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WO2022138803A1 - 視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法 - Google Patents

視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法 Download PDF

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WO2022138803A1
WO2022138803A1 PCT/JP2021/047809 JP2021047809W WO2022138803A1 WO 2022138803 A1 WO2022138803 A1 WO 2022138803A1 JP 2021047809 W JP2021047809 W JP 2021047809W WO 2022138803 A1 WO2022138803 A1 WO 2022138803A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
retinal
photoreceptor
layered
signaling pathway
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/047809
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
政代 高橋
暁士 大西
登起義 松下
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Santen Pharmaceutical Co Ltd
RIKEN
Original Assignee
Santen Pharmaceutical Co Ltd
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Santen Pharmaceutical Co Ltd, RIKEN filed Critical Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP2022571610A priority Critical patent/JPWO2022138803A1/ja
Publication of WO2022138803A1 publication Critical patent/WO2022138803A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • the present invention relates to a method for forcing and producing layered retinal tissue containing photoreceptor cells from aggregates containing retinal progenitor cells or pluripotent stem cells.
  • uniform pluripotent stem cell aggregates are formed in a serum-free medium, suspended and cultured, and then used for induction of differentiation.
  • a method for producing neural tissue has been reported by suspending and culturing in a medium in the presence of a differentiation-inducing factor or the like and inducing differentiation from pluripotent stem cells to target nervous system cells (neural cells). ..
  • uniform pluripotent stem cell aggregates are formed in a serum-free medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor, which is suspended and cultured in the presence of a basal membrane preparation, and then suspended and cultured in the serum medium.
  • a method for obtaining a multi-layered retinal tissue (Patent Document 1), a medium containing pluripotent stem cells, a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agonist, and an undifferentiated maintenance factor.
  • the obtained cells are suspended-cultured in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor, and the obtained aggregates are suspended-cultured in a medium containing a BMP signaling pathway agonist to obtain retinal cells or.
  • Method for obtaining aggregates containing retinal tissue (Patent Document 2), obtained after culturing cell aggregates containing retinal tissue in a medium containing a Wnt signal pathway agonist until cells expressing the RPE65 gene appear.
  • a method for obtaining cell aggregates containing hairy peripheral peripheral-like structures by culturing cell aggregates in which cells expressing the RPE65 gene have not appeared in a medium containing no Wnt signal pathway agonist (Patent Document 3), Cell aggregates containing retinal tissue were cultured in a medium containing a Wnt signal pathway agonist and an FGF signal pathway inhibitor until cells expressing the RPE65 gene appeared, and then the obtained RPE65 was obtained.
  • a method for obtaining a cell aggregate containing a hair-like peripheral periphery-like structure by culturing a cell aggregate in which a cell expressing a gene has not appeared in a medium containing no Wnt signal pathway agonist (Patent Document).
  • the pluripotent stem cells are cultured in a medium containing an undifferentiated maintenance factor, and the obtained pluripotent stem cells are suspended-cultured in a medium containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent to form cell aggregates.
  • a method of obtaining aggregates containing retinal cells or retinal tissues by suspending and culturing the formed aggregates in a medium containing a BMP signal transduction pathway agent (Patent Document 5) is known.
  • pluripotent stem cells are suspended and cultured in a serum-free medium to form aggregates of pluripotent stem cells, and the formed aggregates are transmitted by sonic hedgehog signaling.
  • a method for obtaining retinal precursor cells by suspension culture in a medium containing a BMP signaling pathway agent without a pathway agent (Patent Document 6).
  • Pluripotent stem cells are suspension-cultured and differentiated into retinal precursor cells. Induced, the obtained retinal progenitor cells were suspended and cultured to induce differentiation into retinal ganglion cells, and the obtained retinal ganglion cells were adherently cultured to elongate the axons.
  • a method for obtaining ganglion cells (Patent Document 7) and the like are known.
  • Non-Patent Document 1 a method for inducing differentiation (SEAM method) for obtaining various ocular tissue cells derived from ectoderm concentrically, and two-dimensional culture.
  • SEAM method a method for inducing differentiation of retinal organoids
  • Non-Patent Document 2 a method for inducing differentiation of retinal organoids
  • dual inhibition of BMP signals and TGF ⁇ family signals efficiently induces human ES cells and iPS cells to neural progenitor cells (Non-Patent Document 3), and human pluripotent stem cells can be treated with BMP4.
  • Non-Patent Document 4 Differentiation into neuroretinal cells is induced by suspension culture in a medium containing BMP4 (Non-Patent Document 4), and retinal organoids are produced by adherent culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing BMP4.
  • Non-Patent Document 5 sonic hedgehog signal promotes differentiation into rod photoreceptors in mammalian retinal cells (Non-Patent Document 6), retinoic acid differentiation into photoreceptor cells (Non-Patent Document 7), in the process of inducing the differentiation of pluripotent stem cells into nerve cells, Activin promotes the differentiation into retinal precursor cells (Non-Patent Document 8), human pluripotency It is also known that Activin promotes the induction of differentiation of stem cell-derived ophthalmic tissue into retinal pigment epithelial cells (Non-Patent Document 9).
  • An object to be solved by the present invention is to provide a method for producing a layered retinal tissue containing photoreceptor cells from aggregates containing retinal progenitor cells or pluripotent stem cells in a short period of time.
  • the present inventors used pluripotent stem cells as a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and BMP signaling pathway inhibition in the absence of undifferentiated maintenance factor as an adhesion culture step.
  • Adhesive culture was performed in a medium containing the substance, and the obtained cells were placed in a medium containing a BMP signaling pathway agonist in the absence of an undifferentiated maintenance factor, a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor.
  • the resulting cells are adherently cultured in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists to cause retinal precursors.
  • Cell-containing aggregates are obtained and, as a subsequent suspension culture step, the aggregates containing retinal precursor cells are suspended in a medium containing Activin signaling pathway agonists, Sonic Hedgehog signaling pathway agonists and retinoic acid. It is pluripotent in a short period of time by culturing and suspending the resulting aggregates in a medium containing Sonic Hedgehog signaling pathway agonists in the absence of Activin signaling pathway agonists and retinoic acid.
  • a layered retinal tissue containing photoreceptor cells can be produced from stem cells, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to the following.
  • a method for producing a layered retinal tissue containing photoreceptor cells which comprises the following steps (1) and (2); (1) Aggregates containing retinal precursor cells are suspended-cultured in a medium containing Activin signaling pathway agonist, sonic hedgehog signal transduction pathway agonist and retinoic acid, and contain retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells. The process of obtaining aggregates, (2) Aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells were suspended-cultured in a medium containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid. The process of obtaining layered retinal tissue containing photoreceptor cells.
  • the layered retinal tissue containing photoreceptor cells is a retinal tissue containing an outer nuclear layer, an inner nuclear layer, and a ganglion cell layer.
  • the photoreceptor cells are contained in the outer nuclear layer.
  • the photoreceptors contained in the outer nuclear layer are rod photoreceptors and / or cone photoreceptors.
  • 50% or more of all cells contained in the outer nuclear layer are rod photoreceptors and / or cone photoreceptors.
  • the Activin signaling pathway agent is one or more substances selected from the group consisting of Activin A, Activin B, Activin C, and Activin AB, to any one of [1] to [6]. The method described. [8] The method according to [7], wherein the Activin signaling pathway agent is Activin A.
  • the Sonic hedgehog signaling pathway agonist is one or more substances selected from the group consisting of Sonic Hedgehog (Shh), Smoothened Agonist (SAG), and Purmorphamine (PMA), [1] to [8]. ] The method according to any one of. [10] The method according to [9], wherein the Sonic Hedgehog signaling pathway agonist is SAG. [11] The method according to any one of [1] to [10], wherein the aggregate containing the retinal progenitor cells is suspended-cultured for 0.5 to 50 days in the step (1).
  • [14] The method according to any one of [1] to [13], further comprising the following steps prior to step (1); (a) A step of adhering and culturing pluripotent stem cells in a medium containing a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor in the absence of an undifferentiated maintenance factor to obtain neural progenitor cells. (b) Neural progenitor cells are adherently cultured in a medium containing a BMP signaling pathway agonist in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors, and retinal progenitor cells.
  • Retinal progenitor cells are adherently cultured in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists, and coagulation containing retinal progenitor cells.
  • the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell.
  • the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is one or more substances selected from the group consisting of Lefty, SB431542, LY-364947, SB-505124, and A-83-01, [14] to [16].
  • the method according to any one of. [18] The method according to [17], wherein the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is SB431542.
  • the BMP signal transduction pathway inhibitor is one or more substances selected from the group consisting of LDN193189 and Dorsomorphin.
  • the method according to [19], wherein the BMP signaling pathway inhibitor is LDN193189.
  • a method for screening a therapeutic agent for a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells which comprises the following steps (11) to (13): (11) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the presence of the test substance for a certain period of time under viable culture conditions, the degree of damage to the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells is measured.
  • step (12) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the absence of the test substance or in the presence of positive control for a certain period of time under viable culture conditions, the layered retina containing the photoreceptor cells The process of measuring the degree of tissue damage, (13) A step of selecting a test substance in step (11) as a therapeutic agent for a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells based on the difference in the results measured in step (11) and step (12).
  • a drug efficacy evaluation method including the following steps (21) to (23): (21) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the presence of the test substance for a certain period of time under viable culture conditions, the degree of damage to the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells is measured.
  • Toxicity evaluation method including the following steps (31) to (33): (31) A step of measuring the degree of damage to the layered retinal tissue containing photoreceptor cells after culturing the layered retinal tissue containing photoreceptor cells in the presence of a test substance for a certain period of time under viable culture conditions.
  • a layered retinal tissue containing photoreceptor cells from aggregates or pluripotent stem cells containing retinal progenitor cells in a short period of time.
  • FIG. 1 shows the culture schedule of cell line 201B7 in Example 1.
  • FIG. 4 shows the culture schedule of cell line 201B7 in Example 2.
  • FIG. 5 shows the expression of the photo
  • FIG. 6 shows the expression of the photoreceptor progenitor cell marker Crx and the retinal ganglion cell marker Brn3 in the aggregate 20 days after the start of differentiation of the cell line M8.
  • FIG. 7 shows the expression of the photoreceptor progenitor cell marker Crx and the retinal ganglion cell marker Brn3 in the aggregate 40 days after the onset of differentiation of the cell line M8.
  • Outer neuroblastic layer outer neuroblastic layer
  • Inner neuroblastic layer inner neuroblastic layer
  • FIG. 8 shows the expression of the pyramidal photoreceptor marker RXR ⁇ and the rod photoreceptor marker NRL in the aggregate 60 days after the start of differentiation of the cell line M8.
  • FIG. 9 shows the expression of pyramidal photoreceptor markers S-opsin, L / M-opsin and rod photoreceptor marker rhodopsin in aggregates 80 days after the onset of differentiation of cell line M8.
  • FIG. 10 shows the culture schedule of cell line 1231A3 in Example 4.
  • FIG. 11 shows microscopic images of aggregates 15 days, 20 days, 40 days, 60 days, 80 days, and 90 days after the start of differentiation induction of cell line 1231A3 in Example 4.
  • the present invention provides a method for producing layered retinal tissue containing photoreceptor cells (hereinafter, production method 1 of the present invention).
  • a tissue is a cell having a structure in which one type of cell having a uniform morphology or property, or a cell layer composed of a plurality of types of cells having a different morphology or property, is arranged in a layered pattern.
  • the layered retinal tissue produced in the production method 1 of the present invention (hereinafter referred to as the retinal tissue of the present invention) is a tissue in which each retinal layer in the living retina or a layer corresponding to each retinal layer is arranged in a layered manner. It means a tissue in which each retinal layer or a layer corresponding to each retinal layer is composed of one type of retinal cells having uniform morphology and properties, or a plurality of types of retinal cells having different morphologies and properties.
  • the retinal layer means each layer constituting the retina, and specifically, the retinal pigment epithelial layer, the photoreceptor layer, the external limiting membrane, the outer nuclear layer, the outer plexiform layer, the inner nuclear layer, and the inner plexiform. Layers, ganglion cell layer, nerve fiber layer and inner limiting membrane can be mentioned.
  • the retinal layer of the present invention may also be a layer corresponding to each of the above-mentioned layers constituting the retina.
  • the term "corresponding" means having the same or substantially the same characteristics as each layer constituting the normally differentiated retina in the living body.
  • the characteristics of each retinal layer constituting the retina include the types of retinal cells contained in each retinal layer and the order of development of each layer in the retina.
  • the retinal layer constituting the retinal tissue of the present invention (hereinafter referred to as the retinal layer of the present invention) is not particularly limited as long as it is the above-mentioned retinal layer, and is composed of each of the above-mentioned one type or two or more types of retinal layers. It may have been done.
  • the retinal tissue of the present invention is preferably a retinal tissue exhibiting the characteristics of the outer nuclear layer, inner nuclear layer, and ganglion cell layer.
  • the retinal tissue of the present invention is preferably a retinal tissue including a layer corresponding to the outer nuclear layer, a layer corresponding to the inner nuclear layer, and a layer corresponding to the ganglion cell layer.
  • retinal cells means cells constituting each retinal layer in a living retina or precursor cells thereof, and are retinal precursor cells, photoreceptor precursor cells, photoreceptor cells (rod photoreceptor cells, pyramidal photoreceptor cells). Includes cells such as horizontal cells, amacrine cells, intervening nerve cells, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells, retinal pigment epithelial cells (RPE), hairline marginal cells, and precursor cells thereof. Not limited to these.
  • the retinal precursor cell is specific to any mature retinal layer such as photoreceptor cells, rod photoreceptors, pyramidal photoreceptors, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, and retinal pigment epithelial cells. Precursor cells that can also differentiate into target nerve cells.
  • the photoreceptor cells, horizontal cell precursors, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, retinal ganglion cell precursor cells, and retinal pigment epithelial precursor cells are photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retina, respectively. Precursor cells that have been determined to differentiate into ganglion cells and retinal pigment epithelial cells.
  • the retinal layer-specific nerve cell means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
  • retinal layer-specific neurons include bipolar cells, retinal ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells, photoreceptor cells, retinal pigment epithelial cells, rod photoreceptor cells and pyramidal photoreceptor cells.
  • the retinal cells constituting the retinal layer of the present invention are not particularly limited as long as they are the above-mentioned retinal cells, and may be composed of one or more of the above-mentioned retinal cells.
  • Examples of the retinal system cells constituting the retinal layer of the present invention include retinal pigment epithelial cells (RPE) constituting the retinal pigment epithelial layer and photoreceptor cells constituting the outer granule layer (rod photoreceptor cells, pyramidal photoreceptor cells). , Horizontal cells constituting the inner granule layer, amacrine cells, bipolar cells, retinal ganglion cells (ganglion cells) constituting the ganglion cell layer, and the like. Which cell constitutes each retinal layer can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of expression of a retinal cell marker or the degree thereof.
  • Retinal cell markers include Rx (also called Rax) expressed in neural precursor cells, Rx, PAX6 and Chx10 expressed in retinal precursor cells, and Nkx2 expressed in precursor cells of hypothalamic neurons but not in retinal precursor cells.
  • Rx also called Rax
  • Sox1 which is expressed in the hypothalamic nerve epithelium and not in the retina
  • Crx, Blimp1, etc. which are expressed in precursor cells of photoreceptor cells.
  • Markers for retinal layer-specific neurons include Chx10, PKC ⁇ and L7 expressed in bipolar cells, TuJ1 and Brn3 expressed in retinal ganglion cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, and mature photoreceptor cells.
  • Rhodopsin and Recoverin expressed in rod photoreceptors Nrl and Rhodopsin expressed in rod photoreceptors, Rxr-gamma, S-Opsin and M / L-Opsin expressed in pyramidal photoreceptors, RPE65 and Mitf expressed in retinal pigment epithelial cells, Examples thereof include Rdh10 and SSEA1 expressed in hair-like peripheral cells.
  • the retinal tissue of the present invention is characterized by containing photoreceptor cells.
  • the photoreceptor cells contained in the retinal tissue of the present invention are not particularly limited as long as they are contained in one or more types of retinal layers constituting the retinal tissue, but are contained in the outer nuclear layer as described above. Is preferable.
  • the photoreceptor cells contained in the retinal tissue of the present invention are contained in the outer nuclear layer, the photoreceptor cells contained in the outer nuclear layer may be rod photoreceptors and / or cone photoreceptors.
  • the ratio of rod photoreceptors to cone photoreceptors contained in the outer nuclear layer is not particularly limited as long as it is in the range of 100%: 0% to 0%: 100%, and is usually 10%: 90% to 90%.
  • the ratio of rod photoreceptors to pyramidal photoreceptors can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence or degree of expression of rod photoreceptors and cone photoreceptors.
  • the proportion of rod photoreceptors and / or pyramidal photoreceptors contained in the outer nuclear layer is not particularly limited, but rod photoreceptors and pyramidal photoreceptors among all cells contained in the outer nuclear layer are not particularly limited.
  • the total number of cells in the cells is usually 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more. Of all the cells contained in the outer nuclear layer, the larger the total number of rod photoreceptors and cone photoreceptors, the more mature the retinal tissue of the present invention can be determined.
  • the production method 1 of the present invention includes the following steps. (1) Aggregates containing retinal precursor cells are suspended-cultured in a medium containing Activin signaling pathway agonist, sonic hedgehog signal transduction pathway agonist and retinoic acid, and contain retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells. The process of obtaining aggregates. (2) Aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells were suspended-cultured in a medium containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid. The process of obtaining layered retinal tissue containing photoreceptor cells.
  • step (1) aggregates containing retinal progenitor cells are suspended-cultured in a medium containing an Activin signaling pathway agonist, a sonic hedgehog signaling pathway agonist, and retinoic acid.
  • the aggregate containing retinal progenitor cells is particularly limited as long as it is an aggregate having a cell layer expressing at least one selected from the group consisting of retinal progenitor cell markers Rx, PAX6 and Chx10.
  • it may be an aggregate containing retinal progenitor cells obtained by adherent culture of pluripotent stem cells, or an aggregate containing retinal progenitor cells obtained by another production method. good.
  • Elizabeth E. Capowski 1 et al., Development. 2019 Jan 1; 146 (1): dev171686, WO 2015/025967 an aggregate containing retinal progenitor cells produced by the method disclosed in the present invention. It may be used in the step (1) of the manufacturing method 1.
  • the aggregate containing the retinal progenitor cells used in the step (1) is uniform.
  • Uniform agglomerates means that the size of each agglomerate is constant when culturing a plurality of agglomerates, and when the size of the agglomerates is evaluated by the length of the maximum diameter, the agglomerates are uniform.
  • Aggregation means that the variance of the maximum diameter length is small. More specifically, 75% or more of the entire population of aggregates is more preferably within the range of an average value of ⁇ 100%, preferably an average value of ⁇ 50%, of the maximum diameter in the population of the aggregates. Means that the average value is within the range of ⁇ 20%.
  • step (1) aggregates containing retinal progenitor cells are suspended and cultured.
  • the term "suspension culture” or “suspension culture method” refers to a method of culturing while maintaining a state in which cells or cell aggregates are suspended and present in a medium, and a method of performing the culture. That is, suspension culture is performed under the condition that cells or cell aggregates are not adhered to the culture equipment or the like, and culture (adhesion culture or adhesion culture method) performed under the condition of adhering to the culture equipment or the like is in the category of suspension culture. Not included in. In this case, cell adhesion means that a strong cell-substratum junction is formed between the cell or cell aggregate and the culture equipment. More specifically, suspension culture refers to culture under conditions that do not form strong cell-substrate bonds between cells or cell aggregates and culture equipment or the like.
  • the cell-substrate bond In the aggregate of cells in suspension culture, cells adhere to each other. In the aggregate of cells in the suspension culture, the cell-substrate bond is hardly formed with the culture equipment or the like, or even if it is formed, its contribution is small. In some embodiments, in the aggregate of cells in suspension culture, the endogenous cell-substrate bond is present inside the aggregate, but the cell-substrate bond is hardly formed with the culture equipment or the like. Or, even if it is formed, its contribution is small.
  • Cell-to-cell plane attachment means that cells adhere to each other on the surface. More specifically, when cells are surface-adhered, the ratio of the surface area of one cell to the surface of another cell is, for example, 1% or more, preferably 3% or more, and more preferably 5%. That is all.
  • the surface of the cell can be observed by staining with a membrane-staining reagent (eg DiI) or by immunostaining with a cell adhesion factor (eg E-cadherin or N-cadherin).
  • a membrane-staining reagent eg DiI
  • a cell adhesion factor eg E-cadherin or N-cadherin
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as the suspension culture is possible, and a person skilled in the art can appropriately determine the incubator.
  • Examples of such an incubator include a flask, a tissue culture flask, a culture dish (dish), a petri dish, a tissue culture dish, a multidish, a microplate, a microwell plate, a micropore, a multiplate, and a multiwell plate.
  • These incubators are preferably cell non-adhesive to allow suspension culture.
  • the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells (for example, extracellular matrix of basement membrane preparation, laminin, entactin, collagen, gelatin, etc.). , Or coating treatment with polymers such as polylysine and polyornithin, or surface treatment such as positive charge treatment), etc. can be used.
  • the surface of the incubator was artificially treated for the purpose of reducing the adhesion to cells (for example, superhydrophilic treatment such as MPC polymer, low protein adsorption treatment, etc.). You can use things.
  • Rotational culture may be performed using a spinner flask, a roller bottle, or the like.
  • the culture surface of the incubator may have a flat bottom or may have irregularities.
  • the medium used in the suspension culture can be prepared using the medium normally used for culturing animal cells as the basal medium.
  • the basal medium include BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glassgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, and F-12.
  • Examples include media that can be used for culturing animal cells, such as medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof.
  • the medium used in the suspension culture may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but since the retinal progenitor cells contained in the aggregate have already been determined in the direction of differentiation, the retinal progenitor cells It is preferred to use serum-containing medium to promote further maturation and proliferation.
  • the serum-containing medium means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts and the like. You may.
  • serum-containing mediums include 10% Fetal Bovine Serum (BioSera), 1% N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), 1x Antibiotic-Antimycotic (GIBCO), and 0.1 mM Taurine (Sigma-).
  • DMEM / F-12, GlutaMax supplement medium (Thermo Fisher Scientific) containing Aldrich) may be used.
  • the culture may be carried out under xeno-free conditions, preferably.
  • Xenofree means a condition in which a component derived from a species different from that of the cell to be cultured is excluded.
  • the medium used for suspension culture of aggregates containing retinal progenitor cells in step (1) contains Activin signaling pathway agonist, Sonic Hedgehog signaling pathway agonist and retinoic acid.
  • Activin signaling pathway agonist Activin signaling pathway agonist
  • Sonic Hedgehog signaling pathway agonist Activin signaling pathway agonist
  • retinoic acid Activin signaling pathway agonist
  • in order to prepare retinal tissue culturing in a medium containing a differentiation-inducing factor at the time when pluripotent stem cells are differentiated into retinal progenitor cells is not common, and in a medium containing no differentiation-inducing factor.
  • the method of culturing in was the usual method.
  • step (1) aggregates containing retinal progenitor cells are further suspended-cultured in a medium containing an Activin signaling pathway agonist, a sonic hedgehog signaling pathway agonist, and retinoic acid to obtain retinal progenitor cells. It is possible to promote differentiation and further proliferation. In particular, the process of culturing aggregates containing retinal progenitor cells in a medium containing the Activin signaling pathway agonist, the sonic hedgehog signaling pathway agonist, and retinoic acid at the same time was completely unknown.
  • the Activin signal transduction pathway agent is a substance that can enhance the signal mediated by Activin.
  • the Activin signaling pathway agonist is not particularly limited as long as it can induce the differentiation of pluripotent stem cells into retinal precursor cells by enhancing the Activin signaling pathway, but for example, a protein belonging to the Activin family (for example, Activin A, Activin B, Activin C, Activin AB, etc.), Activin receptor agonists, etc.
  • the Activin signal transduction pathway agent may contain one or more of these.
  • the Activin signaling pathway agent is preferably Activin A.
  • the sonic hedgehog signal (hereinafter, may be referred to as Shh) transmission pathway acting substance is a substance capable of enhancing signal transduction mediated by Shh.
  • the Shh signaling pathway agonist is not particularly limited as long as it can promote the differentiation into rod photoreceptors by enhancing the Shh signaling pathway, but is not particularly limited, and is, for example, a protein belonging to the Hedgehog family (eg, for example).
  • Shh especially Sonic Headgehog N-terminus and Ihh
  • Shh receptor agonist PMA (Purmorphamine; 9-cyclohexyl-N- [4- (4-morpholinyl) phenyl] -2- (1-nagtale) Nyloxy) -9H-purine-6-amine) or SAG (Smoothened Agonist; N-methyl-N'-(3-pyridinylbenzyl) -N'-(3-chlorobenzo [b] thiophen-2-carbonyl) ) -1,4-Diaminocyclohexane) and the like.
  • the Shh signal transduction pathway agonist may contain one or more of these.
  • the Shh signal transduction pathway agonist is preferably SAG, Shh N-terminal. Is.
  • retinoic acid acts to promote differentiation into photoreceptor cells.
  • the concentrations of the Activin signaling pathway agonist, the Sonic Hedgehog signaling pathway agonist and the retinoic acid can be appropriately set within the range in which the above effects can be achieved.
  • Activin A is usually used at a concentration of 0.01 to 1000 ng / mL, preferably 0.1 to 750 ng / mL, more preferably 1 to 500 ng / mL (eg, 100 ng / mL).
  • SAG is usually used at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 700 nM, more preferably 30 to 600 nM (eg, 100 nM).
  • the Shh N-terminus is usually used at a concentration of 0.1-300 ⁇ g / mL, preferably 1-100 ⁇ g / mL, more preferably 3-60 ⁇ g / mL (eg, 10 ⁇ g / mL).
  • Tretinoin acid is usually used at a concentration of 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M (eg, 1 ⁇ M).
  • the Activin signaling pathway agent can be appropriately used in an amount having an Activin signaling promoting activity equivalent to that of Activin A at the above concentration.
  • the sonic hedgehog signal transduction pathway agent can be appropriately used in an amount having the same Shh signal transduction promoting activity as the SAG and Shh N-terminals at the above concentrations.
  • the aggregate obtained by the step (1) expresses the retinal ganglion cell marker Brn3 in the inner layer and the photoreceptor progenitor cell marker Crx in the outermost layer. It is not particularly limited as long as it is an aggregate in which the expressed cell layer is formed, but it is usually 0.5 to 50 days.
  • the culture time of the aggregate containing the retinal progenitor cells in the step (1) is preferably 1 day or more, 5 days or more, 10 days or more, 15 days or more, or 20 days or more.
  • the culture time of pluripotent stem cells in the step (1) is preferably within 45 days or within 40 days.
  • the range of culture time for aggregates containing retinal progenitor cells in step (1) is preferably 1 to 45 days, 15 to 45 days, or 20 to 40 days (most preferably 30 days). .. That is, in step (1), aggregates containing retinal progenitor cells were suspended and cultured for 0.5 to 50 days (preferably 1 to 45 days, 15 to 45 days, or 20 to 40 days (most preferably 30 days)). After that, step (2) is continued.
  • step (1) aggregates containing retinal progenitor cells are cultivated in a medium containing Activin A (final concentration 100 ng / mL), SAG (final concentration 100 nM) and retinoic acid (final concentration 1 ⁇ M). Suspension culture can be performed for 30 days.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (1) can be set as appropriate.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C to about 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • step (2) aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells are placed in a medium containing a sonic hedgehog signaling pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonists and retinoic acid. Floating culture is performed to obtain layered retinal tissue containing photoreceptor cells.
  • step (2) aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor progenitor cells are suspended-cultured.
  • the incubator used in the suspension culture method and suspension culture may be the same as that used in step (1).
  • the basal medium used in the step (2) is not particularly limited, and the basal medium described in the step (1) can be appropriately selected.
  • the medium used in the step (2) may be a serum-containing medium or a serum-free medium as in the step (1), but the retinal ganglion cells and photoreceptor precursors contained in the aggregates. Since the cells have already been determined to differentiate, it is preferable to use a serum-containing medium to promote further maturation and proliferation of these cells.
  • DMEM / F-12 containing 0.1 mM Taurine Sigma-Aldrich
  • GlutaMax supplement medium Thermo Fisher Scientific
  • the medium used for suspension culture of aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor progenitor cells in step (2) is sonic hedgehog signaling pathway action in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid. Contains substances.
  • step (1) in the conventional method, in order to prepare retinal tissue, after the pluripotent stem cells have differentiated into retinal progenitor cells, a method of culturing in a medium containing no differentiation-inducing factor is usually used. there were.
  • step (2) aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells were further subjected to a medium containing a sonic hedgehog signaling pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid.
  • a medium containing a sonic hedgehog signaling pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid.
  • the transfer method from the step (1) to the step (2) is not particularly limited.
  • a medium containing the medium used in step (1) that is, an Activin signaling pathway agonist, a sonic Hedgehog signaling pathway agonist, and retinoic acid.
  • the medium may be exchanged directly from the medium used in the step (1) to the medium used in the step (2), or the medium used in the step (1) may be exchanged with the basal medium. It may be replaced with the medium used in step (2).
  • step (2) aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells are suspended-cultured in a medium containing a sonic hedgehog signaling pathway agonist in the absence of Activin signaling pathway agonists and retinoic acid. ..
  • absence means that a specific substance is not contained in the medium. Therefore, for example, in the absence of the Activin signal transduction pathway agent, the condition that the Activin signal transduction pathway agent is not added, or the activin signal transduction pathway agent is substantially not contained (for example, Activin A).
  • the condition that the concentration is 0.1 ng / mL or less) can be mentioned.
  • the absence of retinoin acid includes a condition in which A retinoinic acid is not added or a condition in which retinoinic acid is substantially not contained (for example, the concentration of retinoinic acid is 0.1 nM or less).
  • step (2) the Activin signaling pathway agonist and retinoic acid not contained in the medium, and the sonic hedgehog signaling pathway agonist contained in the medium are the same as those described in step (1). It may be a thing.
  • the concentration of the Sonic Hedgehog signaling pathway agent can be appropriately set within the range in which the above effects can be achieved.
  • SAG is typically used at concentrations of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 700 nM, more preferably 30 to 600 nM (eg, 100 nM).
  • the Shh N-terminus is usually used at a concentration of 0.1-300 ⁇ g / mL, preferably 1-100 ⁇ g / mL, more preferably 3-60 ⁇ g / mL (eg, 10 ⁇ g / mL).
  • the sonic hedgehog signaling pathway agonist can be appropriately used in an amount having Shh signaling promoting activity equivalent to that of SAG at the above concentration.
  • the culture time of the aggregate in the step (2) is particularly long as long as the outermost layer of the aggregate obtained in the step (2) can contain pyramidal photoreceptor marker-positive cells or rod photoreceptor marker-positive cells. Not limited, but usually 20-320 days.
  • the culture time of the aggregate containing the retinal ganglion cells and the photoreceptor progenitor cells in the step (2) is preferably 25 days or more, 30 days or more, 35 days or more, or 40 days or more.
  • the culture time of the aggregate containing the retinal ganglion cells and the photoreceptor progenitor cells in the step (2) is preferably within 200 days, within 100 days, within 75 days, or within 60 days.
  • the range of culture times for aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor progenitor cells in step (2) is preferably 25-200 days, 30-100 days, 35-75 days, or 40-60 days. Days (most preferably 50 days).
  • step (2) aggregates containing retinal ganglion cells and photoreceptor precursor cells are placed in a medium containing SAG (final concentration 100 nM) in the absence of Activin signaling pathway agonist and retinoic acid.
  • a layered retinal tissue containing photoreceptor cells can be obtained by performing suspension culture for 50 days.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (2) can be set as appropriate.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C to about 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the production method 1 of the present invention may further include the following steps before the step (1).
  • (b) Neural progenitor cells are adherently cultured in a medium containing a BMP signaling pathway agonist in the absence of undifferentiated maintenance factor, TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and BMP signaling pathway inhibitor, and retinal progenitor cells.
  • Retinal progenitor cells are adherently cultured in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists, and coagulation containing retinal progenitor cells.
  • pluripotent stem cells are adherently cultured in a medium containing a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor in the absence of undifferentiated maintenance factors.
  • a pluripotent stem cell can be cultured in vitro and can differentiate into all three germ layers (outer germ layer, middle germ layer, endoderm) and / or all cell lineages belonging to extraembryonic tissues. Stem cells with ability (pluripotency).
  • Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, reproductive stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells: Embryonic stem cells), EG cells (Embryonic germ cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cells).
  • Muse cells Multi-lineage differentiating stress ending cells obtained from mesenchymal stem cells (MSC) and GS cells produced from germ cells (for example, testis) are also included in pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to knockout mouse production since 1989. Human embryonic stem cells were established in 1998 and are being used in regenerative medicine.
  • ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. Methods for producing ES cells are described in, for example, WO96 / 22362, WO02 / 101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like.
  • Embryonic stem cells can be obtained from predetermined institutions or can be purchased commercially. For example, human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • the human embryonic stem cell Rx :: GFP strain (derived from KhES-1) is available from RIKEN. Both EB5 cells, which are mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are preferably ES cells or induced pluripotent stem cells, and more preferably induced pluripotent stem cells.
  • the induced pluripotent stem cells in the present specification are cells in which pluripotency is induced by reprogramming somatic cells by a known method or the like. Specifically, differentiated somatic cells such as fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells are treated as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28. , Esrrb, etc., and cells that have been reprogrammed to induce pluripotency by expression of any combination of a plurality of genes selected from the reprogramming gene group.
  • differentiated somatic cells such as fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells are treated as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28. , Esrrb, etc.
  • Preferred combinations of reprogramming factors include (1) Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc (c-Myc or L-Myc), (2) Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Lin28, and L-Myc (Stem). Cells, 2013; 31: 458-466) can be mentioned.
  • Induced pluripotent stem cells were established in mouse cells by Yamanaka et al. In 2006 (Cell, 2006, 126 (4), pp.663-676). Induced pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007, and have pluripotency and self-renewal ability similar to embryonic stem cells (Cell, 2007, 131 (5), pp.861-872; Science. , 2007, 318 (5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1), pp.101-106).
  • induced pluripotent stem cells In addition to the method of producing induced pluripotent stem cells by direct reprogramming by gene expression, it is also possible to induce induced pluripotent stem cells from somatic cells by adding a compound or the like (Science, 2013, 341, pp. 651- 654).
  • induced pluripotent stem cells for example, 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells established at Kyoto University.
  • 1231A3 cells and other human induced pluripotent cell lines are available from Kyoto University and iPS Academia Japan Co., Ltd.
  • the induced pluripotent stem cells for example, Ff-I01 cells, Ff-I14 cells and QHJI01s04 cells established at Kyoto University are available from Kyoto University.
  • the somatic cells used for producing artificial pluripotent stem cells are not particularly limited, but are tissue-derived fibroblasts, blood cell lineage cells (for example, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and T cells), and liver. Examples thereof include cells, pancreatic cells, intestinal epithelial cells, smooth muscle cells and the like.
  • the means for expressing the genes is not particularly limited when the cells are reprogrammed by the expression of several kinds of genes.
  • an infection method using a virus vector for example, a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a Sendai virus vector which is a cytoplasmic RNA vector), or a plasmid vector which is a non-viral vector.
  • Gene transfer method using for example, plasmid vector, episomal vector
  • plasmid vector, episomal vector for example, calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, electroporation method
  • gene transfer method using RNA vector for example, calcium phosphate method
  • lipofection method electroporation method
  • direct protein injection method for example, a method using a needle, a lipofection method, an electroporation method
  • Induced pluripotent stem cells can be produced in the presence of feeder cells or in the absence of feeder cells (feeder-free).
  • artificial pluripotent stem cells can be produced in the presence of undifferentiated maintenance factor by a known method.
  • the medium used for producing induced pluripotent stem cells in the absence of feeder cells that is, a medium containing an undifferentiated maintenance factor (undifferentiated maintenance medium) is not particularly limited, but known embryonic stem cells and / Alternatively, a medium well known to those skilled in the art can be used as a maintenance medium for induced pluripotent stem cells or a medium for establishing artificial pluripotent stem cells in a feeder-free manner.
  • Essential 8 medium is DMEM / F12 medium with L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg / l), sodium selenite (14 ⁇ g / 1), insulin (19.4 mg / l), ⁇ 3 ( Includes 543 mg / l), transferrin (10.7 mg / l), bFGF (100 ng / mL), and TGF ⁇ family signaling pathway agonist (TGF ⁇ 1 (2 ng / mL) or Nodal (100 ng / mL)) (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)).
  • feeder-free media include, for example, Essential 6 medium (manufactured by Life Technologies), Stabilized Essential 8 medium (manufactured by Life Technologies), and S-medium (manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • Essential 6 medium manufactured by Life Technologies
  • Stabilized Essential 8 medium manufactured by Life Technologies
  • S-medium manufactured by DS Pharma Biomedical
  • StemPro manufactured by Life Technologies
  • hESF9 Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9; 105 (36): 13409-14
  • TeSR medium manufactured by STEMCELL Technologies
  • mTeSR1 manufactured by STEMCELL Technologies
  • Examples include mTeSR2 (manufactured by STEMCELL Technologies) and TeSR-E8 (manufactured by STEMCELL Technologies).
  • StemFit registered trademark
  • a feeder-free medium undifferentiated maintenance medium
  • the pluripotent stem cell used in the present invention is a mammalian pluripotent stem cell, preferably a rodent (eg, mouse, rat) or primate (eg, human, monkey) pluripotent stem cell. More preferably, it is a human induced pluripotent stem cell, and even more preferably, it is a human induced pluripotent stem cell (iPS cell) or a human embryonic stem cell (ES cell).
  • iPS cell human induced pluripotent stem cell
  • ES cell human embryonic stem cell
  • pluripotent stem cells established from somatic cells of transplant recipients can be used to solve this problem.
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • the recipient It produces a layered retinal tissue containing immunological autologous photoreceptor cells, which is transplanted into the recipient.
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • somatic cells of another person whose recipient and immunity are compatible for example, HLA type and MHC type are compatible
  • Layered retinal tissue containing photoreceptor cells may be produced and transplanted into the recipient.
  • pluripotent stem cells are adherently cultured.
  • the term "adhesive culture” or “adhesive culture method” refers to culturing cells or cell aggregates under conditions of adhering them to a culture device or the like, and a method of performing the culture. That is, adhesive culture is performed under the condition that cells or cell aggregates are adhered to culture equipment or the like, and suspension culture is not included in the category of adhesive culture. More specifically, adhesive culture refers to culture under conditions that allow a strong cell-substrate bond to be formed between cells or cell aggregates and culture equipment or the like.
  • the incubator used for adhesive culture is not particularly limited as long as it is capable of adhesive culture, and a person skilled in the art should appropriately select an incubator according to the scale of culture, culture conditions and culture period. Is possible.
  • Examples of such an incubator include a flask, a tissue culture flask, a culture dish (dish), a tissue culture dish, a multi-dish, a micro plate, a micro-well plate, a multi-plate, a multi-well plate, a chamber slide, and a petri dish.
  • Examples include tubes, trays, culture bags, microcarriers, beads, stack plates, spinner flasks or roller bottles. These incubators are preferably cell adherent in order to enable adherent culture.
  • Examples of the cell-adhesive incubator include an incubator in which the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving the adhesion to cells, specifically, a surface-processed incubator or an incubator.
  • An incubator whose inside is coated with a coating agent can be mentioned.
  • Examples of the coating agent include laminin [including laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 111) and the like, and laminin fragments (including laminin 511E8, iMatrix-511 (Nippi), etc.)], entactin, collagen.
  • Extracellular matrix such as gelatin, Vitronectin, Synsemax (Corning), Matrigel, etc., or polymers such as polylysine, polyornithin, etc.
  • the surface-treated incubator include a surface-treated incubator such as a positive charge treatment.
  • the medium usually used for culturing animal cells can be prepared as the basal medium in the same manner as in the suspension culture.
  • the basal medium include BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glassgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, and F-12.
  • media that can be used for culturing animal cells such as medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof.
  • the medium used in the adhesion culture may be a serum-containing medium or a serum-free medium, and may be a differentiation-inducing factor necessary for differentiating pluripotent stem cells into aggregates containing retinal progenitor cells. To limit it, it is preferable to use a serum-free medium.
  • the serum-free medium means a medium containing no unadjusted or unpurified serum.
  • a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components is also included in the serum-free medium unless unadjusted or unpurified serum is contained.
  • the serum-free medium may contain a serum substitute.
  • the serum substitute include those appropriately containing albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace element, 2-mercaptoethanol or 3'thiolglycerol, or an equivalent thereof.
  • Such serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • Commercially available products may be used as serum substitutes. Examples of such commercially available serum substitutes include Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Life Technologies; currently Thermo Fisher: hereinafter, also referred to as KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Life Technologies), and Glutamax TM . (Life Technologies), B27 (Life Technologies), N2 supplement (Life Technologies), ITS supplement (Life Technologies).
  • the serum-free medium used in the adhesion culture is appropriately fatty acids or lipids, amino acids (for example, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like. May be contained.
  • the medium used for adherent culture of pluripotent stem cells in step (a) contains a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor in the absence of undifferentiated maintenance factors.
  • agglomerates of pluripotent stem cells are prepared by adherent culture of pluripotent stem cells in the presence of undifferentiated maintenance factors, and the aggregates are differentiated and cultured in the absence of undifferentiated maintenance factors. It was a common method to make retinal tissue by means of.
  • pluripotent stem cells are adherently cultured in a medium containing a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor in the absence of undifferentiated maintenance factors. The purpose is to directly differentiate pluripotent stem cells into neural progenitor cells without going through stem cell aggregates.
  • the undifferentiated maintenance factor in the step (a) is not particularly limited as long as it is a substance having an action of suppressing the differentiation of pluripotent stem cells.
  • undifferentiated maintenance factors widely used by those skilled in the art, in the case of primed pluripotent stem cells (for example, human ES cells and human iPS cells), FGF signaling pathway agonists and TGF ⁇ signaling pathways are used. Activators, insulin and the like can be mentioned.
  • the FGF signal transduction pathway agent include fibroblast growth factors (eg, bFGF, FGF4 and FGF8).
  • TGF ⁇ signal transduction pathway agent include TGF ⁇ 1 and TGF ⁇ 2.
  • the absence of the undifferentiated maintenance factor means that the undifferentiated maintenance factor is not contained in the medium. Therefore, in the absence of the undifferentiated maintenance factor, the condition that the undifferentiated maintenance factor is not added or that the undifferentiated maintenance factor is substantially not contained (for example, the concentration of the undifferentiated maintenance factor is 10 pg / mL).
  • concentration of the undifferentiated maintenance factor is 10 pg / mL.
  • the TGF ⁇ signaling pathway is a signal transduction pathway that uses TGF ⁇ as a ligand and is transmitted intracellularly by the Smad family. Therefore, the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor represents a substance that inhibits the TGF ⁇ signaling pathway, that is, the signaling pathway transmitted by the Smad family.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway caused by TGF ⁇ , and may be any of nucleic acid, protein, and low molecular weight organic compound.
  • Such substances include, for example, substances that directly act on TGF ⁇ (for example, proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding TGF ⁇ (for example, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), TGF ⁇ receptors and TGF ⁇ .
  • examples thereof include a substance that inhibits binding and a substance that inhibits physiological activity caused by signal transduction by the TGF ⁇ receptor (for example, an inhibitor of TGF ⁇ receptor, an inhibitor of Smad, etc.).
  • TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitors examples include Lefty and the like.
  • TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor a compound well known to those skilled in the art can be used, and specific examples thereof include SB431542, LY-364947, SB-505124, and A-83-01.
  • SB431542 (4- (5-benzol [1,3] dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl) -benzamide) and A-83-01 (3-( 6-Methyl-2-pyridinyl) -N-phenyl-4- (4-quinolinyl) -1H-pyrazole-1-carbothioamide) is an inhibitor of TGF ⁇ receptor (ALK5) and Activin receptor (ALK4 / 7). It is a compound known as (that is, a TGF ⁇ R inhibitor). As the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor, one or more of these may be contained.
  • the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is preferably SB431542 or A-83-01.
  • the BMP signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway caused by BMP, and may be any of nucleic acid, protein, and small molecule organic compound.
  • examples of the BMP include BMP2, BMP4, BMP7 and GDF7.
  • Such substances include, for example, substances that directly act on BMP (for example, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding BMP (for example, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), BMP receptors (BMPR) and BMP. Examples thereof include substances that inhibit binding and substances that inhibit physiological activity caused by signal transduction by BMP receptors.
  • BMPR ALK2 or ALK3 can be mentioned.
  • LDN193189 4- [6- (4-piperazine-1-ylphenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] quinoline
  • BMPR inhibitor BMPR inhibitor
  • proteins known as BMP signal transduction pathway inhibitors may be used.
  • the BMP signal transduction pathway inhibitor may contain one or more of these.
  • the BMP signaling pathway inhibitor is preferably LDN193189.
  • the concentrations of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor and the BMP signal transduction pathway inhibitor can be appropriately set within the range in which the above effects can be achieved.
  • SB431542 is typically used at a concentration of 0.025 to 1000 ⁇ M, preferably 0.1 to 250 ⁇ M, more preferably 0.5 to 50 ⁇ M (eg, 5 ⁇ M).
  • Lefty is usually used at a concentration of 0.1 to 3000 ng / mL, preferably 1 to 1000 ng / mL, more preferably 10 to 300 ng / mL (eg, 100 ng / mL).
  • LY-364947 is usually used at a concentration of 0.025 to 1000 ⁇ M, preferably 0.1 to 250 ⁇ M, more preferably 0.5 to 50 ⁇ M (eg, 10 ⁇ M).
  • SB505124 is typically used at a concentration of 0.025 to 1000 ⁇ M, preferably 0.1 to 250 ⁇ M, more preferably 0.5 to 50 ⁇ M (eg, 5 ⁇ M).
  • A-83-01 is usually used at a concentration of 0.001 to 300 ⁇ M, preferably 0.01 to 30 ⁇ M, and more preferably 0.1 to 3 ⁇ M (for example, 0.5 ⁇ M).
  • LDN193189 is usually used at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 700 nM, more preferably 30 to 600 nM (eg, 100 nM).
  • Dorsomorphin is usually used at a concentration of 0.01 to 1000 ⁇ M, preferably 0.1 to 100 ⁇ M, more preferably 1 to 10 ⁇ M (eg, 3 ⁇ M).
  • the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor can be appropriately used in an amount having a TGF ⁇ signaling inhibitory activity equivalent to that of SB431542 at the above concentration.
  • the BMP signal transduction pathway inhibitor can be appropriately used in an amount having a BMP signal transduction inhibitory activity equivalent to that of LDN 193189 at the above concentration.
  • the culture time of pluripotent stem cells in the step (a) is not particularly limited as long as the cells obtained in the step (a) are cells expressing the neural progenitor cell marker Rx, but are usually 1 to 120 hours.
  • the culture time of the pluripotent stem cells in the step (a) is preferably 5 hours or more, 10 hours or more, 15 hours or more, or 20 hours or more.
  • the culture time of the pluripotent stem cells in the step (a) is preferably 100 hours or less, 80 hours or less, 60 hours or less, or 50 hours or less.
  • the range of culture time for pluripotent stem cells in step (a) is preferably 5-100 hours, 10-80 hours, 15-60 hours, or 20-50 hours (most preferably 24 hours). Is.
  • step (a) pluripotent stem cells are adherently cultured for 1 to 50 hours (preferably 5 to 100 hours, 10 to 80 hours, 15 to 60 hours, or 20 to 50 hours (most preferably 24 hours)). After that, step (b) is continued.
  • pluripotent stem cells in step (a), can be adherently cultured in a medium containing SB431542 (final concentration 5 ⁇ M) and LDN193189 (final concentration 100 nM) for 24 hours.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (a) can be set as appropriate.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C to about 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • neural progenitor cells are adherently cultured in a medium containing a BMP signaling pathway agonist in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors. ..
  • step (b) neural progenitor cells are adherently cultured.
  • the incubator used for the adhesive culture method and the adhesive culture may be the same as that used in the step (a).
  • the basal medium used in the step (b) is not particularly limited, and the basal medium described in the step (a) can be appropriately selected.
  • the medium used in the step (b) may be a serum-containing medium or a serum-free medium as in the step (a), but is necessary for differentiating the neural progenitor cells into retinal progenitor cells. It is preferable to use a serum-free medium in order to limit the differentiation-inducing factors.
  • serum-free medium 10% Fetal Bovine Serum (BioSera), 1% N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), 1 x Antibiotic-Antimycotic (1 x Antibiotic-Antimycotic) as in step (a).
  • the medium used for adherent culture of neural progenitor cells in step (b) contains BMP signaling pathway agonists in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors.
  • BMP signaling pathway agonists in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors.
  • neural progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells are subjected to BMP signaling pathway action in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors.
  • Adhesion culture in a medium containing a substance can promote differentiation into retinal progenitor cells.
  • the transfer method from the step (a) to the step (b) is not particularly limited.
  • the medium used in step (a) that is, the medium containing the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor and the BMP signal transduction pathway inhibitor
  • step (b) Can be transferred by exchanging the medium with the medium used in () (medium containing a BMP signal transduction pathway agonist).
  • the medium may be exchanged directly from the medium used in the step (a) to the medium used in the step (b), or the medium used in the step (a) may be exchanged with the basal medium. It may be replaced with the medium used in step (b).
  • neural progenitor cells are adherently cultured in a medium containing a BMP signaling pathway agonist in the absence of an undifferentiated maintenance factor, a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor.
  • the absence of the undifferentiated maintenance factor in the step (b) may be the same conditions as in the step (a). Further, in the absence of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor, the condition that the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is not added or that the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is substantially not contained (for example, TGF ⁇ signal transduction pathway inhibition). The condition that the concentration of the substance is 10 nM or less) can be mentioned.
  • the absence of a BMP signal transduction pathway inhibitor means that the BMP signal transduction pathway inhibitor is not added or that the BMP signal transduction pathway inhibitor is substantially not contained (for example, a BMP signal transduction pathway inhibitor). The condition that the concentration is 100 pM or less) can be mentioned.
  • the undifferentiated maintenance factor, the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and the BMP signaling pathway inhibitor not contained in the medium may be the same as those described in the step (a).
  • a BMP signal transduction pathway agent is a substance that can enhance a signal mediated by BMP.
  • the BMP signaling pathway agonist is not particularly limited as long as it can induce the differentiation of neural precursor cells into retinal precursor cells by enhancing the BMP signaling pathway, but for example, BMP proteins such as BMP2, BMP4 or BMP7, Examples thereof include GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, and BMP partial peptides.
  • the BMP signal transduction pathway agent may contain one or more of these.
  • the BMP2 protein, BMP4 protein and BMP7 protein are available, for example, from R & D Systems, and the GDF7 protein is available, for example, from Wako Pure Chemical Industries.
  • the BMP signaling pathway agent is preferably BMP4.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent can be appropriately set within the range in which the above effects can be achieved.
  • BMP4 is usually used at a concentration of 0.02 to 500 nM, preferably 0.1 to 100 nM, more preferably 0.3 to 30 nM (eg, 3 nM).
  • the BMP signaling pathway agent can be appropriately used in an amount having a BMP signaling promoting activity equivalent to that of BMP4 at the above concentration.
  • the culture time of neural progenitor cells in step (b) is such that the cells obtained in step (b) express at least one selected from the group consisting of retinal progenitor cell markers Rx, PAX6, and Chx10. As long as it is not particularly limited, it is usually 0.5 to 6 days.
  • the culture time of neural progenitor cells in step (b) is preferably 1 day or longer.
  • the culture time of neural progenitor cells in step (b) is preferably within 3 days. In one embodiment, the range of culture time of neural progenitor cells in step (b) is preferably 1 to 3 days (most preferably 2 days).
  • neural progenitor cells are placed in a medium containing BMP4 (final concentration 3 nM) in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors.
  • Retinal progenitor cells can be obtained by adhering culture for 2 days.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (b) can be set as appropriate.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C to about 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • retinal progenitor cells are adherently cultured in a medium in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists.
  • step (c) retinal progenitor cells are adherently cultured.
  • the incubator used in the adhesive culture method and the adhesive culture may be the same as those used in the steps (a) and (b).
  • the basal medium used in the step (c) is not particularly limited, and the basal medium described in the steps (a) and (b) can be appropriately selected.
  • the medium used in the step (c) may be a serum-containing medium or a serum-free medium as in the step (a), but the retinal progenitor cells are differentiated into aggregates containing the retinal progenitor cells. It is preferable to use a serum-free medium in order to limit the differentiation-inducing factors required for this.
  • serum-free medium 10% Fetal Bovine Serum (BioSera), 1% N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), 1x, as in steps (a) and (b).
  • the medium used for adherent culture of retinal progenitor cells in step (c) does not contain undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists.
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors when human pluripotent stem cells are differentiated into neuroretinal cells by culturing them in a medium containing BMP4, it is common to continue culturing in the medium containing BMP4 until they are differentiated into neuroretinal cells. It was a method.
  • retinal precursor cells are adherently cultured in a medium containing not only undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors, but also BMP signaling pathway agonists. This makes it possible to promote differentiation into aggregates containing neuroretinal cells.
  • the transfer method from the step (b) to the step (c) is not particularly limited.
  • the medium used in step (b) that is, the medium containing the BMP signal transduction pathway agonist
  • the medium used in step (c) Can be migrated by doing.
  • retinal progenitor cells are adherently cultured in a medium in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists.
  • the absence of the undifferentiated maintenance factor, the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, and the BMP signaling pathway inhibitor in the step (c) may be the same conditions as in the step (b).
  • the absence of a BMP signal transduction pathway agent means that the BMP signal transduction pathway agent is not added, or that the BMP signal transduction pathway agent is substantially not contained (for example, the BMP signal transduction pathway agent).
  • the condition that the concentration is 10 pg / mL or less) can be mentioned.
  • step (c) undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists not contained in the medium are described in steps (a) and (b). It may be the same as the one that was used.
  • the culture time of the retinal progenitor cells in the step (c) is at least one in which the aggregate containing the retinal progenitor cells obtained in the step (c) is selected from the group consisting of the retinal progenitor cell markers Rx, PAX6 and Chx10. It is not particularly limited as long as the cell layer to be expressed is an aggregate formed, but it is usually 2 to 27 days.
  • the culture time of the retinal progenitor cells in the step (c) is preferably 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, or 6 days or more.
  • the culture time of the retinal progenitor cells in step (c) is preferably within 25 days, within 20 days, within 15 days, or within 8 days.
  • the range of culture time of retinal progenitor cells in step (b) is preferably 3 to 11 days, 4 to 10 days, 5 to 9 days, or 6 to 8 days (most preferably 7 days). be.
  • retinal precursor cells are placed in a medium in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists for 7 days.
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors TGF ⁇ signaling pathway inhibitors
  • BMP signaling pathway inhibitors BMP signaling pathway agonists
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (c) can be set as appropriate.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C to about 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the present invention provides a therapeutic agent (therapeutic agent of the present invention) for a disease caused by a disorder of the retinal tissue, including a layered retinal tissue containing photoreceptor cells.
  • the therapeutic agent of the present invention contains an effective amount of layered retinal tissue containing photoreceptor cells and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the layered retinal tissue containing the included photoreceptor cells may be produced by the production method 1 of the present invention.
  • a physiological aqueous solvent physiological saline solution, buffer solution, serum-free medium, etc.
  • a medicine containing tissues and cells to be transplanted may be mixed with a preservative, a stabilizer, a reducing agent, an tonicity agent, etc., which are usually used.
  • the therapeutic agent of the present invention can be produced as a suspension by suspending the layered retinal tissue containing photoreceptor cells in an appropriate physiological aqueous solvent. If necessary, a cryopreservative may be added, cryopreserved, thawed at the time of use, washed with a buffer solution, and used for transplantation medicine.
  • a layered retinal tissue containing photoreceptor cells can be used as a therapeutic agent for a disease caused by a disorder of the retinal tissue or in order to replenish the damaged site in the damaged state of the retinal tissue.
  • Visualization by transplanting a layered retinal tissue containing photoreceptor cells into a patient with a disorder-based disorder of retinal tissue or a damaged state of retinal tissue that requires transplantation and replenishing the damaged retinal tissue itself. It can treat diseases caused by disorders of layered retinal tissue containing cells, or damaged states of retinal tissue.
  • Diseases based on damage to layered retinal tissue, including photoreceptor cells include, for example, ophthalmic diseases such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, pyramidal dystrophy, macular edema, retinal detachment, cancer-related retinopathy, and retinal veins. Examples include obstruction and retinal pigment epithelial detachment.
  • the layered retinal tissue containing photoreceptor cells produced by the production method 1 of the present invention is a layered retinal tissue containing photoreceptor cells. Since it is useful as a disease research material and a drug discovery material in screening of therapeutic agents for diseases based on retinal tissue disorders and drug efficacy evaluation, it can be used as a screening reagent or a drug efficacy evaluation reagent for a test substance.
  • iPS cells are prepared from a human patient with a disease caused by a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells, particularly a disease caused by a hereditary disorder, and the iPS cells are used for vision according to the production method 1 of the present invention.
  • the retinal tissue can reproduce in vitro damage to the layered retinal tissue containing photoreceptor cells that causes the disease the patient is suffering from. Therefore, the present invention comprises contacting a test substance with a layered retinal tissue containing photoreceptor cells produced by the production method 1 of the present invention and testing the effect of the substance on the retinal tissue.
  • layered retinal tissue containing photoreceptor cells having a specific disorder is cultured in the presence or absence of a test substance (negative control). Then, the degree of damage in the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells treated with the test substance is compared with the negative control.
  • a test substance with a reduced degree of the disorder can be selected as a candidate substance for a therapeutic agent for the disease based on the disorder.
  • a test substance that further enhances the physiological activity (for example, survival promotion or maturation) of a layered retinal tissue containing photoreceptor cells can be searched for as a drug candidate substance.
  • a layered retina containing photoreceptor cells produced by preparing artificial pluripotent stem cells from somatic cells having a gene mutation exhibiting a specific disorder such as retinal disease and inducing differentiation of the cells by the production method 1 of the present invention.
  • a test substance can be added to a tissue, and a candidate for a test substance effective as a therapeutic agent or a preventive agent for the disorder can be searched for by using whether or not the disorder is exhibited as an index.
  • the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells, which comprises the following steps (11) to (13). (11) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the presence of the test substance for a certain period of time under viable culture conditions, the degree of damage to the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells is measured.
  • step (12) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the absence of the test substance or in the presence of positive control for a certain period of time under viable culture conditions, the layered retina containing the photoreceptor cells The process of measuring the degree of tissue damage, (13) A step of selecting a test substance in step (11) as a therapeutic agent for a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells based on the difference in the results measured in step (11) and step (12).
  • the present invention provides a drug efficacy evaluation method including the following steps (21) to (23). (21) After culturing the layered retinal tissue containing the impaired photoreceptor cells in the presence of the test substance for a certain period of time under viable culture conditions, the degree of damage to the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells is measured.
  • the layered retinal tissue containing photoreceptor cells is not particularly limited as long as it is a layered retinal tissue containing damaged photoreceptor cells, and may be produced by the production method 1 of the present invention.
  • the absence of the test substance includes adding only the medium and the solvent in which the test substance is dissolved instead of the test substance.
  • positive control means a known compound having a therapeutic effect on damage to layered retinal tissue including photoreceptor cells.
  • a method for measuring the degree of damage a method for measuring the number of surviving cells, for example, a method for measuring the amount of intracellular ATP, a method for measuring the number of living cells by cell staining (for example, cell nucleus staining) and morphological observation, etc. Can be mentioned.
  • step (23) as a method of selecting a test substance as a therapeutic agent for a disorder of layered retinal tissue including photoreceptor cells or a method of evaluating the medicinal effect of the test substance, for example, the measured value and step of step (21).
  • the test substance can be selected as a therapeutic agent for layered retinal tissue damage, or the test substance. Can be judged to have medicinal properties.
  • the measured value of step (21) and the measured value of positive control in step (22) are compared, and when the degree of cell damage in step (21) is reduced to the same or higher level, the test substance is applied to the layered retina. It can be selected as a therapeutic agent for tissue disorders, or it can be determined that the test substance has a medicinal effect.
  • Toxicity evaluation method In toxicity evaluation, layered retinal tissue containing photoreceptor cells is cultured in the presence or absence of a test substance (negative control). Then, the degree of toxicity in the layered retinal tissue containing the photoreceptor cells treated with the test substance is compared with the negative control. As a result, the test substance showing toxicity as compared with the negative control can be determined as a substance having toxicity to the layered retinal tissue including photoreceptor cells.
  • the present invention provides a toxicity evaluation method including the following steps (31) to (33).
  • (31) A step of measuring the degree of damage to the layered retinal tissue containing photoreceptor cells after culturing the layered retinal tissue containing photoreceptor cells in the presence of a test substance for a certain period of time under viable culture conditions.
  • (32) Damage to the layered retinal tissue containing photoreceptor cells after culturing the layered retinal tissue containing photoreceptor cells under viable culture conditions for a certain period of time in the absence of a test substance or in the presence of positive control.
  • the process of measuring the degree of (33) A step of evaluating the toxicity of the test substance in the step (31) based on the difference in the results measured in the step (31) and the step (32).
  • the layered retinal tissue containing photoreceptor cells may be produced by the production method 1 of the present invention.
  • the absence of the test substance includes adding only the medium and the solvent in which the test substance is dissolved instead of the test substance.
  • the positive control means a known compound having toxicity.
  • a method for measuring the degree of cell damage a method for measuring the number of surviving cells, for example, a method for measuring the amount of intracellular ATP, or a method for measuring the number of living cells by cell staining (for example, cell nucleus staining) and morphological observation. The method and the like can be mentioned.
  • the measured value of the step (31) is compared with the measured value of the negative control in the step (32), and the cell damage in the step (31) is compared. It can be determined that the test substance is toxic when the degree of is large.
  • the measured value of step (31) and the measured value of positive control in step (32) are compared, and it can be determined that the test substance is toxic when the degree of cell damage in step (31) is equal to or higher than that. ..
  • the present invention also comprises a method for producing aggregates containing suspension-cultured retinal progenitor cells in step (1) of the production method of the present invention (hereinafter, production method 2 of the present invention). I will provide a.
  • the production method 2 of the present invention includes the following steps.
  • Retinal progenitor cells are adherently cultured in the absence of undifferentiated maintenance factors, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, BMP signaling pathway inhibitors and BMP signaling pathway agonists, and coagulation containing retinal progenitor cells. The process of obtaining an aggregate.
  • Example 1 Human iPS cell line 201B7 (Ci) seeded on a 6-well plate coated with iMatrix-511 (Nippi) at a cell density of 5,000 cells per well was cultured in StemFit AK02N medium (Ajinomoto) for 8 days, and then the medium was used.
  • Differentiation Medium (10% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM Non-essential Amino Acid (GIBCO), 1 mM Sodium Pyruvate, 100 U / mL Penicilin, 100 mg / mL streptomycin and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol (Sigma-Aldrich) ) was replaced with a GMEM medium (Thermo Fisher Scientific)), and differentiation induction was started.
  • GEBCO Non-essential Amino Acid
  • GMEM medium Thermo Fisher Scientific
  • SB431542 final concentration 5 ⁇ M, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • LDN193189 hydorochrolide final concentration 100 nM, Sigma-Aldrich
  • BMP4 final concentration 1.5 nM, R & D systems
  • the secondary antibody reaction was carried out at room temperature for 2 hours. After the completion of the secondary antibody reaction, washing was performed using PBS (-), and fluorescence microscopy was performed using a laser cofocal microscope LSM700 (Zeiss). Differentiation started 5 In the aggregate after a day, the formation of a dense cell region consisting of cells expressing the neural precursor cell marker Rx was observed (Fig. 2).
  • Samples 10 days after the start of differentiation were blocked with a blocking solution (5% deactivated horse serum (GIBCO), PBS (-) containing 0.05% Triton-X100) at room temperature for 1 hour, and then subjected to anti-Rx antibody and anti-Rx antibody and anti-Rx antibody.
  • the primary antibody reaction was carried out at 4 ° C., day and night, using CHX10 sheep polyclonal IgG antibody (1: 1000 dilution, X1180P / Exalpha Biologicals).
  • Example 2 Human iPS cell line 201B7 strain seeded with iMatrix-511 (Nippi) -coated 6-well plate at a cell density of 5,000 cells per well was cultured in StemFit AK02N medium (Ajinomoto) for 8 days, and then the medium was used as a differentiation medium (Ajinomoto).
  • SB431542 final concentration 5 ⁇ M, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • LDN193189 hydorochrolide final concentration 100 nM, Sigma-Aldrich
  • BMP4 final concentration 1.5 nM, R & D systems
  • the prepared frozen sections were activated by heat treatment in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0), washed with PBS (-), and then blocked solution (5% deactivated horse serum (GIBCO), 0.05. Blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour using PBS (-) containing% Triton-X100. After that, a primary antibody reaction was carried out at 4 ° C., day and night, using an anti-Crx rabbit polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, M231 / Takara) and an anti-Brn3 goat polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, sc-6026 / Santa Cruz). ..
  • fluorescence microscopy was performed using an inverted fluorescence microscope DMi8 (Leica). Retinal ganglion cell marker-positive cells were observed in the inner layer of the aggregate 30 days after the induction of differentiation, and photoreceptor progenitor cell marker-positive cells were scatteredly observed (FIG. 5).
  • Example 3 Human iPS cell line M8 strain seeded with iMatrix-511 (Nippi) -coated 6-well plate at a cell density of 4,500 cells per well (Kyoto University iPS Cell Research Institute "iPS from peripheral blood using episomal vector" According to the “cell establishment method", the inventors cultured iPS cells established from healthy human peripheral blood mononuclear cells in StemFit AK02N medium (Ajinomoto) for 8 days, and then used the medium for differentiation medium (10% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher)).
  • GMEM medium (Thermo Fisher Scientific) containing 0.1 mM Non-essential Amino Acid (GIBCO), 1 mM Sodium Pyruvate, 100 U / mL Penicilin, 100 mg / mL streptomycin and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol (Sigma-Aldrich). was replaced with, and differentiation induction was started.
  • GEBCO Non-essential Amino Acid
  • SB431542 final concentration 5 ⁇ M, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • LDN193189 hydorochrolide final concentration 100 nM, Sigma-Aldrich
  • BMP4 final concentration 3 nM, R & D systems
  • Aggregates were fixed with 3% PFA, 7.5% sucrose / PBS solution 20 days, 40 days, 60 days, and 80 days after the start of differentiation induction, and embedded with O.C.T.Compound (Sakura Finetech). did. After embedding, the frozen block was sliced using a cryomicrotome to prepare 10 ⁇ m frozen sections.
  • Frozen sections prepared from samples 20 and 40 days after the start of differentiation induction were activated by heat treatment in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0), washed with PBS (-), and then a blocking solution. Blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour using (5% deactivated horse serum (GIBCO), PBS (-) containing 0.05% Triton-X100). After that, a primary antibody reaction was carried out at 4 ° C., day and night, using an anti-Crx rabbit polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, M231 / Takara) and an anti-Brn3 goat polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, sc-6026 / Santa Cruz). ..
  • Frozen sections prepared from the sample 60 days after induction of differentiation were blocked with a blocking solution (5% deactivated horse serum (GIBCO), PBS containing 0.05% Triton-X100 (-)) at room temperature for 1 hour. After that, the primary antibody reaction was carried out at 4 ° C. overnight using anti-RxR ⁇ rabbit polyclonal IgG antibody (1: 200 dilution, sc-555 / Santa Cruz) and anti-NRL goat polyclonal IgG antibody (1: 200 dilution, AF2945 / R & D systems). rice field.
  • a blocking solution 5% deactivated horse serum (GIBCO), PBS containing 0.05% Triton-X100 (-)
  • Frozen sections prepared from the sample 80 days after the start of differentiation induction were activated by heat treatment in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0), washed with PBS (-), and then blocked solution (5%). Blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour using deactivated horse serum (GIBCO) and PBS (-) containing 0.05% Triton-X100. Then anti-rhodopsin mouse monoclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, Clone RET-P1 / Sigma-Aldrich), anti-L / M opsin rabbit polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, AB5405 / Sigma-Aldrich) and anti-S-opsin goat.
  • a primary antibody reaction was carried out at 4 ° C. for 24 hours a day using a polyclonal IgG antibody (1: 500 diluted, sc-14363 / Santa Cruz). After the primary antibody reaction, wash with PBS (-), then Alexa488-labeled anti-mouse IgG donkey polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, Thermo Fisher Scientific), Alexa546-labeled anti-rabbit IgG donkey polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted).
  • Thermo Fisher Scientific Alexa647-labeled anti-goat IgG donkey polyclonal IgG antibody (1: 1000 diluted, Thermo Fisher Scientific) and DAPI (final concentration 1 ⁇ g / mL, Thermo Fisher Scientific) at room temperature for 2 hours. gone.
  • the cells were washed with PBS (-) and then encapsulated with a PermaFluor aqueous encapsulant (Thermo Fisher Scientific). After air-drying, fluorescence microscopy was performed using a laser confocal microscope LSM700 (Zeiss).
  • pyramidal photoreceptor cell marker S-opsin-positive cells, L / M-opsin-positive cells, or rod photoreceptor marker rhodopsin-positive cells were found in the outermost layer of the aggregate (Fig. 9).
  • Example 4 Human iPS cell line 1231A3 (CiRA) seeded on a 6-well plate coated with iMatrix-511 (Nippi) at a cell density of 5,000 cells per well was cultured in StemFit AK02N medium (Ajinomoto) for 10 days, and then the medium was used.
  • CiRA Human iPS cell line 1231A3
  • Nippi iMatrix-511
  • Differentiation Medium (10% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM Non-essential Amino Acid (GIBCO), 1 mM Sodium Pyruvate, 100 U / mL Penicilin, 100 mg / mL streptomycin and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol (Sigma-Aldrich) ) was replaced with a GMEM medium (Thermo Fisher Scientific)), and differentiation induction was started.
  • GEBCO Non-essential Amino Acid
  • GMEM medium Thermo Fisher Scientific
  • SB431542 final concentration 5 ⁇ M, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • LDN193189 hydorochrolide final concentration 100 nM, Sigma-Aldrich
  • BMP4 final concentration 3 nM, R & D systems
  • the layer corresponding to the outer neuroblastoma layer observed at the time of development of the living body corresponds to the outer nuclear layer in the living body, and the layer corresponding to the inner nuclear layer is the outer plexiform layer. It was thought that it showed the appearance of being separated by a layer corresponding to.
  • granular structures and microvilli-like structures, which are thought to be inner segments of photoreceptor cells, have begun to be confirmed on the surface of the aggregates.
  • the retinal organoid was fixed with 3% paraformaldehyde / 7.5% sucrose solution and embedded with O.C.T.Compound (Sakura Finetech).
  • the frozen block was sliced using a cryomicrotome to prepare 10 ⁇ m frozen sections.
  • the prepared frozen sections were activated by heat treatment in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0), washed with PBS (-), and then blocked solution (5% deactivated horse serum (GIBCO), 0.05. Blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour using PBS (-) containing% Triton-X100.
  • Thermo Fisher Scientific and DAPI (final concentration 1 ⁇ g / mL, Thermo Fisher Scientific) were used to carry out a secondary antibody reaction at room temperature for 2 hours. After completion of the secondary antibody reaction, the cells were washed with PBS (-) and then encapsulated with a PermaFluor aqueous encapsulant (Thermo Fisher Scientific). After air-drying, fluorescence microscopy was performed using an inverted fluorescence microscope DMi8 (Leica). A large number of rhodopsin-positive cells and L / M opsin-positive cells were found in the outermost layer of the retinal organoid 90 days after the start of differentiation induction (Fig. 12).

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Abstract

本発明は、短期間に網膜前駆細胞を含む凝集体または多能性幹細胞から視細胞を含む層状の網膜組織を製造する方法を提供する。

Description

視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法
　本発明は、網膜前駆細胞を含む凝集体または多能性幹細胞から、視細胞を含む層状の網膜組織を促成製造する方法に関するものである。
　多能性幹細胞から網膜組織等の神経組織(neural tissue)を製造する方法として、均一な多能性幹細胞の凝集体を無血清培地中で形成させ、これを浮遊培養した後、分化誘導用の培地中、適宜分化誘導因子等の存在下で浮遊培養し、多能性幹細胞から目的とする神経系細胞（neural cells）へ分化誘導をすることにより、神経組織を製造する方法が報告されている。例えば、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（特許文献１）、多能性幹細胞を、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質および／またはソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに未分化維持因子を含む培地で接着培養し、得られた細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で浮遊培養し、得られた凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地で浮遊培養することにより、網膜系細胞または網膜組織を含む凝集体を得る方法（特許文献２）、網膜組織を含む細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含む培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するまで培養した後、得られたRPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含まない培地中で培養することにより、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を得る方法（特許文献３）、網膜組織を含む細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含む培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するまで培養した後、得られたRPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含まない培地中で培養することにより、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を得る方法（特許文献４）、多能性幹細胞を、未分化維持因子を含む培地で培養し、得られた多能性幹細胞を、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地で浮遊培養することにより、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る方法（特許文献５）などが知られている。また、神経組織までは得られていないが、多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させ、形成された凝集体を、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、網膜前駆細胞を得る方法（特許文献６）、多能性幹細胞を浮遊培養して網膜前駆体細胞に分化誘導し、得られた網膜前駆体細胞を浮遊培養して網膜神経節細胞に分化誘導し、得られた網膜神経節細胞を接着培養して軸索を伸長させることにより、軸索が伸長した網膜神経節細胞を得る方法（特許文献７）などが知られている。
　また、多能性幹細胞から神経組織を製造するための周知技術として、例えば、外胚葉由来の各種眼組織細胞を同心円状に得る分化誘導方法（SEAM法）（非特許文献１）、二次元培養から分化誘導を開始する網膜オルガノイドの分化誘導方法（非特許文献２）が知られている。他にも、BMPシグナルとTGFβファミリーシグナルのdual inhibitionによって、ヒトES細胞およびiPS細胞から神経前駆細胞への誘導が効率的に行われること（非特許文献３）、ヒト多能性幹細胞をBMP4を含む培地中で浮遊培養することによって神経網膜細胞への分化が誘導されること（非特許文献４）、ヒト多能性幹細胞の凝集体をBMP4を含む培地中で接着培養することによって網膜オルガノイドが誘導されること（非特許文献５）、哺乳類の網膜細胞において、ソニックヘッジホッグシグナルが桿体視細胞への分化に促進的に働くこと（非特許文献６）、レチノイン酸が視細胞への分化に促進的に働くこと（非特許文献７）、多能性幹細胞を神経細胞に分化誘導する過程において、Activinは網膜前駆細胞への分化を促進すること（非特許文献８）、ヒト多能性幹細胞由来の眼胞様組織から網膜色素上皮細胞への分化誘導がActivinによって促進されること（非特許文献９）なども併せて知られている。
　これら製造法によって網膜等の神経系細胞又は神経組織を製造することは可能となったが、組織として成熟するまでの期間が長期間におよぶ場合が多く、特に短期間でヒト多能性幹細胞から視細胞が含まれる層状の網膜オルガノイドを得ることは依然として困難なままであった。
国際公開第2013/077425号 国際公開第2017/183732号 国際公開第2013/183774号 国際公開第2015/087614号 国際公開第2016/063986号 国際公開第2015/025967号 国際公開第2016/021709号
Nature Protocols, 12, 683-696 (2017) PNAS, 111(23), 8518-8523 (2014) Nat. Biotechnol., 27(3), 275-280 (2009) Nature Communications 6, 6286 (2015) Development. 2019 Jan 1; 146(1): dev171686. J. Neurosci., 17(16), 6277-6288 (1997) Development, 120(8), 2091-2102 (1994) Stem Cell Report, 5(4), 532-545 (2015) Stem Cells., 29(8), 1206-1218 (2011)
　本発明が解決しようとする課題は、短期間に網膜前駆細胞を含む凝集体または多能性幹細胞から視細胞を含む層状の網膜組織を製造する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、接着培養工程として、未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養を行い、得られた細胞を未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養を行い、得られた細胞を未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、接着培養を行うことによって網膜前駆細胞を含む凝集体を得て、さらに、続く浮遊培養工程として、網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地中で浮遊培養を行い、得られた凝集体をActivinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することによって、短期間に多能性幹細胞から視細胞を含む層状の網膜組織を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］下記工程（1）～（2）を含む、視細胞を含む層状の網膜組織の製造方法；
(1)網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地中で浮遊培養し、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を得る工程、
(2)網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、視細胞を含む層状の網膜組織を得る工程。
［２］視細胞を含む層状の網膜組織が、外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層を含む網膜組織である、［１］に記載の方法。
［３］視細胞が外顆粒層に含まれる、［２］に記載の方法。
［４］外顆粒層に含まれる視細胞が、桿体視細胞および/または錐体視細胞である、［３］に記載の方法。
［５］外顆粒層に含まれる全細胞の50％以上が桿体視細胞および/または錐体視細胞である、［４］に記載の方法。
［６］網膜前駆細胞を含む凝集体が、網膜前駆細胞マーカーRx及びChx10を共発現する細胞層が形成された凝集体である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］Activinシグナル伝達経路作用物質が、Activin A、Activin B、Activin C、およびActivin ABからなる群から選択される1以上の物質である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］Activinシグナル伝達経路作用物質が、Activin Aである、［７］に記載の方法。
［９］ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、Sonic Hedgehog (Shh)、Smoothened Agonist (SAG)、およびPurmorphamine (PMA)からなる群から選択される1以上の物質である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、SAGである、［９］に記載の方法。
［１１］工程(1)において網膜前駆細胞を含む凝集体を0.5日間～50日間浮遊培養する、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体が、内層に網膜神経節細胞マーカーBrn3を発現し、最外層に視細胞前駆細胞マーカーCrxを発現する細胞層が形成された凝集体である、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］工程(2)において網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を20日間～320日間浮遊培養する、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］工程(1)以前に下記の工程をさらに含む、［１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法；
(a)未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養し、神経前駆細胞を得る工程、
(b)神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養し、網膜前駆細胞を得る工程、
(c)網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、接着培養を行い、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程。
［１５］多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、［１４］に記載の方法。
［１６］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、LY-364947、SB-505124、およびA-83-01からなる群から選択される1以上の物質である、［１４］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、SB431542である、［１７］に記載の方法。
［１９］BMPシグナル伝達経路阻害物質が、LDN193189、およびDorsomorphinからなる群から選択される1以上の物質である、［１４］～［１８］のいずれか１つに記載の方法。
［２０］BMPシグナル伝達経路阻害物質が、LDN193189である、［１９］に記載の方法。
［２１］工程(a)において多能性幹細胞を1時間～50時間接着培養する、［１４］～［２０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7、およびGDF7からなる群から選択される1以上の物質である、［１４］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、［２２］に記載の方法。
［２４］工程(b)において神経前駆細胞を0.5日間～4日間接着培養する、［１４］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］工程(c)において網膜前駆細胞を2日間～12日間接着培養する、［１４］～［２４］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］視細胞を含む、単離された層状の網膜組織であって、多能性幹細胞を分化誘導することによって製造される網膜組織。
［２７］視細胞を含む、単離された層状の網膜組織が、外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層を含む網膜組織である、［２６］に記載の組織。
［２８］視細胞が外顆粒層に含まれる、［２７］に記載の組織。
［２９］外顆粒層に含まれる視細胞が、桿体視細胞および/または錐体視細胞である、［２８］に記載の組織。
［３０］外顆粒層に含まれる全細胞の50％以上が桿体視細胞および/または錐体視細胞である、［２９］に記載の組織。
［３１］［２６］～［３０］のいずれか１つに記載の視細胞を含む層状の網膜組織を含有する、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬。
［３２］下記工程（11）～（13）を含む、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬のスクリーニング方法：
（11）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（12）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（13）工程（11）及び工程（12）において測定した結果の差異に基づき、工程（11）における被験物質を視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬として選択する工程。
［３３］下記工程（21）～（23）を含む、薬効評価方法：
（21）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（22）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（23）工程（21）及び工程（22）において測定した結果の差異に基づき、工程（21）における被験物質が有する薬効を評価する工程。
［３４］下記工程（31）～（33）を含む、毒性評価方法：
（31）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
（32）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
（33）工程（31）及び工程（32）において測定した結果の差異に基づき、工程（31）における被験物質が有する毒性を評価する工程。
　本発明によれば、網膜前駆細胞を含む凝集体または多能性幹細胞から、視細胞を含む層状の網膜組織を短期間に製造することが可能となる。
図１は、実施例１における細胞株201B7の培養スケジュールを示す。 図２は、細胞株201B7の分化開始5日後の凝集体における網膜前駆細胞マーカーRxの発現を示す。Bar=100 μm 図３は、細胞株201B7の分化開始10日後の凝集体における網膜前駆細胞マーカーRx及びCHX10の発現を示す。Bar=200 μm 図４は、実施例２における細胞株201B7の培養スケジュールを示す。 図５は、細胞株201B7の分化開始30日後の凝集体における視細胞前駆細胞マーカーCrx及び網膜神経節細胞マーカーBrn3の発現を示す。Bar=200 μm 図６は、細胞株M8の分化開始20日後の凝集体における視細胞前駆細胞マーカーCrx及び網膜神経節細胞マーカーBrn3の発現を示す。Neuroblastic layer:神経芽細胞層　Bar=50 μm 図７は、細胞株M8の分化開始40日後の凝集体における視細胞前駆細胞マーカーCrx及び網膜神経節細胞マーカーBrn3の発現を示す。Outer neuroblastic layer:外神経芽細胞層　Inner neuroblastic layer:内神経芽細胞層　 Ganglion cell tlayer:神経節細胞層　Bar=50 μm 図８は、細胞株M8の分化開始60日後の凝集体における錐体視細胞マーカーRXRγ及び桿体視細胞マーカーNRLの発現を示す。（外神経芽細胞層の）Outer nuclear layer (ONL):外顆粒層　（外神経芽細胞層の）Inner nuclear layer (INL):内顆粒層　Bar=50 μm 図９は、細胞株M8の分化開始80日後の凝集体における錐体視細胞マーカーS-オプシン、L/M-オプシン及び桿体視細胞マーカーロドプシンの発現を示す。（外神経芽細胞層の）Outer nuclear layer (ONL):外顆粒層　（外神経芽細胞層の）Inner nuclear layer (INL):内顆粒層　Bar=50 μm 図１０は、実施例４における細胞株1231A3の培養スケジュールを示す。 図１１は、実施例４における細胞株1231A3の分化誘導開始15日後、20日後、40日後、60日後、80日後および90日後の凝集体の顕微鏡像を示す。 図１２は、実施例４の分化誘導方法で作製された分化90日後のヒト網膜オルガノイドにおけるロドプシン及びL/Mオプシン発現を示す。Bar=100 μm
１．視細胞を含む層状の網膜組織の製造方法
　本発明は、視細胞を含む層状の網膜組織の製造方法（以下、本発明の製造方法1）を提供する。
　本明細書において組織とは、形態や性質が均一な一種類の細胞、又は、形態や性質が異なる複数種類の細胞によって構成される細胞層が、一定のパターンで層状に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。従って、本発明の製造方法1において製造される層状の網膜組織（以下、本発明の網膜組織）は、生体網膜における各網膜層または各網膜層に相当する層が層状に配置された組織であって、各網膜層または各網膜層に相当する層が形態や性質が均一な一種類の網膜系細胞、又は、形態や性質が異なる複数種類の網膜系細胞によって構成される、組織を意味する。
　本明細書において網膜層とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。本発明の網膜層はまた、網膜を構成する上記の各層に相当する層であってもよい。ここで相当するとは、通常生体内で正常に分化した網膜を構成する各層と同一または実質的に同一の特徴を有することをいう。網膜を構成する各網膜層の特徴としては、各網膜層に含まれる網膜系細胞の種類、網膜における各層の発生順序などが挙げられる。また、実質的に同一とは、各網膜層に含まれる網膜系細胞の種類が同じであれば、その数の多寡は問わないことをいう。本発明の網膜組織を構成する網膜層（以下、本発明の網膜層）は、上記の網膜層であれば特に制限されるわけではなく、上記の1種類または2種類以上の各網膜層によって構成されていてよい。本発明の網膜組織は、好ましくは、外顆粒層、内顆粒層、神経節細胞層の特性を示す網膜組織である。あるいは、本発明の網膜組織は、好ましくは、外顆粒層に相当する層、内顆粒層に相当する層、神経節細胞層に相当する層を含む網膜組織である。
　本明細書において網膜系細胞とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞またはその前駆細胞を意味し、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞、網膜色素上皮細胞（RPE）、毛様体周縁部細胞、これらの前駆細胞などの細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書において網膜前駆細胞とは、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟な網膜層特異的神経細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　本明細書において網膜層特異的神経細胞とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、桿体視細胞及び錐体視細胞を挙げることができる。
　本発明の網膜層を構成する網膜系細胞は、上記の網膜系細胞であれば特に制限されるわけではなく、上記の1種類または2種類以上の各網膜系細胞によって構成されていてよい。本発明の網膜層を構成する網膜系細胞としては、例えば、網膜色素上皮層を構成する網膜色素上皮細胞（RPE）、外顆粒層を構成する視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、内顆粒層を構成する水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞、神経節細胞層を構成する網膜神経節細胞（神経節細胞）などが挙げられる。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば網膜系細胞マーカーの発現の有無若しくはその程度等により確認できる。
　網膜系細胞マーカーとしては、神経前駆細胞で発現するRx（Raxとも言う）、網膜前駆細胞で発現するRx、PAX6及びChx10、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSox1、視細胞の前駆細胞で発現するCrx、Blimp1などが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するChx10、PKCα及びL7、網膜神経節細胞で発現するTuJ1及びBrn3、アマクリン細胞で発現するCalretinin、水平細胞で発現するCalbindin、成熟視細胞で発現するRhodopsin及びRecoverin、桿体視細胞で発現するNrl及びRhodopsin、錐体視細胞で発現するRxr-gamma、S-Opsin及びM/L-Opsin、網膜色素上皮細胞で発現するRPE65及びMitf、毛様体周縁部細胞で発現するRdh10及びSSEA1などが挙げられる。
　本発明の網膜組織は、視細胞を含むことを特徴とする。本発明の網膜組織に含まれる視細胞は、網膜組織を構成する1種類または2種類以上の各網膜層に含まれていれば特に制限されないが、上記の通り、外顆粒層に含まれていることが好ましい。また、本発明の網膜組織に含まれる視細胞が外顆粒層に含まれている場合、外顆粒層に含まれる視細胞は、桿体視細胞および/または錐体視細胞であってよい。外顆粒層に含まれる桿体視細胞と錐体視細胞の比率は、100％：0％～0％：100％の範囲であれば特に制限されず、通常、10％：90％～90％：10％、好ましくは、30％：70％～70％：30％、より好ましくは、45％：55％～55％：45％である。桿体視細胞と錐体視細胞の比率は、公知の方法、例えば桿体視細胞マーカーと錐体視細胞マーカーの発現の有無若しくはその程度等により確認できる。
　外顆粒層に含まれる桿体視細胞および/または錐体視細胞の割合は、特に制限されるものではないが、外顆粒層に含まれる全細胞のうち、桿体視細胞および錐体視細胞の総細胞数が、通常、50％以上、好ましくは、70％以上、より好ましくは80％以上、最も好ましくは、90％以上である。外顆粒層に含まれる全細胞のうち、桿体視細胞および錐体視細胞の総細胞数が多いほど、本発明の網膜組織が成熟していると判断することができる。
　本発明の製造方法1は、以下の工程を含む。
(1)網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地中で浮遊培養し、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を得る工程。
(2) 網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、視細胞を含む層状の網膜組織を得る工程。
　工程（1）においては、網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地中で浮遊培養する。
　本明細書において網膜前駆細胞を含む凝集体とは、網膜前駆細胞マーカーRx、PAX6及びChx10からなる群から選択される少なくとも１つを発現する細胞層が形成された凝集体であれば特に制限されず、後述する通り、多能性幹細胞の接着培養によって得られた網膜前駆細胞を含む凝集体であってもよいし、別の製造方法によって得られた網膜前駆細胞を含む凝集体であってもよい。例えば、Elizabeth E. Capowski1 et al., Development. 2019 Jan 1; 146(1): dev171686、国際公開第2015/025967号に開示された方法によって作製された網膜前駆細胞を含む凝集体を本発明の製造方法1の工程(1)において使用してもよい。
　工程（1）において使用される網膜前駆細胞を含む凝集体は均一であることが好ましい。凝集体が均一とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75％以上の凝集体が、当該凝集体の集団における最大径の平均値±100％、好ましくは平均値±50％の範囲内、より好ましくは平均値±20％の範囲内であることを意味する。
　工程（1）において、網膜前駆細胞を含む凝集体は浮遊培養される。本明細書において浮遊培養または浮遊培養法とは、細胞または細胞の凝集体が培地に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせない条件での培養をいう。
　浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
　細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、浮遊培養が可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、三角フラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
　浮遊培養において用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。浮遊培養において用いられる培地は、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよいが、凝集体に含まれる網膜前駆細胞は既に分化方向性が定まっているため、網膜前駆細胞のさらなる成熟と増殖を促進するために血清含有培地を用いることが好ましい。
　本明細書において血清含有培地とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　調製の煩雑さを回避するために、かかる血清含有培地として、10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific）を使用してもよい。
　一態様として、本明細書において培養は、好ましくはゼノフリー条件で行ってもよい。ゼノフリーとは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
　工程（1）において網膜前駆細胞を含む凝集体を浮遊培養するために用いられる培地は、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む。従来法では、網膜組織を作製する上で、多能性幹細胞を網膜前駆細胞に分化させた時点で分化誘導因子を含む培地中での培養は一般的ではなく、分化誘導因子を含まない培地中で培養する方法が通常であった。しかし、本工程（1）において、網膜前駆細胞を含む凝集体をさらにActivinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地で浮遊培養することによって、網膜前駆細胞の分化を促進し、さらに増殖させることが可能である。特に、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の3種を同時に含む培地で網膜前駆細胞を含む凝集体を培養する工程は全く知られていなかった。
　本明細書において、Activinシグナル伝達経路作用物質とは、Activinにより媒介されるシグナルを増強し得る物質である。Activinシグナル伝達経路作用物質としては、Activinシグナル伝達経路を増強することによって、多能性幹細胞を網膜前駆細胞へ分化誘導することができる限り特に制限されないが、例えば、Activinファミリーに属するタンパク質（例えば、Activin A、Activin B、Activin C、Activin ABなど）、Activin受容体アゴニストが挙げられる。Activinシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Activinシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはActivin Aである。
　本明細書において、ソニックヘッジホッグシグナル（以下、Shhと記すことがある。）伝達経路作用物質とは、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、Shhシグナル伝達経路を増強することによって、桿体視細胞への分化に促進的に働くことができる限り特に制限されないが、例えば、Hedgehogファミリーに属するタンパク質（例えば、Shh（特にSonic Headgehog N-terminus (Shh N末端)やIhh）、Shh受容体アゴニスト、PMA（Purmorphamine; 9-シクロヘキシル-N-[4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-(1-ナグタレニルオキシ)-9H-プリン-6-アミン）、又はSAG（Smoothened Agonist； N-メチル-N'-(3-ピリジニルベンジル)-N'-(3-クロロベンゾ[b]チオフェン-2-カルボニル)-1,4-ジアミノシクロヘキサン）等が挙げられる。Shhシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Shhシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSAG、Shh N末端である。
　本明細書において、レチノイン酸は、視細胞への分化に促進的に働く。
　Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、Activin Aは、通常、0.01～1000 ng/mL、好ましくは0.1～750 ng/mL、より好ましくは1～500 ng/mL（例えば、100 ng/mL）の濃度で使用される。SAGは、通常、1～2000 nM、好ましくは10～700 nM、より好ましくは30～600 nM（例えば、100 nM）の濃度で使用される。Shh N末端は、通常、0.1～300 μg/mL、好ましくは1～100μg/mL、より好ましくは3～60 μg/mL（例えば、10 μg/mL）の濃度で使用される。レチノイン酸は、通常、0.01～100 μM、好ましくは0.1～10 μM、より好ましくは0.5～5 μM（例えば、1 μM）の濃度で使用される。一態様において、Activinシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のActivin Aと同等のActivinシグナル伝達促進活性を有する量で適宜使用することができる。また、一態様において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のSAG、Shh N末端と同等のShhシグナル伝達促進活性を有する量で適宜使用することができる。
　工程（1）における網膜前駆細胞を含む凝集体の培養時間は、工程（1）によって得られる凝集体が、内層に網膜神経節細胞マーカーBrn3を発現し、最外層に視細胞前駆細胞マーカーCrxを発現する細胞層が形成された凝集体であれば特に限定されないが、通常0.5～50日間である。工程（1）における網膜前駆細胞を含む凝集体の培養時間は、好ましくは1日以上、5日以上、10日以上、15日以上、又は20日以上である。工程（1）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは45日以内、又は40日以内である。一態様において、工程（1）における網膜前駆細胞を含む凝集体の培養時間の範囲は、好ましくは1～45日間、15～45日間、又は20～40日間（最も好ましくは、30日間）である。即ち、工程（1）において網膜前駆細胞を含む凝集体が0.5～50日間（好ましくは1～45日間、15～45日間、又は20～40日間（最も好ましくは、30日間））浮遊培養された後、引き続き工程（2）が行われる。
　一態様として、工程(1)において、網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activin A(終濃度100 ng/mL)、SAG（終濃度100 nM）およびレチノイン酸（終濃度1μM）を含む培地中で30日間浮遊培養を行うことができる。
　工程（1）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　工程（2）においては、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、視細胞を含む層状の網膜組織を得る。
　工程（2）において、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体は浮遊培養される。ここで、浮遊培養法、浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、工程(1)において使用されたものと同一であってよい。
　工程（2）において用いられる基礎培地としては、特に限定はなく、工程(1)で記載した基礎培地を適宜選択することができる。工程（2）において用いられる培地は、工程(1)と同様に、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよいが、凝集体に含まれる網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞は既に分化方向性が定まっているため、これらの細胞のさらなる成熟と増殖を促進するために血清含有培地を用いることが好ましい。調製の煩雑さを回避するために、かかる血清含有培地として、工程(1)と同様に、10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific）を使用してもよい。
　工程（2）において網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を浮遊培養するために用いられる培地は、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。工程(1)で記載の通り、従来法では、網膜組織を作製する上で、多能性幹細胞が網膜前駆細胞に分化した以降は、分化誘導因子を含まない培地中で培養する方法が通常であった。しかし、本工程（2）において、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体をさらにActivinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で浮遊培養することによって、凝集体の最外層に含まれる視細胞前駆細胞の分化を促進し、さらに増殖させ、その結果、本発明の製造方法1の目的物である視細胞を含む層状の網膜組織を得ることが可能である。
　工程（2）における浮遊培養は、工程（1）の終了後に実施する限り、工程(1)から工程(2)への移行方法は特に制限されない。例えば、工程(1)から工程(2)への移行方法としては、工程（1）で用いた培地（すなわち、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地)から工程（2）で用いる培地（ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地）へ培地交換を行うことによって移行することができる。なお、培地交換は、工程（1）で用いた培地から工程（2）で用いる培地へ直接交換してもよいし、工程（1）で用いた培地から基礎培地への培地交換を経由し、工程（2）で用いる培地へ交換してもよい。
　工程（2）において、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体はActivinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で浮遊培養される。
　本明細書において、非存在下とは、特定の物質が培地に含有されていないことをいう。従って、例えば、Activinシグナル伝達経路作用物質の非存在下とは、Activinシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件、または、Activinシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない（例えば、Activin Aの濃度が 0.1 ng/mL以下）の条件が挙げられる。また、レチノイン酸の非存在下とは、Aレチノイン酸を添加していない条件、または、レチノイン酸を実質的に含まない（例えば、レチノイン酸の濃度が0.1 nM以下）の条件が挙げられる。
　工程（2）において、培地に含有されていないActivinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸、および培地に含有されるソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、工程（1）に記載したものと同一のものであってよい。
　ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SAGは、通常、1～2000 nM、好ましくは10～700 nM、より好ましくは30～600 nM（例えば、100 nM）の濃度で使用される。例えば、Shh N末端は、通常、0.1～300 μg/mL、好ましくは1～100μg/mL、より好ましくは3～60 μg/mL（例えば、10 μg/mL）の濃度で使用される。一態様において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を有する量で適宜使用することができる。
　工程（2）における凝集体の培養時間は、工程（2）によって得られる凝集体の最外層に錐体視細胞マーカー陽性細胞または桿体視細胞マーカー陽性細胞を認めることができる範囲であれば特に限定されないが、通常20～320日間である。工程（2）における網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体の培養時間は、好ましくは25日以上、30日以上、35日以上、又は40日以上である。工程（2）における網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体の培養時間は、好ましくは200日以内、100日以内、75日以内、又は60日以内である。一態様において、工程（2）における網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体の培養時間の範囲は、好ましくは25～200日間、30～100日間、35～75日間、又は40～60日間（最も好ましくは、50日間）である。
　一態様として、工程(2)において、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下、SAG（終濃度100 nM）を含む培地中で50日間浮遊培養を行うことによって、視細胞を含む層状の網膜組織を得ることができる。
　工程（2）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　工程（1）において浮遊培養される網膜前駆細胞を含む凝集体は、多能性幹細胞を以下の通りに接着培養することによって得ることができる。従って、本発明の製造方法1は、工程(1)以前に下記の工程をさらに含んでもよい。
(a)未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養し、神経前駆細胞を得る工程。
(b)神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養し、網膜前駆細胞を得る工程。
(c)網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、接着培養を行い、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程。
　工程（a）においては、未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養する。
　本明細書において、多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。
　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるRx::GFP株（KhES-1由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
　本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。
　本明細書における人工多能性幹細胞とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（1）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（2）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466)を挙げることが出来る。
　人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4), pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872；Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。
　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341, pp. 651-654）。
　また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞、Ff-I14細胞及びQHJI01s04細胞が、京都大学より入手可能である。
　人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球(PBMC)やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子の発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、細胞質型RNAベクターであるセンダイウイルスベクター）を用いた感染法、非ウイルスベクターであるプラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、又は、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）等が挙げられる。
　人工多能性幹細胞は、フィーダー細胞存在下またはフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地、すなわち未分化維持因子を含む培地(未分化維持培地)としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地や、フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地として当業者に周知の培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための未分化維持培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8（Life Technologies社製）培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/l), sodium selenite(14 μg/1), insulin(19.4mg /l), NaHCO3(543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1(2 ng/mL) またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。他の市販のフィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、例えば、Essential 6培地（Life Technologies社製）、Stabilized Essential 8培地（Life Technologies社製）、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro(Life Technologies社製)、hESF9（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、TeSR培地(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、StemFit（登録商標）（味の素社製）が挙げられる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダー細胞非存在下で体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMycの4因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。
　本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）又はヒト胚性幹細胞（ES細胞）である。
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい態様において、本発明の製造方法1において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の視細胞を含む層状の網膜組織を製造し、これが当該レシピエントに移植される。
　また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、HLA型やMHC型が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から本発明の製造方法1によって視細胞を含む層状の網膜組織を製造し、当該レシピエントに移植してもよい。
　工程（a）において、多能性幹細胞は接着培養される。本明細書において接着培養または接着培養法とは、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させる条件で培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち接着培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させる条件で行われ、浮遊培養は接着培養の範疇に含まれない。より詳細には、接着培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間
結合を作らせる条件での培養をいう。
　接着培養を行う際に用いられる培養器は、接着培養が可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8、iMatrix-511（ニッピ社）等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。
　接着培養において用いられる培地は、浮遊培養と同様に、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。接着培養において用いられる培地は、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよいが、多能性幹細胞を網膜前駆細胞を含む凝集体に分化させるために必要な分化誘導因子を限定するために、血清不含培地を用いることが好ましい。
　本明細書において血清不含培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り血清不含培地に含まれる。
　血清不含培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製；現Thermo Fisher：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2サプリメント（Life Technologies社製）、ITSサプリメント（Life Technologies社製）が挙げられる。
　接着培養で用いる血清不含培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　調製の煩雑さを回避するために、かかる血清不含培地として、10% KnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM Non-essential Amino Acid(GIBCO)、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/mL Penicilin, 100 mg/mL streptomycinおよび450 μM 1-monothioglycerol（Sigma-Aldrich）を含むGMEM培地（Thermo Fisher Scientific）を使用してもよい。
　工程（a）において多能性幹細胞を接着培養するために用いられる培地は、未分化維持因子の非存在下において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む。従来法では、未分化維持因子の存在下において多能性幹細胞を接着培養することによって多能性幹細胞の凝集体を作製し、該凝集体を未分化維持因子の非存在下で分化培養することによって網膜組織を作製することが一般的な方法であった。しかし、本工程（a）は、未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で接着培養することによって、多能性幹細胞の凝集体を経ずに直接多能性幹細胞から神経前駆細胞へ分化させることを目的とする。
　工程（a）において未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（Primed pluripotent stem cells）（例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞）の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、bFGF、FGF4やFGF8）が挙げられる。また、TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。
　工程（a）において未分化維持因子の非存在下とは、未分化維持因子が培地に含有されていないことをいう。従って、未分化維持因子の非存在下とは、未分化維持因子を添加していない条件、または、未分化維持因子を実質的に含まない（例えば、未分化維持因子の濃度が10 pg/mL以下）の条件が挙げられる。
　本明細書において、TGFβシグナル伝達経路とは、TGFβをリガンドとし、細胞内でSmadファミリーにより伝達される、シグナル伝達経路である。従って、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表す。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等）を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Lefty等が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等が挙げられる。ここでSB431542（4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド）及びA-83-01（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）は、TGFβ受容体(ALK5)及びActivin受容体(ALK4/7)の阻害剤（すなわちTGFβR阻害剤）として公知の化合物である。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはSB431542又はA-83-01である。
　BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、BMPに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでBMPとしては、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7が挙げられる。当該物質として例えば、BMPに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、BMP受容体（BMPR）とBMPの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMPRとして、ALK2又はALK3を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、LDN193189、Dorsomorphin等が挙げられる。ここでLDN193189（4-[6-(4-ピペラジン-1-イルフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）は、公知のBMPR(ALK2/3)阻害剤（以下、BMPR阻害剤）であり、通常は塩酸塩の形態で市販されている。また、BMPシグナル伝達経路阻害物質として知られるタンパク質（Chordin、Noggin等）を使用してもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはLDN193189である。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質およびBMPシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SB431542は、通常、0.025～1000 μM、好ましくは0.1～250 μM、より好ましくは0.5～50 μM（例えば、5 μM）の濃度で使用される。Leftyは、通常、0.1～3000 ng/mL、好ましくは1～1000 ng/mL 、より好ましくは10～300 ng/mL（例えば、100 ng/mL）の濃度で使用される。LY-364947は、通常、0.025～1000 μM、好ましくは0.1～250 μM、より好ましくは0.5～50 μM（例えば、10 μM）の濃度で使用される。SB505124は、通常、0.025～1000 μM、好ましくは0.1～250 μM、より好ましくは0.5～50 μM（例えば、5 μM）の濃度で使用される。A-83-01は、通常、0.001～300 μM、好ましくは0.01～30 μM、より好ましくは0.1～3 μM（例えば、0.5 μM）の濃度で使用される。LDN193189は、通常、1～2000 nM、好ましくは10～700 nM、より好ましくは30～600 nM（例えば、100 nM）の濃度で使用される。Dorsomorphinは、通常、0.01～1000 μM、好ましくは0.1～100 μM、より好ましくは1～10 μM（例えば、3 μM）の濃度で使用される。一態様において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達阻害活性を有する量で適宜使用することができる。また、一態様において、BMPシグナル伝達経路阻害物質は、前記濃度のLDN193189と同等のBMPシグナル伝達阻害活性を有する量で適宜使用することができる。
　工程（a）における多能性幹細胞の培養時間は、工程（a）によって得られる細胞が、神経前駆細胞マーカーRxを発現する細胞である限り特に限定されないが、通常1～120時間である。工程（a）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは5時間以上、10時間以上、15時間以上、又は20時間以上である。工程（a）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは100時間以内、80時間以内、60時間以内、又は50時間以内である。一態様において、工程（a）における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは5～100時間、10～80時間、15～60時間、又は20～50時間（最も好ましくは、24時間）である。即ち、工程（a）において多能性幹細胞が1～50時間（好ましくは5～100時間、10～80時間、15～60時間、又は20～50時間（最も好ましくは、24時間））接着培養された後、引き続き工程（b）が行われる。
　一態様として、工程(a)において、多能性幹細胞を、SB431542 (終濃度5 μM)およびLDN193189（終濃度100 nM）を含む培地中で24時間接着培養を行うことができる。
　工程（a）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　工程（b）においては、神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養する。
　工程（b）において、神経前駆細胞は接着培養される。ここで、接着培養法、接着培養を行う際に用いられる培養器は、工程(a)において使用されたものと同一であってよい。
　工程（b）において用いられる基礎培地としては、特に限定はなく、工程(a)で記載した基礎培地を適宜選択することができる。工程（b）において用いられる培地は、工程(a)と同様に、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよいが、神経前駆細胞を網膜前駆細胞に分化させるために必要な分化誘導因子を限定するために、血清不含培地を用いることが好ましい。調製の煩雑さを回避するために、かかる血清不含培地として、工程(a)と同様に、10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific）を使用してもよい。
　工程（b）において神経前駆細胞を接着培養するために用いられる培地は、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む。従来法では、ヒト多能性幹細胞をBMP4を含む培地中で浮遊培養することによって網膜前駆細胞への分化が誘導されること、ヒト多能性幹細胞の凝集体をBMP4を含む培地中で接着培養することによって網膜前駆細胞への分化を誘導することが一般的な方法であった。しかし、本工程（b）において、多能性幹細胞から分化した神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地で接着培養することによって、網膜前駆細胞への分化を促進させることが可能である。
　工程（b）における接着培養は、工程（a）の終了後に実施する限り、工程(a)から工程(b)への移行方法は特に制限されない。例えば、工程(a)から工程(b)への移行方法としては、工程（a）で用いた培地（すなわち、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地)から工程（b）で用いる培地（BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地）へ培地交換を行うことによって移行することができる。なお、培地交換は、工程（a）で用いた培地から工程（b）で用いる培地へ直接交換してもよいし、工程（a）で用いた培地から基礎培地への培地交換を経由し、工程（b）で用いる培地へ交換してもよい。
　工程（b）において、神経前駆細胞は未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地で接着培養される。
　工程（b）において未分化維持因子の非存在下とは、工程（a）と同様の条件であってよい。また、TGFβシグナル伝達経路阻害物質の非存在下とは、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加していない条件、または、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を実質的に含まない（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度が10 nM以下）の条件が挙げられる。BMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下とは、BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加していない条件、または、BMPシグナル伝達経路阻害物質を実質的に含まない（例えば、BMPシグナル伝達経路阻害物質の濃度が100 pM以下）の条件が挙げられる。
　工程（b）において、培地に含有されていない未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質としては、工程（a）に記載したものと同一のものであってよい。
　本明細書において、BMPシグナル伝達経路作用物質とは、BMPにより媒介されるシグナルを増強し得る物質である。BMPシグナル伝達経路作用物質としては、BMPシグナル伝達経路を増強することによって、神経前駆細胞を網膜前駆細胞へ分化誘導することができる限り特に制限されないが、例えばBMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMPタンパク質、GDF7等のGDFタンパク質、抗BMP受容体抗体、又は、BMP部分ペプチドなどが挙げられる。BMPシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。BMP2タンパク質、BMP4タンパク質及びBMP7タンパク質は例えばR＆D Systemsから、GDF7タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはBMP4である。
　BMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、BMP4は、通常、0.02～500 nM、好ましくは0.1～100 nM、より好ましくは0.3～30 nM（例えば、3 nM）の濃度で使用される。一態様において、BMPシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のBMP4と同等のBMPシグナル伝達促進活性を有する量で適宜使用することができる。
　工程（b）における神経前駆細胞の培養時間は、工程(b)によって得られる細胞が、網膜前駆細胞マーカーRx、PAX6、Chx10からなる群から選択される少なくとも1つ以上を発現している細胞である限り特に限定されないが、通常0.5～６日間である。工程（b）における神経前駆細胞の培養時間は、好ましくは1日以上である。工程（b）における神経前駆細胞の培養時間は、好ましくは3日以内である。一態様において、工程（b）における神経前駆細胞の培養時間の範囲は、好ましくは1～3日間（最も好ましくは、2日間）である。
　一態様として、工程(b)において、神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下、BMP4（終濃度3 nM）を含む培地中で2日間接着培養を行うことによって、網膜前駆細胞を得ることができる。
　工程（b）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　工程（c）においては、網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、培地中で接着培養する。
　工程（c）において、網膜前駆細胞は接着培養される。ここで、接着培養法、接着培養を行う際に用いられる培養器は、工程(a)、(b)において使用されたものと同一であってよい。
　工程（c）において用いられる基礎培地としては、特に限定はなく、工程(a)、(b)で記載した基礎培地を適宜選択することができる。工程（c）において用いられる培地は、工程(a)と同様に、血清含有培地であっても、血清不含培地であってもよいが、網膜前駆細胞を網膜前駆細胞を含む凝集体に分化させるために必要な分化誘導因子を限定するために、血清不含培地を用いることが好ましい。調製の煩雑さを回避するために、かかる血清不含培地として、工程(a)、(b)と同様に、10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific）を使用してもよい。
　工程（c）において網膜前駆細胞を接着培養するために用いられる培地は、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質を含まない。従来法では、ヒト多能性幹細胞をBMP4を含む培地中で培養することによって神経網膜細胞へ分化させる際に、神経網膜細胞に分化するまでBMP4を含む培地中で培養し続けることが一般的な方法であった。しかし、本工程（c）において、網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質のみならず、BMPシグナル伝達経路作用物質も含まない培地で接着培養することによって、神経網膜細胞を含む凝集体への分化を促進させることが可能である。
　工程（c）における接着培養は、工程（b）の終了後に実施する限り、工程(b)から工程(c)への移行方法は特に制限されない。例えば、工程(b)から工程(c)への移行方法としては、工程（b）で用いた培地（すなわち、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地)から工程（c）で用いる培地へ培地交換を行うことによって移行することができる。
　工程（c）において、網膜前駆細胞は未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下、培地で接着培養される。
　工程（c）において未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下とは、工程（b）と同様の条件であってよい。BMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下とは、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件、または、BMPシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない（例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質の濃度が10 pg/mL以下）の条件が挙げられる。
　工程（c）において、培地に含有されていない未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質としては、工程（a）、(b)に記載したものと同一のものであってよい。
　工程（c）における網膜前駆細胞の培養時間は、工程（c）によって得られる網膜前駆細胞を含む凝集体が、網膜前駆細胞マーカーRx、PAX6及びChx10からなる群から選択される少なくとも1つ以上を発現する細胞層が形成された凝集体である限り特に限定されないが、通常2～27日間である。工程（c）における網膜前駆細胞の培養時間は、好ましくは3日以上、4日以上、5日以上、又は6日以上である。工程（c）における網膜前駆細胞の培養時間は、好ましくは25日以内、20日以内、15日以内、又は8日以内である。一態様において、工程（b）における網膜前駆細胞の培養時間の範囲は、好ましくは3～11日間、4～10日間、5～9日間、又は6～8日間（最も好ましくは、7日間）である。
　一態様として、工程(c)において、網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下、培地中で7日間接着培養を行うことによって、網膜前駆細胞を含む凝集体を得ることができる。
　工程（c）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
2．視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬
　視細胞を含む層状の網膜組織は、当該網膜組織の障害に基づく疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、視細胞を含む層状の網膜組織を含む、当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬（本発明の治療薬）を提供する。
　本発明の治療薬は、視細胞を含む層状の網膜組織の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。本発明の治療薬において、含まれる視細胞を含む層状の網膜組織は、本発明の製造方法1によって製造されたものであってもよい。
　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
　本発明の治療薬は、視細胞を含む層状の網膜組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
　当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、視細胞を含む層状の網膜組織を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態の患者に、視細胞を含む層状の網膜組織を移植し、障害を受けた網膜組織自体を補充することにより、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することが出来る。視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、眼科疾患である加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、錐体ジストロフィー、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離等が挙げられる。
3．視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング方法または薬効評価方法
　本発明の製造方法1により製造された、視細胞を含む層状の網膜組織は、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、薬効評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被験物質のスクリーニング用試薬または薬効評価用試薬とすることができる。例えば、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を作製し、このiPS細胞を用いて本発明の製造方法1により、視細胞を含む層状の網膜組織を製造する。該網膜組織は、その患者が患っている疾患の原因となる視細胞を含む層状の網膜組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の製造方法1により製造される視細胞を含む層状の網膜組織に被験物質を接触させ、該物質が該網膜組織に及ぼす影響を検定することを含む、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングまたは薬効評価方法を提供する。
　例えば、特定の障害（例、遺伝性の障害）を有する、視細胞を含む層状の網膜組織を、被験物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被験物質で処理した視細胞を含む層状の網膜組織における障害の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、その障害の程度を軽減した被験物質を、当該障害に基づく疾患の治療薬の候補物質として、選択することができる。例えば、視細胞を含む層状の網膜組織の生理活性(例えば、生存促進又は成熟化)をより向上させる被験物質を、医薬品の候補物質として探索することができる。あるいは、網膜疾患等の特定の障害を呈する遺伝子変異を有する体細胞から人工多能性幹細胞を調製し、当該細胞を本発明の製造方法1で分化誘導させて製造した視細胞を含む層状の網膜組織に被験物質を添加し、前記障害を呈するか否かを指標として当該障害の治療薬または予防薬として有効な被験物質の候補を探索することができる。
　例えば、本発明は、以下の工程（11）～（13）を含む、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
（11）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（12）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（13）工程（11）及び工程（12）において測定した結果の差異に基づき、工程（11）における被験物質を視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬として選択する工程。
　また、例えば、本発明は、以下の工程（21）～（23）を含む、薬効評価方法を提供する。
（21）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（22）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
（23）工程（21）及び工程（22）において測定した結果の差異に基づき、工程（21）における被験物質が有する薬効を評価する工程。
　ここで、視細胞を含む層状の網膜組織は、障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織であれば特に制限されず、本発明の製造方法1によって製造されたものであってもよい。また、被験物質の非存在下とは、被験物質の代わりに培地、被験物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、ポジティブコントロールとは、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に対する治療効果を有する既知化合物を意味する。障害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色（例えば細胞核染色）と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
　工程（23）において、被験物質を視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬として選択する方法または被験物質が有する薬効を評価する方法としては、例えば、工程（21）の測定値と工程（22）におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、工程（21）の細胞の障害の程度が改善される場合に当該被験物質を層状の網膜組織の障害の治療薬として選択できる、または当該被験物質が薬効を有すると判断できる。また、工程（21）の測定値と工程（22）におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、工程（21）の細胞の障害の程度が同等以上に軽減される場合に当該被験物質を層状の網膜組織の障害の治療薬として選択できる、または当該被験物質が薬効を有すると判断できる。
4．毒性評価方法
　毒性評価においては、視細胞を含む層状の網膜組織を、被験物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被験物質で処理した視細胞を含む層状の網膜組織における毒性の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、ネガティブコントロールと比較して、毒性を示した被験物質を、視細胞を含む層状の網膜組織に対する毒性を有する物質として判定することが出来る。
　例えば、本発明は、以下の工程（31）～（33）を含む、毒性評価方法を提供する。
（31）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
（32）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
（33）工程（31）及び工程（32）において測定した結果の差異に基づき、工程（31）における被験物質が有する毒性を評価する工程。
　ここで、視細胞を含む層状の網膜組織は、本発明の製造方法1によって製造されたものであってもよい。また、被験物質の非存在下とは、被験物質の代わりに培地、被験物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、ポジティブコントロールとは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色（例えば細胞核染色）と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
　工程（33）において、被験物質が有する毒性を評価する方法としては、例えば、工程（31）の測定値と工程（32）におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、工程（31）の細胞の傷害の程度が大きい場合に当該被験物質が毒性を有すると判断できる。また、工程（31）の測定値と工程（32）におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、工程（31）の細胞の傷害の程度が同等以上の場合に当該被験物質が毒性を有すると判断できる。
5．網膜前駆細胞を含む凝集体の製造方法
　本発明はまた、本発明の製造方法の工程（1）において浮遊培養される網膜前駆細胞を含む凝集体の製造方法（以下、本発明の製造方法2）を提供する。
　本発明の製造方法2は、下記の工程を含む。
(a)未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養し、神経前駆細胞を得る工程。
(b)神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養し、網膜前駆細胞を得る工程。
(c)網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、接着培養を行い、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程。
　本発明の製造方法2において、各工程(a)～(c)において使用される細胞、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、培養条件（培地、培養期間、培養温度など）等はすべて、本発明の製造方法1において使用される細胞等と同一であってよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例1
　iMatrix-511（ニッピ）をコーティングした6-ウェルプレートに1ウェル当たり5,000細胞の細胞密度で播種したヒトiPS細胞株201B7株（Ci）をStemFit AK02N培地（味の素）で8日間培養し、その後培地を分化培地（10% KnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM Non-essential Amino Acid(GIBCO)、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/mL Penicilin, 100 mg/mL streptomycinならびに 450μM 1-monothioglycerol（Sigma-Aldrich）を含むGMEM培地（Thermo Fisher Scientific））に置換し分化誘導を開始した。分化誘導開始から分化誘導1日後までの間はTGF-betaシグナル阻害剤であるSB431542（終濃度5μM、富士フイルム和光純薬）ならびにBMPシグナル阻害剤であるLDN193189 hydorochrolide（終濃度100 nM、Sigma-Aldrich）を分化培地に加えた。分化開始1日後から分化開始3日後まではBMP4（終濃度1.5 nM、R&D systems）を分化培地に添加した。分化開始3日後から分化開始10日後までは分化培地のみで培養を行った。培養スケジュールを図１に示す。分化開始5日後または10日後にiPS細胞コロニーの中心部であった部位に境界明瞭かつ高密度の細胞凝集体として光学顕微鏡下において確認できる網膜前駆細胞を含む凝集体が形成されたことを確認し、細胞を4% PFA（パラホルムアルデヒド）/PBSを用いて固定した。
　分化開始5日後の試料はブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行い、抗RxウサギポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、M228/Takara）を用いて、一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、Alexa546標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher ScientificおよびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、レーザー共焦点顕微鏡LSM700(Zeiss)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化開始5日後の凝集体において、神経前駆細胞マーカーRxを発現する細胞からなる細胞密度の高い領域の形成を認めた（図２）。
　分化開始10日後の試料はブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行い、抗Rx抗体および抗CHX10ヒツジポリクローナルIgG抗体(1:1000希釈、X1180P/Exalpha Biologicals)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、Alexa488標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ヤギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、倒立蛍光顕微鏡DMi8(ライカ)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化開始10日後の境界明瞭な凝集体において、外縁部に網膜前駆細胞マーカーRx及びCHX10を共発現する細胞層の形成を認めた（図３）。
実施例2
　iMatrix-511（ニッピ）をコーティングした6-ウェルプレートに1ウェル当たり5,000細胞の細胞密度で播種したヒトiPS細胞株201B7株をStemFit AK02N培地（味の素）で8日間培養し、その後培地を分化培地（10% KnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM Non-essential Amino Acid(GIBCO)、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/mL Penicilin, 100 mg/mL streptomycinならびに 450μM 1-monothioglycerol（Sigma-Aldrich）を含むGMEM培地（Thermo Fisher Scientific））に置換し分化誘導を開始した。分化誘導開始から分化誘導1日後までの間はTGF-betaシグナル阻害剤であるSB431542（終濃度5μM、富士フイルム和光純薬）ならびにBMPシグナル阻害剤であるLDN193189 hydorochrolide（終濃度100 nM、Sigma-Aldrich）を分化培地に加えた。分化開始1日後から分化開始3日後まではBMP4（終濃度1.5 nM、R&D systems）を分化培地に添加した。
　分化開始3日後から分化開始10日後までは分化培地のみで培養を行った。分化開始10日後にiPS細胞コロニーの中心部であった部位に境界明瞭かつ高密度の細胞凝集体として光学顕微鏡下において確認できる網膜前駆細胞を含む凝集体が形成されたことを確認し、スクレーパーを用いて当該凝集体を剥離した。剥離した凝集体は40 μmのセルストレイナーを用いて不要細胞を除去し、成熟培地（10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific））を用いて浮遊培養を開始した。分化誘導開始10日後から分化誘導30日後までは成熟培地に100 ng/mL Activin A（R&D systems、終濃度100 ng/mL）、ソニックヘッジホッグシグナル活性化剤SAG（Alexis Biochemicals、終濃度100 nM）およびレチノイン酸（富士フイルム和光純薬、終濃度1μM）を加えて培養した。培養スケジュールを図４に示す。分化誘導30日後に凝集体を回収し、3% PFA, 7.5% スクロース/PBS溶液を用いて固定し、O.C.T. Compound(サクラファインテック)を用いて包埋した。包埋後、凍結ブロックをクライオミクロトームを用いて薄切し、10 μm凍結切片を作製した。作製した凍結切片は10mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中で熱処理による賦活化処理を行い、PBS(-)を用いて洗浄した後、ブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行った。その後抗CrxウサギポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、M231/Takara）および抗Brn3ヤギポリクローナルIgG抗体(1:1000希釈、sc-6026/Santa Cruz)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、その後Alexa488標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ヤギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、その後PermaFluor水性封入剤（Thermo Fisher Scientific）を用いて封入した。風乾後、倒立蛍光顕微鏡DMi8(ライカ)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化誘導30日後の凝集体の内層に網膜神経節細胞マーカー陽性細胞を認め、視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞を散在的に認めた（図５）。
実施例3
　iMatrix-511（ニッピ）をコーティングした6-ウェルプレートに1ウェル当たり4,500細胞の細胞密度で播種したヒトiPS細胞株M8株(京都大学iPS細胞研究所「エピソーマルベクターを用いた末梢血からのiPS細胞樹立方法」に従い、発明者らが健常者末梢血単核球より樹立したiPS細胞)をStemFit AK02N培地（味の素）で8日間培養し、その後培地を分化培地（10% KnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM Non-essential Amino Acid(GIBCO)、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/mL Penicilin, 100 mg/mL streptomycinならびに 450μM 1-monothioglycerol（Sigma-Aldrich）を含むGMEM培地（Thermo Fisher Scientific））に置換し分化誘導を開始した。分化誘導開始から分化誘導1日後までの間はTGF-betaシグナル阻害剤であるSB431542（終濃度5μM、富士フイルム和光純薬）ならびにBMPシグナル阻害剤であるLDN193189 hydorochrolide（終濃度100 nM、Sigma-Aldrich）を分化培地に加えた。分化開始1日後から分化開始3日後まではBMP4（終濃度3 nM、R&D systems）を分化培地に添加した。
　分化開始3日後から分化開始10日後までは分化培地のみで培養を行った。分化開始10日後にiPS細胞コロニーの中心部であった部位に境界明瞭かつ高密度の細胞凝集体として光学顕微鏡下において確認できる網膜前駆細胞を含む凝集体が形成されたことを確認し、スクレーパーを用いて当該凝集体を剥離した。剥離した凝集体は40 μmのセルストレイナーを用いて不要細胞を除去し、成熟培地（10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific））を用いて浮遊培養を開始した。分化誘導開始10日後から分化誘導40日後までは成熟培地に100 ng/mL Activin A（R&D systems、終濃度100 ng/mL）、ソニックヘッジホッグシグナル活性化剤SAG（Alexis Biochemicals、終濃度100 nM）およびレチノイン酸（富士フイルム和光純薬、終濃度1μM）を加えて培養した。分化誘導40日後から分化誘導80日後まではソニックヘッジホッグシグナル活性化剤SAG（終濃度100 nM）を含む成熟培地で培養を行った。なお、培地添加剤の変更を伴う場合を除き、培地交換は2日に1回あるいは3日に1回の頻度で行った。
　分化誘導開始20日後、40日後、60日後および80日後に凝集体（網膜オルガノイド）を3%PFA, 7.5% スクロース/PBS溶液を用いて固定し、O.C.T. Compound(サクラファインテック)を用いて包埋した。包埋後、凍結ブロックをクライオミクロトームを用いて薄切し、10 μm凍結切片を作製した。
　分化誘導開始20日後および40日後の試料から作製した凍結切片は、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中で熱処理による賦活化処理を行い、PBS(-)を用いて洗浄した後、ブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行った。その後抗CrxウサギポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、M231/Takara）および抗Brn3ヤギポリクローナルIgG抗体(1:1000希釈、sc-6026/Santa Cruz)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、その後Alexa488標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ヤギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、その後PermaFluor水性封入剤（Thermo Fisher Scientific）を用いて封入した。風乾後、レーザー共焦点顕微鏡LSM700(Zeiss)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化誘導開始20日後の凝集体では、凝集体の内層に網膜神経節細胞マーカー陽性細胞を認め、外層に少数の視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞を認めた（図６）。また、分化誘導開始40日後の凝集体では、凝集体の内層に網膜神経節細胞マーカー陽性細胞を認め、外層に視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞を認めた。また、最外層に視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞の層形成を認めた（図７）。
　分化誘導60日後の試料から作製した凍結切片はブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行い、その後抗RxRγウサギポリクローナルIgG抗体（1:200希釈、sc-555/Santa Cruz）および抗NRLヤギポリクローナルIgG抗体(1:200希釈、AF2945/R&D systems)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、その後Alexa488標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ヤギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、その後PermaFluor水性封入剤（Thermo Fisher Scientific）を用いて封入した。風乾後、レーザー共焦点顕微鏡LSM700(Zeiss)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化誘導開始60日後の凝集体の最外層に錐体視細胞マーカーRXRγ陽性細胞あるいは桿体視細胞マーカーNRL陽性細胞を認めた（図８）。また、RXRγおよびNRL共陽性の細胞は認められなかった。
　分化誘導開始80日後の試料から作製した凍結切片は、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中で熱処理による賦活化処理を行い、PBS(-)を用いて洗浄した後、ブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行った。その後抗ロドプシンマウスモノクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Clone RET-P1/Sigma-Aldrich）、抗L/MオプシンウサギポリクローナルIgG抗体(1:1000希釈、AB5405/Sigma-Aldrich)および抗S-オプシンヤギポリクローナルIgG抗体(1:500希釈、sc-14363/Santa Cruz)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、その後Alexa488標識抗マウスIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa647標識抗ヤギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、その後PermaFluor水性封入剤（Thermo Fisher Scientific）を用いて封入した。風乾後、レーザー共焦点顕微鏡LSM700(Zeiss)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化誘導開始80日後の凝集体の最外層に錐体視細胞細胞マーカーS-オプシン陽性細胞、L/M-オプシン陽性細胞、あるいは桿体視細胞マーカーロドプシン陽性細胞を認めた（図９）。
実施例4
　iMatrix-511（ニッピ）をコーティングした6-ウェルプレートに1ウェル当たり5,000細胞の細胞密度で播種したヒトiPS細胞株1231A3株(CiRA)をStemFit AK02N培地（味の素）で10日間培養し、その後培地を分化培地（10% KnockOut Serum Replacement（Thermo Fisher Scientific）、0.1 mM Non-essential Amino Acid(GIBCO)、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/mL Penicilin, 100 mg/mL streptomycinならびに 450μM 1-monothioglycerol（Sigma-Aldrich）を含むGMEM培地（Thermo Fisher Scientific））に置換し分化誘導を開始した。分化誘導開始から分化誘導1日後までの間はTGF-betaシグナル阻害剤であるSB431542（終濃度5μM、富士フイルム和光純薬）ならびにBMPシグナル阻害剤であるLDN193189 hydorochrolide（終濃度100 nM、Sigma-Aldrich）を分化培地に加えた。分化開始1日後から分化開始3日後まではBMP4（終濃度3 nM、R&D systems）を分化培地に添加した。
　分化開始3日後から分化開始10日後までは分化培地のみで培養を行った。分化開始10日後にiPS細胞コロニーの中心部であった部位に境界明瞭かつ高密度の細胞凝集体として光学顕微鏡下において確認できる網膜前駆細胞を含む凝集体が形成されたことを確認し、スクレーパーを用いて当該凝集体を剥離した。剥離した凝集体は40 μmのセルストレイナーを用いて不要細胞を除去し、成熟培地（10％Fetal Bovine Serum（BioSera）、1 % N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)、1 x Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)、0.1 mM Taurine(Sigma-Aldrich)を含むDMEM/F-12, GlutaMax supplement培地（Thermo Fisher Scientific））を用いて浮遊培養を開始した。分化誘導開始10日後から分化誘導40日後までは成熟培地に100 ng/mL Activin A（R&D systems、終濃度100 ng/mL）、ソニックヘッジホッグシグナル活性化剤SAG（Alexis Biochemicals、終濃度100 nM）およびレチノイン酸（富士フイルム和光純薬、終濃度1μM）を加えて培養した。分化誘導40日後から分化誘導90日後まではソニックヘッジホッグシグナル活性化剤SAG（終濃度100 nM）を含む成熟培地で培養を行った。なお、培地添加剤の変更を伴う場合を除き、培地交換は2日に1回あるいは3日に1回の頻度で行った。培養スケジュールを図１０に示す。また、分化誘導開始15日後、20日後、40日後、60日後、80日後および90日後の凝集体の顕微鏡像を確認した（図１１）。誘導開始15日後、20日後には、凝集体は、細胞が高密度で含まれる高輝度の外層と網状に見える低輝度の内層で構成されていた。誘導開始40日後、凝集体は、全体的に輝度が下がり、一層で構成され、中空となっていた。誘導開始60日後、凝集体は、全体的に輝度が再度高まり、内側の境界が明瞭になっていた。誘導開始80日後か90日後、凝集体は、高輝度の最外層がさらに二つの層に分かれて見えた。これは、組織切片の検討を合わせ考えると生体の発生時に認められる外神経芽細胞層に相当する層が生体におけるところの外顆粒層に相当する層と内顆粒層に該当する層が外網状層に相当する層で隔てられている様子を示しているものと考えられた。また凝集体表面には視細胞内節と思われる粒状の構造や微絨毛様の構造が確認でき始めた。
　分化誘導90日後、網膜オルガノイドは3% パラホルムアルデヒド/7.5% スクロース溶液を用いて固定し、O.C.T. Compound(サクラファインテック)を用いて包埋した。包埋後、凍結ブロックをクライオミクロトームを用いて薄切し、10 μm凍結切片を作製した。作製した凍結切片は10mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中で熱処理による賦活化処理を行い、PBS(-)を用いて洗浄した後、ブロッキング溶液（5%非働化ウマ血清（GIBCO）、0.05% Triton-X100を含むPBS（-））を用いて室温、1時間のブロッキング処理を行った。その後抗ロドプシンマウスモノクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Clone RET-P1/Sigma-Aldrich）および抗L/MオプシンウサギポリクローナルIgG抗体(1:1000希釈、AB5405/Sigma-Aldrich)を用いて一次抗体反応を4℃、一昼夜行った。一次抗体反応後、PBS（-）を用いて洗浄し、その後Alexa488標識抗マウスIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）、Alexa546標識抗ウサギIgGロバポリクローナルIgG抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific）およびDAPI(終濃度1 μg/mL、Thermo Fisher Scientific)を用いて二次抗体反応を室温、2時間行った。二次抗体反応終了後、PBS(-)を用いて洗浄を行い、その後PermaFluor水性封入剤（Thermo Fisher Scientific）を用いて封入した。風乾後、倒立蛍光顕微鏡DMi8(ライカ)を用いて蛍光顕微鏡撮影を行った。分化誘導開始90日後の網膜オルガノイド最外層に多数のロドプシン陽性細胞およびL/Mオプシン陽性細胞を認めた（図１２）。
　発明によれば、網膜前駆細胞を含む凝集体または多能性幹細胞から、視細胞を含む層状の網膜組織を短期間に製造することが可能となる。本出願は、日本で出願された特願2020-215415（出願日：令和2年12月24日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (34)

  1. 　下記工程（1）～（2）を含む、視細胞を含む層状の網膜組織の製造方法；
    (1)網膜前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸を含む培地中で浮遊培養し、網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を得る工程、
    (2)網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を、Activinシグナル伝達経路作用物質およびレチノイン酸の非存在下において、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、視細胞を含む層状の網膜組織を得る工程。
  2. 　視細胞を含む層状の網膜組織が、外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層を含む網膜組織である、請求項１に記載の方法。
  3. 　視細胞が外顆粒層に含まれる、請求項２に記載の方法。
  4. 　外顆粒層に含まれる視細胞が、桿体視細胞および/または錐体視細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 　外顆粒層に含まれる全細胞の50％以上が桿体視細胞および/または錐体視細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 　網膜前駆細胞を含む凝集体が、網膜前駆細胞マーカーRx及びChx10を共発現する細胞層が形成された凝集体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　Activinシグナル伝達経路作用物質が、Activin A、Activin B、Activin C、およびActivin ABからなる群から選択される1以上の物質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　Activinシグナル伝達経路作用物質が、Activin Aである、請求項７に記載の方法。
  9. 　ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、Sonic Hedgehog (Shh)、Smoothened Agonist (SAG)、およびPurmorphamine (PMA)からなる群から選択される1以上の物質である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が、SAGである、請求項９に記載の方法。
  11. 　工程(1)において網膜前駆細胞を含む凝集体を0.5日間～50日間浮遊培養する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体が、内層に網膜神経節細胞マーカーBrn3を発現し、最外層に視細胞前駆細胞マーカーCrxを発現する細胞層が形成された凝集体である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　工程(2)において網膜神経節細胞および視細胞前駆細胞を含む凝集体を20日間～320日間浮遊培養する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　工程(1)以前に下記の工程をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法；
    (a)未分化維持因子の非存在下において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で接着培養し、神経前駆細胞を得る工程、
    (b)神経前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養し、網膜前駆細胞を得る工程、
    (c)網膜前駆細胞を、未分化維持因子、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMPシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質の非存在下において、接着培養を行い、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程。
  15. 　多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、LY-364947、SB-505124、およびA-83-01からなる群から選択される1以上の物質である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　TGFβシグナル伝達経路阻害物質が、SB431542である、請求項１７に記載の方法。
  19. 　BMPシグナル伝達経路阻害物質が、LDN193189、およびDorsomorphinからなる群から選択される1以上の物質である、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　BMPシグナル伝達経路阻害物質が、LDN193189である、請求項１９に記載の方法。
  21. 　工程(a)において多能性幹細胞を1時間～50時間接着培養する、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7、およびGDF7からなる群から選択される1以上の物質である、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、請求項２２に記載の方法。
  24. 　工程(b)において神経前駆細胞を0.5日間～6日間接着培養する、請求項１４～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　工程(c)において網膜前駆細胞を2日間～27日間接着培養する、請求項１４～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　視細胞を含む、単離された層状の網膜組織であって、多能性幹細胞を分化誘導することによって製造される網膜組織。
  27. 　視細胞を含む、単離された層状の網膜組織が、外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層を含む網膜組織である、請求項２６に記載の組織。
  28. 　視細胞が外顆粒層に含まれる、請求項２７に記載の組織。
  29. 　外顆粒層に含まれる視細胞が、桿体視細胞および/または錐体視細胞である、請求項２８に記載の組織。
  30. 　外顆粒層に含まれる全細胞の50％以上が桿体視細胞および/または錐体視細胞である、請求項２９に記載の組織。
  31. 　請求項２６～３０のいずれか１項に記載の視細胞を含む層状の網膜組織を含有する、視細胞を含む層状の網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬。
  32. 　下記工程（11）～（13）を含む、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬のスクリーニング方法：
    （11）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
    （12）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
    （13）工程（11）及び工程（12）において測定した結果の差異に基づき、工程（11）における被験物質を視細胞を含む層状の網膜組織の障害の治療薬として選択する工程。
  33. 　下記工程（21）～（23）を含む、薬効評価方法：
    （21）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
    （22）障害を有する視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の障害の程度を測定する工程、
    （23）工程（21）及び工程（22）において測定した結果の差異に基づき、工程（21）における被験物質が有する薬効を評価する工程。
  34. 　下記工程（31）～（33）を含む、毒性評価方法：
    （31）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
    （32）視細胞を含む層状の網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、視細胞を含む層状の網膜組織の傷害の程度を測定する工程、
    （33）工程（31）及び工程（32）において測定した結果の差異に基づき、工程（31）における被験物質が有する毒性を評価する工程。
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