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WO2011132713A1 - 核内移行性を有する脂質膜構造体 - Google Patents

核内移行性を有する脂質膜構造体 Download PDF

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WO2011132713A1
WO2011132713A1 PCT/JP2011/059738 JP2011059738W WO2011132713A1 WO 2011132713 A1 WO2011132713 A1 WO 2011132713A1 JP 2011059738 W JP2011059738 W JP 2011059738W WO 2011132713 A1 WO2011132713 A1 WO 2011132713A1
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WO
WIPO (PCT)
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lipid membrane
membrane structure
polypeptide
lipid
cells
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2011/059738
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English (en)
French (fr)
Inventor
原島　秀吉
英万 秋田
モハメド シャヒーン シャリフ
孝司 中村
聡一郎 石井
史朗 二木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokkaido University NUC
Kyoto University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Kyoto University NUC
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Publication date
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Priority to EP11772046.6A priority patent/EP2572706A4/en
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Priority to JP2012511688A priority patent/JP5794541B2/ja
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    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Definitions

  • the present invention relates to a lipid membrane structure having nuclear translocation properties. More specifically, the present invention relates to a lipid membrane structure such as a liposome that can be easily transferred into the nucleus of immune cells, particularly the nucleus of dendritic cells.
  • a method of encapsulating a drug in a liposome that is a lipid membrane structure has been proposed as a means of specifically transporting the drug to the affected area.
  • the effectiveness of liposomes encapsulating an antitumor agent has been reported in the field of malignant tumor treatment.
  • a lipid membrane structure that can be used for gene expression a multifunctional envelope-type nanostructure (MEND: Multifunctionallopeenvelope-type nano ⁇ device; hereinafter, it may be abbreviated as “MEND”.
  • MEND Multifunctionallopeenvelope-type nano ⁇ device
  • Drug Delivery System 22-2, 115pp.115-122, 2007, etc.
  • This structure can be used as a drug delivery system for selectively delivering a gene or the like into a specific cell, and is known to be useful for, for example, tumor gene therapy.
  • lipid membrane structures As a means to deliver target substances such as drugs, nucleic acids, peptides, polypeptides, and sugars to specific sites such as target organs and tumor tissues using lipid membrane structures, the surface of lipid membrane structures is a functional molecule.
  • a number of methods of modifying with have been proposed.
  • Lipid membrane structures encapsulating drugs such as antitumor agents reach the target cells and are taken into cells by endocytosis and become encapsulated in endosomes. The received drug is released into the cytoplasm.
  • Liposomes (Biochemistry, 43, pp.5618- modified with a peptide (GALA: Biochemistry, 26, pp.2964-2972, 1987) in order to enhance drug release from liposomes incorporated into endosomes 5623, 2004) and MEND (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-28030) have been proposed.
  • a liposome whose outer surface is modified with octaarginine International Publication WO2005 / 32593; WO Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004
  • bilamellar liposomes with lipid membranes modified with nuclear translocation peptides International Publication WO2006 / 101201
  • surface modification with monosaccharides such as galactose and mannose Liposomes
  • Multi-lipid membrane structures (T-MEND) modified with monosaccharides showed fusion properties with lipid membranes and nuclear membranes, and it was reported that gene expression efficiency could be improved in the in-vitro test results.
  • a nucleic acid encoding an antigenic protein can be introduced into the nucleus of an immune cell, in particular, a dendritic cell having an antigen-presenting action, the protein transcribed and translated from the nucleic acid in the dendritic cell is expressed on the surface of the dendritic cell.
  • the living body can acquire immunity to the protein. From such a viewpoint, there is a need for a technique for efficiently delivering a nucleic acid into the nucleus of immune cells such as dendritic cells.
  • the efficiency of nucleic acid introduction when introducing a nucleic acid into the nucleus of a dendritic cell using a lipid membrane structure such as MEND described above is sufficiently higher than that of other cells such as tumor cells and liver parenchymal cells. is not.
  • the introduced nucleic acid Before the introduced nucleic acid is finally expressed in the nucleus, it must undergo various intracellular kinetic processes such as intracellular uptake, endosomal escape, nuclear translocation, and nuclear transcription.
  • a nuclear membrane consisting of two membranes always exists intact, and this nuclear membrane is presumed to impede the ability of lipid membrane structures to translocate into the nucleus. Therefore, in order to deliver nucleic acids to the nuclei of dendritic cells using lipid membrane structures, how to break through the above-mentioned processes, particularly the barrier by the nuclear membrane composed of two membranes, is a very important issue. It becomes.
  • KALA peptide A 27 amino acid residue polypeptide called KALA peptide is known, and it has been reported that it can form a complex with plasmid DNA using its own cationic charge (Biochemistry, 36, pp. 3008-3017, 1997), there is no suggestion in the above publication whether this peptide promotes nuclear translocation of lipid membrane structures.
  • An object of the present invention is to provide a means for efficiently delivering a nucleic acid into the nucleus of an immune cell, particularly a dendritic cell having antigen-presenting ability. More specifically, it is an object of the present invention to provide a lipid membrane structure capable of efficiently delivering a nucleic acid into the nucleus of immune cells such as dendritic cells.
  • MEND international publication WO2005 / 32593
  • octaarginine polypeptide which is a functional polypeptide capable of enhancing nuclear translocation ability, and endosome escape ability.
  • GALA peptide which is a functional polypeptide to be imparted
  • polypeptide expression from the nucleic acid was almost I was not able to admit.
  • T-MEND multi-lipid membrane structure
  • the present inventors have found that when the lipid membrane of a lipid membrane structure such as MEND encapsulating nucleic acid is modified with KALA peptide, the efficiency of nucleic acid introduction into the nucleus of immune cells such as dendritic cells is remarkable. It was found to increase.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a lipid membrane structure for delivering a substance into the nucleus of a cell, wherein the lipid membrane is a polypeptide of the following (a) and / or (b): (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and a lipid membrane into the nucleus of a cell
  • a lipid membrane structure modified with a polypeptide having activity to promote structure migration is provided.
  • the above lipid membrane structure wherein the lipid membrane structure is a liposome; the above lipid membrane structure wherein the cell is an immune cell, preferably a dendritic cell; And / or the above-mentioned lipid membrane structure wherein the polypeptide of (b) is modified with a hydrophobic group, preferably a stearyl group or a cholesteryl group, and the hydrophobic group is inserted into the lipid membrane;
  • PEG PEG
  • the substance to be delivered is a nucleic acid, for example, any of the above lipid membrane structures, which is a functional nucleic acid such as a nucleic acid containing a gene or siRNA; Lipid membrane structure; the lipid membrane structure described above, wherein the DNA is DNA bound to a vector DNA not containing CpG; the DNA is bound to a vector DNA not containing CpG, and the DNA is free of CpG A lipid membrane structure as described above; the lipid membrane structure as described above, wherein the substance to be delivered is a nucleic acid encoding an antigen polypeptide to be presented on the surface of immune cells, preferably on the surface of dendritic cells; Any of the lipid membrane structures described above, which is a sex envelope nanostructure (MEND); any of the lipid membrane structures described above, in which a nucleic acid and a
  • MEND sex envelope nanostructure
  • the lipid membrane structure described above used for introducing a nucleic acid encoding an antigen polypeptide to be presented on the surface of an immune cell, preferably a dendritic cell, into the nucleus of the cell; for immunotherapy against the antigen polypeptide
  • the above lipid membrane structure for use is the above lipid membrane structure wherein the antigen polypeptide is a surface polypeptide specific for cancer cells.
  • a pharmaceutical composition comprising this lipid membrane structure as an active ingredient, preferably a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid as a substance to be delivered is also provided by the present invention.
  • the present invention provides a method for delivering a nucleic acid in the nucleus of a cell, preferably in the nucleus of an immune cell, more preferably in the nucleus of a dendritic cell in the body of a mammal, including a human,
  • a method comprising the step of administering to the animal the above lipid membrane structure encapsulated therein; a method of presenting an antigenic polypeptide on the surface of immune cells, preferably dendritic cells, in the body of mammals including humans.
  • a method comprising the step of administering to the animal the above lipid membrane structure encapsulating a nucleic acid encoding the antigen polypeptide.
  • a method for obtaining immunity to an antigen polypeptide by presenting the antigen polypeptide on the surface of an immune cell, preferably a dendritic cell, in a living body of a mammal including humans, which encodes the antigen polypeptide A method comprising the step of administering to the animal the above lipid membrane structure having nucleic acid encapsulated therein; and a cancer cell-specific surface on the surface of an immune cell, preferably a dendritic cell, in a mammal including human.
  • An immunotherapy of a malignant tumor in which a surface polypeptide is presented to acquire immunity to the polypeptide comprising the step of administering to the animal the above lipid membrane structure in which a nucleic acid encoding the polypeptide is encapsulated
  • a method of including is provided.
  • polypeptide used for promoting the migration of a lipid membrane structure into the nucleus of a cell, preferably into the nucleus of an immune cell, more preferably into the nucleus of a dendritic cell
  • the lipid membrane structure provided by the present invention can efficiently migrate into the nucleus of any cell such as immune cells including dendritic cells, and efficiently transfer substances such as nucleic acids encapsulated in the nucleus.
  • the polypeptide encoded by the nucleic acid can be expressed upon release.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide is introduced into the nucleus of a dendritic cell using the lipid membrane structure of the present invention, the polypeptide transcribed and translated from the nucleic acid is presented on the surface of the dendritic cell, Can acquire immunity to the polypeptide, so that effective immunotherapy can be performed against the desired polypeptide.
  • the lipid membrane structure provided by the present invention itself can exert an adjuvant action on dendritic cells and can promote the production of various cytokines.
  • tumor exacerbation and proliferation can be remarkably suppressed regardless of the presence or absence of an adjuvant.
  • gene expression efficiency is remarkably improved by removing the CpG sequence from the vector part in the DNA to be encapsulated and, if necessary, removing the CpG sequence from the DNA encoding the protein to be expressed. .
  • FIG. 4 is a graph showing gene expression efficiencies of four-membrane cationic T-MEND and anionic T-MEND in which a lipid membrane is modified with polypeptide (a) (KALA). It is the figure which showed the result of having introduce
  • FIG. 3 shows that KALA modified on the MEND surface has an adjuvant effect on dendritic cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing a step of constructing a CpGfree plasmid DNA having a new multiple cloning site as the first step of the method for constructing plasmid DNA (2) in Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing a step of incorporating a luciferase gene into CpGfree-NEWmcs as the second step of the method for constructing plasmid DNA (2) in Example 6.
  • FIG. 9 is a diagram showing a step of removing one remaining CpG sequence as the third step of the method for constructing plasmid DNA (2) in Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing a step of constructing a CpGfree plasmid DNA having a new multiple cloning site as the first step of the method for constructing plasmid DNA (2) in Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing a step of incorporating a luciferase gene into CpGfree-NEWmcs as the second step of the method for constructing plasm
  • MEND surface-modified with KALA has high antitumor activity irrespective of the presence or absence of an adjuvant. It is the figure which showed the anti-tumor effect at the time of administering MEND surface-modified with KALA after tumor formation.
  • Examples of the lipid constituting the lipid membrane structure of the present invention include phospholipids, glycolipids, sterols, and saturated or unsaturated fatty acids.
  • Examples of phospholipids and phospholipid derivatives include phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, 1 , 2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, phosphatidic acid and the like, and these can be used alone or in combination of two or more.
  • Fatty acid residues in these phospholipids are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 20 carbon atoms. Specific examples include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearin Mention may be made of acyl groups derived from fatty acids such as acids, oleic acid and linoleic acid. Moreover, phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used.
  • glycolipids examples include glyceroglycolipid (eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), sphingoglycolipid (eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside) and the like. Can be mentioned.
  • glyceroglycolipid eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride
  • sphingoglycolipid eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside
  • sterols examples include animal-derived sterols (e.g., cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterol) (e.g., stigmasterol, sitosterol, campesterol, Brush castrol), sterols derived from microorganisms (for example, timosterol, ergosterol) and the like.
  • the saturated or unsaturated fatty acid include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • the form of the lipid membrane structure is not particularly limited.
  • a form dispersed in an aqueous solvent a single membrane liposome, a multilamellar liposome, an O / W emulsion, a W / O / W emulsion, a spherical micelle, a string micelle Or an irregular layered structure.
  • a preferred form of the lipid membrane structure of the present invention is a liposome.
  • a liposome may be described as a preferred embodiment of the lipid membrane structure of the present invention, the lipid membrane structure of the present invention is not limited to liposomes.
  • the lipid membrane structure of the present invention is a lipid membrane structure for delivering a substance into the nucleus of a cell, wherein the lipid membrane is a polypeptide of the following (a) and / or (b): (a) sequence A polypeptide comprising the amino acid sequence of No. 1; (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID No. 1. It is characterized by being modified with a polypeptide having an activity of promoting the migration of the lipid membrane structure into the nucleus of the cell.
  • the polypeptide (a) represented by SEQ ID NO: 1 is a polypeptide comprising 27 amino acid residues obtained by removing 3 amino acids from the C-terminus from a known polypeptide (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA) comprising 30 amino acid residues. It is a peptide (hereinafter, this polypeptide may be referred to as “KALA peptide” in the present specification: chemistryBiochemistry, 36, pp.3008-3017, 1997).
  • KALA peptide this polypeptide can form a complex with plasmid DNA by utilizing its own cationic charge, but suggests whether or not it promotes nuclear translocation of lipid membrane structures. There is no.
  • the known KALA peptide is a functional polypeptide consisting of 30 amino acid residues called GALA peptide (Bioor. Med. Chem., 5, pp.1883-1891, 1997). Has an amino acid sequence substituted with another amino acid residue (for example, a plurality of glutamine residues are substituted with lysine residues).
  • GALA peptide is a polypeptide having a function of promoting fusion of lipid membranes in response to pH and a function capable of enhancing the ability of the lipid membrane structure to escape from the endosome, and is used in the present invention. It is different from the function of KALA peptide (function of improving the nuclear translocation in cells of lipid membrane structures).
  • polypeptide (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “modified”)
  • a polypeptide having an activity of promoting the transfer of a lipid membrane structure into the nucleus of a cell may be used.
  • the activity for promoting the transfer of the lipid membrane structure into the nucleus for example, the activity for promoting the ability of the dendritic cell to transfer into the nucleus can be evaluated.
  • a dendritic cell is used as a target cell, and a nucleic acid that can be expressed in its nucleus, for example, a nucleic acid that encodes a polypeptide linked downstream of a promoter operable in the nucleus of the dendritic cell is contained therein.
  • a lipid membrane structure in which the lipid membrane is modified with a modified polypeptide (hereinafter referred to as ⁇ modified lipid membrane structure '') and a lipid membrane structure not modified with the modified polypeptide (hereinafter referred to as ⁇ modified lipid membrane structure '')
  • the expression level of the marker polypeptide in the cell into which the modified lipid membrane structure is introduced is the expression level of the polypeptide in the cell into which the unmodified lipid membrane structure is introduced. What is necessary is just to evaluate whether it increases.
  • the modified polypeptide can be used as the polypeptide (b).
  • One or more of the above polypeptides (b) can be used in combination with the polypeptide (a).
  • polypeptide (a) and polypeptide (b) can be biologically prepared using host cells by various gene recombination techniques available to those skilled in the art. Moreover, you may manufacture the said polypeptide by the organic-chemical method using peptide synthesis reactions, such as the solid-phase synthesis method which can be utilized for those skilled in the art. Alternatively, automatic synthesis may be performed using a peptide synthesizer.
  • the means for immobilizing the polypeptide (a) and / or the polypeptide (b) to the lipid membrane of the lipid membrane structure is not particularly limited.
  • the polypeptide (a) may be a hydrophobic group such as a stearyl group or a cholesteryl group.
  • lipid membrane modification can be easily performed by preparing the lipid membrane structure so that the hydrophobic group is embedded in the lipid membrane of the lipid membrane structure. .
  • Any hydrophobic compound residue can be used as the hydrophobic group.
  • the lipid membrane modification with the polypeptide (a) and / or polypeptide (b) is applied to the inner lipid membrane in addition to the outer lipid membrane. You may go.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be used to deliver a substance into the nucleus of a cell, but the type of cell is not particularly limited, and the type of substance to be delivered and the purpose of substance delivery into the nucleus Depending on the situation, appropriate cells can be targeted.
  • Preferred examples of the cell to be targeted include immune cells, and among the immune cells, antigen-presenting cells can be preferably used.
  • antigen-presenting cells such as macrophages, dendritic cells, and B cells are preferred, and dendritic cells are particularly preferred.
  • the lipid membrane structure can be surface-modified with an oligosaccharide compound having 3 or more sugars.
  • the type of oligosaccharide compound having 3 or more sugars is not particularly limited.
  • an oligosaccharide compound having about 3 to about 10 sugar units bound thereto can be used, and preferably about 3 to about 6 sugar units. Bound oligosaccharide compounds can be used.
  • oligosaccharide compound for example, cellotriose (Cellotriose: ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 4) -D-glucose), chacotriose: ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 2)-[ ⁇ -L-rhamnopyranosyl- (1 ⁇ 4)]-D-glucose), gentianose (- ⁇ -D-fructofuranosyl ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 6) - ⁇ -D-glucopyranoside), isomaltotriose (Isomaltotriose: ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 6) - ⁇ -D-glucopyranosyl- (1 ⁇ 6) -D-glucose), isopanose : ⁇ -D-glucopy
  • an oligosaccharide compound that is a trimer or hexamer of glucose can be used, and more preferably, an oligosaccharide compound that is a trimer or tetramer of glucose can be used.
  • isomaltotriose, isopanose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, etc. can be suitably used, and among these, malto in which glucose is ⁇ 1-4 bonded. More preferred is triose, maltotetraose, maltopentaose, or maltohexaose.
  • the amount of surface modification of the lipid membrane structure by the oligosaccharide compound is not particularly limited. For example, it is about 1 to 30 mol%, preferably about 2 to 20 mol%, more preferably 5 to 10 mol% with respect to the total amount of lipid. Degree.
  • the method of modifying the surface of the lipid membrane structure with an oligosaccharide compound is not particularly limited.
  • liposomes whose surfaces are modified with monosaccharides such as galactose and mannose are known. Therefore, the surface modification method described in this publication can be adopted.
  • This method is a method in which a monosaccharide compound is bonded to a polyalkylene glycolated lipid to modify the surface of the lipid membrane structure. By this means, the surface of the lipid membrane structure can be simultaneously modified with polyalkylene glycol. preferable.
  • the blood retention of liposomes can be enhanced.
  • a hydrophilic polymer such as polyalkylene glycol
  • polyalkylene glycol is preferable.
  • polyalkylene glycol for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol and the like can be used.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.
  • the surface modification of the lipid membrane structure with polyalkylene glycol can be easily performed by constructing a lipid membrane structure using, for example, a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid.
  • a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid.
  • stearyl polyethylene glycol for example, PEG45 stearate (STR-PEG45) or the like
  • the surface modification of the lipid membrane structure can be performed using the polypeptide (a) and / or the polypeptide (b) modified with polyalkylene glycol.
  • polyalkylene glycol modified with polyalkylene glycol.
  • an appropriate phospholipid such as stearyl polyethylene glycol
  • the lipid membrane modification with the polyalkylene glycol and the polypeptide (a) and / or the polypeptide (b) can be simultaneously achieved.
  • surface modification with the polyalkylene glycol and the oligosaccharide compound can be simultaneously achieved by bonding the oligosaccharide compound to the polyalkylene glycol.
  • the method of surface-modifying the lipid membrane structure with a polyalkylene glycol or oligosaccharide compound is not limited to the above-mentioned method.
  • a lipidated compound such as stearyl polyalkylene glycol or oligosaccharide compound is used.
  • surface modification can be performed by using as a constituent lipid of the lipid membrane structure.
  • examples of lipid derivatives for enhancing retention in blood include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, etc. Can also be used.
  • examples of lipid derivatives for enhancing retention in blood include glycophorin, ganglioside GM1, phosphatidylinositol, ganglioside GM3, glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, etc.
  • polyalkylene glycol dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer as well as polyalkylene glycol are used as hydrophilic polymers to enhance blood retention.
  • the lipid membrane of the lipid membrane structure of the present invention may be modified with GALA.
  • GALA GALA cholesterol derivative
  • a lipid membrane structure surface-modified with GALA can be easily produced according to the method described in the above-mentioned publication. Can do.
  • a lipid membrane structure surface-modified with GALA can be produced.
  • the surface modification amount by GALA is not particularly limited, but is, for example, about 0.01 to 10 mol%, preferably about 0.1 to 4 mol%, more preferably about 1 to 3 mol%, based on the total lipid amount.
  • GALA includes deletion and substitution of one or several amino acids in the amino acid sequence of the peptide in addition to the peptide specified by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of JP-A-2006-28030. And / or a modified peptide consisting of an added amino acid sequence and having substantially the same properties as GALA (for example, the ability to fuse lipid membranes under acidic conditions).
  • GALA herein should not be construed as limiting in any way.
  • the entire disclosure of JP-A-2006-28030 is included as a disclosure of the present specification by reference.
  • the surface of the lipid membrane structure of the present invention can be modified with an MPC polymer.
  • the MPC polymer is an MPC polymer obtained by polymerizing 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC). Since this polymer has a molecular structure similar to that of a biological membrane, interaction with biological components such as polypeptides and blood cells is extremely small, and it has been shown to have excellent biocompatibility.
  • MPC polymer includes both a homopolymer of MPC and a copolymer of MPC and other polymerization components.
  • MPC polymers can be easily obtained from commercially available polymers.
  • MPC homopolymer (CAS: 67881-99-6) as a registered trademark “LIPIDURE” from NOF Corporation; copolymer of MPC and butyl methacrylate (CAS: 125275-25-4); MPC, methacrylic Ternary copolymer of sodium acid and butyl methacrylate; binary copolymer of MPC and 2-hydroxy-3- (meth) acryloyloxypropyltrimethylammonium chloride; phospholipid polymer (LIPIDURE-S), etc. Can also be used in the present invention.
  • the type of MPC polymer used in the present invention is not particularly limited, but for example, a copolymer of MPC and a methacrylic acid ester such as butyl methacrylate, particularly a block copolymer can be preferably used.
  • the production method of this copolymer is described in detail in Japanese Patent No. 2890316, and those skilled in the art can easily produce a desired copolymer by referring to this patent publication. The entire disclosure of this patent publication is incorporated herein by reference.
  • MPC copolymers can be preferably used.
  • a copolymer of MPC and butyl methacrylate (BMA) for example, a copolymer having a molar ratio of MPC and BMA of 5: 5 (PMB50) or a copolymer having a molar ratio of MPC and BMA of 3: 7 (PMB30) is known.
  • PMB50 a copolymer having a molar ratio of MPC and BMA of 5: 5
  • PMB30 copolymer having a molar ratio of MPC and BMA of 3: 7
  • PMB50 can be particularly preferably used.
  • the degree of polymerization and molecular weight of the MPC polymer are not particularly limited. For example, from the viewpoint of maintaining water solubility, a polymer having an average molecular weight (weight average molecular weight) of about 5,000 to 300,000, preferably about 10,000 to 100,000 can be used.
  • the method of modifying the lipid membrane structure with the MPC polymer is not particularly limited.
  • the MPC polymer may be added to an aqueous dispersion of a lipid membrane structure such as a liposome and allowed to stand at room temperature for several minutes to several hours.
  • the amount of the MPC polymer added to the aqueous dispersion is not particularly limited, but depending on the amount of the MPC polymer to be modified, for example, in the range of 0.01 to 1% by mass with respect to the total lipid amount of the lipid membrane structure, preferably May be added in an amount of about 0.1 to 10% by mass, more preferably about 0.1 to 3% by mass.
  • the MPC polymer is rapidly incorporated into the lipid component of the lipid membrane structure, and a lipid membrane structure whose surface is modified with the MPC polymer can be prepared.
  • the amount of surface modification by the MPC polymer is not particularly limited, but is, for example, in the range of about 0.1 to 5% by mass with respect to the total lipid amount of the lipid membrane structure.
  • the lipid membrane structure of the present invention comprises a sterol or a membrane stabilizer such as glycerin or a fatty acid ester thereof, an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene, a charged substance, and a membrane.
  • an antioxidant such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, or butylated hydroxytoluene
  • a charged substance and a membrane.
  • One or two or more substances selected from the group consisting of polypeptides and the like may be included.
  • the charged substance imparting positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammoniumpropane; or cationic polymers.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • Examples of the membrane polypeptide include a membrane superficial polypeptide or an integral membrane polypeptide. The compounding amount of these substances is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be provided with any one function or two or more functions such as a temperature change sensitivity function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitivity function.
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoyl phosphatidylcholine and the like.
  • Examples of the pH-sensitive lipid derivative that can impart a pH-sensitive function include dioleoylphosphatidylethanolamine.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be modified with a substance such as an antibody capable of specifically binding to a cell surface receptor or antigen, thereby improving the substance delivery efficiency into the cell nucleus. can do.
  • a substance such as an antibody capable of specifically binding to a cell surface receptor or antigen
  • a lipid derivative capable of reacting with a mercapto group in a monoclonal antibody or a fragment thereof such as poly (ethylene glycol) ) - ⁇ -distearoylphosphatidylethanolamine- ⁇ -maleimide, ⁇ - [N- (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoryl-ethyl) carbamyl) - ⁇ - ⁇ 3- [2- ( By including a lipid derivative having a maleimide structure such as 2,5-dihydro-2,5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) ethanecarboxamido] propyl ⁇ -poly (oxy-1,2-ethanedyl)
  • the monoclonal antibody can be bound to the membrane surface of the lipid membrane structure.
  • the surface of the lipid membrane structure of the present invention may be modified with a polypeptide containing a plurality of continuous arginine residues (hereinafter referred to as “polyarginine”).
  • the polyarginine is preferably a polypeptide containing 4 to 20 consecutive arginine residues, more preferably a polypeptide consisting of only 4 to 20 consecutive arginine residues, particularly preferably octaarginine. Can do.
  • Modification of the lipid membrane structure surface with polyarginine can be easily performed by using, for example, a lipid-modified polyarginine such as stearylated octaarginine as a constituent lipid of the lipid membrane structure according to the method described in the above publication. Can be done.
  • a lipid-modified polyarginine such as stearylated octaarginine as a constituent lipid of the lipid membrane structure according to the method described in the above publication. Can be done.
  • the surface of the lipid membrane structure of the present invention may be modified with INF7.
  • INF7 is a glutamic acid-rich peptide obtained by modifying a peptide (1-23) derived from influenza HA polypeptide (HA2) .When mixed with liposomes, the lipid structure collapses and the encapsulated substance is easily released. (Biochemistry, 46, pp.13490-13504, 2007) and a delivery system in which INF7 is conjugated to polyethylene glycol tetraacrylate (PEG-TA) has also been proposed (The Journal Gene Medicine, 10, pp .1134-1149, 2008). Those skilled in the art can easily use INF7 in the present invention by referring to these publications.
  • the term “INF7” includes one or several amino acids in the amino acid sequence of the above peptide in addition to the peptides specified by the sequences described in Table 1 of Biochemistry, 46, pp.13490-13504, 2007.
  • a modified peptide consisting of an amino acid sequence in which is deleted, substituted and / or added and having substantially the same properties as INF7 is also included.
  • the term “INF7” herein should not be construed as limiting in any way. The disclosures of the above publications and the disclosures of all documents cited in this publication are incorporated herein by reference.
  • the method of modifying the lipid membrane structure with INF7 is not particularly limited, but in general, by constructing a lipid membrane structure using lipid-modified INF7 in which a lipid compound and INF7 are covalently bound as a lipid membrane-constituting lipid, A lipid membrane structure surface-modified with INF7 can be easily produced.
  • lipid-modified INF for example, stearylated INF7 can be used, and this compound is described in Futaki, S. et al., Biocongug. Chem., 12 (6), pp.1005-1011, 2001. It can be easily manufactured according to the method.
  • the amount of surface modification by INF7 is not particularly limited, but is generally in the range of 1 to 5 mol% with respect to the total lipid content of the lipid membrane structure, preferably about 3 to 5 mol% with respect to the total lipid content. It is.
  • MEND Envelope-type nanostructures with multi-functionality
  • MEND has a structure in which a core is a complex of a nucleic acid such as plasmid DNA and a cationic polymer such as protamine, and the core is enclosed in a lipid envelope membrane in the form of a liposome.
  • MEND lipid envelope membranes can be equipped with peptides to adjust pH responsiveness and membrane permeability as needed, and the outer surface of lipid envelope membranes can be modified with alkylene glycols such as polyethylene glycol. it can.
  • MEND Inside the lipid envelope of MEND, condensed DNA and cationic polymer are encapsulated, and designed to achieve efficient gene expression.
  • MEND that can be suitably used in the present invention, a MEND in which a complex of plasmid DNA incorporating a desired gene and protamine is encapsulated inside and the outer surface of the lipid envelope is modified with oligosaccharide-conjugated PEG is preferable.
  • the modification with oligosaccharide-linked PEG preferably uses stearyl polyethylene glycol to which the above-mentioned polypeptide (a) and / or polypeptide (b) is bound as a constituent lipid component.
  • reviews such as DrugDDelivery System, 22-2, pp.115-122, 2007 can be referred to.
  • the disclosures of the above publications and the disclosures of all documents cited in this review are hereby incorporated by reference.
  • the form of the lipid membrane structure is not particularly limited, and examples thereof include a form dispersed in an aqueous solvent (for example, water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, etc.) and a form obtained by lyophilizing this aqueous dispersion. It is done.
  • an aqueous solvent for example, water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, etc.
  • the method for producing the lipid membrane structure is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be employed.
  • all the lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and after forming a lipid film by drying under reduced pressure with an evaporator or spray drying with a spray dryer, the above mixture is dried with an aqueous solvent.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier.
  • it can manufacture also by the method well-known as a method of manufacturing a liposome, for example, a reverse phase evaporation method etc.
  • extrusion may be performed under high pressure using a membrane filter having a uniform pore size.
  • the size of the lipid membrane structure in the dispersed state is not particularly limited.
  • the particle diameter is about 50 to 5 ⁇ m, preferably about 50 to 400 nm, and about 50 to 300 nm. Is preferable, and about 150 to 250 nm is more preferable.
  • the particle diameter can be measured, for example, by the DLS (dynamic light scattering) method.
  • the composition of the aqueous solvent is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like. Can do.
  • a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like.
  • aqueous solvents can stably disperse lipid membrane structures, but also glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose.
  • Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol (aqueous solutions), glycerin, diglycerin, poly Glycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol -Alkyl ether, 1,3-polyhydric alcohol (aqueous solution), such as butylene glycol and the like may be added.
  • aqueous solution such as butylene glycol and the like
  • the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent In order to stably store the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is desirable to eliminate the electrolyte in the aqueous solvent as much as possible from the viewpoint of physical stability such as aggregation suppression. From the viewpoint of chemical stability of the lipid, it is desirable to set the pH of the aqueous solvent from weakly acidic to neutral (about pH 3.0 to 8.0) and / or to remove dissolved oxygen by nitrogen bubbling or the like. .
  • aqueous dispersion of the obtained lipid membrane structure is freeze-dried or spray-dried, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharide, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose Stability can be improved by using disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol (aqueous solutions) There is a case.
  • disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose
  • polysaccharides such as cyclodextrin
  • sugars such as erythritol, xylitol,
  • a polyhydric alcohol aqueous solution
  • aqueous solution such as diethylene glycol monoalkyl ether or 1,3-butylene glycol
  • a substance to be delivered into the nucleus of a cell of a target tissue or organ can be encapsulated.
  • the type of substance to be encapsulated is not particularly limited, but in addition to any active pharmaceutical ingredients such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antiviral agents, sugars, peptides, nucleic acids, low molecular weight compounds, metals Any substance such as a compound can be encapsulated.
  • the nucleic acid include a nucleic acid containing a gene, and more specifically, for example, a gene incorporated in a plasmid, but are not limited to this specific embodiment. Needless to say, any gene can be used as the gene.
  • the case where a nucleic acid is encapsulated will be specifically described below, but the scope of the present invention is not limited to this specific embodiment.
  • a nucleic acid can be preferably encapsulated.
  • the nucleic acid includes DNA or RNA, and analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.
  • the nucleic acid may contain a gene.
  • the gene may be any of oligonucleotide, DNA, or RNA.
  • a gene for introduction in vitro such as transformation
  • nucleic acids examples include genes encoding physiologically active substances such as antisense oligonucleotides, antisense DNAs, antisense RNAs, enzymes and cytokines, as well as nucleic acids having a function of regulating gene expression, such as siRNAs. Functional nucleic acids including RNA and the like can also be used, and these are also included in the term nucleic acid in the present specification.
  • nucleic acid should be interpreted in the broadest sense, and should not be interpreted in a limited way in any sense.
  • the gene DNA to be expressed can be bound to the vector DNA and encapsulated in the lipid membrane structure, but in order to achieve higher gene expression efficiency, the vector It is preferred that the DNA does not contain a CpG sequence, and in addition it may be more preferred that the gene DNA to be expressed does not contain a CpG sequence. It is preferable that an enhancer and / or a promoter is bound to the vector.
  • a compound having a nucleic acid introduction function can also be added.
  • examples of such compounds include O, O′-N-didodecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O′-N-ditetradecanoyl-N- ( ⁇ -trimethyl).
  • Ammonioacetyl) -diethanolamine chloride O, O'-N-dihexadecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O'-N-dioctadecenoyl-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O ', O' '-tridecanoyl-N- ( ⁇ -trimethylammoniodecanoyl) aminomethane bromide and N- [ ⁇ -trimethylammonioacetyl] -didodecyl- D-glutamate, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl) -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate, 1 , 2-Dimy
  • a lipid membrane structure encapsulating a nucleic acid can be used as a carrier for delivering the nucleic acid into the nucleus of a cell of a target tissue or organ.
  • a nucleic acid containing a desired gene as the nucleic acid and use the above MEND.
  • MEND a nucleic acid containing a desired gene
  • by administering a lipid membrane structure encapsulating a nucleic acid containing a gene, preferably MEND, to mammals including humans the desired gene is delivered into the nucleus of the cells of the target tissue or organ and efficiently expressed.
  • the administration method is not particularly limited, but parenteral administration is preferable, and intravenous administration is more preferable.
  • a medicine in the form of a pharmaceutical composition can be prepared and administered together with an appropriate formulation additive.
  • nucleic acid When a nucleic acid is transferred into the nucleus of an immune cell, preferably a dendritic cell, using the lipid membrane structure of the present invention, a substance such as a nucleic acid encapsulated in the nucleus is efficiently released and encoded by the nucleic acid. Polypeptides can be expressed.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide is introduced into the nucleus of a dendritic cell using the lipid membrane structure of the present invention, the polypeptide transcribed and translated from the nucleic acid is presented on the surface of the dendritic cell, Can acquire immunity to the polypeptide, so that effective immunotherapy can be performed against the desired polypeptide.
  • This aspect is a particularly preferable aspect in the present invention.
  • the lipid membrane structure provided by the present invention itself can exert an adjuvant action on dendritic cells and can promote the production of various cytokines. Therefore, immunotherapy can be performed very efficiently by using the lipid membrane structure of the present invention.
  • immunotherapy can be performed very efficiently by using the lipid membrane structure of the present invention.
  • Example 1 (a) Preparation of encapsulated nucleic acid (condensate with protamine) A plasmid encoding luciferase (pDNA, manufactured by BD Biosciences Clontech) was dissolved in 10 mM HEPES buffer to a concentration of 0.1 mg / mL. A pDNA solution was added dropwise to 150 ⁇ L of a 0.1 mg / mL (10 mM HEPES buffer) Protamine (Protamine) solution while stirring little by little to prepare a compact body of protamine and pDNA (N / P ratio is 2.2).
  • pDNA plasmid encoding luciferase
  • lipid membrane To obtain a lipid membrane. To this lipid membrane, the compacted body (a) was added so that the total lipid concentration was 0.55 mM, left standing at room temperature for 10 minutes for hydration, and then sonicated for 1 minute with a sonicator. Stearylated octaarginine (STR-R8) (2 mg / mL aqueous solution) synthesized by the method described in JP-A-2003-343857 was added in an amount of 5 mol% of the total lipid, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • STR-8 Stearylated octaarginine
  • the solution was dissolved in a buffer (converted to 1 mM amine concentration), and 100 ⁇ L of the pDNA solution was added dropwise to 150 ⁇ L of the resulting solution while stirring in small amounts to prepare a polyrotaxane / pDNA compact (N / P ratio is 5.0).
  • the compact (c) was added to this lipid membrane so that the total lipid concentration was 0.55 mM, left to stand for 10 min at room temperature to be hydrated, and then sonicated with a sonicator for 1 minute.
  • a stearylated octaarginine (STR-R8) 2 mg / mL aqueous solution synthesized by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-343857 was added to 10 mol% of the total lipid, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. It was harmonized.
  • the collected cell lysate was centrifuged (4 ° C., 15,000 rpm, 5 minutes) and centrifuged, and 45 ⁇ L of the supernatant was recovered. Luciferase activity measurement (RLU / mL) was measured using the obtained supernatant. Furthermore, protein quantification (mg / mL) was performed by the BCA method, luciferase activity per unit polypeptide amount (RLU / mg protein) was calculated, and luciferase expression levels were compared. The results are shown in FIG.
  • CL cardiolipin
  • T-MEND four-membrane MEND
  • 2 mg / mL STR-R8 was further added to SUV2 Cationic T-MEND having KALA and R8 in both inner and outer membranes was prepared by adding 10 mol% of the total lipid amount and incubating at room temperature for about 30 minutes.
  • Example 3 (a) Evaluation of antigen presentation amount Plasmid DNA encoding egg white antigen (Ovalbumin), an antigen, was introduced into dendritic cells using various vectors, and the dendritic cells were collected 24 hours after transfection, in later washing 96 well plate 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L of dendritic cells and 2 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ L of B3Z the (MHC-I) cells were seeded and cultured for 16 hours both. After washing the cells with PBS, CPRG buffer (5 mM CPRG (Roche Diagnotics), 0.125% NP-40 (Igepal CA-630, SIGMA), 9 mM MgCl 2 ) 100 ⁇ L) was added and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, the absorbance at 595 nm was measured using a Benchmark Plus microplate spectrophotometer (Bio-Rad). The absorbance of only untreated dendritic cells was normalized as 1. The results are shown in Figure 3.
  • the lipid membrane structure of the present invention can introduce a gene into the nucleus of a dendritic cell very efficiently, and can present an antigen protein expressed from the introduced gene on the surface of the dendritic cell. Indicated.
  • Example 4 Gene expression analysis of immune-related genes using microarray analysis
  • a pDNA solution and a Protamine solution were each diluted to 0.1 mg / mL with 10 mM HEPES buffer.
  • STR-R8 After adding the compaction body solution to the lipid membrane so that the total lipid concentration is 0.55 mM, STR-R8 alone is 5 mol% of the total lipid amount in R8-MEND, STR-KALA in R8 / KALA-MEND, STR-R8 was added to 5 mol% of the total lipid, left to stand for 10 min at room temperature to hydrate, and then sonicated with a sonicator for 1 min.
  • RNA preparation Two days before transfection, JAWS-II cells were seeded on a 6-well plate at 4 ⁇ 10 5 cells / well. After washing the cells with PBS (-) 500 ⁇ L, add MEND solution diluted to 2 ⁇ g / mL (equivalent to plasmid DNA concentration) with ⁇ MEM (no serum, no antibiotics) to 1 mL cells, and add 5% at 37 ° C. It was left in a CO 2 incubator. 1, 3, and 6 hours after transfection, the cells were washed with 500 ⁇ L of PBS ( ⁇ ), and TRIzol Reagent (Invitrogen) was added to make a total of 1 mL for each sample.
  • PBS PBS
  • TRIzol Reagent Invitrogen
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • RNA labeling Labeled RNA for DNA microarray experiments was prepared using the Quick Amp Labeling Kit, one-color (Agilent) according to the attached protocol. CDNA was synthesized from 500 ng of total RNA by reverse transcription. Next, cRNA labeled with cyanine3 (Cy3) -CTP was prepared from the cDNA by in vitro transcription reaction. In order to remove unreacted Cy3, the labeled cRNA was purified using RNeasy Mini Kit. About the obtained Cy3 labeled cRNA solution, the concentration and the amount of Cy3 uptake were calculated using Nano Drop, and the quality was confirmed.
  • Cy3 cyanine3
  • the efficiency of Cy3 incorporation (pmol / ⁇ g) of the purified labeled cRNA probe was calculated from the cRNA concentration (ng / ⁇ L) and the amount of Cy3 incorporation (pmol / ⁇ L).
  • the calculation method is shown below.
  • the cRNA concentration (ng / ⁇ L) was calculated by the following formula.
  • cRNA concentration (ng / ⁇ L) OD 260 ⁇ 10 * ⁇ 40 ( ⁇ g / mL) * The optical path length of NanoDrop is 1 mm.
  • the amount of Cy3 incorporation (pmol / ⁇ L) was calculated using the following formula.
  • Cy3 uptake (pmol / ⁇ L) (OD 550 ⁇ 10 * ⁇ 1000) / (150 mM -1 cm -1 ) * The optical path length of NanoDrop is 1 mm.
  • DNA microarray Hybridization of labeled cRNA to mouse oligo DNA microarray (4x44K) was performed using Gene Expression Hybridization Kit according to the attached protocol. Labeled cRNA was randomly cleaved and fragmented, and a hybridization solution was prepared using 1.65 ⁇ g of RNA. Samples were applied to microarray slides, hybridized at 65 ° C. for 17 hours, and then washed with Expression Wash Buffer containing 10% Triton X-102.
  • the microarray slide was scanned using an Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). A 532 nm laser was used to measure Cy3. The created TIFF image was read with Feature Extraction Software, and each spot information (gene profile) was saved in text file format. The acquired expression profile was imported into GeneSpringGX11 and analyzed.
  • Example 5 CTL activity of protein-encapsulated KALA-modified liposomes (1) Preparation of antigen-encapsulated R8-modified liposome and KALA-modified liposome A lipid thin film consisting of EPC / Chol / CHEMS (molar ratio 70:20:10) was prepared in a glass test tube, and OVA (5 mg / mL, 10 mM HB ) was added to a lipid concentration of 10 mM and hydrated at room temperature for 15 minutes. After hydration, the mixture was vortexed, transferred to a 15 mL conical tube, and freeze-thawed 5 times.
  • EPC / Chol / CHEMS molar ratio 70:20:10
  • the particle size of R8-Lip was 189.5 nm, PDI was 0.095, and the ⁇ potential was 47.8 mV.
  • the particle size of KALA-Lip was 188.4 nm, PDI was 0.317, and the ⁇ potential was 33.7 mV.
  • mice Female, 7-9 weeks old were subcutaneously administered with R8-Lip or KALA-Lip containing 50 ⁇ g of OVA (26G needle) .
  • target cells prepared by the following method were administered. The spleen was removed from naive mice that had undergone cervical dislocation, cells were loosened in a petri dish containing 3-5 mL of RPMI1640 medium, collected using a 2.5 mL syringe, and transferred to a 50 mL conical tube through a nylon mesh.
  • the supernatant was removed, suspended in 1 mL of ACK Lysing buffer (Lonza, Walkersville, MD), and incubated at room temperature for 5 minutes for hemolysis. After adding 9 mL of RPMI1640 medium, the mixture was centrifuged, further washed with 10 mL of medium, suspended in 20 mL, and transferred to two 50 mL conical tubes through nylon mesh. The cells were counted and centrifuged, and resuspended in the medium (10 7 cells / mL).
  • OVA 257-264 peptide (1 mM, final concentration 5 ⁇ M) was added to one of the two, and the cell suspension was incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 60 minutes. After washing with 10 mL of medium and 10 mL of PBS, 5 ⁇ M CFSE (Molecular probe) (CFSE High ) is used for cells that are pulsed with OVA 257-264 peptide, and 0.5 ⁇ M CFSE (CFES Low ) is used for cells that are not pulsed. The suspension was suspended in PBS containing 3 ⁇ 10 7 cells / mL and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the spleen was removed, the spleen was hemolyzed by the above method, washed with 10 mL of RPMI1640 medium and 10 mL of PBS, and suspended in 5 mL of FACS buffer.
  • the prepared cell suspension was transferred to a FACS tube through a nylon mesh, and the number of CFSE positive cells was measured with a flow cytometer. 7,500 cells were analyzed for cells stained at a low concentration (CFSE low ).
  • CTL activity was calculated by comparing the number of cells in CFSE High and CFSE Low . The error between experiments was corrected by the CFSE High / CFSE Low ratio in naive mice.
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis shows CTL activity, and shows the percentage of cells killed among cells targeted by CTL (a group of cells pulsed with OVA 257-264 peptide). Since the target cell (CFSE High ) presents an OVA peptide to MHC class I, the cell killing effect in this evaluation is due to OVA-specific CTL.
  • R8-Lip has been shown to be a carrier capable of inducing specific MHC class I presentation and anti-tumor activity in vivo (Nakamura, T. et al. Mol. Ther., 16, pp.1507- 1514, 2008). As shown by the above results, a dramatic improvement in CTL activity was observed by modifying KALA instead of R8 on the liposome surface. Both R8-Lip and KALA-Lip have no adjuvant, but the CTL activity of KALA-Lip is comparable to the CTL activity when R8-Lip is equipped with a CpG sequence-containing oligonucleotide known as an adjuvant. there were. This result supports the result of Example 4 that KALA has a high adjuvant function from the viewpoint of function.
  • Example 6 Enhancement of KALA-MEND gene expression activity by vector modification of the introduced plasmid
  • a Preparation of various plasmid DNAs
  • the following four types of plasmid DNAs (1) Plasmid DNA containing a CpG sequence in the backbone of the plasmid DNA and also having a CpG sequence from the start codon to the stop codon of the luciferase sequence that is a marker gene (PcDNA3.1-Luc (+); 425 total CpG sequences), (2) The plasmid DNA backbone and the luciferase sequence between the start codon and the stop codon do not contain CpG sequences (pCpGfree-Luc (0); CpG sequence total 0), (3) The plasmid DNA backbone contains CpG sequence, and the luciferase sequence start codon to stop codon do not contain CpG sequence (pcDNA3.1-Luc (0); (4) Total of 332 CpG sequences), and (4) The plasmid DNA backbone does
  • the expression vector pcDNA3.1 purchased from Invitrogen was used for the construction of the expression plasmid DNA containing the CpG sequence in the backbone (above (1) and (3)).
  • an expression vector pCpGfree-mcs purchased from Invivogen was used for the construction of an expression plasmid DNA ((2) and (4) above) consisting of a backbone not containing a CpG sequence.
  • plasmid DNA (1) a DNA fragment containing luciferase containing a CpG sequence was obtained by cleaving Promega's pGL3-basic vector restriction enzyme Hind III / Xba I. This fragment was introduced into the HindIII / XbaI site of pcDNA3.1 vector (pcDNA3.1-Luc (+)).
  • double-stranded DNA having a complementary end at the restriction enzyme cleavage site after treating the multicloning site of pCpGfree-mcs (BglII-KpnI-EcoO109I-NcoI-NheI) with BglII / NheI
  • BglII-PvuII-NcoI-XbaI-NheI was created (pCpGfree-NEWmcs) (FIG. 6).
  • the plasmid DNA prepared by this method has only one CpG sequence after the 12th position counted from the codon of the luciferase gene (FIG. 7).
  • the remaining CpG sequence is excised from pCpGfree-Luc (+1) by DraIII / NheI treatment to cut out the sequence part containing the stop codon and CpG sequence, has a terminal complementary to this restriction enzyme cleavage site, and is mutated to the CpG sequence part. It was removed by inserting the oligonucleotide added with. At this time, the EcoRI site existing immediately below the stop codon was replaced with the EcoRV site (pCpGfree-Luc (0)) (FIG. 8).
  • plasmid DNA (3) insert the CpG-free luciferase gene excised from BglII / EcoRV from pCpGfree-Luc (0) created in the construction of plasmid DNA (2) into the BamHI / RV site of pcDNA3.1. (PcDNA3.1-Luc (0)).
  • luciferase code obtained by PmeI / XbaI treatment from pcDNA3.1-Luc (+) prepared in the construction of plasmid DNA (1) against the PvuII / XbaI cleavage site of pCpGfree-NEWmcs It was created by inserting the gene (pCpGfree-Luc (+)).
  • ACK Lysing Buffer 1 mL was added, mixed, and allowed to stand at room temperature for 3 to 5 minutes. After adding 10 mL of the medium, the supernatant was removed by centrifugation, and further washed twice with 10 mL of the medium. Next, the cells were suspended in 10 mL of medium, added to a 10 cm cell culture dish (FALCON), and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours or more. Lightly pipetted to collect only floating cells in a 50 mL conical tube, centrifuged, removed the supernatant, suspended in 10 mL of medium and counted.
  • FALCON 10 cm cell culture dish
  • GM-CSF final concentration 10 ng / mL
  • seed 1 mL each in a 24-well plate (Corning, NY), 37 ° C, 5% Cultivation was performed for 2 days under CO 2 conditions. After 2 days and 4 days, cell clumps were left and floating cells were removed, and then 1 mL of fresh GM-CSF-containing RPMI1640 medium was added. Suspended and weakly adherent cells 6-8 days after the start of culture in the presence of GM-CSF were used as immature dendritic cells in the experiment. According to the evaluation using a CD11c antibody (PE anti-mouse CD11c, Clone: N418, BioLegend), the purity was 85 to 90%.
  • CD11c antibody PE anti-mouse CD11c, Clone: N418, BioLegend
  • STR-R8 Stearylated R8
  • the floating cell group was collected together with the medium, centrifuged (4 ° C., 500 g, 5 minutes), and collected by removing the supernatant. Add the Reporter Lysis Buffer (1x) to the cells remaining in each well and the previously collected floating cells and mix them together to make a total of 75 ⁇ L, and then pipet at -80 ° C. Frozen. After thawing the sample frozen at ⁇ 80 ° C., the cells were removed using a cell scraper and collected in an Eppendorf tube. The collected cell lysate was centrifuged at 15,000 rpm, 4 ° C. for 2 minutes, and 50 ⁇ L of the supernatant was recovered.
  • Luciferase activity measurement (RLU / mL) was measured using the obtained supernatant. Furthermore, protein quantification (mg / mL) by BCA method was performed, and luciferase activity (RLU / mg protein) per unit protein amount was calculated.
  • FIG. The left figure shows the gene expression activity of R8-MEND and KALA-MEND in BMDC when (1) pcDNA3.1-Luc (+) and (4) pCpGfree-Luc (0) prepared in (a) is used.
  • Both R8-MEND and KALA-MEND showed a high gene expression activity promoting effect when pCpGfree-Luc (0) was used.
  • the gene expression level (10 7) that enables antigen presentation based on the results of Examples 2 and 3 using JAWS II. RUL / mg protein level) was achieved.
  • Example 7 Cancer prevention vaccine effect (a) Preparation of CpG-free OVA expression plasmid DNA An antigen (OVA) gene sequence excluding all CpG sequences was designed (1161 bp DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), and custom synthesis was performed (TAKARA). This sequence was subcloned into the NcoI / NheI site among the multiple cloning sites of pCpGfree-NEWmcs (pCpGfree-OVA (0)).
  • OVA antigen gene sequence excluding all CpG sequences was designed (1161 bp DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), and custom synthesis was performed (TAKARA). This sequence was subcloned into the NcoI / NheI site among the multiple cloning sites of pCpGfree-NEWmcs (pCpGfree-OVA (0)).
  • RPMI 1640 (with serum and antibiotics) 500 ⁇ L was added to each well, and after 21 hours, cells were collected. The floating cells and the adherent cells peeled off by pipetting in PBS were collected and collected by centrifugation (4 ° C., 500 g, 5 minutes).
  • Tumor volume tumor volume (mm 3 ) was calculated by the formula of major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis ⁇ 0.52.
  • Example 8 Tumor growth inhibitory effect (a) Gene transfer of antigen (OVA) -expressing plasmid DNA into BMDC Dendritic cells isolated and differentiated by the method described in Example 6 (b) so that they become 4 ⁇ 10 5 cells / well in a 24-well plate Sowing.
  • KALA-MEND prepared using CpG-free OVA expression plasmid DNA (pCpGfree-OVA (0)) was prepared according to the method described in Example 6 (c). MEND was diluted with RPMI 1640 (no serum, no antibiotics) so that the amount of pDNA was 0.8 ⁇ g / well, and prepared to 500 ⁇ L.
  • a MEND solution was applied to each well and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. After 3 hours, 500 ⁇ L of RPMI 1640 (with serum and antibiotics) was added to each well, and the cells were collected after 21 hours. The floating cells and the adherent cells peeled off by pipetting in PBS were collected and collected by centrifugation (4 ° C., 500 g, 5 minutes).
  • KALA-MEND can provide an antitumor effect even if administered after the tumor has formed.
  • the lipid membrane structure provided by the present invention can efficiently migrate into the nucleus of any cell such as immune cells including dendritic cells, and efficiently transfer substances such as nucleic acids encapsulated in the nucleus. Since it can be released to express the polypeptide encoded by the nucleic acid, and it can also exert an efficient adjuvant effect, effective immunotherapy can be performed on the desired polypeptide. There is a feature.

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Abstract

　樹状細胞などの免疫細胞の核内に核酸を効率的に送達することができる脂質膜構造体であって、脂質膜が下記の(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び／又は(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進する活性を有するポリペプチドで修飾された細胞核内に物質を送達するための脂質膜構造体。

Description

核内移行性を有する脂質膜構造体
　本発明は核内移行性を有する脂質膜構造体に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞の核内、特に樹状細胞の核内に容易に移行することができるリポソームなどの脂質膜構造体に関するものである。
　薬剤を患部に特異的に輸送する手段として脂質膜構造体であるリポソームに薬剤を封入する方法が提案されている。特に、悪性腫瘍の治療分野において抗腫瘍剤を封入したリポソームの有効性が数多く報告されている。また、遺伝子発現に利用可能な脂質膜構造体として多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND: Multifunctional envelope-type nano device；以下、本明細書において「MEND」と略す場合がある。例えばDrug Delivery System, 22-2, pp.115-122, 2007などを参照のこと)が提案されている。この構造体は、遺伝子などを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、腫瘍の遺伝子治療などに有用であることが知られている。
　脂質膜構造体を用いて薬物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖などの目的物質を標的臓器や腫瘍組織など特異的な部位に送達するための手段として、脂質膜構造体の表面を機能性分子で修飾する方法が多数提案されている。抗腫瘍剤などの薬剤を内包した脂質膜構造体は標的細胞に到達するとエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれエンドソーム内に包含された状態となるが、その後、リソソームの酵素による加水分解作用などを受けて内包されていた薬剤を細胞質内に放出する。エンドソーム内に取り込まれたリポソームからの薬剤放出性を高めるために、リポソームの表面をペプチド(GALA: Biochemistry, 26, pp.2964-2972, 1987)で修飾したリポソーム（Biochemistry, 43, pp.5618-5623, 2004）やMEND(特開2006-28030号公報)が提案されている。
　また、核酸などの目的物質を内包した脂質膜構造体を標的細胞の核内に移行させるための手段としては、例えば、リポソームの外側表面をオクタアルギニンで修飾したリポソーム(国際公開WO2005/32593; Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004)、核移行性ペプチドで修飾された脂質膜を有する2枚膜リポソーム(国際公開WO2006/101201)、ガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム(国際公開WO2007/102481)が提案されている。単糖で修飾された多重脂質膜構造体(T-MEND)は脂質膜及び核膜と融合性を示し、in vitroでの試験結果において遺伝子発現効率を改善できたとされている。
　一方、免疫細胞、特に抗原提示作用を有する樹状細胞の核内に抗原性タンパク質をコードする核酸を導入することできれば、樹状細胞内で核酸から転写翻訳されたタンパク質を樹状細胞表面に抗原提示させることができ、生体は当該タンパク質に対する免疫を獲得することができる。このような観点から、樹状細胞などの免疫細胞の核内に核酸を効率的に送達する技術が求められている。
　しかしながら、上記のMENDなどの脂質膜構造体を用いて樹状細胞の核内に核酸を導入する場合の核酸導入効率は、その他の細胞、例えば腫瘍細胞や肝実質細胞の場合と比較して十分ではない。導入された核酸が最終的に核内で発現するまでには、細胞内への取り込み、エンドソーム脱出、核内移行、及び核内転写などのさまざまな細胞内動態プロセスを経る必要があるが、樹状細胞などの非分裂細胞においては2枚膜からなる核膜が常にインタクトに存在しており、この核膜が脂質膜構造体の核内移行能を妨げているものと推察される。従って、脂質膜構造体を用いて樹状細胞の核に核酸を送達するためには、上記の各プロセス、特に2枚膜からなる核膜によるバリヤーを如何に突破するかが、きわめて重要な課題となる。
　なお、KALAペプチドと称される27アミノ酸残基のポリペプチドが知られており、自身のカチオン電荷を利用してプラスミドDNAとコンプレックスを形成することができることが報告されているが(Biochemistry, 36, pp.3008-3017, 1997)、上記刊行物にはこのペプチドが脂質膜構造体の核内移行を促進するか否かについての示唆はない。
国際公開WO2005/32593 国際公開WO2006/101201 国際公開WO2007/102481 特開2006-28030号公報
Drug Delivery System, 22-2, pp.115-122, 2007 Biochemistry, 26, pp.2964-2972, 1987 Biochemistry, 43, pp.5618-5623, 2004 Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004 Biochemistry, 36, pp.3008-3017, 1997
　本発明の課題は、免疫細胞、特に抗原提示能を有する樹状細胞の核内に核酸を効率的に送達するための手段を提供することにある。より具体的には、樹状細胞などの免疫細胞の核内に核酸を効率的に送達することができる脂質膜構造体を提供することが本発明の課題である。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく、核内移行能を高めることのできる機能性ポリペプチドであるオクタアルギニンポリペプチドで修飾されたMEND(国際公開WO2005/32593)や、エンドソーム脱出能を付与する機能性ポリペプチドであるGALAペプチドで修飾されたMEND(特開2006-28030号公報)に核酸を封入して樹状細胞への導入を試みたが、その核酸からのポリペプチド発現はほとんど認められなかった。また、エンドソームと融合性を示す脂質膜及び核膜と融合性を示す脂質膜を有する多重脂質膜構造体(T-MEND)に核酸を封入して樹状細胞への核酸導入を試みたが、核内において導入核酸からのポリペプチド発現促進がわずかに認められるものの、樹状細胞表面への該ポリペプチドの提示は観察されなかった。
　本発明者らはさらに研究を重ねた結果、核酸を封入したMENDなどの脂質膜構造体の脂質膜をKALAペプチドで修飾すると、樹状細胞などの免疫細胞の核内への核酸導入効率が顕著に高まることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明により、細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造体であって、脂質膜が下記の(a)及び／又は(b)のポリペプチド：
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進する活性を有するポリペプチド
で修飾された脂質膜構造体が提供される。
　上記脂質膜構造体の好ましい態様によれば、脂質膜構造体がリポソームである上記の脂質膜構造体；細胞が免疫細胞、好ましくは樹状細胞である上記の脂質膜構造体；上記(a)及び／又は(b)のポリペプチドが疎水性基、好ましくはステアリル基若しくはコレステリル基などで修飾されており、前記疎水性基が脂質膜に挿入された上記の脂質膜構造体；連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチド、好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチド、さらに好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基のみからなるポリペプチド、特に好ましくはオクタアルギニンを表面に有する上記の脂質膜構造体；ポリアルキレングリコール又はリン脂質が縮合したポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール(PEG)を表面に有する上記の脂質膜構造体；脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合が0～40％(モル比)である上記の脂質膜構造体が提供される。
　また、別の観点からは、送達すべき物質が内部に封入された上記のいずれかの脂質膜構造体が提供される。この発明の好ましい態様によれば、送達すべき物質が核酸、例えば遺伝子を含む核酸やsiRNAなどの機能性核酸である上記のいずれかの脂質膜構造体；送達すべき物質がDNAである上記の脂質膜構造体；該DNAがCpGを含まないベクターDNAと結合したDNAである上記の脂質膜構造体；該DNAがCpGを含まず、かつ該DNAがCpGを含まないベクターDNAと結合したDNAである上記の脂質膜構造体；送達すべき物質が免疫細胞表面、好ましくは樹状細胞表面に提示すべき抗原ポリペプチドをコードする核酸である上記の脂質膜構造体；脂質膜構造体が多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)である上記のいずれかの脂質膜構造体；内部に核酸及びカチオン性ポリマー、好ましくはプロタミンが封入された上記のいずれかの脂質膜構造体が提供される。
　また、免疫細胞表面、好ましくは樹状細胞表面に提示すべき抗原ポリペプチドをコードする核酸を該細胞の核内に導入するために用いる上記の脂質膜構造体；上記抗原ポリペプチドに対する免疫療法に用いるための上記の脂質膜構造体；上記抗原ポリペプチドががん細胞に特異的は表面ポリペプチドである上記の脂質膜構造体が提供される。この脂質膜構造体を有効成分として含む医薬組成物、好ましくは送達すべき物質として核酸を含む医薬組成物も本発明により提供される。
　さらに別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において細胞の核内、好ましくは免疫細胞の核内、さらに好ましくは樹状細胞の核内に核酸を送達する方法であって、核酸を内部に封入した上記の脂質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物の生体内において免疫細胞、好ましくは樹状細胞の表面に抗原ポリペプチドを提示させる方法であって、該抗原ポリペプチドをコードする核酸を内部に封入した上記の脂質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法が提供される。
　また、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において免疫細胞、好ましくは樹状細胞の表面に抗原ポリペプチドを提示させて該抗原ポリペプチドに対する免疫を獲得させる方法であって、該抗原ポリペプチドをコードする核酸を内部に封入した上記の脂質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法；及びヒトを含む哺乳類動物の生体内において免疫細胞、好ましくは樹状細胞の表面にがん細胞特異的な表面ポリペプチドを提示させて該ポリペプチドに対する免疫を獲得させる悪性腫瘍の免疫療法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を内部に封入した上記の脂質膜構造体を該動物に投与する工程を含む方法が提供される。
　さらに、本発明により、細胞の核内、好ましくは免疫細胞の核内、さらに好ましくは樹状細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進するために用いるポリペプチドであって、下記の(a)及び／又は(b)のポリペプチド：
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
が提供される。
　本発明により提供される脂質膜構造体は樹状細胞を含む免疫細胞などの任意の細胞の核内に効率的に移行することができ、核内において封入された核酸などの物質を効率的に放出して該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。本発明の脂質膜構造体を用いて樹状細胞の核内にポリペプチドをコードする核酸を導入する場合には、該核酸から転写翻訳されたポリペプチドが樹状細胞の表面に提示され、生体は当該ポリペプチドに対する免疫を獲得することができるので、所望のポリペプチドに対して有効な免疫療法を行うことができるようになる。
　また、本発明により提供される脂質膜構造体はそれ自体が樹状細胞に対してアジュバント作用を発揮することができ、種々のサイトカイン産生を促進することができるという特徴もあり、本発明により提供される脂質膜構造体で形質転換した樹状細胞を投与することにより、アジュバントの有無にかかわらず腫瘍の増悪や増殖を顕著に抑制することができ、抗原タンパク質を封入して投与することによりイン・ビボで細胞障害活性を増強することができる。さらに、封入するDNAにおいてベクター部分からCpG配列を除去し、さらに必要に応じて、発現させるべきタンパク質をコードするDNAからもCpG配列を除去することにより遺伝子発現効率が顕著に向上するという特徴もある。
ポリペプチド(a)(KALA)により脂質膜が修飾されたMENDの遺伝子発現効率を示した図である。 ポリペプチド(a)(KALA)により脂質膜が修飾された4枚膜のカチオン性T-MEND及びアニオン性T-MENDの遺伝子発現効率を示した図である。 本発明の脂質膜構造体を用いて樹状細胞の核内に抗原分子をコードする遺伝子を導入し、発現した抗原分子を樹状細胞表面に提示させた結果を示した図である。 MEND表面に修飾したKALAが樹状細胞に対してアジュバント効果を有することを示した図である。 タンパク封入KALA修飾リポソームのCTL活性を示した図である。 例6におけるプラスミドDNA(2)の構築方法の第1工程として、新たなマルチプルクロニングサイトを有するCpGfreeプラスミドDNAを構築する工程を示した図である。 例6におけるプラスミドDNA(2)の構築方法の第2工程として、CpGfree-NEWmcsへのルシフェラーゼ遺伝子の組み込み工程を示した図である。 例6におけるプラスミドDNA(2)の構築方法の第3工程として、一つ残ったCpG配列を除去する工程を示した図である。 導入プラスミドのベクター改変によるKALA－MENDの遺伝子発現活性の増強効果を示した図である。 KALAで表面修飾したMENDがアジュバントの有無に関わらず高い抗腫瘍活性を有することを示した図である。 腫瘍が形成された後にKALAで表面修飾したMENDを投与した場合の抗腫瘍効果を示した図である。
　本発明の脂質膜構造体を構成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸などが挙げられる。
　リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸などを挙げることができ、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数12～20の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
　糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）などが挙げられる。
　ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）などが挙げられる。
　飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数12～20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
　脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション、W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の好ましい形態としてリポソームを挙げることができる。以下、本発明の脂質膜構造体の好ましい態様としてリポソームについて説明する場合があるが、本発明の脂質膜構造体はリポソームに限定されることはない。
　本発明の脂質膜構造体は、細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造体であって、脂質膜が下記の(a)及び／又は(b)のポリペプチド：(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進する活性を有するポリペプチドで修飾されていることを特徴としている。
　配列番号1で表される上記のポリペプチド(a)は、30個のアミノ酸残基からなる公知のポリペプチド（WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA）よりC末端より3アミノ酸分を除去した27個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである(以下、本明細書においてこのポリペプチドを「KALAペプチド」と呼ぶ場合がある: Biochemistry, 36, pp.3008-3017, 1997)。上記刊行物にはこのペプチドが自身のカチオン電荷を利用してプラスミドDNAとコンプレックスを形成することができることが記載されているが、脂質膜構造体の核内移行を促進するか否かについての示唆はない。また、公知のKALAペプチドは、GALAペプチドと称される30個のアミノ酸残基からなる機能性ポリペプチド(Bioor. Med. Chem., 5, pp.1883-1891, 1997)において複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列を有している(例えば複数のグルタミン残基がリジン残基により置換されている)。しかしながら、GALAペプチドはpH応答して脂質膜の融合を促進する機能を有し、脂質膜構造体のエンドソームからの脱出能を高めることができる機能を有するポリペプチドであり、本発明において利用されるKALAペプチドの機能(脂質膜構造体の細胞における核内移行性を向上させる機能)とは相違する。
　本発明においてはポリペプチド(b)：配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド(以下、「改変ポリペプチド」と呼ぶ)であって、細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進する活性を有するポリペプチドを用いてもよい。脂質膜構造体の核内への移行を促進する活性としては、例えば、樹状細胞における核内移行能を促進する活性を評価することができる。例えば、標的細胞として樹状細胞を用い、その核内において発現可能な状態にある核酸、例えば樹状細胞の核内で作動可能なプロモーターの下流に連結されたポリペプチドをコードする核酸を内部に保持した脂質膜構造体において、その脂質膜を改変ポリペプチドで修飾した脂質膜構造体(以下、「修飾脂質膜構造体」と呼ぶ)及び改変ポリペプチドで修飾していない脂質膜構造体(以下、「非修飾脂質膜構造体」と呼ぶ)を調製し、修飾脂質膜構造体を導入した細胞におけるマーカーポリペプチドの発現量が非修飾脂質膜構造体を導入した細胞におけるポリペプチドの発現量を増加するか否かを評価すればよい。発現量の増加が認められる場合には、その改変ポリペプチドを上記ポリペプチド(b)として使用することができる。上記ポリペプチド(b)の1種又は2種以上をポリペプチド(a)と組み合わせて使用することも可能である。
　上記ポリペプチド(a)及びポリペプチド(b)は当業者に利用可能な各種の遺伝子組み換え技術によって宿主細胞を用いて生物学的に調製することができる。また、上記ポリペプチドを当業者に利用可能な固相合成法などのペプチド合成反応を利用した有機化学的方法で製造してもよい。あるいはペプチドシンセサイザーを用いて自動合成してもよい。
　上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)を脂質膜構造体の脂質膜に固定する手段は特に限定されないが、例えば、ステアリル基又はコレステリル基などの疎水性基で上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)を修飾し、該疎水性基が脂質膜構造体の脂質膜に埋没するように脂質膜構造体を調製することにより、容易に脂質膜修飾を行うことができる。疎水性基としては任意の疎水性化合物の残基を用いることができる。脂質膜構造体として脂質多重膜を有するリポソームなどを用いる場合には、上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)による脂質膜修飾を外側の脂質膜のほか、内側の脂質膜に対して行ってもよい。
　本発明の脂質膜構造体は細胞の核内に物質を送達するために使用することができるが、細胞の種類は特に限定されず、送達すべき物質の種類や核内への物質送達の目的などに応じて、適宜の細胞を標的とすることができる。標的とすべき細胞として、好ましくは免疫細胞を挙げることができ、免疫細胞のなかでも抗原提示細胞を好ましく用いることができる。例えばマクロファージ、樹状細胞、B細胞などの抗原提示細胞が好ましく、特に好ましいのは樹状細胞である。
　本発明の脂質膜構造体の核内移行を促進するために、例えば、脂質膜構造体を3糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。3糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、3個ないし10個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは3個ないし6個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。
　オリゴ糖化合物としてより具体的には、例えば、セロトリオース（Cellotriose: β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、カコトリオース（Chacotriose: α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[α-L-ラムノピラノシル-(1→4)]-D-グルコース）、ゲンチアノース（Gentianose: β-D-フルクトフラノシル β-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、イソマルトトリオース（Isomaltotriose: α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、イソパノース（Isopanose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-[α-D-グルコピラノシル-(1→6)]-D-グルコース）、マルトトリオース（Maltotriose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、マンニノトリオース（Manninotriose: α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-D-グルコース）、メレジトース（Melezitose: α-D-グルコピラノシル-(1→3)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、パノース （Panose: α-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、プランテオース（Planteose: α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-β-D-フルクトフラノシル=α-D-グルコピラノシド）、ラフィノース（Raffinose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）、ソラトリオース（Solatriose: α-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[β-D-グルコピラノシル-(1→3)]-D-ガラクトース）、ウンベリフェロース（Umbelliferose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→2)-α-D-ガラクトピラノシド）などの3糖化合物； リコテトラオース（Lycotetraose: β-D-グルコピラノシル-(1→2)-[β-D-キシロピラノシル-(1→3)]-β-D-グルコピラノシル-(1→4)-β-D-ガラクトース）、マルトテトラオース（Maltotetraose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、スタキオース（Stachyose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）などの4糖化合物；マルトペンタオース（Maltopentaose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）、ベルバスコース（Verbascose: β-D-フルクトフラノシル=α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-ガラクトピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシド）などの5糖化合物；マルトヘキサオース（Maltohexaose: α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-D-グルコース）などの6糖化合物を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　好ましくはグルコースの3量体ないし6量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの3量体又は4量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質膜構造体の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して1～30モル％程度、好ましくは2～20モル％程度、より好ましくは5～10モル％程度である。
　オリゴ糖化合物で脂質膜構造体を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質膜構造体をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム(国際公開WO2007/102481)が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。この手段はポリアルキレングリコール化脂質に単糖化合物を結合して脂質膜構造体の表面修飾を行なう方法であり、この手段により脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールにより同時に修飾することができるので好ましい。
　脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールなどの親水性ポリマーで修飾することによりリポソームの血中滞留性を高めることができる。この手段については、例えば、特開平1-249717号公報、特開平2-149512号公報、特開平4-346918号公報、特開2004-10481号公報などに記載されている。親水性ポリマーとしてはポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば300～10,000程度、好ましくは500～10,000、さらに好ましくは1,000～5,000程度である。
　ポリアルキレングリコールによる脂質膜構造体の表面修飾は、例えばポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質膜構造体を構築することにより容易に行なうことができる。例えば、ポリエチレングリコールによる修飾を行う場合にはステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-{カルボニル－メトキシポリエチレングリコール-2000}-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、n-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000}-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-{カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000}-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。
　例えば、ポリアルキレングリコールで修飾された上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)を用いて脂質膜構造体の表面修飾を行うこともできる。例えば、適当なリン脂質が縮合したポリアルキレングリコール、例えばステアリル化ポリエチレングリコールで修飾された上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)を使用することができる。例えば、ポリアルキレングリコールをN末端又はC末端のシステイン(Cys)残基に縮合させたポリペプチドを利用することが好ましい。この態様により、ポリアルキレングリコールと上記ポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)とによる脂質膜修飾を同時に達成することができる。
　また、ポリアルキレングリコールにオリゴ糖化合物を結合させることにより、ポリアルキレングリコール及びオリゴ糖化合物による表面修飾を同時に達成することができる。もっとも、脂質膜構造体をポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物で表面修飾する方法は上記の方法に限定されることはなく、例えば、ステアリル化されたポリアルキレングリコールやオリゴ糖化合物など脂質化された化合物を脂質膜構造体の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行なうことができる場合もある。
　本発明の脂質膜構造体の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドGM1、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドGM3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。
　エンドソーム内から脂質膜構造体を細胞質中に効率的に脱出させるために本発明の脂質膜構造体の脂質膜をGALAで修飾してもよい。例えば、特開2006-28030号公報にはGALAで表面修飾を施したリポソームが開示されているので、上記公報に記載された方法に従って、GALAで表面修飾した脂質膜構造体を容易に製造することができる。一般的にはGALAのコレステロール誘導体（Chol-GALA）を脂質成分として用いて脂質膜構造体を調製することにより、GALAで表面修飾した脂質膜構造体を製造することができる。GALAによる表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して0.01～10モル％程度、好ましくは0.1～4モル％程度、より好ましくは1～3モル％程度である。
　本明細書において「GALA」の用語には特開2006-28030号公報の配列表の配列番号1により特定されるペプチドのほか、上記ペプチドのアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、実質的にGALAと同様の性質（例えば酸性条件下において脂質膜同士を融合できる性質）を有する修飾ペプチドも包含される。本明細書における「GALA」の用語をいかなる意味においても限定して解釈してはならない。GALA及びGALAによる脂質膜構造体の表面修飾方法に関して、特開2006-28030号公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
　本発明の脂質膜構造体の表面をMPCポリマーで修飾することもできる。MPCポリマーは2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）を重合して得られるMPCポリマーである。このポリマーは生体膜と類似の分子構造を有していることからポリペプチドや血球などの生体成分との相互作用が極めて小さく、優れた生体適合性を有することが示されている。本明細書において、「MPCポリマー」の用語にはMPCのホモポリマー、及びMPCと他の重合成分とのコポリマーのいずれも包含される。
　MPCポリマーは市販のポリマーを容易に入手することができる。例えば、日油株式会社から登録商標「リピジュア（LIPIDURE）」としてMPCのホモポリマー（CAS: 67881-99-6）；MPCとブチルメタクリレートとのコポリマー（CAS: 125275-25-4）；MPC、メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ブチルの3元コポリマー；MPCと2-ヒドロキシ-3-(メタ)アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとの2元コポリマー；リン脂質ポリマー(LIPIDURE-S)などが提供されており、いずれも本発明に用いることができる。
　本発明において用いられるMPCポリマーの種類は特に限定されないが、例えば、MPCとブチルメタクリレートなどのメタクリル酸エステルとのコポリマー、特にブロックコポリマーなどを好ましく用いることができる。このコポリマーについては特許第2890316号公報に製造方法が詳細に記載されており、当業者はこの特許公報を参照することにより所望のコポリマーを容易に製造することができる。この特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。本発明においては、水溶性を有し、かつ疎水性基を有するMPCポリマーを用いることが好ましいが、このような観点から炭素数4ないし18程度のアクリル酸エステル又はメタクリル酸エステルを用いて製造されたMPCコポリマーを好適に使用することができる。MPCとブチルメタクリレート(BMA)とのコポリマーとしては、例えば、MPCとBMAのモル比が5:5のコポリマー（PMB50）やMPCとBMAのモル比が3:7のコポリマー（PMB30）などが知られており、例えば、Polymer Journal, 22, pp.355-360, 1990などに記載の方法に従って容易に調製することが可能である（例えば特開2007-314526号公報に具体的な製造方法の説明がある）。本発明にはPMB50を特に好ましく用いることができる。MPCポリマーの重合度や分子量は特に限定されないが、例えば、水溶性を維持する観点から平均分子量（重量平均分子量）が5,000～300,000程度、好ましくは10,000～100,000程度のポリマーを用いることができる。
　MPCポリマーで脂質膜構造体を修飾する方法は特に限定されないが、例えば、リポソームなどの脂質膜構造体の水性分散物にMPCポリマーを添加し、室温で数分から数時間程度放置すればよい。上記水性分散物へのMPCポリマーの添加量は特に限定されないが、修飾すべきMPCポリマーの量に応じて、例えば、脂質膜構造体の総脂質量に対して0.01～1質量％の範囲、好ましくは0.1～10質量％、さらに好ましくは0.1～3質量％程度のMPCポリマーを添加すればよい。この操作によりMPCポリマーは速やかに脂質膜構造体の脂質成分に取り込まれ、表面がMPCポリマーで修飾された脂質膜構造体を調製することができる。MPCポリマーによる表面修飾量は特に限定されないが、例えば脂質膜構造体の総脂質量に対して0.1～5質量％程度の範囲である。
　本発明の脂質膜構造体は、ステロール、又はグリセリン若しくはその脂肪酸エステルなどの膜安定化剤、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンなどの飽和又は不飽和カチオン性合成脂質；あるいはカチオン性ポリマーなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
　また、本発明の脂質膜構造体には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びpH感受性機能などのいずれか1つ又は2つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、例えば遺伝子を含む核酸などを内包する脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質膜構造体を脱出させて核内に移行させることができ、核内において高い遺伝子発現活性を達成することが可能になる。
　温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどを挙げることができる。また、pH感受性機能を付与することができるpH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどを挙げることができる。
　また、本発明の脂質膜構造体は、細胞表面の受容体や抗原に対して特異的に結合可能な抗体などの物質で修飾を施すこともでき、細胞の核内への物質送達効率を改善することができる。例えば標的組織又は臓器に特異的に発現する生体成分に対するモノクローナル抗体を脂質膜構造体の表面に配置することが好ましい。この手法は、例えば、STEALTH  LIPOSOME（第233-244頁、CRC Press, Inc.発行， Danilo Lasic及びFrank Martin編）などに記載されている。脂質膜構造体の構成成分として、モノクローナル抗体やそのフラグメント（例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、又はFab’フラグメントなど）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体、例えばポリ（エチレングリコール）-α-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ω-マレインイミド、α-［N-(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォリル-エチル）カルバミル)-ω-{３-[2-（2,5-ジヒドロ-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-1-イル）エタンカルボキサミド］プロピル｝-ポリ（オキシ-1,2-エタンジル）などのマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有させることにより、モノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に結合させることができる。
　本発明の脂質膜構造体の表面は連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチド(以下、「ポリアルギニン」と呼ぶ。)で修飾されていてもよい。ポリアルギニンとしては、好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基を含むポリペプチド、さらに好ましくは4ないし20個の連続したアルギニン残基のみからなるポリペプチド、特に好ましくはオクタアルギニンなどを用いることができる。リポソームなどの脂質膜構造体の表面をオクタアルギニンなどのポリアルギニンで修飾することにより、リポソームに封入された目的物質の細胞内送達効率を向上させることができる（Journal of Controlled Release, 98, pp.317-323, 2004; 国際公開WO2005/32593）。ポリアルギニンによる脂質膜構造体表面の修飾は、上記の刊行物に記載された方法に従って、例えば脂質修飾ポリアルギニン、例えばステアリル化オクタアルギニンなどを脂質膜構造体の構成脂質として使用することにより容易に行なうことができる。上記刊行物の開示及びこの刊行物において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
　さらに、本発明の脂質膜構造体の表面はINF7で修飾されていてもよい。INF7はインフルエンザHAポリペプチド(HA2)由来のペプチド(1-23)を改変したグルタミン酸リッチペプチドであり、リポソームと混在させることにより脂質構造が崩壊して内包された物質が容易に放出されることが報告されており(Biochemistry, 46, pp.13490-13504, 2007)、ポリエチレングリコールテトラアクリレート(PEG-TA)にINF7を結合させた送達システムも提案されている(The Journal of Gene Medicine, 10, pp.1134-1149, 2008)。当業者はこれらの刊行物を参照することにより本発明においてINF7を容易に使用することが可能である。本明細書において「INF7」の用語にはBiochemistry, 46, pp.13490-13504, 2007のTable 1に記載された配列により特定されるペプチドのほか、上記ペプチドのアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、実質的にINF7と同様の性質を有する修飾ペプチドも包含される。本明細書における「INF7」の用語をいかなる意味においても限定して解釈してはならない。上記刊行物の開示及びこの刊行物において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
　INF7による脂質膜構造体の修飾方法は特に限定されないが、一般的には、脂質化合物とINF7とが共有結合した脂質修飾INF7を脂質膜構成脂質として用いて脂質膜構造体を構築することにより、INF7により表面修飾された脂質膜構造体を容易に製造することができる。脂質修飾INFとしては、例えばステアリル化INF7などを利用することができ、この化合物はFutaki, S. et al., Biocongug. Chem., 12(6), pp.1005-1011, 2001に記載された方法に従って容易に製造することができる。INF7による表面修飾量は特に限定されないが、一般的には脂質膜構造体の総脂質量に対して1～5 モル％の範囲であり、好ましくは総脂質量に対して3 ～5 モル％程度である。
　多機能性を付加したエンベロープ型ナノ構造体（MEND）が知られており、本発明の脂質膜構造体として好適に使用することができる。MENDは、例えば、プラスミドDNAなどの核酸とプロタミンなどのカチオン性ポリマーとの複合体をコアとし、このコアがリポソーム形態の脂質エンベロープ膜の内部に封入された構造を有している。MENDの脂質エンベロープ膜には、必要に応じてpH応答性や膜透過性を調節するためのペプチドを配置することができ、脂質エンベロープ膜の外側表面はポリエチレングリコールなどのアルキレングリコールで修飾することができる。MENDの脂質エンベロープの内部には、凝縮化されたDNA及びカチオン性ポリマーが封入されており、効率的に遺伝子発現を達成できるように設計されている。本発明に好適に使用可能なMENDとしては、所望の遺伝子を組み込んだプラスミドDNAとプロタミンとの複合体が内部に封入され、脂質エンベロープの外側表面がオリゴ糖結合PEGで修飾されたMENDが好ましい。オリゴ糖結合PEGによる修飾は構成脂質成分として上記のポリペプチド(a)及び／又はポリペプチド(b)が結合したステアリル化ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。MENDについては、例えばDrug Delivery System, 22-2, pp.115-122, 2007などの総説を参照することができる。上記刊行物の開示及びこの総説において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。
　脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒（例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など）に分散された形態やこの水性分散物を凍結乾燥した形態などが挙げられる。
　脂質膜構造体の製造方法も特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームの場合には粒子径が50 nmから5μm程度であり、50 nmから400 nm程度が好ましく、50 nmから300 nm程度が好ましく、150 nmから250 nm程度がより好ましい。粒子径は、例えばDLS(dynamic light scattering)法により測定することができる。
　水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のpHを弱酸性から中性付近（pH3.0から8.0程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。
　得られた脂質膜構造体の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。
　本発明の脂質膜構造体、例えばリポソームの内部には、標的組織又は臓器の細胞の核内に送達すべき物質を封入することができる。封入すべき物質の種類は特に限定されないが、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬の有効成分のほか、糖類、ペプチド類、核酸類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。核酸としては、例えば遺伝子を含む核酸を挙げることができ、より具体的には、例えば、プラスミドに組み込まれた遺伝子などを挙げることができるが、この特定の態様に限定されることはない。また、遺伝子としては任意の遺伝子を用いることができることは言うまでもない。本発明の一例として、以下、核酸を封入する場合について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの特定の態様に限定されることはない。
　本発明の脂質膜構造体には、好ましくは核酸を封入することができる。核酸にはDNA又はRNAのほか、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸(PNA)やホスホロチオエートDNAなど）が包含される。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、線状又は環状のいずれであってもよい。核酸には遺伝子が含まれていてもよい。遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、DNA、又はRNAのいずれでもよく、特に形質転換などのイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、相同組換え用の正常遺伝子などの遺伝子治療用遺伝子などを挙げることができる。治療用の核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、酵素、サイトカインなどの生理活性物質をコードする遺伝子のほか、遺伝子の発現を調節する機能を有する核酸、例えばsiRNAなどのRNAなどを含む機能性核酸を用いることもでき、これらも本明細書における核酸の用語に含める。本明細書において「核酸」の用語は最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。例えば核酸としてDNAを用いる場合には、例えば、発現させるべき遺伝子DNAをベクターDNAに結合させて脂質膜構造体に封入することができるが、より高い遺伝子発現効率を達成するためには、該ベクターDNAがCpG配列を含まないことが好ましく、それに加えて、発現させるべき遺伝子DNAがCpG配列を含まないことがさらに好ましい場合もある。該ベクターにはエンハンサー及び／又はプロモーターが結合されていることが好ましい。
　また、本発明の脂質膜構造体に核酸を封入する場合には、核酸導入機能を有する化合物を加えることもできる。このような化合物としては、例えば、O,O'-N-ジドデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジテトラデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジヘキサデカノイル-N-(α－トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジオクタデセノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O',O''-トリデカノイル-N-(ω-トリメチルアンモニオデカノイル)アミノメタンブロミド及びN-[α-トリメチルアンモニオアセチル]-ジドデシル-D-グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキサミド）エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、3-β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロールなどを挙げることができる。これらの核酸導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜の任意の位置に配置されていてもよく、及び／又は脂質膜構造体の内部に充填されていてもよい。
　例えば、核酸を封入した脂質膜構造体は、標的組織又は臓器の細胞の核内に該核酸を送達するためのキャリアーとして用いることができる。遺伝子発現を目的とする場合には、核酸として所望の遺伝子を含む核酸を用い、上記のMENDを用いることが特に好ましい。例えば、遺伝子を含む核酸を封入した脂質膜構造体、好ましくはMENDをヒトを含む哺乳類動物に投与することにより、標的組織又は臓器の細胞の核内に所望の遺伝子を送達して効率よく発現させることができる。投与方法は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、静脈内投与がさらに好ましい。本発明の脂質膜構造体を医薬として使用する場合には、例えば、適宜の製剤用添加物とともに医薬組成物の形態の医薬を調製して投与することができる。
　本発明の脂質膜構造体を用いて免疫細胞、好ましくは樹状細胞の核内に核酸を移行させると、核内において封入された核酸などの物質を効率的に放出して該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。本発明の脂質膜構造体を用いて樹状細胞の核内にポリペプチドをコードする核酸を導入する場合には、該核酸から転写翻訳されたポリペプチドが樹状細胞の表面に提示され、生体は当該ポリペプチドに対する免疫を獲得することができるので、所望のポリペプチドに対して有効な免疫療法を行うことができるようになる。この態様は本発明において特に好ましい態様である。
　本発明により提供される脂質膜構造体はそれ自体が樹状細胞に対してアジュバント作用を発揮することができ、種々のサイトカイン産生を促進することができる。従って、本発明の脂質膜構造体を用いることにより、極めて効率的に免疫療法を行うことができる。また、本発明により提供される脂質膜構造体で形質転換した樹状細胞をヒトを含む哺乳類動物に投与することにより、アジュバントの有無にかかわらず悪性腫瘍の増悪や増殖を顕著に抑制することができ、抗原タンパク質を封入して投与することによりイン・ビボで細胞障害活性を増強することができることから、高い有効性を有する悪性腫瘍の予防ワクチン又は悪性腫瘍の治療のための医薬の有効成分として利用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
(a)封入する核酸の調製(プロタミンによる凝縮体)
　ルシフェラーゼをコードしているプラスミド(pDNA、BD Biosciences Clontech社製)を10 mM HEPES緩衝液に0.1 mg/mLとなる様に溶解した。0.1 mg/mL(10 mM HEPES緩衝液)の プロタミン(Protamine)溶液150μLにpDNA溶液を100μL少量ずつ攪拌しながら滴下して、プロタミンとpDNAのコンパクション体を調製した(N/P比は2.2)。
(b)プロタミンコア封入リポソームの作成
　1 mM DOPE 112.5μL及び1 mM CHEMS 25μLをDOPE:CHEMS=9:2となるようにガラス試験管に加えた。さらに、Biochemistry, 43, pp.5618-5628, 2004に記載の方法に従って合成された1mg/mL Chol-GALA、及び特開2003-343857号公報に記載された方法に準じて合成した1mg/mLステアリル化KALA(STR-KALA)を総脂質濃度の1～8％分の修飾量となるように加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるように上記(a)のコンパクション体を添加し、室温で10分間静置して水和させた後、ソニケーターで1分間超音波処理した。特開2003-343857号公報に記載の方法で合成したステアリル化オクタアルギニン(STR-R8)(2 mg/mL水溶液を総脂質の 5 mol%分添加し、室温で10 分間静置した。
(c)封入する核酸の調製(ポリロタキサンによる凝縮体)
　ルシフェラーゼをコードしているプラスミド(pDNA、BD Biosciences Clontech社製)を10 mM HEPES緩衝液に0.1 mg/mLとなる様に溶解した。J. Control. Release, 131, pp.137-144, 2008に記載の方法に従って合成されたポリロタキサン(平均ポリエチレングリコール鎖長4,000、シクロデキストリン貫通数29、１鎖内平均カチオン数46)を10 mM HEPES緩衝液により溶解し(1 mM アミン濃度換算)、得られた溶液150μLにpDNA溶液を100μL少量ずつ攪拌しながら滴下して、ポリロタキサンとpDNAのコンパクション体を調製した(N/P比は5.0)。
(d)ポリロタキサンコア封入リポソームの作成
　1 mM DOPE 107 μL及び1 mM ホスファチジン酸(PA) 30.5μLをDOPE:PA=7:2となるようにガラス試験管に加えた。特開2003-343857号公報に記載された方法に準じて合成した1mg/mLのSTR-KALAを総脂質濃度の1.5～5％分の修飾量(8.25μL～27.5μL)となるように加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるように上記(c)のコンパクション体を添加し、室温で10 min静置し水和させた後、ソニケーターで1分間超音波処理した。特開2003-343857号公報に記載の方法で合成したステアリル化オクタアルギニン(STR-R8)2 mg/mL水溶液を総脂質の 10 mol%となるように添加し、室温で10 分間静置し水和させた。
(e)形質転換細胞の作製
　JAWS II細胞を8×104cells/ウェルとなるように24 ウェルプレートに播種し、αMEM培地で24 時間培養した。培養後の細胞をPBS 500 μLで洗浄した後、上記(b)及び(d)で作製したリポソームとコントロールリポソーム(ステアリル化KALA及びChol-GALA未修飾)をpDNA量が0.4μg/wellとなる様にαMEM に添加した後、各ウェルに加えて37 ℃、5% CO2で3時間インキュベーションした。インキュベーション後に細胞をPBS 500 μLで洗浄した後、αMEM 1 mLを各ウェルに添加し、37℃、5% CO2の条件下でさらに21時間インキュベーションして形質転換細胞を作製した。
(f)発現量の測定
　上記(e)の形質転換細胞をPBS 500μLで洗浄し、そのPBSを1.5 mLサンプルチューブに回収し、遠心(4℃、2,000 rpm, 2分間)して上清を除去した。各ウェルにReporter Lysis Buffer(Promega社)75μLを添加し、-80℃のリーザーに移して凍結した。凍結させたサンプルを解凍させた後、セルスクレーパーを用いて細胞をはがし、1.5 mLサンプルチューブに回収した。回収した細胞溶解液を遠心(4℃、15,000 rpm、5分間)して遠心分離し、その上清45μLを回収した。得られた上清を用いてルシフェラーゼ活性測定(RLU/mL)を測定した。さらにBCA法によるタンパク定量(mg/mL)を行い、単位ポリペプチド量当たりのルシフェラーゼ活性(RLU/ mg protein)を算出し、ルシフェラーゼ発現量を比較した。結果を図１に示す。
　図1に示される様に、プロタミンによりコアを形成し、DOPE/CHEMSにより封入したリポソームの場合には、Chol-GALA修飾時において2％修飾時に遺伝子発現が最大となるが、その遺伝子発現は3倍程度であった。一方、STR-KALAを修飾した際には遺伝子発現レベルは10倍以上に上昇し、特に5％修飾時においては100倍以上発現が促進することが明らかとなった。また、ポリロタキサンによりコアを形成し、DOPE/PAの脂質で封入した際にも最適値である1.5%修飾時においてR8のみの修飾に比較して10倍以上遺伝子発現の発現上昇が得られた。
例2
(a)正電荷コアT-MENDの調製
　3.3 mM カルジオリピン(CL) 84 μL及び10 mM DOPE 27.5 μLをCL:DOPE=1:1となるようにガラス試験管に加えた。1 mg/mLのSTR-KALAを総脂質濃度の0.5％、1％、2％、及び5％の修飾量となるようにそれぞれ加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に総脂質濃度が0.55 mMとなるように10 mM HEPES溶液を１mＬ加え、水和した脂質膜をバスタイプソニケーターを用いてガラス試験管から剥離させた後、プローブ型ソニケーターを用いて10分間超音波処理した。超音波処理後、遠心分離(15,000 rpm、20℃、5分間)して上清を回収する操作を3回行い、STR-KALA濃度の異なる4種類のリポソーム(SUV1－1～5)を回収した。
　10 mM PA 12.2μL及び10 mM DOPE 42.8μLをPA:DOPE=7:2となるようにガラス試験管に加えた。1 mg/mLのSTR-KALAを総脂質濃度の1.5％の修飾量となるように加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるように10 mM HEPES溶液を1 mL加え、水和した脂質膜をバスタイプソニケーターを用いてガラス試験管から剥離させた後、プローブ型ソニケーターを用いて10分間超音波処理した。超音波処理後、遠心分離(15,000 rpm、20℃、5分間)して上清を回収する操作を3回行い、リポソームを回収した(SUV2)。
　例1(c)で得られたコンパクション体100μlとSUV1－1～5の各溶液200μlを1.5 mL サンプルチューブ内で混合し、5種類の2枚膜リポソーム(D-MEND)を形成させた。D-MEND形成後、正電荷を付加するために2 mg/mL STR-R8をSUV1総脂質量に対して20 mol%相当添加し、室温で30分程度インキュベートして、R8修飾を行った。
　さらに、上記インキュベーション後の各溶液200μlに対し、400μl のSUV2を加えて1.5 mL サンプルチューブ内で混合して4枚膜MEND(T-MEND)を形成させ、さらに2 mg/mL STR-R8をSUV2総脂質量に対して10mol%相当添加し、室温で30分程度インキュベートすることで、内膜と外膜の両方にKALAとR8を有するカチオン性T-MENDを作製した。
(b)負電荷コアT-MENDの調製
　ルシフェラーゼをコードしているプラスミド(pDNA、BD Biosciences Clontech社製)を10 mM HEPES緩衝液に0.1 mg/mLとなるように溶解した。0.1 mg/mL pDNA 60μLにアミン濃度換算で1 mMのポリロタキサン溶液(平均ポリエチレングリコール鎖長4,000、シクロデキストリン貫通数29、１鎖内平均カチオン数46) 90μLを少量ずつ攪拌しながら滴下して、ポリロタキサンとpDNAのコンパクション体を調製した(N/P比は0.5)。
　3.3 mM カルジオリピン(CL) 84μL及び10 mM DOPE 27.5μLをCL:DOPE=1:1となるようにガラス試験管に加えた。2 mg/mLの STR-R8を総脂量の20 mol％相当、及び1 mg/mLの STR-KALA溶液を総合脂質濃度の0あるいは5 mol％となるように加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるように10 mM HEPES溶液を1 mL加え、水和した脂質膜をバスタイプソニケーターを用いてガラス試験管から剥離させた後、プローブ型ソニケーターを用いて10分間超音波処理した。超音波処理後、遠心分離(15,000 rpm、20℃、5分間)して上清を回収する操作を3回行い、リポソームを回収した(SUV1－0、1－5)。
　10 mM PA 12.2μL及び10 mM DOPE 42.8μLをPA:DOPE=7:2となるようにガラス試験管に加え、1 mg/mLのSTR-KALAを総脂質濃度の0あるいは1.5％分(0あるいは8.3μl)の修飾量となるように加え、さらに全量が200μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて2種類の脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるように10 mM HEPES溶液を1 mL加え、水和した脂質膜をバスタイプソニケーターを用いてガラス試験管から剥離させた後、プローブ型ソニケーターを用いて10分間超音波処理した。超音波処理後、遠心分離(15,000 rpm、20℃、5分間)して上清を回収する操作を3回行い、リポソームを回収した(SUV2－0、2－1.5)。
　上記N/P＝0.5でpDNAとポリロタキサンとから得られるコンパクション体100μl及びSUV1－0、1－5溶液200μlを1.5 mL サンプルチューブ内で混合し、2枚膜リポソーム(D-MEND-0、-5)を形成させた。D-MEND形成後、2 mg/mL STR-R8をSUV1の総脂質量に対して5 mol%相当添加し、室温で30分程度インキュベートした。
　さらに、上記インキュベーション後の溶液(D-MEND-0、-5)200μlに対し、それぞれ400μl のSUV2－0あるいは2－1.5を1.5 mL サンプルチューブ内で混合し、4枚膜MEND(T-MEND)を形成後、2 mg/mL STR-R8をSUV2総脂質量に対して10 mol%相当を添加し、室温で30分程度インキュベートして、内膜と外膜の両方にKALAとR8を有するアニオン性T-MENDを作製した。
(c)形質転換細胞の作製ならびに発現量の測定
　例1(e)に記載の方法に従って、上記(a)及び(b)でそれぞれ調製した2種のT-MENDを用いて形質転換細胞を作製し、さらに例1(f)に記載の方法に従って、各細胞におけるルシフェラーゼの発現量を測定した。その結果、カチオン性T-MENDにおいて、KALAの修飾密度依存的に封入された遺伝子発現の上昇が認められた(図2)。また、アニオン性T-MENDに対しても、内膜と外膜をKALAで修飾することで遺伝子発現が10倍以上に上昇した。特にアニオン性T-MENDは市販の遺伝子導入試薬であるLipofectamine PLUSよりも高い遺伝子発現を示した。
例3
(a)抗原提示量の評価
　種々のベクターを用いて、抗原である卵白抗原(Ovalbumin)をコードするプラスミドDNAを樹状細胞に導入し、トランスフェクションから24時間後に樹状細胞を回収し、培地で洗浄後96 well plateに1×104 cells/100μLの樹状細胞と2×105 cells/100μLのB3Z(MHC-I)細胞を播種し、16時間共培養した。その後PBSで細胞を洗い、CPRG buffer(5 mM CPRG(Roche Diagnotics), 0.125% NP-40(Igepal CA-630, SIGMA), 9 mM MgCl2となるように二回蒸留水に溶解し、1 mLずつ分注して-20℃で遮光保存したもの)100μLを添加して37℃で4時間インキュベートした。その後、Benchmark Plus microplate spectrophotometer(Bio-Rad)を用いて595 nmの吸光度を測定した。未処理の樹状細胞のみの吸光度を1として規格化した。結果を図3に示す。
　Ovalbumin遺伝子を導入した後に抗原への提示を評価した結果、市販のlipofectamine PLUSや従来型のT-MENDではコントロール(遺伝子導入なしの樹状細胞)と比較して優位な抗原提示は観察されたかった(点線)。一方、図2においてもっとも高い遺伝子発現を有するKALA修飾T-MENDにおいては抗原提示が観察された。この結果から、本発明の脂質膜構造体は樹状細胞の核内に遺伝子を極めて効率的に導入することができ、導入された遺伝子から発現した抗原タンパク質を樹状細胞表面に抗原提示できることが示された。
例4：マイクロアレイ解析を用いた免疫関連遺伝子群の遺伝子発現解析
(a) R8-MEND及びR8/KALA-MENDの調製
　ベクターのコアとして、pDNA溶液、Protamine溶液をそれぞれ、10 mM HEPES bufferで0.1 mg/mLに希釈した。0.1 mg/mL Protamine 150 μLに対し、0.1 mg/mL pDNA 100 μLを攪拌しながら少量ずつ滴下してProtamineとpDNAのコンパクション体を調製した(N/P比=2.2)。脂質膜は、DOPE:CHEMS=9:2となるように、1 mM DOPE 112.5 μL、1 mM CHEMS 25 μLをガラス試験管に加え、全量が200 μLとなるようにCHCl3を加えた後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去して脂質膜を得た。脂質膜に総脂質濃度が0.55 mMとなるようにコンパクション体溶液を添加した後、R8-MENDにおいてはSTR-R8単独を総脂質量の5mol%、、R8/KALA-MENDにおいてはSTR-KALA、STR-R8を総脂質の5 mol%となるようにそれぞれ添加し、室温で10 min静置し水和させた後、ソニケーターで1 min超音波処理した。
(2)RNA調製
　トランスフェクション 2日前にJAWS-II細胞を4×105 cells/wellとなるように6 well plateに播種した。細胞をPBS(-)500 μLでwashした後、αMEM（血清なし、抗生物質なし）によって2 μg/mL（プラスミドDNA濃度相当）に希釈したMEND溶液を1 mL細胞に加え、37℃で5% CO2インキュベーター内に静置した。トランスフェクションしてから1、3、及び6時間後に細胞をPBS(-) 500 μLで洗浄し、サンプルごとに合計1 mLとなるようにTRIzol Reagent（invitrogen社）を加えた。Cell scraperで細胞をはがし、エッペンドルフチューブに回収した。1分間 ボルテックスにより混合して-80℃で保存した。mRNAの精製に際し、各サンプルを室温で解凍した後、クロロホルムを200 μL加え、15 秒間 ボルテックスにより混合した。室温で3分間インキュベーションした後、4℃環境下で12,000 rpmで15 min遠心した。上清を他のエッペンドルフチューブに移し、イソプロパノールを500 μL加えた後に室温で10 minインキュベーションした。4℃環境下で12,000 rpm、10 min遠心した後、上清を除き、pelletに75％エタノールを1 mLを加えてボルテックスにより混合し、遠心した(4℃、12,000 rpm、4分間)。上清を除去し、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水を25 μL加え、10 min インキュベーションし、Nano Drop（Thermo Scientific社）を用い、260 nmにおける吸光度よりRNA量を定量した。
(3)RNAのラベル化
　DNAマイクロアレイ実験用のラベル化RNAをQuick Amp Labeling Kit、one-color(Agilent)を用いて添付プロトコルに従い調製した。Total RNA 500 ngから逆転写反応によりcDNAを合成した。次に、cDNAからin vitro転写反応によってCyanine3（Cy3）-CTPでラベルしたcRNAを調製した。未反応のCy3を除去するために、ラベル化cRNAをRNeasy Mini Kitを用いて精製した。得られたCy3ラベル化cRNA溶液について、Nano Dropを用いて濃度とCy3取り込み量を算出し、品質を確認した。
　精製したラベル化cRNAプローブのCy3の取り込み効率(pmol/μg)はcRNA濃度(ng/μL)とCy3の取り込み量(pmol/μL)から算出した。計算方法を以下に示す。
(1)以下の式で、cRNA濃度(ng/μL)を算出した。
cRNA濃度(ng/μL)=OD260×10※×40(μg/mL)
※　NanoDropの光路長は1 mm
(2)以下の式で、Cy3の取り込み量(pmol/μL)を算出した。
Cy3取り込み量(pmol/μL)=(OD550×10※×1000)/(150 mM-1cm-1)
※　NanoDropの光路長は1 mm
(3)以下の式で、Cy3の取り込み効率(pmol/μg)を算出した。
Cy3取り込み効率(pmol/μg)= Cy3取り込み量(pmol/μL)/ cRNA濃度(ng/μL)
全Cy3ラベル化cRNAサンプルに関して、cRNAの収量が1.65 μg以上かつCy3の取り込み効率が9 pmol/μg以上であることを確認した。
(4)DNAマイクロアレイ
　マウスオリゴDNAマイクロアレイ(4x44K)へのラベル化cRNAのハイブリダイゼーションは、Gene Expression Hybridization Kitを用いて添付プロトコルに従い実験を行った。ラベル化cRNAをランダムに切断してフラグメント化し、1.65 μgのRNAを使用してハイブリダイゼーション溶液を調製した。マイクロアレイスライドにサンプルをアプライし、65℃、17時間ハイブリダイゼーションを行った後、10％ Triton X-102を含むExpression Wash Bufferでスライドを洗浄した。
　マイクロアレイスライドをAgilent DNA Microarray Scanner(Agilent Technologies)を用いてスキャンした。Cy3の測定には532 nmのレーザーを使用した。作成したTIFF画像をFeature Extraction Softwareで読み込み、各スポットの情報(遺伝子プロファイル)をtext file形式で保存した。取得した発現プロファイルをGeneSpringGX11へインポートし、解析を行った。
　スポットとして検出した41220遺伝子のうち、信頼性の低い遺伝子の除去(Quality Control)を行い、解析対象となる21995遺伝子(Qualified genes)の抽出を行った。
(1)コントロールスポットの除去
　解析ソフトGeneSpring GX11にデータを取り込むと、アレイの四隅を認識させるスポットなどを含むコントロールスポットまで検出するため、これらのスポットの除去を行った。
(2)フラグの除去
　スポットの検出時に、形が乱れている、蛍光が飽和している、などシグナルの状況に応じてPresent(P)、Marginal(M)、Absent(A)の3段階のフラグが評価される。(P、M、Aの順に信頼度が低下する)。全サンプル中少なくとも1サンプルでPresentの評価が下された遺伝子を抽出した。
(3)低発現遺伝子の除去
　発現レベルの低い遺伝子は、同一サンプル同士の発現レベルもばらつくため、除去を行った。シグナル強度の絶対値であるRaw値が全サンプル中少なくとも1サンプルで、100以上の遺伝子を抽出した。以上のQuality controlを行った後、21995遺伝子を対象として解析を進めた。
　免疫に関わる遺伝子群を抽出し、R8-MENDとR8/KALA-MEND間で遺伝子発現比較を行った。本結果では未処理の細胞における各遺伝子の発現を１として規格化した際の値を示す。その結果、R8-MENDと比較し、R8/KALA-MENDにおいて免疫関連遺伝子の発現上昇倍率は高く、多くの遺伝子で時間依存的に上昇していることが認められた。このことから、MEND表面に修飾したKALAは、樹状細胞に対してアジュバント効果を示すことが明らかとなった（図４）。
例5：タンパク封入KALA修飾リポソームのCTL活性
(1)抗原封入R8修飾リポソーム、KALA修飾リポソームの調整
　ガラス試験管にEPC/Chol/CHEMS（モル比70:20:10）からなる脂質薄膜を調製し、OVA（5 mg/mL, 10 mM HB）を脂質濃度が10 mMとなるように添加後、室温で15分間水和した。水和後、ボルテックスにより混合し15 mLコニカルチューブに移し、凍結融解を5回行った。400 nmのメンブレンフィルターでエクストリュージョンし、超遠心（43,000 rpm, 4℃, 30 min）して上清を除去後、ペレットをHBG 200 μLで静かにすすぎ、適量のHBGに再懸濁した。下記の項にある手順に従い、OVA濃度及び脂質濃度を定量した。実験に使用する前にSTR-R8（10 mg/mL）又はSTR-KALA（10 mg/mL）を脂質モル濃度の7.5%添加し、室温で30分間以上インキュベートすることで、R8-Lip及びKALA-Lipを調製した。R8-Lipの粒子径は189.5 nm、PDIは0.095、ζ電位は47.8 mVであり、KALA-Lipの粒子径は188.4 nm、PDIは0.317、ζ電位は33.7 mVであった。
　リポソーム溶液 25 μL及び、検量線用のOVAを滅菌水で希釈して1 mLとしたものに、0.15% sodium deoxycholate 100 μLを添加後、室温で10分間インキュベーションした。72% トリクロロ酢酸 100μLを添加し、遠心後（3,500 rpm, 4℃, 20～30 min）上清を除去した。得られたペレットを0.5% SDS -0.1 N NaOH 50 μLに溶解しBCA assay reagent 1 mLを添加して、プロトコールに従い定量した。脂質濃度はリン脂質C-テストワコー（和光純薬工業）により定量した。
(2)イン・ビボCTL（cytotoxic T lymphocyte）活性
　C57BL/6マウス（雌、7-9週齢）に50 μgのOVAを内封したR8-LipもしくはKALA-Lipを皮下投与した（26G針）。免疫から1週間後に、以下の方法で調製した標的細胞を投与した。頚椎脱臼したnaiveマウスより脾臓を摘出し、RPMI1640培地3～5 mLの入ったシャーレ中で細胞をほぐし2.5 mLシリンジを用いて回収後、ナイロンメッシュを通して50 mLコニカルチューブに移した。遠心（1600～1700 rpm、4℃、5分）後、上清を除去し、ACK Lysing buffer（Lonza, Walkersville, MD） 1 mLに懸濁して室温で5 分間インキュベートし溶血した。RPMI1640培地9 mLを添加後遠心し、さらに培地 10 mLで洗浄後、20 mLに懸濁しナイロンメッシュを通して50 mLコニカルチューブ2本に移した。細胞を計数後遠心し、培地に再懸濁した（107 cells/mL）。2本のうち1本にOVA257-264ペプチド（1 mM、終濃度 5 μM）を添加し、この細胞懸濁液を37℃、5% CO2条件下で60分間インキュベートした。培地10 mL及びPBS 10 mLで洗浄後、OVA257-264ペプチドによってパルスした細胞群は5 μM CFSE（Molecular probe） (CFSEHigh) により、パルスしていない細胞群は0.5 μM CFSE (CFESLow)を含むPBSに3×107 cells/mLとなるよう懸濁し、37℃で10分間インキュベーションした。RPMI1640培地10 mLで2回、PBS 10 mLで2回洗浄後、最終的にPBSに懸濁した（5×107 cells/mL）。投与直前に異なる濃度で染色した2種の細胞を等量混合し、免疫したマウスに尾静脈より投与した（1×107 cells/200 μL/mouse、26G針）。
　標的細胞を投与してから20時間後に脾臓を摘出し、脾臓を上記の方法で溶血後、RPMI1640培地10 mL及びPBS 10 mLで洗浄しFACS buffer 5 mLに懸濁した。調製した細胞懸濁液をナイロンメッシュを通してFACSチューブに移し、フローサイトメーターによってCFSE陽性細胞数を測定した。低濃度で染色した細胞（CFSElow）について、7,500個の細胞を解析した。CTL活性はCFSEHighとCFSELowの細胞数を比較して算出した。実験間の誤差は、naiveマウスにおけるCFSEHigh/CFSELow比により補正した。
　結果を図5に示す。縦軸はCTL活性を示し、CTLの標的となる細胞（OVA257-264ペプチドによってパルスした細胞群）のうち何%の細胞が殺されたかを示す。標的としている細胞（CFSEHigh）はMHCクラスIにOVAペプチドを提示しているので、本評価における細胞殺傷効果はOVA特異的なCTLによるものである。
　R8-Lipは特異的なMHCクラスI提示及びin vivoにおける抗腫瘍活性を誘導可能なキャリアであることが示されている(Nakamura, T. et al. Mol. Ther., 16, pp.1507-1514, 2008)。上記の結果で示されるように、リポソーム表面にR8の代わりにKALAを修飾することでCTL活性の飛躍的な向上が認められた。R8-Lip、KALA-Lip共にアジュバント未使用であるが、KALA-LipのCTL活性は、R8-Lipにアジュバントとして知られているCpG配列含有オリゴヌクレオチドを搭載した場合のCTL活性に匹敵するものであった。この結果は、KALAが高いアジュバント機能を有するという例4の結果を機能の面から支持するものである。
例6：導入プラスミドのベクター改変によるKALA－MENDの遺伝子発現活性の増強
(a)各種プラスミドDNAの調製
　以下の4種類のプラスミドDNA：(1)プラスミドDNAのバックボーンにCpG配列を含み、かつマーカー遺伝子であるルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンにもCpG配列を有するプラスミドDNA（pcDNA3.1-Luc(+);CpG配列合計425個）、(2)プラスミドDNAのバックボーン及びルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンまでの間のいずれにもCpG配列を含まないもの（pCpGfree-Luc(0); CpG配列合計0個）、(3)プラスミドDNAのバックボーンにCpG配列を含み、ルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンにはCpG配列を含まないもの（pcDNA3.1-Luc (0);CpG配列合計332個）、及び(4)プラスミドDNAのバックボーンにはCpG配列を含まず、ルシフェラーゼ配列の開始コドンからストップコドンにはCpG配列を含むもの（pCpGfree-Luc(+);CpG配列合計98個）を作成した。
　バックボーンにCpG配列を含む発現プラスミドDNA（上記(1)及び(3)）の構築にはInvitrogen社から購入した発現ベクターpcDNA3.1を用いた。また、CpG配列を含まないバックボーンからなる発現プラスミドDNA（上記(2)及び(4)）の構築には、Invivogen社から購入した発現ベクターpCpGfree-mcsを用いた。
　プラスミドDNA(1)に関しては、CpG配列を含むルシフェラーゼを含むDNAフラグメントはプロメガ社のpGL3-basic vectorの制限酵素Hind III / Xba I切断により得た。本フラグメントをpcDNA3.1ベクターのHind III / Xba Iサイトに導入した(pcDNA3.1-Luc(+))。
　プラスミドDNA(2)に関しては、pCpGfree-mcsのマルチクローニングサイト（BglII-KpnI-EcoO109I-NcoI-NheI）をBglII/NheIにより処理し、本制限酵素切断部位に相補的な末端を有する２本鎖DNAフラグメントを挿入することで、新たなマルチクローニングサイト（BglII-PvuII-NcoI-XbaI-NheI）を作成した（pCpGfree-NEWmcs）（図６）。pORF-Luc::Sh-ΔCpG（invivogen社）のNcoI/NheI処理により得たCpG配列を持たないルシフェラーゼコード遺伝子をpCpGfree-NEWmcsのNcoI/NheIサイトに導入した（pCpGfree-Luc(+1)）。本方法で作成したプラスミドDNAは、ルシフェラーゼ遺伝子のコドンから数えて12番目後に一つだけCpG配列を有している（図７）。残存CpG配列は、pCpGfree-Luc(+1)からDraIII/NheI処理によりストップコドン並びにCpG配列を含む配列部分を切り出し、本制限酵素切断部位に相補的な末端を有し、かつCpG配列部分に変異を加えたオリゴヌクレオチドを挿入することで除去した。この際、ストップコドン直下に存在するEcoRIサイトは、EcoRVサイトに置き換えを行った（pCpGfree-Luc(0)）（図８）。
　プラスミドDNA(3)に関しては、pcDNA3.1のBamHI/RVサイトに対して、プラスミドDNA(2)の構築において作成したpCpGfree-Luc(0)よりBglII/EcoRV切り出したCpGフリーのルシフェラーゼ遺伝子を挿入することで作成した（pcDNA3.1-Luc(0)）。
　プラスミドDNA(4)に関しては、pCpGfree-NEWmcsのPvuII/XbaI切断サイトに対して、プラスミドDNA(1)の構築において作成したpcDNA3.1-Luc(+)よりPmeI/XbaI処理によって得られたルシフェラーゼコード遺伝子を挿入することで作成した（pCpGfree-Luc(+)）。
(b)マウス骨髄由来樹状細胞（BMDC）の単離・誘導
　頚椎脱臼したC57BL/6マウス（6～8週齢）より大腿骨および頸骨を摘出し、70%エタノールで軽く消毒した後、PBSに浸した。骨の両端を切断し、培地入りの1 mLシリンジ（26G針）で骨髄細胞をRPMI1640培地中に押しだした。細胞懸濁液を40 μmのセルストレイナー（FALCON）を通して50 mLコニカルチューブに移した。遠心（450 g、4℃、5分間）後上清を除去し、タッピングして細胞を分散させた後、ACK Lysing Buffer1 mLを添加、混合し、室温で3～5分間静置した。培地10 mLを添加後、遠心して上清を除去し、さらに培地10 mLで2回洗浄した。次に、細胞を培地10 mLに懸濁し、10 cm細胞培養ディッシュ（FALCON）に添加し、37℃、5% CO2条件下で4時間以上培養した。軽くピペッティングして浮遊細胞のみを50 mLコニカルチューブに回収し、遠心、上清除去後、培地10 mLに懸濁して計数した。1×106 cells/mLとなるよう培地に懸濁し、GM-CSF（終濃度10 ng/mL）を添加後、24 well plate（Corning, NY）に1 mLずつ播種し、37℃、5% CO2条件下で2日間培養した。2日後および4日後に細胞の凝集塊を残し浮遊細胞を除去した後、新しいGM-CSF含有RPMI1640培地1 mLを添加した。GM-CSF存在下で培養開始後6～8日目の浮遊及び弱付着細胞を未成熟樹状細胞として実験に用いた。CD11c抗体（PE anti-mouse CD11c, Clone: N418, BioLegend）を用いた評価では純度は85～90%であった。
(c)KALA－MENDの調製
　上記(a)で得られた各種プラスミドDNAを10 mM HEPES緩衝液に0.1 mg/mLとなる様に溶解した。0.1 mg/mL（10 mM HEPES緩衝液）の プロタミン（Protamine）溶液150 μLにpDNA溶液を100μL少量ずつ攪拌しながら滴下し、プロタミンとpDNAのコンパクション体を調製した（N/P比は2.2）。
　DOPE:CHEMS=9:2となるように1 mM DOPE 112.5 μL及び1 mM CHEMS 25 μLをガラス試験管に加えた。1mg/mLステアリル化KALA（STR-KALA）を総脂質濃度の5％分の修飾量となるように加え、さらに全量が200 μLとなるようにクロロホルムを加えた後、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に、総脂質濃度が0.55 mMとなるようにコンパクション体を添加し、室温で10 min静置し水和させた後、ソニケーターで1 min超音波処理した。さらにステアリル化KALA（STR-KALA）(1 mg/mL水溶液を総脂質の5 mol%となるように添加し、室温で10 分間静置した。
　R8-MENDの調製においては、DOPE:CHEMS=9:2となるように1 mM DOPE 112.5 μL及び1 mM CHEMS 25 μLをガラス試験管に加えた後、さらに全量が200 μLとなるようにクロロホルムを加え、デシケーターで減圧乾燥して溶媒を留去させて脂質膜を得た。この脂質膜に対して総脂質濃度が0.55 mMとなるようにコンパクション体を添加し、室温で10 min静置し水和させた後、ソニケーターで1 min超音波処理した。ステアリル化R8（STR-R8）(2 mg/mL水溶液を総脂質の5 mol%となるように添加し、室温で10 分間静置した。
(d)BMDCにおける遺伝子発現活性評価
上記(b)に示す方法により誘導したBMDCを24wellプレートに4×105 cells/wellとなるように播種した。調製したMENDをpDNA量が0.4 μg/well含むようにRPMI 1640(血清なし、抗生物質なし)で希釈し、500 μLとなるように調製した。各wellにMEND溶液をアプライし、37℃、5% CO2環境下でインキュベーションした。3時間後にRPMI 1640(血清、抗生物質有り) 500μLを各wellに添加し、さらに21時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定に関して、浮遊している細胞群はメディウムごと回収し、遠心(4℃、500 g、5分間)し、上清を除去することで集めた。各wellに残っている細胞、及び先に回収した浮遊細胞群にReporter Lysis Buffer(1×)を添加して両者を混合した後、合計75 μLにした後、ピペッティングを行い、-80℃で凍結した。-80℃で凍結させたサンプルを解凍させた後、セルスクレーパーを用いて細胞をはがし、エッペンドルフチューブに回収した。回収した細胞溶解液を15,000 rpm、4℃、2分間遠心分離し、その上清50 μLを回収した。得られた上清を用いてルシフェラーゼ活性測定（RLU/mL）を測定した。さらにBCA法によるタンパク定量(mg/mL)行い、単位タンパク質量当たりのルシフェラーゼ活性（RLU/ mg protein）を算出した。
　結果を図9に示す。左図は(a)で作成した(1)pcDNA3.1-Luc(+)及び(4)pCpGfree-Luc(0)を用いた場合におけるR8-MEND、KALA-MENDのBMDCにおける遺伝子発現活性を示す。R8-MEND、KALA-MEND共に、pCpGfree-Luc(0)を用いた際に高い遺伝子発現活性促進効果が認められた。特に、KALA-MENDに(2)pCpGfree-Luc(0)を封入した際には、JAWS IIを用いた例2及び3の結果を踏まえて考えられる抗原提示が可能となる遺伝子発現レベル（107 RUL/mg protein程度）が達成できることが明らかとなった。
　インサートのみ（(3);pcDNA3.1-Luc(0)）からCpG配列を除いた場合には遺伝子発現の上昇は認められなかった。一方、バックボーン側（(4);pCpGfree-Luc(+)）からCpG配列を除いた場合には遺伝子発現活性の促進が認められた。このことから、プロモーターの選択として、the mouse CMV enhancer 及び the human elongation factor 1 alpha core promoterの組み合わせが樹状細胞への遺伝子導入に有用であることが示された。また、CpG配列を完全に除いた(2)pCpGfree-Luc(0)のほうが(3)pCpGfree-Luc(+)と比較して遺伝子発現が高いことから、the mouse CMV enhancer 及び the human elongation factor 1 alpha core promoterをもち、かつCpG配列を完全に除いたプラスミドDNAが樹状細胞に最も適していることが示された。
例7：がん予防ワクチン効果
(a)CpGフリーOVA発現プラスミドDNAの調製
　CpG配列をすべて除いた抗原（OVA）遺伝子配列を設計し（配列表の配列番号2に示す1161bpのDNA配列）、カスタム合成を行った（TAKARA）。本配列を、pCpGfree-NEWmcsのマルチクローニングサイトのうち、NcoI/NheIサイトにサブクローニングした(pCpGfree-OVA(0))。
(b)BMDCへの抗原（OVA）発現プラスミドDNAの遺伝子導入とアジュバントによる刺激
　例6(b)に記載した方法により単離・分化された樹状細胞を24wellプレートに4×105 cells/wellとなるように播種した。CpGフリーのOVA発現プラスミドDNA（pCpGfree-OVA(0)）を用いて調製されたKALA-MENDを例6(c)に記載した方法に従って調製した。MENDをpDNA量が0.4 μg/well含むようにRPMI 1640(血清なし、抗生物質なし)で希釈し、500 μLとなるように調製した。各wellにMEND溶液をアプライし、37℃、5% CO2環境下でインキュベーションした。3時間後にRPMI 1640(血清、抗生物質有り) 500μLを各wellに添加し、さらに21 時間後に細胞を回収した。浮遊している細胞及びPBS中でピペッティングすることによってはがした付着細胞をまとめ、遠心(4℃、500 g、5分間)することで回収した。
　CpGオリゴヌクレオチドをアジュバントとしてBMDCを活性化する際には、KALA-MENDのトランスフェクション前に、1時間 RPMI 1640(血清なし、抗生物質なし)中で1 μg/mLの濃度でBMDCとインキュベーションを行った。
(c)抗腫瘍効果の評価
　抗原（OVA）発現腫瘍細胞（E.G7-OVA細胞）を移植する14日前、7日前に、C57BL/6マウス（雌、8週齢）に(1)DCのアジュバントであるCpGのみを作用させたBMDC、(2)KALA-MENDを用いて非抗原タンパクであるルシフェラーゼを発現させたBMDC、(3)KALA-MENDを用いて抗原タンパク（OVA）を発現させたBMDC、(4)KALA-MENDを用いて抗原タンパク（OVA）を発現させ、かつCpGアジュバントにより活性化したBMDCを4×105 cells/40μL PBSになるように調製し、全量をマウスの足の裏に投与した。2回目の免疫から1週間後に8×105個のE.G7-OVA細胞を左脇腹に移植し、経時的に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（tumor volume (mm3)）は長径×短径×短径×0.52の式により算出した。
　結果を図10に示す。PBSを投与したコントロール群と比較して、CpG配列によるアジュバント刺激をかけることにより腫瘍増殖の減少が認められたが、本効果は、KALA-MEND(非抗原タンパク；ルシフェラーゼ発現)のほうで高いことが明らかとなった、このことは、KALA－MEND自体が高いアジュバント効果を有するという例4及び5の結果を支持するものである。また、アジュバントであるCpGの有無に関わらず、OVA発現プラスミドDNAをKALA-MENDを用いて導入することにより、ほぼ同等の極めて高い腫瘍予防効果が認められた。このことから、KALA-MENDは、細胞障害活性を示すのに十分な抗原発現レベルをBMDCに付与することができ、同時にアジュバント効果も有していること明らかとなった。
例8：腫瘍増殖抑制効果
(a)BMDCへの抗原（OVA）発現プラスミドDNAの遺伝子導入
　例6(b)に記載した方法により単離・分化された樹状細胞を24wellプレートに4×105 cells/wellとなるように播種した。CpGフリーのOVA発現プラスミドDNA（pCpGfree-OVA(0)）を用いて調製されたKALA-MENDを例6(c)に記載した方法に従って調製した。MENDをpDNA量が0.8 μg/well含むようにRPMI 1640(血清なし、抗生物質なし)で希釈し、500 μLとなるように調製した。各wellにMEND溶液をアプライし、37℃、5% CO2環境下でインキュベーションした。3 時間後にRPMI 1640(血清、抗生物質有り) 500μLを各wellに添加し、さらに21時間後に細胞を回収した。浮遊している細胞及びPBS中でピペッティングすることによってはがした付着細胞をまとめ、遠心(4℃、500 g、5分間)することで回収した。
(b)抗腫瘍効果の評価
　8×105個の抗原（OVA）発現腫瘍細胞（E.G7-OVA細胞）をC57BL/6マウス（雌、8週齢）の左脇腹に移植して15日目及び22日目に、(1)未処理のBMDC、(2)KALA-MENDを用いて非抗原タンパクであるルシフェラーゼを発現させたBMDC、(3)KALA-MENDを用いて抗原タンパク（OVA）を発現させたBMDCを40μL PBS中に4x 105個のBMDCが入るように懸濁し、足の裏に投与した。経時的に腫瘍体積を測定し、腫瘍体積（tumor volume (mm3)）は長径×短径×短径×0.52の式により算出した。
　未処理のDC及び非抗原タンパク発現BMDCでは抗腫瘍効果は認められなかったが、OVA発現KALA-MENDにおいては、未処理マウスと比較して優位な抗腫瘍増殖効果が認められた。従って、KALA-MENDは、腫瘍ができた後に投与しても抗腫瘍効果が得られることが明らかとなった。
　本発明により提供される脂質膜構造体は樹状細胞を含む免疫細胞などの任意の細胞の核内に効率的に移行することができ、核内において封入された核酸などの物質を効率的に放出して該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させることができること、さらには、効率的なアジュバント効果も発揮することができることから、所望のポリペプチドに対して有効な免疫療法を行うことができるという特徴がある。

Claims (15)

  1. 細胞の核内に物質を送達するための脂質膜構造体であって、脂質膜が下記の(a)及び／又は(b)のポリペプチド：
    (a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    (b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進する活性を有するポリペプチド
    で修飾された脂質膜構造体。
  2. 脂質膜構造体がリポソームである請求項１に記載の脂質膜構造体。
  3. 細胞が免疫細胞である請求項１又は２に記載の脂質膜構造体。
  4. 上記(a)及び／又は(b)のポリペプチドが疎水性基で修飾されており、前記疎水性基が脂質膜に挿入された請求項１ないし３のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
  5. 連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチドを表面に有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
  6. ポリアルキレングリコールを表面に有する請求項１ないし５のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
  7. 免疫細胞表面に提示すべき抗原ポリペプチドをコードする核酸を該細胞の核内に導入するために用いる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
  8. 送達すべき物質が内部に封入された請求項１ないし７のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
  9. 内部に核酸及びカチオン性ポリマーが封入された請求項８に記載の脂質膜構造体。
  10. 送達すべき物質が免疫細胞表面に提示すべき抗原ポリペプチドをコードする核酸である請求項８又は９に記載の脂質膜構造体。
  11. 上記抗原ポリペプチドに対する免疫療法に用いるための請求項１０に記載の脂質膜構造体。
  12. 該核酸がDNAであり、該DNAがCpGを含まないDNAである請求項１０又は１１に記載の脂質膜構造体。
  13. 請求項８ないし１２のいずれか１項に記載の脂質膜構造体を有効成分として含む医薬組成物。
  14. 悪性腫瘍の予防及び／又は治療のために用いる請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 細胞の核内への脂質膜構造体の移行を促進するために用いるポリペプチドであって、下記の(a)及び／又は(b)のポリペプチド：
    (a)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    (b)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
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