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WO2019004668A1 - 프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 - Google Patents

프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019004668A1
WO2019004668A1 PCT/KR2018/007144 KR2018007144W WO2019004668A1 WO 2019004668 A1 WO2019004668 A1 WO 2019004668A1 KR 2018007144 W KR2018007144 W KR 2018007144W WO 2019004668 A1 WO2019004668 A1 WO 2019004668A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
disease
vesicles
derived
proteus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/007144
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MD Healthcare Inc
Original Assignee
MD Healthcare Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020180072307A external-priority patent/KR102011375B1/ko
Application filed by MD Healthcare Inc filed Critical MD Healthcare Inc
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Priority to EP18825252.2A priority patent/EP3647437A4/en
Priority to JP2019569842A priority patent/JP6959665B2/ja
Publication of WO2019004668A1 publication Critical patent/WO2019004668A1/ko
Priority to US16/362,176 priority patent/US11040074B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/175,925 priority patent/US11883440B2/en
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a nano-vesicle derived from a bacterium belonging to the genus Proteus, and to its use. More specifically, the present invention relates to a nano-vesicle derived from a bacterium of the genus Proteus, Respiratory diseases, and inflammatory bowel disease, and compositions for preventing or treating such vesicles.
  • intractable chronic diseases are characterized by a chronic inflammatory reaction caused by immune dysfunction due to repetitive exposure to causal factors, which are caused by changes in lifestyle, including cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, Allergic-respiratory diseases, and inflammatory bowel diseases are becoming serious problems in the public health.
  • Th17 (T helper 17) immune response which is characterized by the secretion of interleukin-17 cytokine, is important for the immune response to the causative agent derived from bacteria.
  • Interleukin-6, IL-66) secretion plays an important role in the differentiation of Th17 cells into innate immune responses.
  • inflammation occurs when exposed to bacterial causative factors.
  • inflammatory mediators such as tumor necrosis factor-alpha (TNF- ⁇ ) are secreted to treat cancer, cardiovascular disease, - Mental illness, allergic - respiratory disease, and inflammatory bowel disease are known to occur.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor-alpha
  • the number of microorganisms that are symbiotic to the human body is 10 times more than that of human cells, and the number of microorganisms is known to be over 100 times that of human genes.
  • Bacteria and archaea that coexist in our body secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes, proteins, and so on into other cells.
  • the mucous membrane forms a physical barrier that can not pass through particles of 200 nanometers (nm) or larger, and can not pass through the mucous membrane when the bacteria are symbiotic to the mucous membrane.
  • the bacterial-derived vesicles are less than 100 nanometers in size, It is absorbed into the epithelium through the mucosa to induce an inflammatory reaction, and is also absorbed into the body through the lymphatic vessels.
  • Bacterial-derived vesicles which are secreted locally from bacteria that coexist in our body, are absorbed into the epithelial cells of the mucosa to induce a local inflammatory reaction, and the vesicles derived from the pathogenic bacteria that are absorbed by our bodies are distributed in the organs through the blood and absorbed Increases inflammatory response in organs and exacerbates disease.
  • the genus Proteus bacterium is an anaerobic gram-negative bacterium that converts urea to ammonia via urease, which converts urine into ammonia, converting the urea to ammonia.
  • Proteus mirabilis is known to be a pathogenic bacterium, accounting for 90% of human bacterial infections in the genus Proteus.
  • the bacterium of the above-mentioned Proteus is not only symbiotic with human digestive organs, but also widely known as an environment such as soil and water.
  • an invention for treating diseases by using an extracellular endoplasmic reticulum derived from a Bacillus genus or a lactic acid bacterium has been disclosed (KR 10-1862507, KR 10-1726488).
  • proteases secrete out vesicles have not been reported, and there have been no reports of applications in the diagnosis and treatment of diseases such as cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuropsychiatric diseases, allergic-respiratory diseases, and inflammatory bowel diseases.
  • the vesicles derived from the bacterium of the genus Proteus were significantly reduced in clinical samples of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disease, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease patients, Of the patients.
  • the vesicles isolated from the culture broth of the Proteus bacterium can be used as a composition for preventing or treating cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neurological diseases, allergic-respiratory diseases, and inflammatory bowel diseases.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above conventional problems and have found that metagenomic analysis can be used to diagnose gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, Cardiovascular diseases such as cardiovascular diseases such as cardiomyopathy such as cardiomyopathy, cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris and stroke, diabetic and other metabolic diseases, neuropsychiatric diseases such as Parkinson's disease and depression, atopic dermatitis, asthma, chronic It has been confirmed that the contents of proteas-derived bacterial vesicles are significantly reduced in samples derived from inflammatory bowel disease patients such as allergic-respiratory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), irritable growth syndrome and inflammatory bowel disease.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the present invention provides a method for treating or preventing asthma, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, brain tumor, chronic obstructive pulmonary disease, A method for providing information for diagnosis of one or more diseases selected from the group consisting of myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma,
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma
  • one or more diseases selected from the group consisting of atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression
  • diseases selected from the group consisting of atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression
  • atopic dermatitis
  • the present invention provides a method for the treatment and / or prophylaxis of cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuropsychiatric diseases, allergic-respiratory diseases and inflammatory bowel diseases, Provide a method of providing information for the diagnosis of the above diseases:
  • the present invention also provides a method of diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease, comprising the steps of:
  • the sample in step (a) may be blood, urine, or feces.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating at least one disease selected from the group consisting of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease, A pharmaceutical composition for therapeutic use is provided.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating at least one disease selected from the group consisting of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease, There is provided a therapeutic inhaler composition.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating at least one disease selected from the group consisting of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease, A composition for improvement is provided.
  • the composition for preventing or ameliorating the disease may be a food composition or a cosmetic composition.
  • the food composition may be a health functional food composition.
  • the present invention also relates to a method for treating cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient a bacterium- A disease, a disease, a disease or a disease.
  • the present invention also provides a prophylactic or therapeutic use of at least one disease selected from the group consisting of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease .
  • the cancer may be a gastric cancer, a colon cancer, a liver cancer, a bile duct cancer, a pancreatic cancer, a lung cancer, a breast cancer, an ovarian cancer, a bladder cancer, a prostate cancer, a lymphoma or a brain tumor.
  • the cardiovascular disease may be myocardial infarction, cardiomyopathy, atrial fibrillation, dysenteric angina, or stroke.
  • the metabolic disease may be diabetes.
  • the neuropsychiatric disorder may be Parkinson ' s disease or depression.
  • the allergic-respiratory disease may be atopic dermatitis, asthma, or chronic obstructive pulmonary disease.
  • the inflammatory bowel disease may be hypersensitivity syndrome, or inflammatory bowel disease.
  • the vesicles may have an average diameter of 10 to 200 nm.
  • the vesicle may be secreted naturally or artificially in the bacterium of the genus Proteus.
  • the proteas-derived bacterium-derived vesicle may be secreted from Proteus mirabilis.
  • the present inventors confirmed that intestinal bacteria are not absorbed into the body but they are absorbed into the body through epithelial cells in the case of bacterial-derived vesicles, and are excreted through the kidneys, liver, and lungs systemically, Colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, brain tumor, myocardial infarction, Allergic diseases such as cardiovascular diseases such as cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris and stroke, metabolic diseases such as diabetes, neuropsychiatric diseases such as Parkinson's disease and depression, atopic dermatitis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , Hypersensitivity growth syndrome, and inflammatory bowel disease, are present in the blood, urine, or feces of a patient suffering from inflammatory bowel disease.
  • Colon cancer liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer
  • the present inventors have found that the bacterium derived from the bacterium belonging to the genus Proteus according to the present invention is useful for the treatment of gastric cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, Cardiovascular diseases such as cardiovascular diseases such as cardiomyopathy such as cardiomyopathy, cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris, stroke, etc., neuropsychiatric diseases such as Parkinson's disease and depression, atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive lung Disease, etc. - Diagnosis method for inflammatory bowel disease such as respiratory disease, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, and foods, inhalants, cosmetics, medicines, etc. It is expected to be useful for use in for preventing, treating, and / or improve the composition.
  • Cardiovascular diseases such as cardiovascular diseases such as cardiomyopathy such as cardiomyopathy, cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris, stroke, etc.
  • FIG. 1A is a picture of distribution patterns of bacteria and vesicles after oral administration of bacteria and bacterial-derived vesicles (EVs) to a mouse.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 1B is a picture showing the distribution of bacteria and vesicles in the body by extracting blood, kidney, liver, and various organs at 12 hours after oral administration of bacteria and bacterial-derived vesicles (EV) to the mouse.
  • EV bacterial-derived vesicles
  • FIG. 2 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes in stool cancer patients, normal stool, blood, and urine.
  • Fig. 3 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes existing in colon cancer and normal human stool and urine.
  • FIG. 4 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes present in liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer patients and normal human blood.
  • FIG. 5 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes existing in lung cancer patients and normal blood.
  • FIG. 6 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes existing in breast cancer, ovarian cancer patients and normal human urine.
  • FIG. 7 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes present in bladder cancer patients and normal human blood and urine.
  • Fig. 8 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes present in prostate cancer patients and normal urine.
  • FIG. 9 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes existing in lymphoma, brain tumor patients and normal human blood.
  • FIG. 10 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes existing in diabetic patients and normal blood.
  • Fig. 11 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle meta-genome present in myocardial infarction, cardiomyopathy, atrial fibrillation, dysmorphic angina and normal human blood.
  • FIG. 12 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria in the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes existing in the blood of a stroke patient and a normal person.
  • Fig. 13 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes in Parkinson's disease, depression patients and normal human urine.
  • Fig. 14 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes present in atopic dermatitis patients and normal human blood.
  • Fig. 15 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from bacteria belonging to the genus Proteus after the analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes present in asthma, COPD patients and normal human blood.
  • FIG. 16 shows the results of a comparison of the distribution of vesicles derived from the bacteria belonging to the genus Proteus after the analysis of the bacterial-derived vesicle metagenomes present in hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease (IBD), and normal feces.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • FIG. 17A shows the results of observing the shape of vesicles by electron microscopy after culturing Proteus mirabilis in vitro, separating the vesicles from the culture solution.
  • 17B shows the result of measurement of the size of vesicles isolated from the culture medium of Proteus mirabilis by dynamic light scattering.
  • FIGS. 18A and 18B show the results of pretreatment of the vesicles derived from the Proteus fungus before the treatment of the E. coli EV, which is a pathogenic vesicle, to evaluate the anti-inflammatory effect of the vesicles derived from the Proteus mirabilis, -6 secretion (Fig. 18A) and TNF-a secretion (Fig. 18B).
  • FIG. 19 is a graph showing the effect of vesicles derived from various strains on the anti-inflammatory effect of the proteasum-labile vesicles.
  • NC negative control
  • PC positive control
  • L. pantalum positive control
  • plantarum Lactobacillus plantarum
  • FIG. 20 is a graph showing the effect of heat treatment or acid treatment on the anti-inflammatory effect of the proteasum bilberry-derived vesicles in the presence of protease mirabilis (PMR) treated with heat treatment or acid treatment before the E. coli EV treatment, which is a pathogenic vesicle, (NC: negative control; PC: positive control; L. plantarum).
  • PMR protease mirabilis
  • 21A is a protocol in which a vesicle derived from Proteus mirabilis is administered to a mouse to evaluate the anticancer efficacy of the parasite derived from Proteus mirabilis.
  • Fig. 21B shows the results of evaluating the effects of administration of a parasite derived from Proteus mirabilis on mice orally to tumorigenesis by cancer cells.
  • the present invention relates to a vesicle derived from bacteria belonging to the genus Proteus and a use thereof.
  • the present inventors have found that metagenomic analysis enables the diagnosis of cancers such as gastric cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma and brain tumor, myocardial infarction, cardiomyopathy, Allergic-respiratory diseases such as atopic dermatitis, asthma or chronic obstructive pulmonary disease, hypersensitivity syndromes or inflammatory bowel disease, such as cardiovascular diseases such as atrial fibrillation and stroke, metabolic diseases such as diabetes, Parkinson's disease, The inventors of the present invention have completed the present invention based on this finding.
  • cancers such as gastric cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma and brain tumor, myocardial infarction, cardiomyopathy, Allergic-respiratory diseases such as atopic dermatitis, asthma or chronic obstructive pulmonary disease, hypersensitivity syndrome
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, brain tumor, chronic obstructive pulmonary disease,
  • the present invention provides a method of providing information for diagnosis of at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression.
  • diagnosis means, in a broad sense, judging the actual condition of a patient in all aspects. The contents of the judgment are the pathology, etiology, pathology, severity, details of the disease, presence of complications, and prognosis. In the present invention, the diagnosis is to judge whether or not the cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disease, allergic-respiratory disease, or inflammatory bowel disease occurs and the level of disease.
  • Cancer as a diagnostic target disease of the present invention means a malignant tumor that rapidly grows while infiltrating into surrounding tissues and diffuses or transitions to each part of the body and is life-threatening.
  • Cells the smallest unit of the body, normally divide and grow by the regulatory function of the cells themselves, and when they reach the end of their life or become damaged, they self-destruct themselves and maintain an overall balance of numbers. If there is a problem with the regulation of the cell itself, the abnormally normal cells that are to die are over-proliferated, invading the surrounding tissues and organs, forming a mass, destroying or deforming the existing structure.
  • the cancer may preferably be gastric cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma or brain tumor.
  • cardiovascular disease means that a disease occurs in the cardiovascular system of a mammal, including, for example, heart disease such as myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, Vasculitis; Dementia, stroke, etc.
  • the cardiovascular diseases include, but are not limited to, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, or stroke.
  • metabolic disease used in the present invention means a disease in which complications occur in various organs due to metabolic disorders in the mammalian body.
  • the metabolic diseases include metabolic disorders such as hyperlipidemia and diabetes, And complications.
  • the metabolic diseases preferably include, but are not limited to, diabetes.
  • neuropsychiatric disease means a disease occurring in the nervous system and the brain of mammals such as brain diseases such as Parkinson's disease and dementia; Depression, obsessive compulsive disorder, asthma and the like.
  • the neuropsychiatric disorder preferably includes, but is not limited to, Parkinson's disease and depression.
  • allergic disease used in the present invention means a disease caused by an allergic mechanism in a mammal, and includes, for example, atopic dermatitis of the skin, allergic rhinitis of the respiratory system, asthma,
  • the allergic diseases preferably include, but are not limited to, atopic dermatitis and asthma.
  • respiratory disease used in the present invention means a disease occurring in the respiratory system of a mammal such as rhinitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, etc.
  • Respiratory diseases preferably include, but are not limited to, asthma, chronic obstructive pulmonary disease.
  • inflammatory bowel disease of the present invention means chronic inflammation of unknown origin occurring in the intestine, and broadly refers to infectious enteritis such as bacterial, viral, amoebic, tuberculous enteritis, Inflammatory bowel disease, ischemic bowel disease, and inflammatory bowel disease.
  • infectious enteritis such as bacterial, viral, amoebic, tuberculous enteritis, Inflammatory bowel disease, ischemic bowel disease, and inflammatory bowel disease.
  • the inflammatory bowel disease preferably includes, but is not limited to, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease.
  • Nanovesicle or " Vesicle " as used in the present invention means a structure composed of nano-sized membranes secreted from various bacteria.
  • Gram-negative bacteria-derived vesicles or outer membrane vesicles (OMVs) have not only lipopolysaccharides but also toxic proteins and bacterial DNA and RNA, as well as various metabolites, gram-positive bacteria -positive bacterial cells have protein and nucleic acid as well as peptidoglycan and lipoteichoic acid, which are bacterial cell wall components.
  • OMVs outer membrane vesicles
  • nano-vesicles or vesicles are naturally secreted or artificially produced in the bacterium of the genus Proteus, and have an average diameter of 10 to 200 nm.
  • the vesicles can be obtained by centrifugation, ultracentrifugation, extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freezing-thawing, electroporation, mechanical degradation, chemical treatment, filtration by filtration, gel filtration chromatography And may be separated using one or more methods selected from the group consisting of electrophoresis, electrophoresis, pre-flow electrophoresis, and capillary electrophoresis. Further, it may further include processes such as washing for removal of impurities and concentration of the resulting vesicles.
  • metagenome as used in the present invention is also referred to as " meta genome ", which means the total of all genomes including viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated region such as soil, It is used as a concept of a genome to explain the identification of many microorganisms at a time using a sequencer to analyze the microorganisms that are not.
  • a metagenome is not a genome or a genome, but a kind of mixed genome as a genome of all species of an environmental unit. This is a term derived from the viewpoint that when defining a species in the course of omics biology development, it functions not only as an existing species but also as a species that interacts with various species to form a complete species.
  • it is the subject of techniques that analyze all DNA and RNA regardless of species, identify all species in an environment, identify interactions, and metabolism using rapid sequencing.
  • the sample may be blood, urine, or feces, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for the treatment of gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma,
  • one or more diseases selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression
  • diseases selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, Prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression Thereby providing a drag inhaler composition.
  • diseases selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, Prevention or amelioration of one or more diseases selected from the group consisting of chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, asthma, myocardial infarction, cardiomyopathy, angina pectoris, atrial fibrillation, stroke, diabetes, Parkinson's disease and depression ≪ / RTI >
  • the composition comprises a food composition and a cosmetic composition.
  • prevention refers to the administration of a pharmaceutical composition according to the present invention to inhibit or prevent cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease It means all actions that delay.
  • treatment used in the present invention means that the symptoms of cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, neuropsychiatric disorder, allergic-respiratory disease, and inflammatory bowel disease are improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention It means all acts that benefitfully change.
  • &quot means all actions that at least reduce the degree of symptom associated with the condition being treated.
  • bacterial and bacterial-derived vesicles were orally administered to mice to evaluate the absorption, distribution, and excretion of bacteria and vesicles in the body.
  • the vesicles were not absorbed through the intestinal membrane, And was excreted through kidneys, liver, and the like (see Example 1).
  • blood of a normal control matched age in gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, brain tumor patients, , Urine, or feces were used to analyze bacterial metagenomes.
  • the samples from patients with gastric cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma and brain tumor were significantly reduced (See Example 3).
  • bacterial meta-genomic analysis is performed using vesicles isolated from samples of patients with diabetes, myocardial infarction, cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris, and stroke patients, Respectively.
  • vesicles isolated from samples of patients with diabetes, myocardial infarction, cardiomyopathy, atrial fibrillation, angina pectoris, and stroke patients Respectively.
  • bacterial metagenomic analysis was performed using parcels isolated from samples of patients with Parkinson ' s disease and depression, and with age matched to the patient. As a result, it was confirmed that the samples of patients suffering from Parkinson's disease and depression were significantly reduced in vesicles derived from bacteria in the genus Proteus (see Example 5).
  • bacterial metagenomics were performed using vesicles isolated from samples of atopic dermatitis, asthma, and chronic obstructive pulmonary disease, and normal persons matched with the age and sex of the patient. As a result, it was confirmed that the samples of patients suffering from atopic dermatitis, asthma, and chronic obstructive pulmonary disease had significantly decreased vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus, compared with normal samples (see Example 6).
  • the bacterial metagenomic analysis was performed using vesicles isolated from samples of patients with hypersensitivity syndrome and inflammatory bowel disease and normal age matched patients. As a result, it was confirmed that the samples from the patients with hypersensitivity growth syndrome and inflammatory bowel disease were significantly reduced in the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus in comparison with the normal samples (see Example 7).
  • the vesicles derived from Proteus mirabilis were subjected to heat treatment or acid treatment. Thereafter, the effect on the TNF- ⁇ secretion was evaluated by administering heat-treated or acid-treated vesicles to the macrophages before treating them with E. coli-derived vesicles. As a result, it was found that all of the vesicles derived from the proteasum- TNF-a < / RTI > secretion (see Example 10).
  • a cancer disease model was prepared by subcutaneously injecting a cancer cell line in order to evaluate whether or not the parasite secreted from the culture of the Proteus mirabilis strain exhibits an anticancer treatment effect, Derived vesicles were orally administered to mice 4 days prior to treatment with cancer cells and the size of cancer tissues was measured for 20 days. As a result, it was confirmed that the size of cancer tissues was significantly reduced when the vesicles were administered (See Example 11).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises a bacterium-derived vesicle of the genus Proteus as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers are those conventionally used in the field of application and include, but are not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, And may further contain other conventional additives such as antioxidants and buffers as needed.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be suitably formulated according to the respective ingredients using the methods disclosed in Remington's reference.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited to a formulation, but may be formulated into an injection, an inhalant, an external preparation for skin, or an oral ingestion agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenous, subcutaneous, skin, nasal, or airway) according to the desired method, The type of administration, the route of administration, and the time, but may be suitably selected by those skilled in the art.
  • composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dosage level is determined depending on the type of disease, severity, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition according to the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and can be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient. In general, 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg, It may be administered one to three times a day. However, the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.
  • the active ingredient can be added directly to the food or can be used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (for prevention or improvement).
  • the composition of the present invention is added in an amount of not more than 15% by weight, preferably not more than 10% by weight based on the raw material, in the production of food or beverage.
  • the amount may be less than the above range.
  • the food composition of the present invention has no particular limitation on the ingredients other than those containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratios and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • Natural flavors tau martin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used as flavors other than those described above .
  • the ratio of the above-mentioned natural carbohydrate can be appropriately determined by a person skilled in the art.
  • the food composition of the present invention can be used as a flavoring agent such as a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, Salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. These components may be used independently or in combination. The ratios of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the cosmetic composition of the present invention may contain components commonly used in cosmetic compositions as well as microcapsules derived from bacteria belonging to the genus Proteus, and may contain conventional additives such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, , And a carrier.
  • composition of the present invention may be used in combination with an organic ultraviolet screening agent that has been used in the past so long as it does not impair the skin protecting effect by reacting with the microbial virus derived from the bacteria belonging to the genus Proteus.
  • organic UV blocking agent examples include glyceryl paraben, drometrizol trisiloxane, drometrizol, dipaloyyl triolate, disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate, diethylhexylbutamidotriazone, diethylamino Hydroxybenzoylhexyl benzoate, di-methoxycinnamate, a mixture of Rawson and dihydroxyacetone, methylene bis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol, 4-methylbenzylidene camphor, menthyl anthranylate, benzophenone (Benzophenone-4), benzophenone-8 (dioxyphenylbenzone), butylmethoxydibenzoylmethane, bisethylhexyloxyphenol methoxyphenyltriazine, synoxate, ethyl dihydroxypropylparaben, Ethylhe
  • Examples of products to which the cosmetic composition of the present invention can be added include cosmetics such as astringent lotion, softening longevity lotion, nutrition lotion, various creams, essences, packs, foundation and the like, cleansing, cleanser, soap, .
  • Specific formulations of the cosmetic composition of the present invention include skin lotions, skin softeners, skin toners, astringents, lotions, milk lotions, moisturizing lotions, nutritional lotions, massage creams, nutritional creams, moisturizing creams, hand creams, essences, It includes formulations such as soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, latex, lipstick, makeup base, foundation, press powder, loose powder, eye shadow and the like.
  • the content of proteasome-derived vesicles of the present invention is 0.00001-30 wt%, preferably 0.5-20 wt%, more preferably 1.0-10 wt% to be.
  • the active ingredient may be directly added to the inhalant or may be used together with other ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (for prevention or treatment).
  • Example 1 Analysis of intestinal absorption, distribution, and excretion of intestinal bacteria and bacterial-derived parasites
  • Fig. 1A As a result of observation of the whole image of the mouse, as shown in Fig. 1A, when the bacterium was not absorbed systemically, the bacterium-derived vesicles were systemically absorbed at 5 minutes after the administration, And the vesicles were excreted in the urinary tract. It was also found that the vesicles were present in the body for up to 12 hours of administration (see FIG. 1A).
  • Example 2 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes in clinical samples
  • the DNA extracted by the above method was amplified using the 16S rDNA primer described above, followed by sequencing (Illumina MiSeq sequencer), outputting the result as a Standard Flowgram Format (SFF) file, and using GS FLX software (v2 .9) to convert the SFF file into a sequence file (.fasta) and a nucleotide quality score file, then verify the creditworthiness of the lead, and use the window (20 bps) average base call and the accuracy was less than 99% (Phred score ⁇ 20).
  • SFF Standard Flowgram Format
  • GS FLX software v2 .9
  • the genus is 94%, the family is 90 Clustering is performed based on the sequence similarity of 85% for order, 80% for class, 75% for phylum, and the phylum, class, order sequence, more than 97% sequence level at the genome level using the 16S RNA sequence database (108,453 sequence) of BLASTN and GreenGenes, Were profiled (QIIME).
  • Example 3 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes in clinical samples of cancer patients
  • the gene was extracted from the vesicles present in the urine and the metagenomic analysis was carried out to evaluate the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteas.
  • the vesicles derived from the bacteria in the stomach cancer were significantly decreased in the urine of the gastric cancer patients (normal vs vs stomach cancer: 1.8% vs 0.1%, p ⁇ 0.0001, p ⁇ 0.0001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the stool of 38 stools of colorectal cancer patients and 55 stools of normal control cells, and the results of the metagenomic analysis were analyzed. Respectively. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus were significantly decreased in the stool of the colon cancer patients compared with the normal stool (1.2% vs 0.05%, p ⁇ 0.001 in the normal vs. colorectal cancer patients, see FIG.
  • the genomic DNA was extracted from the vesicles present in the blood of 84 biliary tract blood and 132 normal control blood, and the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteus was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterium-derived vesicles in the blood of the biliary cancer patients were significantly decreased (0.7% vs 0.06%, p ⁇ 0.001) in normal patients and biliary cancer patients (see FIG. 4).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of 191 pancreatic cancer patients and 291 normal control blood samples, and then the metagenomic analysis was performed to evaluate the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteas. As a result, it was confirmed that the blood of the pancreatic cancer patient was significantly reduced in the proteasome-derived vesicles compared to the normal blood (0.7 vs 0.06% in normal vs. pancreatic cancer patients, p ⁇ 0.001, p ⁇ 0.001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of 318 lung cancer patients and 234 normal control patients by the method of Example 2, and the metagenomic analysis was performed. Then, the distribution of the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus was evaluated Respectively. As a result, it was confirmed that the blood of the lung cancer patients was significantly decreased in the proteasome-derived vesicles compared with the normal blood (0.7 vs 0.1%, p ⁇ 0.001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the urine and the metagenomic analysis was carried out. Then, the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the Proteus was evaluated Respectively. As a result, it was found that the vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus were significantly decreased in the urine of the breast cancer patients (normal vs. vs breast cancer: 1.4% vs 0.3%, p ⁇ 0.001, p ⁇ 0.001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of 96 bladder cancer patients and 184 normal control blood samples by the method of Example 2, followed by the metagenome analysis, and then the distribution of the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus was evaluated .
  • the vesicles derived from the bacterium in the bladder cancer patients were significantly decreased (normal vs. vs bladder cancer patients: 0.8% vs. 0.1%, p ⁇ 0.001) (see FIG. 7).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the urine and the metagenomic analysis was performed to evaluate the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteus. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus were significantly decreased in the urine of the bladder cancer patients compared to the normal urine (1.9% vs 0.1%, p ⁇ 0.000001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the urine by the method of Example 2 and the metagenome was analyzed.
  • the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteus Respectively.
  • the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus were significantly decreased in the urine of the prostate cancer patients compared to the normal urine (1.1% vs. 0.09%, p ⁇ 0.000001).
  • the genome was extracted from the vesicles present in the blood of 93 blood samples from lymphoma patients and 109 blood samples from a normal control sample, and the results of the metagenome analysis were analyzed.
  • the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteas Respectively.
  • the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus were significantly reduced (0.09% vs 0.00%, p ⁇ 0.001) in the blood of the lymphoma patients (normal vs non-lymphoma patients, p ⁇ 0.001).
  • the genomic DNA was extracted from the vesicles present in the blood of 84 brain samples and 92 normal control samples, and the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteas was evaluated. As a result, it was confirmed that the blood of the brain tumor patients was significantly decreased in the proteasome-derived vesicles compared to the normal blood (0.09% vs 0.01%, p ⁇ 0.01 in the normal vs.
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of the blood of 73 diabetic patients and the blood of 146 normal control patients by the method of Example 2, and the distribution of the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus was evaluated after performing the metagenome analysis. As a result, it was confirmed that the blood of the diabetic patients had a significant decrease in the vesicles derived from the bacteria in the proteasome (normal vs vs diabetic patients: 0.4% vs 0.01%, p ⁇ 0.01) (see FIG. 10).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of blood of 57 myocardial infarction patients and 163 normal control patients by the method of Example 2, and the metagenome was analyzed. Then, the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the proteas Respectively. As a result, it was confirmed that the blood of the myocardial infarction patient was significantly decreased in the blood of the proteus in the blood of the normal person (0.4% vs 0.07%, p ⁇ 0.01 in the normal persons vs myocardial infarction patients, p ⁇ 0.01).
  • the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus was evaluated after extracting the genes from the vesicles present in the blood of 72 blood samples from cardiomyopathy patients and 163 blood samples from normal control samples. As a result, it was confirmed that the blood of the patient with cardiomyopathy was significantly decreased in the blood of the proteus in the blood of the normal person (0.4% vs. 0.08% in normal persons vs. cardiomyopathy, p ⁇ 0.01) (see FIG. 11).
  • the genomic DNA was extracted from the vesicles present in the blood of 69 blood samples from atrial fibrillation patients and 103 blood samples from normal control samples, and the distribution of the microorganisms derived from the proteasome was evaluated. As a result, it was confirmed that the blood of the atrial fibrillation patients was significantly decreased in the blood of the proteus from the normal human blood (normal vs. Atrial fibrillation: 0.1% vs 0.01%, p ⁇ 0.01).
  • the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus was evaluated by extracting genes from the vesicles present in the blood of 32 blood samples from patients with angina pectoris and blood from 32 normal control samples. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from the genus Proteus were significantly reduced in the blood of the patients with angiotension (0.6% vs 0.1%, p ⁇ 0.05).
  • the blood samples from 87 stroke patients and 92 normal control samples were subjected to metagenome analysis by extracting genes from the vesicles present in the blood, and then evaluated for the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the genus Proteus. As a result, it was confirmed that the blood of the stroke patients had a significant decrease in the vesicles derived from the bacteria in the proteasome (normal vs. vs stroke patients: 0.3% vs 0.00%, p ⁇ 0.05).
  • Example 5 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes in clinical samples of neuropsychiatric patients
  • the urine of 39 patients with Parkinson's disease and the urine of 79 normal controls were extracted from the vesicles present in the urine by the method of Example 2 to perform metagenome analysis and the distribution of the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus was evaluated . As a result, it was confirmed that the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus were significantly reduced in the urine of patients with Parkinson's disease (normal vs. vs Parkinson's disease: 0.6% vs 0.02%, p ⁇ 0.0001, p ⁇ 0.0001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the urine and the metagenome was analyzed.
  • the distribution of the vesicles derived from the bacteria in the Proteus was evaluated Respectively. As a result, it was found that the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus were significantly decreased in the urine of the depressed patients (normal vs non-depressed patients: 1.7% vs. 0.06%, p ⁇ 0.01).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of the blood of 27 patients with atopic dermatitis and the blood of 138 normal control patients by the method of Example 2 and the metagenomic analysis was performed to evaluate the distribution of vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus .
  • the blood of the atypical dermatitis patients had a significant decrease in the vesicles derived from the bacteria of the genus Proteus (2.0% versus 0.06%, p ⁇ 0.00001 in normal persons vs atopic dermatitis patients, p ⁇ 0.00001).
  • the gene was extracted from the vesicles present in the blood of 291 asthmatic patients, 207 COPD patients, and 291 normal control patients by the method of Example 2, and meta genome analysis was performed , And then the distribution of the microbial-derived vesicles in the Proteus was evaluated.
  • the vesicles derived from bacteria in the genus Proteus were significantly decreased in the blood of patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease (normal vs non - asthmatic patients: 0.7% vs 0.08%, p ⁇ 0.01; Patients with chronic obstructive pulmonary disease: 0.7% vs 0.07%, p ⁇ 0.01) (see FIG. 15).
  • Example 7 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenomes in clinical samples of inflammatory bowel disease patients
  • genomic DNA was extracted from vesicles present in the stool of 91 stools of inflammatory bowel disease (IBD) and 99 normal control, The distribution of bacterial-derived vesicles was evaluated. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from bacteria in the genus Proteus were significantly decreased in the feces of the patients with inflammatory bowel disease (normal vs. non-inflammatory bowel disease: 1.9% vs 0.00%, p ⁇ 0.00001).
  • Example 8 Separation and characterization of vesicles in the culture medium of Proteus mirabilis
  • Proteus mirabilis strains isolated from clinical samples of various persons were cultured in an anaerobic chamber at 37 ° C in a brain heart infusion (BHI) medium until the absorbance (OD600) reached 1.0 to 1.5 Sub-culture. Subsequently, the supernatant containing the strain was recovered, centrifuged at 10,000 g for 15 minutes at 4 ° C, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter. The supernatant was filtered through a 100 kDa hollow filter membrane with a QuixStand benchtop system system, GE Healthcare, UK). The supernatant, which had been concentrated, was filtered once again with a 0.22 ⁇ m filter. Then, proteins were quantified using BCA assay. The following experiments were carried out on the vesicles obtained. The vesicles were separated from the culture medium of the Proteus mirabilis cultured according to the above method, and then the shape and size were evaluated by an electron microscope Respectively.
  • BHI brain heart infusion
  • Fig. 17A it was observed that the shape of the vesicles isolated from the culture medium of Proteus mirabilis was spherical and the size was smaller than 200 nm, and the size of the vesicle was found to be 37.8 ⁇ 13.5 nm.
  • the mouse macrophage cell line, Raw 264.7 cells was infected with the parasites isolated from the proteus mirabilis strain ( P. mirabilis EV) was treated with various concentrations (0.1, 1, 10 ⁇ ⁇ / ml) and E. coli- derived vesicles EV) to measure the secretion amount of inflammatory mediators (IL-6, TNF-a, etc.).
  • Raw 264.7 cells were plated at 1 ⁇ 10 5 in 24-well cell culture plates and cultured in DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) complete medium for 24 hours. Then, the culture supernatant was collected in a 1.5 ml tube and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. The supernatant was collected and stored at 4 ° C for ELISA analysis.
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Media
  • the capture antibody was diluted in PBS (phosphate buffered saline) and dispensed in a 96-well polystyrene plate in an amount of 50 ⁇ l to the working concentration, followed by overnight reaction at 4 ° C. After washing with 100 ⁇ l of PBST (PBS containing 0.05% tween-20) twice, 100 ⁇ l of RD (PBST containing 1% bovine serum albumin (BSA)) solution was added and blocked for 1 hour at room temperature. After blocking, the cells were washed twice with 100 ⁇ l of PBST, and then 50 ⁇ l of each sample and standard was dispensed at a concentration of 1 ⁇ g / ml and reacted at room temperature for 2 hours.
  • PBST PBS containing 0.05% tween-20
  • RD bovine serum albumin
  • the detection antibody was diluted with RD and dispensed in a volume of 50 ⁇ l according to the concentration. The reaction was carried out at room temperature for 2 hours. After washing twice with 100 ⁇ l of PBST, streptavidin-horseradish peroxidase (Streptavidin-horseradish peroxidase) was diluted to 1/200 in the RD, and the cells were reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Example 10 The anti-inflammatory action of parasites derived from Proteus mirabilis Acid-treated effect
  • Example 9 The anti-inflammatory effect of the standard strains of Proteus mirabilis and the isolates derived from the isolate strain was confirmed through Example 9, and further the stability of the vesicles and the characteristics of the active substances were investigated concretely.
  • three kinds of proteasum-labile vesicles (PMR101, PMR202 and PMR205) were boiled for 10 minutes at 100 ° C for 10 minutes and then subjected to acid treatment (pH 2.0) for 10 minutes to pretreat the macrophages (Raw 264.7) Respectively.
  • the parasites derived from bacteria in the genus Proteus were significantly reduced in the clinical samples of the cancer patients as compared with the normal persons. Further, the anticancer effect of the parasites was investigated in detail.
  • the parasites derived from Proteus mirabilis were orally administered to 6-week-old C57BL / 6 male mice and subcutaneously injected with a cancer cell line (CT26 cell) .
  • CT26 cell cancer cell line
  • the size of cancer tissues was measured until 20 days after the administration of cancer cells, and the cancer treatment effect was evaluated.
  • the size of cancer tissue was remarkably reduced in the mice to which the vesicle was orally administered compared with the group administered with the physiological saline orally (see Fig. 21B).
  • the bacterium-derived vesicles derived from the genus Proteus according to the present invention can be used for the treatment of cancer such as stomach cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, lymphoma, brain tumor, myocardial infarction, Allergic-respiratory diseases such as atopic dermatitis, asthma, and chronic obstructive pulmonary disease, hypersensitivity syndrome, inflammatory bowel disease, etc., which are caused by atopic dermatitis, cardiovascular diseases such as angina pectoris, stroke, metabolic diseases such as diabetes, Inflammatory bowel disease, and it is expected to be economical and applicable to a wide range of compositions for prevention, treatment, and / or improvement of foods, inhalants, cosmetics, and drugs, Functional foods, cosmetics industry, and the like.
  • cancer such as stomach cancer, colon cancer, liver cancer, biliary cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer,

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Abstract

본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 정상인에 비하여 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암 등의 암환자, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 아토피피부염 등의 알레르기-호흡기 질환, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 및 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환 환자의 샘플에 상기 소포가 유의하게 감소 되어 있고, 상기 소포는 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 억제함과 동시에 항암효능을 보임을 실험적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 프로테우스 속 세균 유래 소포는 암, 심혈관질환, 대사질환, 및 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환 및 염증성 장질환의 진단방법, 및 예방, 치료 및/또는 개선용 조성물을 개발하기 위한 목적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 프로테우스 속 세균에서 유래하는 나노소포를 이용한 만성염증을 특징으로 하는 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환의 진단방법, 및 상기 소포를 포함하는 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성질환의 중요성이 덜해지는 반면, 인간과 마이크로바이옴과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능 이상을 동반한 만성질환이 삶의 질과 인간 수명을 결정하는 주요 질환으로 질병패턴이 바뀌었다. 21세기 난치성 만성질환은 생활방식의 변화에 따라 원인인자에 반복적인 노출에 따른 면역기능 이상에 의해 발생하는 만성 염증반응을 특징으로 하는데, 이에는 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환 등이 국민보건에 큰 문제가 되고 있다.
세균에서 유래하는 원인인자에 대한 면역반응에는 인터류킨-17(interleukin-17) 사이토카인 분비를 특징으로 하는 Th17(T helper 17) 면역반응이 중요하고, 세균성 인자에 의한 인터류킨-6(interleukin-6, 이하 IL-6) 분비와 같은 선천면역반응이 Th17 세포로의 분화에 중요한 역할을 담당한다. 또한, 세균성 원인인자에 노출시 염증이 발생하는데, 이 과정에서 종양괴사인자-알파(tumer necrosis factor-α, 이하 TNF-α)와 같은 염증성 매개체가 분비되어, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환 등이 발생한다고 알려져 있다.
인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 우리 몸에 공생하는 진정세균 (bacteria) 및 고세균 (archaea)은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통하여 상피세포로 흡수되어 염증반응을 유도하고, 또한 림프관을 통해 우리 몸에 흡수된다. 우리 몸에 공생하는 세균에서 국소적으로 분비된 세균 유래 소포는 점막의 상피세포에 흡수되어 국소 염증반응을 유도하고, 우리 몸에 흡수되는 병원성 세균유래 소포는 혈액을 통해 각 장기로 분포하여 흡수된 장기에서 염증반응을 증가시켜 질병을 악화시킨다.
프로테우스 속(genus Proteus) 세균은 혐기성 그람음성간균으로서 요산분해효소(urease)를 통해 요소(urea)를 암모니아로 바꾸는데, 소변에서 요소를 암모니아로 바꾸어 소변을 알칼리화 시킨다. 상기 세균 중에서 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균은 병원성 세균으로 알려져 있고, 사람에서 프로테우스 속 세균 감염의 90%를 차지한다. 상기 프로테우스 속 세균은 인간의 소화기관에 공생할 뿐만 아니라, 토양과 물 등의 환경에도 널리 서식하는 것으로 알려져 있다.
한편, 바실러스속 세균이나 유산균 유래의 세포밖 소포체를 이용하여 질병을 치료하는 발명은 공개되어 있으나(KR 10-1862507, KR 10-1726488), 현재까지 프로테우스 속 세균이 세포밖으로 소포를 분비한다는 사실이 보고되지 않았고, 특히 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환 등의 질환에 대한 진단 및 치료에 응용한 사례는 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명에서는 프로테우스 속 세균 유래 소포가 정상인에 비하여 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환 환자의 임상 샘플에 유의하게 감소되어 있음을 확인하여 질병을 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 프로테우스 세균 배양액에서 분리한 소포를 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 메타게놈 분석을 통해 정상인에 비하여 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 및 뇌종양 등의 암, 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 및 뇌졸중 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환, 아토피피부염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 등의 알레르기-호흡기질환, 과민성장증후군, 염증성장염 등의 염증성 장질환 환자 유래 샘플에서 프로테우스 속 세균 유래 소포의 함량이 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다.
또한, 프로테우스 속 세균에 속하는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균에서 소포를 분리하여 염증세포에 처리하였을 때, 병원성 소포에 의한 TNF-α 분비를 현저히 억제할 뿐만 아니라, 마우스 암질환 모델에서 항암효능을 평가한 결과, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 유래 소포를 경구로 투여한 경우 암 발생이 현저히 억제됨을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방, 치료, 및/또는 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로 부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로테우스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병으로 판정하는 단계.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로테우스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병으로 판정하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 (a) 단계에서 샘플은 혈액, 소변, 또는 대변일 수 있다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 흡입제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질병의 예방 또는 개선용 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물 일 수 있다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포의, 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 암은 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 또는 뇌종양 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 심혈관질환은 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 또는 뇌졸중일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 대사질환은 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경-정신질환은 파킨슨병 또는 우울증일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알레르기-호흡기질환은 아토피피부염, 천식, 또는 만성폐쇄성폐질환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증성 장질환은 과민성장증후군, 또는 염증성장염일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 프로테우스 속 세균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프로테우스 속 세균 유래 소포는 프로테우스 미라빌리스에서 분비되는 것일 수 있다.
본 발명자들은 장내 세균인 경우에는 체내에 흡수되지 않지만, 세균유래 소포인 경우에는 상피세포를 통해 체내에 흡수되어, 전신적으로 분포하고, 콩팥, 간, 폐를 통해 체외로 배설됨을 확인하였고, 환자 혈액, 소변, 또는 대변 등에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 통해 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 등의 암, 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 뇌졸중 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환, 아토피피부염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD) 등의 알레르기-호흡기질환, 과민성장증후군, 염증성장염 등의 염증성 장질환 환자의 혈액, 소변, 또는 대변에 존재하는 프로테우스 속 세균 유래 소포가 정상인에 비하여 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다. 또한, 프로테우스 속 세균의 한 종인 프로테우스 미라빌리스를 체외에서 배양하여 소포를 분리하여, 체외에서 염증세포에 투여하였을 때, 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 유의하게 억제하였고, 상기 소포를 마우스에 경구로 투여하였을 때, 암 발생이 유의하게 억제됨을 관찰하였는 바, 본 발명에 따른 프로테우스 속 세균 유래 소포는 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 등의 암, 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 뇌졸중 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환, 아토피피부염, 천식, 만성폐쇄성폐질환 등의 알레르기-호흡기질환, 과민성장증후군, 염증성장염 등의 염증성 장질환에 대한 진단방법, 및 식품, 흡입제, 화장품, 혹은 약물 등의 예방용, 치료용, 및/또는 개선용 조성물에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 마우스에 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 1b는 마우스에 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액, 콩팥, 간, 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 위암 환자 및 정상인 대변, 혈액, 및 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 3은 대장암 환자 및 정상인 대변 및 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 4는 간암, 담도암, 췌장암 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 5는 폐암 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 6은 유방암, 난소암 환자 및 정상인 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 7은 방광암 환자 및 정상인 혈액 및 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 8은 전립선암 환자 및 정상인 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 9는 림프종, 뇌종양 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 10은 당뇨병 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 11은 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 12는 뇌졸중 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 13은 파킨슨병, 우울증 환자 및 정상인 소변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 14는 아토피피부염 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 15는 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD) 환자 및 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 16은 과민성장증후군, 염증성장염(IBD) 환자 및 정상인 대변에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 17a는 프로테우스 미라빌리스를 체외에서 배양한 후 배양액에서 소포를 분리하여 전자현미경으로 소포의 모양을 관찰한 결과이다.
도 17b는 프로테우스 미라빌리스 배양액에서 분리한 소포의 크기를 동적광산란법으로 측정한 결과이다.
도 18a 및 도 18b는 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV) 처리 전에 프로테우스균 유래 소포를 전처리하여, 대장균 소포에 의한 염증매개체인 IL-6 분비(도 18a) 및 TNF-α 분비(도 18b)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 19는 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 여러 가지 균주에서 유래한 소포의 영향을 비교하기 위하여, 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV) 처리 전에 여러 사람에서 분리한 프로테우스 미라빌리스 (PMR) 유래 소포를 전처리하여, 대장균 소포에 의한 TNF-α 분비에 미치는 영향을 평가한 결과이다 (NC: 음성대조군(negative control); PC: 양성대조군(positive control); L. 플란타럼(plantarum): 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)).
도 20은 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과에 대한 열처리 또는 산처리의 영향을 평가하기 위하여, 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV) 처리 전에 열처리 또는 산처리한 프로테우스 미라빌리스 (PMR) 유래 소포를 전처리하여, 대장균 소포에 의한 TNF-α 분비에 미치는 영향을 평가한 결과이다 (NC: 음성대조군(negative control); PC: 양성대조군(positive control); L. 플란타럼(plantarum): 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)).
도 21a는 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항암효능을 평가하기 위하여, 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 마우스에 투여한 프로토콜이다.
도 21b는 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 마우스 경구로 투여하여, 암세포에 의한 종양발생에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 메타게놈 분석을 통해 정상인에 비하여 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 등의 암, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환, 아토피피부염, 천식 또는 만성폐쇄성폐질환 등의 알레르기-호흡기질환, 과민성장증후군 또는 염증성 장염 등의 염증성 장질환 환자 유래 샘플에서 프로테우스 속 세균유래 소포의 함량이 현저히 감소되어 있음을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로테우스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병으로 판정하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 또는 염증성 장질환의 발병 여부 및 질환의 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 진단 대상 질병인 "암(cancer)"은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성종양(malignant tumor)을 의미한다. 신체를 구성하는 가장 작은 단위인 세포(cell)는 정상적으로는 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지하나, 여러 가지 원인에 의해 이러한 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키게 된다. 본 발명에 있어서, 암은 바람직하게는 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종 또는 뇌종양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "심혈관질환(cardiovascular disease)"은, 포유동물의 심혈관계통에 질병이 발생하는 것을 의미하며, 예컨대, 심근경색, 심근병증, 협심증, 부정맥 등의 심장질환; 혈관염; 치매, 뇌졸중 등의 뇌혈관질환 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 심혈관질환은 바람직하게는 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 또는 뇌졸중을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사질환(metabolic disease)"은, 포유동물의 체내에서 대사장애에 의해 여러 장기에 합병증이 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대, 고지혈증, 당뇨 등의 대사장애, 및 이의 합병증으로 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 대사질환은 바람직하게는 당뇨병을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "신경-정신질환(neuropsychiatric disease)"은, 포유동물의 신경계통 및 뇌에 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대, 파킨슨병, 치매 등의 뇌질환; 우울증, 강박장애, 조현병 등의 정신질환 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 신경-정신질환은 바람직하게는 파킨슨병, 우울증을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "알레르기질환(allergic disease)"은, 포유동물에서 알레르기 기전에 의해 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대, 피부의 아토피피부염, 호흡기계의 알레르기비염, 천식 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 알레르기질환은 바람직하게는 아토피피부염, 천식을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "호흡기질환(respiratory disease)"은, 포유동물의 호흡기계에 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대, 비염, 천식, 만성폐쇄성폐질환 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 호흡기질환은 바람직하게는 천식, 만성폐쇄성폐질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "염증성 장질환(inflammatory bowel disease)"은 장에 발생하는 원인불명의 만성적인 염증을 뜻하는 것으로, 넓은 의미로는 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환을 모두 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 염증성 장질환은 바람직하게는 과민성장증후군, 염증성 장염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "나노소포(Nanovesicle)"혹은 “소포(Vesicle)”란, 다양한 세균에서 분비되는 나노크기의 막으로 된 구조물을 의미한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포, 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs)는 내독소(lipopolysaccharide) 뿐만 아니라 독성 단백질 및 세균 DNA와 RNA, 및 여러 가지 대사산물도 가지고 있고, 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포는 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있다. 본 발명에 있어서, 나노소포 혹은 소포는 프로테우스 속 세균에서 자연적으로 분비되거나 또는 인공적으로 생산하는 것으로, 10 내지 200 nm의 평균 직경을 가지고 있다.
상기 소포는 프로테우스 속 세균을 포함하는 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈, 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다.
본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 소변, 또는 대변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 흡입제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함 하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 식품 조성물 및 화장료 조성물을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암, 심혈관질환, 대사질환, 신경-정신질환, 알레르기-호흡기질환, 및 염증성 장질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 세균 및 세균유래 소포를 마우스 경구로 투여하여 세균 및 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상을 평가하여, 세균인 경우에는 장점막을 통해 흡수되지 않는데 비해 소포는 투여 5분 이내에 흡수되어 전신적으로 분포하고, 신장, 간 등을 통해 배설됨을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 환자, 및 상기 암 환자에 연령을 매칭한 정상대조군의 혈액, 소변, 또는 대변에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 환자의 샘플에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 당뇨병, 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 및 뇌졸중 환자, 및 상기 환자의 연령을 매칭한 정상인의 샘플에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 당뇨병, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 및 뇌졸중 환자의 샘플에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 파킨슨병 및 우울증 환자, 및 상기 환자의 연령을 매칭한 정상인의 샘플에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 파킨슨병 및 우울증 환자의 샘플에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 아토피피부염, 천식, 및 만성폐쇄성폐질환 환자, 및 상기 환자의 연령 및 성별을 매칭한 정상인의 샘플에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 아토피피부염, 천식, 및 만성폐쇄성폐질환 환자의 샘플에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 과민성장증후군 및 염증성장염 환자, 및 상기 환자의 연령을 매칭한 정상인의 샘플에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 과민성장증후군 및 염증성장염 환자의 샘플에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 실시예 결과를 바탕으로 프로테우스 속 세균에 속하는 프로테우스 미라빌리스 종 세균유래 소포의 특성을 분석하기 위해 더욱 연구한 결과, 상기 소포는 평균직경이 200 nm 보다 작고, 바람직하게는 41.40 ± 5.03 nm 크기의 원형임을 확인하였다(실시예 8 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로테우스 미라빌리스 균주를 배양하여 이로부터 분비된 소포가 항염증 효과를 나타내는지를 평가하였는데, 여러 사람에서 분리한 프로테우스 미라빌리스 균주를 배양한 후, 다양한 농도의 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 대식세포에 처리한 후, 염증질환, 대사질환, 및 암의 원인인자인 대장균 유래 소포를 처리하여 염증매개체 분비를 평가한 결과, 프로테우스 미라빌리스의 유래와 상관없이 프로테우스 미라빌리스 유래 소포 모두가 대장균 유래 소포에 의한 TNF-α 분비를 효율적으로 억제함을 확인하였다(실시예 9 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로테우스 미라빌리스의 항염증 효과를 나타내는 유효물질이 소포에 포함된 저분자화합물 또는 단백질인지를 평가하기 위하여, 프로테우스 미라빌리스 유래 소포에 열처리 또는 산처리를 하였다. 이후, 대식세포에 대장균 유래 소포를 처리하기 전에 열처리 또는 산처리한 소포를 투여하여 TNF-α 분비에 미치는 영향 평가한 결과, 열처리 또는 산처리한 프로테우스 미라빌리스 유래 소포 모두가 대장균 유래 소포에 의한 TNF-α 분비를 효율적으로 억제함을 확인하였다(실시예 10 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로테우스 미라빌리스 균주를 배양하여 이로부터 분비된 소포가 항암 치료효과를 나타내는지를 평가하기 위하여, 암세포주를 피하로 주사하여 암질환 모델을 만들었고, 상기 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 암세포주 처처 4일전부터 마우스에 경구로 투여한 후 20일간 암조직의 크기를 측정한 결과, 상기 소포를 투여한 경우에, 대조군에 비하여 암조직의 크기가 현저히 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 11 참고).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 프로테우스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 프로테우스 속 세균 유래 소포뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 프로테우스 속 세균 유래 소포 이외에, 프로테우스 속 세균 유래 소포와 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로테우스 속 세균 유래 소포의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-30 중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-10 중량%이다.
본 발명의 흡입제 조성물에서 유효성분을 흡입제에 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 치료용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다.
마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 세균인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균유래 소포인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 후 3시간에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다(도 1a 참조).
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 후, 투여 12시간 후에 혈액, 심장, 간, 신장, 비장, 지방, 근육을 채취하였다.
채취한 조직에서 형광을 관찰한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 세균 유래 소포가 혈액, 심장, 폐, 간, 콩팥, 비장, 지방, 근육, 신장에 분포하였으나, 세균은 흡수되지 않음을 알 수 있었다(도 1b 참조).
실시예 2. 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
혈액, 소변, 대변 등의 임상샘플을 먼저 10 ml 튜브에 넣고 원심분리법(3,500 x g, 10min, 4℃)으로 부유물을 가라앉히고 상등액만을 새로운 10 ml 튜브에 옮겼다. 0.22㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브 (centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리며 10 ml 까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, 타입 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 펠렛(pellet)을 PBS(phosphate buffered saline)로 녹였다.
상기 방법으로 분리한 소포 100㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고 그 후 얼음에 5분 동안 식힌 뒤 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모았다. 그리고 나노드랍(Nanodrop)을 이용하여 DNA 양을 정량한 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA 프라이머(primer)로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
상기 방법으로 추출한 DNA를 상기의 16S rDNA 프라이머를 사용하여 증폭을 한 다음 시퀀싱을 수행하고 (Illumina MiSeq sequencer), 결과를 스텐다드 플로우그램 포맷(Standard Flowgram Format, SFF) 파일로 출력하고 GS FLX 소프트웨어 (v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 시퀀스 파일 (.fasta)과 뉴클레오티드 퀄리티 스코어(nucleotide quality score)파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, 윈도우 (20 bps) 평균 베이스 콜 에큐러시(base call accuracy)가 99% 미만 (Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 운영분류단위(Operational Taxonomy Unit, OTU) 분석을 위해서는 유클러스트(UCLUST)와 유서치(USEARCH)를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하고, 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 운영분류단위의 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 레벨의 분류를 수행하고, 블라스트N(BLASTN)과 그린진(GreenGenes)의 16S RNA 시퀀스 데이터베이스 (108,453 시퀀스)를 이용하여 속 수준에서 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 세균을 프로파일링 하였다 (QIIME).
실시예 3. 암 환자 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
실시예 2의 방법으로 위암환자 55명의 대변과 정상대조군 99명의 대변을 대상으로, 대변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 대변에 비하여 위암환자의 대변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 위암환자: 1.1% vs 0.05%, p< 0.001) (도 2 참조).
또한, 위암환자 67명의 혈액과 정상대조군 198명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 위암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 위암환자: 1.3% vs 0.2%, p=< 0.001) (도 2 참조).
또한, 위암환자 61명의 소변과 정상대조군 120명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 위암환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 위암환자: 1.8% vs 0.1%, p<0.0001) (도 2 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 대장암환자 38명의 대변과 정상대조군 55명의 대변을 대상으로, 대변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 대변에 비하여 대장암환자의 대변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 대장암환자: 1.2% vs 0.05%, p<0.001) (도 3 참조).
또한, 대장암환자 38명의 소변과 성별과 연령을 매칭한 정상대조군 38명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 대장암환자의 대변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 대장암환자: 1.3% vs 0.06%, p<0.001) (도 3 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 간암환자 94명의 혈액과 정상대조군 152명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 간암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 간암환자: 0.7% vs 0.01%, p<0.001) (도 4 참조).
또한, 담도환자 84명의 혈액과 정상대조군 132명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 담도암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 담도암환자: 0.7% vs 0.06%, p<0.001) (도 4 참조).
또한, 췌장암환자 191명의 혈액과 정상대조군 291명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 췌장암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 췌장암환자: 0.7% vs 0.06%, p<0.001) (도 4 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 폐암환자 318명의 혈액과 정상대조군 234명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 폐암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 폐암환자: 0.7% vs 0.1%, p<0.001) (도 5 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 유방암환자 127명의 소변과 정상대조군 220명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 유방암환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 유방암환자: 1.4% vs 0.3%, p<0.001) (도 6 참조).
또한, 난소암환자 136명의 소변과 정상대조군 136명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 난소암환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 난소암환자: 1.1% vs 0.1%, p<0.001) (도 6 참조).
또한 실시예 2의 방법으로 방광암환자 96명의 혈액과 정상대조군 184명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 방광암환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 방광암환자: 0.8% vs 0.1%, p<0.001) (도 7 참조).
또한, 방광암환자 95명의 소변과 정상대조군 157명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 방광암환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 방광암환자: 1.9% vs 0.1%, p<0.000001) (도 7 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 전립선암환자 53명의 소변과 정상대조군 159명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 전립선암환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 전립선암환자: 1.1% vs 0.09%, p<0.000001) (도 8 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 림프종환자 93명의 혈액과 정상대조군 109명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 림프종환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 림프종환자: 0.09% vs 0.00%, p<0.001) (도 9 참조).
또한, 뇌종양환자 84명의 혈액과 정상대조군 92명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 뇌종양환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 뇌종양환자: 0.09% vs 0.01%, p<0.01) (도 9 참조).
실시예 4. 당뇨병 및 심혈관질환 환자 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
실시예 2의 방법으로 당뇨병환자 73명의 혈액과 정상대조군 146명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 당뇨병환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 당뇨병환자: 0.4% vs 0.01%, p<0.01) (도 10 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 심근경색환자 57명의 혈액과 정상대조군 163명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 심근경색환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 심근경색환자: 0.4% vs 0.07%, p<0.01) (도 11 참조).
또한, 심근병증환자 72명의 혈액과 정상대조군 163명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 심근병증환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 심근병증환자: 0.4% vs 0.08%, p<0.01) (도 11 참조).
또한, 심방세동환자 69명의 혈액과 정상대조군 103명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 심방세동환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 심방세동환자: 0.1% vs 0.01%, p<0.01) (도 11 참조).
또한, 이형협심증환자 32명의 혈액과 정상대조군 32명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 이형협심증환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 이형협심증환자: 0.6% vs 0.1%, p<0.05) (도 11 참조).
또한, 뇌졸중환자 87명의 혈액과 정상대조군 92명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 뇌졸중환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 뇌졸중환자: 0.3% vs 0.00%, p<0.05) (도 12 참조).
실시예 5. 신경정신질환 환자 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
실시예 2의 방법으로 파킨슨병환자 39명의 소변과 정상대조군 79명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 파킨슨병환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 파킨슨병환자: 0.6% vs 0.02%, p<0.0001) (도 13 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 우울증환자 20명의 소변과 정상대조군 20명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 우울증환자의 소변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 우울증환자: 1.7% vs 0.06%, p<0.01) (도 13 참조).
실시예 6. 알레르기 및 호흡기질환 환자 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
실시예 2의 방법으로 아토피피부염환자 27명의 혈액과 정상대조군 138명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 아토피피부염환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 아토피피부염환자: 2.0% vs 0.06%, p<0.00001) (도 14 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 천식환자 291명, 만성폐쇄성폐질환(COPD)환자 207명, 및 정상대조군 291명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 천식환자 및 만성폐쇄성폐질환환자의 혈액에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 천식환자: 0.7% vs 0.08%, p<0.01; 정상인 vs 만성폐쇄성폐질환환자: 0.7% vs 0.07%, p<0.01) (도 15 참조).
실시예 7. 염증성 장질환 환자 임상샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
실시예 2의 방법으로 과민성장증후군(irritable bowel syndrome, IBS)환자 57명의 혈액과 정상대조군 58명의 대변을 대상으로, 대변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 대변에 비하여 과민성장증후군환자의 대변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 과민성장증후군환자: 1.9% vs 0.00%, p<0.00001) (도 16 참조).
또한, 실시예 2의 방법으로 염증성장염(inflammatory bowel disease, IBD)환자 91명 및 정상대조군 99명의 대변을 대상으로, 대변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 프로테우스 속 세균유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 대변에 비하여 염증성장염환자의 대변에 프로테우스 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 염증성장염환자: 1.9% vs 0.00%, p<0.00001) (도 16 참조).
실시예 8. 프로테우스 미라빌리스 배양액에서 소포 분리 및 특성 분석
상기 실시예 2에서 7의 결과를 바탕으로, 프로테우스속 세균유래 소포의 기능을 평가하고자, 프로테우스 속 세균의 하나인 프로테우스 미라빌리스 균주를 배양한 후 이의 소포를 분리하여 특성을 분석하였다.
여러 사람의 임상샘플에서 분리한 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균주를 37℃ 혐기성 챔버에서 흡광도(OD600)가 1.0~1.5가 될 때까지 브레인 하트 인퓨전(brain heart infusion, BHI) 배지에서 배양한 후 서브-컬쳐(sub-culture) 하였다. 이후 균주가 포함되어 있지 않은 배지 상등액을 회수하여 10,000 g, 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하고 0.45 μm 필터에 거른 후 거른 상등액을 100 kDa 할로우(hollow) 필터 맴브레인으로 퀵스스텐드 벤치탑 시스템(QuixStand benchtop system, GE Healthcare, UK)을 이용하여 200 ㎖ 부피로 농축하였다. 이후 농축시킨 상등액을 다시 한번 0.22 μm 필터로 필터링 하였다. 이후 BCA 어세이(assay)를 이용해 단백질을 정량하였고, 얻어진 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였으며 상기 방법에 따라 배양한 프로테우스 미라빌리스의 배양액에서 소포를 분리한 후 전자현미경을 통해 모양과 크기를 평가하였다.
그 결과, 도 17a에 나타낸 바와 같이, 프로테우스 미라빌리스 배양액에서 분리한 소포의 모양은 구형이며, 크기는 200 nm보다 작은 것을 관찰하였고, 도 17b에 나타낸 동적광산란법 측정 결과를 통해 상기 소포의 크기는 37.8 ± 13.5 nm임을 확인하였다.
실시예 9. 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과
프로테우스 미라빌리스 유래 소포가 염증세포에서 염증매개체 분비에 대한 영향을 알아보기 위해, 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에 프로테우스 미라빌리스 균주에서 분리한 소포(P. mirabilis EV)를 다양한 농도(0.1, 1, 10 ㎍/㎖)로 처리한 후, 병원성 소포인 대장균 유래 소포 (E. coli EV)를 처리하여 염증매개체 (IL-6, TNF-α 등)의 분비량을 측정하였다.
보다 구체적으로, Raw 264.7 세포를 1 x 105 개씩 24-웰 세포 배양 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media) 완전배지에서 배양시켰다. 이후, 배양 상층액을 1.5 ml 튜브에 모아 3000 g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 모아 4 ℃에 보관해두었다가 엘라이자(ELISA) 분석을 진행하였다.
엘라이자 분석을 위해, 캡쳐 항체를 PBS(phosphate buffered saline)에 희석시켜 96 웰 폴리스티렌(96 well polystyrene) 플레이트에 작용 농도에 맞게 50 μl 씩 분주한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안(overnight) 반응시켰다. 이후 PBST (0.05 % tween-20이 들어있는 PBS) 용액 100 μl로 두 번씩 씻어준 후, RD(1 % bovin serum albumin(BSA) 가 들어있는 PBST) 용액 100 μl을 분주하여 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 한 후, 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, 샘플 및 스탠다드를 농도에 맞게 50 μl씩 분주하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, 디텍션(detection) 항체를 RD에 희석시켜 작용 농도에 맞게 50 μl씩 분주하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 또 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-horseradish peroxidase를 RD에 1/200으로 희석시켜 50 μl씩 분주하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 마지막으로 PBST 100 μl로 세 번 씻어준 후, TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine) 기질과 0.04 % 과산화수소수를 1:1 혼합한 용액 50 μl를 분주한 후 발색을 기다리다가 5분에서 20분 후 발색이 진행되었을 때, 1 M 황산용액을 50 μl씩 분주해 반응을 멈추고 시너지사의 HT 멀티-디텍션 마이크로플레이트 리더(Synergy™ HT multi-detection microplate reader)를 이용해 (BioTek, USA) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 전 처리 한 경우, 대장균 유래 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비가 현저히 억제됨을 확인하였다(도 18a 및 도 18b 참조).
또한, 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과에 프로테우스 미라빌리스의 아형의 영향을 평가하기 위하여, 여러 사람에서 분리한 5가지의 프로테우스 미라빌리스 분리균주 유래 소포(PMR201, PMR202, PMR203, PMR204, PMR205)를 다양한 농도로 12시간 동안 전처리하고, 병원성 소포인 대장균 유래 소포 1㎍/㎖를 12시간 처리하였다. 배양 상층액을 1.5 ml 튜브에 모아 3000 g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 모아 4 ℃에 보관해두었다가 엘라이자를 수행하였다.
그 결과, 프로테우스 미라빌리스 분리균주 유래 소포를 전처리한 경우, 프로테우스 미라빌리스 표쥰균주 유래 소포 (PMR101)와 마찬가지로 대장균 유래 소포에 의한 TNF-α의 분비를 현저히 억제함을 확인하였다 (도 19 참조). 특히 유용미생물 대조군인 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 유래 소포보다 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 전처리에 의한 TNF-α의 분비 억제효과가 큼을 확인하였다 (도 19 참조).
이는 대장균 유래 소포와 같은 병원성 소포에 의해 유도되는 염증반응을 프로테우스 미라빌리스 분리균주 유래 소포가 아형에 상관없이 염증반응을 효율적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 10. 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 작용에 열 또는 산처리의 효과
상기 실시예 9를 통해 프로테우스 미라빌리스 표준균주 및 분리균주 유래 소포의 항염증 효과를 확인하였고, 나아가 상기 소포의 안정성 및 유효물질의 특성을 구체적으로 알아보고자 하였다. 이를 위해, 100℃에서 10분간 끓이거나 10분간 산 처리 (pH 2.0)를 한 3종의 프로테우스 미라빌리스 유래 소포 (PMR101, PMR202, PMR205)를 대식세포(Raw 264.7)에 전처리하여 항염증 효과를 평가하였다.
그 결과, 소포를 100℃에서 끓이거나 산 처리를 하여도 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항염증 효과가 유지됨을 확인하였다 (도 20 참조). 이는 프로테우스 미라빌리스 유래 소포가 높은 온도와 산에 안정함을 의미하고, 또한 프로테우스 미라빌리스 유래 소포에서 항염증효과를 나타내는 것은 단백질 성분이 아님을 의미한다.
실시예 11. 프로테우스 미라빌리스 유래 소포의 항암 효과
상기 실시예를 통해 정상인에 비하여 암환자의 임상샘플에 프로테우스속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였는바, 나아가 상기 소포의 항암효과를 구체적으로 알아보고자 하였다. 이를 위해, 도 21a에 그림으로 도시한 바와 같이, 프로테우스 미라빌리스 유래 소포를 6 주령 C57BL/6 수컷 마우스에 경구로 투여하여, 투여 4일째에 암세포주 (CT26 cell)를 피하로 주사하여 암모델을 만들었다. 암세포주를 투여한 후 20일째까지 암조직의 크기를 측정하여, 암치료효과를 평가하였다. 그 결과, 생리식염수 경구투여군에 비하여 상기 소포를 경구로 투여한 마우스에서 암조직의 크기가 현저히 줄어들었다(도 21b 참조).
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 프로테우스 속 세균 유래 소포는 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양 등의 암, 심근경색, 심근병증, 심방세동, 이형협심증, 뇌졸중 등의 심혈관질환, 당뇨병 등의 대사질환, 파킨슨병, 우울증 등의 신경-정신질환, 아토피피부염, 천식, 만성폐쇄성폐질환 등의 알레르기-호흡기질환, 과민성장증후군, 염증성장염 등의 염증성 장질환과 같이 다양한 질병의 진단방법에 이용될 수 있어 경제적이고, 식품, 흡입제, 화장품, 혹은 약물 등의 예방용, 치료용, 및/또는 개선용 조성물등 다양한 범위에 적용될 것으로 기대되므로 의료, 기능성 식품, 화장품 산업과 같이 다양한 산업분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 샘플은 혈액, 소변, 또는 대변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 하기의 단계를 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 진단방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병으로 판정하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 샘플은 혈액, 소변, 또는 대변인 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  5. 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 소포는 프로테우스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 프로테우스 속 세균 유래 소포는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 흡입제 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 소포는 프로테우스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 흡입제 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 프로테우스 속 세균 유래 소포는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 흡입제 조성물.
  12. 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 소포는 프로테우스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 프로테우스 속 세균 유래 소포는 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  16. 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료방법.
  17. 프로테우스(Proteus) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 림프종, 뇌종양, 만성폐쇄성폐질환, 아토피 피부염, 과민성장증후군, 염증성 장염, 천식, 심근경색, 심근병증, 이형협심증, 심방세동, 뇌졸중, 당뇨병, 파킨슨병 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용도.
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