した両シートを新たな容器（培養器材など）に移してもよいが、一方を培養器材中に残したまま、別の一方を当該培養器材中に移してもよい。同じ大きさの培養器材で製造することにより、接合させるシート状組織の大きさを揃えることができる。また、接触させる神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞について、上述の製造方法における異なる培養日数の神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞を用いる場合、製造を開始する日をずらせばよい。

　上述の神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞は、接着因子の存在下で接触させることが好ましい。接着因子とは、細胞同士を接着させる作用を有している物質を意味し、特に限定はないが、例えば、上述した細胞外マトリクスや人工的なハイドロゲル等が挙げられる。接着因子は、単離された単一の物質である必要はなく、例えばマトリゲル、視細胞間マトリクス、血清等の生体や細胞からの調製物も含まれる。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈｏｌｍ　Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルは、例えばＵＳ　ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．４８２９０００に開示された方法により調製することができ、市販のものを購入することもできる。マトリゲルの主成分はラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンである。視細胞間マトリクスは、生体網膜における視細胞等の網膜系細胞の間に存在する細胞外マトリクスの総称であり、例えばヒアルロン酸が含まれる。視細胞間マトリクスは、当業者であれば、例えば網膜を蒸留水中に置き、膨張させて分離するという方法により、生体網膜から採取することが可能であり、市販のものを購入することもできる。接着因子としては、細胞外マトリクス又はハイドロゲルであることが好ましい。さらに、細胞外マトリクスとして、ヒアルロン酸、フィブリン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンからなる群から選択される１又は複数の細胞外マトリクスであることが好ましい。ハイドロゲルとして、ゼラチン、フィブリン、コラーゲン、ペクチン、ヒアルロン酸、アルギン酸からなる群から選択される１又は複数のハイドロゲルであることが好ましい。細胞外マトリクス及びハイドロゲルのどちらにも分類される物質が存在するが、本明細書においては、ゲル状の接着因子として用いる場合には、ハイドロゲルとして扱う。市販の細胞外マトリクスとしては、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス、ｉＭａｔｒｉｘ５１１等が挙げられる。接着因子としては、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質であってよく、特に、ゼラチン又はフィブリンであることが好ましい。

　フィブリンゲルとは、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液とを反応させることで得られるゲル状フィブリンである。市販のボルヒール（登録商標）組織接着用を使用することもできる。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を接触又は混合させることで、両者を反応させることができる。

　「ゼラチン」とは、水に不溶性のコラーゲンを、例えば酸あるいはアルカリで前処理し、熱加水分解するなどにより可溶化したものである。市販のゼラチンを入手することも可能であり、例えば、ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、非加熱処理ゼラチン、高ゼリー強度）、ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、加熱処理ゼラチン、低ゼリー強度）が挙げられる。アルカリ処理（石灰処理）ゼラチン（Ｂタイプゼラチン）が好ましく、加熱処理ゼラチンが好ましい。

　ハイドロゲルは、加熱又は冷却によって、溶液がゲルからゾル、ゾルからゲルに相変化する。ハイドロゲルは、冷却して流動性を失うことでゲル（ゼリー）化し、加熱して流動性を獲得することによりゾル（水溶液）化する。ここで、「融解点」とは、一定圧力のもとで、ゾル化する温度を意味し、「凝固点」とは、一定圧力のもとで、ゲル化する温度を意味する。ハイドロゲルは、生体で分解される方が好ましい。一態様として、融解点が体温付近の温度（２５℃～４０℃）のハイドロゲル（例：ゼラチン）が好ましい。本明細書におけるハイドロゲルは、融解点が２０℃～４０℃（例：２０℃～３５℃、２５℃～３５℃、３０℃～４０℃、３５℃～４０℃）であってもよい。一般に、ゲルの融点は、ネットワークの強さの尺度であり、ハイドロゲルの濃度及び分子量の上昇に伴い、ハイドロゲル（例：ゼラチン）の融解点は上昇する。また、例えば、糖類により固形分を増加させると融解点及び凝固点は上昇する傾向にある。このように、一定の範囲で融解点及び凝固点を変動させることが可能である。ハイドロゲルの融解点の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＪＩＳ　Ｋ６５０３に定められた方法によって測定できる。

　ハイドロゲルの強度は、移植のための操作においてハイドロゲルが崩れない程度であればよい。ハイドロゲルの強度の指標として「ゼリー強度」がある。ハイドロゲルの「ゼリー強度」とは、ゲルを形成した物体の機械的強度を意味する。通常一定形状のゲルを変形させるのに要する力又はゲルを破断させるのに要する力（単位：ｇ、ｄｙｎｅ（ｓ）／ｃｍ^２又はｇ／ｃｍ^２）で表現され、主としてゲルの硬さの尺度である。なお、１ダイン（ｄｙｎｅ（ｓ））は、質量１グラム（ｇ）の物体に働くとき、その方向に１センチメートル毎秒毎秒（ｃｍ／ｓ^２）の加速度を与える力と定義される。例えば、ゼラチンのゼリー強度は、ＪＩＳ　Ｋ６５０３に定められた方法において測定することができる。本明細書において、例えば、ハイドロゲル（例：ゼラチン）ゲルのゼリー強度は、５０ｇ以上、１００ｇ以上、２００ｇ以上、５００ｇ以上、１０００ｇ以上、１２００ｇ以上、１３００ｇ以上、１４００ｇ以上又は１５００ｇ以上であってよい。また、ハイドロゲル（ゼラチン）のゼリー強度は、３０００ｇ以下、２５００ｇ以下又は２０００ｇ以下であってよい。

　接着因子（細胞外マトリクス）の濃度は、神経網膜シート若しくは網膜色素上皮細胞シートの大きさや網膜色素上皮細胞の細胞数により異なるが、当業者であればＲＰＥ細胞の接着の状態を確認することにより容易に設定可能である。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌであれば、既製品（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を２００～１００００倍希釈した濃度、ｉＭａｔｒｉｘ５１１であれば、０．１～５μｇ／ｍＬの濃度で添加するのが好ましい。

　細胞外マトリクスを用いた上記複合体の製造方法の一態様として、接着因子（細胞外マトリクス）を含む媒体中で、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートとを接着させるための培養を行えばよい。使用する媒体としては、特に限定されないが、例えば、網膜色素上皮細胞又は神経網膜の培養に用いられる培地（例：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、これらの混合培地、ＲＰＥ維持培地等）が挙げられる。また、細胞外マトリクスと共に、ＥＧＦ等の成長因子等の他の成分の存在下で接着のための培養を行ってもよい。上述した神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートとを接着させるための培養期間中、継続して接着因子を含む上記媒体中で培養してもよいし、接着因子を含む上記媒体中で一定期間（例：１日～１０日間）培養後、接着因子を含まない媒体に交換して培養を継続してもよい。

　神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを接着させるための培養を行う前に、神経網膜シート又は網膜色素上皮細胞若しくは網膜色素上皮細胞シートを接着因子でコーティングしてもよい。具体的には、接着因子を含む上記媒体中で、神経網膜シート又は網膜色素上皮細胞若しくは網膜色素上皮細胞シートを培養すればよい。当業者であれば培養時間は適宜設定可能であるが、１０分～５時間（例えば、１０分～６０分）程度培養すればよい。培養後、ＰＢＳ等の媒体により洗浄してもよい。

　接着因子、ハイドロゲルもしくはマトリクスゲルは好ましくはフィブリンゲルである。フィブリンゲルとは、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液とを反応させることで得られるゲル状フィブリンである。本明細書において、反応によってゲルを形成する性質の物質をマトリクス前駆体といい、例えば、反応することによってフィブリンゲルを形成するトロンビン及びフィブリノーゲンはマトリクス前駆体の一例である。フィブリノーゲン溶液は、フィブリノーゲン粉末などを、アプロチニンを含むフィブリノーゲンを溶解できる溶解液に溶解させることで作製でき、その濃度は特に限定されないが、例えば４０～４８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、８０ｍｇ／ｍＬ～３２０ｍｇ／ｍＬ（例：１６０ｍｇ／ｍＬ）である。また、正常人血漿１ｍＬ中に含まれる血液凝固第ＶＩＩＩ因子活性を１単位とした時、３７．５単位／ｍＬ～２２５単位／ｍＬ（例：７５単位／ｍＬ）であってよい。トロンビン溶液は、トロンビン粉末などを、塩化カルシウム水和物を含むトロンビン溶解液に溶解させることで作製でき、その濃度は特に限定されないが、例えば１２５単位／ｍＬ～７５０単位／ｍＬ（例：７５単位／ｍＬ）である。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を接触又は混合させることで、両者を反応させることができ、その際、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を活性比で、１：１～１：９、好ましくは１：３～１：４の範囲で使用されることが好ましい。

　ハイドロゲルを用いた上記複合体の製造方法の一態様として、フィブリンゲルを用いた複合体の製造方法を下記に示す。具体的には、フィブリノーゲン及びトロンビンを反応させることによって生成するフィブリンゲルにより、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを接着させる。

　一態様において、上記の２つの組織のうち、フィブリノーゲン溶液を接触させた１の組織（神経網膜又は網膜色素上皮細胞）、及び、トロンビン溶液に接触させた他の１の組織（網膜色素上皮細胞又は神経網膜）を、互いに接触させることでフィブリノーゲン及びトロンビンを反応させて、ゲル化させてもよい。ここで溶液との接触とは、少なくとも組織の接着面（フィブリンゲルによって他の組織と接着する際、他の組織に向いている面）をフィブリノーゲン溶液又はトロンビン溶液に、溶液によって組織の接着面に付着する程度に触れさせることをいう。

　より具体的には、例えば、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞シートとを接着させる場合、神経網膜シートをフィブリノーゲン溶液に浸し、網膜色素上皮細胞シートをトロンビン溶液に浸していればよい（溶液は逆でもよい）。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を、容量比で、３：１～１：３の範囲で使用されることが好ましい。接着させる前に、組織に付着した余分のフィブリノーゲン又はトロンビンを取り除いてもよい。この操作によってフィブリンゲルの厚さを調整することができる。

　フィブリノーゲン溶液を接触させた神経網膜シートと、トロンビン溶液に接触させた網膜色素上皮細胞シートとを接着させるために、両者を接触させればよい。ここで組織を接触させるとは、フィブリノーゲン溶液が付着した面と、トロンビン溶液が付着した面とを接触させる、すなわち、重ね合わせることをいう。また、網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜が、それぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞シートの頂端面とが向き合うように、両者を接着させることが好ましい。

　一態様において、上記の組織をフィブリノーゲン溶液に接触させ、続いてトロンビン溶液をフィブリノーゲン溶液に添加することでフィブリノーゲン及びトロンビンを反応させてもよい。この場合、上記の組織がフィブリンゲルに包埋される。

　一態様において、本発明の製造方法は、複合体から、移植に必要な大きさの複合体を切り出す工程をさらに含んでもよい。フィブリンゲルによって２以上の組織が強固に接着されているため、複合体から移植片を切り出す際に、複合体から組織が剥がれることなく、容易に所望のサイズに切り出すことができる。切り出す際は、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いることが可能である。

〔医薬組成物、治療方法、治療薬及び使用〕
　本発明の一態様として、シート状網膜組織を含む医薬組成物が挙げられる。医薬組成物は好ましくは、本発明のシート状網膜組織の他にさらに医薬として許容される担体を含む。医薬組成物は、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患の治療に使用し得る。神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性疾患、黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー等の眼科疾患が挙げられる。神経網膜の損傷状態としては、例えは、視細胞が変性死している状態等が挙げられる。

　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、医薬組成物には、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

　本発明の一態様として、本発明で得られるシート状網膜組織を含む、神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。また、本発明の一態様として、本発明で得られるシート状網膜組織を、移植を必要とする対象（例えば、眼科疾患が起きている眼の網膜下）に移植することを含む、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患を治療する方法が挙げられる。神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬として、又は、当該神経網膜の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明のシート状網膜組織を用いることができる。移植を必要とする、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患を有する患者、又は神経網膜の損傷状態の患者に、本発明のシート状網膜組織を移植し、当該神経網膜系細胞又は、障害を受けた神経網膜を補充することによって、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患、又は神経網膜の損傷状態を治療することができる。移植方法としては、例えば、眼球の切開などにより損傷部位の網膜下にシート状網膜組織を移植する方法が挙げられる。移植する方法としては、例えば細い管を用いて注入する方法やピンセットで挟んで移植する方法が挙げられ、細い管としては注射針等が挙げられる。

　本発明の一態様として、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療に使用するための、本発明で得られるシート状網膜組織を提供する。また、本発明の一態様として、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬の製造における、本発明で得られるシート状網膜組織の使用を提供する。

　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

＜実施例１　凝集体再形成因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株（非特許文献３））、及びヒトｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株、京都大学より入手）を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　４，　３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　具体的なヒトＥＳ及びヒトｉＰＳ細胞（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞）の維持培養操作は、以下のように行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。なお、ここで、単一細胞への分散とは、単一細胞となるように分散することであり、単一細胞に分散された細胞集団は、単一細胞のほか、２～５０個の細胞の塊を含み得る。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ^２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の播種細胞数は１ウェルあたり０．４～１．２×１０^４細胞とした。播種した１日後に、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１～２日に１回Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、サブコンフレントに達する１日前までフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、０日目）に、上記無血清培地にＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、終濃度１０μＭ又は２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ、又は０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧを含まず、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ用いた。浮遊培養開始後６日目以降、３日に１回Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。

　ＫｈＥＳ－１由来の細胞凝集体については、さらに当該浮遊培養開始後１４日目から１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（浮遊培養用シャーレ　９０Φ（深型）、住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（浮遊培養用シャーレ　９０Φ（深型）、住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ０培地）で長期培養した。

　浮遊培養開始後１６日目（１２３１Ａ３由来）又は２７日目（ＫｈＥＳ－１由来）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃で２０～３０分間インキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２×１０^５細胞（ＫｈＥＳ－１由来）又は５×１０^５細胞（１２３１Ａ３由来）になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。細胞添加と同時に、（１）添加無し（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）１０μＭ又は２０μＭ（１２３１Ａ３由来）　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０μｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社）、（５）１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、（６）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）１０μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社）、（８）３μＭ　ＩＷＲ－１（Ｗａｋｏ社）をそれぞれ添加した。

　（１）～（８）のいずれの条件においても２週間程度培養すると凝集体が再形成されることが確認されたが（実施例３の結果を参照）、Ｙ－２７６３２を添加した場合、凝集体の再形成のための浮遊培養後１～２日目（Ｄａｙ１～Ｄａｙ２）から凝集体が再形成されていることが確認された（図１:ＫｈＥＳ－１、図２:１２３１Ａ３）。一方で、Ｙ－２７６３２以外の化合物では、早期の凝集体の再形成促進効果は認められなかった（図１及び図２）。よって、単一細胞に分散された網膜前駆細胞において、Ｙ－２７６３２を添加することで、早期から凝集体の再形成を促進することがわかった。

＜実施例２　層構造形成促進因子及び凝集体増殖促進因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後２０日目（１２３１Ａ３）及び２７日目（ＫｈＥＳ－１）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２～５×１０^５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。細胞添加と同時に、（１）添加無し（１０μＭ　Ｙ－２７６３２のみ）、（２）３０ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社）、（５）１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、（６）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）１０μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社）、（８）３μＭ　ＩＷＲ－１（ＫｈＥＳ－１由来）又は１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（１２３１Ａ３由来）を添加した。

　凝集体再形成のための浮遊培養後１日目、７日目、及び１４日目に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）にて観察した。ＫｈＥＳ－１由来細胞の結果を図３～５に示す。また、凝集体の面積をＩｍａｇｅ　Ｊにて計測した。ＫｈＥＳ－１由来細胞の結果を図６に示す（１２個計測した平均値）。また、浮遊培養後１日目の凝集体の再形成状態を観察した１２３１Ａ３由来細胞の結果を図７に示す。図３～７により、Ｙ－２７６３２に加えてＳＡＧ（３００ｎＭ）又はＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）を添加した群は、Ｙ－２７６３２のみ添加した群より大きな凝集体が再形成されていることが確認された。よって、ＳＡＧとＣＨＩＲ９９０２１は凝集体の増殖、再形成を促進する効果が確認された。

＜実施例３　層構造形成促進因子及び凝集体増殖促進因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり３．０×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。細胞添加と同時に（１）添加無し（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（５）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（６）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（８）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を添加した。

　凝集体再形成のための浮遊培養後１日目、１４日目及び２８日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２８）、すなわち、分化誘導のための浮遊培養開始後２７日目、４０日目及び５４日目（ｄｄ２７、ｄｄ４０、ｄｄ５４）に凝集体の再形成状態を観察した結果を図８、図９、図１０に示す。図８、図９、図１０により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した際、凝集体が再形成されていることが確認された。またＣＨＩＲ９９０２１に加えてＳＡＧを添加すると凝集体がより大きいことが確認された。

　凝集体の再形成のための浮遊培養後１５日目（分化４１日目相当）及び２８日目（分化５４日目相当）凝集体を、４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗β－Ｃａｔｅｎｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗Ｚｏ－１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）抗体（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗ＣＲＸ抗体（Ａｂｎｏｖａ社）、抗ＮＲＬ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、抗Ｉｓｌｅｔ－１抗体（ＤＳＨＢ社）、抗ＧＳ抗体（Ｓｉｇｍａ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて免疫染色を行った。

　これらの免疫染色された切片を、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡観察（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＳＰ－８）を用いて観察し、その結果を図１１～２０に示す。図１１、図１４、図１５、図１８により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、凝集体の最も外側にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜前駆細胞が含まれる層構造が形成されていることを確認した。また、図１２、図１６、図１７により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、凝集体の最も外側にＺｏ－１陽性の頂端面が、内部にコラーゲン陽性の基底面が形成されており、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有する上皮組織が形成されていることを確認した。一方で特に図１７のように、ＣＨＩＲ９９０２１を添加していない群では、細胞の極性がない、もしくはロゼット様の構造を示していることが観察された。さらに、図１９、図２０により、ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）陽性及びＣＲＸ陽性の錐体前駆細胞、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性及びＣＲＸ陽性の視細胞前駆細胞が分化していることが確認され、Ｉｓｌｅｔ－１陽性及びＢｒｎ３陽性の網膜神経節細胞、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性アマクリン細胞の分化も確認された。

　これらの結果から、一度分散した網膜系細胞の単一細胞懸濁液において、ＣＨＩＲ９９０２１を添加することで、Ａｐｉｃａｌ　ｂａｓａｌの極性を有する上皮組織としての網膜組織を再組織化・網膜分化できることが分かった。

＜実施例４　凝集体再形成させる分化時期について＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後１８日目、２５日目、４０日目、６１日目、及び７５日目（ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ４０、ｄｄ６１、ｄｄ７５）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２～５×１０^５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。

　凝集体の再形成のための培養３日目、１５日目、２１日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ２１）に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した結果を図２１に示す。図２１により、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ４０、ｄｄ６１、ｄｄ７５のどの分化日数の細胞凝集体においても、凝集体が再形成され、層構造が形成されていることが確認された。また、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜組織の特性が維持されていることが観察された（図２１）。

　これらの結果から、どの分化段階の網膜組織においてもＹ－２７６３２並びにＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を添加することで凝集体を再形成できることがわかった。

＜実施例５　脳オルガノイドの再凝集体形成について＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始後３日目に、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧを含まず、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ用いた。また、脳オルガノイドを作製するために、ＢＭＰ４を添加しない群をおいた。浮遊培養開始後６日目以降、３日に１回Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。

　このように作製された浮遊培養開始後４０日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散した細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり５×１０^５細胞になるように、１０ｍＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。

　凝集体の再形成のための培養３日目、１５日目、２１日目に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡した結果を図２２に示す。図２２により、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の終脳オルガノイドにおいても、網膜オルガノイドと同様に凝集体が再形成され、層構造が形成されていることが確認された。

　これらの結果から、網膜オルガノイドだけでなく終脳オルガノイド等の神経上皮組織においても凝集体を再形成できることがわかった。

＜実施例６　凍結保存検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後３１日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。

　分散後、非凍結群においては、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２．０×１０^５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。

　分散後、凍結群として、陰性対照のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）と、以下の凍結保存液、Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１（ＴａＫａＲａ社）、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ（ＴａＫａＲａ社）、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ；富士フイルム和光純薬株式会社）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）　Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて、上記単一細胞を１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、バイセルを用いて－８０℃にて凍結保存した。

　凍結保存１日後、起眠し、生細胞率を確認した。起眠直後の生細胞率は、ＰＢＳ群では激減したが、いずれの凍結保存液でも生細胞率は高く、ＳＴＥＭｄｉｆｆ以外の凍結保存液（Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）では、非凍結と遜色なく９０％以上を示した（図２４（Ａ））。

　これらの細胞を、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２×１０^５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬのＮｕｃＴ０培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。

　播種１日後、いずれの凍結保存液（Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）においても、非凍結と比較して遜色なく凝集体が再形成されていることが確認された（図２３、図２４（Ｂ））。特に、Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１では、他の凍結保存液で見られる凝集体の周辺部に存在する小さなＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞凝集体が確認されず、非凍結に近い観察像が得られた（図２３）。

　凝集体の再形成のための培養７日後、いずれの凍結保存液においても、非凍結と比較して遜色なく凝集体が再形成されていることがわかった。

　これらの結果から、一度分散して得られた網膜系細胞の単一細胞懸濁液を、凍結保存させても、起眠後、Ｙ－２７６３２、ＳＡＧ、及びＣＨＩＲ９９０２１を添加して培養することで、凝集体を再形成させることができることがわかった。

＜実施例７　網膜凝集体の発現している足場タンパク質について＞
　実施例１～６の検討で、網膜系細胞を分散し、多能性幹細胞を網膜分化させて網膜系細胞を含む細胞凝集体を得て、細胞凝集体を分散して単一細胞懸濁液を得て、当該単一細胞懸濁液を、播種時にＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及びＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を添加して浮遊培養することで、層構造を持ち、極性を有する網膜組織を再組織化できることがわかった。次に、広いシート状網膜組織を作製するための検討として、接着培養を行うことを構想した。そして、接着培養するための、細胞外マトリクスを検討することとした。

　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後２５～３５日後の凝集体を４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｌａｍｉｎｉｎ抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｌａｍｉｎｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）、抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、凝集体は少なくとも基底膜の構成成分であるＬａｍｉｎｉｎやＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶを発現していることを確認した（図２５）。すなわち、この自己組織化培養系では、ヒト網膜組織が自ら基底膜を形成し、ＬａｍｉｎｉｎやＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶを発現することがわかった。

　公知の基底膜に特化したマウス胎児の組織染色に関するデータベース（MOUSE BASEMENT MEMBRANE BODYMAP; http://dbarchive.biosciencedbc.jp/archive/matrixome/bm/home.html）の情報から、マウスの胎児神経網膜組織において発現しているＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームを調査した。その結果、ＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームとしてＬａｍｉｎｉｎαが１、４、５、Ｌａｍｉｎｉｎβが１，２、Ｌａｍｉｎｉｎγが１ということが明らかとなった（図２６）。

　この結果から、神経網膜組織に適した細胞外マトリクスとして、Ｌａｍｉｎｉｎα、Ｌａｍｉｎｉｎβ、Ｌａｍｉｎｉｎγの組み合わせで、Ｌａｍｉｎｉｎの５１１、５２１、４１１、４２１、１１１、１２１（特に５１１、５２１、４１１）が有用である可能性が示唆された。

　すなわち、接着培養でシート状網膜シートを再形成させるための、細胞外マトリクスとして、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１、Ｌａｍｉｎｉｎ５２１、Ｌａｍｉｎｉｎ４１１、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ等が有用である可能性が示唆された。

＜実施例８　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種　細胞外マトリクス検討＞
　実施例１～６の検討で、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、浮遊培養で、層構造を持つ網膜組織を含む凝集体を再形成させる手法を検討した。実施例７にて、接着培養に用いる細胞外マトリクスの候補を検討した。これらを組み合わせ、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養での、シート状網膜組織の再形成法（再シート化）を検討した。

　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後１６日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。

　再シート化を促進させる細胞外マトリクスとして、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）とＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名ｉＭａｔｒｉｘ５１１、ニッピ社製）を用いた。上記分散した網膜系細胞の単一細胞を、以下の３条件で２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、１ウェル当たり０．５～４×１０^５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地に浮遊させて播種した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ｇｆＣＤＭ）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
条件１：Ｍａｔｒｉｇｅｌで予めコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに播種（Ｍａｔｒｉｇｅｌ　（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ））
条件２：Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８で予めコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに播種（ｉＭａｔｒｉｘ５１１　（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ））
条件３：予めコートをしなかった２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８を添加した培養液を用いて細胞を播種（Ｍｉｘ法）。

　凝集体の再形成のための培養１４日以降、いずれの条件においてもシート状の細胞凝集体（細胞シート）が形成された。シート状の細胞凝集体を４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（ＥｘＡｌｐｈａ社）、抗Ｚｏ－１抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｚｏ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）、Ｍｉｘ法の全てにおいて、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜前駆細胞が存在することが確認された（図２７）。さらに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）及びｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）の条件では、Ａｐｉｃａｌ面（上皮組織のｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎはＡｐｉｃａｌ面に形成される）のマーカーであるＺｏ－１が、シート状の細胞凝集体の上側（ウェルに接していない側）に、Ｂａｓａｌ面のマーカーであるＣｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶが、シート状の細胞凝集体の下側（ウェルに接している側）にて確認された（図２８）。ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有するＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが再形成されていることが確認された。一方で、細胞外マトリクスを同時に投与するＭｉｘ法では極性が形成されていないことが確認された。

　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８もしくはＭａｔｒｉｇｅｌを足場として事前にコートすることでＡｐｉｃａｌ－ｂａｓａｌの極性を有するシート状網膜組織を再度作製（再シート化）できることが分かった。

＜実施例９　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化　ＣＨＩＲ９９０２１の効果確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後１５～３０日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり８×１０^５細胞となるように（１）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（２）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（３）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（４）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で接着培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養１４日に得られた細胞シートを観察したところ、全ての条件において、細胞が生着していることが観察された（図２９）。そこで、これらの細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｚｏ－１抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｚｏ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有するＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが再度形成されていることが確認された。一方で、ＣＨＩＲ９９０２１を添加しなかった場合、Ａｐｉｃａｌ面が構成されず、極性が形成さていないことが確認された（図３０）。

　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、ＣＨＩＲ９９０２１を添加することでＡｐｉｃａｌ－ｂａｓａｌの極性を有する網膜シートを再度作製できることが分かった。

＜実施例１０　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化　ＣＨＩＲ９９０２１の濃度・添加期間の検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後３３日（ｄｄ３３）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２～４×１０^５細胞となるように播種し、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）に加え、１μＭ、３μＭ又は９μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地を添加し、３日間（０～３日目）又は６日間（０～６日目）又は９日間（０～９日目）、３７℃、５％ＣＯ_２で接着培養した。播種３日以降に３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養１４日後（Ｄａｙ１４、ｄｄ４７）に得られた細胞シートを、観察したところ、ＣＨＩＲ９９０２１を９μＭで６日間、９日間添加群以外は生着していることが観察された（図３１）。そこで、これらの細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩを用いて免疫染色を行った。ＣＨＩＲ９９０２１を１μＭから９μＭで３日間から９日間添加することで、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが厚く再形成されていることが確認された（図３２）。

　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、ＣＨＩＲ９９０２１を少なくとも１～９μＭで３～９日間添加することで網膜シートを再度作製できることが分かった。

＜実施例１１　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種時の足場の検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後２４日の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、（１）コーディングなし（Ｎｏｎ　Ｃｏａｔ）、並びに、（２）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ５１１（商品名、ニッピ社製）、（３）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ４１１（商品名、ニッピ社製）、（４）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ２１１（商品名、ニッピ社製）、（５）２μＬのＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　（ＶＴＮ－Ｎ）　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、（６）２μＬのＣｅｌｌ　Ｓｔａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、（７）５μLのＬａｍｉｎｉｎ１１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ１２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ２１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ２２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ４１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ４２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ５１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、（８）５μLのＬａｍｉｎｉｎ３３２、（９）２μLのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２．０×１０^５細胞となるように播種し、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）に加え、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、１００μｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を含む２００μＬの無血清培地を添加し、３日間、３７℃、５％ＣＯ_２で接着培養した。播種３日以降に３～４日に１回、培地交換を行った。

　播種２２日後に得られた細胞シートを、観察したところ、Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｒｔ以外の足場で良好な神経網膜シートが得られた（図３３）。

　これらの結果から、単一細胞に分散された凝集体（ＮＲ）において、ｉＭａｔｒｉｘ５１１やＭａｔｒｉｇｅｌだけでなく、様々な足場タンパク質においても網膜シートを再度作製できることが分かった。

＜実施例１２　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化・網膜分化の確認＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後１５日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２．０×１０^５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む２００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　播種４４日後（Ｄａｙ４４、ｄｄ５９）に得られた細胞シートを、観察したところ、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の視細胞が分化してきていることが観察された（図３４）。

　さらに、浮遊培養開始後２９日目の凝集体を用いて、同様に再シート化した。再組織化培養２８日目（Ｄａｙ６７）の細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｋｉ６７抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）抗体（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗Ｃｒｘ抗体（ａｂｎｏｖａ社）を用いて免疫染色を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌとして平面化（再シート化）させていないｄｄ７０の３Ｄ　Ｒｅｔｉｎａ（細胞凝集体）も染色を行った（図３５～３７）。
　また、Ｄａｙ５７の細胞シートを４％ＰＦＡで固定した後、切片は作製せず、全体免疫染色を行った。ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗Ｓｏｘ２抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＴＵＪ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗Ｉｓｌｅｔ－１抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｒｘ抗体（ａｂｎｏｖａ社）、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗Ｚｏ－１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。

　その結果、Ｃｈｘ１０陽性、Ｐａｘ６陽性及びＫｉ６７陽性の網膜前駆細胞、Ｂｒｎ３陽性の網膜神経節細胞、ＲｘＲｇ陽性、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性及びＣｒｘ陽性の錐体細胞前駆細胞が、Ｃｏｎｔｒｏｌの３Ｄ　Ｒｅｔｉｎａと遜色なく分化していることが確認された。また、透過光でＴｒａｎｓｗｅｌｌとの位置関係を観察したところ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に網膜シートが形成されており、Ｂａｓａｌ側に局在するＰａｘ６強陽性、Ｃｈｘ１０陰性の網膜神経節細胞がＴｒａｎｓｗｅｌｌ側に局在していることが確認された（図３８）。さらに、切片を作製せずに全体を共焦点顕微鏡で観察したところ、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有し、極性に従って各種網膜細胞が分化していることが確認された（図３９、図４０、図４１）。

　さらに長期間培養し、ｄｄ１１２の細胞シートについて、切片は作製せず、シートの状態で免疫染色を行った。抗Ｒｉｂｅｙｅ抗体（ＣｔＢＰ２、ＢＤ社）と抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を用いて染色したところ、Ｃｒｘ：：ＶｅｎｕｓとＲｅｃｏｖｅｒｉｎが同一の細胞で発現が観察され、Ｒｉｂｅｙｅが発現していることが確認された（図４２）。よって、再シート化した網膜から分化した視細胞は、シナプスタンパク質を発現する程度にまで成熟することが確認された。また、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ、がＡｐｉｃａｌ側に、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６が内側に局在された状態で、シートが形成されていることが確認された（図４３）。

　これらの結果から、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上で再組織化した網膜シートにおいて網膜細胞の分化が確認され、極性が維持されていることが観察された。

＜実施例１３　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株で網膜系細胞の維持培養＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後３１日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１０μＬのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２．０×１０^５細胞となるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む５００μＬの血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２を添加した培地に（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ、（２）２０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、（３）２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、（４）１００ｎＭ　ＳＡＧ、（５）１ユニットＬＩＦ、（６）１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＧＦ－１、（７）１００ｎｇ／ｍＬ　ＰＤＧＦ－ＡＡ、（８）１００ｎｇ／ｍＬ　ＰＤＧＦ－ＡＢ、（９）１０μｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、（１０）２０μｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、（１１）２μＭ　Ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ、（１２）１μＭ　ＢＭＰ４を添加して、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２を添加）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　３４日後、細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の面積に着目して観察し、網膜系の細胞の維持の状態について検討を行った。蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）を用いて、観察したところ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ及びＦＧＦ２を添加し続けた際、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞が広く維持されていることが確認された（図４４）。

　よって、ＥＧＦやＦＧＦを網膜の再組織化の際に添加すると、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の維持に効果があることがわかった。

＜実施例１４　平面化培養時の網膜前駆細胞の維持培養＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後２７日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１０μＬのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌに８．０×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む５００μＬの以下の培地に懸濁して、細胞を播種した。網膜前駆細胞を維持する培地を検討するため、（１）ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、（２）ＳＴＥＭｄｉｆｆ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｎｅｉｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、（３）ＳｔｅｍＰｒｏ　ＮＳＣ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）、（４）ＲＨＢ－Ａ（ＴａＫａＲａ社）の培地に２０ｎｇ／ｍＬＦＧＦ２と２０ｎｇ／ｍＬＥＧＦを添加して１か月間培養した。ＣｏｎｔｒｏｌとしてＮｕｃＴ０培地をおいた。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養１６日後、視細胞前駆細胞マーカーＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に分化をしていない条件（蛍光顕微鏡で観察した場合、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓが光っていない条件）を調べたところ、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ及びＲＨＢ－Ａ培地がある程度分化を遅らせる効果があることが認められた（図４５）。

　よって、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ及びＲＨＢ－Ａ培地とＥＧＦやＦＧＦを再シート化の際に添加すると、網膜前駆細胞の維持、及び分化を遅らせる効果があることがわかった。

＜実施例１５　コラーゲンゲル上で培養＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　ｂｅＭａｔｒｉｘ低エンドトキシン化コラーゲン液（新田ゼラチン社）を用いてコラーゲンゲルを作製した。具体的な操作としては、コラーゲンＡＴと５ｘＤＭＥ、再構成用緩衝液を７：２：１の割合で混合し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのメッシュの上にコーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて３０分インキュベートした。インキュベート後、インサートの内外に培地を添加した。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上に８．０×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養３３日後、実体顕微鏡にて、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に再シート化の具合を観察したところ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上で前面にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞が存在していることが認められた（図４６）。

　よって、コラーゲンゲル上においても、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を添加することで再シート化ができることがわかった。

＜実施例１６　移植検討＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１５のようにして作製されたコラーゲンゲル上で２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上に８．０×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養３７日及び４４日の分化６３日目及び７０日目の網膜細胞シートに関してＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて３０分間３７℃で処理し、剥離させた。剥離させた網膜シートをピンセットとハサミを用いて細長く切り出し、長さ１．８ｃｍ程度の移植用のグラフトを用意した（図４７）。

　用意したグラフトについて、ガラスパスツールピペットを用いて、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下に移植した。

　移植後１年のラットの眼を取り出し、４％ＰＦＡで固定した。蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ８１０）を用いて、観察したところＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のグラフトが生着していることが確認された（図４８）。

　よって、再シート化した網膜シートは移植後に生着することができることがわかった。

＜実施例１７　ソーティング検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後１４～２５日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いて、ＦＳＣとＳＳＣで目的の細胞集団をゲーティングした後、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の画分を分取した（図４９）。

　分取した細胞を、１ウェルあたり１．６～８．０×１０^５細胞となるように、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングしておいた１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種した。コントロールとしてＳｏｔｉｎｇしていないシートも作製した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。播種後、２６日目に蛍光実体顕微鏡を用いて観察した（図５０）。

　また、分化８２日目のＳｏｔｉｎｇによりＲｘ：：Ｖｅｎｕｓで純化した細胞シートを４％ＰＦＡで固定した後、切片は作製せず、シートのまま免疫染色を行った。ＤＡＰＩ及び抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を用いて免疫染色を行った。ＣｏｎｔｒｏｌとしてＳｏｔｉｎｇしていない網膜シートも染色を行った（図５１、図５２、図５３）。その後、凍結切片を作製しＤＡＰＩ及び抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＣＲＸ抗体（ＴａＫａＲａ社）を用いて免疫染色を行った。（図５３）。

　その結果、　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分をソーティングせずに播種すると、一部においてＲＰＥ細胞の塊が観察された。もっとも、目視で確認できるため、ＲＰＥ細胞を除去することは可能である。一方、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分をＳｏｒｔｉｎｇした場合、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜シートが作製できていることが観察された。さらに、ＲＰＥ細胞が大部分除去できていることが確認された（図４９、図５０）。しかしながら、Ｓｏｒｔｉｎｇしても、ＲＰＥ細胞が混入する場合があり、これはＳｏｒｔｉｎｇでＲＰＥ細胞を完全に除去できなかったためか、又は、Ｓｏｒｔｉｎｇ後に分化されたかは不明である。しかし、混入したＲＰＥ細胞は神経網膜組織と混ざり合っていないことが確認できた（図５２）。目視で確認できるため、ＲＰＥ細胞を除去することは可能である。

　また、Ｓｏｒｔｉｎｇを行った網膜シートにおいて、ＣｏｎｔｒｏｌであるＳｏｒｔｉｎｇ無の網膜シートと遜色なく、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性の視細胞が分化していることが確認された（図５１、図５３）。Ｚ　Ｓｔａｃｋ解析及び、切片の免疫組織学的な解析から、網膜組織の層構造が再形成されていること、Ｃｈｘ１０陽性及びＫｉ６７陽性の網膜前駆細胞、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の存在が確認された（図５３）。

　よって、ＦＳＣ及びＳＳＣで目的の細胞集団をゲーティングした後、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇすることにより、大部分のＲＰＥ細胞を除去することができ、かつ、再シート化をした際問題なく網膜細胞が分化することが観察された。

＜実施例１８　再シート化時のＲｅｔｉｎａの性質を維持する因子探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後２５日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＥａｓｙ　ｉＭａｔｒｉｘを用いてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コートした９６Ｗｅｌｌガラスボトムプレート（グライナー社）に１ウェルあたり５×１０^４細胞を１００μＬのＮｕｃＴ０にＹ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＡＧを添加して播種した。播種と同時に表１に示すタンパク質、又は表２に示す低分子化合物を添加した。

　播種３日後にも同様に表１及び２に記載の低分子化合物又はタンパク質の濃度を維持するように培地交換を行った。その後７日目に表１及び２に記載の低分子化合物又はタンパク質を含まないＮｕｃＴ０培地で培地交換を実施した。播種１０日後、４％ＰＦＡで固定し、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に、Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞の評価を行った。その結果、タンパク質のうち、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８を添加したシートでは、ＣｏｎｔｒｏｌであるＰＢＳと比較して、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５４）。また、低分子化合物のうち、ＩＷＲ１　ｅｎｄｏを添加したシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５５）。さらに、濃度依存性が確認され、ＦＧＦ８を１００μｇ／ｍＬ添加した際、最もＲｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５６）。

　よって、細胞播種直後にＦＧＦシグナルを活性化させることで、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を維持できることがわかった。

＜実施例１９　ＦＧＦ８の添加による凝集体再形成、網膜分化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後２４日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞を低接着Ｖｐｌａｔｅに１ウェルあたり２．０～５．０×１０^４細胞播種した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）、Ｓｏｒｔｉｎｇしていない群（Ｓｏｒｔｉｎｇ無）も置いた。

　３～４日に１回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。再播種後１０日目に顕微鏡で観察したところ、Ｓｏｒｔｉｎｇ無、ＦＧＦ８－の群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の細胞塊、又はＲＰＥ細胞が観察された（図５７）。一方、ＦＧＦ８を添加した群（ＦＧＦ８＋）では、これらの細胞塊が減少していることが観察された。Ｓｏｒｔｉｎｇ有、ＦＧＦ８－の群では、ＲＰＥ細胞が部分的に観察された。ＳｏｒｔｉｎｇによってＲＰＥ細胞は除去されていることから、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の一部の集団がＲＰＥ細胞に分化したことが示唆された。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ有、ＦＧＦ８＋の群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の凝集体が形成され、ＲＰＥ細胞、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の塊は観察されなかった。

　これらの結果から、ＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥ細胞、又はＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させることができると分かった。

　さらに凝集体の再形成のための培養５４日目（再播種後３０日目）の凝集体を、ＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を用いて、単一細胞に分散した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）を用いてホルムアルデヒド固定を行った。その後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で洗浄した後、抗ＣＨＸ１０－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）、抗Ｓｏｘ２－ＢＶ４２１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗Ｋｉ６７－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＲＸ－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）で染色を行った。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で抗体を洗浄後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、コントロールとして、再組織化をしていない、同分化日数の神経網膜組織も置いた。

　その結果、Ｓｏｒｔｉｎｇ無でかつ、ＦＧＦ８を添加していない群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓネガティブの細胞集団が多数観察され、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が低い傾向にあった。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ無においても、ＦＧＦ８を添加した群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が高い傾向にあることが示された（図５８）。

　また、Ｓｏｒｔｉｎｇを行うとＦＧＦ８を添加しない群においてもＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率は高い傾向であった（図５８）。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇを行いかつ、ＦＧＦ８を添加した群では、Ｃｈｘ１０陽性及びＳｏｘ２陽性の神経網膜前駆細胞の割合が高く、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の割合が低い傾向であった（図５９）。

　これらの結果から、Ｓｏｒｔｉｎｇだけでなく、ＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥやＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させ、均一で良好な凝集体を得ることができると分かった。

＜実施例２０　再シート化時のＦＧＦ８の効果の確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後２４日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＹ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１及びＳＡＧ、ＦＧＦ８を含むＮｕｃＴ０培地に２４ウェルトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１ウェルあたり２．０×１０^５細胞を懸濁し、播種した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）も置いた。

　３～４日に１回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。分化６３日、再播種後４０日を経過したシートを、蛍光実体顕微鏡で観察をした（図６０、図６１）。また、ＦＡＣＳ解析のため、分化６４日、再播種後４１日の凝集体を、ＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を用いて、単一細胞に分散した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）を用いてホルムアルデヒド固定を行った。その後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）ＢＤ社）を用いて固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で洗浄した後、抗ＣＨＸ１０－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）、抗Ｓｏｘ２－ＢＶ４２１　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗ＣＲＸ－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）で染色を行った。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で抗体を洗浄後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、コントロールとして、再組織化をしていない、同分化日数の神経網膜組織も置いた（図６２）。

　その結果、Ｓｏｒｔｉｎｇをした後、ＦＧＦ８を添加していないシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓネガティブの細胞集団が多数観察され、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞がウェルの周辺部に偏って、塊上に存在している傾向にあった。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ後にＦＧＦ８を添加したシートではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞がウェル全体に均一に存在しており、良好なシートが作製されていることが観察された（図６０、図６１）。また、ＦＧＦ８を添加していないシートでは黒いＲＰＥ（図６１、矢印）が観察された一方、ＦＧＦ８を添加したシートではほとんど観察されなかった。

　また、ＦＡＣＳ解析において、ＦＧＦ８を添加していないシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が６０％と減少していたが、ＦＧＦ８を添加した群では９５％以上と、神経網膜組織と遜色ない陽性率を維持できていることがわかった（図６２）。さらに、Ｃｈｘ１０陽性及びＳｏｘ２陽性の神経網膜前駆細胞やＣｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の割合も神経網膜組織と比較しても同等であった。Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性でかつ、Ｋｉ６７陽性の増殖性のある網膜系細胞の割合は神経網膜組織と比較して多い傾向であった（図６２）。

　これらの結果から、再シート化を行う際、Ｓｏｒｔｉｎｇ後にＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥやＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させ、均一で良好なシートを得ることができると分かった。

＜実施例２１　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化後の経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１のように作製された浮遊培養開始後２７日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２.０×１０^５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を含む２００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ８を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。

　凝集体の再形成のための培養３日、６日、９日、１２日、２２日、４０日後（ｄｄ３０、ｄｄ３３、ｄｄ３６、ｄｄ３９、ｄｄ４９、ｄｄ６７）に得られた細胞シートを、４％ＰＦＡで固定後、蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にシート化を観察したところ、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜細胞が増殖し、厚みの持ったシートが形成されてきていることが観察された（図６３）。特に２２日から４０日後には全面がＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞に覆われた厚い細胞シートが確認された

　これらの結果から、２２日から４０日後に移植やアッセイ等に用いられる再組織化網膜シートが得られることが観察された。

＜実施例２２　ＲＰＣ表面抗原スクリーニング～ｈＥＳ細胞とＮＲの比較～＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　上記細胞を用いて、実施例１に記載のように分化誘導のための浮遊培養を開始した。なお、分化誘導開始時にＳＡＧ　３００ｎＭを添加した。浮遊培養開始後１９及び２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、表面抗原スクリーニングキット　ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍａｒｋｅｒ　Ｓｃｒｅｅｎ,　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、表面抗原スクリーニングを実施した（Ａｌｅｘａ　６４７で蛍光色素Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体群）。ＣｏｎｔｒｏｌとしてヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）を染色した。なお、スクリーニングに使用したマーカーは全部で３７１個であった（図６４～６９）。

　ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。図６５に示すＦＳＣ及びＳＳＣで示される集団でゲーティングを行い解析した。まず、ｈＥＳＣで発現され、分化すると発現が消失されるＥ－ＣａｄｈｅｒｉｎやＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－５で染色及び解析が正確に行われていることを確認した（図６６）。その後の解析結果を図６４に纏める。なお、「ｈＥＳＣ：高い」はヒトＥＳ細胞での発現レベルが高い又は発現があることを意味し、「ｈＥＳＣ：低い」はヒトＥＳ細胞での発現レベルが低い又は発現がないことを意味し、「ＮＲ：高い」は神経網膜細胞での発現レベルが高いことを意味し、「ＮＲ：低い」は神経網膜細胞での発現レベルが低い又は発現がないことを意味する。

　ｈＥＳＣでは発現が無く（又は発現がある）、浮遊培養開始後１９日目又は２６日目でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の集団が発現している（又は発現していない）表面抗原を探索したところ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＸＣＲ４、さらにはＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５７、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ２００が、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞とその他の細胞（Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞、ｈＥＳＣ）とを区別できるマーカーである可能性が示唆された（図６７）。

　さらにＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ７３－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ4）－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、浮遊培養開始後ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ５３、ｄｄ８１（図６８中、ｄ１８、ｄ２５、ｄ５３、ｄ８１）におけるＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１８４(ＣＸＣＲ４)の発現を、ＦＡＣＳ解析した（図６８）。

　その結果、ＣＤ３９及びＣＤ７３は、ｄｄ２５で最も発現している細胞の割合が高く、ＣＤ１８４に関しては、ｄｄ１８及びｄｄ２５で発現が低い細胞の割合が高いことがわかった。

　よって、神経網膜前駆細胞を純化するために表面抗原ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１８４を用いる場合は、浮遊培養開始後１８日目以降、２５日目付近が良いことがわかった（図６８）。

＜実施例２３　でのＣＤ３９及びＣＤ７３、ＣＸＣＲ４の発現解析＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始時（分化誘導開始時）にＳＡＧ　３００ｎＭを添加し、浮遊培養開始後の３日目にＢＭＰ４を添加せず、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄを作製した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＢＭＰ４を添加する群をおいた。このようにして作製された浮遊培養開始後２６日目のＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄに関して、蛍光顕微鏡観察を行った（図７０）。その結果、ＢＭＰ４を添加した群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜組織が分化していることが観察された一方、ＢＭＰ４を添加していない群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の神経上皮細胞が分化していることが観察された。さらに、これらの凝集体を４％ＰＦＡで固定し、切片を作製し、ＤＡＰＩ及び抗ＦｏｘＧ１抗体（ＴａＫａＲａ社）で染色し、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）で観察を行った。その結果、ＢＭＰ４を添加した群ではＦｏｘＧ１は陰性である一方、ＢＭＰ４を添加していない群ではＦｏｘＧ１陽性が確認され、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄが分化されていることを確認された（図７１）。

　このようにして作製された浮遊培養開始後２５日目のＢｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄをＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ７３－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、ＦＡＣＳ測定はＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて発現細胞集団の割合を測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。

　その結果、ＣＤ３９及びＣＤ７３はＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄで発現しておらず、一方でＣＸＣＲ４はＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄの大部分の細胞で発現していることが観察された（図７２）。

　よって、ＣＤ３９陽性、ＣＤ７３陽性、及びＣＸＣＲ４陰性の細胞集団を指標にすることでＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと区別して、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の集団を分取できることが確認された

＜実施例２４　ＣＤ３９発現解析＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　分化誘導開始時にＳＡＧを（１）０ｎＭ、（２）３０ｎＭ、（３）３００ｎＭを添加して作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体（ＮＲ）の形態を顕微鏡で観察した。その結果、浮遊培養開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭ添加した場合に比べ、ＳＡＧ　０ｎＭ及びＳＡＧ　３０ｎＭを添加した場合には、凝集体がより大きく、また、層構造もよりはっきりわかることが確認された（図７３）。

　さらに、上記凝集体に関して、神経細胞分散液を用いて単一細胞に分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）用いて、ＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現についてＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて発現細胞集団の割合を測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。また、これら凝集体を４％ＰＦＡ固定し、切片を作製後、抗ＡＬＤＨ１Ａ１抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＣｏｕｐＴＦ１抗体（ＰＰＭＸ社）、抗ＬＨＸ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗Ｃｈｘ１０抗体（ＥｘＡｌｐｈａ社製）、抗Ｐａｘ２抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社製）、抗ＮＫＸ２．１抗体（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて染色を行った。

　その結果、浮遊培養開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭ添加した凝集体ではＣＤ３９の発現があり、ＣＸＣＲ４の発現が低いことが観察された（図７４）。また、ｄｄ０におけるＳＡＧの添加により、背側マーカーであるＡＬＤＨ１Ａ１の発現の低下、及び、腹側マーカーであるＣｏｕｐＴＦ１の発現の上昇が認められた（図７５、図７６）。また、ＳＡＧの刺激を加えない方が、細胞凝集体におけるＲｘの発現度が均一であることが判明した（図７７）。しかしながら、ＬＨＸ２及び、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ２に関して３００ｎＭ添加した凝集体でＲｘの発現が低い領域においても発現が確認され、ＮＫＸ２．１は陰性であったことから、神経網膜組織であることは確認されている（図７８、図７９）。

　よって、分化誘導開始時にＳＡＧを３００ｎＭ添加することで、ＣＤ３９陽性かつＣＸＣＲ４陰性の神経網膜前駆細胞の集団を得ることができることがわかった。

＜実施例２５　ＣＤ３９発現増強検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　分化誘導開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭを添加し作製された凝集体（ＮＲ）に対して、浮遊培養開始後１７日目に１０個の神経網膜組織を低接着浮遊培養用シャーレ６０ｍｍＤｉｓｈ（住友ベークライト社製）に移し、４ｍＬのＮｕｃＴ０培地中に１ｍＭ、０．２ｍＭ　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ａ２Ａ受容体Ａｇｏｎｉｓｔ、Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭ　ＡＭＰ－ＰＮＰ（Ｔｏｃｒｉｓ社製）、５ｍＭ、１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭ　ＡＴＰ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｔｏｃｒｉｓ社製）、及び１μＭ、０．２μＭ、０．０４μＭ　ＣＧＳ　２１６８０（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ａ２Ａ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｇｏｎｉｓｔ、Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加して浮遊培養開始後２５日目まで培養し、ＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現変化をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ３９－ＢＶ４２１　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、ＣｏｎｔｒｏｌとしてＤＭＳＯ添加群を置いた。

　その結果、ＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体ＡｇｏｎｉｓｔがＣＤ３９の発現を増強させ、ＣＸＣＲ４の発現を減少させる効果があることがわかった（図８０、図８１）。

　よって、ＣＤ３９の発現をＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体Ａｇｏｎｉｓｔを添加することで増強できることがわかった。

＜実施例２６　ＣＤ３９でＳｏｒｔｉｎｇし、ＦＧＦ８添加により作製したＩｓｌｅｔ－１　ＫＯ　ｈＥＳＣ－網膜シートの移植＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変し、かつＩｓｌｅｔ－１遺伝子をＫＯしたヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」及びＷＯ２０１８／０９７２５３に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ３００ｎＭで分化させた凝集体に対して、浮遊培養開始２５日目の凝集体（ＮＲ）を単一細胞に分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣＣｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて３７℃で１５分間染色した後、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＣＤ３９－ＡＰＣを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＣｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌコートした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり８．０×１０^５細胞播種した。播種時にＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及びＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を添加した。また、Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）もおいた。

　３～４日に一回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。浮遊培養開始後７３日目に顕微鏡で観察したところ、ＦＧＦ８を添加していない群では、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ細胞集団がまばらに観察されるのに対して、ＦＧＦ８を添加した群においては、均一に存在していることが観察された（図８２）。

　このようにして作製されたシートを浮遊培養開始後８８日目にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを用いてシートを回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し（図８２）、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した。

　よって、ＣＤ３９でＳｏｒｔｉｎｇした細胞から製造した網膜シートは移植可能であることが確認された。

＜実施例２７　ＲＰＣ表面抗原スクリーニング～Ｂｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄとＮＲの比較～＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加し作製された浮遊培養開始後２４～２６日目の凝集体（ＮＲ）に関して、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）を用いて単一細胞に分散し、表面抗原スクリーニングキットＭＡＣＳ（登録商標）　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓｃｒｅｅｎ,　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、表面抗原スクリーニングを実施した（Ａｌｅｘａ　６４７で蛍光色素Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体群）。Ｃｏｎｔｒｏｌとして分化誘導開始後３日目にＢＭＰ４を添加せずに作製したＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄを染色した。

　ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄでは発現が無く（又は発現がある）、浮遊培養開始後２４～２６日目でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の集団が発現している（又は発現していない）表面抗原を探索したところ、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ８２、ＣＤ１６４、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ２（ＣＤ３４０）においてＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと区別できる可能性が示された（図８３）。

　また、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞と陰性細胞を区別するマーカーとして、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭが有用である可能性が示された（図８４）。

＜実施例２８　ＣＤ９の発現経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　ｈＥＳＣ及び、浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製されたｄｄ４、ｄｄ１１、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ３２、ｄｄ４６の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、ＡＰＣがＣｏｎｊｕｇａｔｅされた抗ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色し、抗体を洗浄した後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。

　その結果、ＣＤ９はｈＥＳＣでは発現しているものの、分化開始Ｄａｙ４では一度発現が落ち、Ｄａｙ１１（図８５中ｄ１１）頃から発現し始め、ｄｄ１８（図８５中ｄ１８）からｄｄ２５（図８５中ｄ２５）、ｄｄ３２（図８５中ｄ３２）頃で陽性細胞率が高まることが分かった。純化する時期として、ｄｄ１１以降であることがよく、より好ましくはｄｄ１８からｄｄ３２以降で純化するとよいことが確認された（図８５）。

＜実施例２９　ＳＳＥＡ１を指標とした目的外細胞の除去検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製された２５日目の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、ＡＰＣがＣｏｎｊｕｇａｔｅされた抗ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）に加えて、ＢＶ４２１をＣｏｎｊｕｇａｔｅした抗ＳＳＥＡ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。

　その結果、凝集体全体ではＲｘ陽性細胞は約８７％であるが、ＣＤ９陽性細胞をゲーティングしたところ、Ｒｘ陽性細胞は９４％まで向上することがわかった。さらにＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ１陰性の細胞をゲーティングしたところ、Ｒｘ陽性細胞は約９６％まで向上することがわかった（図８６）。

よって、ＣＤ９に加えて、ＳＳＥＡ１を組み合わせることで、より網膜系の細胞を純化できることがわかった

＜実施例３０　ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ１の組み合わせ検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製された２５日目の凝集体（ＮＲ）２００個を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、７等分に細胞を分け、次の７条件で表面抗原を４℃で１時間染色した。（１）非染色（Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に純化）、（２）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、（３）抗ＣＤ９０－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）、（４）抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、（５）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、（６）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＣＤ９０－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、並びに、（７）抗ＣＤ９０－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて染色した。染色後、ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ社）を用いて、図８７に示す枠を指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇにより回収した細胞を、ＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＦＡＣＳ解析を行い、目的の細胞画分で純化できていることを確認した（図８７）。純化後の細胞の集団におけるＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の割合を測定したところ、Ｓｏｒｔｉｎｇ前と比較し、（１）Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分でＳｏｒｔｉｎｇしたサンプルで最も純度は高かったが、ＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ－１陰性の画分で純化したサンプルではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓで純化したものと遜色なく、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が高かった（図８８、図８９）。

　これらのＳｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コートした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２．０×１０^５細胞播種した。播種時に１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を添加した。播種後、３～４日に一回培地交換を実施した。

　再シート化培養開始後１日目及び１２日目に蛍光顕微鏡で明視野及び蛍光観察をしたところ、播種後１日目ではいずれの純化後の細胞でもＴｒａｎｓｗｅｌｌのメッシュ上に細胞が生着していることが観察された（図９０）。さらに１２日後の観察では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性で純化したサンプルでは黒いＲＰＥがいくつか観察されたのに対し、ＣＤ９陽性、及びＣＤ９陽性／ＳＳＥＡ１陰性（ＣＤ９／ＳＳＥＡ１）の集団、ＣＤ９陽性／ＣＤ９０陽性（ＣＤ９／ＣＤ９０）の集団のＣＤ９で純化しているシートにおいて、黒いＲＰＥは観察されなかった（図９１）。

　よって、ＣＤ９及びＣＤ９とＳＳＥＡ１陰性又はＣＤ９０陽性の画分でＳｏｒｔｉｎｇした網膜シートはＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性でＳｏｒｔｉｎｇするよりもＲＰＥ画分を除去でき、より良好であることが確認された。

＜実施例３１　ＣＤ９及びＳＳＥＡ１の発現の経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　ｈＥＳＣ及び、浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製されたｄｄ４、ｄｄ１１、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ３２、ｄｄ４６の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色しＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。

　その結果、ｈＥＳＣにおいて、ＣＤ９は陽性でかつＳＳＥＡ１は陰性であるが、分化開始後４日目になると、ＣＤ９は陰性でかつＳＳＥＡ１は陽性となる（図９２）。さらに分化１１日目からＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ１陰性の集団が現れ始め、Ｄａｙ１８、Ｄａｙ２５と目的の集団の割合が増殖することがわかった。Ｄａｙ３２やＤａｙ４６においても発現し続けていることも測定された。

　よって、純化する時期として、ｄｄ１１（図９２中ｄ１１）以降であることがよく、ｄｄ１８（図９２中ｄ１８）から、ｄｄ３２（図９２中ｄ３２）以降で純化するとよいことが確認された（図９２）。

　このようにしてＣＤ９及びＳＳＥＡ１を指標にＳｏｔｉｎｇして１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を添加して、作製された１２ウェルトランズウェル上の網膜シートを浮遊培養開始後４８及び６２日目にメスやハサミを用いてシートを回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した（図無）。

　よって、ＣＤ９及びＳＳＥＡ１でＳｏｒｔｉｎｇした細胞を用いて製造した網膜シートは移植可能であることが確認された。

＜実施例３２　ゼラチンを用いたＲＰＥ－網膜組織複合化検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後１８～３０日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり４．０～８．０×１０^５細胞播種した。播種時、ＮｕｃＴ０培地にＹ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した。その後、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないＮｕｃＴ０培地で３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後８０日以降のＲＰＥも同時に分化された凝集体をＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートしたディッシュにＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）及びＦ１２　Ｈａｍ（ＳＩＧＭＡ社）培地にＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ，１０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、ＳＢ４３１５４２を添加した培地に播種し、培養した。ＲＰＥが接着後、増殖し広がってきたら、ＲＰＥのみを１ｍＬのチップを用いて削り取り、別のＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートしたディッシュに播種し、純化を行った。その後、拡大培養した後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートした１２ウェルＴｒａｎｓＷｅｌｌに１．０×１０^６細胞のＲＰＥを播種し、３～４日に１回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った。

　上記のようにして培養されたＲＰＥシートとシート状網膜組織の接着作業をＢｅＭａｔｒｉｘ　ＬＳ－Ｗゼラチン（新田ゼラチン社）を用いて行った。具体的な操作としては、ピンセットやハサミを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌからそれぞれのシートを回収し、１０％（ｗ／ｖ）のゼラチンでシート状網膜組織、ＲＰＥシートをなじませた後、２０％ゼラチンでなじませ、最終的に３０％のゼラチンを添加し、シート状網膜組織とＲＰＥシートを接着させる。接着後４℃に急冷し、２０分間インキュベートすることで固め、回収することでシート状網膜組織とＲＰＥシートを接着させた複合シートを作製した（図９３～図９８）。

　このようにして作製された網膜組織－ＲＰＥ複合シートをピンセットとハサミを用いて、切り出しを行った。まず、複合シートを半割した後、切り出した面に沿うように細長く切り出した（図９９）。その結果、両シートがゼラチンを介して接着した状態で切り出すことができた。この切り出した複合シートの断面を観察したところ、片方に黒い色素を持ったＲＰＥが、反対側にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のシート状網膜組織が確認され、その間にゼラチンが詰まっていることが観察された（図１００）。この切り出した複合シートが移植の作業である、吸引、吐出の動作によって、剥がれたりしないか、先端を切り落とした１ｍＬのチップを用いて、吸引・吐出の作業を行った。その結果、複合シートは分離することなく、何度も吸引・吐出することができた（図１０１）。

　よって、シート状網膜組織とＲＰＥシート、及びゼラチンを用いることによって、移植可能な、網膜組織－ＲＰＥ複合シートを作製することができることがわかった。

＜実施例３３　フィブリンを用いたＲＰＥ－網膜組織複合化検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後１８～３０日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり４．０～８．０×１０^５細胞播種した。播種時、ＮｕｃＴ０培地にＹ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した。その後、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないＮｕｃＴ０培地で３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った（図１０２）。

　実施例１で作製された浮遊培養開始後８０日以降のＲＰＥも同時に分化された凝集体をｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートしたディッシュにＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）及びＦ１２　Ｈａｍ（ＳＩＧＭＡ社）培地にＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ，１０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、ＳＢ４３１５４２を添加した培地に播種し、培養した。ＲＰＥが接着後、増殖し広がってきたら、ＲＰＥのみをチップを用いて削り取り、別のｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートしたディッシュに播種し、純化を行った。その後、拡大培養した後、ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートした１２ウェルＴｒａｎｓＷｅｌｌ　１．０×１０^６細胞のＲＰＥを播種し、３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った（図１０２）。

　上記のようにして培養されたシート状網膜組織とＲＰＥシートの接着作業をボルヒール組織接着用（帝人ファーマ社）を用いて行った。具体的な操作としては、ピンセットやハサミを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌからそれぞれのシートを回収し、シート状網膜組織にＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎを１００μＬ、ＲＰＥシートにＴｈｏｒｏｍｂｉｎを１００μＬ添加し、なじませた後、除去した（図１０３～１０４）。再度、シート状網膜組織にＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎを１００μＬ、ＲＰＥシートにＴｈｏｒｏｍｂｉｎを１００μＬ添加した（図１０４）。ＲＰＥシートを培養皿の上にＡｐｉｃａｌ側が上側に、メッシュ側を培養皿側に置き、シート状網膜組織をＡｐｉｃａｌ面がＲＰＥ側にむくように上から乗せた（図１０５）。接着後室温で５分間インキュベートすることで固め、回収することで接着させたシートを作製した（図１０６～１０７）。このようにして作製された網膜組織－ＲＰＥ複合シートをピンセットを用いて裏返し、下側にシート状網膜組織、上側に網膜色素上皮シートが向くように置き、観察した（図１０８）。また、接着させていたトランズウェルのメッシュをはいた（図１０９）。

　よって、シート状網膜組織とＲＰＥシート、及びフィブリンを用いることによって、網膜組織－ＲＰＥ複合シートを作製することができることがわかった。

＜実施例３４　セルシフターを用いた２つのシート間の不要なゼラチンの除去の検討＞
　実施例３２で検討した複合化したシートでは、二つのシートの間に多くのゼラチンが含まれて厚くなることがわかった。そこで、複合化工程時に、二つのシートの間の不要なゼラチンを押し出して除去できるように、ゼラチンが逃げる通り道を作った複合化デバイスの検討を行った。

　スライドガラス上に、シリコンシートを用いて、通り道が２つ、４つ、５つでかつ堤防状にしたものを作成し、ゼラチンを間に添加した２枚のセルシフター（Ｃｅｌｌ　Ｓｅｅｄ社）を用いて、上から押し出して、ゼラチンが流れ出るか観察した。

　その結果、流路を５つにし、堤防状にシリコンシートをのせたデバイスで最も余分なゼラチンが流れ出ることがわかった（図１１０）。

＜実施例３５　温度感受性培養皿上で平面化シートを作製し、剥離・移植検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　実施例１で作製されたＤａｙ１８～３０日の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コーティングした２４ウェルの７段階の剥離度の異なる温度感受性培養皿（Ｃｅｌｌ　ｓｅｅｄ社）に８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した。３～４日に一回培地交換を実施し、播種後３０日以降でシートが厚みをもって形成された後、室温に下げて、２時間インキュベートし、観察した。その結果、７段階の剥離度の温度感受性培養皿のうち、２ｂ、２ｃ、３、４と複数のウェルにおいて、網膜シートが室温にすることで剥離できることが観察された（図１１１）。

　よって、温度感受性培養皿で培養することで、網膜シートを回収できることがわかった。

　このようにしてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｔｉｎｇして１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を添加して、作製された温度感受性培養皿上の網膜シートを浮遊培養開始後６２日目に４℃で１時間インキュベートして回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した（図無）。

　よって、温度感受性培養皿上で培養した網膜シートは移植可能であることが確認された。

Claims

　上皮構造を有する網膜組織の製造方法であって、
　分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養することを含み、
　前記網膜系細胞集団が、網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む、製造方法。
　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質である、請求項１に記載の製造方法。
　前記培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、請求項３に記載の製造方法。
　前記ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質が、ＳＡＧ、ＰＭＡ及びＳＨＨからなる群から選択される１以上の物質である、請求項３又は４に記載の製造方法。
　前記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である、請求項３～５のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養することを含み、前記上皮構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記接着培養が、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を用いて行われる、請求項７に記載の製造方法。
　前記培養容器の培養面が、前記温度感受性ポリマーでコーティングされ、前記温度感受性ポリマーの上面が、前記細胞外マトリクスでコーティングされる、請求項８に記載の製造方法。
　前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル及びビトロネクチンからなる群から選択される１以上の物質である、請求項８又は９に記載の製造方法。
　前記温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、前記シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程をさらに含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
　網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む細胞凝集体を分散させて、前記分散された網膜系細胞集団を得る工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
　多能性幹細胞を分化させて、前記網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含む細胞凝集体を得る工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
　前記分散された網膜系細胞集団を浮遊培養又は接着培養する前に、前記分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の製造方法。
　網膜色素上皮細胞の混入又は分化が抑制される、請求項１４に記載の方法。
　前記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、前記分散された網膜系細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原を発現する細胞集団を得る工程を含む、請求項１４又は１５に記載の製造方法。
　前記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、前記分散された網膜系細胞集団を、さらにＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程を含む、請求項１６に記載の製造方法。
　前記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、以下の工程を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の製造方法：
（１）多能性幹細胞をＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体作用物質からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、細胞凝集体を製造する工程、
（２）細胞凝集体を網膜前駆細胞へ分化誘導させる工程、
（３）細胞凝集体を分散させ、ＣＤ３９に結合する物質と接触させる工程。
　前記網膜前駆細胞及び／又は前記視細胞前駆細胞が、前記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の５０％以上を占める、請求項１～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記網膜前駆細胞及び／又は前記視細胞前駆細胞が、前記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の８０％以上を占める、請求項１～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記浮遊培養又は接着培養の開始時から、前記分散された網膜系細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記上皮構造において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の製造方法。
　浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造を有する網膜組織を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記上皮構造が、多層構造である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の製造方法。
　多層構造を有する網膜系細胞層からなるシート状網膜組織であって、
（１）当該多層構造を有する網膜系細胞層が基底面及び頂端面の極性を有し、
（２）前記多層構造を有する網膜系細胞層が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（３）前記網膜系細胞層の各層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっており、かつ、
（４）直径が８ｍｍ以上である、シート状網膜組織。
　前記多層構造を有する網膜系細胞層が、前記網膜系細胞層に接合しているシート状網膜色素上皮細胞をさらに含み、前記網膜系細胞層と前記シート状網膜色素上皮細胞とはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、前記網膜系細胞層の頂端面と前記シート状網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、かつ、前記網膜系細胞層と前記シート状網膜色素上皮細胞とは両者の間に存在する接着因子により接合している、請求項２５に記載のシート状網膜組織。
　前記接着因子が細胞外マトリクス又はハイドロゲルである、請求項２６に記載のシート状網膜組織。
　前記接着因子が、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質である、請求項２７に記載のシート状網膜組織。
　前記接着因子が、ゼラチン又はフィブリンである、請求項２７に記載のシート状網膜組織。
　請求項２５～２９のいずれか一項に記載のシート状網膜組織を含む、医薬組成物。
　請求項２５～２９のいずれか一項に記載のシート状網膜組織を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の、治療方法。
　網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９f、ＣＤ５７、ＣＤ７３、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ３４０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法。
　前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程を含む、請求項３２に記載の方法。
　前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させる工程をさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
　ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも１つの因子が陽性であり、かつ、Ｒｘ陽性である網膜前駆細胞を、細胞集団の全細胞数に対して９０％以上含む、細胞集団。
　前記網膜前駆細胞が、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原が陰性である、請求項３５に記載の細胞集団。