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WO2018008895A1 - 프로피오니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 - Google Patents

프로피오니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 Download PDF

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WO2018008895A1
WO2018008895A1 PCT/KR2017/006889 KR2017006889W WO2018008895A1 WO 2018008895 A1 WO2018008895 A1 WO 2018008895A1 KR 2017006889 W KR2017006889 W KR 2017006889W WO 2018008895 A1 WO2018008895 A1 WO 2018008895A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vesicles
derived
propionibacterium
diseases
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/006889
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
반창일
전진성
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
POSTECH Academy Industry Foundation
MD Healthcare Inc
Original Assignee
POSTECH Academy Industry Foundation
MD Healthcare Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020170081782A external-priority patent/KR101923969B1/ko
Application filed by POSTECH Academy Industry Foundation, MD Healthcare Inc filed Critical POSTECH Academy Industry Foundation
Priority to JP2019500448A priority Critical patent/JP6808011B2/ja
Priority to US16/315,683 priority patent/US11193173B2/en
Priority to EP17824451.3A priority patent/EP3483284B1/en
Priority to CN201780042554.XA priority patent/CN109715832B/zh
Publication of WO2018008895A1 publication Critical patent/WO2018008895A1/ko
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to nano-vesicles derived from the bacteria of the genus Propionibacterium, and more specifically, to a method for diagnosing cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases using nano-vesicles derived from propionium bacteria. And a prophylactic or therapeutic composition comprising the vesicles.
  • microbiota refers to a microbial community including bacteria, archaea and eukarya that exist in a given settlement.Intestinal microbiota is an important role in human physiology. It is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • the symbiotic bacteria secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes and proteins in other cells.
  • the mucous membrane forms a physical protective film that particles larger than 200 nanometers (nm) in size can't pass through, so that the symbiotic bacteria cannot pass through the mucosa, but bacterial-derived vesicles are usually less than 100 nanometers in size. It passes freely through the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • Pathogenic bacteria-derived vesicles absorbed by our bodies are inflammatory diseases such as inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis, inflammatory respiratory diseases such as chronic rhinitis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease. It is found to be an important factor in the etiology of. In addition, it has attracted attention as it has recently been found that there is a close relationship with the occurrence of metabolic diseases such as diabetes, obesity, lung cancer, gastric cancer, colon cancer and the like.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the bacterium of Propionibacterium is an anaerobic Gram-positive bacillus that has a characteristic of synthesizing propionic acid through transcarboxylase enzyme.
  • the bacterium is a bacterium that coexists with animals including humans, and is known to coexist not only with the skin but also with the gastrointestinal tract. In most cases, the bacterium does not cause disease, but it is Propionibacerium acnes (Acne). It is known to use fatty acids present in sebum secreted by sebaceous glands as an energy source and the most important causative bacteria for skin diseases such as acne.
  • propionibacterium Bacteria in the propionibacterium are industrially used in the synthesis of vitamin B12, tetrapyrrole compounds and propionic acid, probiotics, and cheese production. To date, it has not been reported that bacteria in Propionibacterium secrete extracellular vesicles, and propionibacterium, preferably propionibacterium acnes, is a homologous species of propionibacterium acnes. Studies have been conducted only on the treatment of allergies, influenza vaccines, and digestive tract dysfunction (see Japanese Patent Application Laid-Open No. JP 2016-028033 and Korean Patent Registration No. KR 10-1459166).
  • the androgen receptor is an intracellular receptor that binds to male hormones such as testosterone and dihydrotestosterone, and plays an important role in the expression and maintenance of male phenotypes such as muscle mass, bone density, and hair growth.
  • male hormone is known to play an important role in the prevention of osteoporosis, senescence through androgen receptor.
  • the inventors of the present invention the vesicles derived from the propionibacterium bacteria, cancer, chronic inflammatory diseases, endocrine diseases, The present invention has been completed based on the fact that it is reduced in the blood of patients with metabolic diseases.
  • the present inventors confirmed that the vesicles can be used as a composition for preventing or treating cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases by first separating the vesicles from the bacteria of propionibacterium and confirming their properties.
  • the contents of bacterial vesicles derived from propionibacterium were significantly higher in cancer patients such as liver cancer, breast cancer, and atopic dermatitis, asthma, diabetes mellitus, cirrhosis, etc.
  • cancer patients such as liver cancer, breast cancer, and atopic dermatitis, asthma, diabetes mellitus, cirrhosis, etc.
  • the vesicles derived from propionibacterium were isolated in vitro and evaluated for therapeutic efficacy, anti-inflammatory and keratinocyte killing effects were shown.
  • the male hormone receptor As a result of increasing the expression, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing information for the diagnosis of cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, ameliorating or treating cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease, which comprises a bacterium-derived vesicle belonging to propionibacterium as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for providing information for the diagnosis of cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, including the following steps.
  • the patient derived sample may be blood or urine.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, including the vesicles derived from propionibacterium bacteria as an active ingredient.
  • the bacteria in the Propionibacterium may be Propionibcerium acnes (Propionibacerium acnes).
  • the vesicles may have an average diameter of 10 to 1000 nm.
  • the vesicles may be secreted naturally or artificially in bacteria of the genus Propionibacterium.
  • the patient-derived sample may be urine or blood.
  • the composition may be an inhalant.
  • the composition may use a protein contained in the propionibacterium Acnes-derived vesicles.
  • the cancer may be liver cancer or breast cancer.
  • the inflammatory disease may be atopic dermatitis, asthma, diabetes, or cirrhosis of the liver.
  • the endocrine disease may be osteoporosis, senility (frailty), hair loss.
  • the metabolic disease may be diabetes or cirrhosis of the liver.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, including the vesicles derived from propionibacterium bacteria as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, including the vesicles derived from the propionibacterium bacteria as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a bacterium-derived vesicle belonging to propionibacterium as an active ingredient. do.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a bacterium-derived vesicle of propionibacterium as an active ingredient for the prevention or treatment of cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases.
  • the present inventors confirmed that the activity of the bacteria in the propionibacterium is increased by fat by increasing the content of the vesicle-derived bacteria in the propionibacterium in the high fat diet-derived stool sample compared to the high-carbohydrate mice.
  • Bacterial-derived vesicles in the blood of patients have significantly reduced bacterial vesicles in propionibacterium in the blood of patients with liver cancer, breast cancer, asthma, atopic dermatitis, diabetes mellitus, and liver cirrhosis. It was confirmed.
  • propionibacterium acnes a species of bacteria in the propionibacterium, was cultured in vitro to isolate the vesicles, and when administered to mice, it was experimentally confirmed to increase the expression of the androgen receptor in the prostate tissue.
  • the vesicle-derived vesicles of propionibacterium according to the present invention are a cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease. It is expected to be useful for diagnostic or predictive methods, pharmaceutical compositions, foods, and cosmetics.
  • RCD carbohydrate diet
  • HFD high fat diet
  • Figure 2 is a high-carbohydrate diet (RCD) and 12 weeks high-fat diet (HFD) mouse and vesicles from the stool to separate the results of the meta-genomic analysis in each.
  • RCD high-carbohydrate diet
  • HFD high-fat diet
  • Figure 3a is a photograph of the distribution of bacteria and vesicles over time after the oral administration of enteric bacteria and bacteria-derived vesicles (EV) to the mouse.
  • Figure 3b is a 12 hours after oral administration, blood, kidneys, and various organs were extracted to evaluate the distribution pattern of bacteria and vesicles in the body.
  • Figure 4 is a schematic diagram of a method for analyzing bacteria-derived vesicle metagenome in human derivatives.
  • Figure 5a is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after the analysis of bacteria-derived vesicles metagenome present in liver cancer patients and normal blood matched age and sex.
  • Figure 5b is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after the analysis of bacteria-derived vesicles metagenomics present in breast cancer patients and blood of age and sex matched normal.
  • Figure 6a is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after the analysis of bacteria-derived vesicles metagenome present in normal asthma patients and blood of age and sex matched.
  • Figure 6b is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after performing a bacterial-derived vesicle metagenome analysis present in atopic dermatitis patients and normal blood matched with age and sex.
  • Figure 7a is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after the analysis of bacteria-derived vesicles metagenomics present in diabetic patients and blood of age and sex matched normal.
  • Figure 7b is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in propionibacterium after the analysis of bacterial-derived vesicles metagenomics present in liver cirrhosis patients and blood of normal age and sex matched.
  • Figure 8a is a result of culturing propionibacterium acnes in vitro and separating the vesicles from the culture medium and observed the shape of the vesicles with an electron microscope.
  • Figure 8b is the result of measuring the size of the vesicles separated from propionibacterium Acnes culture medium by dynamic light scattering method.
  • Figure 9a shows the analysis of the proteome contained in the propionibacterium Acnes-derived vesicles are shown to classify the identified proteins as cell components.
  • Figure 9b shows the results of analyzing the proteome contained in the propionibacterium Acnes-derived vesicles are shown to classify the identified proteins as a function.
  • Figure 10a is a result of measuring the degree of apoptosis after treatment with a propionibacterium Acnes-derived vesicles macrophages.
  • Figure 10b is the result of measuring the secretion amount of IL-6, an inflammation medium after the propionibacterium Acnes-derived vesicles treated with macrophages.
  • E. coli EV E. coli vesicles
  • IL-6 Escherichia coli vesicles
  • propionibacterium acnes-derived vesicles at various concentrations. The result of evaluating the impact.
  • FIG. 11B shows the secretion of TNF- ⁇ , an inflammatory mediator of Escherichia coli vesicles, when E. coli EVs, which are pathogenic vesicles, are pretreated with various concentrations of vesicle vesicles derived from propionibacterium acnes in mouse macrophage lines. This is the result of evaluating the impact.
  • 12A shows the results of evaluating the degree of killing keratinocytes caused by Staphylococcus aureus-derived vesicles after treating S. aureus EV vesicles at various concentrations in the skin keratinocytes.
  • 12B is a result of evaluating the degree of killing keratinocytes by propionibacterium acnes-derived vesicles after treatment with various concentrations of propionibacterium acnes-derived vesicles (P. acnes EV) in the skin keratinocytes.
  • P. acnes EV propionibacterium acnes-derived vesicles
  • propionibacterium acnes-derived vesicles P. acnes EV
  • S. aureus EV vesicles pathogenic vesicles of skin diseases, various concentrations It is the result of measuring the apoptosis of keratinocytes by pretreatment of the propionibacterium acne-derived vesicles with keratinocytes, followed by treatment with high concentrations of Staphylococcus aureus-derived vesicles.
  • the present invention relates to vesicles derived from bacteria of the genus Propionibacterium and uses thereof.
  • the present inventors conducted metagenome analysis of the contents of bacteria derived from propionibacterium in the samples derived from patients with endocrine-metabolic diseases such as liver cancer, breast cancer and other inflammatory diseases such as atopic dermatitis and asthma, diabetes and liver cirrhosis, compared to normal people. It was confirmed that this is significantly reduced, the present invention was completed based on this.
  • the present invention provides an information providing method for diagnosing cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease, comprising the following steps.
  • diagnosis in the broad sense means to determine the actual condition of the patient in all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, the etiology, the type of disease, the seriousness, the detailed mode of the condition, the presence or absence of complications, and the prognosis. Diagnosis in the present invention is to determine the onset of cancer, inflammatory diseases, or metabolic diseases and the level of the disease.
  • Cancer the disease to be diagnosed according to the present invention, refers to a malignant tumor that grows rapidly while infiltrating surrounding tissues and spreads or metastasizes to various parts of the body and threatens life.
  • Cells the smallest unit of the body, divide and grow normally under the control function of the cells themselves, and die off at the end of their life or damage to maintain the balance of the overall number, but for a number of reasons If a problem occurs in the cell's own regulatory function, abnormal cells that normally must die will overgrow, invading surrounding tissues and organs, forming a mass, and destroying or modifying existing structures.
  • the cancer may preferably be liver cancer or breast cancer, but is not limited thereto.
  • the term "inflammatory disease” refers to a disease caused by an inflammatory response in a mammalian body. Representative examples include respiratory inflammatory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease and rhinitis. ; Skin inflammatory diseases such as atopic dermatitis, psoriasis, acne and contact dermatitis; Gastrointestinal inflammatory diseases such as gastritis, peptic ulcer, and inflammatory bowel disease; And complications thereof.
  • the inflammatory disease is used in the sense including cancer associated with the inflammatory response, in addition to the general inflammatory disease, and includes, for example, lung cancer, stomach cancer, colon cancer and the like.
  • the inflammatory disease preferably means, but is not limited to, asthma or atopic dermatitis.
  • endocrine disease refers to the occurrence of disorders caused by excess or deficiency of hormones in the body of a mammal, for example, in the reduction of breast cancer and male hormones caused by the excess of female hormones.
  • endocrine diseases preferably include, but are not limited to, osteoporosis, senility, or hair loss.
  • metabolic disease refers to a disease caused by metabolic disorders and complications thereof in a mammal's body, for example, hyperlipidemia due to lipid metabolism abnormality, diabetes due to carbohydrate metabolism abnormality Or cirrhosis such as metabolic complications, and in the present invention, metabolic diseases preferably include, but are not limited to, diabetes or cirrhosis.
  • the term "nanovesicle” or “vesicle” refers to a structure of nanoscale membranes secreted by various bacteria.
  • Gram-negative bacteria-derived vesicles or outer membrane vesicles (OMVs) contain toxic proteins, bacterial DNA and RNA as well as lipopolysaccharides, and gram-positive bacteria-derived vesicles.
  • OMVs outer membrane vesicles
  • the nano-vesicles or vesicles are naturally secreted or artificially produced by the bacteria of the Propionibacterium, spherical form, has an average diameter of 10 to 1000 nm.
  • the vesicles were centrifuged, ultra-fast centrifugation, extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation, chemical treatment, filtration by filter, gels containing culture medium containing bacteria of propionibacterium.
  • the separation can be carried out using one or more methods selected from the group consisting of filtration chromatography, pre-flow electrophoresis, and capillary electrophoresis. In addition, it may further include a process for washing to remove impurities, concentration of the obtained vesicles and the like.
  • the term "metagenome” used in the present invention also referred to as "gunoelectric”, refers to the sum total of the genome including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated region such as soil, animal intestine, mainly culture It is used as a concept of genome explaining the identification of many microorganisms at once using sequencer to analyze microorganisms that are not.
  • the metagenome does not refer to one genome or genome, but to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA, regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • the patient-derived sample may be blood or urine, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, including the vesicles derived from propionibacterium bacteria as an active ingredient.
  • the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, comprising as an active ingredient a bacterium derived from propionibium bacteria.
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving cancer, inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, comprising as an active ingredient a bacterium derived from propionibium bacteria.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease by administration of a food, inhalant, or pharmaceutical composition according to the present invention. do.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms for cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the term " improvement" means at least a parameter related to a condition in which cancer, inflammatory disease, endocrine disease, or metabolic disease is treated by administration of a food or cosmetic composition according to the present invention, for example, the degree of symptoms It means all acts of diminishing.
  • bacterial metagenome analysis was performed using vesicles isolated from blood of breast cancer patients, liver cancer patients, and normal persons. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from propionibacterium were significantly reduced in the blood of breast cancer and liver cancer patients compared to normal blood (see Example 3).
  • bacterial metagenome analysis was performed using vesicles isolated from blood of asthma patients, atopic dermatitis patients, and normal persons. As a result, it was confirmed that the vesicles derived from propionibacterium were significantly reduced in the blood of asthma and atopic dermatitis patients compared to normal blood (see Example 4).
  • bacterial metagenome analysis was performed using vesicles isolated from blood of diabetic patients, cirrhosis patients, and normal persons. As a result, compared with normal blood, it was confirmed that the vesicles derived from propionibacterium were significantly reduced in blood of diabetic and cirrhosis patients (see Example 5).
  • the vesicles It was confirmed that the average diameter is less than 200 nm, preferably a circle size of 37.8 ⁇ 13.5 nm (see Example 6).
  • 252 proteins present in propionibacterium acnes-derived vesicles were identified by proteome analysis, and are classified and shown by cell constituents and protein functions (see Example 7).
  • Staphylococcus aureus EV vesicles are a major causative factor of atopic dermatitis ).
  • the treatment of keratinocytes caused by Staphylococcus aureus vesicles is inhibited by the propionibacterium acne-derived vesicles. (See Example 9).
  • one of the therapeutic mechanisms for endocrine diseases of propionibacterium acnes-derived vesicles to evaluate the effect on male hormone receptor expression the propionibacterium acne-derived vesicles in the mouse
  • the propionibacterium acne-derived vesicles in the mouse As a result of extracting and analyzing prostate tissue after administration, it was confirmed that when the vesicles were administered, the expression of androgen receptor was increased in the prostate tissue (see Example 10).
  • Stool was collected according to the method shown in FIG. 1 in a normal mouse fed a high-carbohydrate diet (RCD) for 12 weeks and a mouse fed a high fat diet (HFD) for 2 months and inducing obesity. It was.
  • the weight (grams) of the collected mouse feces was then measured and dispersed in PBS.
  • the supernatant was separated by centrifugation for 5 minutes at 500 ⁇ g, 5 minutes at 3,000 ⁇ g, and 5 minutes at 4,350 rpm, followed by ultrafast centrifugation at 10,000 ⁇ g for 20 minutes.
  • the bacteria contained in the feces were isolated.
  • the supernatant from which bacteria were removed was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, followed by protein quantification. Thereafter, 0.8 M and 2.5 M sucrose cushions were made, and ultra-high centrifugation was repeatedly performed twice at 2,800 ° C. for 2 hours at 4 ° C., and ultra-high centrifugation was performed at 4,200 ° C. for 2 hours at 40 ° C. to obtain stool-derived vesicles. And the resulting vesicles were dispersed and stored in PBS.
  • the bacteria and vesicles separated by the above method were boiled at 100 ° C. to let the DNA inside the lipids out and then cooled on ice for 5 minutes. And centrifuged at 10,000 x g, 4 °C 30 minutes to remove the remaining suspended solids and collected only the supernatant. The amount of DNA was quantified using Nanodrop. Thereafter, PCR was performed with the 16s rRNA primer shown in Table 1 to confirm whether the bacteria-derived DNA exists in the extracted DNA, and it was confirmed that the bacteria-derived gene was present in the extracted gene.
  • DNA extracted by the above method was amplified using the above 16S rDNA primers, followed by sequencing (Illumina MiSeq sequencer), and the results were outputted in a Standard Flowgram Format (SFF) file, using GS FLX software (v2.9).
  • SFF Standard Flowgram Format
  • GS FLX Standard Flowgram Format
  • Clustering is performed according to sequence similarity using UCLUST and USEARCH for Operational Taxonomy Unit (OTU) analysis, genus 94%, family 90%, order 85%, class 80%, phylum 75% sequence similarity Clustering is based on the phylum, class, order, family, and genus levels of each OTU, and BLASTN and GreenGenes' 16S RNA sequence database (108,453 sequences) is used to identify bacteria with greater than 97% sequence similarity at the genus level. Was profiled (QIIME).
  • OTU Operational Taxonomy Unit
  • the bacteria were not absorbed systemically, but in the case of the bacteria-derived vesicles, they were absorbed systemically 5 minutes after administration, and the bladder was fluorescence at 30 minutes of administration. Observed strongly, the vesicles were found to be excreted by the urinary system. In addition, the vesicles were found to exist in the body until 12 hours of administration.
  • the bacteria-derived vesicles were distributed in blood, heart, lung, liver, kidney, spleen, fat, muscle and kidney, but bacteria were not absorbed. there was.
  • the blood was allowed to settle by centrifugation (3,500 x g, 10 min, 4 ° C.) and only the supernatant was transferred to a new 10 ml tube. After removing bacteria and foreign substances using a 0.22 ⁇ m filter, it was transferred to centripreigugal filters (50 kD) and centrifuged at 1500 x g and 4 ° C for 15 minutes to discard materials smaller than 50 kD and concentrated to 10 ml.
  • centripreigugal filters 50 kD
  • the genes were extracted from the vesicles present in the blood of 277 asthma patients and 246 blood of the normal control group.
  • Bacterial-derived vesicles in Onibacterium were significantly reduced (normal vs asthmatic: 1.8% vs 0.2%; fold change: 0.12, p ⁇ 0.000001).
  • the blood was extracted from the vesicles present in the blood of the blood of 100 patients with liver cirrhosis and 100 of the normal control group.
  • propionibacterium acnes strains were cultured and their vesicles were separated and analyzed.
  • Propionic sludge tumefaciens arc Ness (P. acnes) after the the 6919 strain absorbance (OD600) at 37 °C anaerobic chamber cultured in BHI (brain heart infusion) culture medium until a 1.0 to 1.5 were sub-culture. Since no P. acnes The media supernatant of 6919 was recovered, centrifuged at 10,000 g, 4 ° C.
  • the filtered supernatant was purified by ultrafiltration using a QuixStand benchtop system (GE Healthcare, UK) using a 100 kDa hollow filter membrane. Concentrated to mL volume. Thereafter, the concentrated supernatant was once again filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and the filtered supernatant was ultracentrifuged at 150,000 g, 4 ° C. for 3 hours, and the pellet was suspended in DPBS.
  • Optiprep solution was prepared using HEPES-buffered saline (20 mM HEPES) to prepare low density solution. , 150 mM NaCl, pH 7.4) was used. After centrifugation for 2 hours at 200,000 g, 4 ° C conditions, the ultracentrifugation was further performed for 3 hours at 150,000 g, 4 ° C each solution fractionated in the same volume of 1 mL from the upper layer. Thereafter, the protein was quantified by BCA assay, and the following experiments were performed on the obtained vesicles.
  • the vesicles were separated from the culture medium of propionibacterium acnes cultured according to the above method, and the shape and size were evaluated by electron microscopy.
  • proteome analysis was performed. To this end, trypsin digested peptides were obtained through FASP (Filter-aid sample preparation) digestion. 18 ⁇ g of protein extracted from propionibacterium acne-derived vesicles was mixed with a reducing solution (4% SDS and 0.1 M DTT in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6) and reacted at 37 ° C. for 45 minutes. After boiling for 7 minutes, centrifugation-based filter was performed at 16 ° C for 40 minutes at 14,000 g.
  • FASP Ferter-aid sample preparation
  • UA solution 0.2 mL of 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5
  • 0.1 ml of 55 mM IAA solution was added and the reaction was performed at room temperature for 20 minutes. And centrifuged for 40 minutes.
  • the sample was diluted in 0.2 ml of 100 mM TEAB solution and centrifuged twice for further solution exchange for trypsin treatment.
  • the filter is placed in a 1.5 ml tube and 100 mM TEAB solution containing high purity trypsin is digested for 12 hours at 37 ° C in the filter, followed by centrifugation at 16 ° C for 20 minutes at 14,000 g for 100 mM TEAB. The process of adding 75 ⁇ l of solution was repeated twice.
  • the collected samples were dried with a SpeedVac concentrator, then dissolved in 180 ⁇ l of 5% ACN dissolved solution (0.1% formic acid in distilled water solvent) and decontaminated with a C-18 rotary column (Thermo Scientific, USA), followed by vacuum drying. I was.
  • the dried samples were analyzed with a Q Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Germany) in conjunction with EASY nLC1000 (Thermo Fisher Scientific, Germany) using the nano-LC-ESI-MS / MS method. Trypsin-cut peptides were loaded into a trap column (75 ⁇ m ⁇ 2 cm) packed with C18 3- ⁇ m resin and then subjected to a speed of 300 nl / min for 85 minutes using a 5% -40% linear gradient of B solvent. Eluted. Eluted peptides were separated by an analytical column (75 ⁇ m ⁇ 50 cm) packed with C18 2- ⁇ m resin, followed by electrospraying at 2.0 kV to the nano ESI source.
  • the Q Exactive mass spectrometer was operated in a top 10 data-dependent method. Higher-energy collisional dissociation separation is achieved by setting the normalized collisional energy to 30%, the dynamic exclusion time to 30 seconds, and the precursor isolation window to 2. The most abundant precursor ions were selected using a survey scan (m / z; 400-2,000). Survey MS scans were obtained with a resolution of 70,000 using an Orbitrap analyzer with the HCD Spectra resolution set to 17,500.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles As a result, as shown in FIGS. 9A and 9B, among proteins analyzed in propionibacterium acnes-derived vesicles, highly reliable proteins detected two or more times in three repetitions were selected, resulting in a total of 252 proteins. Found. More than half the properties of the proteins analyzed were not well known because of the lack of proteomic studies of propionibacterium acnes. The distribution ratio of the analyzed proteins by cell component was 27.4% for membrane-related protein, 7.1% for cytoplasmic protein, 1.2% for extracellular protein and 4.4% for liposome protein. This means that propionibacterium acnes-derived vesicles, like commonly known bacterial vesicles, are wrapped in membranes and contain both cytoplasmic and extracellular proteins.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles are important for metabolic processes and mass transport of propionibacterium acnes. It is expected to play a role.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles exhibit prominent features such as biochemical lifestyle, survival, cell adhesion, pathogenicity and inflammatory properties of propionibacterium acnes. It can be seen that.
  • oxidative phosphorylation cytochrome c oxidase, Rieske domain protein
  • nitrogen fixation bacterial cytochrome ubiquinol oxidase, cytochrome d ubiquinol oxidase
  • oxygen-free breathing succinate dehydrogenases, methylmalonyl-CoA mutase
  • ATP-binding cassettes-related proteins are present, consistent with the fact that Propionibacterium Acnes has an aerobic and anaerobic nonkinetic lifestyle.
  • proteins in the propionibacterium acnes-derived vesicles have functions related to transcription, translation, protein transport, and protein folding.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles function as intercellular transport of biochemical processes and energy metabolism-related substances or proteins, and are large transporters that transport nutrients on behalf of the non-motile propionibacterium acnes. It can be expected to function as.
  • propionibacterium acnes is present in various environments. It can be expected that propionibacterium acnes-derived vesicles will be used to survive and display antibiotic resistance at the site of infection.
  • Putative uncharacterized protein which binds to dermatan sulfate of host and shows immunity
  • Putative glycosyl-transferase which binds to epidermal cells of host and forms biofilm
  • Glyceraldehyde- which shows pathogenicity by attaching to cell
  • Propionibacterium acnes from proteins that play a key role in attaching cells or forming biofilms, such as 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a polysaccharide deacetylase that binds to epidermal cells and escapes the host's immune response from lysozymes.
  • GPDH 3-phosphate dehydrogenase
  • Hyaluronate lyase which induces immune response in inflammatory cells by decomposing host's extracellular matrix
  • Endoglycoceramidase which breaks down glycosphingolipid on cell surface to prevent signal transduction
  • Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H which metabolizes host cell-derived substrate
  • propionibacterium acnes-derived vesicles can be efficiently transferred into cells from proteins such as Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) factors, which invade the host and puncture cells.
  • CAMP Christie-Atkins-Munch-Peterson
  • NlpC / P60 endopeptidase family protein, basic membrane protein, 60 kDa chaperonin, and 10 kDa chaperonin are essential proteins for the survival of propionibacterium acnes.
  • propionibacterium acnes derived protein can be used for immunomodulation through propionibacterium acnes derived vesicles by stimulating the host's immune response.
  • Proteins identified through propionibacterium acnes derived vesicle proteome analysis are shown in Table 2 below.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles were applied to raw macrophage cell lines, Raw 264.7 cells. EV) was treated at various concentrations (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 ⁇ g / ml) and then secreted by inflammatory mediators (IL-6, TNF- ⁇ , etc.) through apoptosis and ELISA (R & D system, USA), respectively.
  • IL-6 inflammatory mediators
  • apoptosis and ELISA R & D system, USA
  • propionibacterium Acnes-derived vesicles were mixed and treated with fresh DMEM complete medium, and then cultured in a 37 °C incubator for 6 hours to 24 hours to obtain a culture supernatant. .
  • the culture supernatant was collected in a 1.5 ml tube, centrifuged at 3000 g for 5 minutes, the supernatant was collected and stored at 4 ° C., followed by ELISA analysis.
  • the Capture antibody was diluted in PBS, 50 ⁇ l was dispensed into 96-well polystyrene plates according to the working concentration, and then reacted overnight at 4 ° C. After washing twice with 100 ⁇ l of PBST (PBS containing 0.05% tween-20) solution, dispense 100 ⁇ l of RD (PBST containing 1% BSA) solution and block for 1 hour at room temperature. After washing twice with 100 ⁇ l, 50 ⁇ l of the sample and standard were dispensed according to the concentration and reacted at room temperature for 2 hours.
  • PBST PBS containing 0.05% tween-20
  • the detection antibody was diluted in RD and 50 ⁇ l was dispensed at the action concentration for 2 hours at room temperature.
  • Strpetavidin-HRP was diluted to 1/200 in RD and 50 ⁇ l divided and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 50 ⁇ l of a solution of 1: 1 mixed TMB substrate and 0.04% hydrogen peroxide solution was dispensed and waited for color development.
  • 50 ⁇ l of sulfuric acid solution was dispensed to stop the reaction and the absorbance was measured at 450 nm using Synergy TM HT multi-detection microplate reader (BioTek, USA).
  • propionibacterium acnes-derived vesicles can effectively suppress inflammatory diseases such as asthma and metabolic diseases such as diabetes induced by pathogenic vesicles such as E. coli-derived vesicles.
  • Example 9 Skin dead skin cells caused by Staphylococcus aureus-derived vesicles Propionibacterium Acnes-derived parcels Anti-killing effect
  • Example 8 In order to evaluate the inhibitory effect of Propionibacterium acnes-derived vesicles on the killing of skin epithelial cells by Staphylococcus aureus-derived vesicles, the same pretreatment as in Example 8 was used using a keratinocyte line (HaCaT cell) instead of macrophages. After the procedure, the Staphylococcus aureus-derived vesicles and Propionibacterium acnes-derived vesicles were treated for 24 hours, and then MTT assay (Sigman, USA) was performed.
  • HaCaT cell keratinocyte line
  • Examples 3 and 5 confirmed that the vesicles derived from propionibacterium were significantly reduced in the blood of breast cancer and atopic dermatitis patients compared to normal people, and further, for the atopic dermatitis and breast cancer of the vesicles.
  • propionibacterium acnes-derived vesicles were treated in 6-week-old C57BL / 6 male mice to evaluate androgen receptor expression in mouse prostate tissue.
  • Each experimental group consisted of 1 ⁇ g of propionibacterium acnes-derived vesicles (PaEV), and 1 ⁇ g of peptidoglycan (PGN), a well-known antigen of PBS or propionibacterium acnes-derived vesicles, 1 ⁇ g of lipoteichoic acid (LTA) was injected intraperitoneally twice a week for a total of 4 weeks. Three days after the last injection, the prostate tissue was removed, ground, and supernatant was obtained, and the expression pattern of androgen receptor (AR) was confirmed by western blot.
  • PaEV propionibacterium acnes-derived vesicles
  • PPN peptidoglycan
  • LTA lipoteichoic acid
  • the extracted mouse prostate tissue was transferred to a 1.5 ml tube and placed in liquid nitrogen for rapid cooling. The tissue was then added to Tissuelyser II (Qiagen, Germany) with lysis solution and beads. . The ground tissue solution was transferred to a new 1.5 ml tube and centrifuged at 17,000 g for 15 minutes at 4 ° C. to obtain supernatant twice. Supernatant proteins were quantified using BCA assay. 150 ⁇ g of protein sample was mixed with loading solution and subjected to SDS-PAGE at 160 V for 1 hour in 4% stacking gel and 7.5% seperating gel, and then the PA gel was 400 mA 50 minutes with activated PVDF membrane for 5 minutes in 100% ethanol.
  • the transfer was carried out in an ice bucket. Tranferd PVDF membrane was shaken incubated for 40 minutes at room temperature in RD solution (TBS-T containing 5% skim milk). After washing three times with TBS-T for 30 minutes, the primary antibody against androgen receptor (androgen receptor) was diluted in 1/4000 RD and shaken incubation for 1 hour and half at room temperature. After washing three times with TBS-T for 30 minutes, the secondary antibody was diluted in RD to 1/4000 and shaken incubation for 1 hour at room temperature.
  • the ECL femto substrate (Thermo Scientific, USA) was diluted in distilled water in 1/10 and sprayed onto the PVDF membrane to obtain Western images with the LAS 4000 (GE Healthcare, UK) instrument. Western images for ⁇ -actin were used as controls.
  • Bacterial-derived vesicles of propionibacterium according to the present invention increased the expression of androgen receptors in prostate tissue, and when the vesicles were pretreated in inflammatory cells, the effects of anti-inflammatory and immunomodulatory functions were observed.
  • the present invention is expected to be useful for diagnosing or predicting inflammatory diseases, endocrine diseases, or metabolic diseases, pharmaceutical compositions, foods, and cosmetics.

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Abstract

본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것으로 고탄수화물식이에 비해 고지방식이에 의해 체내에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 생성이 증가하고, 정상인에 비하여 유방암, 간암 등의 암환자, 천식, 아토피피부염 등의 염증질환, 및 당뇨병, 간경화증 등의 대사질환 환자의 혈액에 상기 소포가 유의하게 감소되어 있고, 상기 소포는 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 억제함과 동시에 각질세포의 사멸을 억제하고, 체내에서 안드로젠 수용체의 발현을 증가시킴을 실험적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포는 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단 또는 예측방법, 약학적 조성물, 식품, 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

프로피오니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 프로피오니박테리움 속 세균에서 유래하는 나노소포를 이용한 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단방법, 및 상기 소포를 포함하는 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성질환의 중요성이 덜해지는 반면, 인간과 마이크로바이옴과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능이상을 동반한 만성질환, 특히 암, 심혈관질환, 만성폐질환, 대사질환, 신경-정신질환 등이 21세기에 큰 문제가 되고 있다.
인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 우리 몸에 흡수되는 병원성 세균유래 소포는 아토피피부염과 같은 염증성 피부질환, 만성비염, 천식, 만성폐쇄성폐질환 (COPD) 등의 염증성 호흡기질환, 궤양성대장염, 크론씨병 등의 염증성 장질환 등과 같은 염증성질환의 병인에 중요한 인자임이 밝혀지고 있다. 또한, 당뇨병, 비만 등의 대사질환, 폐암, 위암, 대장암 등의 고형암의 발생과도 긴밀한 관계가 있음이 최근 밝혀지면서 주목을 받고 있다.
프로피오니박테리움 속 세균은 혐기성 그람양성간균으로서 transcarboxylase 효소를 통해 프로피온산을 합성하는 특징을 갖고 있다. 상기 세균은 인간을 포함한 동물과 공생하는 세균으로서, 피부뿐만 아니라 위장관에도 공생함이 알려져 있고, 대부분의 경우에는 질병을 일으키지 않으나, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacerium acnes) 균 (여드름균)인 경우에는 피지선에서 분비되는 피지(sebum)에 존재하는 지방산을 에너지원으로 사용하고, 여드름과 같은 피부질환에 가장 중요한 원인균으로 알려져 있다. 프로피오니박테리움 속 세균은 산업적으로는 비타민 B12, tetrapyrrole 화합물 및 프로피온산 합성, 프로바이오틱스, 치즈생산 등에 이용되고 있다. 현재까지, 프로피오니박테리움 속 세균이 세포밖으로 소포를 분비한다는 사실이 보고되지 않았고, 프로피온산균, 바람직하게는 프로피오니박테리움 아크네스의 동속 이종인 프로피오니박테리움 후로이덴하이히(P. freudenreichii)의 알레르기, 인플루엔자 백신, 소화관기능 이상의 치료 용도에 대해서만 연구들이 진행되어 왔다(일본 공개특허 JP 2016-028033 및 한국등록특허 KR 10-1459166 참조).
한편, 안드로젠 수용체(androgen receptor)는 테스토스테론(testosterone), 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone) 등의 남성호르몬에 결합하는 세포 내 수용체로서 근육량 및 뼈밀도 증가, 발모 등의 남성 표현형의 발현 및 유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 남성호르몬이 안드로젠 수용체를 통해 골다공증, 노쇠 등의 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 정상인에 비하여 암, 만성염증질환, 내분비질환, 그리고 대사질환 환자의 혈액에서 감소되어 있음을 확인함에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명자들은 프로피오니박테리움 속 세균으로부터 소포를 최초로 분리하고 그 특성을 확인함으로써 상기 소포를 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 메타게놈 분석을 통해 정상인에 비하여 간암, 유방암 등의 암환자, 및 아토피피부염, 천식, 당뇨병, 간경화 등의 염증 또는 대사질환 환자 유래 샘플에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 현저히 감소되어 있음 확인하였고, 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 체외에서 분리하여 치료효능을 평가한 결과, 항염증 및 각질세포 사멸 억제 효과를 보였고, 상기 소포의 작용기전을 평가한 결과, 남성호르몬 수용체 발현을 증가시킴을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 환자 유래 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA 서열에 존재하는 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 검출 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 환자 유래 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 프로피오니박테리움 속 세균은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacerium acnes)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 1000 nm인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 소포는 프로피오니박테리움 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 환자 유래 샘플은 소변 또는 혈액인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 흡입제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 포함된 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 간암 또는 유방암일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증질환은 아토피피부염, 천식, 당뇨병, 또는 간경화증일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 내분비질환은 골다공증(osteoporosis), 노쇠(frailty), 탈모(hair loss)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 대사질환은 당뇨병 또는 간경화증일 수 있다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명자들은 고지방식이 마우스 유래 대변샘플에서 고탄수화물식이 마우스에 비해 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있음을 통해 지방에 의해 프로피오니박테리움 속 세균의 활성이 증가함을 확인하였고, 환자 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 통해 간암, 유방암, 천식, 아토피피부염, 당뇨병, 및 간경화증 환자의 혈액에 존재하는 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포가 정상인에 비하여 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다. 또한, 프로피오니박테리움 속 세균의 한 종인 프로피오니박테리움 아크네스를 체외에서 배양하여 소포를 분리한 후, 이를 마우스 투여하였을 때, 전립선조직에서 안드로젠 수용체의 발현을 증가시킴을 실험적으로 확인하였고, 상기 소포를 염증세포에 전처치하였을 때, 항염증 및 면역조절 기능을 갖는 효과를 관찰하였는바, 본 발명에 따른 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포는 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단 또는 예측방법, 약학적 조성물, 식품, 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 고탄수화물식이(RCD)와 고지방식이(HFD) 마우스 대변에서 소포를 분리하고, 메타게놈 분석을 위한 프로토콜을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 고탄수화물식이(RCD)와 12주간 고지방식이(HFD) 마우스 대변에서 세균과 소포를 분리하여 각각에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 3a는 마우스에 장내 세균과 세균 유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 3b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액, 콩팥, 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 4는 인체 유래물에서 세균유래 소포 메타게놈 분석 방법을 모식화한 그림이다.
도 5a는 간암 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 5b는 유방암 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 6a는 천식 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 6b는 아토피피부염 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 7a는 당뇨병 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 7b는 간경화 환자 및 연령과 성별이 매칭된 정상인 혈액에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 8a는 프로피오니박테리움 아크네스를 체외에서 배양한 후 배양액에서 소포를 분리하여 전자현미경으로 소포의 모양을 관찰한 결과이다.
도 8b는 프로피오니박테리움 아크네스 배양액에서 분리한 소포의 크기를 동적광산란법으로 측정한 결과이다.
도 9a는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 함유된 프로테옴을 분석한 결과 동정된 단백질들을 세포 구성물질로 분류하여 나타낸 것이다.
도 9b는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 함유된 프로테옴을 분석한 결과 동정된 단백질들을 기능으로 분류하여 나타낸 것이다.
도 10a는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 대식세포주에 처리한 후 세포사멸 정도를 측정한 결과이다.
도 10b는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 대식세포주에 처리한 후 염증매개체인 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 11a는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 소포를 대식세포주에 다양한 농도로 전처리한 후 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV) 처리 시, 대장균 소포에 의한 염증매개체인 IL-6의 분비에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 11b는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 소포를 마우스 대식세포주에 다양한 농도로 전처리한 후 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV) 처리 시, 대장균 소포에 의한 염증매개체인 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 12a는 황색포도상구균 유래 소포 (S. aureus EV)를 피부 각질세포에 다양한 농도로 처리한 후, 황색포도상구균 유래 소포에 의한 각질세포의 사멸 정도를 평가한 결과이다.
도 12b는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 (P. acnes EV)를 피부 각질세포에 다양한 농도로 처리한 후, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 의한 각질세포의 사멸 정도를 평가한 결과이다.
도 13은 피부질환의 병원성 소포인 황색포도상구균 유래 소포 (S. aureus EV)에 의한 피부사멸에 대한 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 (P. acnes EV)의 억제효과를 평가하기 위하여, 다양한 농도의 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 각질세포에 전처리한 후, 고농도의 황색포도상구균 유래 소포를 처리하여 각질세포의 세포사멸을 측정한 결과이다.
도 14는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 마우스 복강으로 4주간 8회 투여한 후, 전립선 조직에서 안드로젠 수용체의 발현양상을 웨스턴 블롯으로 평가한 결과이다.
본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 메타게놈 분석을 통해 정상인에 비하여 간암, 유방암 등의 암, 아토피피부염, 천식 등의 염증성질환, 당뇨, 간경화 등의 내분비-대사질환 환자 유래 샘플에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 현저히 감소되어 있음을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 환자 유래 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA 서열에 존재하는 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 검출 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환으로 판정하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 암, 염증질환, 또는 대사질환의 발병 여부 및 질환의 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 진단 대상 질병인 "암(cancer)"은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성종양(malignant tumor)을 의미한다. 신체를 구성하는 가장 작은 단위인 세포(cell)는 정상적으로는 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지하나, 여러 가지 원인에 의해 이러한 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키게 된다. 본 발명에 있어서, 암은 바람직하게는 간암 (Liver cancer) 또는 유방암(Breast cancer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "염증질환(inflammatory disease)"은, 포유동물 체내의 염증 반응에 의하여 유발되는 질환을 의미하며, 대표적인 예로는, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기계 염증질환; 아토피피부염, 건선, 여드름, 접촉피부염 등의 피부 염증질환; 위염, 소화기궤양, 염증성장염 등의 소화기 염증질환; 및 이의 합병증 등을 포함한다. 또한, 상기 염증성 질환은 일반적인 염증성 질환 이외에도, 염증 반응과 관련된 암을 포함하는 의미로 사용되며, 예컨대, 폐암, 위암, 대장암 등을 포함한다. 본 발명에 있어서, 염증질환은 바람직하게는 천식 또는 아토피피부염을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "내분비질환(endocrine disease)"은, 포유동물의 체내에서 호르몬의 과다 혹은 결핍에 의한 장애가 나타나는 것을 의미하며, 예컨대, 여성호르몬의 과다에 의한 유방암, 남성호르몬의 감소에 따른 골다공증, 노쇠, 탈모 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 내분비질환은 바람직하게 골다공증, 노쇠, 또는 탈모를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사질환(metabolic disease)"은, 포유동물의 체내에서 대사장애 및 이의 합병증으로 발생하는 질환을 의미하며, 예컨대, 지질대사 이상에 의한 고지혈증, 탄수화물대사 이상에 의한 당뇨병, 또는 대사이상의 합병증으로 나타나는 간경화증 등을 포함하며, 본 발명에 있어서, 대사질환은 바람직하게 당뇨 또는 간경화증를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "나노소포(Nanovesicle)" 혹은 "소포(Vesicle)"란, 다양한 세균에서 분비되는 나노크기의 막으로 된 구조물을 의미한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포, 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs)는 내독소(lipopolysaccharide) 뿐만 아니라 독성 단백질 및 세균 DNA와 RNA도 가지고 있고, 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포는 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있다. 본 발명에 있어서, 나노소포 혹은 소포는 프로피오니박테리움 속 세균에서 자연적으로 분비되거나 또는 인공적으로 생산하는 것으로, 구형의 형태이며, 10 내지 1000 nm의 평균 직경을 가지고 있다.
상기 소포는 프로피오니박테리움 속 세균를 포함하는 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈, 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다.
본 발명에 있어서, 상기 환자 유래 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 식품, 흡입제, 또는 약학적 조성물의 투여에 의해 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 본 발명에 따른 식품, 화장료 조성물의 투여에 의해 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 실시예에서는 고지방식이 동물모델을 이용하여 고지방식이 마우스 대변에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 고탄수화물식이 마우스 대변에 비하여 증가되어 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 일실시예에서는, 유방암 환자, 간암 환자, 및 정상인의 혈액에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여, 유방암 및 간암 환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 일실시예에서는, 천식환자, 아토피피부염 환자, 및 정상인의 혈액에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여, 천식 및 아토피피부염 환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 일실시예에서는, 당뇨병환자, 간경화증환자, 및 정상인의 혈액에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여, 당뇨병 및 간경화증 환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 실시예 3 내지 5의 결과를 바탕으로 프로피오니박테리움 속 세균에 속하는 프로피오니박테리움 아크네스 종 세균 유래 소포의 특성을 분석하기 위해 더욱 연구한 결과, 상기 소포는 평균직경이 200 nm 보다 작고, 바람직하게는 37.8 ± 13.5 nm 크기의 원형임을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로테옴 분석을 통해 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내에 존재하는 252개의 단백질을 동정하고, 세포 구성 물질 및 단백질 기능별로 분류하여 나타내었다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로피오니박테리움 아크네스 균주를 배양하여 이로부터 분비된 소포가 염증매개체 분비에 어떠한 영향을 미치는지 평가한 결과, 대식세포주에서 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 의한 IL-6 분비능이 병원성 소포인 대장균 유래 소포 (E. coli EV)에 비하여 현저히 낮았다. 또한, 다양한 농도의 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 대식세포에 처리한 후, 염증 및 대사질환의 원인 인자인 대장균 소포를 처리하여 염증매개체 분비를 평가한 결과, 대장균 유래 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비를 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 효율적으로 억제함을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로피오니박테리움 아크네스 균주를 배양하여 이로부터 분비된 소포가 아토피피부염 치료효과를 평가하기 위하여, 아토피피부염의 중요한 원인 인자인 황색포도상구균 유래 소포 (Staphylococcus aureus EV)를 각질세포에 처리하기 전에, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 피부각질세포에 전 처리하였을 때, 황색포도상구균 소포에 의한 각질세포 사멸이 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 의해 억제됨을 확인하였다(실시예 9 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 내분비질환에 대한 치료기전 중의 하나로 남성호르몬 수용체 발현에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 마우스에 투여한 후 전립선조직을 적출하여 분석한 결과, 상기 소포를 투여한 경우에 전립선조직에 안드로젠 수용체의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다(실시예 10 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 고탄수화물식이 및 고지방식이 마우스 대변 내 세균 및 세균유래 소포 메타게놈 분석
고탄수화물식이(Regular CHO diet; RCD)를 12주 동안 먹인 정상 마우스와, 고지방 식이(High fat diet; HFD)를 2달 동안 먹여 비만을 유도한 마우스에서 도 1에 도시한 방법에 따라 대변을 수집하였다. 이후 수집한 마우스 대변의 무게(그람)를 측정하고, PBS에 분산시켰다. 이물질을 제거하기 위해 500×g에서 5분, 3,000×g에서 5분, 4,350 rpm에서 5분씩 연속적으로 원심분리를 수행하여 상층액을 분리한 후, 10,000×g에서 20분간 초고속 원심분리를 수행하여 대변에 포함되어 있는 세균을 분리하였다. 또한 소포를 분리하기 위하여 세균이 제거된 상층액을 0.45 μm 필터를 이용하여 여과한 후, 단백질 정량을 수행하였다. 이후 0.8 M과 2.5 M sucrose cushion을 만들고, 28,500 rpm으로 4 ℃에서 2시간 동안 초고속 원심분리를 두 번 반복 수행한 후, 대변 유래 소포를 얻기 위하여 4 ℃에서 40,200 rpm으로 2시간 동안 초고속 원심분리를 수행하였고, 수득한 소포는 PBS에 분산시켜 보관하였다.
상기 방법으로 분리한 세균과 소포 100㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고 그 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 그리고 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모았다. 그리고 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후, 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rRNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2017006889-appb-T000001
상기 방법으로 추출한 DNA를 상기의 16S rDNA 프라이머를 사용하여 증폭을 한 다음 시퀀싱을 수행하고 (Illumina MiSeq sequencer), 결과를 Standard Flowgram Format (SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software (v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일 (.fasta)과 nucleotide quality score파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window (20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만 (Phred score <20)인 부분을 제거하였다. Operational Taxonomy Unit (OTU) 분석을 위해 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하고, genus는 94%, family는 90%, order는 85%, class는 80%, phylum은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 phylum, class, order, family, genus 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S RNA 시퀀스 데이터베이스 (108,453 시퀀스)를 이용하여 속 수준에서 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 세균을 프로파일링 하였다 (QIIME).
상기 방법에 따라 고탄수화물식이와 고지방식이를 12주간 투여한 마우스 대변에서 세균과 세균 유래 소포의 메타게놈 분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 속 세균 자체(Bacteria)의 분포는 고탄수화물식이와 고지방식이 마우스에서 차이가 없었으나, 프로피오니박테리움 유래 소포(EV)의 분포는 고탄수화물식이 마우스에 비하여 고지방식이 마우스 대변에 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다.
실시예 2. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는지를 평가하기 위하여 하기 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다.
마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 세균인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 30분에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 후, 투여 12시간 후에 혈액, 심장, 간, 신장, 비장, 지방, 근육을 채취하였다.
채취한 조직에서 형광을 관찰한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 세균 유래 소포가 혈액, 심장, 폐, 간, 콩팥, 비장, 지방, 근육, 신장에 분포하였으나, 세균은 흡수되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 3. 정상인, 유방암, 및 간암 환자 혈액 내 세균유래소포 메타게놈 분석
먼저 10 ml 튜브에 환자 및 정상인 혈액에서 소포를 분리하기 위하여, 혈액을 원심분리법(3,500 x g, 10분, 4℃)으로 부유물을 가라앉히고 상등액만을 새로운 10 ml 튜브에 옮겼다. 0.22㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브 (centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리며 10 ml 까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22㎛ filter를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹였다.
상기 방법으로 유방암환자 96명의 혈액과 성별과 연령을 매칭한 정상대조군 191명의 혈액; 및 간암환자 91명의 혈액과 성별과 연령을 매칭한 정상대조군 99명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하였다.
상기 실시예 1의 방법으로 메타게놈 분석을 수행한 후, 속 수준에서 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 평가한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 유방암환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 유방암환자: 2.2% vs 0.5%; fold change: 0.23; p<0.000001).
또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 간암환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 간암환자: 1.7% vs 0.6%; fold change: 0.34, p=0.000001).
실시예 4. 정상인, 천식, 및 아토피피부염 환자 혈액 내 세균유래소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 천식환자 277명의 혈액과 정상대조군 246명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 메타게놈 분석을 수행한 후, 속 수준에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 분포를 평가한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 천식환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 천식환자: 1.8% vs 0.2%; fold change: 0.12, p< 0.000001).
상기 실시예 3의 방법으로 아토피피부염환자 25명의 혈액과 정상대조군 138명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 메타게놈 분석을 수행한 후, 속 수준에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 분포를 평가한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 아토피피부염환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 아토피피부염환자: 0.7% vs 0.1%; fold change: 0.15, p= 0.000003).
실시예 5. 정상인, 당뇨병, 및 간경화증 환자 혈액 내 세균유래소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 당뇨병환자 73명의 혈액과 정상대조군 146명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 메타게놈 분석을 수행한 후, 속 수준에서 프로피오니박테리움 속 세균유래 소포의 분포를 평가한 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 천식환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 당뇨병환자: 1.3% vs 0.01%; fold change: 0.01, p< 0.000001).
상기 실시예 3의 방법으로 간경화증환자 100명의 혈액과 정상대조군 100명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 메타게놈 분석을 수행한 후, 속 수준에서 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 분포를 평가한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 정상인 혈액에 비하여 간경화증환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다 (정상인 vs 간경화증환자: 1.4% vs 0.5%; fold change: 0.4, p=0.00004).
실시예 6. 프로피오니박테리움 아크네스 배양액에서 소포 분리 및 특성 분석
상기 실시예 3 내지 실시예 5의 결과를 바탕으로, 프로피오니박테리움 아크네스 균주를 배양한 후 이의 소포를 분리하여 특성을 분석하였다. 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes) 6919 균주를 37℃ 혐기성 챔버에서 흡광도(OD600)가 1.0~1.5가 될 때까지 BHI(brain heart infusion) 배지에서 배양한 후 sub-culture 하였다. 이후 균주가 포함되어 있지 않은 P. acnes 6919의 배지 상등액을 회수하여 10,000 g, 4 ℃에서 15분 동안 원심분리하고 0.45 μm 필터에 거른 후 거른 상등액을 100 kDa hollow 필터 맴브레인으로 QuixStand benchtop system(GE Healthcare, UK)을 이용하여 ultrafiltration을 통해 200 ㎖ 부피로 농축하였다. 이후 농축시킨 상등액을 다시 한 번 0.22 μm 필터로 필터링 하고, 걸러진 상등액을 150,000 g, 4 ℃에서 3시간 동안 초원심분리한 후 펠렛을 DPBS로 현탁하였다. 다음으로 10 %, 40 %, and 50 % 옵티프렙 용액(Axis-Shield PoC AS, Norway)을 이용해 밀도구배 원심분리를 수행하였고, 저밀도 용액 제조를 위해 옵티프렙 용액을 HEPES-buffered saline (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)에 희석하여 이용하였다. 200,000 g, 4 ℃ 조건으로 2시간 동안 원심분리를 수행한 후 위층에서부터 1 ㎖의 동일한 볼륨으로 분획된 각 용액을 150,000 g, 4 ℃ 조건으로 3시간 동안 추가로 초원심분리를 실시하였다. 이후 BCA assay를 이용해 단백질을 정량하였고, 얻어진 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였다.
상기 방법에 따라 배양한 프로피오니박테리움 아크네스의 배양액에서 소포를 분리한 후 전자현미경을 통해 모양과 크기를 평가하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 배양액에서 분리한 소포의 모양은 구형이며, 크기는 200 nm보다 작은 것을 관찰하였고, 도 8b에 나타낸 동적광산란법 측정 결과를 통해 상기 소포의 크기는 37.8 ± 13.5 nm임을 확인하였다.
실시예 7. 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 프로테옴 분석
프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내에 어떠한 단백질들이 포함되어 있는지 알아보기 위하여, 프로테옴 분석을 실시하였다. 이를 위해, FASP(Filter-aid sample preparation) 분해 과정을 통하여 트립신으로 분해된 펩타이드들을 얻어내었다. 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포로부터 추출된 18 μg의 단백질을 환원용액(4% SDS and 0.1 M DTT in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6)과 섞어준 후 37°C로 45분간 반응시켰다. 7분간 끓인 후, 14,000 g로 40 분간 16 °C에서 원심분리 기반 필터를 진행하였다. 추가로 UA 용액(0.2 mL of 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5)과 섞고 상기 원심분리 기반 필터를 3회 반복시행한 후, 55 mM IAA 용액을 0.1 ml 넣고 20분간 암실에서 상온 반응시키고, 40분간 원심분리하였다. 마찬가지로 UA 용액에 섞어 원심분리 기반 필터를 3회 반복시행한 후, 샘플을 100 mM TEAB 용액 0.2 ml에 희석시켜 2회 더 원심분리시켜 트립신 처리를 위한 용액 교환을 진행하였다. 필터를 1.5 ml 튜브에 두고, 고순도의 트립신이 들어있는 100 mM TEAB 용액을 필터 내에서 37 °C로 12시간 동안 분해시킨 후, 14,000 g로 20분간 16°C에서 원심분리 과정을 거쳐 100 mM TEAB 용액 75 μl를 첨가하는 과정을 2회 반복하였다. 수집된 샘플은 SpeedVac 농축기로 건조시킨 후, 5% ACN이 녹아있는 용액 (0.1 % 포름산이 녹아있는 증류수가 용매) 180 μl로 풀어 C-18 회전 칼럼 (Thermo Scientific, USA)으로 제염시킨 후 진공건조 시켰다.
건조된 샘플을 nano-LC-ESI-MS/MS 방법을 이용하여 EASY nLC1000(Thermo Fisher Scientific, Germany)과 연결된 Q Exactive 질량분석기(Thermo Fisher Scientific, Germany)로 분석시켰다. 트립신으로 잘린 펩타이드들을 C18 3-μm 레진으로 패킹된 trap 칼럼 (75 μm × 2 cm)에 로딩한 후, B 용매의 5%-40% 선형 농도구배를 이용하여 85 분간 300 nl/분의 속력으로 용리시켰다. 용리된 펩타이드들은 C18 2-μm 레진으로 패킹된 분석 칼럼 (75 μm × 50 cm)으로 분리시킨 후, nano ESI source에 2.0 kV로 전기분무시켰다. Q Exactive 질량분석기는 상위 10 데이터 종속 방법으로(top 10 data-dependent method) 작동되었다. 정규화 충돌 에너지(normalized collisional energy)를 30%로, 동적 배제 (dynamic exclusion) 시간을 30초로, 전구체 분석창 (precursor isolation window)을 2로 설정하여 고에너지 충돌해리(higher-energy collisional dissociation) 분리를 위한 survey 스캔(m/z; 400-2,000)을 이용하여 가장 풍부한 전구체 이온을 선정하였다. Survey MS 스캔은 HCD 스펙트라 해상도를 17,500으로 설정하여 Orbitrap 분석기를 이용한 70,000의 해상도로 얻어졌다.
3회 반복으로 얻어진 질량분석(MS/MS) 스펙트라는, SEQUEST 엔진툴 (Bioworks-Browser rev. 3.1 coupled with percolator validation)을 이용하여 프로피오니박테리움 아크네스 Uniprot 데이터베이스(2015. 11. reviewed)에서 탐색하였다. 최대 2개의 손실된 절단 부위(missed cleavage site)까지 full tryptic specficity에 포함시키며, 전구체 이온 및 단편 이온의 질량 공차(mass tolerances)는 10 ppm과 0.6 Da으로 설정하였다. carbamidomethyl cysteine의 변용(modification)은 고정하였으며, methionine oxidation의 다양한 변용은 허용하였다. FDR = 0.01의 차단값으로 펩타이드를 선별하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에서 분석된 단백질들 중에서, 3회 반복 중 2회 이상 검출된 신뢰도 높은 단백질들을 선택하여, 총 252 개의 단백질을 최종 발견하였다. 프로피오니박테리움 아크네스의 프로테옴 연구가 많이 진행되지 않았기 때문에, 분석된 단백질의 절반 이상의 특성이 잘 알려지지 않았다. 분석된 단백질들의 세포 내 구성요소 별 분포 비율을 보면, 막 관련 단백질 27.4%, 세포질 단백질 7.1%, 세포 외 단백질 1.2%, 리포솜 단백질 4.4% 로 분석되었다. 이는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 역시, 일반적으로 알려진 세균 유래 소포와 같이, 막으로 싸여 있으며, 세포질, 세포 외 단백질 모두 포함한다는 것을 의미한다. 또한, 생물학적 기능별 단백질 분포 비율을 기준으로 분류해보면, 대사과정 15.9%, 물질수송 7.5%, 단백질 처리과정 5.2%, 번역 4.8%, 병원성 4%로 분석되었다. 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내 단백질이 대사과정과 물질 수송에 매우 높은 비율로 구성되어 있다는 특징으로부터, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 프로피오니박테리움 아크네스의 대사과정 및 물질 수송에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.
상기 프로테옴 분석 결과에 의해 밝혀진 252개 단백질들의 기능으로부터, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 프로피오니박테리움 아크네스의 생화학적 lifestyle, 생존방식, 세포 부착, 병원성 및 염증성 등의 현저한 특징을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내 단백질들 중, 산화적 인산화 (cytochrome c oxidase, Rieske domain protein), 질소 고정 (bacterial cytochrome ubiquinol oxidase, cytochrome d ubiquinol oxidase), 무산소 호흡 (succinate dehydrogenases, methylmalonyl-CoA mutase), 기질 섭취 (ATP-binding cassettes) 관련 단백질이 존재하는 데, 이는 프로피오니박테리움 아크네스가 비호기성이며 혐기성인 비운동성 lifestyle을 갖는다는 사실과 부합된다. 뿐만 아니라, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내 단백질 중, 상당수가 전사, 번역, 단백질 수송, 단백질 접힘에 관련된 기능을 갖는다. 이로부터, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포는 생화학적 처리과정 및 에너지 대사과정 관련 물질 또는 단백질들의 세포 간 수송의 기능을 하며, 비운동성 프로피오니박테리움 아크네스를 대신해 양분을 수송하는 거대 수송체로서의 기능을 할 것으로 예측할 수 있다.
또한, transglycosylase, beta-lactamase, multimodular transpeptidase-transglycosylase, FtsI 등의 세균 펩티도글리칸 층을 결합하거나 페니실린에의 저항성을 갖는 단백질들로부터, 프로피오니박테리움 아크네스가 다양한 종류의 균이 존재하는 환경에서 살아남고, 감염 부위에서의 항생제 저항성을 나타내기 위해 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 이용할 것이라 예측할 수 있다.
숙주의 dermatan sulfate에 결합해 면역성을 나타내는 Putative uncharacterized protein (PPA2127), 숙주의 표피 세포에 결합해 바이오필름을 형성할 수 있게 하는 Putative glycosyl-transferase, 세포에 부착해 당분해 작용으로 병원성을 나타내는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 표피세포에 결합해 lysozyme으로부터 피해 숙주의 면역반응을 회피하는 Polysaccharide deacetylase 등의 세포에 부착하거나 바이오필름을 형성하는데 핵심적인 역할을 하는 단백질들로부터 프로피오니박테리움 아크네스는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 이용해 생물학적 니치를 형성할 수 있다.
숙주의 세포 외 기질을 분해하여 염증세포에서 면역반응을 유도하는 Hyaluronate lyase, 세포 표면의 glycosphingolipid를 분해해 신호전달을 막는 Endoglycoceramidase, 숙주세포 유래 기질을 대사로 사용하는 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H, 숙주에 침입해 세포에 구멍을 내어 터뜨려 강한 병원성을 나타내는 Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) factors 등의 단백질들로부터 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 세포 내로 효율적으로 전달됨을 예상할 수 있다.
NlpC/P60 endopeptidase family protein, basic membrane protein, 60 kDa chaperonin, 10 kDa chaperonin 등은 프로피오니박테리움 아크네스의 생존에 필수적인 단백질이며, 숙주에 침입 시 염증세포들의 방어기작으로 이들에 대한 면역반응이 나타난다는 사실이 보고된 바 있다. 이러한 사실로부터, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 단백질을 이용해 숙주의 면역반응을 자극함으로써 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 통해 면역조절을 위한 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 프로테옴 분석을 통해 동정된 단백질을 하기 표 2에 나타내었다.
Gene Name Accession Protein Name GO-Biological Process GO-Cellular Component
ftsY W4U385_PROAA Signal recognition particle receptor FtsY SRP-dependent cotranslational protein targeting to membrane Cytoplasm, Intrinsic component of plasma membrane
PAST3_05111 A0A085B3F8_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
JCM18909_1125 W4TIQ5_PROAA Uroporphyrinogen III decarboxylase porphyrin-containing compound biosynthetic process -
HMPREF9570_01608 F1UIQ1_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9344_01072 A0A0E1YHC7_PROAA Uncharacterized protein - -
JCM18918_946 W4U3Y9_PROAA L-proline glycine betaine ABC transport system permease protein ProW - -
pdxT W4U4U3_PROAA Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxT glutamine catabolic process, pyridoxal phosphate biosynthetic process, vitamin B6 biosynthetic process -
JCM18920_273 W4UDV8_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9570_01578 F1UIW0_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9570_00330 F1UEX6_PROAA ABC transporter, solute-binding protein - -
HMPREF9206_0523 D1YFC9_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
JCM18918_3895 W4U9Z7_PROAA Dolichol-phosphate mannosyltransferase - -
JCM18916_1395 W4TTY6_PROAA Glutamine synthetase type I Nitrogen compound metabolic process -
JCM18918_383 W4U0P5_PROAA Dolichol-phosphate mannosyltransferase - -
JCM18909_3341 W4TNE4_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9344_00075 A0A0E1YK98_PROAA Succinate CoA transferase acetyl-CoA metabolic process -
PAST3_07564 A0A085B206_PROAA Fructose-bisphosphate aldolase glycolytic process -
HMPREF9570_01325 F1UI30_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9344_01711 A0A0E1YH92_PROAA ErfK/YbiS/YcfS/YnhG - -
HMPREF1162_1003 F9NXK4_PROAA Pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase - -
HMPREF9578_01543 E6D3Y4_PROAA ErfK/YbiS/YcfS/YnhG - -
HMPREF9344_01854 A0A0E1YI81_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
JCM18918_3903 W4UAZ1_PROAA 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2,6-dicarboxylate N-acetyltransferase - -
JCM18920_1123 W4UEG5_PROAA 2,4-dienoyl-CoA reductase - -
JCM18916_1756 W4TVT1_PROAA Uncharacterized protein photosynthesis, light reaction plasma membrane light-harvesting complex
JCM18909_4054 W4TQJ4_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
PAST3_01596 A0A085B4Q8_PROAA Putative glycosyl transferase - -
JCM18916_2713 W4TXW7_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
HMPREF9344_01464 A0A0E1YGY4_PROAA Aminotransferase, class I/II - -
rpoB R4L3U6_PROAA DNA-directed RNA polymerase (Fragment) transcription, DNA-templated -
sdhA D4HEX0_PROAS Succinate dehydrogenase flavoprotein subunit - -
JCM18918_3293 W4UA75_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
JCM18920_3008 W4UKV6_PROAA DNA-directed RNA polymerase Transcription, DNA-templated -
rpsJ F1UKL8_PROAA 30S ribosomal protein S10 translation ribosome
HMPREF1162_2086 F9NXA8_PROAA Peptidase C1-like protein - -
JCM18916_3283 W4TYC7_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
JCM18916_839 W4TSZ0_PROAA Elongation factor Ts - small ribosomal subunit
coxB D4HCM6_PROAS Cytochrome c oxidase, subunit II electron transport chain integral component of membrane
JCM18916_1312 W4TUQ7_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
rplL RL7_PROAC 50S ribosomal protein L7/L12 translation ribosome
cbiN A0A085B001_PROAA Cobalt transport protein CbiN cobalamin biosynthetic process integral component of membrane, plasma membrane
JCM18920_2186 W4UIY5_PROAA Outer membrane protein A - Cell outer membrane, Integral component of membrane
rplQ F1UKD4_PROAA 50S ribosomal protein L17 translation ribosome
rplS W4UI67_PROAA 50S ribosomal protein L19 translation ribosome
JCM18909_475 W4TF81_PROAA Methylmalonyl-CoA mutase - -
JCM18909_2328 W4TLS3_PROAA LSU ribosomal protein L5p ribosome translation
JCM18916_3017 W4TXR1_PROAA cAMP factor - -
JCM18909_473 W4TH18_PROAA Methylmalonyl-CoA mutase - -
PPA2127 E2ICJ6_PROAA Putative uncharacterized protein (Fragment) - -
JCM18918_1025 W4U2V0_PROAA Signal peptidase I protein processing involved in protein targeting to mitochondrion integral component of membrane
JCM18920_1269 W4UFS4_PROAA Methylmalonyl-CoA:pyruvate transcarboxylase - -
HMPREF0675_5348 D4HBJ7_PROAS SH3 domain protein - -
N/A Q50E66_PROAA CAMP factor 2 - -
HMPREF1162_1035 F9NXN7_PROAA Tricorn protease homolog - cytoplasm
HMPREF9344_00824 A0A0E1YKT1_PROAA Hyaluronate lyase Carbohydrate metabolic process Extracellular region
N/A Q5QCW8_PROAA Camp2 - -
HMPREF9344_01393 A0A0E1YGP6_PROAA NlpC/P60 family protein - -
HMPREF9344_01070 A0A0E1YTB5_PROAA Tricorn protease homolog - cytoplasm
PAST3_10318 A0A085B0H7_PROAA Beta-N-acetylhexosaminidase Carbohydrate metabolic process -
JCM18920_1344 W4UFZ3_PROAA cAMP factor - -
JCM18918_2370 W4U6W5_PROAA Peptidase E - -
hflB A0A0E1YKG2_PROAA ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH protein catabolic process integral component of membrane, plasma membrane
HMPREF9344_00204 A0A0E1YLS2_PROAA SH3 domain protein - -
PAST3_08146 A0A085B1J8_PROAA Serine acetyltransferase cysteine biosynthetic process from serine cytoplasm
HMPREF1162_1127 F9NUI0_PROAA Bacterial SH3 domain protein - -
HMPREF9578_02632 E6DAK7_PROAA Periplasmic binding protein - -
rpsE A0A085B5C6_PROAA 30S ribosomal protein S5 Translation Small ribosomal subunit
HMPREF9344_00841 A0A0E1YLV6_PROAA ABC transporter, ATP-binding protein - -
HMPREF9570_02049 F1UK58_PROAA ABC transporter, solute-binding protein - -
JCM18909_3059 W4TNL8_PROAA ABC transporter ATP-binding protein - -
rpsD F1UKD2_PROAA 30S ribosomal protein S4 translation small ribosomal subunit
JCM18916_3143 W4TY03_PROAA ABC transporter ATP-binding protein - -
HMPREF9578_00861 E6D6Z0_PROAA Sugar-binding domain protein - -
rpsF A0A085B274_PROAA 30S ribosomal protein S6 translation ribosome
JCM18920_3587 W4ULS0_PROAA ABC transporter - -
PA4687 Q06WK8_PROAA HtaA-like surface protein - -
atpA A0A085B090_PROAA ATP synthase subunit alpha ATP hydrolysis coupled proton transport, plasma membrane ATP synthesis coupled proton transport -
rplN F9NX47_PROAA 50S ribosomal protein L14 translation large ribosomal subunit
HMPREF9570_00519 F1UFZ3_PROAA Periplasmic binding protein - -
HMPREF0675_4199 D4HDU5_PROAS Beta-lactamase - -
JCM18916_557 W4TRS6_PROAA ATP synthase gamma chain ATP synthesis coupled proton transport -
JCM18916_980 W4TSU8_PROAA Membrane protein - -
HMPREF0675_4855 D4H9R7_PROAS Triacylglycerol lipase - -
JCM18918_412 W4U2L4_PROAA ATP synthase beta chain ATP synthesis coupled proton transport -
JCM18920_1413 W4UG55_PROAA ATP synthase delta chain ATP synthesis coupled proton transport membrane
JCM18909_3148 W4TN95_PROAA Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase - -
tmRNAPropi_acnes_SK137 V6BXX0_PROAA Proteolysis tag peptide encoded by tmRNA Propi_acnes_SK137 (Fragment) - -
HMPREF9570_01661 F1UJ13_PROAA Kinase domain protein - -
JCM18916_1386 W4TUE1_PROAA PTS system phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system integral component of membrane, plasma membrane
HMPREF9570_00339 F1UEY5_PROAA Uncharacterized protein - -
pgk A0A085B4M9_PROAA Phosphoglycerate kinase glycolytic process cytoplasm
JCM18918_1238 W4U4T1_PROAA MoxR-like ATPases - -
JCM18918_4037 W4UAB5_PROAA PTS system phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system -
JCM18918_3273 W4U8C3_PROAA Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase - -
purL W4THC8_PROAA Phosphoribosylformylglycinamidine synthase subunit PurL de novo' IMP biosynthetic process cytoplasm
JCM18918_1333 W4U3P8_PROAA Cytochrome c oxidase polypeptide I - -
JCM18918_303 W4U2A8_PROAA Protein YceG like - -
sucC A0A085B1K8_PROAA Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta tricarboxylic acid cycle -
tatA A0A085B0L5_PROAA Sec-independent protein translocase protein TatA Protein secretion, Protein transport by the Tat complex Integral component of plasma membrane, TAT protein transport complex
PAST3_07599 A0A085B213_PROAA Biotin carboxyl carrier protein of methylmalonyl-CoA:Pyruvate transcarboxylase - -
JCM18916_723 W4TR26_PROAA Lysine-tRNA ligase lysyl-tRNA aminoacylation cytoplasm
rho W4U2H4_PROAA Transcription termination factor Rho DNA-templated transcription, termination, regulation of transcription, DNA-templated -
JCM18909_1988 W4TKY5_PROAA Cation diffusion facilitator family transporter - -
HMPREF9570_01974 F1UJY3_PROAA Uncharacterized protein - integral component of membrane
PAST3_09633 A0A085B110_PROAA ABC-type transporter, periplasmic component - -
JCM18916_3759 W4TZ18_PROAA Preprotein translocase subunit SecE Protein secretion, Protein targeting Integral component of membrane, Intracellular
glyQS A0A085B438_PROAA Glycine-tRNA ligase glycyl-tRNA aminoacylation cytoplasm
HMPREF9206_1837 D1YCA6_PROAA Tat pathway signal sequence domain protein - -
HMPREF9344_02504 A0A0E1YDI6_PROAA Lon protease (S16) C-terminal proteolytic domain protein protein catabolic process integral component of membrane
secD D4HDW9_PROAS Protein translocase subunit SecD Intracellular protein transmembrane transport, Proteintargeting,ProteintransportbytheSeccomplex Integral component of membrane, Intracellular, Plasma membrane
JCM18916_470 W4TSE3_PROAA Enzyme of poly-gamma-glutamate biosynthesis - -
groL A0A085B1J1_PROAA 60 kDa chaperonin Protein refolding cytoplasm
HMPREF9570_00463 F1UFN7_PROAA ABC transporter, solute-binding protein - -
groL E6D9F5_PROAA 60 kDa chaperonin Protein refolding cytoplasm
groS CH10_PROAC 10 kDa chaperonin protein folding cytoplasm
JCM18920_241 W4UCN3_PROAA PspA/IM30 family protein - -
secA A0A0E1YDL8_PROAA Protein translocase subunit SecA intracellular protein transmembrane transport, protein import, protein targeting cytoplasm, plasma membrane
pstS F1UIJ3_PROAA Phosphate-binding protein PstS phosphate ion transmembrane transport -
JCM18916_1981 W4TVZ8_PROAA Heme ABC transporter - -
HMPREF9578_01591 E6D431_PROAA FHA domain protein - -
HMPREF9344_02598 A0A0E1YF67_PROAA Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Protein folding -
JCM18918_4160 W4UBK0_PROAA Cell envelope-related function transcriptional attenuator - -
JCM18920_274 W4UC57_PROAA Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase protein folding -
JCM18916_1704 W4TTJ3_PROAA ABC transporter ATP-binding protein - -
JCM18909_251 W4TFA1_PROAA Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase protein folding -
JCM18909_2781 W4TM00_PROAA Argininosuccinate synthase Arginine biosynthetic process cytoplasm
JCM18918_2061 W4U6R2_PROAA Integral membrane protein - integral component of membrane
JCM18909_1400 W4THK0_PROAA NADH-ubiquinone oxidoreductase - -
JCM18918_1420 W4U3H8_PROAA Arginine deiminase arginine catabolic process -
HMPREF9570_00243 F1UES3_PROAA Uncharacterized protein - -
JCM18916_2258 W4TX28_PROAA Cell division protein FtsI Cell division -
pepA AMPA_PROAC Probable cytosol aminopeptidase - cytoplasm
JCM18916_3790 W4TZQ4_PROAA Uncharacterized protein - -
JCM18916_1932 W4TU75_PROAA Cell division protein FtsI Cell division -
metN D4H9G7_PROAS Methionine import ATP-binding protein MetN - -
JCM18916_3473 W4TZX4_PROAA Uncharacterized protein - -
실시예 8. 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 항염증 효과
프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 염증세포에서 염증매개체 분비에 대한 영향을 알아보기 위해, 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포(P. acnes EV)를 다양한 농도(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖)로 처리한 후 세포사멸과 ELISA(R&D system, USA)를 통해 각각 염증매개체 (IL-6, TNF-α 등)의 분비량을 측정하였다. 보다 구체적으로, Raw 264.7 세포를 1 x 105 개씩 24-well 세포 배양 플레이트에 분주한 후, 24시간 동안 DMEM 완전배지에서 배양시켰다. 이후 세포사멸은 MTT assay(Sigman, 미국)를 진행 수행하였다. 또한, 염증매개체 분비능을 평가하기 위하여 배지를 걷어내고 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 새로운 DMEM 완전배지에 섞어 처리한 후, 6시간부터 24시간까지 37 ℃ 인큐베이터에서 배양 후 배양 상층액을 얻어내었다. 배양 상층액을 1.5 ml 튜브에 모아 3000 g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 모아 4 ℃에 보관해두었다가 ELISA 분석을 진행하였다.
ELISA 분석을 위해, Capture 항체를 PBS에 희석시켜 96-well 폴리스티렌 플레이트에 작용 농도에 맞게 50 μl 씩 분주한 후 4 ℃에서 overnight 반응시켰다. 이후 PBST (0.05 % tween-20이 들어있는 PBS) 용액 100 μl로 두 번씩 씻어준 후, RD(1 % BSA 가 들어있는 PBST) 용액 100 μl을 분주하여 상온에서 1시간 동안 blocking 한 후, 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, 샘플 및 standard를 농도에 맞게 50 μl씩 분주하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, detection 항체를 RD에 희석시켜 작용 농도에 맞게 50 μl씩 분주하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 또 다시 PBST 100 μl로 두 번 씻어준 후, Strpetavidin-HRP를 RD에 1/200으로 희석시켜 50 μl씩 분주하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 마지막으로 PBST 100 μl로 세 번 씻어준 후, TMB substrate와 0.04 % 과산화수소수를 1:1 혼합한 용액 50 μl를 분주한 후 발색을 기다리다가 5분에서 20분 후 발색이 진행되었을 때, 1 M 황산용액을 50 μl씩 분주해 반응을 멈추고 Synergy™ HT multi-detection microplate reader를 이용해 (BioTek, USA) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 처리농도에 상관없이 염증세포의 세포사멸이 유도되지 않았다.
또한, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 처리에 의한 대식세포 염증매개체 분비가 병원성 소포인 대장균 유래 소포(E. coli EV)에 비하여 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 체내에 흡수되었을 때, 훨씬 안전함을 알 수 있었다.
상기 결과를 바탕으로, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 다양한 농도의 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 대식세포주에 대장균 유래 소포 (1㎍/㎖ 농도)를 처리하기 12시간 전에 투여한 후, 대장균 유래 소포에 의한 염증성 사이토카인 분비를 ELISA법으로 측정하였다.
그 결과, 도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 전 처리 한 경우, 대장균 유래 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비가 현저히 억제됨을 확인하였다. 이는, 대장균 유래 소포와 같은 병원성 소포에 의해 유도되는 천식 등의 염증질환 및 당뇨병 등의 대사질환을 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 효율적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 9. 황색포도상구균 유래 소포에 의한 피부 각질세포 사멸에 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 항사멸효과
황색포도상구균 유래 소포에 의한 피부상피세포의 사멸에 대한 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 억제효과를 평가하기 위하여, 대식세포주 대신에 각질세포주(HaCaT cell)를 사용하여 상기 실시예 8과 동일한 전처리 과정을 한 후, 황색포도상구균 유래 소포 및 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 24시간 처리 후, MTT assay(Sigman, 미국)를 수행하였다.
그 결과, 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 황색포도상구균 유래 소포에 비하여 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 의한 각질세포의 사멸이 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.
상기 결과를 토대로, 황색포도상구균 소포에 의한 피부 각질세포의 사멸에 대한 프로피오니박테리움 아크네스 소포의 사멸 억제 효과를 평가하기 위하여, 다양한 농도의 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 각질세포주에 황색포도상구균 유래 소포 (100 ㎍/㎖ 농도)를 처리하기 12시간 전에 투여한 후, MTT assay(Sigman, 미국)를 수행하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 소포를 전 처리 한 경우, 황색포도상구균 소포에 의한 각질세포 사멸이 억제됨을 확인하였다. 이는, 황색포도상구균 유래 소포와 같은 병원성 소포에 의해 유도되는 피부질환이 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 효율적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 10. 안드로젠 수용체 발현에 대한 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포의 효과
상기 실시예 3 및 실시예 5를 통해 정상인에 비하여 유방암 및 아토피피부염 환자의 혈액에 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였는바, 나아가 상기 소포의 아토피피부염 및 유방암 등에 대한 치료기전을 구체적으로 알아보고자 하였다. 이를 위해, 도 14에 그림으로 도시한 바와 같이, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 6 주령 C57BL/6 수컷 마우스에 처리하여 마우스 전립선 조직에서 안드로젠 수용체 발현을 평가하였다. 각 세 마리로 구성된 실험군에 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 (PaEV) 1 μg을, 대조군에는 PBS 또는 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포가 갖는 잘 알려진 항원인 펩티도글리칸(PGN) 1 μg과 lipoteichoic acid(LTA) 1 μg을 매주 2회씩 총 4주간 복강으로 주사하였다. 마지막 주사 3일 후, 전립선 조직을 적출하여 갈아내어 상층액을 얻어, 안드로젠 수용체 (AR)의 발현양상을 western blot으로 확인해 보았다.
Western blot 분석을 위해, 적출한 마우스 전립선 조직을 1.5 ml 튜브로 옮겨 담은 후 액체 질소에 넣어 급속냉각시켰다.. 이후, lysis 용액을 넣고, 비드를 넣어 Tissuelyser II (Qiagen, Germany)으로 조직을 갈았다. 갈아진 조직 용액을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮겨 17,000 g 15 분간 4 ℃에서 원심분리시켜 상층액을 얻는 과정을 2번 반복하였다. 상층액의 단백질을 BCA 분석법을 이용하여 정량하였다. 150 ㎍의 단백질 샘플을 loading 용액과 섞어 4% stacking 젤과 7.5 % seperating 젤에서 160 V 1시간 동안 SDS-PAGE를 진행 후, PA 젤을 100 % 에탄올에서 5분간 활성화된 PVDF 막으로 400 mA 50분 동안 얼음통 내에서 transfer를 진행하였다. Tranfer된 PVDF 막은 RD 용액(5% skim milk 가 들어있는 TBS-T) 에 상온에서 40분간 shaking incubation 시켰다. 이후 TBS-T로 30분간 3번 씻어준 후, 안드로젠 수용체(androgen receptor)에 대한 1차 항체를 1/4000으로 RD에 희석시켜 상온에서 1시간 반 동안 shaking incubation 시켰다. TBS-T로 30분간 3번 씻어준 후, 2차 항체를 1/4000으로 RD에 희석시켜 상온에서 1시간 동안 shaking incubation 시켰다. TBS-T로 30분간 3회 씻어준 후, ECL femto substrate (Thermo Scientific, USA)를 1/10으로 증류수에 희석시켜 PVDF 막에 뿌려주어 LAS 4000(GE Healthcare, UK) 기기로 웨스턴 이미지를 얻었다. 대조군으로 β-actin에 대한 웨스턴 이미지를 사용하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 잘 알려진 항원인 펩티도글리칸 (PGN)과 lipoteichoic acid (LTA)에서와 달리, 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포를 투여하였을 경우에 전립선조직에 안드로젠 수용체가 과발현된 것을 확인할 수 있었다. 유방암 치료를 위해 안드로젠 수용체를 자극하고, 또한 안드로젠 수용체 발현이 증가하는 사춘기 때에 아토피피부염이 호전되는 현상을 통해, 프로피오니박테리움 아크네스 소포가 안드로젠 수용체 발현을 증가시켜 치료효능을 나타내는 것이 치료기전이 하나임을 알 수 있다. 또한, 안드로젠 수용체의 과발현은 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포 내에서 PGN과 LTA 등의 비단백질 성분이 아닌 단백질 성분에 의해 이루어짐을 예상할 수 있다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포는 전립선조직에서 안드로젠 수용체의 발현을 증가시키고, 상기 소포를 염증세포에 전처치하였을 때, 항염증 및 면역조절 기능을 갖는 효과를 관찰하였는바, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단 또는 예측방법, 약학적 조성물, 식품, 및 화장품 등에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (20)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 환자 유래 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA 서열에 존재하는 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포 검출 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 환자 유래 샘플은 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암은 간암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염증질환은 아토피피부염 또는 천식인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 내분비질환은 골다공증, 노쇠, 또는 탈모인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 대사질환은 당뇨병 또는 간경화증인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 프로피오니박테리움 속 세균은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacerium acnes)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 소포는 평균 직경이 10 내지 1000 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 소포는 프로피오니박테리움 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 암은 유방암 또는 간암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 염증질환은 아토피피부염 또는 천식인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 내분비질환은 골다공증, 노쇠, 또는 탈모인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 대사질환은 당뇨병 또는 간경화증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 흡입제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스 유래 소포에 포함된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료 방법.
  18. 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 치료 용도.
  19. 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  20. 프로피오니박테리움 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 암, 염증질환, 내분비질환, 또는 대사질환의 개선용 화장료 조성물.
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