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WO2022168417A1 - 分析方法 - Google Patents

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WO2022168417A1
WO2022168417A1 PCT/JP2021/044101 JP2021044101W WO2022168417A1 WO 2022168417 A1 WO2022168417 A1 WO 2022168417A1 JP 2021044101 W JP2021044101 W JP 2021044101W WO 2022168417 A1 WO2022168417 A1 WO 2022168417A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
eluate
humidity
analysis method
carrier
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/044101
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 金子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Priority to EP21924802.8A priority Critical patent/EP4290229A4/en
Priority to CN202180089543.3A priority patent/CN116745608A/zh
Priority to JP2022579359A priority patent/JP7439962B2/ja
Priority to US18/266,977 priority patent/US20240053357A1/en
Publication of WO2022168417A1 publication Critical patent/WO2022168417A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein

Definitions

  • the present invention relates to analysis methods.
  • a ⁇ -related peptides such as amyloid ⁇ (A ⁇ ) produced by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) are deeply involved in the onset of Alzheimer's disease.
  • a combination of immunoprecipitation and mass spectrometry was used to detect multiple A ⁇ -related peptides in the blood, and it was reported that the detected specific A ⁇ -related peptide ratio was promising as a blood biomarker for amyloid accumulation in the brain.
  • a method for measuring A ⁇ -related peptides in a blood sample includes, for example, a step of binding an antibody-immobilized carrier with a peptide in the sample, a step of washing these conjugates, and an acidic aqueous solution containing an organic solvent to remove the antibody.
  • a method comprising a step of dissociating a peptide from an immobilized carrier and a step of detecting the dissociated peptide by mass spectrometry has been disclosed (Patent Documents 1 and 2).
  • the measurement methods of Patent Documents 1 and 2 can detect peptides even when they are present in a sample in a very small amount.
  • the concentration (concentration) of the target substance in the eluate that is, The smaller the amount of eluate used, the stronger the signal intensity of the substance to be analyzed detected by mass spectrometry, thus enabling highly sensitive analysis.
  • the number of samples subjected to mass spectrometry that is, the number of mass spectrometry results (mass spectra) is preferably plural from the viewpoint of analysis accuracy.
  • the purpose of the present invention is to detect an analyte with high sensitivity and accuracy when performing analysis using mass spectrometry.
  • the analysis method of the first aspect of the present invention comprises a humidity measurement step of measuring humidity, a binding step of contacting a sample containing an analysis target substance with a carrier to bind the analysis target substance to the carrier, and an elution step of bringing an eluent containing a volatile organic solvent into contact with the carrier to which the analyte is bound, and eluting the analyte into the eluate; An arrangement step of arranging on a measurement plate for mass spectrometry and a detection step of detecting the substance to be analyzed by mass spectrometry. In the elution step, the amount of the eluate to be used is determined according to the humidity.
  • the analyte can be detected with high sensitivity and accuracy.
  • FIG. 1 shows mass spectra of A ⁇ -related peptides detected by a MALDI-TOF/MS apparatus under the first environment (humidity 58.0%).
  • FIG. 2 shows mass spectra of A ⁇ -related peptides detected by a MALDI-TOF/MS apparatus under the second environment (humidity 21.2%).
  • a polypeptide is used as the substance to be analyzed, a biological sample is used as the sample, and MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) is used as the mass spectrometry method.
  • MALDI Microx Assisted Laser Desorption/Ionization
  • the analysis method of the first aspect includes a humidity measurement step, a first binding step (an example of the “binding step” of the present invention), a first washing step, a first elution step, a neutralization step, and a It comprises 2 binding steps, a second washing step, a second elution step (an example of the “elution step” of the present invention), an arrangement step, and a detection step.
  • Polypeptide which is the object of analysis and measurement in the first aspect, also includes “peptide” and “protein”. Polypeptides include various ones, and specifically include A ⁇ -related peptides. A ⁇ -related peptides are A ⁇ produced by cleavage of amyloid precursor protein (APP) and peptides containing at least part of the sequence of A ⁇ . Specifically, it is shown in the examples and also disclosed in WO2015/178398.
  • APP amyloid precursor protein
  • Humidity is measured in the humidity measurement step. Specifically, the humidity in the analysis space (room) where the second elution step and placement step described below are performed is measured. Generally, these are performed in the same space, but if they are different, the humidity in each space is measured and divided proportionally by the time from immediately after the start of the second elution step until the eluate is placed on the measurement plate. It should be average humidity.
  • first binding step In the first binding step, the biological sample is brought into contact with the first carrier (an example of the "carrier” of the present invention).
  • the first carrier an example of the "carrier” of the present invention.
  • a biological sample is mixed with a first carrier.
  • the polypeptide binds to the first carrier to obtain the first conjugate.
  • biological samples include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid, urine, body secretions, saliva, and sputum; for example, feces.
  • Blood samples include whole blood, plasma, serum, and the like.
  • the blood sample may be whole blood collected from an individual that has been subjected to a treatment such as centrifugation or cryopreservation.
  • the biological sample is usually brought into contact with the first carrier while being mixed with the binding solution.
  • the binding solution used in normal immunoprecipitation can be used.
  • the binding solution includes a neutral buffer containing a surfactant. Non-specific adsorption can be suppressed by containing a surfactant.
  • the surfactant is preferably a neutral surfactant.
  • neutral surfactants include n-decyl- ⁇ -D-maltoside (DM: n-Decyl- ⁇ -D-maltoside), n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (DDM: n-Dodecyl- ⁇ -D-maltoside), n-nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside (NTM: n-Nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside), surfactants having maltose in the hydrophilic moiety; ⁇ -D-glucopyranosyl ⁇ -D -glucopyranoside monooctanoate (trehalose C8), ⁇ -D-glucopyranosyl ⁇ -D-glucopyranoside monododecanoate (trehalose C12), ⁇ -D-glucopyranosyl ⁇ -
  • buffers examples include Tris buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, and ammonium acetate buffer.
  • the pH of the buffer solution is, for example, 6.5 or more and 8.5 or less.
  • the surfactant concentration in the binding solution is, for example, 0.001% (w/v) or higher, preferably 0.05% (w/v) or higher, and for example, 10% (w/v). Below, preferably, it is 2% (w/v) or less.
  • the first carrier should be capable of binding a polypeptide, and examples thereof include antibody-immobilizing carriers.
  • the antibody immobilized on the first carrier may have an antigen-binding site capable of recognizing a polypeptide, and examples thereof include immunoglobulins having an antigen-binding site capable of recognizing a polypeptide or fragments thereof. .
  • immunoglobulins examples include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgY, IgD, and IgE.
  • the immunoglobulin is appropriately determined according to the substance to be analyzed, and a known immunoglobulin may be adopted.
  • immunoglobulin fragments include F(ab')2, F(ab'), F(ab), Fd, Fv, L chains, H chains, and the like.
  • an immunoglobulin having an antigen-binding site capable of recognizing the A ⁇ -related peptide or a fragment thereof is, for example, 6E10, 4G8, 1E11, 11A50-B10, 12F4 , 9C4, 82E1, 12B2, 1A10 and fragments thereof.
  • Antibodies may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • Examples of materials for the first carrier include agarose, sepharose, dextran, silica gel, polyacrylamide, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, (meth)acrylic acid-based polymer, fluororesin, metal complex resin, glass, and metal. , a magnetic material, and the like.
  • a magnetic material is preferable from the viewpoint that only the carrier can be easily extracted by magnetic force and the decrease in the eluate can be suppressed when the carrier is taken out.
  • the shape of the first carrier may be any shape such as spherical (including bead shape), plate-like, needle-like, irregular shape, etc., and may be the channel wall in the microdevice. .
  • pretreatment for removing antibodies such as IgG and IgM may be performed.
  • washing method A known method may be adopted for the washing method, and preferably, washing is performed multiple times. For example, washing with a neutral buffer containing detergent, followed by washing with a neutral buffer without detergent.
  • the neutral buffer containing a surfactant the same surfactant and neutral buffer as exemplified for the binding solution can be used. Thereby, for example, highly hydrophobic unnecessary components (blood proteins, lipids, glycolipids, etc.) can be effectively removed.
  • Neutral buffers containing no surfactant can also be the same as the neutral buffers exemplified for the binding solution. As a result, foaming caused by the surfactant remaining in the first combined body can be suppressed.
  • washing method a general method may be adopted, and examples thereof include a method of stirring the carrier in a washing liquid, a method of spraying the washing liquid from a washing nozzle, and the like.
  • washing with water may be further carried out, if necessary.
  • First elution step In the first elution step, the first conjugate is brought into contact with the first eluate after the first washing step. As a result, the polypeptide is dissociated from the first binder, and the polypeptide is eluted in the first eluate.
  • the first eluate is a liquid for eluting the polypeptide, and for example, an acidic aqueous solution such as glycine buffer or hydrochloric acid is used.
  • the pH of the first eluate is, for example, 1.0 or more and 3.5 or less.
  • the first eluate preferably contains a surfactant. This makes it possible to more reliably dissociate the polypeptide from the first binder. It also prevents the eluted polypeptide from adhering to containers such as test tubes and microplates. Therefore, it is possible to reliably improve the recovery rate of the polypeptide.
  • surfactants include those similar to the surfactants exemplified in the binding solution.
  • the surfactant concentration in the first eluate is, for example, 0.001% (w/v) or more, preferably 0.05% (w/v) or more, and for example, 10% (w/v) or more. v) less than or equal to 2% (w/v), preferably less than or equal to 2% (w/v);
  • the first eluate is mixed with a neutral buffer.
  • the first eluate is mixed with a neutral buffer containing a surfactant.
  • neutral buffers and surfactants examples include those similar to the neutral buffers and surfactants exemplified in the binding solution.
  • the pH of the purified solution is, for example, pH 6.0 or higher, preferably 6.5 or higher, and is, for example, 8.5 or lower, preferably 8.0 or lower.
  • the purified solution is brought into contact with the second carrier after the neutralization step. Thereby, the polypeptide binds to the second carrier to obtain a second conjugate.
  • the second carrier is preferably an antibody-immobilized carrier, and specifically includes the same antibody-immobilized carriers exemplified for the first carrier.
  • washing step In the second washing step, after the second bonding step, the second conjugate is washed with a washing liquid.
  • a known method may be adopted as the washing method, and specifically, a method similar to the washing method exemplified in the first washing step may be performed.
  • the second conjugate is brought into contact with the second eluate after the second washing step.
  • the polypeptide is dissociated from the second conjugate, and the polypeptide is eluted in the second eluate.
  • the second eluate is a liquid for eluting the polypeptide, and uses, for example, an acidic aqueous solution such as glycine buffer or hydrochloric acid.
  • the pH of the second eluate is, for example, 1.0 or more and 3.5 or less.
  • the second eluate contains a volatile organic solvent.
  • the polypeptide can be efficiently dissociated from the second conjugate and eluted with the second eluate, and the recovery rate of the polypeptide can be improved.
  • Such volatile organic solvents include organic solvents that are miscible with water in any proportion, such as acetonitrile, methanol, ethanol, acetone, toluene, isopropanol, hexane, butanol, cyclohexane, ethylene glycol, benzene, chloroform. , acetaldehyde, triethylamine, phenol, naphthalene, formaldehyde, tetrahydrofuran, ethyl acetate and the like, preferably acetonitrile, methanol, ethanol, acetone, isopropanol and the like. These can be used singly or in combination of two or more.
  • Volatile organic solvent concentration in the second eluate is, for example, 10% (v/v) or more, preferably 30% (v/v) or more, more preferably 55% (v/v) or more. Also, for example, 90% (v/v) or less, preferably 85% (v/v) or less, more preferably 80% (v/v) or less.
  • the second eluate preferably contains amino acids such as methiotine.
  • amino acids such as methiotine.
  • the amino acid concentration in the second eluate is, for example, 0.01 mM or higher, preferably 0.05 mM or higher, and is, for example, 5 mM or lower, preferably 1 mM or lower.
  • the amount of the second eluate to be brought into contact with the second conjugate is determined according to the humidity. That is, the amount of the eluent used when the humidity is low is determined to be greater than the amount of the eluent used when the humidity is high.
  • the usage amount (first usage amount) of the second eluate under the first environment (first humidity) is determined. That is, the humidity (first humidity) is measured under the first environment. Then, the second eluate is determined just enough so that a desired number of samples (desired number of wells) and a desired amount of samples can be placed on the MALDI plate at the first humidity. At this time, the amount of the second eluate should be as small as possible in order to increase the polypeptide concentration. If necessary, add the dead amount remaining in the test tube or tube and the volatile content of the volatile organic solvent.
  • the total is 4 ⁇ L, but the dead amount (for example, 2 ⁇ L) and the volatilization amount (eg, 2 ⁇ L).
  • the humidity is measured under a second environment (second humidity), and the amount of the second eluate used (second amount) is based on the first amount used at the first humidity. to decide. That is, the humidity (second humidity) is measured under the second environment. Then, if the second humidity is lower than the first humidity, the second usage amount is determined to be greater than the first usage amount. The second usage amount is determined to be less than the first usage amount.
  • the calculation method for determining the second usage amount is appropriately determined according to the type of organic solvent, humidity, and placement time. or more), the ratio between the first usage amount and the second usage amount may be set to, for example, 1.1 or more (eg, 1.5 or less). For example, if the first humidity is 50% or more, the first usage amount is 8 ⁇ L, and the second humidity is 30% or less, the second usage amount may be approximately 9 ⁇ L.
  • the temperature conditions in the first environment and the second environment are not limited and may be the same or different, but preferably substantially the same temperature, specifically the first environment and the second environment. and the temperature difference is 10 degrees or less.
  • the amount used in the second elution step is determined in this analysis step by allowing a desired time, such as 3 minutes or more, preferably 5 minutes or more, or, for example, 60 minutes, from the start of the second elution step to the completion of the arrangement step. It is particularly effective when the time required is 30 minutes or less, preferably 30 minutes or less. It is also effective when the volatile organic solvent concentration in the second eluate is high, for example, 10% (v/v) or more, preferably 55% (v/v)% or more. is.
  • the second eluate in which the polypeptide is eluted is measured by MALDI, which will be described later, to detect the polypeptide.
  • MALDI the amount of the eluate subjected to MALDI
  • the number of samples analyzed by MALDI is more than one. Therefore, the amount of second eluate used is a factor that determines the sensitivity and accuracy of the analysis.
  • the polypeptide was eluted at a high concentration in a low volume of the second eluate, placed in a plurality of wells (desired number of samples), and MALDI measurements were performed a plurality of times.
  • the result may be obtained with a smaller number of samples than desired, resulting in a decrease in accuracy.
  • the present inventors focused on the measurement environment.
  • the volatile organic solvent of the second eluate volatilizes before the second eluate is placed, and the amount of the second eluate becomes insufficient, making it impossible to place the second eluate on the MALDI plate. rice field.
  • the polypeptide is eluted in the eluate at a high concentration and the second eluate is placed on the MADLI plate.
  • MALDI analysis could be performed using a desired number of samples of high concentration, enabling highly sensitive and highly accurate analysis.
  • the second eluate is placed on the measurement plate after the second elution step. Specifically, the second eluate in which the polypeptide has been eluted is distributed to each well of a MALDI plate for a MALDI device.
  • the number of wells (the number of samples to be measured) in which the second eluate is distributed to the MALDI plate is preferably more than one, specifically 2 wells or more, preferably 4 wells or more. Wells or less, preferably 20 wells or less, more preferably 10 wells or less. By providing a plurality of wells, the number of measurement samples (the number of mass spectra to be measured) increases, and detection accuracy can be improved.
  • the amount of the second eluate placed in each well is, for example, 0.2 ⁇ L or more, preferably 0.5 ⁇ L or more, and is, for example, 4 ⁇ L or less, preferably 2 ⁇ L or less.
  • the amount per well unit is equal to or higher than the above lower limit, the analyte can be reliably detected.
  • the amount per well unit is equal to or less than the above upper limit, the number of samples of the substance to be analyzed that are subjected to measurement can be increased.
  • This work may be performed using an automatic pipetting device, or may be performed manually using a pipette or the like.
  • the matrix Prior to placing the second eluate, the matrix may be placed on the MALDI plate in advance. Conversely, after the second eluate is placed on the MALDI plate, the matrix may be placed on top of the second solution. The matrix will be described later in the analysis process.
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight
  • MALDI-IT matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap
  • MALDI-IT -TOF matrix-assisted laser desorption/ionization-ion trap-time-of-flight
  • MALDI-FTICR matrix-assisted laser desorption/ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance
  • the matrix is placed, for example, by dropping a matrix-containing solution onto a MALDI plate and drying it.
  • matrices examples include ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA; ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid), 2,5-dihydroxybenzoic acid, sinapinic acid, and 3-aminoquinoline. These can be used individually by 1 type, or can use 2 or more types together.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • 2,5-dihydroxybenzoic acid 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • sinapinic acid sinapinic acid
  • 3-aminoquinoline 3-aminoquinoline.
  • solvents that the matrix contains include acetonitrile, trifluoroacetic acid, methanol, ethanol, and water. These can be used individually by 1 type, or can use 2 or more types together.
  • the matrix concentration in the matrix-containing solvent is, for example, 0.1 mg/mL or more, preferably 0.5 mg/mL or more, and is, for example, 50 mg/mL or less, preferably 10 mg/mL or less.
  • a matrix additive is used together with the matrix.
  • matrix additives include phosphonic acid group-containing compounds and ammonium salts.
  • Phosphonic acid group-containing compounds include, for example, phosphonic acid, methylphosphonic acid, phenylphosphonic acid, 1-naphthylmethylphosphonic acid, methylenediphosphonic acid (MDPNA; Methylenediphosphonic acid), ethylenediphosphonic acid, ethane-1-hydroxy-1, 1-diphosphonic acid, nitrilotriphosphonic acid, ethylenediaminotetraphosphonic acid and the like.
  • the matrix additive concentration in the matrix-containing solvent is, for example, 0.01% (w/v) or more, preferably 0.1% (w/v) or more, and for example, 10% (w/v ) or less, preferably 1% (w/v) or less.
  • the analysis method of the first aspect includes a humidity measurement step, a first binding step (binding step), a first washing step (washing step), a second elution step (elution step), an arrangement step, and a detection step.
  • the first aspect is preferable from the viewpoint that the polypeptide can be analyzed even when the amount of the polypeptide present in the biological sample is much smaller.
  • the humidity measurement step is performed, but the humidity measurement step is not limited as long as it is before the second elution step. It may be performed after one washing step or after the first neutralization step.
  • the solid phase extraction method preferably employs a reversed-phase retention mode.
  • the carrier is a carrier having a functional group on its surface, and examples of the functional group include an octyl group (C8), an octadecyl group (C18), and a benzene ring.
  • a biological sample is used as the sample and the substance to be analyzed is set to be a polypeptide, but the present invention is not limited to these.
  • the sample may be, for example, a biological sample (cell culture supernatant, cell lysate, microbial culture supernatant, microbial lysate, etc.), food and drink, contaminated water, soil, and the like.
  • a digested peptide produced by digesting the polypeptide contained in the sample with a protease trypsin, Lys-C, Lys-N, Glu-C, Thermolysin, AspN, chymotrypsin, etc.
  • the substance to be analyzed may be, for example, biological components other than polypeptides, pharmaceutical components, food components, residual pesticide components, and the like.
  • MALDI is adopted as the ionization method for mass spectrometry.
  • SELDI surface enhanced laser desorption ionization
  • PALDI nanoparticle assisted laser desorption ionization
  • An analysis method includes a humidity measurement step of measuring humidity, and a binding step of bringing a sample containing an analysis target substance into contact with a carrier to bind the analysis target substance to the carrier.
  • An arrangement step of arranging the liquid on a measurement plate for mass spectrometry, and a detection step of detecting the substance to be analyzed by mass spectrometry, and in the elution step, the use of the eluate depending on the humidity. amount may be determined.
  • the substance to be analyzed can be analyzed with high sensitivity and high accuracy by mass spectrometry even under different environments.
  • the substance to be analyzed can be analyzed with high sensitivity and accuracy by mass spectrometry even in an environment with low humidity.
  • the eluate may be disposed in a plurality of wells of the measurement plate.
  • the volatile organic solvent is acetonitrile, methanol, ethanol, acetone, toluene, isopropanol, hexane, butanol, cyclohexane, ethylene glycol, It may contain at least one selected from the group consisting of benzene, chloroform, acetaldehyde, triethylamine, phenol, naphthalene, formaldehyde, tetrahydrofuran, and ethyl acetate.
  • the substance to be measured can be efficiently eluted into the eluate, and the recovery rate of the substance to be measured to be subjected to mass spectrometry can be improved. As a result, the sensitivity of mass spectrometry can be improved.
  • the concentration of the volatile organic solvent in the eluate may be 10% (v/v) or more.
  • the substance to be measured can be more efficiently eluted into the eluate, and the recovery rate of the substance to be measured to be subjected to mass spectrometry can be more reliably improved. As a result, the sensitivity of mass spectrometry can be improved more reliably.
  • the mass spectrometry may be a matrix-assisted laser desorption/ionization method.
  • the substance to be analyzed may be a polypeptide, and the carrier may be an antibody-immobilized carrier.
  • polypeptides such as A ⁇ -related peptides can be detected.
  • the antibody immobilized on the antibody-immobilizing carrier may be an anti-A ⁇ -related peptide antibody, and the substance to be analyzed may be an A ⁇ -related peptide. .
  • An anti-A ⁇ antibody (IgG) clone 6E10 (Covance) with epitope at residues 3 to 8 of amyloid ⁇ protein (A ⁇ ) was prepared.
  • About 3.3 ⁇ 10 8 magnetic beads (Dynabeads M-270 Epoxy) per 100 ⁇ g of anti-A ⁇ antibody (IgG) were added to an immobilization buffer (0.1 M phosphate buffer containing 1.3 M ammonium sulfate; pH 7). .4) at 37° C. for 16 to 24 hours.
  • Antibody beads were thus produced as an antibody-immobilized carrier.
  • Example 1 Measurement under the first environment (humidity measurement process) When the indoor humidity was measured, it was 58.0%. The temperature was 23.1°C.
  • Human plasma was prepared using A ⁇ -related peptides as the substance to be analyzed. 250 ⁇ L of human plasma was added to neutral buffer containing 11 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-38 (SIL-A ⁇ 1-38) (0.2% (w/v) DDM, 0.2% (w/v) NTM , 800 mM GlcNAc, 100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl; pH 7.4) was mixed with 250 ⁇ L and allowed to stand on ice for 5 to 60 minutes. The human plasma was mixed with antibody beads and shaken at 4°C for 1 hour. SIL-A ⁇ 1-38 was used as an internal standard for standardizing the signal intensity of mass spectra.
  • SIL-A ⁇ 1-38 was used as an internal standard for standardizing the signal intensity of mass spectra.
  • Antibody beads were then washed once with 100 ⁇ L of wash buffer (0.1% (w/v) DDM, 0.1% (w/v) NTM, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl; pH 7.4). , and washed once with 50 ⁇ L of 50 mM ammonium acetate buffer. After that, the antibody beads were brought into contact with the first eluate (50 mM glycine buffer containing 0.1% (w/v) DDM; pH 2.8) to elute the A ⁇ -related peptides into the first eluate.
  • wash buffer 0.1% (w/v) DDM, 0.1% (w/v) NTM, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl; pH 7.4
  • 50 mM ammonium acetate buffer 50 mM ammonium acetate buffer. After that, the antibody beads were brought into contact with the first eluate (50 mM glycine buffer containing 0.1% (w/v) DDM
  • the antibody beads are contacted with 8 ⁇ L of a second eluate (70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing 5 mM HCl and 0.1 mM methionine; pH 2.3), and A ⁇ -related peptides are transferred to the second eluate. eluted.
  • a second eluate 70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing 5 mM HCl and 0.1 mM methionine; pH 2.3
  • a MALDI-TOF MS was run to detect A ⁇ -related peptides. Mass spectral data were acquired with Linear TOF in positive ion mode using AXIMA Performance (Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK) as the set conditions. 400 spots and 16000 shots were accumulated for each well. The m/z value of Linear TOF is indicated by the average mass of peaks. The m/z values were calibrated using human angiotensin II, human ACTH fragment 18-39, bovine insulin oxidized beta-chain, and bovine insulin as external standards.
  • FIG. 1 shows the mass spectrum in the first environment (58.0% humidity).
  • FIG. 2 shows the mass spectrum in the second environment (humidity 21.2%).
  • the vertical axis is the signal intensity and the horizontal axis is the mass-to-charge ratio (m/z).
  • Table 1 shows the amino acid sequences of A ⁇ -related peptides to be analyzed. From FIGS. 1 and 2, it was confirmed with high sensitivity that A ⁇ -related peptides were eluted in both high-humidity and low-humidity environments. Moreover, mass spectra of the desired number of samples (wells 1 to 4) were obtained, confirming that highly accurate detection is possible.

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Abstract

分析方法は、湿度を測定する湿度測定工程と、分析対象物質を含有する試料を担体に接触させて、分析対象物質を担体に結合させる結合工程と、分析対象物質が結合した担体を、揮発性有機溶媒を含有する溶出液に接触させて、分析対象物質を溶出液に溶出させる溶出工程と、分析対象物質が溶出した溶出液を質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程とを備え、溶出工程において、湿度に応じて、溶出液の使用量を決定する。

Description

分析方法
　本発明は、分析方法に関する。
　アルツハイマー病の発症において、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ；Amyloid precursor protein）の切断によって生じるアミロイドβ（Ａβ）などのＡβ関連ペプチドが深く関わっている。そして、免疫沈降法および質量分析法を組み合わせて血液内の複数のＡβ関連ペプチドを検出し、検出した特定のＡβ関連ペプチド比が、脳内アミロイド蓄積の血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
　血液試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法として、例えば、抗体固定化担体と試料中のペプチドとを結合させる工程と、これらの結合体を洗浄する工程と、有機溶媒含有酸性水溶液を用いて抗体固定化担体からペプチドを解離させる工程と、解離したペプチドを質量分析により検出する工程とを備える方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。特許文献１および特許文献２の測定方法では、試料中にペプチドが微量にしか存在しない場合であっても検出することができる。
ＷＯ２０１５／１１１４３０ 特開２０１７－２０９８０号公報
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(9):353-364. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018;554(7691):249-254.
　ところで、免疫沈降法によって夾雑物質を取り除いて分析対象物質のみを溶出させた溶出液を、質量分析法で測定する際に、溶出液中の分析対象物質の濃度（濃縮度）が高いほど、すなわち、溶出液の使用量が少ないほど、質量分析法で検出される分析対象物質のシグナル強度が強くなるため、高感度な分析が可能となる。その一方、質量分析法に供されるサンプル数、すなわち、質量分析結果（マススペクトル）の数は、複数であることが、分析精度の観点から望ましい。
　そのため、分析対象物質を高濃度となるように少量の溶出液で溶出し、その少量の溶出液を複数のサンプル数に分けて質量分析用の測定プレートに配置することが試みられる。しかしながら、このような測定を、日時・場所などの環境を変更して複数回実施したところ、溶出液の量が不足し、所望数のサンプル結果（マススペクトル）よりも少なくなる場合が生じてデータ数が減り、精度が低下する不具合が生じる。その一方、上記不具合を回避すべく、溶出液の量を多くしてマージンを作りすぎてしまうと、高濃度で溶出できず、高感度での分析ができない不具合が生じる。
　本発明は、質量分析法を用いて分析する際に、分析対象物質を高感度かつ高精度で検出することを目的とする。
　本発明の第１の態様の分析方法は、湿度を測定する湿度測定工程と、分析対象物質を含有する試料を担体に接触させて、前記担体に前記分析対象物質を結合させる結合工程と、前記分析対象物質が結合した前記担体に、揮発性有機溶媒を含有する溶出液を接触させて、前記溶出液に前記分析対象物質を溶出させる溶出工程と、前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程とを備える。前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定する。
　本発明の第１の態様によれば、分析対象物質を高感度かつ高精度で検出することができる。
図１は、第１環境（湿度５８．０％）下において、Ａβ関連ペプチドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ装置にて検出したマススペクトルを示す。 図２は、第２環境（湿度２１．２％）下において、Ａβ関連ペプチドをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ装置にて検出したマススペクトルを示す。
　１．第１の態様
　本発明の第１の態様の分析方法として、分析対象物質としてポリペプチド、試料として生体試料、質量分析法としてＭＡＬＤＩ（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization；マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）を採用した際の分析方法を説明する。
　第１の態様の分析方法は、湿度測定工程と、第１結合工程（本発明の「結合工程」の一例）と、第１洗浄工程と、第１溶出工程と、中性化工程と、第２結合工程と、第２洗浄工程と、第２溶出工程（本発明の「溶出工程」の一例）と、配置工程と、検出工程とを備える。
　第１の態様の分析測定対象である「ポリペプチド」には、「ペプチド」、「タンパク質」も含まれる。ポリペプチドには、種々のものが含まれ、具体的には、Aβ関連ペプチドが挙げられる。Aβ関連ペプチドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ；Amyloid precursor protein）が切断されることにより生じるＡβ、および、Ａβの配列を一部でも含むペプチドである。具体的には、実施例において示されており、また、ＷＯ２０１５／１７８３９８にも開示されている。
　（湿度測定工程）
　湿度測定工程では、湿度を測定する。具体的には、後述する第２溶出工程および配置工程が実施される分析空間（室内）の湿度を測定する。一般的にこれらは同一空間で実施されるが、異なっている場合は、各空間の湿度を測定し、第２溶出工程開始直後から、溶出液が測定プレートに配置されるまでの時間で按分した平均湿度とすればよい。
　（第１結合工程）
　第１結合工程では、生体試料を第１担体（本発明の「担体」の一例）に接触させる。例えば、生体試料を第１担体と混合する。これにより、第１担体にポリペプチドが結合して、第１結合体が得られる。
　生体試料としては、例えば、血液、脳脊髄液、尿、体分泌液、唾液、痰などの体液；例えば、糞便などが挙げられる。血液試料には、全血、血漿、血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血に、遠心分離、冷凍保存などの処理がなされたものであってよい。
　生体試料は、通常、結合溶液と混合した状態で、第１担体に接触させる。
　結合溶液としては、通常の免疫沈降法で用いられる結合溶液を用いることができる。好ましくは、結合溶液は、界面活性剤を含有する中性緩衝液が挙げられる。界面活性剤を含有することにより、非特異的吸着を抑制することができる。
　界面活性剤としては、タンパク質変性の抑制、除去容易性などの観点から、好ましくは、中性界面活性剤が挙げられる。中性界面活性剤としては、例えば、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＭ：n-Decyl-β-D-maltoside）、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ：n-Dodecyl-β-D-maltoside）、ｎ－ノニル－β－Ｄ－チオマルトシド（ＮＴＭ：n-Nonyl-β-D-thiomaltoside）などの、マルトースを親水性部分に有する界面活性剤；α－Ｄ－グルコピラノシルα－Ｄ－グルコピラノシド　モノオクタノエート（トレハロースＣ８）、α－Ｄ－グルコピラノシルα－Ｄ－グルコピラノシド　モノドデカノエート（トレハロースＣ１２）、α－Ｄ－グルコピラノシルα－Ｄ－グルコピラノシド　モノミリステート（トレハロースＣ１４）などの、トレハロースを親水性部分に有する界面活性剤；ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－へプチル－β－Ｄ－チオグルコシドなどの、グルコースを親水性部分に有する界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で用いることができ、または、２種以上を併用することができる。
　緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨは、例えば、６．５以上、８．５以下である。
　結合溶液中の界面活性剤濃度は、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、例えば、１０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは、２％（ｗ／ｖ）以下である。
　第１担体は、ポリペプチドが結合可能なものであればよく、例えば、抗体固定化担体が挙げられる。
　第１担体に固定化されている抗体は、ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を有していればよく、例えば、ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する免疫グロブリンまたはその断片が挙げられる。
　免疫グロブリンとしては、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられる。免疫グロブリンは、分析対象物質に応じて適宜決定され、公知のものを採用すればよい。免疫グロブリン断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｌ鎖、Ｈ鎖などが挙げられる。分析対象物質がＡβ関連ペプチドとする場合、Ａβ関連ペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する免疫グロブリンまたはその断片（抗Ａβ関連ペプチド抗体）は、例えば、６Ｅ１０、４Ｇ８、１Ｅ１１、１１Ａ５０－Ｂ１０、１２Ｆ４、９Ｃ４、８２Ｅ１、１２Ｂ２、１Ａ１０およびこれらの断片などである。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。
　第１担体の材質としては、例えば、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸系ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、磁性体などが挙げられる。後述する第１溶出工程や第２溶出工程において、磁力によって容易に担体のみを抽出でき、かつ、担体取り出し時に溶出液の減少を抑制できる観点から、好ましくは、磁性体が挙げられる。
　第１担体の形状としては、球状（ビーズ形状を含む）、板状、針状、不定形などのいずれの形状であってもよく、また、マイクロデバイス内の流路壁などであってもよい。
　第１結合工程の前に、必要に応じて、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの抗体を除去する前処理などを実施してもよい。
　（第１洗浄工程）
　第１洗浄工程では、第１結合工程の後において、洗浄液を用いて第１結合体を洗浄する。
　洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、好ましくは、複数回洗浄を実施する。例えば、界面活性剤を含有する中性緩衝液を用いて洗浄し、続いて、界面活性活性剤を含有しない中性緩衝液を用いて洗浄する。
　界面活性剤を含有する中性緩衝液としては、結合溶液で例示した界面活性剤および中性緩衝液と同様のものを使用することができる。これにより、例えば、疎水性の高い不要成分（血中タンパク質、脂質、糖脂質など）を効果的に除去することができる。
　界面活性剤を含有しない中性緩衝液も、結合溶液で例示した中性緩衝液と同様のものを使用することができる。これにより、界面活性剤が第１結合体に残存することによる泡立ちを抑制することができる。
  洗浄方法としては、一般的な方法を採用すればよく、例えば、洗浄液内で担体を攪拌する方法、洗浄ノズルから洗浄液を噴射する方法などが挙げられる。
　これら中性緩衝液による洗浄後に、必要に応じて、水による洗浄をさらに実施してもよい。
　（第１溶出工程）
　第１溶出工程では、第１洗浄工程の後において、第１結合体を第１溶出液に接触させる。これにより、第１結合体からポリペプチドが解離して、第１溶出液にポリペプチドが溶出する。
　第１溶出液は、ポリペプチドを溶出するための液体であって、例えば、グリシン緩衝液、塩酸などの酸性水溶液を用いる。第１溶出液のｐHは、例えば、１．０以上、３．５以下である。
  第１溶出液は、好ましくは、界面活性剤を含有する。これにより、第１結合体からポリペプチドをより確実に解離させることができる。また、溶出されたポリペプチドが、試験管、マイクロプレートなどの容器に付着することを抑制する。したがって、ポリペプチドの回収率を確実に向上させることができる。
　界面活性剤としては、結合溶液で例示した界面活性剤と同様のものが挙げられる。第１溶出液中の界面活性剤濃度は、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、例えば、１０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは、２％（ｗ／ｖ）以下である。
　（中性化工程）
 中性化工程では、第１溶出工程の後において、ポリペプチドが溶出した第１溶出液を中性化する。これにより、ポリペプチドを含有する精製溶液が得られる。
　中性化方法としては、例えば、第１溶出液を中性緩衝液と混合する。好ましくは、第１溶出液を、界面活性剤を含有する中性緩衝液と混合する。
　中性緩衝液および界面活性剤としては、結合溶液で例示した中性緩衝液および界面活性剤と同様のものが挙げられる。
　精製溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ６．０以上、好ましくは、６．５以上であり、また、例えば、８．５以下、好ましくは、８．０以下である。これにより、第２結合工程において、結合効率を向上させることができる。
　（第２結合工程）
　第２結合工程では、中性化工程の後において、精製溶液を第２担体に接触させる。これにより、第２担体にポリペプチドが結合して、第２結合体が得られる。
　第２担体としては、好ましくは、抗体固定化担体であり、具体的には、第１担体で例示した抗体固定化担体と同様のものが挙げられる。
　（第２洗浄工程）
  第２洗浄工程では、第２結合工程の後において、洗浄液を用いて第２結合体を洗浄する。洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、具体的には、第１洗浄工程で例示した洗浄方法と同様の方法を実施すればよい。
　（第２溶出工程）
　第２溶出工程では、第２洗浄工程の後において、第２結合体を第２溶出液に接触させる。これにより、第２結合体からポリペプチドが解離して、第２溶出液にポリペプチドが溶出する。
　第２溶出液は、ポリペプチドを溶出するための液体であって、例えば、グリシン緩衝液、塩酸などの酸性水溶液を用いる。第２溶出液のｐHは、例えば、１．０以上、３．５以下である。
　第２溶出液は、揮発性有機溶媒を含有する。これにより、第２結合体からポリペプチドを効率よく解離させ、第２溶出液に溶出させることができ、ポリペプチドの回収率を向上させることができる。
　このような揮発性有機溶媒としては、水と任意の割合で混和する有機溶媒が挙げられ、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、酢酸エチルなどが挙げられ、好ましくは、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどが挙げられる。これらは、１種単独で用いることができ、または、２種以上併用してもよい。
　第２溶出液中の揮発性有機溶媒濃度は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは、３０％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは、５５％（ｖ／ｖ）以上であり、また、例えば、９０％（ｖ／ｖ）以下、好ましくは、８５％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは、８０％（ｖ／ｖ）以下である。濃度が上記範囲内にすることにより、第２担体からポリペプチドの解離が効率よく起き、また、質量分析時の感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させることができる。
　第２溶出液は、好ましくは、メチオチンなどのアミノ酸を含有する。これにより、質量分析用の測定プレートに配置し、分析が開始するまでの間において、ポリペプチドの酸化を低減させることができ、分析精度を向上させることができる。第２溶出液中のアミノ酸濃度は、例えば、０．０１ｍＭ以上、好ましくは、０．０５ｍＭ以上であり、また、例えば、５ｍＭ以下、好ましくは、１ｍＭ以下である。
　本工程では、第２結合体と接触させる第２溶出液の使用量は、湿度に応じて決定する。すなわち、湿度が低い場合の溶出液の使用量は、湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定する。
　具体的には、まず、第１環境（第１湿度）下での第２溶出液の使用量（第１使用量）を決定する。すなわち、第１環境下で湿度（第１湿度）を測定する。そして、第１湿度において、所望サンプル数（所望ウェル数）かつ所望量のサンプルをMALDIプレートに配置できるように、第２溶出液を過不足なく決定する。この際、第２溶出液の量は、ポリペプチド濃度を高くするために、なるべく少なくする。必要に応じて、試験管やチューブに残存するデッド量や揮発性有機溶媒の揮発分量も加える。一例として、各ウェルに配置される第２溶出液サンプルを１μＬ、サンプル数（ウェル数）を４つに設定した場合、合計４μＬとなるが、これに、デッド量（例えば、２μＬ）や揮発量（例えば、２μＬ）も追加する。
　次いで、第２環境（第２湿度）下で湿度を測定し、その湿度に応じて、第１湿度での第１使用量を基準にして、第２溶出液の使用量（第２使用量）を決定する。すなわち、第２環境下で湿度（第２湿度）を測定する。そして、第２湿度が第１湿度よりも低い場合は、第２使用量は、第１使用量よりも多くなるように決定し、一方、第２湿度が第１湿度よりも高い場合は、第２使用量は、第１使用量よりも少なくなるように決定する。
　第２使用量の決定の算出方法は、有機溶媒種や湿度、配置時間に応じて適宜決定されるが、例えば、第１湿度と第２湿度との差が２０％以上（好ましくは、３０％以上）である場合は、第１使用量と第２使用量との比を例えば１．１以上（例えば１．５以下）とすればよい。一例としては、第１湿度が５０％以上で、第１使用量が８μＬで、第２湿度が３０％以下であった場合、第２使用量は、約９μＬとすればよい。
　なお、第１環境および第２環境での温度条件は限定的でなく、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、略同一温度、具体的には、第１環境と第２環境との温度差が１０度以下である。
　第２溶出工程における使用量の決定は、この分析工程において、第２溶出工程開始後から配置工程完了までに、所望時間、例えば、３分以上、好ましくは、５分以上、また、例えば、６０分以下、好ましくは、３０分以下の時間を要する場合に特に有効である。また、第２溶出液中の揮発性有機溶媒濃度が、高濃度である場合、例えば、１０％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは、５５％（ｖ／ｖ）％以上である場合にも有効である。
　なお、本発明の第１の態様は、以下の知見に基づいてなされたものであるが、本発明の範囲は、以下の知見に限定されない。ポリペプチドが溶出した第２溶出液は、後述するＭＡＬＤＩで測定され、ポリペプチドが検出される。この際、ＭＡＬＤＩに供される溶出液の量が少ないほど、すなわち、ポリペプチドの濃度が濃いほど、検出結果が高感度で得られるため、溶出液の量が少ないことが好ましい。また、検出精度を高めるため、ＭＡＬＤＩで分析されるサンプル数（使用されるウェル数）は、複数以上あることが好ましい。したがって、第２溶出液の使用量が、分析の感度および精度を左右する一因となる。
　そして、低量の第２溶出液に高濃度でポリペプチドを溶出させて、複数のウェル数（所望のサンプル数）に配置して、ＭＡＬＤＩ測定を複数回実施したところ、例えば、異なる日時にまたがって複数回測定したところ、所望のサンプル数よりも少ないサンプル数の結果が得られ、精度が下がる場合が生じる。本発明者らは、この現象を鋭意検討したところ、測定環境に着目し、測定環境が低湿度である場合、分析対象物質を第２溶出液に溶出させ始めた後ＭＡＬＤＩ装置用の測定プレートに配置しようとするまでの間に、第２溶出液の揮発性有機溶媒が揮発して、第２溶出液の液量が不足してしまい、ＭＡＬＤＩプレートに第２溶出液を配置できなくなる知見を見出した。
　そして、湿度を測定し、その測定湿度に応じて第２溶出液の使用量を決定することによって、ポリペプチドを高濃度で溶出液に溶出させるとともにＭＡＤＬＩプレートに配置される第２溶出液の液量（ひいては、サンプル数）の不足を防止することに達成した。その結果、高濃度かつ所望数のサンプルを用いてＭＡＬＤＩ分析することができ、高感度および高精度の分析を可能とした。
　（配置工程）
　配置工程では、第２溶出工程の後において、第２溶出液を測定プレートに配置する。具体的には、ポリペプチドが溶出された第２溶出液を、ＭＡＬＤＩ装置用のＭＡＬＤＩプレートの各ウェルに分配する。
　第２溶出液をＭＡＬＤＩプレートに分配するウェル数（測定サンプル数）は、好ましくは、複数以上であり、具体的には、２ウェル以上、好ましくは、４ウェル以上であり、また、例えば、５０ウェル以下、好ましくは、２０ウェル以下、より好ましくは、１０ウェル以下である。ウェル数が複数であることにより、測定サンプル数（測定されるマススペクトル数）が増加し、検出精度を向上させることができる。
　各ウェルに配置される第２溶出液の量は、それぞれ、例えば、０．２μL以上、好ましくは、０．５μL以上であり、また、例えば、４μL以下、好ましくは、２μL以下である。ウェル単位当たりの量が上記下限以上であることにより、分析対象物質を確実に検出することができる。また、ウェル単位当たりの量が上記上限以下であることにより、測定に供される分析対象物質のサンプル数を多くすることができる。
　この作業は、自動分注装置を使用してもよく、また、ピペットなどを用いて手作業で実施してもよい。
　なお、第２溶出液の配置に先立って、予め、ＭＡＬＤＩプレートに、マトリックスを配置していてもよい。また、逆に、第２溶出液をＭＡＬＤＩプレートに配置した後に、その第２溶液の上にマトリックスを配置してもよい。マトリックスについては、分析工程にて後述する。
　（分析工程）
　分析工程では、配置工程の後において、第２溶出液に含有されるポリペプチドをＭＡＬＤＩによって検出する。
　ＭＡＬＤＩでの検出には、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などを用いて常法に従って操作すればよい。
　マトリックスは、例えば、マトリックス含有溶液をＭＡＬＤＩプレートに滴下し、乾燥させることにより、配置する。
  マトリックスとしては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ；α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）、２，５-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、３－アミノキノリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で用いることができ、または、２種以上を併用することができる。
　マトリックスが含有させる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、メタノール、エタノール、水などが挙げられる。これらは、１種単独で用いることができ、または、２種以上を併用することができる。
　マトリックス含有溶媒中のマトリックス濃度は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、また、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは、１０ｍｇ／ｍＬ以下である。
　好ましくは、マトリックスとともに、マトリックス添加剤を併用する。マトリックス添加剤としては、例えば、ホスホン酸基含有化合物、アンモニウム塩などが挙げられ、好ましくは、洗浄液の残存によるバックグランドへの悪影響を抑制できる観点から、ホスホン酸基含有化合物が挙げられる。ホスホン酸基含有化合物としては、例えば、ホスホン酸、メチルホスホン酸、フェニルホスホン酸、１－ナフチルメチルホスホン酸、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ；Methylenediphosphonic acid）、エチレンジホスホン酸、エタン－１－ヒドロキシ－１，１－ジホスホン酸、ニトリロトリホスホン酸、エチレンジアミノテトラホスホン酸などが挙げられる。
　マトリックス含有溶媒中のマトリックス添加剤濃度は、例えば、０．０１％（ｗ/ｖ）以上、好ましくは、０．１％（ｗ/ｖ）以上であり、また、例えば、１０％（ｗ/ｖ）以下、好ましくは、１％（ｗ/ｖ）以下である。
　２．そのほかの態様
　（１）第１の態様の分析方法では、２回の免疫沈降法（アフィニティ精製）を実施しているが、例えば、１回の免疫沈降法でもよい。この場合、分析方法は、湿度測定工程と、第１結合工程（結合工程）と、第１洗浄工程（洗浄工程）と、第２溶出工程（溶出工程）と、配置工程と、検出工程とを備える。生体試料中のポリペプチドの存在量がより一層微量な場合でも、ポリペプチドを分析することができる観点から、第１の態様が好ましい。
　（２）第１の態様の分析方法では、まず、湿度測定工程を実施しているが、湿度測定工程は、第２溶出工程の前であれば限定されず、例えば、第１結合工程、第１洗浄工程または第１中性化工程の後で実施してもよい。
　（３）第１の態様の分析方法では、抗体として、抗体固定化担体を用いて免疫沈降法を実施しているが、免疫沈降法に限定されず、例えば、固相抽出法を実施することもできる。この場合、固相抽出法は、好ましくは、逆相の保持モードを採用する。担体は、官能基を表面に有する担体であり、官能基としては、例えば、オクチル基（Ｃ８）、オクタデシル基（Ｃ１８）、ベンゼン環などが挙げられる。
　（４）第１の態様の分析方法では、試料として生体試料を用い、分析対象物質をポリペプチドに設定しているが、これらに限定されない。試料は、例えば、生物試料（細胞培養上清、細胞溶解液、微生物培養上清、微生物溶解液など）、飲食料、汚染水、土壌などであってもよい。また、上記試料に含有されるポリペプチドをプロテアーゼ（トリプシン、Lys-C、Lys-N、Glu-C、Thermolysin、AspN、キモトリプシンなど）によって消化して生成される消化ペプチドを、試料としても用いてもよい。分析対象物質は、例えば、ポリペプチド以外の生体成分、医薬品成分、食品成分、残留農薬成分などとしてもよい。
　（５）第１の態様の分析方法では、質量分析のイオン化法としてＭＡＬＤＩを採用しているが、例えば、ＭＡＬＤＩ以外のイオン化法、具体的には、ＬＤＩ（Laser desorption ionization；レーザー脱離イオン化法）、ＳＥＬＤＩ（surface enhanced laser desorption ionization；表面増強レーザー脱離イオン化法）、ＰＡＬＤＩ（ナノ粒子支援レーザー脱離イオン化法）などを採用してもよい。
　３．態様
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係る分析方法は、湿度を測定する湿度測定工程と、分析対象物質を含有する試料を、担体に接触させて、前記分析対象物質を前記担体に結合させる結合工程と、前記分析対象物質が結合した前記担体を、揮発性有機溶媒を含有する溶出液に接触させて、前記分析対象物質を前記溶出液に溶出させる溶出工程と、前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を、質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程とを備え、前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定してもよい。
　第１項の分析方法によれば、異なる環境下でも、分析対象物質を質量分析法にて、高感度および高精度で分析することができる。
　（第２項）第１項に記載の分析方法において、前記溶出工程において、前記湿度が低い場合の溶出液の使用量は、前記湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定してもよい。
　第２項の分析方法によれば、湿度が低い環境下でも、分析対象物質を質量分析法にて、高感度および高精度で分析することができる。
　（第３項）第１項または第２項に記載の分析方法において、前記配置工程では、前記溶出液を前記測定プレートの複数のウェルに配置してもよい。
　第３項の分析方法によれば、１つのサンプルから複数の質量分析結果が得られるため、高精度で分析することができる。
　（第４項）第１～３項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記揮発性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、および、酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも１種を含有してもよい。
　第４項の分析方法によれば、測定対象物質を溶出液に効率よく溶出することができ、質量分析に供する測定対象物質の回収率を向上させることができる。その結果、質量分析の感度を向上させることができる。
　（第５項）第１～４項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記溶出液中の前記揮発性有機溶媒の濃度が、１０％（ｖ／ｖ）以上であってもよい。
　第５項の分析方法によれば、測定対象物質をより一層効率よく溶出液に溶出することができ、質量分析に供する測定対象物質の回収率をより確実に向上させることができる。その結果、質量分析の感度をより確実に向上させることができる。
　（第６項）第１～５項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であってもよい。
　第６項の分析方法によれば、ポリペプチドなどの生体高分子の分析を容易にすることができる。
　（第７項）第１～６項のいずれかに記載の分析方法において、前記分析対象物質が、ポリペプチドであり、前記担体が、抗体固定化担体であってもよい。
　第７項の分析方法によれば、Ａβ関連ペプチドなどのポリペプチドを検出することができる。
　（第８項）第７項に記載の分析方法において、前記抗体固定化担体に固定されている抗体が、抗Ａβ関連ペプチド抗体であり、前記分析対象物質が、Ａβ関連ペプチドであってもよい。
　第８項の分析方法によれば、アルツハイマー型認知症の発症などを検査することができる。
　次に実施例および比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
　（抗体ビーズの用意）
　アミロイドβタンパク質（Ａβ）の３－８残基をエピトープとする抗Ａβ抗体（ＩｇＧ）のクローン６Ｅ１０(Covance社)を用意した。抗Ａβ抗体（ＩｇＧ）１００μｇに対して磁性ビーズ(Dynabeads M-270 Epoxy)約３．３×１０８個を、固定化緩衝液（１．３Ｍ硫酸アンモニウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液；ｐＨ７．４）中で３７℃、１６～２４時間反応させた。これにより、抗体固定化担体としての抗体ビーズを作製した。
　＜実施例１＞
　１．第１環境下での測定
　（湿度測定工程）
　室内の湿度を測定したところ、５８．０％であった。なお、温度は、２３．１℃であった。
　（第１結合工程、第１洗浄工程、第１溶出工程）
　分析対象物質をＡβ関連ペプチドとし、ヒト血漿を用意した。ヒト血漿２５０μＬを、安定同位体標識されたＡβ１－３８（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）１１ｐＭを含む中性緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．２％（ｗ／ｖ）ＮＴＭ、８００ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）２５０μＬと混合し、氷上で５～６０分静置させた。そのヒト血漿を抗体ビーズと混合し、４℃で１時間振盪させた。なお、ＳＩＬ－Ａβ１－３８は、マススペクトルのシグナル強度を標準化するための内部標準とした。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．１％（ｗ／ｖ）ＮＴＭ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）１００μＬで１回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄した。その後、抗体ビーズを、第１溶出液（０．１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭを含む５０ｍＭグリシン緩衝液；ｐＨ２．８）に接触させて、Ａβ関連ペプチドを第１溶出液に溶出させた。
　（中性化工程）
　Ａβ関連ペプチドを含有する第１溶出液を、中性緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、８００ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ、３００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）と混合させて、精製溶液を得た。
　（第２結合工程、第２洗浄工程、第２溶出工程）
　精製溶液を抗体ビーズと混合し、４℃で１時間振盪させた。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）５０μＬで２回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄し、水３０μＬで１回洗浄した。その後、抗体ビーズを、８μＬの第２溶出液（５ｍＭ　ＨＣｌと０．１ｍＭメチオニンを含む７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液；ｐＨ２．３）に接触させて、Ａβ関連ペプチドを第２溶出液に溶出させた。
　（配置工程）
　質量分析装置として、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ装置（島津製作所製、AXIMA Performance）を用いた。Ｌｉｎｅａｒ　ＴＯＦ用のマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用い、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を用い、溶媒としてアセトニトリルを用いて、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡマトリックス溶液を調製した。ＭＡＬＤＩプレート(μFocus MALDI plate 900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ))の４ｗｅｌｌに、マトリックス溶液を０．５μＬずつ滴下し、乾固させた。これらの４ｗｅｌｌに、Ａβ関連ペプチドを含有する第２溶出液を滴下して、配置させた。なお、第２溶出工程開始後から配置工程完了までの所要時間は、５分１５秒であった。
　（検出工程）
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを作動させて、Ａβ関連ペプチドを検出した。設定条件として、マススペクトルデータはAXIMA Performance(Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)を用いて、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ　ＴＯＦで取得した。１ｗｅｌｌに対して４００スポット、１６０００ショットずつ積算した。Ｌｉｎｅａｒ　ＴＯＦのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準としてhuman angiotensin IIおよびhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。
　２．第２環境下での測定
　（湿度測定工程）
　日時を変更して、室内の湿度を測定したところ、２１．２％であった。なお、温度は、２１．２℃であった。
　（第１結合工程～検出工程）
　第２溶出液の使用量を９μＬに変更した以外は、第１環境と同様に実施した。
　＜結果＞
　図１に、第１環境（湿度５８．０％）におけるマススペクトルを示す。図２に、第２環境（湿度２１．２％）におけるマススペクトルを示す。図１および図２において、縦軸はシグナル強度、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）である。表１に、分析対象物質となるＡβ関連ペプチドのアミノ酸配列を示す。図１および図２から、高湿度条件および低湿度条件のいずれの環境でもＡβ関連ペプチドが溶出していることが高感度で確認できた。また、所望サンプル数（Ｗｅｌｌ　１～４）のマススペクトルが得られており、高精度の検出が可能であることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜参考例＞
　第２環境において、第２溶出液の使用量を第１環境と同様の８μＬのままにした以外は、同様に実施した。そうすると、ＭＡＬＤＩプレートに第２溶出液が３ｗｅｌｌにしか配置されず、所望サンプル数の分析ができなかった。

 

Claims (8)

  1. 　湿度を測定する湿度測定工程と、
    　分析対象物質を含有する試料を、担体に接触させて、前記分析対象物質を前記担体に結合させる結合工程と、
    　前記分析対象物質が結合した前記担体を、揮発性有機溶媒を含有する溶出液に接触させて、前記分析対象物質を前記溶出液に溶出させる溶出工程と、
    　前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を、質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、
    　前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程と
    を備え、
    　前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定する、分析方法。
  2. 　前記溶出工程において、前記湿度が低い場合の溶出液の使用量は、前記湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定する、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記配置工程では、前記溶出液を前記測定プレートの複数のウェルに配置する、請求項１に記載の分析方法。
  4. 　前記揮発性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、および、酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも１種を含有する、請求項１に記載の分析方法。
  5. 　前記溶出液中の前記揮発性有機溶媒の濃度が、１０％（ｖ／ｖ）以上である、請求項１に記載の分析方法。
  6. 　前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である、請求項１に記載の分析方法。
  7. 　前記分析対象物質が、ポリペプチドであり、
    　前記担体が、抗体固定化担体である、請求項１に記載の分析方法。
  8. 　前記抗体固定化担体に固定されている抗体が、抗Ａβ関連ペプチド抗体であり、
    　前記分析対象物質が、Ａβ関連ペプチドである、請求項７に記載の分析方法。
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