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WO2018230710A1 - ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体 - Google Patents

ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体 Download PDF

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WO2018230710A1
WO2018230710A1 PCT/JP2018/022940 JP2018022940W WO2018230710A1 WO 2018230710 A1 WO2018230710 A1 WO 2018230710A1 JP 2018022940 W JP2018022940 W JP 2018022940W WO 2018230710 A1 WO2018230710 A1 WO 2018230710A1
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WO
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group
mmol
lipid
integer
sirna
Prior art date
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PCT/JP2018/022940
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English (en)
French (fr)
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原島　秀吉
悠介 佐藤
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Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
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Publication date
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Priority to KR1020197036750A priority patent/KR102676927B1/ko
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Definitions

  • the present invention relates to a lipid membrane structure for intracellular delivery such as siRNA (short interfering RNA). More specifically, the present invention relates to a lipid membrane structure such as a liposome capable of easily delivering siRNA or the like into the nucleus of immune cells, particularly into the cells of dendritic cells.
  • siRNA short interfering RNA
  • a lipid membrane structure such as a liposome capable of easily delivering siRNA or the like into the nucleus of immune cells, particularly into the cells of dendritic cells.
  • a method of encapsulating a drug in a liposome that is a lipid membrane structure has been proposed as a means of specifically transporting the drug to the affected area.
  • the effectiveness of liposomes encapsulating an antitumor agent has been reported in the field of malignant tumor treatment.
  • a lipid membrane structure that can be used for gene expression a multifunctional envelope-type nanostructure (MEND: Multifunctional envelope-type nano device; hereinafter referred to as “MEND” in this specification.
  • MEND Multifunctional envelope-type nano device
  • non-patent literature See 1 etc.
  • This structure can be used as a drug delivery system for selectively delivering a gene or the like into a specific cell, and is known to be useful for, for example, tumor gene therapy.
  • lipid membrane structures As a means to deliver target substances such as drugs, nucleic acids, peptides, polypeptides, and sugars to specific sites such as target organs and tumor tissues using lipid membrane structures, the surface of lipid membrane structures is a functional molecule.
  • a number of methods of modifying with have been proposed.
  • Lipid membrane structures encapsulating drugs such as anti-tumor agents reach the target cells and are taken into cells by endocytosis and become encapsulated in endosomes, and then undergo lysosomal enzymatic hydrolysis. The received drug is released into the cytoplasm.
  • Non-patent Document 3 Liposomes (Non-patent Document 3) and MENDs (Patent Document 4) in which the surface of the liposome is modified with a peptide (GALA: Non-patent Document 2) have been proposed in order to enhance the drug release from the liposomes incorporated into the endosome. ing.
  • GALA Non-patent Document 2
  • a means for transferring a lipid membrane structure encapsulating a target substance such as nucleic acid into the nucleus of a target cell for example, a liposome whose outer surface is modified with octaarginine (Patent Document 1, Non-Patent Document) 4), bilamellar liposomes having a lipid membrane modified with a nuclear translocation peptide (Patent Document 2), and liposomes whose surface is modified with a monosaccharide such as galactose or mannose (Patent Document 3) have been proposed.
  • Non-patent Document 5 a lipid membrane structure modified with a KALA peptide
  • dendritic cells are antigen-presenting cells that play a central role in immune responses, and are therefore important target cells for cancer immunotherapy.
  • Immune cell therapy (dendritic cell therapy) is also performed in which dendritic cells are collected from cancer patients, and after antigen introduction and activation outside the body, they are administered to the patients again.
  • immunosuppressive factors in dendritic cells have been discovered, and dendritic cells are also attracting attention as siRNA drug targets.
  • Non-Patent Document 6 RNA introduction into dendritic cell nuclei
  • Non-Patent Document 7 RNA introduction into dendritic cell nuclei
  • siRNA introduction into dendritic cells using artificial delivery systems there are few reports of siRNA introduction into dendritic cells using artificial delivery systems.
  • the use of a viral vector can achieve high-efficiency knockdown of a target gene, it has a safety problem.
  • D-MEND R8 / GALA-D-MEND
  • Non-patent Document 8 D-MEND is a nanocarrier in which the number of envelope membranes of MEND is controlled by modifying the cytoplasmic element octaarginine (R8) peptide and the endosomal escape element GALA peptide to MEND.
  • D-MEND shows about 70% knockdown at a low siRNA concentration of 12 nM in HeLa cells, which are commonly used cancer cells, and its activity is Lipofectamine, which is widely used as a general introduction reagent. More than double the activity compared to 2000 (LFN2000).
  • cationic lipids have been developed in order to achieve efficient in vivo delivery of functional nucleic acids, particularly siRNA capable of suppressing the expression of specific target genes.
  • functional nucleic acids particularly siRNA capable of suppressing the expression of specific target genes.
  • pH-sensitive cationic lipids that are electrically neutral at physiological pH and change cationically in a weakly acidic pH environment such as endosomes is remarkable.
  • Jayaraman et al. Developed DLin-MC3-DMA and achieved 0.005 mg siRNA / kg with ED 50 in factor 7 (F7) knockdown in mouse liver (Non-patent Document 10).
  • the present inventors have also developed unique pH-sensitive cationic lipids YSK05 and YSK13-C3 so far, and achieved 0.06 and 0.015 mg siRNA / kg as ED 50 in F7 knockdown, respectively (non-patent literature) 11, Non-Patent Document 12, Non-Patent Document 13).
  • Maier et al. Developed L319 that imparted biodegradability to MC3-DMA, and reported on the compatibility of 0.01 mg siRNA / kg and high safety at ED 50 (Non-patent Document 14, Non-patent Document 15, Non-patent document 16).
  • Non-patent Document 17 the efficiency of endosomal escape of lipid nanoparticles containing these lipids is still only a few percent (Non-patent Document 17), and the development of technology that can further improve bioavailability has been made. It is desired.
  • Non-patent Document 18 a unique lipid-like substance cKK-E12 through high-throughput screening, and achieved 0.002 mg siRNA / kg with ED 50 in F7 knockdown.
  • Non-patent Document 20 Non-patent Document 21
  • siRNA delivery activity is significantly reduced by downsizing LNP (Non-patent Document 22 and Non-patent Document 23). While overcoming this problem is extremely important in realizing an excellent siRNA delivery technology for cancer treatment, there is no knowledge at present about how to overcome this problem.
  • An object of the present invention is to provide means for efficiently delivering siRNA or the like into cells, particularly immune cells such as dendritic cells having antigen-presenting ability. More specifically, a lipid membrane structure capable of efficiently delivering siRNA into cells of various cells including immune cells such as dendritic cells, and useful for the production of the lipid membrane structure It is an object of the present invention to provide new compounds. In particular, it is possible to provide a novel compound and a lipid membrane structure capable of achieving both excellent delivery efficiency such as siRNA and high safety and overcoming a decrease in delivery activity such as siRNA accompanying a decrease in the particle size of LNP. It is the subject of the present invention.
  • the present inventors have first devised means for efficiently delivering siRNA into cells in order to achieve efficient knockdown of a target gene in immune cells, particularly dendritic cells capable of presenting antigens. investigated.
  • lipid membrane structures such as MEND
  • lipid compounds such as YSK12, which have two unsaturated bonds in two fatty acid chains and have an increased pKa by extending the carbon chain in the hydrophilic part, are lipidated. It has been found that very high endosomal escape is achieved when used as a component.
  • the present inventors have also found that a lipid membrane structure prepared with a lipid composition containing this lipid compound can perform target gene knockdown with siRNA extremely efficiently (Non-patent Document 24 and Patent Document 6).
  • the present inventors have further improved the delivery efficiency and the high safety of the target substance to be delivered to cells such as siRNA (hereinafter sometimes referred to as “subject to be delivered”) based on the structure of YSK12.
  • subject to be delivered based on the structure of YSK12.
  • novel compound and lipid membrane structure that can overcome the decrease in the delivery activity of the substance to be delivered with the decrease in the particle size of LNP, biodegradability, excellent endosomal escape ability, and stability of LNP
  • R 3 and R 4 each independently represents a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group (the C 1-4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group).
  • Group may be substituted with one or two phenyl groups), but R 3 and R 4 are bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle (on the ring, 1 or 2
  • a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group may be substituted).
  • a salt thereof is
  • r and t are 0, and q + s + u is an integer of 8 to 18, preferably an integer of 10 to 16, or a salt thereof
  • r is 1, t is 0, q is an integer of 5 to 9, preferably 6 to 8, and s + u is an integer of 5 to 9, preferably 6 to 8;
  • the above lipid compound or a salt thereof is provided, wherein v is an integer of 5 to 12, preferably an integer of 6 to 10.
  • r and t are 0, q + s + u is an integer of 8 to 18, preferably an integer of 10 to 16, and v is an integer of 5 to 12, preferably 6 to
  • the above lipid compound or a salt thereof which is an integer of 10; r is 1, t is 0, q is an integer of 5 to 9, preferably an integer of 6 to 8, and s + u is an integer of 5 to 9
  • the above lipid compound or a salt thereof is preferably provided, which is an integer of 6 to 8, and v is an integer of 5 to 12, preferably an integer of 6 to 10.
  • lipid compound or a salt thereof wherein in the above formula (I), a is 4 and b is 0 or 1.
  • R 1 and R 2 are each independently a group represented by the formula (A): r And t is 0, q + s + u is an integer of 8 to 18, preferably an integer of 10 to 16, and v is an integer of 5 to 12, preferably an integer of 6 to 10, or r is 1 Yes, t is 0, q is an integer of 5 to 9, preferably 6 to 8, s + u is an integer of 5 to 9, preferably 6 to 8, and v is 5 to 12
  • the above lipid compound or a salt thereof which is an integer, preferably a group which is an integer of 6 to 10.
  • b is 0 and X is a group represented by the formula (B) (where d is 0, R 3 and R 4 are or each C 1-4 alkyl group independently (C 1-4 alkyl group represented by R 3 may be optionally substituted with one phenyl group), or when R 3 and R 4 are bonded to each other 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group (the 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group is one C 1 -4 aforementioned lipid compound is an alkyl to form a which may optionally) substituted with groups) or a salt thereof; b is 1, X is a group represented by the formula (B) (provided that, d is 1 to 3 R 3 and R 4 each independently represent a C 1-4 alkyl group (the C 1-4 alkyl group represented by R 3 may
  • a lipid compound represented by the above formula (I) or a salt thereof for use as a lipid component of a lipid membrane structure for delivering a delivery target substance such as siRNA into cells.
  • the lipid compound is an immune cell or a cancer cell, more preferably a dendritic cell, monocyte, macrophage, or cancer cell; the lipid membrane structure is a liposome.
  • the above lipid compound or a salt thereof and the above lipid compound or a salt thereof, wherein the lipid membrane structure is a multifunctional envelope nanostructure (MEND).
  • MEND multifunctional envelope nanostructure
  • the present invention provides a lipid membrane structure containing a lipid compound represented by the above formula (I) as a lipid component.
  • This lipid membrane structure is, for example, a liposome.
  • the lipid membrane structure is a lipid membrane structure for delivering a substance, preferably siRNA, into a cell, and a substance to be delivered such as siRNA is enclosed inside. ing.
  • the lipid membrane structure can be used for knocking down a target gene in a cell.
  • the cells are immune cells or cancer cells, more preferably dendritic cells, monocytes, macrophages, or cancer cells.
  • the lipid membrane structure can be used for knocking down a target gene in dendritic cells having antigen-presenting ability. Therefore, from the above viewpoint, according to the present invention, the above-mentioned for use in knockdown of a target gene in cells, preferably immune cells or cancer cells, more preferably dendritic cells, monocytes, macrophages, or cancer cells. Lipid membrane structures are also provided.
  • Lipid membrane structure the above lipid membrane structure, wherein the cell is an immune cell, preferably a dendritic cell, monocyte, or macrophage; the above lipid membrane structure, which is a liposome And a lipid compound as described above that is a multifunctional envelope nanostructure (MEND).
  • MEND multifunctional envelope nanostructure
  • a method for delivering a substance to be delivered such as siRNA, into a cell, preferably an immune cell, particularly preferably a dendritic cell, wherein the substance to be delivered is encapsulated inside and a lipid.
  • a method comprising the step of contacting a cell with the above lipid membrane structure containing the lipid compound represented by the above formula (I) as a component. This method may be performed in vivo in mammals including humans, or may be performed in vitro using cells separated and collected from the living body.
  • the dendritic cell when using a dendritic cell, after introducing the substance to be delivered into the cell by the above method on the dendritic cell isolated and collected from the patient, the dendritic cell in which the target gene is knocked down is used.
  • Dendritic cell therapy can be performed by administering to the patient. Therefore, according to the present invention, the dendritic cell is an immunotherapy, in which a dendritic cell is isolated and collected from a patient, a target substance is knocked down after introducing a substance to be delivered into the dendritic cell in vitro.
  • a method of administering cells to the patient is provided.
  • dendritic cells are isolated and collected from a patient, a substance to be delivered is introduced into the dendritic cell in vitro, and then the dendritic cell in which the target gene is knocked down is administered to the patient.
  • the above-mentioned lipid membrane structure used for knocking down a target gene in dendritic cells is provided.
  • the lipid compound of the present invention achieves both excellent delivery efficiency and high safety of a delivery target substance such as siRNA, and can overcome a decrease in delivery activity such as siRNA accompanying a decrease in the particle size of LNP
  • the body can be provided.
  • biodegradability, excellent endosome escape ability, and LNP stabilization ability can be imparted to the lipid membrane structure.
  • the lipid membrane structure provided by the invention efficiently migrates into cells of any cell where it is difficult to introduce a delivery target substance such as siRNA, such as immune cells including dendritic cells, and efficiently escapes from endosomes can do. Therefore, the lipid membrane structure can efficiently release the encapsulated delivery target substance in the cell and knock out the target gene by the delivery target substance.
  • lipid membrane structure of the present invention effective immunotherapy, preferably dendritic cell therapy, using a substance such as siRNA, for example, in cancer treatment can be performed.
  • a lipid membrane structure such as a liposome is prepared using the lipid compound provided by the present invention as a lipid component, very high endosomal escape property is achieved, and the lipid membrane structure containing the lipid compound enters the cytoplasm. It becomes possible to efficiently deliver a substance to be delivered such as siRNA.
  • Example 2 It is a schematic diagram of the preparation procedure of LNP by the alcohol dilution method.
  • Example 2 it is the figure which showed pKa of each LNP containing the lipid compound from which the chemical structure of a hydrophilic part each differs.
  • Example 2 it is the figure which showed the in-vivo F7 knockdown activity of each LNP containing the lipid compound from which the chemical structure of a hydrophilic part differs, respectively.
  • Example 2 it is the figure which showed the in-vitro knockdown activity of each LNP containing the lipid compound from which the chemical structure of a hydrophilic region each differs.
  • Example 2 it is the figure which showed the hemolysis activity of each LNP containing the lipid compound from which the chemical structure of a hydrophilic region each differs.
  • Example 3 it is the figure which showed pKa of LNP containing the lipid compound (CL4 series) from which hydrophobic scaffold structures differ, respectively.
  • Example 3 it is the figure which showed pKa of LNP containing the lipid compound (CL15 series) from which each hydrophobic scaffold structure differs.
  • Example 3 it is the figure which showed the in-vitro knockdown activity of CL15-LNP from which each hydrophobic scaffold structure differs.
  • Example 3 it is the figure which showed the in-vivo F7 knockdown activity of LNP containing a lipid compound (CL4 series) from which hydrophobic scaffold structure differs, respectively.
  • Example 3 it is the figure which showed the in-vivo F7 knockdown activity of LNP containing a lipid compound (CL15 series) from which each hydrophobic scaffold structure differs.
  • Example 3 it is the figure which showed the optimization result of the lipid composition of the pharmaceutical formulation which used the in-vivo F7 knockdown activity of CL4H6-LNP as an index.
  • Example 3 it is the figure which showed the optimization result of the Lipid / siRNA charge ratio of the pharmaceutical prescription which used the in-vivo F7 knockdown activity of CL4H6-LNP as a parameter
  • index it is the figure which showed the dosage dependence of the in-vivo F7 knockdown efficiency of optimal composition CL4H6-LNP.
  • Example 4 it is the result which evaluated the safety
  • Example 4 it is the result which evaluated the safety
  • Example 4 it is the figure which showed the in-vitro knockdown activity of CL15-LNP controlled to about 35-nm average particle diameter.
  • Example 5 it is the figure which showed pKa of LNP containing the lipid compound (CL4H series) from which each hydrophobic scaffold structure differs.
  • Example 5 it is the figure which showed the in-vivo-F7 knockdown activity of LNP containing the lipid compound (CL4H series) from which each hydrophobic scaffold structure differs.
  • Example 6 the measurement results of siRNA amount (ng / g liver) in the liver 30 minutes after administration of CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA against F7 FIG.
  • Example 6 the measurement results of siRNA amount (ng / g liver) in the liver 24 hours after administration of mice administered with CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA for F7 FIG.
  • Example 6 the amount of siRNA (ng / g liver, 24h) in the liver 24 hours after administration of CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA against F7, F7 is a graph plotting the relationship between the ED 50 in the knock-down.
  • hepatic blood vessels (FITC), lipids (DiI), and siRNA (1 hour after administration of mice administered CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA against F7 ( It is a fluorescent staining image of Cy5).
  • Example 6 the amount of F7 protein in the relative plasma of mice administered with CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA against F7 (in the plasma of LNP-untreated mice (NT) on each recovery day) It is a figure which showed the time-dependent change of F7 protein amount as 100).
  • the time elapsed after LNP administration (day) when the amount of F7 protein in the relative plasma of the mice administered with CL4H6-LNP, YSK05-LNP, and YSK13-C3-LNP loaded with siRNA against F7 was 50 When a diagram plotting the relationship between the ED 50 in the F7 knockdown.
  • Example 6 it is the figure which showed the time-dependent change of content of each cationic lipid in the liver of the mouse
  • Example 6 it is the figure which showed the time-dependent change of content of each cationic lipid in the spleen of the mouse
  • Example 7 the relative blood PEG-DSG-modified CL4H6-LNP level in mice administered with PEG-DSG-modified CL4H6-LNP (the amount of PEG-DSG-modified CL4H6-LNP (ID) administered to the mouse was 100%) over time It is the figure which showed the change.
  • Example 7 the relative expression level of PLK1 in cancer tissues of OSRC2 cell subcutaneously transplanted mice administered with PEG-DSG-modified CL4H6-LNP and PEG-DSG-modified YSK05-LNP loaded with siRNA against PLK1 24 hours after administration It is the figure which showed the measurement result (The PLK1 expression level in the cancer tissue of the OSRC2 cell subcutaneous transplant mouse
  • the rate of change in body weight of the OSRC2 cell subcutaneously transplanted mice administered with PEG-DSG modified CL4H6-LNP and PEG-DSG modified YSK05-LNP loaded with siRNA against PLK1 (%) It is the figure which showed the measurement result of).
  • Example 8 macrophages derived from ICR mouse bone marrow cells were transfected with siRNA against CD45, and the relative CD45 expression level of each macrophage after 24-hour culture (the CD45 expression level of tumor-related macrophages (NT) not administered with siRNA) It is a figure which showed the measurement result of 100%.
  • CL4H6-LNP or YSK05-LNP loaded with siRNA against CD45 was administered to mice subcutaneously transplanted with OSRC2 cells, and the relative CD45 expression level (%) of tumor-related macrophages 24 hours after administration (siRNA not administered to CD45) It is the figure which showed the measurement result of CD45 expression level in tumor related macrophage (NT) of 100%).
  • mice were repeatedly administered with CL4H6-LNP intravenously at 0.3 mg siRNA / kg or 1 mg siRNA / kg on days 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, and 23 from the start of administration It is the figure which showed the time-dependent change of the body weight change rate (%) which made the body weight of the administration start day 0 100%.
  • X1 to X2 (X1 and X2 are real numbers satisfying X1 ⁇ X2)” means “X1 or more and X2 or less”.
  • the lipid compound according to an embodiment of the present invention (the lipid compound of the present invention) is represented by the following formula (I).
  • a represents an integer of 3 to 5, and is preferably 4.
  • b represents an integer of 0 or 1. When b is 0, it means that the —O—CO— group does not exist and is a single bond.
  • R 1 and R 2 each independently represent a group represented by the following formula (A).
  • r and t are 0, and q + s + u is an integer of 8-18, preferably an integer of 10-16.
  • r is 1, t is 0, q is an integer of 5 to 9, preferably 6 to 8, and s + u is an integer of 5 to 9, preferably 6 It is an integer of ⁇ 8.
  • v is an integer from 4 to 12, preferably an integer from 6 to 10, more preferably 6.
  • An embodiment in which a is 4 and b is 0 or 1 is also preferred. However, when b and c are 0 simultaneously, q is an integer of 3 to 5, r and t are 1, s is 1, and u + v is an integer of 6 to 10. except.
  • X represents a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group or a group represented by the following formula (B):
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group represented by X is bonded to (O—CO) b— by a carbon atom, and 1 or 2 C 1-4 alkyl groups (having 1 to 2 carbon atoms) are present on the ring. 4 alkyl group) or a C 2-4 alkenyl group (an alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms) may be substituted.
  • Examples of the hetero atom contained in the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group include a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom.
  • One ring-constituting heteroatom may be contained, or two or more heteroatoms that are the same or different may be contained.
  • the heterocyclic ring constituting the heterocyclic group may contain one or two or more double bonds, but the heterocyclic ring does not become an aromatic ring. Saturated heterocycles may be preferred.
  • the C 1-4 alkyl group includes a methyl group, an ethyl group, n- Examples thereof include a propyl group, an n-butyl group, an isopropyl group, an isobutyl group, and a tert-butyl group.
  • Examples of the C 2-4 alkenyl group include an ethenyl group (vinyl group), a propenyl group, and a butenyl group.
  • d represents an integer of 0 to 3
  • R 3 and R 4 each independently represent a C 1-4 alkyl group or a C 2-4 alkenyl group. Examples of the C 1-4 alkyl group and C 2-4 alkenyl group are the same as those described above.
  • the C 1-4 alkyl group or C 2-4 alkenyl group represented by R 3 and R 4 may be substituted with 1 or 2 phenyl groups, respectively.
  • R 3 and R 4 may combine with each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle may be substituted with 1 or 2 C 1-4 alkyl groups or C 2-4 alkenyl groups.
  • b is 0 and X represents a group represented by the formula (B).
  • d is preferably 0, and R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group (the C 1-4 alkyl group represented by R 3 is substituted with one phenyl group). They may be combined with each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • R 3 and R 4 When R 3 and R 4 are bonded to each other, it preferably forms a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group, and the 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group , 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group may be substituted with one C 1-4 alkyl group.
  • b represents 1 and X represents a group represented by the formula (B).
  • d is preferably an integer of 1 to 3
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-4 alkyl group (the C 1-4 alkyl group represented by R 3 is one phenyl group) And may be bonded to each other to form a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • R 3 and R 4 When R 3 and R 4 are bonded to each other, it preferably forms a 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group, 1-morpholinyl group, or 1-piperazinyl group, and the 1-pyrrolidinyl group, 1-piperidinyl group
  • the 1-morpholinyl group or 1-piperazinyl group may be substituted with 1 or 2 identical or different C 1-4 alkyl groups.
  • b is 1, and X is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group (the group is bonded to (O—CO) b— by a carbon atom),
  • the 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group is preferably a pyrrolidinyl group, piperidinyl group, morpholinyl group, or piperazinyl group, and the pyrrolidinyl group, piperidinyl group, morpholinyl group, or piperazinyl group is 1 or 2 identical or It may be substituted with a different C 1-4 alkyl group.
  • the lipid compound represented by the formula (I) may exist as an acid addition salt.
  • the kind of acid constituting the salt is not particularly limited, and may be any of mineral acids or organic acids.
  • mineral salts such as hydrochloride, nitrate, sulfate, or organic acid salts such as tartrate, oxalate, maleate, malate, p-toluenesulfonate, methanesulfonate, etc.
  • the lipid compound represented by the formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and these substances are also included in the scope of the present invention.
  • optical isomers may exist, and pure forms of optical isomers, mixtures of optically active isomers, racemates, and the like are also included in the scope of the present invention.
  • particularly preferred compounds include compounds in which R 1 and R 2 are the same and a is 4.
  • the compound of the formula (I) including this compound can be easily produced by the method specifically shown in the examples of the present specification. By referring to the production method of this Example and appropriately selecting raw material compounds, reagents, reaction conditions, etc., those skilled in the art can easily produce any compound included in the scope of formula (I). .
  • the pKa of the compound of formula (I) is not particularly limited, but can be selected, for example, from about 4.0 to 9.0, preferably from about 4.5 to 8.5. The type of each substituent is selected so as to give a pKa in this range. Is preferred.
  • lipid structures such as liposomes into cells by endocytosis is affected by the pKa of the lipid structure.
  • the pKa of lipid structures that are easily taken up by endocytosis differs. For this reason, it is preferable to adjust the pKa of the compound of the formula (I) so that the pKa of the lipid structure is in a range that can be easily taken into the target cells.
  • Examples of the lipid constituting the lipid membrane structure of the present invention include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acid esters, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.
  • Examples of phospholipids and phospholipid derivatives include phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, 1 , 2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, phosphatidic acid and the like, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • Fatty acid residues in these phospholipids are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 20 carbon atoms. Specific examples include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearin Mention may be made of acyl groups derived from fatty acids such as acids, oleic acid and linoleic acid. Moreover, phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used.
  • glycolipid examples include glyceroglycolipid (eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), sphingoglycolipid (eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside) and the like. Can be mentioned.
  • glyceroglycolipid eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride
  • sphingoglycolipid eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside
  • sterols examples include animal-derived sterols (for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterol) (for example, stigmasterol, sitosterol, campesterol, Brush castrol), sterols derived from microorganisms (for example, timosterol, ergosterol) and the like.
  • animal-derived sterols for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols for example, stigmasterol, sitosterol, campesterol, Brush castrol
  • sterols derived from microorganisms for example, timosterol, ergosterol
  • saturated or unsaturated fatty acid examples include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • saturated or unsaturated fatty acid ester examples include glycerin fatty acid ester in which one or two hydroxyl groups of glycerol are ester-bonded with fatty acid.
  • fatty acid residue in the glycerin fatty acid ester examples include acyl groups derived from saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid. Specific examples include dimyristoyl glycerol (DMG) and distearoyl glycerol (DSG).
  • the form of the lipid membrane structure is not particularly limited.
  • a form dispersed in an aqueous solvent a single membrane liposome, a multilamellar liposome, an O / W emulsion, a W / O / W emulsion, a spherical micelle, a string micelle Or an irregular layered structure.
  • a preferred form of the lipid membrane structure of the present invention is a liposome.
  • a liposome may be described as a preferred embodiment of the lipid membrane structure of the present invention, the lipid membrane structure of the present invention is not limited to liposomes.
  • the lipid membrane structure of the present invention is a lipid membrane structure for delivering a delivery target substance such as siRNA into a cell, the delivery target substance is encapsulated therein, and the above formula ( It is characterized by containing a lipid compound represented by I).
  • the type of cell (target cell) to which the substance to be delivered is delivered by the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited.
  • the lipid membrane structure of the present invention includes various cells constituting animals such as immune cells, endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts, hepatocytes (hepatocytes), pancreatic cells, nerve cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, and the like.
  • the substance to be delivered can be delivered to a wide variety of cells such as cancer cells in which these cells have become cancerous and stem cells having differentiation potential.
  • the target cell may be a cell in an animal body or a cell cultured in vitro such as a cultured cell or a primary cultured cell.
  • immune cells include dendritic cells, macrophages, lymphocytes (T cells, B cells, NK cells), granulocytes, monocytes and the like.
  • the cells to which the lipid membrane structure of the present invention is delivered preferably include immune cells and cancer cells, and particularly preferably include dendritic cells, monocytes, macrophages, and cancer cells.
  • siRNA will be described as a preferred example of a substance to be delivered (delivery target substance), but the delivery target substance is not limited to siRNA.
  • delivery target substance is not limited to siRNA.
  • any pharmaceutical active ingredients such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antiviral agents, saccharides, peptides, low molecular weight compounds, metal compounds Any substance can be encapsulated in the lipid membrane structure of the present invention.
  • SiRNA small interfering RNA
  • RNAi RNA interference
  • Synthetic siRNA has been reported to cause RNA interference in human cells, and it can be knocked down by RNA interference using siRNA, so it can be used in medicine and therapeutic fields such as cancer. Expected.
  • the type of siRNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and any siRNA may be used as long as it can cause RNA interference.
  • RNA having a structure in which the 3 ′ portion of the RNA strand protrudes by 2 bases, and each strand has a phosphate group at the 5 ′ end and a hydroxyl group at the 3 ′ end as siRNA in the present invention Can be used. Also included are siRNAs in which the hydroxyl group at the 2 ′ position of the ribose backbone is partially substituted with a methoxy group, a fluoro group, or a methoxyethyl group, and a phosphodiester bond is partially substituted with a phosphorothioate bond.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be used to deliver siRNA into cells, preferably immune cells or cancer cells, particularly preferably dendritic cells, monocytes, macrophages, or cancer cells.
  • This method can be performed in vivo in mammals including humans, or in vitro using cells separated and collected from the living body.
  • dendritic cells the target gene was knocked down after siRNA was introduced into the cells using the lipid membrane structure of the present invention for the dendritic cells isolated and collected from the patient.
  • Dendritic cell therapy can be performed by administering dendritic cells to the patient.
  • the double-stranded siRNA delivered into the cell by the lipid membrane structure of the present invention is dissociated into a single strand under the action of an enzyme called helicase, and is directed against the target mRNA.
  • a complex (RISC) is formed with an Argonaute protein or the like that exhibits endonuclease activity, and the target gene can be knocked down by RNA interference.
  • the lipid compound of formula (I) may be used alone as the lipid component of the lipid membrane structure of the present invention, but generally one or more of the lipids described above and the lipid of formula (I) It is preferable to form a lipid membrane structure in combination with a compound.
  • the combination of a plurality of lipids and the blending ratio thereof are not particularly limited, but as specifically shown in the examples, for example, the type and blending ratio of lipids to be used as an index such as knockdown activity for a target gene should be optimized. Can do.
  • lipid component a compound of formula (I), 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE), cholesterol (Chol), 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol, methoxy
  • POPE 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • cholesterol Chol
  • 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol methoxy
  • PEG-DMG 2000 polyethylene glycol 2000 dimyristoyl glycerol
  • the content of the compound of formula (I) is 80 to 90 mol%, preferably about 85 mol%
  • PEG-DMG 2000 is about 1-2.
  • the POPE / Chol ratio (molar ratio) is about 0/15 to 4/11, preferably about 0/15 mol, preferably about 1 mol% and / or 85 mol% of the compound of formula (I)
  • the knockdown activity can be increased by setting the ratio to / 15, it is not limited to these specific lipids and the blending ratio thereof.
  • the particle size of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but in a preferred embodiment, the average particle size is about 60 to 140 nm, more preferably about 80 to 120 nm, and in another preferred embodiment, the average particle size is about 20 to 50 nm. It may be preferable from the viewpoint of knockdown efficiency.
  • the polydispersity index (PDI) is about 0.05 to 0.1, preferably about 0.06 to 0.08, and more preferably about 0.07.
  • the zeta potential can be in the range of 5.5 to 6.0 mV, preferably about 5.8 mV.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be subjected to appropriate surface modification as required.
  • the lipid membrane structure in order to promote the nuclear translocation of the lipid membrane structure of the present invention, for example, can be surface-modified with an oligosaccharide compound having 3 or more sugars.
  • the type of oligosaccharide compound having 3 or more sugars is not particularly limited.
  • an oligosaccharide compound having about 3 to about 10 sugar units bound thereto can be used, and preferably about 3 to about 6 sugar units. Bound oligosaccharide compounds can be used.
  • oligosaccharide compound for example, cellotriose (Cellotriose: ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) -D-glucose), chacotriose: ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 4)]-D-glucose), gentianose (- ⁇ -D-fructofuranosyl ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 6) - ⁇ -D-Glucopyranoside), Isomaltotriose ( ⁇ -D-Glucopyranosyl- (1 ⁇ 6) - ⁇ -D-Glucopyranosyl- (1 ⁇ 6) -D-glucose), Isopanose : ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 4) - ⁇ -D-
  • an oligosaccharide compound that is a trimer or hexamer of glucose can be used, and more preferably, an oligosaccharide compound that is a trimer or tetramer of glucose can be used.
  • isomaltotriose, isopanose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc. can be suitably used, and among these, malto in which glucose is ⁇ 1-4 bonded. More preferred is triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose.
  • the amount of surface modification of the lipid membrane structure by the oligosaccharide compound is not particularly limited. For example, it is about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably 5 to 10 mol% with respect to the total amount of lipid. Degree.
  • the method of modifying the surface of the lipid membrane structure with an oligosaccharide compound is not particularly limited.
  • a liposome in which the surface of the lipid membrane structure is modified with a monosaccharide such as galactose or mannose is known.
  • the surface modification method described in this publication can be employed.
  • the entire disclosures of the above publications are incorporated herein by reference.
  • This means is a method in which a monosaccharide compound is bonded to a polyalkylene glycolated lipid to modify the surface of the lipid membrane structure.
  • the surface of the lipid membrane structure can be simultaneously modified with polyalkylene glycol. preferable.
  • polyalkylene glycol is preferable.
  • polyalkylene glycol for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol and the like can be used.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.
  • the surface modification of the lipid membrane structure with polyalkylene glycol can be easily performed by, for example, constructing a lipid membrane structure using a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid.
  • a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid.
  • stearyl polyethylene glycol for example, PEG45 stearate (STR-PEG45) or the like
  • polyalkylene glycolation lipid is not limited to these.
  • surface modification with the polyalkylene glycol and the oligosaccharide compound can be simultaneously achieved by bonding the oligosaccharide compound to the polyalkylene glycol.
  • the method of surface-modifying the lipid membrane structure with a polyalkylene glycol or oligosaccharide compound is not limited to the above-mentioned method.
  • a lipidated compound such as stearyl polyalkylene glycol or oligosaccharide compound is used.
  • surface modification can be performed by using as a constituent lipid of the lipid membrane structure.
  • examples of lipid derivatives for enhancing retention in blood include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, etc. Can also be used.
  • hydrophilic polymers for enhancing blood retention are dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer Combined, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan and the like can also be used for surface modification.
  • the lipid membrane structure of the present invention comprises a sterol or a membrane stabilizer such as glycerin or a fatty acid ester thereof; an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene; a charged substance; One or two or more substances selected from the group consisting of a membrane polypeptide and the like may be contained.
  • the charged substance that imparts a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammoniumpropane; or cationic polymers. Can be mentioned.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • Examples of the membrane polypeptide include a membrane superficial polypeptide or an integral membrane polypeptide. The compounding amount of these substances is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be provided with any one function or two or more functions such as a temperature change sensitivity function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitivity function.
  • a temperature change sensitivity function e.g., a temperature change sensitivity function
  • a membrane permeation function e.g., a membrane permeation function
  • a gene expression function e.g., a pH sensitivity function
  • the retention of a lipid membrane structure containing a nucleic acid containing a gene in blood is improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen is reduced. be able to.
  • the lipid membrane structure that has been taken up into the target cell by endocytosis can be efficiently escaped from the endosome and transferred into the nucleus, achieving high gene expression activity in the nucleus. It becomes possible to do.
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoyl phosphatidylcholine and the like.
  • Examples of the pH-sensitive lipid derivative that can impart a pH-sensitive function include dioleoylphosphatidylethanolamine.
  • the lipid membrane structure of the present invention can also be modified with substances such as antibodies that can specifically bind to cell surface receptors and antigens. This modification can improve the efficiency of substance delivery into the nucleus of the cell. For example, it is preferable to arrange a monoclonal antibody against a biological component specifically expressed in the target tissue or organ on the surface of the lipid membrane structure. This technique is described in Non-Patent Document 25, for example.
  • a lipid derivative capable of reacting with a mercapto group in a monoclonal antibody or a fragment thereof such as poly (ethylene glycol) ) - ⁇ -distearoylphosphatidylethanolamine- ⁇ -maleimide, ⁇ - [N- (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoryl-ethyl) carbamyl) - ⁇ - [3- [2- ( By including a lipid derivative having a maleimide structure such as 2,5-dihydro-2,5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) ethanecarboxamido] propyl ⁇ -poly (oxy-1,2-ethanedyl)
  • the monoclonal antibody can be bound to the membrane surface of the lipid membrane structure.
  • the surface of the lipid membrane structure of the present invention may be modified with a polypeptide containing a plurality of consecutive arginine residues (hereinafter referred to as “polyarginine”).
  • the polyarginine is preferably a polypeptide containing 4 to 20 consecutive arginine residues, more preferably a polypeptide consisting of only 4 to 20 consecutive arginine residues, particularly preferably octaarginine. Can do.
  • Modification of the lipid membrane structure surface with polyarginine can be easily performed by using, for example, a lipid-modified polyarginine such as stearylated octaarginine as a constituent lipid of the lipid membrane structure according to the method described in the above publication. It can be carried out.
  • a lipid-modified polyarginine such as stearylated octaarginine as a constituent lipid of the lipid membrane structure according to the method described in the above publication. It can be carried out.
  • a compound having a nucleic acid introduction function can be added as necessary.
  • examples of such compounds include O, O′-N-didodecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O′-N-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethyl).
  • Ammonioacetyl) -diethanolamine chloride O, O'-N-dihexadecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O'-N-dioctadecenoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O ', O' '-tridecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammoniodecanoyl) aminomethane bromide and N- [ ⁇ -trimethylammonioacetyl] -didodecyl- D-glutamate, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl) -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate, 1 , 2-Dimy
  • Envelope-type nanostructures with multi-functionality are known and can be suitably used as the lipid membrane structure of the present invention.
  • MEND for example, a structure in which a complex of a nucleic acid such as plasmid DNA and a cationic polymer such as protamine is used as a core and the core is encapsulated inside a lipid envelope membrane in a liposome form has been reported.
  • a peptide for adjusting pH responsiveness and membrane permeability can be placed on the lipid envelope membrane of MEND as needed, and the outer surface of the lipid envelope membrane is modified with alkylene glycol such as polyethylene glycol. It has also been reported that it can.
  • MENDs are also known that are designed so that condensed DNA and cationic polymers are encapsulated inside the lipid envelope of MEND, and gene expression can be achieved efficiently.
  • review articles such as Non-Patent Document 1 can be referred to.
  • the disclosures of the above publications and the disclosures of all documents cited in this review are hereby incorporated by reference.
  • the form of the lipid membrane structure is not particularly limited, and examples thereof include a form dispersed in an aqueous solvent (for example, water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, etc.) and a form obtained by lyophilizing this aqueous dispersion. It is done.
  • an aqueous solvent for example, water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, etc.
  • the method for producing the lipid membrane structure is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be employed.
  • all the lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and after forming a lipid film by drying under reduced pressure with an evaporator or spray drying with a spray dryer, the above mixture is dried with an aqueous solvent.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier.
  • it can manufacture also by the method well-known as a method of manufacturing a liposome, for example, a reverse phase evaporation method etc.
  • extrusion may be performed under high pressure using a membrane filter having a uniform pore size.
  • the size of the lipid membrane structure in a dispersed state is not particularly limited.
  • the average particle size is about 60 to 140 nm, preferably about 80 to 120 nm, and yet another preferred embodiment is the average particle size. It may be preferable from the viewpoint of knockdown efficiency to be about 20 to 50 nm.
  • the particle diameter can be measured, for example, by the DLS (dynamic light scattering) method.
  • the average particle diameter of the lipid membrane structure means the number average particle diameter measured by DLS.
  • the measurement by DLS can be performed by a conventional method using a commercially available DLS apparatus or the like.
  • the composition of the aqueous solvent is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like. Can do.
  • a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like.
  • aqueous solvents can stably disperse lipid membrane structures, but also glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose.
  • Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol (aqueous solutions), glycerin, diglycerin, poly Glycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol -Alkyl ether, 1,3-polyhydric alcohol (aqueous solution), such as butylene glycol and the like may be added.
  • aqueous solution such as butylene glycol and the like
  • the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent In order to stably store the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is desirable to eliminate the electrolyte in the aqueous solvent as much as possible from the viewpoint of physical stability such as aggregation suppression. From the viewpoint of chemical stability of the lipid, it is possible to set the pH of the aqueous solvent from weakly acidic to near neutral (about pH 3.0 to 8.0) and / or to remove dissolved oxygen by nitrogen bubbling or the like. desirable.
  • aqueous dispersion of lipid membrane structure When the obtained aqueous dispersion of lipid membrane structure is freeze-dried or spray-dried, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides; lactose, sucrose, cellobiose, trehalose Improve stability by using sugars (aqueous solution) such as disaccharides such as maltose; trisaccharides such as raffinose and merezinose; polysaccharides such as cyclodextrin; sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol; There are cases where it is possible.
  • sugars aqueous solution
  • disaccharides such as maltose
  • trisaccharides such as raffinose and merezinose
  • polysaccharides such as cycl
  • a polyhydric alcohol aqueous solution
  • aqueous solution such as diethylene glycol monoalkyl ether or 1,3-butylene glycol
  • substances can be encapsulated in the lipid membrane structure of the present invention as long as the function of siRNA is not inhibited.
  • the types of substances that can be encapsulated are not particularly limited, but include any active pharmaceutical ingredients such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antiviral agents, saccharides, peptides, nucleic acids, low molecular weight compounds, metals Any substance such as a compound can be encapsulated.
  • the nucleic acid include a nucleic acid containing a gene, and more specifically, for example, a gene incorporated in a plasmid, but are not limited to this specific embodiment.
  • Patent Document 6 discloses a method for synthesizing a lipid compound containing YSK12, a method for preparing a lipid membrane structure using the lipid compound, and a gene for THP-1 cells (human monocyte strain) for the obtained lipid membrane structure.
  • the expression suppressing action and the gene expression suppressing action on Jurkat cells (human T cell line) are specifically shown.
  • the entire disclosure of Patent Document 6 is included in the disclosure of the present specification by reference.
  • Example 1 The lipid compound of the present invention was synthesized according to the following scheme.
  • the hydrophobic scaffold is the same as that of YSK12 (Patent Document 6), that is, when a lipid in which c in the general formula (A) is 0 is synthesized, linoleic acid (Compound A) was used as a starting material. Linoleic acid was reduced with lithium aluminum hydride (Compound B), activated by mesylating the hydroxyl group (Compound C), and brominated by the action of magnesium bromide (Compound D). Two linoleic acid-derived hydrophobic scaffolds were linked by performing Grignard reaction using ⁇ -Valerolactone as a substrate (Compound E). When the tertiary amino group was directly bonded to the hydrocarbon chain, the primary hydroxyl group was activated by tosylation (Compound F), and the amino group was introduced by nucleophilic substitution reaction.
  • a lipid containing an ester bond in the hydrophobic scaffold for example, c in the general formula (A) is 1, and a lipid containing an ester bond in R 1 and R 2 is a straight chain alkane (having 6 to 6 carbon atoms).
  • lipid compounds were expressed as “Cationic® Lipid® (CL) -hydrophilic site number-hydrophobic scaffold 2 number-hydrophobic scaffold 1 number” according to the following partial structure.
  • YSK12 disclosed in Patent Document 6 is expressed as “CL1A6”.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 300 mL of hexane was added and suspended, and the insoluble material was removed by Celite filtration to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by subjecting to silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 26.0 g (88.0 mmol) of ((6-bromohexyl) oxy) (tert-butyl) dimethylsilane. Was obtained as a colorless oil. The yield was 80%.
  • the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 11-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) -5- (6-((tert-butyl 14.0 g (26.3 mmol) of dimethylsilyl) oxy) hexyl) undecane-1,5-diol was obtained as a colorless oil.
  • the yield based on ⁇ -valerolactone was 66%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 11-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) -5- (6-((tert-butyl 12.4 g (28.0 mmol) of dimethylsilyl) oxy) hexyl) -5-hydroxyundecyl 4-methylbenzenesulfonate was obtained as a colorless oil. The yield was 69%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 11- (4- (diisopropylamino) butyl) -2,2,3,3,19,19, 20,27-Octamethyl-4,18-dioxa-3,19-disilahenicosan-11-ol 7.27 g (11.8 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 66%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, and then purified by subjecting it to reverse phase silica gel chromatography ⁇ elution solvent; water (0.1% trifluoroacetic acid): acetonitrile 0.1% trifluoroacetic acid) (continuous gradient) ⁇ .
  • -(4- (Diisopropylamino) butyl) tridecane-1,7,13-triol 3.43 g (8.85 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 75%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 7- (4- (diisopropylamino) butyl) -7-hydroxytridecane-1,13-diyl di Obtained 93 mg (0.115 mmol) of tetradecanoate (CL4C6) as a pale yellow oil. The yield was 58%.
  • the crude product was purified by subjecting it to silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 7- (4- (diisopropylamino) butyl) -7-hydroxytridecane-1,13-diyl dipalmitate. 143 mg (0.164 mmol) of (CL4D6) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 82%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 11-((tert-butyldimethylsilyl) oxy) -5- (6-((tert-butyldimethyl). Silyl) oxy) hexyl) -5-hydroxyundecyl 1-methylpiperidine-4-carbooxylate 5.01 g (7.61 mmol) was obtained as a colorless oil. The yield was 76%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, and then purified by subjecting it to reverse phase silica gel chromatography ⁇ eluting solvent; water (0.1% trifluoroacetic acid): acetonitrile 0.1% trifluoroacetic acid) (continuous gradient) ⁇ .
  • 11-dihydroxy 5- (6-hydroxyhexyl) undecyl 1-methylpiperidine-4-carbooxylate 2.34 g (5.45 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 72%.
  • the reaction solution was collected and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 10.64 g (30.9 mmol) of (9z, 12z) -octadiene-1-methanesulfonate as a colorless oil. Obtained. The yield was 95%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 8.85 g (26.9 mmol) of 18-bromo-octadeca- (6z, 9z) -diene as a colorless oil. Got as. The yield was 87%.
  • the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 4-[(9z, 12z) -octadienyl]-(13z, 16z) -tricosadiene-1, 1.64 g (2.73 mmol) of 4-diol was obtained as a colorless oil.
  • the yield based on ⁇ -valerolactone was 85%.
  • silica gel was added to the reaction solution, and the solvent was distilled off using a rotary evaporator. Then, it refine
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluent: dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 432 mg (0.673 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 78%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to obtain 401 mg (0.611 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 77%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to obtain 81 mg (0.118 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 47%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 97.4 mg (0.138 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 55%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to obtain 85.0 mg (0.127 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 51%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 116 mg (0.163 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 65%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 117 mg (0.164 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 82%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, 5 mL of ethyl acetate was added, and the mixture was washed with 5 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution. Subsequently, the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluent: dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 130 mg (0.179 mmol) as a pale yellow oil. The yield was 90%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 7- (4- (dimethylamino) butyl) -7-hydroxytridecane-1,13-diyl di Tetradecanoate (CL1C6) 472 mg (0.627 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 48%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ elution solvent; dichloromethane: methanol (continuous gradient) ⁇ to give 7- (4- (dimethylamino) butyl) -7-hydroxytridecane-1,13-diyl dioleate (CL1H6) 2.56 g (2.98 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 50%.
  • the solvent was distilled off using a rotary evaporator, and then purified by subjecting it to reverse phase silica gel chromatography ⁇ eluting solvent; water (0.1% trifluoroacetic acid): acetonitrile 0.1% trifluoroacetic acid) (continuous gradient) ⁇ to obtain 2.40. g (5.95 mmol) was obtained as a pale yellow oil. The yield was 57%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 14.0 g (44.3 mmol) as a colorless oil. The yield was 51%.
  • the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 8.00 g (13.58 mmol) as a colorless oil.
  • the yield based on ⁇ -valerolactone was 70%.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluting solvent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 21.0 g (59.8 mmol) as a colorless oil. The yield was 57%.
  • the organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. After filtering this, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain a crude product.
  • the crude product was purified by silica gel chromatography ⁇ eluent; hexane: ethyl acetate (continuous gradient) ⁇ to give 11.95 g (18.52 mmol) as a colorless oil.
  • the yield based on ⁇ -valerolactone was 69%.
  • Example 2 We evaluated pH-sensitive cationic lipids whose hydrophobic scaffolds are derived from linoleic acid and have various hydrophilic sites.
  • LNP was prepared by mixing each pH-sensitive cationic lipid, cholesterol, methoxy polyethyleneglycol 2000 dimirystoylglycerol (PEG-DMG 2000) with a molar ratio of 50: 50: 0.75-1.5, and alcohol. Prepared by the dilution method ( Figure 1). The average particle size calculated by the phase light scattering method was 80-120 nm, and the siRNA loading rate was 90% or more.
  • the pKa of each LNP was determined using p-Toluenesulfonic acid (TNS).
  • TNS final concentration: 0.75 ⁇ M
  • LNP final concentration: 30 ⁇ M
  • TNS p-Toluenesulfonic acid
  • the highest value and the lowest value were calculated as 100% and 0% charge, respectively, and the pH showing 50% charge rate was calculated as pKa.
  • Fig. 2 the chemical structure around the tertiary amino group
  • the hemolysis activity, in vitro knockdown activity and in vivo F7 knockdown activity as indicators of endosome escape activity were measured.
  • mouse erythrocytes and LNP were mixed in a buffer adjusted to pH 6.5, incubated at 37 ° C. for 30 min, centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 545 nm was measured.
  • the hemolysis efficiency of each sample was calculated using a sample to which LNP was not added and a sample to which Triton X-100 having a final concentration of 0.5% was added as negative and positive controls, respectively.
  • Example 3 The hydrophilic site was immobilized on two types of CL4 and CL15, and the effect of changing the chemical structure of the hydrophobic scaffold was evaluated in the same manner as in Example 2.
  • CL4 was 6.25-6.40 and CL15 was 6.80-7.25, which was not affected by the change in the hydrophobic scaffold structure (FIGS. 4A and 4B).
  • other derivatives except CL15B were superior to CL15A having a conventional hydrophobic scaffold (FIG. 5).
  • CL15H which has oleic acid as a hydrophobic scaffold, showed about three times higher activity than CL15A.
  • hydrophobic scaffolds C and D showed low activity for both CL4 and CL15, while hydrophobic scaffold H showed the same or higher activity as hydrophobic scaffold A (FIGS. 6A and 6B). .
  • the formulation formulation was optimized from the viewpoint of knockdown activity, focusing on the lipid composition and lipid / siRNA charge ratio.
  • LNP was prepared by changing the CL4H: cholesterol molar ratio from 30:70 to 70:30. As a result, the maximum activity was shown at a CH4H: cholesterol ratio of 60:40 (FIG. 7A).
  • LNP was prepared by changing the Lipid / siRNA charge ratio in the range of 2.375-14.25. As a result of the experiment, the knockdown activity increased as the charge ratio increased, and reached a plateau at a charge ratio of about 7 (FIG. 7B). From this result, the charge ratio of 14.25 was determined as the optimum charge ratio.
  • More CL4H-LNP prepared in optimized prescription from study, F7 result of examining the dose-dependent knockdown showed 0.002 mg siRNA / kg in ED 50 (FIG. 8).
  • YSK13-C3-LNP showed a strong hepatotoxicity of more than 10,000 for both ALT and AST, while CL4H-LNP remained at the same level of slight hepatotoxicity as the PBS administration group (FIG. 9A).
  • the YSK13-C3-LNP administration group showed a decrease in body weight, while the CL4H-LNP started to gain weight (FIG. 9B). From the above results, it was shown that CL4H is a lipid compound with excellent safety.
  • the effect of hydrophobic scaffolds on the siRNA introduction activity of small LNPs with an average particle size of about 35 nm was examined.
  • CL15A with a conventional hydrophobic scaffold derived from linoleic acid has 10% of CL15C, CL15D, and CL15H under the condition that the knockdown efficiency is 30% or less with 30 nM siRNA.
  • Both nM siRNAs showed high knockdown efficiency of 50% or more (Fig. 10). This result shows that the pH-sensitive cationic lipid compound having a long hydrophobic scaffold can overcome the decrease in siRNA introduction efficiency associated with the miniaturization of LNP.
  • Example 5 The effect of changing the chemical structure of the hydrophobic scaffold 1 was evaluated in the same manner as in Example 2 using three lipid compounds (CL4H6, CL4H8, and CL4H10) in which the hydrophilic site was fixed to CL4.
  • CL4H6, CL4H8, and CL4H10 When pKa was measured using TNS, it was 6.35 for CL4H6, 6.10 for CL4H8, and 5.85 for CL4H10, and the pKa decreased as the carbon chain length of hydrophobic scaffold 1 increased (FIG. 11).
  • plasma F7 enzyme activity was measured 24 hours after intravenous administration of LNP loaded with siRNA against F7 to ICR mice. As a result, all of the three types of derivatives had activity. Among them, CL4H6 showed the most excellent activity (FIG. 12).
  • Example 6 In vivo F7 knockdown activity was measured for CL4H6 and lipid compounds YSK05 and YSK13-C3 described in Non-Patent Document 11 etc., and the relationship with the remaining amount of siRNA 24 hours after administration was examined.
  • For in vivo F7 knockdown activity prepared each LNP loaded with siRNA against F7 using each lipid compound in the same manner as in Example 2, and each LNP was added to 0.01 mg siRNA / kg in ICR mice (4 weeks old, female). The liver was collected from each mouse 30 minutes and 24 hours after administration, and siRNA in the liver was quantified by qRT-PCR.
  • the siRNA in the liver 30 minutes after administration was similar in LNP using any lipid compound, and it was confirmed that the amount transferred to the liver was almost the same (FIG. 13A).
  • a large difference was observed in the amount of siRNA remaining in the liver 24 hours after administration (FIG. 13B).
  • the amount of siRNA remaining in the liver administered with CL4H6-LNP was 17.3 times that in the liver administered with YSK05-LNP and 4.8 times that in the liver administered with YSK13-C3-LNP.
  • siRNA residual amount in the liver 24 hours after administration was inversely proportional (Fig. @ 13 C).
  • each LNP was intravenously administered to ICR mice (4 weeks old, female) at 1 mg mg siRNA / kg, and the liver of the mice was excised 1 hour after administration, and the nucleus (Hoechst33342), blood vessel (FITC), Lipid (DiI) and siRNA (Cy5) were each fluorescently stained and observed with a confocal laser microscope (CLSM).
  • CLSM confocal laser microscope
  • FIG. 15A shows time-dependent changes in the relative plasma F7 protein level with respect to 100 as the F7 protein level in the plasma of LNP-untreated mice (NT) on each collection day. Mice administered CL4H6-LNP were able to keep the relative plasma F7 protein level low for the longest period.
  • ED 50 in F7 knockdown of mice administered with each LNP was determined, this value and the elapsed time (Durability) (day) after LNP administration when the amount of F7 protein in the relative plasma was 50 had a negative correlation
  • Figure 15B shows that is, CL4H6-LNP maintained gene knockdown activity over a longer period than YSK05-LNP and YSK13-C3-LNP at the same siRNA dose.
  • Plasma F7 protein was quantified by a color reaction using Biophen® FVII assay kit (Hypen® BioMed).
  • FVII protein is first complexed with tissue factor (TF) in the kit.
  • TF tissue factor
  • FVII-TF complex activates factor X (FX) in the kit (FXa), and produces a chromogenic substrate with the enzyme activity.
  • the amount of chromogenic substrate produced was quantified by measuring the absorbance at 405 nm.
  • Example 7 By further modifying CL4H6-LNP with methoxy polyethyleneglycol 2000 distearoylglycerol (PEG-DSG 2000), the residence time in blood was prolonged, and the knockdown activity in cancer cells was further evaluated.
  • LNP carrying siRNA against PLK1 was prepared using CL4H6-LNP in the same manner as in Example 2.
  • the obtained CL4H6-LNP was dispersed with PEG-DSG 2000 in 10% EtOH aqueous solution at pH 6.0 and incubated at 60 ° C. for 30 minutes to further modify CL4H6-LNP with PEG-DMG 2000.
  • This PEG-DSG-modified CL4H6-LNP was intravenously administered to ICR mice (4 weeks old, female) at 0.5 mg siRNA / kg, and the amount of PEG-DSG-modified CL4H6-LNP in blood was quantified over time.
  • FIG. 17 shows the change over time in the amount of PEG-DSG-modified CL4H6-LNP in the relative blood, with the amount (ID) administered to the mouse of PEG-DSG-modified CL4H6-LNP being 100%.
  • PEG-DSG modified YSK05-LNP was prepared in the same manner as PEG-DSG modified CL4H6-LNP. Each LNP was then administered intravenously to OSRC2 cells (derived from human renal cell carcinoma) subcutaneously at 2 ⁇ mg siRNA / kg, and the expression level of the PLK1 gene in the cancer tissue 24 hours after administration was qRT- Measured by PCR method. As a result, the relative PLK1 expression level with the PLK1 expression level in the cancer tissue of LNP-untreated control mice (NT) was set to 1 for PEG-DSG modified CL4H6-LNP mice and PEG-DSG modified YSK05-LNP. Significantly lower in both treated mice. In particular, PEG-DSG-modified CL4H6-LNP had a lower relative blood PLK1 expression level than PEG-DSG-modified YSK05-LNP, and an excellent knockdown activity was observed (FIG. 18A).
  • mice administered PEG-DSG modified YSK05-LNP a slight decrease in body weight was observed after administration, but in mice administered PEG-DSG modified CL4H6-LNP, mice administered PEG-DSG modified YSK05-LNP. There was almost no change in weight. From these results, it was suggested that PEG-DSG-modified YSK05-LNP is highly safe and can be used in various ways.
  • Example 8 LNP containing CL4H6 loaded with siRNA against CD45 was introduced into bone marrow-derived macrophages and the knockdown activity of CD45 gene was measured.
  • the composition of the cationic lipid (CL4H6), cholesterol, and PEG-DMG 2000 was 60: 40: 2, and the siRNA for CD45 was varied in the same manner as in Example 2 except that siRNA for CD45 was used.
  • CL4H6-LNP mounted at various concentrations was prepared.
  • CL4H6-LNP loaded with siRNA against CD45 was added to the culture medium of macrophages derived from ICR mouse bone marrow cells and cultured for 24 hours.
  • FIG. 19 shows the results of the relative CD45 expression level (%) of each macrophage with the CD45 expression level in macrophages (NT) not administered with siRNA against CD45 as 100%. Macrophages transfected with siRNA against CD45 loaded on CL4H6-LNP induced gene knockdown at a 10-fold higher efficiency than macrophages transfected with siRNA against CD45 using Lipofectamine reagent.
  • Example 9 LNP loaded with siRNA against CD45 was administered to OSRC2 cell subcutaneously transplanted mice, and the knockdown activity of CD45 gene was measured.
  • the lipid composition was a cationic lipid (CL4H6 or YSK05), cholesterol, and PEG-DSG 2000 at a molar ratio of 70: 30: 2, and siRNA against CD45 was used, the siRNA against CD45 was used in the same manner as in Example 2.
  • LNP equipped with was prepared. Each LNP was intravenously administered to OSRC2 cell subcutaneously transplanted mice at 2 mg siRNA / kg / dose for 2 consecutive days. The expression level of CD45 gene in tumor-associated macrophages 48 hours after the final administration was measured by flow cytometry.
  • FIG. 20 shows the results of the relative CD45 expression level (%) of each tumor-related macrophage when the CD45 expression level in the tumor-related macrophage (NT) not administered with siRNA is defined as 100%.
  • the relative expression level of CD45 in tumor-associated macrophages was lower in mice administered with siRNA against CD45 in CL4H6-LNP than in mice administered in YSK05-LNP. That is, CL4H6 induced excellent gene knockdown in tumor-associated macrophages.
  • Example 10 Mice were repeatedly administered with LNP containing CL4H6 to evaluate safety. As siRNA loaded on LNP, siRNA having no pharmacological activity for mice was used.
  • LNP (CL4H6-LNP) carrying siRNA against human PLK1 was prepared in the same manner as in Example 2 using CL4H6 as the pH-sensitive cationic lipid.
  • the obtained CL4H6-LNP was repeatedly administered intravenously at 0.3 mg siRNA / kg or 1 mg siRNA / kg every 3 or 4 days to ICR mice (4 weeks old, female).
  • CL4H6-LNP was intravenously administered on the administration start date (day 0) and on days 4, 7, 11, 14, 18, 21, and 23 from the administration start date.
  • 0.3 mg siRNA / kg is 120 times the ED 50 (0.0025 mg siRNA / kg) of CL4H6-LNP loaded with siRNA against F7 (see Example 6), and 1 mg siRNA / kg is 400 times that amount. Dosage.
  • the body weight of each mouse was measured on the 0th, 4th, 7th, 11th, 14th, 18th, 21st, 23rd and 28th days after the start of administration, and compared with the untreated group.
  • FIG. 21 shows the change over time in the rate of change (%).
  • the changes in the body weight of the 0.3 mg mg siRNA / kg administration group and the 1 mg mg siRNA / kg administration group were almost the same as those in the non-administration group, and no systemic toxicity was observed after repeated administration of CL4H6-LNP.
  • the lipid compound of the present invention can achieve excellent delivery efficiency for a delivery target substance such as siRNA, and while reducing the particle size of LNP, the delivery activity of siRNA and the like is reduced while achieving high safety. It is possible to provide a lipid membrane structure that can overcome the above.
  • the lipid membrane structure containing the lipid compound of the present invention has biodegradability, excellent endosome escape ability, and LNP stabilization ability, and siRNA and the like are contained in immune cells such as dendritic cells. Can be delivered efficiently.

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Abstract

この脂質膜構造体は、脂質成分として式(I)：(R1)(R2)C(OH)-(CH2)a-(O-CO)b-X〔式中、aは3～5の整数を示し；bは0又は1の整数を示し；R1及びR2はそれぞれ独立に-CO-O-を有していてもよい直鎖状炭化水素基を示し；Xは5～７員非芳香族ヘテロ環基又は下記の式(B)(式中、dは0～3の整数を示し、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基を示す。R3及びR4は互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環(当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基が置換していていてもよい)を形成してもよい)で表される基を示す〕の脂質化合物を含む脂質膜構造体である。

Description

ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体
　本発明はsiRNA(short interfering RNA)などの細胞内送達のための脂質膜構造体に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞の核内、特に樹状細胞の細胞内にsiRNAなどを容易に送達することができるリポソームなどの脂質膜構造体に関する。
　本願は、２０１７年６月１５日に、日本に出願された特願２０１７－１１７７０８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　薬剤を患部に特異的に輸送する手段として脂質膜構造体であるリポソームに薬剤を封入する方法が提案されている。特に、悪性腫瘍の治療分野において抗腫瘍剤を封入したリポソームの有効性が数多く報告されている。また、遺伝子発現に利用可能な脂質膜構造体として多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND: Multifunctional envelope-type nano device；以下、本明細書において「MEND」と略す場合がある。例えば非特許文献1などを参照のこと)が提案されている。この構造体は、遺伝子などを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、腫瘍の遺伝子治療などに有用であることが知られている。
　脂質膜構造体を用いて薬物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖などの目的物質を標的臓器や腫瘍組織など特異的な部位に送達するための手段として、脂質膜構造体の表面を機能性分子で修飾する方法が多数提案されている。抗腫瘍剤などの薬剤を内包した脂質膜構造体は、標的細胞に到達するとエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれてエンドソーム内に包含された状態となり、その後、リソソームの酵素による加水分解作用などを受けて内包されていた薬剤を細胞質内に放出する。エンドソーム内に取り込まれたリポソームからの薬剤放出性を高めるために、リポソームの表面をペプチド（GALA：非特許文献2）で修飾したリポソーム（非特許文献3）やMEND（特許文献4）が提案されている。
　また、核酸などの目的物質を内包した脂質膜構造体を標的細胞の核内に移行させるための手段としては、例えば、リポソームの外側表面をオクタアルギニンで修飾したリポソーム（特許文献1、非特許文献4）、核移行性ペプチドで修飾された脂質膜を有する2枚膜リポソーム（特許文献2）、ガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（特許文献3）が提案されている。単糖で修飾された多重脂質膜構造体(T-MEND)は脂質膜及び核膜と融合性を示し、in vitroでの試験結果において遺伝子発現効率を改善できたと報告されている。さらに、KALAペプチド（非特許文献5）により修飾された脂質膜構造体が細胞の核内に核酸などの物質を効率的に送達できることが報告されている（特許文献5）。
　一方、樹状細胞は、免疫応答の中心を担っている抗原提示細胞であることから、がん免疫療法の重要な標的細胞の１つである。がん患者から樹状細胞を採取し、体外で抗原導入や活性化を行った後、再びその患者に投与する免疫細胞療法（樹状細胞療法）も行われている。近年、樹状細胞における免疫抑制因子が発見されたことから、樹状細胞はsiRNA医薬の標的としても注目を集めており、樹状細胞療法を免疫療法と組み合わせることにより、より強力ながん免疫誘導を行えると期待されている。
　従来、樹状細胞の核内へのRNA導入に関して、shRNAを発現するレンチウイルスベクターを用いて免疫抑制因子をノックダウンしたとの報告(非特許文献6、非特許文献7)はある。しかし、人工デリバリーシステムを用いた樹状細胞へのsiRNA導入の報告は殆どない。ウイルスベクターの使用は標的遺伝子の高効率ノックダウンを実現可能であるが、安全面に問題がある。
　siRNA導入用の人工デリバリーシステムとしてR8/GALA-D-MEND(D-MEND)が報告されている（非特許文献8）。D-MENDは、細胞親和性素子であるオクタアルギニン(R8)ペプチドとエンドソーム脱出性素子であるGALAペプチドをMENDに修飾し、MENDのエンベロープ膜枚数を制御したナノキャリアである。D-MENDは、一般的に使用されるがん細胞であるHeLa細胞においてはsiRNA濃度が12 nMという低濃度で約70%のノックダウンを示し、その活性は一般導入試薬として汎用されているリポフェクタミン2000(LFN2000)と比較して2倍以上の活性を示す。
　しかしながら、マウス骨髄細胞から誘導した樹状細胞にD-MENDでトランスフェクションを行う場合には、70-80%のノックダウン効率を達成するためにsiRNA濃度を高濃度(80-120 nM)にする必要があり、siRNAの標的因子によっては40%程度のノックダウン効率に留まるという問題もある（非特許文献9）。このように従来の人工デリバリーシステムを用いた場合には、一般的ながん細胞に比べて樹状細胞におけるノックダウン効率は大きく低下する傾向があり、siRNA医薬の免疫療法分野への展開を妨げている。
　これまでに、機能性核酸、とりわけ特定の標的遺伝子の発現を抑制可能なsiRNAの効率的なin vivo送達を達成する目的で、多くのカチオン性脂質が開発されている。特に、生理的pHでは電気的に中性であり、エンドソームなどの弱酸性pH環境下ではカチオン性に変化するpH感受性カチオン性脂質の開発は著しい。JayaramanらはDLin-MC3-DMAを開発し、マウス肝臓における第7因子(F7)ノックダウンにおいてED50で0.005 mg siRNA/kgを達成した（非特許文献10）。本発明者らもこれまでに独自のpH感受性カチオン性脂質YSK05及びYSK13-C3を開発しており、F7ノックダウンにおけるED50としてそれぞれ0.06、0.015 mg siRNA/kgを達成している（非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13）。また、MaierらはMC3-DMAに生分解性を付与したL319を開発し、ED50で0.01 mg siRNA/kgと高い安全性の両立について報告している（非特許文献14、非特許文献15、非特許文献16）。しかしながら、これら上記脂質を含む脂質ナノ粒子のエンドソーム脱出効率は未だ数%程度に過ぎないことが明らかにされており（非特許文献17）、バイオアベイラビリティを更に向上させることが可能な技術の開発が望まれている。
　さらに、Dongらはハイスループットスクリーニングを通して独自の脂質様物質cKK-E12を見出し、F7ノックダウンにおいてED50で0.002 mg siRNA/kgを達成した（非特許文献18）。当該技術は活性の面では文献上最も優れているが、高投与量における毒性や脂質の生分解性等の安全面における知見はない。
　近年、多くのがん組織、特にヒト患者がん組織は、コラーゲンをはじめとする間質成分が非常に豊富であり、それら成分ががん組織内におけるナノ粒子の浸透性を著しく妨げることが明らかにされつつある。ナノ粒子の小型化はこの問題を解決するための非常に有効な戦略として考えられている。実際に、Cabralらは、白金製剤内封高分子ミセルの直径を約30 nmに小さく制御することでがん組織内浸透性が向上し、抗腫瘍効果が向上することを報告している（非特許文献19）。siRNA送達においても同様の戦略が非常に有効であると考えられるが、脂質ナノ粒子(Lipid Nanoparticle: LNP)を小さく制御することは技術的に難しく、報告は非常に乏しい。2液の瞬間混合を達成可能なマイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いることで直径30 nm程度のLNPを再現良く製造可能であることが、近年報告された(非特許文献20、非特許文献21)。一方で、LNPを小型化することで、そのsiRNA送達活性は著しく減少することが見出されている（非特許文献22、非特許文献23）。この問題を克服することは優れたがん治療用siRNA送達技術を実現する上で極めて重要である一方で、その克服法についての知見は現時点で皆無である。
国際公開第2005/32593号 国際公開第2006/101201号 国際公開第2007/102481号 日本国特開2006-28030号公報 国際公開第2011/132713号 国際公開第2015/178343号
Drug Delivery System, vol.22-2, pp.115-122, 2007 Biochemistry, vol.26, pp.2964-2972, 1987 Biochemistry, vol.43, pp.5618-5628, 2004 Journal of Controlled Release, vol.98, pp.317-323, 2004 Biochemistry, vol.36, pp.3008-3017, 1997 Nature Biotechnology, vol.22, pp.1546-1553, 2004 Nature Medicine, vol.14, pp.258-265, 2008 Journal of Controlled Release, vol.143, pp.311-317, 2010 Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol.34, pp.1348-1351, 2011 Angewandte Chemie International Edition, vol.51, pp.8529-8533, 2012 Scientific Reports, 4:4750, DOI: 10.1038/srep04750, 2014 Journal of Hepatology, vol.64, pp.547-555, 2016 Molecular Therapy, vol.24, pp.788-795, 2016 Molecular Therapy, vol.21(8), pp.1570-1578, 2013 Nature Biotechnology, vol.33(8), pp.870-876, 2015 Molecular Pharmaceutics, vol.11, pp.1424-1434, 2014 Nature Biotechnology, vol.31(7), pp.638-646, 2013 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol.111(11), pp.3955-3960, 2014 Nature Nanotechnology, vol.6, pp.815-823, 2011 Journal of Physical Chemistry C Nanomater Interfaces, vol.116(34), pp.18440-18450, 2012 Molecular Therapy - Nucleic Acids, vol.1, e37, 2012 Journal of Controlled Release, vol.229, pp.48-57, 2016 Journal of Controlled Release, vol.235, pp.236-244, 2016 Journal of Controlled Release, vol.225, pp.183-191, 2016 American Association of Pharmaceutical Scientists Journal, vol.14(2), pp.303-315, 2012
　本発明の課題は、細胞、特に抗原提示能を有する樹状細胞のような免疫細胞の細胞内にsiRNAなどを効率的に送達するための手段を提供することにある。より具体的には、樹状細胞などの免疫細胞をはじめとする各種細胞の細胞内に、siRNAを効率的に送達することができる脂質膜構造体、及び当該脂質膜構造体の製造に有用な新規化合物を提供することが本発明の課題である。
　特に、siRNAなどの優れた送達効率と高い安全性を両立させ、LNPの粒子径の減少に伴うsiRNAなどの送達活性の低下の克服を可能とする新規化合物及び脂質膜構造体を提供することが本発明の課題である。
　本発明者らは、先に、免疫細胞、特に抗原提示能を有する樹状細胞における標的遺伝子の効率的なノックダウンを実現すべく、細胞内にsiRNAを効率的に送達するための手段を鋭意検討した。その結果、MENDなどの脂質膜構造体の形成において、2本の脂肪酸鎖に2つの不飽和結合を有し、親水部の炭素鎖を伸長することによりpKaを高めたYSK12などの脂質化合物を脂質成分として用いると非常に高いエンドソーム脱出性が達成されることを見出した。さらに、この脂質化合物を含む脂質組成物で調製した脂質膜構造体ではsiRNAによる標的遺伝子ノックダウンを極めて効率的に行うことができることも見出した（非特許文献24、特許文献6）。この脂質膜構造体を用いてSOCS1をノックダウンした樹状細胞では、サイトカイン産生の顕著な増強が認められ、この樹状細胞を投与したマウス群では、移植した腫瘍の生着・増殖が完全に抑制される。
　本発明者らは、さらにYSK12の構造を基にして、siRNAなどの細胞へ送達する目的の物質（以下、「送達対象物質」ということがある）のさらに優れた送達効率と高い安全性を両立させ、LNPの粒子径の減少に伴う送達対象物質の送達活性の低下の克服を可能とする新規化合物及び脂質膜構造体を提供すべく、生分解性と優れたエンドソーム脱出能、及びLNPの安定化能を付与できる新規化合物を鋭意検討した。その手段として、まず、YSK12の第3級水酸基部位から2本の適当な長さの炭化水素鎖を伸長させ、エステル結合を介して中～長鎖脂肪酸を結合させた。これにより、疎水性足場の鎖長の増大によるエンドソーム脱出能の向上、脂質分子間の疎水性相互作用の増大によるLNP安定化能の付与、及び生分解性の付与を図った。さらに、LNPの動態に大きな影響を与えるパラメーターとしてのpH感受性脂質の酸乖離定数(pKa)を調節するために、親水性部位であるアミノ基周囲の化学構造の最適化を図った。その結果、下記の式(I)で表される化合物が所望の性質を有していることを確認して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明により、下記の式(I)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
〔式中、aは3～5の整数を示し；bは0又は1の整数を示し；R1及びR2はそれぞれ独立に下記の式(A)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 (式中、qは1～9の整数を示し；rは0又は1を示し；sは1～3の整数を示し；tは0又は1を示し；uは1～8の整数を示し；cは0又は1を示し：vは4～12の整数を示すが、bとcが同時に0となる場合には、qが3～5の整数であり、r及びtが1であり、sが1であり、かつu＋vが6～10の整数である場合を除く) で表される基を示し；Xは5～７員非芳香族ヘテロ環基(ただし、当該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基が置換していてもよい)、又は下記の式(B)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 (式中、dは0～3の整数を示し、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基(当該C1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基は1個又は2個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すが、R3及びR4は互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環(当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基が置換していていてもよい)を形成してもよい)で表される基を示す〕
で表される脂質化合物又はその塩が提供される。
　上記の発明の好ましい態様によれば、上記の式 (A)において、r及びtが0であり、q＋s＋uが8～18の整数、好ましくは10～16の整数である上記の脂質化合物又はその塩；rが1であり、tが0であり、qが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、s＋uが5～9の整数、好ましくは6～8の整数である上記の脂質化合物又はその塩；vが5～12の整数、好ましくは6～10の整数である上記の脂質化合物又はその塩が提供される。より好ましくは、上記の式(A)において、r及びtが0であり、q＋s＋uが8～18の整数、好ましくは10～16の整数であり、vが5～12の整数、好ましくは6～10の整数である上記の脂質化合物又はその塩；rが1であり、tが0であり、qが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、s＋uが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、vが5～12の整数、好ましくは6～10の整数である上記の脂質化合物又はその塩が提供される。
　上記の発明の好ましい態様によれば、上記の式(I) において、aが4であり、bが0又は1である上記の脂質化合物又はその塩が提供される。より好ましい態様としては、上記の式(I) において、aが4であり；bが0又は1であり；R1及びR2がそれぞれ独立に式(A)で表される基のうち、r及びtが0であり、q＋s＋uが8～18の整数、好ましくは10～16の整数であり、vが5～12の整数、好ましくは6～10の整数である基、又は、rが1であり、tが0であり、qが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、s＋uが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、vが5～12の整数、好ましくは6～10の整数である基；である、上記の脂質化合物又はその塩が提供される。
　また、別の好ましい態様によれば、上記の式(I)において、bが0であり、Xが式(B)で表される基〔ただし、dは0であり、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すか、あるいはR3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基(当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1個のC1-4アルキル基で置換されていてよい)を形成する)である上記の脂質化合物又はその塩；bが1であり、Xが式(B)で表される基(ただし、dは1～3の整数であり、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すか、あるいはR3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基(当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい)を形成する)である上記の脂質化合物又はその塩；Xが示す5～７員非芳香族ヘテロ環基(当該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合する)がピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基(当該ピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基は1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい)である上記の脂質化合物又はその塩が提供される。
　別の観点からは、本発明により、細胞内にsiRNAなどの送達対象物質を送達するための脂質膜構造体の脂質成分として用いるための上記の式(I)で表される脂質化合物又はその塩が提供される。この発明の好ましい態様によれば、当該細胞が免疫細胞又はがん細胞、より好ましくは樹状細胞、単球、マクロファージ、又はがん細胞である上記の脂質化合物；当該脂質膜構造体がリポソームである上記の脂質化合物又はその塩；及び当該脂質膜構造体が多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)である上記の脂質化合物又はその塩が提供される。
　さらに別の観点からは、本発明により、脂質成分として上記の式(I)で表される脂質化合物を含む脂質膜構造体が提供される。この脂質膜構造体は、例えば、リポソームである。また、この発明の好ましい態様によれば、当該脂質膜構造体は、細胞内に物質、好ましくはsiRNAを送達するための脂質膜構造体であって、siRNAなどの送達対象物質が内部に封入されている。当該脂質膜構造体は、細胞内の標的遺伝子をノックダウンするために用いることができる。この発明の好ましい態様によれば、当該細胞が免疫細胞又はがん細胞、より好ましくは樹状細胞、単球、マクロファージ、又はがん細胞である。例えば、当該脂質膜構造体は、抗原提示能を有する樹状細胞における標的遺伝子をノックダウンするために用いることができる。従って、上記の観点から、本発明により、細胞、好ましくは免疫細胞又はがん細胞、より好ましくは樹状細胞、単球、マクロファージ、又はがん細胞における標的遺伝子のノックダウンに用いるための上記の脂質膜構造体も提供される。
　また、別の好ましい態様により、脂質成分として上記式(I)の脂質化合物、1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE)、コレステロール(Chol)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、及びメトキシポリエチレングリコール2000ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG 2000)からなる群から選ばれる1種又は2種以上の化合物を含む脂質膜構造体；脂質成分として上記式(I)の脂質化合物、コレステロール(Chol)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、及びメトキシポリエチレングリコール2000ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG 2000)からなる群から選ばれる1種又は2種以上の化合物を含む脂質膜構造体；細胞が免疫細胞、好ましくは樹状細胞、単球、又はマクロファージである上記の脂質膜構造体；リポソームである上記の脂質膜構造体；及び多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)である上記の脂質化合物が提供される。
　また、本発明により、細胞、好ましくは免疫細胞、特に好ましくは樹状細胞の細胞内にsiRNAなどの送達対象物質を送達する方法であって、送達対象物質が内部に封入されており、かつ脂質成分として上記の式(I)で表される脂質化合物を含む上記の脂質膜構造体を細胞に接触させる工程を含む方法が提供される。この方法はヒトを含む哺乳類動物の生体内で行ってもよいが、生体から分離・採取された細胞を用いてin vitroで行ってもよい。
　例えば、樹状細胞を用いる場合には、患者から分離・採取された樹状細胞に対して上記の方法により細胞内に送達対象物質を導入した後、標的遺伝子がノックダウンされた樹状細胞をその患者に投与することにより樹状細胞療法を行うことができる。従って、本発明により、免疫療法であって、患者から樹状細胞を分離・採取し、in vitroで樹状細胞の細胞内に送達対象物質を導入した後、標的遺伝子がノックダウンされた樹状細胞をその患者に投与する方法が提供される。また、本発明により、患者から樹状細胞を分離・採取し、in vitroで樹状細胞の細胞内に送達対象物質を導入した後、標的遺伝子がノックダウンされた樹状細胞をその患者に投与する免疫療法において、樹状細胞における標的遺伝子をノックダウンするために用いる上記の脂質膜構造体が提供される。
　本発明の脂質化合物は、siRNAなどの送達対象物質の優れた送達効率と高い安全性を両立させ、LNPの粒子径の減少に伴うsiRNAなどの送達活性の低下の克服を可能にする脂質膜構造体を提供することができる。また、当該脂質膜構造体に対して生分解性と優れたエンドソーム脱出能、及びLNPの安定化能を付与できることができる。発明により提供される脂質膜構造体は、樹状細胞を含む免疫細胞など、siRNAなどの送達対象物質の導入が困難な任意の細胞の細胞内に効率的に移行し、エンドソームから効率的に脱出することができる。このことから、当該脂質膜構造体は、封入された送達対象物質を細胞内において効率的に放出して当該送達対象物質により標的遺伝子をノックアウトすることができる。従って、本発明の脂質膜構造体を用いて、例えばがん治療においてsiRNAなどの物質を利用した有効な免疫療法、好ましくは樹状細胞療法を行うことができる。また、本発明により提供される脂質化合物を脂質成分として用いてリポソームなどの脂質膜構造体を調製すると、非常に高いエンドソーム脱出性が達成され、当該脂質化合物を含む脂質膜構造体から細胞質中にsiRNAなどの送達対象物質を効率よく送達することが可能になる。
アルコール希釈法によるLNPの調製手順の模式図である。 例2において、親水性部位の化学構造がそれぞれ異なる脂質化合物を含む各LNPのpKaを示した図である。 例2において、親水性部位の化学構造がそれぞれ異なる脂質化合物を含む各LNPのin vivo F7ノックダウン活性を示した図である。 例2において、親水性部位の化学構造がそれぞれ異なる脂質化合物を含む各LNPのin vitroノックダウン活性を示した図である。 例2において、親水性部位の化学構造がそれぞれ異なる脂質化合物を含む各LNPのhemolysis活性を示した図である。 例3において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL4シリーズ）を含むLNPのpKaを示した図である。 例3において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL15シリーズ）を含むLNPのpKaを示した図である。 例3において、疎水性足場構造がそれぞれ異なるCL15-LNPのin vitroノックダウン活性を示した図である。 例3において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL4シリーズ）を含むLNPのin vivo F7ノックダウン活性を示した図である。 例3において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL15シリーズ）を含むLNPのin vivo F7ノックダウン活性を示した図である。 例3において、CL4H6-LNPのin vivo F7ノックダウン活性を指標とした製剤処方の脂質組成の最適化結果を示した図である。 例3において、CL4H6-LNPのin vivo F7ノックダウン活性を指標とした製剤処方のLipid/siRNA電荷比の最適化結果を示した図である。 例3において、最適組成CL4H6-LNPのin vivo F7ノックダウン効率の投与量依存性を示した図である。 例4において、CL4H6-LNPの安全性を評価した結果であり、投与24時間後における血漿中ALT/AST値を示した図である。 例4において、CL4H6-LNPの安全性を評価した結果であり、投与直前から投与24時間後までのマウス体重変化を示した図である。 例4において、平均粒子径35 nm程度に制御されたCL15-LNPのin vitroノックダウン活性を示した図である。 例5において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL4Hシリーズ）を含むLNPのpKaを示した図である。 例5において、疎水性足場構造がそれぞれ異なる脂質化合物（CL4Hシリーズ）を含むLNPのin vivo F7ノックダウン活性を示した図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの、投与後30分後の肝臓におけるsiRNA量（ng/g liver）の測定結果を示した図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの、投与後24時間後の肝臓におけるsiRNA量（ng/g liver）の測定結果を示した図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの、投与後24時間後の肝臓におけるsiRNA量（ng/g liver, 24h）と、F7ノックダウンにおけるED50との関係をプロットした図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの投与後1時間後の肝臓の血管(FITC)、脂質(DiI)、及びsiRNA(Cy5)の蛍光染色画像である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの相対血漿中F7タンパク質量（各回収日のLNP未投与マウス（NT）の血漿中F7タンパク質量を100とする）の経時的変化を示した図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの相対血漿中F7タンパク質量が50となるLNP投与後経過時間(Durability)(day)と、F7ノックダウンにおけるED50との関係をプロットした図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの肝臓中の各カチオン性脂質の含有量の経時的変化を示した図である。 例6において、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP、YSK05－LNP、及びYSK13-C3－LNPを投与したマウスの脾臓中の各カチオン性脂質の含有量の経時的変化を示した図である。 例7において、PEG-DSG修飾CL4H6-LNPを投与したマウスの相対血中PEG-DSG修飾CL4H6-LNP量（マウスへ投与したPEG-DSG修飾CL4H6-LNP量（ID）が100%）の経時的変化を示した図である。 例7において、PLK1に対するsiRNAを搭載したPEG-DSG修飾CL4H6-LNP、及びPEG-DSG修飾YSK05－LNPを投与したOSRC2細胞皮下移植マウスの、投与後24時間後のがん組織における相対PLK1発現量（siRNA未投与のOSRC2細胞皮下移植マウス（NT）のがん組織におけるPLK1発現量を1とする）の測定結果を示した図である。 例7において、PLK1に対するsiRNAを搭載したPEG-DSG修飾CL4H6-LNP及びPEG-DSG修飾YSK05－LNPを投与したOSRC2細胞皮下移植マウスの、投与前から投与後24時間後の体重の変化率（%）の測定結果を示した図である。 例8において、ICRマウス骨髄細胞から誘導したマクロファージに、CD45に対するsiRNAをトランスフェクションし、24時間培養後の各マクロファージの相対CD45発現量（siRNA未投与の腫瘍関連マクロファージ（NT）のCD45発現量を100%とする）の測定結果を示した図である。 例9において、CD45に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNP又はYSK05－LNPをOSRC2細胞皮下移植マウスに投与し、投与後24時間後の腫瘍関連マクロファージの相対CD45発現量（％）（CD45に対するsiRNA未投与の腫瘍関連マクロファージ（NT）におけるCD45発現量を100%とする）の測定結果を示した図である。 例10において、CL4H6-LNPを、投与開始から０、４、７、１１、１４、１８、２１、及び２３日目に静脈内に0.3 mg siRNA/kg 又は1 mg siRNA/kgで反復投与したマウスの、投与開始０日目の体重を１００％とする体重変化率（％）の経時的変化を示した図である。
　以下、本発明の実施態様について具体的に説明する。本願明細書において、「Ｘ１～Ｘ２（Ｘ１とＸ２は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」を意味する。
　本発明の実施態様に係る脂質化合物（本発明の脂質化合物）は、下記の式(I) で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式(I)において、aは3～5の整数を示し、好ましくは4である。
　bは0又は1の整数を示す。bが0の場合には-O-CO-基が存在せず、単結合であることを意味する。
　式(I)において、R1及びR2は、それぞれ独立に、下記の式(A) で表される基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式(A)において、qは1～9の整数を示し；rは0又は1を示し；sは1～3の整数を示し；tは0又は1を示し；uは1～8の整数を示し；vは4～12の整数を示す。cは0又は1を示す。bが0であり、cが1である場合、又はbが1であり、cが0である場合が好ましい。
　好ましい一態様では、r及びtが0であり、q＋s＋uが8～18の整数、好ましくは10～16の整数である。また、別の好ましい態様では、rが1であり、tが0であり、かつqが5～9の整数、好ましくは6～8の整数であり、s＋uが5～9の整数、好ましくは6～8の整数である。さらに別の好ましい態様では、vは4～12の整数、好ましくは6～10の整数、より好ましくは6である。aが4であり、bが0又は1である態様も好ましい。
　ただし、bとcが同時に0となる場合には、qが3～5の整数であり、r及びtが1であり、sが1であり、かつu＋vが6～10の整数である場合を除く。
　式(I)において、Xは、5～７員非芳香族ヘテロ環基、又は下記の式(B) で表される基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　Xが示す5～7員非芳香族ヘテロ環基は、炭素原子により(O-CO)b-に結合し、当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基（炭素数１～４のアルキル基）又はC2-4アルケニル基（炭素数２～４のアルケニル基）が置換していてもよい。5～7員非芳香族ヘテロ環基に含まれるヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子などを挙げることができる。環構成ヘテロ原子は1個でもよく、あるいは同一又は異なるヘテロ原子を2個以上含んでいてもよい。ヘテロ環基を構成するヘテロ環には1個又は2個以上の二重結合が含まれていてもよいが、ヘテロ環が芳香環となることはない。飽和のヘテロ環が好ましい場合がある。また、当該5～7員非芳香族ヘテロ環基中の１個又は２個の水素原子が置換されている置換基のうち、C1-4アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられ、C2-4アルケニル基としては、エテニル基（ビニル基）、プロペニル基、ブテニル基等が挙げられる。
　式(B)において、dは0～3の整数を示し、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基を示す。C1-4アルキル基及びC2-4アルケニル基としては、前記で挙げられたものと同様のものが挙げられる。R3及びR4が示すC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基は、それぞれ1個又は2個のフェニル基で置換されていてもよい。また、R3及びR4は互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環を形成してもよい。当該5～7員非芳香族ヘテロ環は、1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基で置換されていてもよい。
　別の好ましい態様によれば、式(I)で表される脂質化合物において、bが0であり、Xが式(B)で表される基を示す。この態様の場合、dは0であることが好ましく、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示してもよく、互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環を形成してもよい。R3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基を形成することが好ましく、当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1個のC1-4アルキル基で置換されていてよい。
　さらに別の好ましい態様によれば、bが1であり、Xが式(B)で表される基を示す。この態様の場合、dは1～3の整数であることが好ましく、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示してもよく、互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環を形成してもよい。R3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基を形成することが好ましく、当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい。
　また、別の好ましい態様によれば、bが1であり、Xが5～７員非芳香族ヘテロ環基(当該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合する)であり、当該5～７員非芳香族ヘテロ環基がピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基であることが好ましく、当該ピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基は1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい。
　式(I)で表される脂質化合物は酸付加塩として存在する場合がある。塩を構成する酸の種類は特に限定されず、鉱酸類又は有機酸類などのいずれであってもよい。例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、又は酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。式(I)で表される脂質化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本発明の範囲に包含される。さらに、R1及びR2が異なる場合には光学異性体が存在する場合もあり、純粋な形態の光学異性体、任意の光学活性体の混合物、又はラセミ体なども本発明の範囲に包含される。
　式(I)の化合物のうち特に好ましい化合物として、R1及びR2が同一であり、aが4である化合物を挙げることができる。この化合物を含めて式(I)の化合物は、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この実施例の製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は式(I)の範囲に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。式(I)の化合物のpKaは特に限定されないが、例えば4.0～9.0程度、好ましくは4.5～8.5程度で選択することができ、この範囲のpKaを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。リポソーム等の脂質構造体のエンドサイトーシスによる細胞への取り込みは、脂質構造体のpKaに影響を受ける。細胞の種類によって、エンドサイトーシスにより取り込まれやすい脂質構造体のpKaが異なる。このため、脂質構造体のpKaが標的細胞へ取り込まれやすい範囲となるように、式(I)の化合物のpKaを調整することが好ましい。
　本発明の脂質膜構造体を構成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和若しくは不飽和の脂肪酸エステル、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸などが挙げられる。
　リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸などを挙げることができ、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数12～20の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
　糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）などが挙げられる。
　ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）などが挙げられる。
　飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数12～20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
　飽和又は不飽和の脂肪酸エステルとしては、グリセロールの1又は2個の水酸基が脂肪酸とエステル結合したグリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。当該グリセリン脂肪酸エステル中の脂肪酸残基は、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数12～20の飽和又は不飽和の脂肪酸由来のアシル基が挙げられる。具体的には、ジミリストイルグリセロール（DMG）、ジステアロイルグリセロール（DSG）等が挙げられる。
　脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション、W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の好ましい形態としてリポソームを挙げることができる。以下、本発明の脂質膜構造体の好ましい態様としてリポソームについて説明する場合があるが、本発明の脂質膜構造体はリポソームに限定されることはない。
　本発明の脂質膜構造体は、細胞内にsiRNAなどの送達対象物質を送達するための脂質膜構造体であって、送達対象物質が内部に封入されており、かつ脂質成分として上記の式(I)で表される脂質化合物を含むことを特徴としている。本発明の脂質膜構造体により送達対象物質が送達される細胞（標的細胞）の種類は特に限定されない。本発明の脂質膜構造体は、免疫細胞、内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞（肝実質細胞）、膵臓細胞、神経細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等の動物を構成する各種細胞や、これらの細胞ががん化したがん細胞、分化能を備える幹細胞などの多種多様な細胞に送達対象物質を送達することができる。また、標的細胞は、動物の体内にある細胞であってもよく、培養細胞や初代培養細胞等の生体外で培養される細胞であってもよい。免疫細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球（T細胞、B細胞、NK細胞）、顆粒球、単球等が挙げられる。本発明の脂質膜構造体が送達される細胞としては、好ましくは免疫細胞及びがん細胞が挙げられ、特に好ましくは樹状細胞、単球、マクロファージ、及びがん細胞を挙げることができる。
　以下、送達すべき物質（送達対象物質）の好ましい例としてsiRNAについて説明するが、送達対象物質はsiRNAに限定されることはない。例えば、マイクロRNA、mRNA、プラスミドなどの核酸類のほか、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬の有効成分や、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を本発明の脂質膜構造体に封入することができる。
　siRNA(small interfering RNA)は21～23塩基対からなる低分子二本鎖RNAであり、RNA干渉(RNAi)に関与し、mRNAの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。合成のsiRNAがヒトの細胞においてRNA干渉を引き起こすことが報告されており、siRNAを用いたRNA干渉により遺伝子をノックダウンすることができることから、医薬としての利用やがんなどの治療分野において応用が期待されている。本発明において使用可能なsiRNAの種類は特に限定されず、RNA干渉を引き起こすことができるものであればいかなるものを使用してもよいが、一般的には、21～23塩基対の二本鎖RNAであって、RNA鎖の3'部分が2塩基分突出した構造をとり、それぞれの鎖は5'末端にリン酸基と3'末端にヒドロキシル基を有する構造のRNAを本発明におけるsiRNAとして使用することができる。また、リボース骨格の2'位のヒドロキシル基がメトキシ基、フルオロ基、あるいはメトキシエチル基に、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合に一部置換されたsiRNAも含まれる。
　本発明の脂質膜構造体を用いて、細胞、好ましくは免疫細胞又はがん細胞、特に好ましくは樹状細胞、単球、マクロファージ、又はがん細胞の細胞内にsiRNAを送達することができる。この方法は、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において行うこともでき、生体から分離・採取された細胞を用いてin vitroで行ってもよい。例えば、樹状細胞を用いる場合には、患者から分離・採取された樹状細胞に対して本発明の脂質膜構造体を用いて細胞内にsiRNAを導入した後、標的遺伝子がノックダウンされた樹状細胞をその患者に投与することにより樹状細胞療法を行うことができる。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の脂質膜構造体により細胞内に送達された二本鎖siRNAはヘリカーゼと呼ばれる酵素の働きを受けて一本鎖に解離し、標的mRNAに対するエンドヌクレアーゼ活性を示すアルゴノート（Argonaute）タンパク質等と複合体（RISC）を形成し、標的遺伝子をRNA干渉によりノックダウンすることができる。
　本発明の脂質膜構造体の脂質成分として式(I)の脂質化合物を単独で用いてもよいが、一般的には先に説明した脂質の1種又は2種以上と式(I)の脂質化合物とを組み合わせて脂質膜構造体を形成することが好ましい。複数の脂質の組み合わせ及びその配合割合は特に限定されないが、実施例に具体的に示したように、例えば標的遺伝子に対するノックダウン活性などを指標として使用する脂質の種類及び配合割合を最適化することができる。例えば、脂質成分として式(I)の化合物、1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE)、コレステロール(Chol)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール2000ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG 2000)の組み合わせについては、式(I)の化合物の含有割合を80～90モル％、好ましくは85モル％程度とし、PEG-DMG 2000を約1～2モル％、好ましくは1モル%程度とし、及び/又は式(I)の化合物を85モル%としたときのPOPE/Cholの割合（モル比）を0/15～4/11程度、好ましくは0/15とすることによりノックダウン活性を上昇させることができるが、これらの特定の脂質及びその配合割合に限定されるわけではない。
　本発明の脂質膜構造体の粒子径は特に限定されないが、好ましい態様として平均粒子径60～140 nm程度、より好ましくは80～120 nm程度、別の好ましい態様として平均粒子径20～50 nm程度であることがノックダウン効率の点から好ましい場合がある。多分散度指数(PDI)は0.05～0.1程度、好ましくは0.06～0.08程度、さらに好ましくは約0.07程度である。ゼータ電位は5.5 mV～6.0 mVの範囲、好ましくは5.8 mV程度とすることができる。
　本発明の脂質膜構造体には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
　例えば、本発明の脂質膜構造体の核内移行を促進するために、例えば、脂質膜構造体を3糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。3糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、3個ないし10個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは3個ないし6個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。
　オリゴ糖化合物としてより具体的には、例えば、セロトリオース（Cellotriose: β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、カコトリオース（Chacotriose: α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[α-L-ラムノピラノシル-(1→4)]-D-グルコース）、ゲンチアノース（Gentianose: β-D-フルクトフラノシル β-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、イソマルトトリオース（Isomaltotriose:α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、イソパノース（Isopanose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-[α-D-グルコピラノシル-(1→6)]-D-グルコース）、マルトトリオース（Maltotriose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、マンニノトリオース（Manninotriose: α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、メレジトース（Melezitose: α-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、パノース （Panose: α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、プランテオース（Planteose: α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、ラフィノース（Raffinose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、ソラトリオース（Solatriose: α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[β-D-グルコピラノシル-(1→3)]-D-ガラクトース）、ウンベリフェロース（Umbelliferose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→2)-α-D-ガラクトピラノシド）などの3糖化合物； リコテトラオース（Lycoテトラose: β-D-グルコピラノシル-(1→2)-[β-D-キシロピラノシル-(1→3)]-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-ガラクトース）、マルトテトラオース（Maltoテトラose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、スタキオース（Stachyose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）などの4糖化合物；マルトペンタオース（Maltopentaose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、ベルバスコース（Verbascose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）などの5糖化合物；マルトヘキサオース（Maltohexaose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）などの6糖化合物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　好ましくはグルコースの3量体ないし6量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの3量体又は4量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質膜構造体の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して1～30モル％程度、好ましくは2～20モル％程度、より好ましくは5～10モル％程度である。
　オリゴ糖化合物で脂質膜構造体を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質膜構造体をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム(特許文献3)が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。この手段はポリアルキレングリコール化脂質に単糖化合物を結合して脂質膜構造体の表面修飾を行う方法であり、この手段により脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールにより同時に修飾することができるので好ましい。
　脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールなどの親水性ポリマーで修飾することによりリポソームの血中滞留性などの安定性を高めることができる場合がある。この手段については、例えば、特開平1-249717号公報、特開平2-149512号公報、特開平4-346918号公報、特開2004-10481号公報などに記載されている。親水性ポリマーとしてはポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば300～10,000程度、好ましくは500～10,000、さらに好ましくは1,000～5,000程度である。
　ポリアルキレングリコールによる脂質膜構造体の表面修飾は、例えばポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質膜構造体を構築することにより容易に行うことができる。例えば、ポリエチレングリコールによる修飾を行う場合にはステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-[カルボニル－メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、n-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコー-5000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
　また、ポリアルキレングリコールにオリゴ糖化合物を結合させることにより、ポリアルキレングリコール及びオリゴ糖化合物による表面修飾を同時に達成することができる。もっとも、脂質膜構造体をポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物で表面修飾する方法は上記の方法に限定されることはなく、例えば、ステアリル化されたポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物など脂質化された化合物を脂質膜構造体の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行うことができる場合もある。
　本発明の脂質膜構造体の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドGM1、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドGM3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかに、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。
　本発明の脂質膜構造体は、ステロール、又はグリセリン若しくはその脂肪酸エステルなどの膜安定化剤；トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤；荷電物質；及び、膜ポリペプチド；などからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンなどの飽和又は不飽和カチオン性合成脂質；又は、カチオン性ポリマーなどを挙げることができる。負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
　また、本発明の脂質膜構造体には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びpH感受性機能などのいずれか1つ又は2つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、例えば遺伝子を含む核酸などを内包する脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。これらに加えて、標的細胞にエンドサイトーシスで取り込まれた後の当該脂質膜構造体を、エンドソームから効率的に脱出させて核内に移行させることができ、核内において高い遺伝子発現活性を達成することが可能になる。
　温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどを挙げることができる。また、pH感受性機能を付与することができるpH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどを挙げることができる。
　また、本発明の脂質膜構造体は、細胞表面の受容体や抗原に対して特異的に結合可能な抗体などの物質で修飾を施すこともできる。当該修飾により、細胞の核内への物質送達効率を改善することができる。例えば、標的組織又は臓器に特異的に発現する生体成分に対するモノクローナル抗体を脂質膜構造体の表面に配置することが好ましい。この手法は、例えば、非特許文献２５などに記載されている。脂質膜構造体の構成成分として、モノクローナル抗体やそのフラグメント（例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、又はFab’フラグメントなど）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体、例えばポリ（エチレングリコール）-α-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ω-マレインイミド、α-［N-(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホリル-エチル）カルバミル)-ω-[３-[2-（2,5-ジヒドロ-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-1-イル）エタンカルボキサミド］プロピル｝-ポリ（オキシ-1,2-エタンジル）などのマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有させることにより、モノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に結合させることができる。
　本発明の脂質膜構造体の表面を、連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチド(以下、「ポリアルギニン」と呼ぶ。)で修飾してもよい。ポリアルギニンとしては、好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチド、さらに好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基のみからなるポリペプチド、特に好ましくはオクタアルギニンなどを用いることができる。リポソームなどの脂質膜構造体の表面をオクタアルギニンなどのポリアルギニンで修飾することにより、リポソームに封入された目的物質の細胞内送達効率を向上させることができる(非特許文献4; 特許文献1)。ポリアルギニンによる脂質膜構造体表面の修飾は、上記の刊行物に記載された方法に従って、例えば脂質修飾ポリアルギニン、例えばステアリル化オクタアルギニンなどを脂質膜構造体の構成脂質として使用することにより容易に行うことができる。上記刊行物の開示及びこの刊行物において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
　また、本発明の脂質膜構造体にsiRNAを封入する際に、必要に応じて核酸導入機能を有する化合物を加えることもできる。このような化合物としては、例えば、O,O'-N-ジドデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジテトラデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジヘキサデカノイル-N-(α－トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジオクタデセノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O',O''-トリデカノイル-N-(ω-トリメチルアンモニオデカノイル)アミノメタンブロミド及びN-[α-トリメチルアンモニオアセチル]-ジドデシル-D-グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキサミド）エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、3-β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロールなどを挙げることができる。これらの核酸導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜の任意の位置に配置されていてもよく、及び／又は脂質膜構造体の内部に充填されていてもよい。
　多機能性を付加したエンベロープ型ナノ構造体（MEND）が知られており、本発明の脂質膜構造体として好適に使用することができる。MENDとしては、例えば、プラスミドDNAなどの核酸とプロタミンなどのカチオン性ポリマーとの複合体をコアとし、このコアがリポソーム形態の脂質エンベロープ膜の内部に封入された構造を有するものが報告されている。また、MENDの脂質エンベロープ膜には、必要に応じてpH応答性や膜透過性を調節するためのペプチドを配置することができ、脂質エンベロープ膜の外側表面はポリエチレングリコールなどのアルキレングリコールで修飾することができることも報告されている。MENDの脂質エンベロープの内部に凝縮化されたDNA及びカチオン性ポリマーが封入され、効率的に遺伝子発現を達成できるように設計されたMENDも知られている。MENDについては、例えば非特許文献1などの総説を参照することができる。上記刊行物の開示及びこの総説において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
　脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒（例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など）に分散された形態やこの水性分散物を凍結乾燥した形態などが挙げられる。
　脂質膜構造体の製造方法も特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームの場合には平均粒子径60～140 nm程度、好ましくは80～120 nm程度、さらに別の好ましい態様として平均粒子径20～50 nm程度であることがノックダウン効率の点から好ましい場合がある。粒子径は、例えばDLS(dynamic light scattering)法により測定することができる。本願明細書において、脂質膜構造体の平均粒子径とは、DLSにより測定された個数平均粒子径を意味する。DLSによる測定は、市販のDLS装置等を用いて常法により行うことができる。
　水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは、水系溶媒のpHを弱酸性から中性付近（pH3.0から8.0程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。
　得られた脂質膜構造体の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類；乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類；ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコール；などの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。
　本発明の脂質膜構造体の内部には、siRNAの機能を阻害しない範囲で他の物質を封入することができる。封入可能な物質の種類は特に限定されないが、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬の有効成分のほか、糖類、ペプチド類、核酸類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。核酸としては、例えば遺伝子を含む核酸を挙げることができ、より具体的には、例えば、プラスミドに組み込まれた遺伝子などを挙げることができるが、この特定の態様に限定されることはない。
　特許文献6には、YSK12を含む脂質化合物の合成方法、当該脂質化合物を用いた脂質膜構造体の調製方法、及び得られた脂質膜構造体についてTHP-1細胞(ヒト単球株)に対する遺伝子発現抑制作用及びJurkat細胞(ヒトT細胞株)に対する遺伝子発現抑制作用が具体的に示されている。特許文献6の開示の全てを参照により本明細書の開示に含める。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
　本発明の脂質化合物を以下のスキームに従って合成した。疎水性足場がYSK12（特許文献6）と同じ場合、すなわち、一般式（Ａ）中のｃが0である脂質を合成する場合には、出発としてリノール酸(Compound A)を用いた。リノール酸を水素化リチウムアルミニウムで還元後(Compound B)、水酸基をメシル化することで活性化し(Compound C)、臭化マグネシウムを作用させることで臭素化した(Compound D)。δ-Valerolactoneを基質としてグリニャール反応を行うことで2本のリノール酸由来疎水性足場を連結した(Compound E)。第3級アミノ基を炭化水素鎖に直接結合させる場合には、第1級水酸基をトシル化によって活性化し(Compound F)、求核置換反応によりアミノ基を導入した。
　一方、エステル結合を介して第3級アミノ基を結合させる場合には、第1級水酸基に対してアミノ酸を脱水縮合することで連結した。疎水性足場にエステル結合を含む脂質、例えば、一般式（Ａ）中のcが1であり、R1及びR2中にエステル結合を含む脂質の合成には、直鎖アルカン(炭素数6～10)の両末端炭素原子に結合する水素原子が臭素原子と水酸基に1つずつ置換した物質(Compound G)を出発原料として用いた。水酸基をtert-ブチルジメチルシリルエーテル化することで保護し(Compound H)、上述と同様にグリニャール反応により2分子を連結させた(Compound I)。上述と同様に、第1級水酸基部分に直接あるいはエステル結合を介して第3級アミノ基を導入後(Compound J, M)、シリルエーテルを脱保護し（Compound K,N）、脱水縮合によって任意の直鎖脂肪酸を連結した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　以下の実施例において、脂質化合物の命名は以下の部分構造に従って「Cationic Lipid (CL)-親水性部位番号-疎水性足場2番号-疎水性足場1番号」として表記した。例えば、特許文献6に開示されているYSK12は「CL1A6」と表記される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
(1) ((6-ブロモヘキシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン
　6-ブロモヘキサン-1-オール 20.0 g（110.5 mmol）を150 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、4℃に冷却した。tert-ブチルジメチルクロロシラン（TBSCl） 18.0 g（120 mmol）を加えたのち、トリエチルアミン（TEA） 19.5 mL（140 mmol）を滴下し、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、ヘキサン300 mLを加えて懸濁させ、セライト濾過によって不溶物を除去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、((6-ブロモヘキシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 26.0 g（88.0 mmol）を無色オイルとして得た。収率は80%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.31-1.54 (m, 6H), 1.86 (m, 2H), 3.40 (t, 2H), 3.96 (t, 2H).
(2) 11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)ウンデカン-1,5-ジオール
　4 mLのジエチルエーテルに((6-ブロモヘキシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン1.2 g（4.06 mmol）を溶解し、削り屑状マグネシウム2.43 g（100 mmol）を加え、続いてヨウ素1欠片加えた。室温で10分静置した後、オイルバスで40℃に加熱しながら撹拌し、21 mLのジエチルエーテルに溶解した((6-ブロモヘキシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 24.8 g（83.94 mmol）を滴下した。40℃で2時間反応させた後、4℃に冷却した。続いて、δ-バレロラクトン3.67 mL（39.6 mmol）を添加し、室温で一晩反応させた。次に、4℃に冷却し、5%硫酸を滴下することで残留したマグネシウムを溶解させた。ジエチルエーテルで希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で分液洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)ウンデカン-1,5-ジオール 14.0 g（26.3 mmol）を無色オイルとして得た。δ-バレロラクトンからの収率は66%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-1.56 (m, 26H), 3.59 (t, 4H), 3.65 (t, 2H).
(3) 11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 4-メチルベンゼンスルホネート
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)ウンデカン-1,5-ジオール 14.0 g（26.3 mmol）を50 mLのジクロロメタンに溶解し、DMAP(N,N-ジメチル-4-アミノピリジン) 321 mg（2.63 mmol）とジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）5.50 mL（39.5mmol）を加え、4℃に冷却した。続いて、p-トルエンスルホニルクロリド（pTsCl）6.02g（31.6 mmol）を徐々に加えていった後、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、酢酸エチルで懸濁し、水及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 4-メチルベンゼンスルホネート 12.4 g（28.0 mmol）を無色オイルとして得た。収率は69%であった。
(4) 11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,19,19,20,20-オクタメチル-4,18-ジオキサ-3,19-ジシラヘニコサン-11-オール
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 4-メチルベンゼンスルホネート 12.4 g（18.0 mmol）に30 mLのテトラヒドロフランを加え、4℃に冷却した。続いて、ジプロピルアミン 7.38 mL（54.0 mmol）を加えた後、室温で11日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、0.5 N 水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,19,19,20,20-オクタメチル-4,18-ジオキサ-3,19-ジシラヘニコサン-11-オール 7.27 g（11.8 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は66%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.24-1.64 (m, 30H), 2.30-2.43 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(5) 7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール
　11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,19,19,20,20-オクタメチル-4,18-ジオキサ-3,19-ジシラヘニコサン-11-オール 7.27 g（11.8 mmol）に酢酸2.23 mL（39 mmol）及び26 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 3.43 g（8.85 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は75%であった。
(6) 7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジオレアート（CL4H6）
　7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 388 mg（1.0 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、オレイルクロリド900 mg（3.0 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。TEA 697 μL（5.0 mmol）を滴下し、室温で3時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジオレアート（CL4H6）570 mg（0.622 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は62%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (m, 12H), 1.18-1.71 (m, 74H), 2.01 (m, 8H), 2.24-2.30 (t, 4H), 2.32-2.42 (m, 6H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
(7) 7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL4C6）
　7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 77.5 mg（0.20 mmol）を1 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、ミリストイルクロリド 197 mg（0.80 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。DIPEA 205 μL（1.2 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL4C6）93 mg（0.115 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は58%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (m, 12H), 1.18-1.68 (m, 74H), 2.27 (t, 4H), 2.42-2.53 (br, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
(8) 7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL4D6）
　7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 77.5 mg（0.20 mmol）を1 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、パルミトイルクロリド 220 mg（0.80 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。DIPEA 205 μL（1.2 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL4D6）143 mg（0.164 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は82%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (m, 12H), 1.18-1.68 (m, 82H), 2.27 (t, 4H), 2.45-2.53 (br, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
(9) 11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)ウンデカン-1,5-ジオール 5.33 g（10.0 mmol）を50 mLのジクロロメタンに溶解し、DMAP 122 mg（1.0 mmol）と1-メチルピペリジン-4-カルボオキシ酸 塩酸塩 2.16 g（12.0 mmol）を加えた。続いて、EDCI 2.49 g（13.0 mmol）を徐々に加えていった後、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 5.01 g（7.61 mmol）を無色オイルとして得た。収率は76%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-2.01 (m, 26H), 2.23 (br.s, 4H), 2.78 (m, 2H), 3.58 (t, 4H), 4.08 (t, 2H).
(10) 5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 5.01 g（7.61 mmol）に酢酸1.43 mL（25 mmol）及び20 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 2.34 g（5.45 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は72%であった。
1H NMR；400 MHz δ=1.25-1.45 (m, 20H), 1.52 (m, 4H), 1.62 (m, 2H), 1.86 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 2.50-2.70 (m, 6H), 3.16 (m, 2H), 3.53 (t, 4H), 4.11 (t, 2H).
(11) 7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジオレアート（CL15H6）
　5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 430 mg（1.00 mmol）を10 mLのジクロロメタンに溶解した。続いて、オレイン酸 706 mg（2.50 mmol）、DMAP 24.4 mg（0.20 mmol）及びEDCI 671 mg（3.5 mmol）を加え、室温で2時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジオレアート（CL15H6）569 mg（0.594 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は59%であった。
1H NMR；400 MHz）データ　δ=0.88 (t, 6H), 1.20-2.05 (m, 78H), 2.28 (m, 8H), 2.82(m, 2H), 4.07 (m, 6H), 5.33 (m, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
(12) 7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジドデカノエート（CL15B6）
　5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 85.9 mg（0.20 mmol）を1.5 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、lauroyl chloride 143 mg（0.60 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。TEA 139 μL（1.00 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジドデカノエート（CL15B6）101. 2 mg（0.127 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は64%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (t, 6H), 1.20-2.13 (m, 70H), 2.28 (m, 8H), 2.84 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
(13) 7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL15C6）
　5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 85.9 mg（0.20 mmol）を1.5 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、ミリストイルクロリド 163 mg（0.60 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。TEA 139 μL（1.00 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（C
L15C6）116 mg（0.136 mmol）を薄黄色固体として得た。収率は68%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (t, 6H), 1.20-2.10 (m, 78H), 2.28 (m, 8H), 2.82 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
(14) 7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL15D6）
　5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 85.9 mg（0.20 mmol）を1.5 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、パルミトイルクロリド 181 mg（0.60 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。TEA 139 μL（1.00 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL15D6）114 mg（0.126 mmol）を薄黄色固体として得た。収率は63%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (t, 6H), 1.20-2.11 (m, 86H), 2.28 (m, 8H), 2.83 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
(15) 7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジステアレート（CL15E6）
　5,11-ジヒドロキシ5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 1-メチルピペリジン-4-カルボオキシレート 85.9 mg（0.20 mmol）を1.0 mLのジクロロメタンに溶解し、続いて、stearoyl chloride 181 mg（0.80 mmol）を加えた後、4℃に冷却した。TEA 139 μL（1.00 mmol）を滴下し、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-ヒドロキシ7-(4-((1-メチルピペリジン-4-カルボニル)オキシ)ブチル)トリデカン-1,13-ジイル ジステアレート（CL15E6）141mg（0.146 mmol）を薄黄色固体として得た。収率は73%であった。
1H NMR；400 MHz δ=0.88 (t, 6H), 1.20-2.10 (m, 94H), 2.28 (m, 8H), 2.83 (m, 2H), 4.06 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
(16) (9z,12z)-オクタジエン-1-オール
　4℃に冷却したテトラヒドロフラン（THF）190 mLに、水素化リチウムアルミニウム2.73 g（72 mmol）を懸濁した。そこへリノール酸10 g（36 mmol）を滴下し、10分間撹拌した。その後、オイルバスで加熱しながら一晩還流した。これを冷却した後、1 mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液100 mLを加えて反応を停止させた。次に、酢酸エチル100 mLを加えて希釈した後、濾過し、濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて洗浄した。続いて、有機層を回収して、そこに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、(9z,12z)- オクタジエン-1-オール 8.68 g(32.6 mmol)を無色オイルとして得た。収率は91%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 3H), 1.25-1.36 (m, 16H), 1.53-1.58 (m, 2H), 2.02-2.06 (m, 4H), 2.76 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 5.29-5.40 (m, 4H).
(17) (9z,12z)- オクタジエン-1-メタンスルホネート
　 (9z,12z)- オクタジエン-1-オール 8.68 g（32.6 mmol）を100 mLのジクロロメタンに溶解した後、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）366 mg（3.26 mmol）、トリエチルアミン（TEA）6.8 mL（48.9 mmol）を加えた。続いて、滴下ロートを用いて、50 mLのジクロロメタンで希釈したメタンスルホニルクロリド（MsCl）3.03 mL（39.1 mmol）を滴下し、室温で一晩撹拌した。反応液を回収して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、(9z, 12z)- オクタジエン-1-メタンスルホネート 10.64 g（30.9 mmol）を無色オイルとして得た。収率は95%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 3H), 1.06-1.18 (m, 18H), 1.70-1.90 (m, 2H), 2.00-2.19 (m, 4H), 2.79 (t, 2H), 3.06 (s, 3H), 4.20 (t, 2H), 5.21-5.42 (m, 4H).
(18) 18-ブロモ-オクタデカ-(6z,9z)-ジエン
　 (9z,12z)- オクタジエン-1-メタンスルホネート 10.64 gを140 mLのジエチルエーテルに溶解した後、臭化マグネシウムエチルエテレート 16.0 g（61.8 mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液を回収して、100 mLの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、18-ブロモ-オクタデカ-(6z,9z)-ジエン 8.85 g（26.9 mmol）を無色オイルとして得た。収率は87%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 3H), 1.27-1.46 (m, 18H), 1.80-1.88 (m, 2H), 2.00-2.09 (m, 4H), 2.77 (t, 2H), 3.40 (t, 2H), 4.20 (d, 2H), 5.29-5.41 (m, 4H).
(19) 4-[(9z,12z)-オクタジエニル]-(13z,16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール
　1.5 mLのジエチルエーテルに18-ブロモ-オクタデカ-(6z,9z)-ジエン 50 g（1.52 mmol）を溶解し、削り屑状マグネシウム609 mg（25.1 mmol）を加え、続いてヨウ素1欠片を加えた。室温で10分間静置した後、オイルバスで45℃に加熱しながら撹拌し、6 mLのジエチルエーテルに溶解した18-ブロモ-オクタデカ-(6z, 9z)-ジエン 5.0 g（15.2 mmol）を滴下した。45℃で1時間反応させた後、室温に冷却した。続いて、δ-バレロラクトン300 μL（3.23 mmol）を添加し、室温で1時間反応させた。次に、4℃に冷却し、濾過した後、濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 1.64 g（2.73 mmol）を無色オイルとして得た。δ-バレロラクトンからの収率は85%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.25-1.1.46 (m, 46H), 2.02-2.06 (m, 8H), 2.77 (t, 4H), 3.66 (t, 2H), 5.30-5.40 (m, 8H).
(20) 4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 301 mg（0.50 mmol）を5.0 mLのジクロロメタンに溶解し、DMAP 6.11 mg（0.05 mmol）とTEA 83.6 μL（0.60 mmol）を加え、続いてp-トルエンスルホニルクロリド（pTsCl） 95.3 mg（0.50 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。続いて、反応液にシリカゲルを加え、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して293 mg（0.39 mmol）を無色オイルとして得た。収率は78%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 3H), 1.25-1.49 (m, 46H), 2.03-2.05 (m, 8H), 2.44 (s, 3H), 2.77 (t, 4H), 4.03 (t, 2H), 5.31-5.39 (m, 8H), 7.34 (d, 2H), 7.78 (d, 2H).
(21) 1-N,N-ジメチルアミノ-4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 293 mg（0.39 mmol）に10 mLの 2.0 MジメチルアミンのTHF溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、100 mLのジクロロメタンを加え、100 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 155 mg（0.25 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は64%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.23-1.40 (m, 46H), 2.02-2.07 (m, 8H), 2.26 (s, 6H), 2.33 (t, 2H), 2.77 (t, 4H), 5.31-5.39 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
(22) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(エチル(メチル)アミノ)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 650 mg（0.86 mmol）を4 mLのジクロロメタンに溶解し、エチルメチルアミン0.86 mL（10 mmol）を加え、40℃で3日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 432 mg（0.673 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は78%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.20-1.67 (m, 49H), 2.03 (m, 8H), 2.38-2.75 (m, 7H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
(23) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(ジエチルアミノ)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 603 mg（0.80 mmol）を4 mLのジクロロメタンに溶解し、ジエチルアミン1.04 mL（10 mmol）を加え、40℃で3日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 401 mg（0.611 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は77%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.20-1.67 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.38-2.75 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
(24) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(ジプロピルアミノ)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 189 mg（0.25 mmol）を1.5 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、ジプロピルアミン41 μL（0.3 mmol）を加え、室温で8日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 81 mg（0.118 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は47%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.22-1.60 (m, 50H), 2.03 (m, 8H), 2.30-2.48 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
(25) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(ベンジル(メチル)アミノ)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 189 mg（0.25 mmol）を1.5 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、N-ベンジルメチルアミン39 μL（0.3 mmol）を加え、室温で8日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 97.4 mg（0.138 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は55%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.23-1.60 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 2.37 (t, 2H), 2.77 (t, 4H), 3.47 (s, 2H), 5.35 (m, 8H), 7.30 (m, 5H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
(26) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(ピペリジン-1-イル)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 189 mg（0.25 mmol）を1.5 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、ピペリジン30 μL（0.3 mmol）を加え、室温で8日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 85.0 mg（0.127 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は51%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.22-1.68 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.30-2.52 (m, 6H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
(27) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-モルフォリノブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 227 mg（0.30 mmol）を2 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、モルフォリン87.1 mg（1.0 mmol）を加え、室温で7日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLのジクロロメタンを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 60.0 mg（0.09 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は30%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.22-1.65 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.34 (t, 2H), 2.42 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.71 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
(28) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 227 mg（0.30 mmol）を2 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-メチルピペラジン100.2 mg（1.0 mmol）を加え、室温で7日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLのジクロロメタンを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 79.0 mg（0.116 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は39%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.87 (t, 6H), 1.22-1.65 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.26-2.65 (m, 13H), 2.77 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
(29) (6Z,9Z,28Z,31Z)-19-(4-(4-イソプロピルピペラジン-1-イル)ブチル)ヘプタトリコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール
　4-[(9z, 12z)-オクタジエニル]-1-p-トルエンスルホニル-(13z, 16z)-トリコサジエン-4-オール 189 mg（0.25 mmol）を2 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-イソプロピルピペラジン42.7 μL（0.3 mmol）を加え、室温で8日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することで精製して 116 mg（0.163 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は65%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.05 (d, 6H), 1.20-1.60 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.31-2.68 (m, 11H), 2.76 (t, 4H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
(30) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 2-(ピロリジン-1-イル)アセテート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 120.2 mg（0.20 mmol）を1.0 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-ピロリジン酢酸38.7 mg（0.30 mmol）を加え、続いてDMAP 6.1 mg（0.05 mmol）及び1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDCI）57.5 mg（0.30 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して117 mg（0.164 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は82%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.22-1.69 (m, 46H), 1.82 (br, 4H), 2.03 (m, 8H), 2.65 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.33 (s, 2H), 4.13 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
(31) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 2-(ピペリジン-1-イル)アセテート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 120.2 mg（0.20 mmol）を1.0 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-ピペリジン酢酸43.0 mg（0.30 mmol）を加え、続いてDMAP 6.1 mg（0.05 mmol）及びEDCI 57.5 mg（0.30 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して130 mg（0.179 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は90%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.22-1.67 (m, 52H), 2.03 (m, 8H), 2.50 (br, 4H), 2.77 (t, 4H), 3.18 (s, 2H), 4.12 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
(32) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 601 mg（1.0 mmol）を5.0 mLのジクロロメタンに溶解し、3-(ジメチルアミノ)プロピオン酸塩酸塩153.6 mg（1.0 mmol）を加え、続いてDMAP 12.2 mg（0.1 mmol）及びEDCI 230 mg（1.2 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。50 mLのジクロロメタンを加え、50 mLの1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して351 mg（0.501 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は50%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.22-1.72 (m, 46H), 2.03 (m, 8H), 2.24 (s, 3H), 2.50 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 2.78 (t, 4H), 4.09 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
(33) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 3-(ジエチルアミノ)プロパノエート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 180 mg（0.30 mmol）を2.0 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、3-(ジエチルアミノ)プロピオン酸塩酸塩72.7 mg（0.40 mmol）を加え、続いてDMAP 6.0 mg（0.05 mmol）及びEDCI 96 mg（0.50 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLのジクロロメタンを加え、5 mLの1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して151 mg（0.207 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は69%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.03 (t, 6H), 1.22-1.44 (m, 46H), 1.62 (m, 2H), 2.03 (m, 8H), 2.41-2.56 (m, 6H), 2.78 (m, 6H), 4.07 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
(34) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 3-(ピペリジン-1-イル)プロパノエート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 120.2 mg（0.20 mmol）を1.0 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-ピペリジンプロピオン酸47.2 mg（0.30 mmol）を加え、続いてDMAP 6.1 mg（0.05 mmol）及びEDCI 57.5 mg（0.30 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、5 mLの酢酸エチルを加え、5 mLの0.5 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して80.4 mg（0.109 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は55%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.22-1.66 (m, 52H), 2.04 (m, 8H), 2.40 (br, 4H), 2.51 (br, 2H), 2.66 (br, 2H), 2.78 (t, 4H), 4.09 (t, 2H), 5.35 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
(35) (14Z,17Z)-5-ヒドロキシ-5-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イル)トリコサ-14,17-ジエン-1-イル 1-メチルピペリジン-4-カルボキシレート
　4-[(9z, 12z)-オクタデカジエニル]-(13z, 16z)-トリコサジエン-1,4-ジオール 842 mg（1.40 mmol）を10 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、1-メチル-4-ピペリジンカルボン酸200 mg（1.40 mmol）を加え、続いてDMAP 17.1 mg（0.14 mmol）及びEDCI 383 mg（2.0 mmol）を加えた後、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、50 mLの酢酸エチルを加え、50 mLの1 M水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して877 mg（1.21 mmol）を無色オイルとして得た。収率は86%であった。
1H NMR；500 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.23-1.45 (m, 46H), 1.55-2.08 (m, 17H), 2.25 (s, 3H), 2.79 (t, 4H), 4.08 (t, 2H), 5.30-5.40 (m, 8H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
(36) 11-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,19,19,20,20-オクタメチル-4,18-ジオキサ-3,19-ジシラヘニコサン-11-オール
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 4-メチルベンゼンスルホネート 8.78 g（12.78 mmol）に50 mLの2.0 MジメチルアミンのTHF溶液を加え、室温で6日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して6.20 g（11.07 mmol）を無色オイルとして得た。収率は87%であった。
(37) 7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール
　11-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,19,19,20,20-オクタメチル-4,18-ジオキサ-3,19-ジシラヘニコサン-11-オール 6.20 g（11.07 mmol）に酢酸1.90 mL（33.21 mmol）及び24.4 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液を加え、室温で2時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して2.86 g（8.63 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は80%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=1.20-1.60 (m, 26H), 2.80 (s, 6H), 3.02 (t, 2H), 3.62 (t, 4H).
(38) 7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL1C6）
　7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 431 mg（1.30 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、ミリスチン酸 713 mg（3.12 mmol）及びDMAP 31.8 mg（0.26 mmol）を加え、続いてEDCI 748 mg（3.90 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL1C6）472 mg（0.627 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は48%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (m, 6H), 1.16-1.70 (m, 70H), 2.22 (s, 6H), 2.28 (m, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
(39) 7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL1D6）
　7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 431 mg（1.30 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、パルミチン酸 800 mg（3.12 mmol）及びDMAP 31.8 mg（0.26 mmol）を加え、続いてEDCI 748 mg（3.90 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL1D6）557 mg（0.689 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は53%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (m, 6H), 1.16-1.70 (m, 78H), 2.22 (s, 6H), 2.28 (m, 6H), 4.04 (t, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
(40) 7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL1C6）
　7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)トリデカン-1,7,13-トリオール 1.99 g（6.0 mmol）を20 mLのジクロロメタンに溶解し、オレイン酸 4.07 g（14.4 mmol）及びDMAP 147 mg（1.20 mmol）を加え、続いてEDCI 3.45 g（18.0 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して7-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジオレエート（CL1H6）2.56 g（2.98 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は50%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (m, 6H), 1.16-1.75 (m, 66H), 2.01 (m, 8H), 2.21-2.35 (m, 12H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
(41) 11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)ウンデカン-1,5-ジオール 12.73 g（23.9 mmol）を50 mLのジクロロメタンで溶解し、3-(ジメチルアミノ)プロパン酸塩酸塩 4.04 g（26.3 mmol）及びDMAP 293 mg（2.4 mmol）を加え、続けてEDCI 5.50 g（28.7 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、0.5 M 水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して6.66 g（10.54 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は44%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.23-1.66 (m, 26H), 2.22 (s, 6H), 2.47 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 3.60 (t, 4H), 4.08 (t, 2H).
(42) 5,11-ジヒドロキシ-5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート
　11-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ヘキシル)-5-ヒドロキシウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート 6.66 g（10.54 mmol）に酢酸1.82 mL（31.6 mmol）及び21.1 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのTHF溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して2.40 g（5.95 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は57%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=1.22-1.50 (m, 20H), 1.52-1.70 (m, 6H), 2.81 (s, 6H), 2.87 (t, 2H), 3.33 (t, 2H), 3.63 (t, 4H), 4.12 (t, 2H).
(43) 7-(4-((3-(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジテトラデカノエート（CL12C6）
　5,11-ジヒドロキシ-5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート 800 mg（2.0 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、ミリスチン酸 1.005 g（4.4 mmol）及びDMAP 48.9 mg（0.40 mmol）を加え、続いてEDCI 959 mg（5.0 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。濾液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して737 mg（0.894 mmol）を白色固体として得た。収率は45%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.18-1.70 (m, 70H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 4.05 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
(44) 7-(4-((3-(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジパルミテート（CL12D6）
　5,11-ジヒドロキシ-5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート 800 mg（2.0 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、パルミチン酸 1.128 g（4.4 mmol）及びDMAP 48.9 mg（0.40 mmol）を加え、続いてEDCI 959 mg（5.0 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。濾液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して690 mg（0.784 mmol）を白色固体として得た。収率は39%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.18-1.70 (m, 78H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.61 (t, 2H), 4.05 (m, 6H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
(45) 7-(4-((3-(ジメチルアミノ)プロパノイル)オキシ)ブチル)-7-ヒドロキシトリデカン-1,13-ジイル ジオレエート（CL12H6）
　5,11-ジヒドロキシ-5-(6-ヒドロキシヘキシル)ウンデシル 3-(ジメチルアミノ)プロパノエート 800 mg（2.0 mmol）を5 mLのジクロロメタンに溶解し、オレイン酸 1.243 g（4.4 mmol）及びDMAP 48.9 mg（0.40 mmol）を加え、続いてEDCI 959 mg（5.0 mmol）を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。濾液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して874 mg（0.937 mmol）を無色オイルとして得た。収率は47%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (t, 6H), 1.11-1.68 (m, 66H), 2.01 (m, 8H), 2.22-2.31 (m, 10H), 2.48 (t, 2H), 2.62 (t, 2H), 4.04 (m, 6H), 5.32 (m, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
(46) ((8-ブロモオクチル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン
　8-ブロモオクタン-1-オール 17.78 g（85.0 mmol）を100 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、4℃に冷却した。TBSCl 13.86 g（92.0 mmol）を加えたのち、TEA 15.33 mL（110 mmol）を滴下し、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、ヘキサン300 mLを加えて懸濁させ、セライト濾過によって不溶物を除去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して、14.0 g（44.3 mmol）を無色オイルとして得た。収率は51%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.04 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.31 (m, 6H), 1.42 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.85 (tt, 2H), 3.40 (t, 2H) 3.59 (t, 2H).
(47) 13-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)オクチル)トリデカン-1,5-ジオール
　4 mLのジエチルエーテルに((8-ブロモオクチル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 0.70 g（2.17 mmol）を溶解し、削り屑状マグネシウム1.26 g（52 mmol）を加え、続いてヨウ素1欠片加えた。室温で10分静置した後、オイルバスで40℃に加熱しながら撹拌し、11 mLのジエチルエーテルに溶解した((8-ブロモオクチル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 13.3 g（41.13 mmol）を滴下した。40℃で2時間反応させた後、4℃に冷却した。続いて、δ-バレロラクトン1.81 mL（19.5 mmol）を添加し、室温で一晩反応させた。次に、4℃に冷却し、5%硫酸を滴下することで残留したマグネシウムを溶解させた。ジエチルエーテルで希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で分液洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して8.00 g（13.58 mmol）を無色オイルとして得た。δ-バレロラクトンからの収率は70%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.25-1.60 (m, 34H), 3.59 (t, 4H), 3.65 (t, 2H).
(48) 13-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)オクチル)-5-ヒドロキシトリデシル 4-メチルベンゼンスルホネート
　13-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)オクチル)トリデカン-1,5-ジオール 8.00 g（13.58 mmol）を30 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、DMAP 183 mg（1.50 mmol）とTEA 2.79 mL（20.0 mmol）を加え、4℃に冷却した。続いて、pTsCl 2.86 g（15.0 mmol）を徐々に加えていった後、室温で2時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、酢酸エチルで懸濁し、水及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して無色オイルとして得た。
(49) 13-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,23,23,24,24-オクタメチル-4,22-ジオキサ-3,23-ジシラペンタコサン-13-オール
　13-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)オクチル)-5-ヒドロキシトリデシル 4-メチルベンゼンスルホネート 10.09 g（13.58 mmol）に30 mLの1,2-ジクロロエタンを加え、4℃に冷却した。続いて、ジプロピルアミン 3.71 mL（27.2 mmol）を加えた後、室温で10日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、0.2 N 水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して5.86 g（8.72 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は64%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 0.98 (t, 6H), 1.22-1.80 (m, 38H), 2.98 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(50) 9-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)ヘプタデカン-1,9,17-トリオール
　13-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,23,23,24,24-オクタメチル-4,22-ジオキサ-3,23-ジシラペンタコサン-13-オール 4.50 g（6.70 mmol）に酢酸1.72 mL（30 mmol）及び20 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのTHF溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して2.03 g（4.57 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は68%であった。
(51) 9-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-7-ヒドロキシヘプタデカン-1,17-ジイル ジオレアート（CL4H8）
　9-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)ヘプタデカン-1,9,17-トリオール 222 mg（0.50 mmol）を2.5 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、4℃に冷却した。続いて、オレイルクロリド451 mg（1.50 mmol）を加えた後、TEA 836 μL（6.0 mmol）を滴下し、室温で3時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.2 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して68.4 mg（0.070 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は14%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (m, 12H), 1.20-1.68 (m, 82H), 2.01 (m, 8H), 2.27 (t, 4H), 2.32-2.45 (m, 6H), 4.04 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
(52) ((10-ブロモデシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン
　10-ブロモデカン-1-オール 25.0 g（105.4 mmol）を100 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、4℃に冷却した。TBSCl 17.3 g（115 mmol）を加えたのち、TEA 19.5 mL（140 mmol）を滴下し、室温で一晩撹拌した。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、ヘキサン300 mLを加えて懸濁させ、セライト濾過によって不溶物を除去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して21.0 g（59.8 mmol）を無色オイルとして得た。収率は57%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.24-1.34 (m, 10H), 1.42 (tt, 2H), 1.51 (tt, 2H), 1.72-1.88 (m, 2H), 3.40 (t, 2H), 3.59 (t, 2H).
(53) 15-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(10-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)デシル)ペンタデカン-1,5-ジオール
　4 mLのジエチルエーテルに((10-ブロモデシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 1.05 g（2.99 mmol）を溶解し、削り屑状マグネシウム1.75 g（72.0 mmol）を加え、続いてヨウ素1欠片加えた。室温で10分静置した後、オイルバスで40℃に加熱しながら撹拌し、11 mLのジエチルエーテルに溶解した((10-ブロモデシル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン 19.95 g（56.81 mmol）を滴下した。40℃で2時間反応させた後、4℃に冷却した。続いて、δ-バレロラクトン3.67 mL（39.6 mmol）を添加し、室温で一晩反応させた。次に、4℃に冷却し、5%硫酸を滴下することで残留したマグネシウムを溶解させた。ジエチルエーテルで希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で分液洗浄した。続いて、有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して11.95 g（18.52 mmol）を無色オイルとして得た。δ-バレロラクトンからの収率は69%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (s, 18H), 1.22-1.60 (m, 42H), 3.59 (t, 4H), 3.66 (t, 2H).
(54) 15-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(10-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)デシル)-5-ヒドロキシペンタデシル 4-メチルベンゼンスルホネート
　15-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(10-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)デシル)ペンタデカン-1,5-ジオール 6.00 g（9.30 mmol）を30 mLの1,2-ジクロロエタンに溶解し、DMAP 114 mg（0.93 mmol）とTEA 3.24 mL（23.25 mmol）を加え、4℃に冷却した。続いて、pTsCl 2.13 g（11.16 mmol）を徐々に加えていった後、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、酢酸エチルで懸濁し、水及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ヘキサン：酢酸エチル（連続勾配）｝に供することにより精製して無色オイルとして得た。
(55) 15-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,27,27,28,28-オクタメチル-4,26-ジオキサ-3,27-ジシラノナコサン-15-オール
　15-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(10-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)デシル)-5-ヒドロキシペンタデシル 4-メチルベンゼンスルホネート 1.66 g（2.08 mmol）に5 mLのTHFを加え、4℃に冷却した。続いて、ジプロピルアミン 569 μL（4.16 mmol）を加えた後、室温で21日間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、1 M水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して1.80 g（2.47 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は27%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.05 (s, 12H), 0.89 (m, 24H), 1.23-1.62 (m, 46H), 2.30-2.44 (m, 6H), 3.58 (t, 4H).
(56) 11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)ヘニコサン-1,11,21-トリオール
　15-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-2,2,3,3,27,27,28,28-オクタメチル-4,26-ジオキサ-3,27-ジシラノナコサン-15-オール 1.80 g（2.47 mmol）に酢酸515 μL（9.0 mmol）及び6 mLの1.0 M テトラブチルアンモニウムフルオリドのTHF溶液を加え、室温で一晩反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、逆相シリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；水（0.1%トリフルオロ酢酸）：アセトニトリル0.1%トリフルオロ酢酸）（連続勾配）｝に供することにより精製して1.01 g（2.02 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は82%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.99 (t, 6H), 1.20-1.79 (m, 46H), 3.00 (m, 6H), 3.63 (t, 4H).
(57) 11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)-11-ヒドロキシヘニコサン-1,21-ジイル ジオレアート（CL4H10）
　11-(4-(ジイソプロピルアミノ)ブチル)ヘニコサン-1,11,21-トリオール 250 mg（0.50 mmol）を4 mLのジクロロメタンに溶解し、4℃に冷却した。続いて、オレイルクロリド602 mg（2.0 mmol）を加えた後、DMAP 12.2 mg（0.10 mmol）及びピリジン 322 μL（4.0 mmol）を滴下し、室温で3時間反応させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した後、酢酸エチルで懸濁し、濾過によって不溶物を除去した。ろ液を0.5 N水酸化ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で分液洗浄した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。これを濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー｛溶離溶媒；ジクロロメタン：メタノール（連続勾配）｝に供することにより精製して42.5 mg（0.041 mmol）を薄黄色オイルとして得た。収率は8.3%であった。
1H NMR；400 MHz　δ=0.88 (m, 12H), 1.17-1.65 (m, 90H), 2.01 (m, 8H), 2.28 (t, 4H), 2.30-2.45 (m, 6H), 4.05 (t, 4H), 5.32 (m, 4H).
例2
　疎水性足場がリノール酸由来であり、様々な親水性部位を有するpH感受性カチオン性脂質の評価を行った。LNPは特許文献6の実施例(例2)の方法に準じて、各pH感受性カチオン性脂質、cholesterol、methoxy polyethyleneglycol 2000 dimirystoylglycerol（PEG-DMG 2000）をモル比50:50:0.75-1.5とし、アルコール希釈法(図1)によって調製した。相的光散乱法によって算出される平均粒子径は80-120 nmであり、siRNA搭載率は90%以上であった。
　p-Toluenesulfonic acid（TNS）を用いて各LNPのpKaを求めた。TNS（終濃度：0.75 μM）とLNP(終濃度：30 μM)を各pHに調整した緩衝液中で混合し、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定した。最も高い値及び低い値をそれぞれ100%及び0%荷電とし、50%荷電率を示すpHをpKaとして算出した。その結果、第3級アミノ基周辺の化学構造によって4.5以下から8.2までの幅広い範囲で様々なpKaを示した(図2）。
　エンドソーム脱出活性の指標としてのhemolysis活性、in vitroノックダウン活性及びin vivo F7ノックダウン活性を測定した。Hemolysis活性に関しては、マウス赤血球とLNPをpH6.5に調整した緩衝液中で混合し、37℃、30 minインキュベート後に遠心し、上清の545 nmにおける吸光度を測定した。LNPを加えないサンプル及び終濃度0.5%のTritonX-100を加えたサンプルをそれぞれネガティブ、ポジティブコントロールとして各サンプルのhemolysis効率を算出した。In vitroノックダウン活性に関しては、dual-luciferase安定発現HeLa（HeLa-dluc）細胞に、luciferaseに対するsiRNAを搭載したLNPを様々な濃度で添加し、24時間後にdual-luciferase assayによりノックダウン効率を算出した。添加濃度に対する標的luciferase発現量をプロットし、50%抑制するsiRNA濃度をIC50として算出した。In vivo F7ノックダウン活性に関しては、ICRマウス（4週齢、雌性）にF7に対するsiRNAを搭載したLNPを0.1 mg siRNA/kgで静脈内投与し、24時間後における血漿中F7酵素活性を測定した。pKaに対する各活性をプロットした（図3）。
　In vivo F7ノックダウン活性はpKa 6.4程度を最大活性とするベル型のpKa依存性を示し(図3A)、これは既報と同様の結果であった(非特許文献10; 非特許文献13）。ベンチマークであるCL1A6(YSK12)よりも優れたノックダウン活性を示す誘導体が複数見出された。In vitroノックダウン活性はpKaの上昇に伴って向上していく結果となった(図3B)。Hemolysis活性もpKaの上昇に伴って向上していく結果となった(図3C)。いずれの活性もおおよそ予測されるpKa依存性を示したことから、第3級アミノ基周辺の化学構造変化はpH感受性カチオン性脂質のpKaに大きく影響を与える一方で、それ以外の部分の性質への影響は比較的少ないことが示唆された。換言すれば、第3級アミノ基周辺の化学構造を変えることでpKaのみを目的の値へ調節することが可能であることが示唆された。
例3
　親水性部位をCL4及びCL15の2種に固定し、疎水性足場の化学構造を変化させた際の影響を例2と同様にして評価した。TNSを用いてpKaを測定したところ、CL4では6.25-6.40、CL15では6.80-7.25と疎水性足場構造変化による影響は認められなかった(図4A及び4B)。In vitroノックダウン活性に関しては、CL15Bを除く他の誘導体で、従来の疎水性足場を有するCL15Aよりも優れていた(図5)。特にオレイン酸を疎水性足場に持つCL15HではCL15Aと比べて約3倍程度の高い活性を示した。In vivo F7ノックダウン活性に関しては、CL4、CL15共に疎水性足場C、Dの活性は低い一方で、疎水性足場Hが疎水性足場Aと同程度以上の活性を示した(図6A及び6B)。
　特に高いF7ノックダウン活性を示したCL4Hについて、脂質組成及びlipid/siRNA電荷比に着目してノックダウン活性の観点から製剤処方の最適化を行った。CL4H:cholesterolのモル比を30:70から70:30に変化させてLNPを調製した。実験の結果、CH4H:cholesterol比60:40で最大活性を示した(図7A)。Lipid/siRNA電荷比を2.375-14.25の範囲で変化させてLNPを調製した。実験の結果、電荷比の上昇に伴ってノックダウン活性は上昇し、電荷比7程度でプラトーに達した(図7B)。この結果から、電荷比14.25を最適電荷比とした。以上の検討より最適化された処方でCL4H-LNPを調製し、F7ノックダウンの投与量依存性を検討した結果、ED50で0.002 mg siRNA/kgを示した(図8)。
例4
　CL4H-LNPのin vivoにおける安全性を検討した。ICRマウス(4週齢、雌性)に7 mg siRNA/kgで静脈内投与し、24時間後における血漿中alanin transaminase(ALT)及びaspartatetransaminase(AST)値及び投与前後の体重変化の測定を行った。比較対象として、開発者が以前に開発したpH感受性カチオン性脂質YSK13-C3を用い、脂質組成はYSK13-C3-LNPで最適化されたpH感受性脂質:cholesterol:PEG-DMG 2000 = 70:30:3(モル比)とした。YSK13-C3-LNPはALT及びAST共に10,000を超える強い肝毒性を示した一方、CL4H-LNPはPBS投与群と同レベルの軽微な肝毒性に留まった(図9A)。また、体重変化についてはYSK13-C3-LNP投与群では体重低下が認められた一方で、CL4H-LNPでは体重増加に転じた(図9B)。以上の結果から、CL4Hは安全性に優れる脂質化合物であることが示された。
　平均粒子径35 nm程度の小さなLNPのsiRNA導入活性に与える疎水性足場の影響を検討した。脂質組成をpH感受性カチオン性脂質：cholesterol:PEG-DMG  2000 = 70:30:3(モル比)とし、マイクロミキサー内蔵マイクロ流路を用いてluciferaseに対するsiRNAを搭載したLNPの製造を行った。HeLa-dluc細胞におけるluciferaseノックダウン活性を測定した結果、従来のリノール酸由来疎水性足場を有するCL15Aでは30 nM siRNAで30%以下のノックダウン効率に留まる条件下において、CL15C、CL15D及びCL15Hは10 nM siRNAでいずれも50%以上の高いノックダウン効率を示した(図10)。この結果は、長い疎水性足場を有するpH感受性カチオン性の脂質化合物により、LNPの小型化に伴うsiRNA導入効率の低下を克服できることを示している。
例5
　親水性部位をCL4に固定した3種の脂質化合物（CL4H6、CL4H8、及びCL4H10）を用いて、前記疎水性足場1の化学構造を変化させた際の影響を例2と同様にして評価した。TNSを用いてpKaを測定したところ、CL4H6では6.35、CL4H8では6.10、CL4H10では5.85であり、疎水性足場1の炭素鎖の長さが長いほどpKaは低下した (図11)。In vivo F7ノックダウン活性は、ICRマウスへF7に対するsiRNAを搭載したLNPを静脈内投与してから24時間後に、血漿中F7酵素活性を測定した。この結果、3種類の誘導体のいずれも活性を有していた。なかでもCL4H6が最も優れた活性を示した(図12)。
例6
　CL4H6と、非特許文献11等に記載されている脂質化合物YSK05及びYSK13-C3について、In vivo F7ノックダウン活性を測定し、投与から24時間後のsiRNAの残存量との関係を調べた。In vivo F7ノックダウン活性は、各脂質化合物を用いて例2と同様にしてF7に対するsiRNAを搭載したLNPを調製し、各LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に0.01 mg siRNA/kgで静脈内投与し、投与後30分後と24時間後に、各マウスから肝臓を回収し、肝臓中のsiRNAをqRT-PCR法により定量した。投与後30分後の肝臓におけるsiRNAは、いずれの脂質化合物を用いたLNPでも同程度であり、肝臓移行量はほぼ同等であることが確認された（図13A）。一方で、投与後24時間後の肝臓におけるsiRNA残存量には大きな差が認められた（図13B）。CL4H6－LNPを投与した肝臓のsiRNA残存量は、YSK05－LNPを投与した肝臓の17.3倍、YSK13-C3－LNPを投与した肝臓の4.8倍であった。また、各LNPを投与したマウスのF7ノックダウンにおけるED50を求め、この値と投与後24時間後の肝臓におけるsiRNA残存量は、反比例の関係にあった（図13C）。これらの結果は、CL4H6-LNPが効率的にエンドソームを脱出し、siRNAを細胞質へ送達していることを示唆していた。
　また、各LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に1 mg siRNA/kgで静脈内投与し、投与後1時間後のマウスの肝臓を切除し、核(Hoechst33342)、血管(FITC)、脂質(DiI)、及びsiRNA(Cy5)をそれぞれ蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）で観察した。この結果、肝実質細胞の細胞質におけるsiRNAの蛍光量は、CL4H6-LNPを投与したマウスが最も多く、CL4H6-LNPがsiRNAを効率的に細胞質へ送達している様子が観察された（図14）。
　各LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に0.3 mg siRNA/kgで静脈内投与し、血漿中F7タンパク質の量を経時的に定量した。各回収日のLNP未投与マウス（NT）の血漿中F7タンパク質量を100とした相対血漿中F7タンパク質量の経時的変化を図15Aに示す。CL4H6-LNPを投与したマウスが最も長期間、相対血漿中F7タンパク質量を低く抑えることができた。また、各LNPを投与したマウスのF7ノックダウンにおけるED50を求めたところ、この値と相対血漿中F7タンパク質量が50となるLNP投与後経過時間(Durability)(day)とは、負の相関関係にあった（図15B）。すなわち、CL4H6-LNPは、同じsiRNA投与量において、YSK05-LNP及びYSK13-C3-LNPよりも遺伝子ノックダウン活性が長期に亘って持続した。
　血漿中F7タンパク質は、Biophen FVII assay kit（Hypen BioMed製）を用いた呈色反応により定量した。この呈色反応は、まず、FVIIタンパク質をキット中の組織因子（TF）と複合体化させる。得られたFVII-TF複合体によってキット中の第X因子（FX）を活性化（FXa）させ、その酵素活性で発色基質を産生させる。産生された発色基質の量を、405nmにおける吸光度を測定して定量した。
　各LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に1 mg siRNA/kgで静脈内投与し、経時的に肝臓及び脾臓を回収し、LC/MSで各カチオン性脂質を定量した。この結果、肝臓及び脾臓におけるYSK05及びYSK13-C3は、投与後72時間経過時点までほぼ一定であるのに対して、CL4H6の組織内含有量は、肝臓と脾臓のいずれにおいても経時的に減少することが確認された（図16A及び16B）。これらの結果から、CL4H6は生分解性に富むことが示され、高い安全性に寄与していると考えられた。
例7
　CL4H6-LNPをmethoxy polyethyleneglycol 2000 distearoylglycerol（PEG-DSG 2000）でさらに修飾することによって血中の滞留時間を長期化し、さらにがん細胞におけるノックダウン活性を評価した。
　具体的には、まず、例2と同様にしてCL4H6-LNP を用いてPLK1に対するsiRNAを搭載したLNPを調製した。得られたCL4H6-LNPを、pH6.0の10%EtOH水溶液にPEG-DSG 2000と共に分散させ、60℃で30分間インキュベートすることにより、CL4H6-LNP をPEG-DMG 2000でさらに修飾した。このPEG-DSG修飾CL4H6-LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に0.5 mg siRNA/kgで静脈内投与し、血中PEG-DSG修飾CL4H6-LNP量を経時的に定量した。PEG-DSG修飾CL4H6-LNPのマウスへ投与した量（ID）を100%とした相対血中PEG-DSG修飾CL4H6-LNP量の経時的変化を図17に示す。
　PEG-DSG修飾CL4H6-LNPと同様にして、PEG-DSG修飾YSK05-LNPを調製した。次いで、各LNPを、OSRC2細胞（ヒト腎細胞がん由来）皮下移植マウスに2 mg siRNA/kgで静脈内投与し、投与後24時間後におけるがん組織中のPLK1遺伝子の発現量をqRT-PCR法で測定した。この結果、LNP未投与のコントロールマウス（NT）のがん組織におけるPLK1発現量を１とした相対PLK1発現量は、PEG-DSG修飾CL4H6-LNPを投与したマウスとPEG-DSG修飾YSK05-LNPを投与したマウスの両方で有意に低かった。特にPEG-DSG修飾CL4H6-LNPは、PEG-DSG修飾YSK05-LNPよりも相対血中PLK1発現量が低く、優れたノックダウン活性が認められた（図18A）。
　また、各LNPを投与後24時間後のOSRC2細胞皮下移植マウスの体重を測定し、投与前の体重からの変化率（％）を調べた（図18B）。PEG-DSG修飾YSK05-LNPを投与したマウスでは、投与後にはやや体重の減少が観察されたが、PEG-DSG修飾CL4H6-LNPを投与したマウスでは、PEG-DSG修飾YSK05-LNPを投与したマウスではほとんど体重の変動はなかった。これらの結果から、PEG-DSG修飾YSK05-LNPは安全性が高く、様々に使用できることが示唆された。
例8
　CD45に対するsiRNAを搭載したCL4H6を含むLNPを骨髄由来マクロファージに導入し、CD45遺伝子のノックダウン活性を測定した。
　まず、脂質組成がカチオン性脂質（CL4H6）、cholesterol、及びPEG-DMG 2000をモル比60:40:2とし、さらにCD45に対するsiRNAを用いた以外は例2と同様にして、CD45に対するsiRNAを様々な濃度で搭載したCL4H6-LNPを調製した。
　ICRマウス骨髄細胞から誘導したマクロファージの培養培地に、CD45に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNPを添加し、24時間培養した。比較対象として、当該マクロファージにリポフェクタミン試薬（Lipofectamine RNAiMAX、Thermo Fisher Scientific社製）を用いてCD45に対するsiRNAをトランスフェクションし、24時間培養した。各マクロファージの24時間培養後におけるCD45遺伝子の発現量を、qRT-PCR法で測定した。CD45に対するsiRNA未投与のマクロファージ(NT)におけるCD45の発現量を100%とした各マクロファージの相対CD45発現量（%）の結果を図19に示す。CD45に対するsiRNAをCL4H6-LNPに搭載してトランスフェクションしたマクロファージのほうが、リポフェクタミン試薬を用いてCD45に対するsiRNAをトランスフェクションしたマクロファージよりも10倍以上高い効率で遺伝子ノックダウンを誘導した。
例9
　CD45に対するsiRNAを搭載したLNPを、OSRC2細胞皮下移植マウスに投与し、CD45遺伝子のノックダウン活性を測定した。
　まず、脂質組成がカチオン性脂質（CL4H6又はYSK05）、cholesterol、及びPEG-DSG 2000をモル比70:30:2とし、さらにCD45に対するsiRNAを用いた以外は例2と同様にして、CD45に対するsiRNAを搭載したLNPを調製した。
 各LNPを、OSRC2細胞皮下移植マウスに2 mg siRNA/kg/doseで2日連続して静脈内投与した。最終投与から48時間後における腫瘍関連マクロファージのCD45遺伝子の発現量を、フローサイトメトリーで測定した。siRNA未投与の腫瘍関連マクロファージ（NT）におけるCD45発現量を100%とした場合の各腫瘍関連マクロファージの相対CD45発現量（%）の結果を図20に示す。CD45に対するsiRNAをCL4H6-LNPに搭載して投与したマウスのほうが、YSK05-LNPに搭載して投与したマウスよりも、腫瘍関連マクロファージにおけるCD45の相対発現量が低かった。すなわち、CL4H6は、腫瘍関連マクロファージにおいて優れた遺伝子ノックダウンを誘導した。
例10
　CL4H6を含むLNPをマウスに反復投与し、安全性を評価した。LNPに搭載するsiRNAとしては、マウスに対する薬理活性のないsiRNAを用いた。
　まず、pH感受性カチオン性脂質としてCL4H6を用いて、例2と同様にしてヒトPLK1に対するsiRNAを搭載したLNP（CL4H6-LNP）を調製した。得られたCL4H6-LNPを、ICRマウス（4週齢、雌性）に、3又は4日ごとに、0.3 mg siRNA/kg 又は1 mg siRNA/kgで静脈内に反復投与した。具体的には、投与開始日（0日目）、投与開始日から4、7、11、14、18、21、及び23日目に、CL4H6-LNPを静脈内投与した。0.3 mg siRNA/kg は、F7に対するsiRNAを搭載したCL4H6-LNPのED50（0.0025 mg siRNA/kg）（例6参照）の120倍の投与量であり、1 mg siRNA/kg はその400倍の投与量である。
　投与開始0、4、7、11、14、18、21、23、及び28日目に各マウスの体重を測定し、未投与群と比較した。0.3 mg siRNA/kg投与群（n=3）、1 mg siRNA/kg投与群（n=3）、及び未投与群（n=3）の、投与開始0日目の体重を100%とする体重変化率（%）の経時的変化を図21に示す。0.3 mg siRNA/kg投与群及び1 mg siRNA/kg投与群の体重変化の推移は、未投与群とほぼ同等であり、CL4H6-LNPの反復投与による全身毒性は認められなかった。
　CL4H6-LNPの反復投与開始から28日目に、0.3 mg siRNA/kg投与群、1 mg siRNA/kg投与群、及び未投与群の各マウスの血清を採取し、血液学的パラメーター、具体的には、総タンパク質（TP：g/dL）、アルブミン（ALB: g/dL）、尿素窒素（BUN:mg/dL）、クレアチニン（CRE:mg/dL）、ナトリウム（Na:mEq/L）、カリウム（K:mEq/L）、塩化物（Cl:mEq/L）、カルシウム（Ca:mg/dL）、無機リン（IP:mg/dL）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST:IU/L）、アラニンアミノ基転移酵素（ALT:IU/L）、乳酸脱水素酵素（LDH:IU/L）、アミラーゼ（AMY:IU/L）、g-グルタミル基転移酵素（γ-GT:IU/L）、総コレステロール（T-CHO:mg/dL）、中性脂肪（TG:mg/dL）、高密度リポタンパク質-コレステロール（HDL-C:mg/dL）、総ビリルビン（T-BIL:mg/dL）、及びグルコース（GLU:mg/dL）を測定した。各測定は常法により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　測定結果を表1及び2に示す。いずれの項目も、0.3 mg siRNA/kg投与群及び1 mg siRNA/kg投与群では、未投与群と比較して有意な変化は認められなかった
　CL4H6-LNPの反復投与開始から28日目に、各群のマウスから血清採取後、肝臓及び脾臓を回収し、病理組織学的検査（ＨＥ染色法）を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　結果を表3に示す。0.3 mg siRNA/kg投与群及び1 mg siRNA/kg投与群では、未投与群と比べて目立った所見は認められなかった。これらの結果から、CL4H6-LNPは安全性に優れていることが明らかになった。
　本発明の脂質化合物は、siRNAなどの送達対象物質に対して優れた送達効率を達成することができ、高い安全性を両立させつつ、LNPの粒子径の減少に伴うsiRNAなどの送達活性の低下の克服を可能にする脂質膜構造体を提供することができる。また、本発明の脂質化合物を含む脂質膜構造体は、生分解性と優れたエンドソーム脱出能、及びLNPの安定化能を有しており、樹状細胞などの免疫細胞の細胞内にsiRNAなどを効率的に送達することができる。

Claims (15)

  1. 　下記の式(I)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、aは3～5の整数を示し；bは0又は1の整数を示し；R1及びR2はそれぞれ独立に下記の式(A)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (式中、qは1～9の整数を示し；rは0又は1を示し；sは1～3の整数を示し；tは0又は1を示し；uは1～8の整数を示し；cは0又は1を示し：vは4～12の整数を示すが、bとcが同時に0となる場合には、qが3～5の整数であり、r及びtが1であり、sが1であり、かつu＋vが6～10の整数である場合を除く) で表される基を示し；Xは5～７員非芳香族ヘテロ環基(ただし、当該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合し、当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基が置換していてもよい)、又は下記の式(B)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     (式中、dは0～3の整数を示し、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基(当該C1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基は1個又は2個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すが、R3及びR4は互いに結合して5～7員非芳香族ヘテロ環(当該環上には1又は2個のC1-4アルキル基又はC2-4アルケニル基が置換していていてもよい)を形成してもよい)で表される基を示す〕
    で表される脂質化合物又はその塩。
  2. 　r及びtが0であり、q＋s＋uが8～18の整数、好ましくは10～16の整数である、請求項１に記載の脂質化合物又はその塩。
  3. 　rが1であり、tが0であり、qが5～9の整数であり、s＋uが5～9の整数である、請求項１又は２に記載の脂質化合物又はその塩。
  4. 　vが5～12の整数である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  5. 　aが4であり、bが0又は1である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  6. 　bが0であり、Xが式(B)で表される基〔ただし、dは0であり、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すか、あるいはR3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基(当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1個のC1-4アルキル基で置換されていてよい)を形成する〕である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  7. 　bが1であり、Xが式(B)で表される基〔ただし、dは0～3の整数であり、R3及びR4はそれぞれ独立にC1-4アルキル基(R3が示すC1-4アルキル基は1個のフェニル基で置換されていてもよい)を示すか、あるいはR3及びR4が互いに結合する場合には、1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基(当該1-ピロリジニル基、1-ピペリジニル基、1-モルホリニル基、又は1-ピペラジニル基は1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい)を形成する〕である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  8. 　bが1であり、Xが5～７員非芳香族ヘテロ環基(当該基は炭素原子により(O-CO)b-に結合する)であり、当該5～７員非芳香族ヘテロ環基がピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基(当該ピロリジニル基、ピペリジニル基、モルホリニル基、又はピペラジニル基は、1又は2個の同一又は異なるC1-4アルキル基で置換されていてよい)である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  9. 　細胞内にsiRNAを送達するための脂質膜構造体の脂質成分として用いられる、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の脂質化合物又はその塩。
  10. 　脂質成分として請求項１ないし８のいずれかに記載の脂質化合物又はその塩を含む脂質膜構造体。
  11. 　リポソームである、請求項１０に記載の脂質膜構造体。
  12. 　siRNAが内部に封入されている請求項１０又は１１に記載の脂質膜構造体。
  13. 　細胞内の標的遺伝子をノックダウンするために用いられる、請求項１２に記載の脂質膜構造体。
  14. 　前記細胞が、免疫細胞又はがん細胞である、請求項１３に記載の脂質膜構造体。
  15. 　患者から樹状細胞を分離・採取し、in vitroで当該樹状細胞の細胞内にsiRNAを導入した後、標的遺伝子がノックダウンされた樹状細胞をその患者に投与する免疫療法において、樹状細胞における標的遺伝子をノックダウンするために用いられる、請求項１４に記載の脂質膜構造体。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2020241679A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03
WO2022071582A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JP2022530043A (ja) * 2019-04-25 2022-06-27 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド イオン化可能なアミン脂質及び脂質ナノ粒子
JPWO2022176953A1 (ja) * 2021-02-17 2022-08-25
WO2022244844A1 (ja) 2021-05-21 2022-11-24 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
WO2023112939A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 Jsr株式会社 組成物の純化方法
WO2023191050A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 日東電工株式会社 がん送達用医薬組成物または免疫賦活用組成物
WO2023188830A1 (ja) 2022-03-31 2023-10-05 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
WO2024018762A1 (ja) 2022-07-19 2024-01-25 国立大学法人北海道大学 ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子
WO2024018761A1 (ja) 2022-07-19 2024-01-25 国立大学法人北海道大学 中性脂質及び脂質ナノ粒子
WO2024024156A1 (ja) * 2022-07-29 2024-02-01 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子および医薬組成物
WO2024190865A1 (ja) 2023-03-15 2024-09-19 ユナイテッド・イミュニティ株式会社 脂質粒子
WO2024248146A1 (ja) * 2023-05-31 2024-12-05 国立大学法人北海道大学 ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022260678A1 (en) * 2021-06-11 2022-12-15 Dnalite Therapeutics, Inc. Compositions and methods for biological delivery vehicles
US20240058454A1 (en) 2020-12-14 2024-02-22 Particella, Inc. Biological delivery systems
CN113264842B (zh) * 2021-07-21 2022-03-01 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 一种脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
US20240415772A1 (en) * 2021-10-22 2024-12-19 Seqirus Inc. Ionizable cationic lipid for messenger rna delivery
KR102549868B1 (ko) 2022-04-22 2023-06-30 주식회사 무진메디 재조합 프로타민을 이용한 지질 나노입자 기반 약물 전달체 및 이의 제조방법
KR102475540B1 (ko) 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치
CA3249787A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Univ British Columbia EXPRESSION OF EXOGENOUS PROTEINS IN DONOR PLATELETS TREATED WITH LIPID NANOPARTICLES
AU2024218499A1 (en) * 2023-02-09 2025-08-14 Seqirus Inc. Ionizable cationic compound

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01249717A (ja) 1988-03-30 1989-10-05 Fuji Photo Film Co Ltd リポソームの製造方法
JPH02149512A (ja) 1988-08-11 1990-06-08 Terumo Corp リポソームおよびその製法
JPH04346918A (ja) 1991-05-23 1992-12-02 Mitsubishi Kasei Corp 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
JP2004010481A (ja) 2002-06-03 2004-01-15 Mebiopharm Co Ltd リポソーム製剤
WO2005032593A1 (ja) 2003-10-01 2005-04-14 Japan Science And Technology Agency 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム
JP2006028030A (ja) 2004-07-12 2006-02-02 Japan Science & Technology Agency リポソーム封入物質がエンドソームから脱出可能なリポソーム
WO2006101201A1 (ja) 2005-03-24 2006-09-28 National University Corporation Hokkaido University 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム
WO2007102481A1 (ja) 2006-03-07 2007-09-13 National University Corporation Hokkaido University 目的物質の核内送達用ベクター
WO2011132713A1 (ja) 2010-04-21 2011-10-27 国立大学法人北海道大学 核内移行性を有する脂質膜構造体
US20120172411A1 (en) * 2010-09-17 2012-07-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
JP2014500233A (ja) * 2010-09-20 2014-01-09 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチドの送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
WO2015178343A1 (ja) 2014-05-20 2015-11-26 国立大学法人北海道大学 ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体
JP2016084297A (ja) * 2014-10-24 2016-05-19 国立大学法人北海道大学 脂質膜構造体
WO2016153012A1 (ja) * 2015-03-24 2016-09-29 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
JP2017117708A (ja) 2015-12-25 2017-06-29 日本特殊陶業株式会社 スパークプラグの製造装置

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01249717A (ja) 1988-03-30 1989-10-05 Fuji Photo Film Co Ltd リポソームの製造方法
JPH02149512A (ja) 1988-08-11 1990-06-08 Terumo Corp リポソームおよびその製法
JPH04346918A (ja) 1991-05-23 1992-12-02 Mitsubishi Kasei Corp 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
JP2004010481A (ja) 2002-06-03 2004-01-15 Mebiopharm Co Ltd リポソーム製剤
WO2005032593A1 (ja) 2003-10-01 2005-04-14 Japan Science And Technology Agency 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム
JP2006028030A (ja) 2004-07-12 2006-02-02 Japan Science & Technology Agency リポソーム封入物質がエンドソームから脱出可能なリポソーム
WO2006101201A1 (ja) 2005-03-24 2006-09-28 National University Corporation Hokkaido University 目的物質を効率的に核内に送達可能なリポソーム
WO2007102481A1 (ja) 2006-03-07 2007-09-13 National University Corporation Hokkaido University 目的物質の核内送達用ベクター
WO2011132713A1 (ja) 2010-04-21 2011-10-27 国立大学法人北海道大学 核内移行性を有する脂質膜構造体
US20120172411A1 (en) * 2010-09-17 2012-07-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
JP2014500233A (ja) * 2010-09-20 2014-01-09 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチドの送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
WO2015178343A1 (ja) 2014-05-20 2015-11-26 国立大学法人北海道大学 ｓｉＲＮＡ細胞内送達のための脂質膜構造体
JP2016084297A (ja) * 2014-10-24 2016-05-19 国立大学法人北海道大学 脂質膜構造体
WO2016153012A1 (ja) * 2015-03-24 2016-09-29 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
JP2017117708A (ja) 2015-12-25 2017-06-29 日本特殊陶業株式会社 スパークプラグの製造装置

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMERICAN ASSOCIATION OF PHARMACEUTICAL SCIENTISTS JOURNAL, vol. 14, no. 2, 2012, pages 303 - 315
ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, vol. 51, 2012, pages 8529 - 8533
BIOCHEMISTRY, vol. 26, 1987, pages 2964 - 2972
BIOCHEMISTRY, vol. 36, 1997, pages 3008 - 3017
BIOCHEMISTRY, vol. 43, 2004, pages 5618 - 5628
BIOLOGICAL AND PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 34, 2011, pages 1348 - 1351
DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 22, no. 2, 2007, pages 115 - 122
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 143, 2010, pages 311 - 317
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 225, 2016, pages 183 - 191
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 98, 2004, pages 317 - 323
JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 64, 2016, pages 547 - 555
JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY C NANOMATER INTERFACES, vol. 116, no. 34, 2012, pages 18440 - 18450
MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 11, 2014, pages 1424 - 1434
MOLECULAR THERAPY, vol. 21, no. 8, 2013, pages 1570 - 1578
MOLECULAR THERAPY, vol. 24, 2016, pages 788 - 795
MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS, vol. 1, 2012, pages e37
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 22, 2004, pages 1546 - 1553
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 31, no. 7, 2013, pages 638 - 646
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 33, no. 8, 2015, pages 870 - 876
NATURE MEDICINE, vol. 14, 2008, pages 258 - 265
NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 6, 2011, pages 815 - 823
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 111, no. 11, 2014, pages 3955 - 3960
SATO, Y. ET AL., MOLECULAR THERAPY, vol. 24, no. 4, 26 January 2016 (2016-01-26), pages 788 - 795, XP055561316, Retrieved from the Internet <URL:doi:10.1038/mt.2015.222> *
SCIENTIFIC REPORTS, vol. 4, 2014, pages 4750
See also references of EP3640237A4
TAKASHI NAKAMURA, HIDEYOSHI HARASHIMA: "[Delivering siRNA to Dendritic Cells Using Multifunctional Envelope Nanostructures and Expanding to Cell Therapy]", CHEMICAL INDUSTRY, vol. 67, no. 7, July 2016 (2016-07-01), pages 477 - 482, XP009518036 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022530043A (ja) * 2019-04-25 2022-06-27 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド イオン化可能なアミン脂質及び脂質ナノ粒子
CN114174522A (zh) * 2019-05-30 2022-03-11 国立大学法人北海道大学 脂质纳米粒子
KR20220015385A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 지질 나노 입자
CN114174522B (zh) * 2019-05-30 2024-10-25 国立大学法人北海道大学 脂质纳米粒子
WO2020241679A1 (ja) 2019-05-30 2020-12-03 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JPWO2020241679A1 (ja) * 2019-05-30 2020-12-03
JP7721128B2 (ja) 2019-05-30 2025-08-12 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
US12365921B2 (en) 2019-05-30 2025-07-22 National University Corporation Hokkaido University Lipid nanoparticle
EP3967649A4 (en) * 2019-05-30 2023-01-18 National University Corporation Hokkaido University LIPIDNANOPARTICLES
WO2022071582A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JPWO2022071582A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07
US12458605B2 (en) 2020-10-02 2025-11-04 National University Corporation Hokkaido University Lipid nanoparticle
KR20230080451A (ko) 2020-10-02 2023-06-07 내셔널 유니버시티 코포레이션 홋카이도 유니버시티 지질 나노 입자
JPWO2022176953A1 (ja) * 2021-02-17 2022-08-25
WO2022176953A1 (ja) * 2021-02-17 2022-08-25 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JP7761921B2 (ja) 2021-05-21 2025-10-29 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
WO2022244844A1 (ja) 2021-05-21 2022-11-24 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JP2022178879A (ja) * 2021-05-21 2022-12-02 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
JP7698851B2 (ja) 2021-12-16 2025-06-26 Jsr株式会社 組成物の純化方法
JPWO2023112939A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22
WO2023112939A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 Jsr株式会社 組成物の純化方法
WO2023191050A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 日東電工株式会社 がん送達用医薬組成物または免疫賦活用組成物
WO2023188830A1 (ja) 2022-03-31 2023-10-05 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子
KR20250004710A (ko) 2022-03-31 2025-01-08 내셔널 유니버시티 코포레이션 홋카이도 유니버시티 지질 나노입자
WO2024018761A1 (ja) 2022-07-19 2024-01-25 国立大学法人北海道大学 中性脂質及び脂質ナノ粒子
KR20250039370A (ko) 2022-07-19 2025-03-20 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 중성 지질 및 지질 나노 입자
WO2024018762A1 (ja) 2022-07-19 2024-01-25 国立大学法人北海道大学 ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子
WO2024024156A1 (ja) * 2022-07-29 2024-02-01 国立大学法人北海道大学 脂質ナノ粒子および医薬組成物
WO2024190865A1 (ja) 2023-03-15 2024-09-19 ユナイテッド・イミュニティ株式会社 脂質粒子
WO2024248146A1 (ja) * 2023-05-31 2024-12-05 国立大学法人北海道大学 ｐＨ感受性カチオン性脂質及び脂質ナノ粒子

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