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WO2018124155A1 - 条件付きノックアウト動物の製造方法 - Google Patents

条件付きノックアウト動物の製造方法 Download PDF

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WO2018124155A1
WO2018124155A1 PCT/JP2017/046837 JP2017046837W WO2018124155A1 WO 2018124155 A1 WO2018124155 A1 WO 2018124155A1 JP 2017046837 W JP2017046837 W JP 2017046837W WO 2018124155 A1 WO2018124155 A1 WO 2018124155A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chromosome
animal
recombinase
human animal
recombinase recognition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/046837
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
出穂 畑田
拓郎 堀居
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gunma University NUC
Original Assignee
Gunma University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gunma University NUC filed Critical Gunma University NUC
Priority to JP2018559561A priority Critical patent/JP7007734B2/ja
Priority to US16/474,232 priority patent/US11464216B2/en
Publication of WO2018124155A1 publication Critical patent/WO2018124155A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a conditional knockout animal and related techniques.
  • the function of a gene can be estimated by preparing an individual in which the gene has been destroyed (knocked out) and comparing the phenotype with a normal individual. Mice have relatively similar gene functions to humans and are easy to handle, so many knockout mice have been created and used for gene function analysis. However, if the gene functions throughout the body and its role is important, normal knockout of the gene results in fetal lethality (it does not die during fetal life) Can not do. A method developed to solve this is conditional knockout. In conditional knockout, genes can be knocked out in a tissue-specific or time-specific manner, so that fetal lethality is not caused, and gene function analysis in individuals born has become possible.
  • a Cre / loxP system or a Flp / FRT system is used as a method for producing a conditional knockout mouse.
  • Cre / loxP system for example, first, a sequence consisting of 34 bases called loxP is placed in the intron part (region that does not encode protein) at both ends of the exon (region that encodes protein) of the gene to be knocked out. Insert so that it is placed in the direction. The state where an exon is sandwiched between two loxPs is called Flox (Flanked loxP). At this stage, the exon is not destroyed and the gene functions normally.
  • conditional knockout mice For the production of conditional knockout mice, conventionally, homologous recombinant ES cells in which loxP is introduced into the chromosome using ES cells and targeting cassettes are established, and then introduced into the early embryo of the mouse to produce a chimeric mouse, Furthermore, it has been carried out by a complicated work of mating to obtain offspring.
  • genome editing technologies such as CRISPR / Cas
  • two loxPs can be introduced into the chromosome of a fertilized egg in one step, and a Flox mouse can be produced in a short time (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Hui Yang, et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR / Cas mediated genome engineering. Cell. 2013 Sep 12; 154 (6): 1370-1379.
  • Nakagawa Y, et al. Hyperlipidemia and hepatitis in liver-specific CREB3L3 knockout mice generated using a one-step CRISPR / Cas9 system. Sci Rep. 2016 Jun 13; 6: 27857.
  • Yoshiko Nakagawa, et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biology Open 2016 5: 1142-1148.
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a conditional knockout animal and related technology (such as an efficient method for producing a Flox animal).
  • the inventors of the present invention have the main cause of low Flox efficiency by the above-described technique. I thought it was going to happen.
  • the present inventors have found that high Flox efficiency can be obtained by introducing two loxPs into chromosomes at different timings (ie, divided into two steps), and have completed the present invention.
  • step (A) a step of introducing a first recombinase recognition sequence onto the chromosome of a non-human animal cell;
  • step (B) After the step (A), introducing a second recombinase recognition sequence onto the chromosome of the animal cell;
  • step (C) After the step (B), obtaining a transformed non-human animal in which the first and second recombinase recognition sequences are introduced onto the chromosome from the animal cell;
  • a method for producing a transformed non-human animal comprising: The method, wherein the first and second recombinase recognition sequences are base sequences that cause recombination between them and are introduced so as to sandwich the target site on the chromosome.
  • the method wherein the first and second recombinase recognition sequences are loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, or gix.
  • the method wherein the recombinase is Cre, VCre, SCre, Dre, FLP, R, or Gin.
  • the aforementioned method wherein the introduction of the first and second recombinase recognition sequences is carried out by the CRISPR / Cas method, the TALEN method, or the ZFN method.
  • Said method wherein the introduction of the first and second recombinase recognition sequences is carried out by electroporation.
  • the method wherein the introduction of the first and second recombinase recognition sequences is performed by a microinjection method.
  • the method wherein the steps (A) and (B) are performed on a fertilized egg or embryo.
  • the method wherein the step (A) is performed on a fertilized egg and the step (B) is performed on a two-cell stage embryo.
  • the method wherein the transformed non-human animal is a monkey, chimpanzee, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, horse, cow, sheep, goat, pig, dog, or cat.
  • the method wherein the target site is a site containing an exon of a target gene.
  • a conditional chromosome-modified non-human animal wherein the non-human animal cell is a non-human animal cell that conditionally expresses the recombinase, and a conditional chromosome-modified non-human animal is obtained by the steps (A) to (C).
  • the method which is a manufacturing method of [12] A method for producing a conditional chromosome-modified non-human animal comprising the following steps (X) and (Y): (X) obtaining the transformed non-human animal by the method; (Y) A step of mating the transformed non-human animal with a non-human animal that conditionally expresses the recombinase to obtain a conditional chromosome-modified non-human animal.
  • the non-human animal that conditionally expresses the recombinase is a non-human animal that expresses the recombinase in a tissue-specific or time-specific manner, or a non-human animal that expresses a recombinase that functions under specific conditions. .
  • the method for producing a transformed animal cell of the present invention includes a step of introducing first and second recombinase recognition sequences onto the chromosome of the animal cell.
  • a method for producing an animal cell wherein the introduction of the first and second recombinase recognition sequences is performed at different timings (ie, divided into two steps).
  • the transformed animal cell produced by the same method is also referred to as “animal cell of the present invention”. In this method, it is assumed that the first recombinase recognition sequence is introduced first and the second recombinase recognition sequence is introduced later.
  • step (A) the step of introducing the first recombinase recognition sequence
  • step (B) the step of introducing the second recombinase recognition sequence
  • the method for producing a transformed animal cell of the present invention is, in other words, a method for producing a transformed animal cell including the following steps (A) and (B): (A) introducing a first recombinase recognition sequence onto the chromosome of an animal cell; (B) A step of introducing a second recombinase recognition sequence onto the chromosome of the animal cell after the step (A).
  • a transformed animal can be obtained from the obtained transformed animal cell.
  • the method for producing a transformed animal of the present invention is a method for producing a transformed animal, comprising the steps of producing transformed animal cells by the above-described method and obtaining the transformed animal from the transformed animal cells.
  • the transformed animal produced by the same method is also referred to as “transformed animal of the present invention”.
  • the step of obtaining a transformed animal from the transformed animal cell is also referred to as “step (C)” or “step C”.
  • the method for producing a transformed animal of the present invention is, in other words, a method for producing a transformed animal comprising the following steps (A) to (C): (A) introducing a first recombinase recognition sequence onto the chromosome of an animal cell; (B) After the step (A), introducing a second recombinase recognition sequence onto the chromosome of the animal cell; (C) A step of obtaining a transformed animal from the animal cell after the step (B).
  • the animal cell of the present invention and the animal of the present invention are collectively referred to as “transformant of the present invention”.
  • the animal type is not particularly limited as long as it is a non-human animal (non-human animal).
  • the non-human animal can be appropriately selected according to various conditions such as the use of the transformant of the present invention.
  • Non-human animals include non-human mammals, birds, reptiles, amphibians, fish and insects.
  • Non-human animals include in particular non-human mammals.
  • Non-human mammals include primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, and various other non-human mammals such as rabbits, horses, cows, sheep, goats, pigs, dogs and cats. Is mentioned.
  • Animal cells refer to animal cells.
  • the cell type is not particularly limited.
  • the cells can be appropriately selected according to various conditions such as the use of the transformant of the present invention.
  • the cell may be a single cell or a multi-cell.
  • Examples of the cells include fertilized eggs (undivided fertilized eggs), embryos, blastocysts, stem cells, somatic cells, and germ cells.
  • Examples of embryos include 2-cell stage embryos and embryos thereafter.
  • the type of cell for performing each step is not particularly limited as long as the transformant of the present invention is obtained.
  • the cell type can vary with the progress of each step, for example.
  • the process B may be performed after performing the process A and before the cell divides, or may be performed after the cell divides.
  • Step B may be performed after performing Step A, particularly after the cell has undergone one or more cell divisions, and more particularly after the cell has undergone one cell division.
  • a fertilized egg and an embryo are mentioned especially, and a fertilized egg is mentioned especially.
  • a fertilized egg and an embryo are mentioned especially, and an embryo is mentioned especially.
  • step A may be performed on a fertilized egg and step B may be performed on an embryo.
  • step A may be performed on a fertilized egg, and step B may be performed on a two-cell stage embryo.
  • the cells for performing Step C include cells that can directly develop into individual animals, and more particularly fertilized eggs, embryos, and blastocysts.
  • the first and second recombinase recognition sequences are introduced so as to sandwich the target site on the chromosome. That is, the second modified chromosome has the first and second recombinase recognition sequences and a site (target site) sandwiched between them. Similarly, the second transformed animal cell (animal cell of the present invention) and the animal of the present invention have the first and second recombinase recognition sequences on the chromosome and the site (target site) sandwiched between them. Have.
  • the target site is a site to be modified by recombinase in a conditional chromosome-modified animal described later.
  • the target site is not particularly limited.
  • part can be suitably set according to various conditions, such as a use of the transformant of this invention.
  • the target site include sites containing part or all of the gene.
  • the gene include a gene (target gene) for which conditional knockout is desired.
  • Examples of the gene include exons, introns, expression control sequences (promoter, etc.). Part of the gene is in particular an exon.
  • the target site may include, for example, part or all of one gene, and may include part or all of two or more genes. In addition, the target site may include, for example, one site selected from a part of these genes, or may include two or more sites.
  • the first and second recombinase recognition sequences are respectively introduced at both ends of the target site on the chromosome. Specifically, for example, by introducing the first and second recombinase recognition sequences into introns at both ends of the exon, the first and second recombinase recognition sequences can be introduced so as to sandwich the exon. .
  • the first and second recombinase recognition sequences may be arranged in the same direction on the chromosome, or may be arranged in the reverse direction on the chromosome.
  • the first and second recombinase recognition sequences are base sequences in which recombination causes recombination between them.
  • the first and second recombinase recognition sequences are not particularly limited as long as recombinase causes recombination between them.
  • the recombinase (recombinase that causes recombination between the first and second recombinase recognition sequences) is also referred to as “recombinase corresponding to the first and second recombinase recognition sequences”.
  • the recombinase causes recombination between the first and second recombinase recognition sequences means that the first and second recombinase recognition sequences are recognized by the corresponding recombinases and are thus sandwiched between them ( The target site) is altered.
  • modification of the target site include target site deletion and inversion.
  • the modification of the target site includes, in particular, a defect in the target site.
  • a target site can be lost.
  • the target site can be inverted.
  • Recombination systems include Cre / loxP system (B Sauer, Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol .: 1987, 7 (6); 2087-96.
  • Gin / gix system S Maeser, R Kahmann, The Gin recombinase of phage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. Mol. Gen. Genet .: 1991, 230 (1-2); 170-6.).
  • examples of the recombinase recognition sequence include loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, and gix.
  • examples of the recombinase include Cre, VCre, SCre, Dre, FLP, R, and Gin corresponding to loxP, VloxP, SloxP, rox, FRT, RS, and gix, respectively.
  • Table 1 shows the base sequences of these recombinase recognition sequences.
  • the recombinase recognition sequence consisting of the base sequence shown in Table 1 is also referred to as “wild-type recombinase recognition sequence”.
  • the recombinase recognition sequence generally comprises an inverted repeat sequence at both ends and a spacer region sandwiched between them, and the spacer region defines the direction of the recombinase recognition sequence.
  • loxP consists of a 13 bp reverse repeat sequence at each end and an 8 bp spacer region sandwiched between them.
  • the first and second recombinase recognition sequences are aligned in the same direction on the chromosome means that the spacer regions of the recombinase recognition sequences are directed in the same direction on the chromosome.
  • the first and second recombinase recognition sequences are aligned in the reverse direction on the chromosome means that the spacer regions of these recombinase recognition sequences are directed in the reverse direction on the chromosome.
  • the recombinase recognition sequence may be a variant of the base sequence exemplified above as long as recombination causes recombination between the first and second recombinase recognition sequences.
  • the variant of the recombinase recognition sequence is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or the base sequence exemplified above, or It may consist of a base sequence having 97% or more identity.
  • the variant of the recombinase recognition sequence may be composed of, for example, a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted, and / or added in the base sequence exemplified above. “One or several” means, for example, 1 to 15, 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3 There may be 1-2, or one.
  • loxP variants include lox66, lox71, lox511, lox2272, loxFAS, lox RE, and lox LE.
  • VloxP variants include Vlox2272, VloxM1, VloxM2, Vlox43R, and Vlox43L.
  • SloxP variants include Slox2272, SloxM1, SloxV1R, and SloxV1L. Table 2 shows the base sequences of these variants.
  • the recombinase recognition sequence identified by the above-exemplified name is not limited to the wild-type recombinase recognition sequence exemplified above, and includes variants thereof. That is, for example, the term “loxP” is not limited to wild-type loxP (loxP of SEQ ID NO: 13) but also includes loxP variants such as lox66, lox71, lox511, lox2272, loxFAS, lox RE, and lox LE.
  • “Introducing a recombinase recognition sequence into a chromosome” is not limited to the case where a base sequence consisting of the base sequence of the recombinase recognition sequence as exemplified above is introduced into a chromosome, but a base sequence containing these base sequences is introduced into a chromosome. Including the case. That is, for example, even when a sequence obtained by adding a desired sequence such as a restriction enzyme recognition site to the base sequence of the recombinase recognition sequence as exemplified above is introduced into the chromosome, “the recombinase recognition sequence is introduced into the chromosome”. Included in that.
  • the first and second recombinase recognition sequences may or may not consist of the same base sequence as long as recombinase causes recombination between them.
  • a single base sequence selected from the group consisting of any wild-type recombinase recognition sequence and variants thereof can be commonly used as the first and second recombinase recognition sequences.
  • a single base sequence selected from loxP wild type loxP and variants thereof
  • loxP wild type loxP and variants thereof
  • two types of base sequences selected from the group consisting of any wild type recombinase recognition sequence and variants thereof can be used as the first and second recombinase recognition sequences.
  • two base sequences selected from loxP wild type loxP and variants thereof
  • loxP wild type loxP and variants thereof
  • a combination in which recombinase causes recombination between them is appropriately selected.
  • all loxPs wild-type loxP and variants thereof are recognized by Cre, but this does not mean that recombination occurs with Cre for any combination of loxPs.
  • loxP when loxP is used as the first and second recombinase recognition sequences, a combination of loxP that causes recombination by Cre is appropriately selected.
  • Cre recombination occurs between recombinase recognition sequences consisting of identical base sequences such as wild-type loxPs or lox2272s.
  • recombination by Cre does not occur between loxP and lox2272 (Experimental Medicine November 2014 issue Vol.32 No.18).
  • Specific examples of combinations of recombinase recognition sequences composed of different base sequences that cause recombination by Cre include the combination of lox66 and lox71.
  • Step A is a step of introducing the first recombinase recognition sequence onto the chromosome of the animal cell.
  • performing Step A is also referred to as, for example, “performing step A for animal cells” or “performing step A for chromosomes”.
  • step A a chromosome into which the first recombinase recognition sequence has been introduced (that is, a chromosome having the first recombinase recognition sequence) is generated.
  • the chromosome (the chromosome generated by the process A) is also referred to as “first modified chromosome”. That is, step A may be more specifically a step of introducing a first recombinase recognition sequence onto the chromosome of an animal cell to generate a first modified chromosome.
  • step A animal cells in which the first recombinase recognition sequence is introduced on the chromosome (that is, animal cells having the first recombinase recognition sequence on the chromosome), in other words, the first modified chromosome Animal cells that retain The animal cell (animal cell produced by the step A) is also referred to as “first transformed animal cell”. That is, step A may be more specifically a step of introducing a first recombinase recognition sequence onto the chromosome of an animal cell to generate a first transformed animal cell.
  • the “first modified chromosome” is not limited to the chromosome itself in which the first recombinase recognition sequence has been introduced in Step A as long as it has the first recombinase recognition sequence, and is replicated from the chromosome after the introduction. Chromosomes generated through such processes are also included. For example, when a first transformed animal cell divides to give rise to a daughter cell that holds the daughter chromosome of the first modified chromosome, the daughter chromosome also falls under the “first modified chromosome”.
  • the “first transformed animal cell” is not limited to the animal cell itself in which the introduction of the first recombinase recognition sequence has occurred on the chromosome in step A as long as it retains the first modified chromosome. Also included are cells that have been produced from the animal cells through a process such as cell division after the introduction. For example, when the first transformed animal cell divides to give rise to a daughter cell that retains the daughter chromosome of the first modified chromosome, the daughter cell also corresponds to the “first transformed animal cell”.
  • Step B is a step of introducing a second recombinase recognition sequence onto the chromosome after Step A. More specifically, Step B is a step of introducing a second recombinase recognition sequence onto the chromosome of the animal cell after Step A. Step B is performed after step A.
  • the “chromosome” in the process B refers to a chromosome that has been subjected to the process A and that has undergone the process A.
  • the “chromosome” in step B is a chromosome into which the first recombinase recognition sequence has been introduced in step A, in other words, the first modified chromosome, and more specifically, the first chromosome It is the 1st modified chromosome which a transformed animal cell hold
  • the “animal cell” in step B refers to an animal cell that has been subjected to step A and that has been subjected to step A. That is, the “animal cell” in step B is an animal cell having the first recombinase recognition sequence introduced into the chromosome in step A, in other words, the first transformed animal cell.
  • the step B is a step of introducing the second recombinase recognition sequence onto the first modified chromosome, and more specifically, the first modified chromosome retained by the first transformed animal cell. This is a step of introducing a second recombinase recognition sequence on the top.
  • performing step B is, for example, “performing step B on animal cells (specifically, first transformed animal cell)” or “chromosome (specifically, first modified chromosome). It is also referred to as “performing step B”.
  • Step B a first modified chromosome into which the second recombinase recognition sequence is further introduced (that is, a chromosome having the first and second recombinase recognition sequences) is generated.
  • the chromosome (the chromosome generated by the process B) is also referred to as “second modified chromosome”. That is, step B may be more specifically a step of introducing a second recombinase recognition sequence onto the first modified chromosome to generate a second modified chromosome.
  • step B an animal cell in which a second recombinase recognition sequence is further introduced on the first modified chromosome (that is, an animal cell having the first and second recombinase recognition sequences on the chromosome), In other words, animal cells that retain the second modified chromosome are generated.
  • the animal cell (animal cell produced by the process B) is also referred to as “second transformed animal cell”.
  • the second transformed animal cell is “an animal cell of the present invention”. That is, step B is more specifically a step of introducing a second recombinase recognition sequence onto the first modified chromosome to generate a second transformed animal cell (animal cell of the present invention). Also good.
  • the “second modified chromosome” is not limited to the chromosome itself in which the second recombinase recognition sequence was introduced in step B as long as it has the first and second recombinase recognition sequences. Chromosomes generated from a chromosome through a process such as replication are also included. For example, when the second transformed animal cell divides to give rise to a daughter cell that holds the daughter chromosome of the second modified chromosome, the daughter chromosome also corresponds to the “second modified chromosome”.
  • the “second transformed animal cell” is not limited to the animal cell itself in which the second recombinase recognition sequence has been introduced onto the chromosome in Step B as long as it retains the second modified chromosome. Also included are cells that have been produced from the animal cells through a process such as cell division after the introduction. For example, when a second transformed animal cell undergoes cell division to produce a daughter cell that retains the daughter chromosome of the second modified chromosome, the daughter cell also falls under the “second transformed animal cell”.
  • the animal cells of the present invention can be obtained by carrying out steps A and B.
  • the animal cell of the present invention may be heterozygous or homozygous for the second modified chromosome.
  • the animal cell of the present invention is composed of a plurality of cells
  • the animal cell of the present invention is a mosaic of the second modified chromosome (that is, a cell having the second modified chromosome in heterogeneity, the second modified chromosome).
  • Step C is a step of obtaining a transformed animal from the animal cell after Step B.
  • Step C is performed after step B.
  • the “animal cell” referred to in Step C refers to an animal cell that has been subjected to Steps A and B and has been subjected to Steps A and B. That is, the “animal cell” referred to in step C is an animal cell into which the first and second recombinase recognition sequences have been introduced on the chromosome in steps A and B. In other words, the second transformed animal cell It is. In other words, step C is a step of obtaining a transformed animal from the second transformed animal cell.
  • Step C is also referred to as, for example, “Performing Step C on an animal cell (specifically, a second transformed animal cell)”.
  • Step C an animal having the first and second recombinase recognition sequences on the chromosome, in other words, an animal holding the second modified chromosome can be obtained.
  • the animal (the animal obtained by Step C) is the “animal of the present invention”. That is, step C may be a step of obtaining the animal of the present invention from the second transformed animal cell more specifically.
  • the “animal of the present invention” is not limited to the individual animal directly generated from the second transformed animal cell in Step C as long as it retains the second modified chromosome, but is mated, bred and cloned from the individual. Individuals generated through such processes are also included.
  • the animals of the present invention can be obtained by carrying out steps A to C.
  • the animal of the present invention may be heterozygous or homozygous for the second modified chromosome.
  • an individual animal that is homozygous for the second modified chromosome can be appropriately obtained.
  • parents that are heterozygotes for the second modified chromosome can be mated and individuals that are homozygous for the second modified chromosome can be selected from the born children.
  • the animal of the present invention may be mosaic with respect to the second modified chromosome.
  • the animal of the present invention is mosaic with respect to the second modified chromosome
  • it is suitably not an mosaic with respect to the second modified chromosome (specifically, an animal individual that is heterozygous or homozygous for the second modified chromosome)
  • an animal individual that is heterozygous or homozygous for the second modified chromosome can be obtained.
  • a parent that is a mosaic for the second modified chromosome and a parent of the same type of wild type can be mated, and those that are heterozygous for the second modified chromosome can be selected from the offspring.
  • the fact that the transformant of the present invention retains the second modified chromosome can be confirmed, for example, by a known method for determining the chromosome structure. Examples of such methods include base sequence analysis of the region into which the first and second recombinase recognition sequences are introduced, and determination of the size of the PCR amplified fragment in the region into which the first and second recombinase recognition sequences are introduced. It is done.
  • the fact that the transformant of the present invention retains the second modified chromosome can be specifically confirmed by, for example, the technique described in the Examples.
  • the means for introducing the recombinase recognition sequence into the chromosome is not particularly limited as long as the recombinase recognition sequence can be introduced into a predetermined portion of the chromosome.
  • Introduction of the recombinase recognition sequence can be performed, for example, by a known site-specific genome editing method.
  • site-specific genome editing methods include methods using various nucleases. Specifically, CRISPR / Cas (CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat, Cas: CRISPR-associated protein) method, TALEN (transcription-activator like effector nuclease) method, ZFN (Zinc finger nuclease) Law. In these methods, Cas, TALEN, and ZFN are used as nucleases, respectively.
  • the CRISPR / Cas method can be performed using, for example, Cas, guide RNA (gRNA), and donor DNA.
  • Cas includes Cas9 and Cpf1.
  • the CRISPR / Cas method using Cas9 as Cas is also referred to as “CRISPR / Cas9 method”, and the CRISPR / Cas method using Cpf1 as Cas is also referred to as “CRISPR / Cpf1 method”.
  • the guide RNA can be appropriately designed so that the recombinase recognition sequence can be introduced into a predetermined position of the chromosome.
  • crRNA and tracrRNA can be used in combination. In the case of Cpf1, crRNA can be used alone as a guide RNA.
  • the TALEN method can be performed using, for example, TALEN and donor DNA.
  • TALEN includes a TAL effector that is a module that recognizes a specific base sequence, and the TAL effector can be designed as appropriate so that a recombinase recognition sequence can be introduced at a predetermined location on the chromosome.
  • the ZFN method can be performed using, for example, ZFN and donor DNA.
  • ZFN has a zinc finger domain that is a module for recognizing a specific base sequence, and the zinc finger domain can be appropriately designed so that a recombinase recognition sequence can be introduced into a predetermined position of a chromosome.
  • the nuclease may be a wild-type nuclease or a variant thereof.
  • the variant is not particularly limited as long as the recombinase recognition sequence can be introduced into a predetermined position of the chromosome.
  • Cas9 variants include Cas9 (D10A) and Cas9 (H840A), which function as nickases.
  • nickase is used in the CRISPR / Cas method, two types of guide RNAs can be used in combination.
  • variants of TALEN include Platinum TALEN (Sakuma T, et. Al., (2013) Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. Sci Rep 3: 3379.) or GoldyTALEN ( Bedell VM, et al., In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 2012 Nov 1; 491 (7422): 114-8.).
  • Donor DNA is DNA containing a recombinase recognition sequence.
  • the recombinase recognition sequence can be integrated on the chromosome by homologous recombination repair using donor DNA.
  • Donor DNA can be selected according to various conditions such as the type of selected method.
  • the donor DNA may be linear or circular.
  • the donor DNA may be single-stranded or double-stranded.
  • the donor DNA may be, for example, a single-stranded linear DNA.
  • the recombinase recognition sequence can be introduced by introducing a necessary substance in accordance with the selected technique into the cell.
  • necessary substances include nuclease, RNA such as gRNA, and donor DNA.
  • necessary substances include nuclease and donor DNA.
  • the nuclease may be introduced directly into the cell, for example, or indirectly introduced into the cell by being expressed in the cell.
  • a nuclease-encoding mRNA or a nuclease-encoding vector can be introduced into a cell, and the nuclease can be expressed from the mRNA or the vector.
  • RNA such as gRNA may be directly introduced into a cell, for example, or may be indirectly introduced into a cell by being expressed in the cell.
  • a vector encoding RNA such as gRNA can be introduced into a cell, and RNA such as gRNA can be expressed from the vector.
  • donor DNA may be introduced directly into cells, for example.
  • the DNA used may be single-stranded or double-stranded.
  • PCR fragments, synthetic oligos, and vectors may be used.
  • the vector include a plasmid vector and a virus vector.
  • the necessary items When expressing two or more kinds of necessary items from a vector, the necessary items may be encoded together in a single vector or may be encoded separately in a plurality of vectors.
  • the vector may also serve as donor DNA.
  • RNAs and vectors encoding them (hereinafter, collectively referred to as “required products”), commercially available products may be used if available, or those produced appropriately may be used. Good.
  • Nucleases can be produced, for example, using heterologous protein expression systems or cell-free protein expression systems.
  • RNA such as mRNA and gRNA can be produced, for example, by chemical synthesis or in vitro transcription.
  • Donor DNA can be produced, for example, by chemical synthesis or PCR amplification.
  • a vector encoding RNA such as nuclease or gRNA can be produced by, for example, chemical synthesis or cloning.
  • transduction of a required thing etc. can be implemented by the well-known method of introduce
  • specific examples of such a technique include an electroporation method, a microinjection method, and a lipofection method.
  • the vector can be introduced into a cell by infecting the cell with the vector.
  • examples of such a method include an electroporation method and a microinjection method.
  • an electroporation method can be mentioned.
  • the success rate of the method of the present invention can be improved as compared with the case of using another method such as a microinjection method.
  • Examples of improving the success rate of the method of the present invention include improvement of cell viability and improvement of introduction efficiency of the first and second recombinase recognition sequences.
  • the means for obtaining the animal of the present invention from the second transformed animal cell is not particularly limited.
  • “Obtaining an animal from a cell” specifically refers to generating an individual animal from a cell.
  • Generation of individual animals from cells can be performed, for example, by a known technique.
  • a cell is a cell that can directly develop into an animal individual such as a fertilized egg, embryo, or blastocyst
  • an animal individual can be directly generated from the cell.
  • an animal individual can be obtained as a litter by transplanting the cells to a pseudopregnant mother and generating and giving birth.
  • animal individuals can be generated by cloning from cells such as stem cells and somatic cells.
  • conditional chromosome modified animal is obtained by mating the transformed animal of the present invention with a conditional recombinase expressing animal. That is, the method for producing a conditional chromosomally modified animal of the present invention includes a step of obtaining a transformed animal of the present invention by the above method, and a step of mating the obtained transformed animal with a conditional recombinase-expressing animal.
  • a method for producing a chromosome-modified animal The conditional chromosome-modified animal produced by the same method is also referred to as “conditional chromosome-modified animal of the present invention”.
  • the method for producing a conditional chromosome-modified animal of the present invention is, in other words, a method for producing a conditional chromosome-modified non-human animal including the following steps (X) and (Y): (X) performing the steps (A) to (C) to obtain a transformed non-human animal from the animal cells; (Y) A step of mating the transformed animal with a conditional recombinase-expressing animal to obtain a conditional chromosome-modified non-human animal.
  • Step (Y) is a step of mating the animal of the present invention with a conditional recombinase-expressing animal.
  • performing the step (Y) is also referred to as “performing the step (Y) on an animal (specifically, the animal of the present invention)”, for example.
  • “Conditional recombinase-expressing animal” refers to an animal that conditionally expresses recombinase corresponding to the first and second recombinase recognition sequences.
  • the recombinase corresponding to each recombinase recognition sequence is as described above.
  • the recombinase may be a wild-type recombinase or a variant thereof.
  • the variant is not particularly limited as long as it can recombine between the first and second recombinase recognition sequences.
  • Cre-ER is mentioned as a variant of Cre.
  • conditional recombinase-expressing animals include animals that express tissue-specific or time-specific recombinases. Expression of the recombinase in a tissue-specific or time-specific manner can be achieved, for example, by expressing the recombinase under the control of a tissue-specific promoter or a time-specific promoter. That is, examples of animals that express tissue-specific or time-specific recombinase include animals having a tissue-specific promoter or a recombinase gene that is expressed under the control of a time-specific promoter.
  • conditional recombinase expressing animals include animals that express recombinases that function under specific conditions.
  • recombinases that function under specific conditions include Cre-ER, which is a variant of Cre. Cre-ER is a fusion protein of Cre and a mutant estrogen receptor, which is normally present in the cytoplasm, but translocates into the nucleus by binding to the estrogen derivative tamoxifen and causes loxP recombination. That is, Cre-ER is a recombinase that functions in the presence of tamoxifen.
  • conditional recombinase-expressing animal a commercially available product may be used when available, or an appropriately produced animal may be used.
  • Conditional recombinase-expressing animals include, for example, knocking in a recombinase gene at the start codon site of a tissue-specific or time-specific expression gene, or a recombinase gene connected downstream of a tissue-specific promoter or a time-specific promoter. Can be produced by knocking in. Gene knock-in can be performed by a conventional method.
  • a conditional recombinase-expressing animal can be produced, for example, by knocking in a recombinase that functions under specific conditions so that it can be expressed.
  • transgenic animal of a construct in which a recombinase gene is connected downstream of a tissue-specific or time-specific transcription control sequence or a transgenic animal of a recombinase construct that functions under specific conditions may be used.
  • step (Y) By performing step (Y), the recombinase functions under conditions such as drug-induced, tissue-specific or time-specific, thereby modifying the target site on the chromosome. That is, by performing the step (Y), specifically, an animal is obtained in which the target site on the chromosome is conditionally modified, or the target site on the chromosome is conditionally modified.
  • the animal the animal obtained by the step (Y)
  • the animal is a “conditional chromosome-modified animal of the present invention”. That is, step (Y) may be more specifically a step of mating the animal of the present invention with a conditional recombinase-expressing animal to obtain the conditional chromosome-modified animal of the present invention.
  • Target site modifications include target site defects and inversions.
  • the gene can be disrupted (knocked out).
  • the gene can be destroyed by modifying the target site. That is, examples of conditional chromosome-modified animals include conditional gene disrupted animals (conditional gene knockout animals).
  • the “conditional chromosome-modified animal of the present invention” is modified so that the recombinase functions under certain conditions (that is, the target site on the chromosome is conditionally modified, or the target site on the chromosome is As long as it is conditionally modified), it is not limited to the individual animal directly produced by the mating of the animal of the present invention and the conditional recombinase expressing animal in step (Y), but the process of mating, breeding, cloning, etc. from the individual Also included are individuals produced through
  • conditional chromosome-modified animal of the present invention can be obtained by carrying out steps (A) to (C) and (Y).
  • conditional chromosome-modified animal of the present invention can be obtained without performing the step (Y) by performing the steps (A) to (C) on the cells of the conditional recombinase-expressing animal. That is, in one embodiment, the animal of the present invention may be synonymous with the conditional chromosome-modified animal of the present invention.
  • the animal cell (the animal cell in which the steps (A) to (C) are performed) is a conditional recombinase-expressing animal cell, and the step (A It may be a method for producing a conditional chromosome-modified animal, in which a conditional chromosome-modified animal is obtained by () to (C).
  • conditional chromosome-modified animal cells can also be obtained from the conditional chromosome-modified animal of the present invention.
  • conditional chromosome-modified animal and its cells can be used, for example, for functional analysis of target sites (for example, genes) on chromosomes.
  • Cas9, gRNA, and ssODN Cas9 was a commercially available recombinant protein (Thermo Fisher Scientific).
  • RNAs having the base sequences shown in Table 3 were synthesized for the MeCP2 gene and the Tet3 gene.
  • the underline indicates the binding site with the chromosome.
  • the synthesis of gRNA was performed according to a method using a synthetic oligo DNA as a template or a method using a DNA amplified by PCR from a gRNA vector as a template (Horii et al., Int J Mol Sci. 14: 19774-81, 2013). .
  • MEGAshortscript T7 Kit Thermo Fisher Fisher Scientific
  • purification was performed using MEGAclear Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • ssODN single-stranded oligodeoxynucleotide
  • DNA consisting of base sequences including loxP shown in Table 4 was synthesized for MeCP2 gene and Tet3 gene.
  • capital letters indicate loxP sequences, and bold underlines indicate foreign restriction enzyme sites.
  • MeCP2-L2-lox66 and MeCP2-R1-lox71 for the MeCP2 gene include lox66 and lox71, respectively.
  • Tet3Ex8-2loxPL and Tet3Ex9-3loxPR for the Tet3 gene contain loxP in common.
  • a Cas9 / gRNA / ssODN solution (a solution containing Cas9, gRNA and ssODN) was prepared as follows immediately before introduction, and this was used as a reference concentration. The concentration indicates the final concentration. For injection, it was diluted with RNase-free water, and for electroporation, it was diluted with Opti-MEM (Thermo-Fisher-Scientific).
  • ⁇ 1 step solution composition Cas9 nuclease 100 ng / ⁇ L gRNA1 24 ng / ⁇ L gRNA2 24 ng / ⁇ L ssODN1 400 ng / ⁇ L ssODN2 400 ng / ⁇ L
  • ⁇ 2-step solution composition > ⁇ First time> Cas9 nuclease 100 ng / ⁇ L gRNA1 24 ng / ⁇ L ssODN1 400 ng / ⁇ L ⁇ Second time> Cas9 nuclease 100 ng / ⁇ L gRNA2 24 ng / ⁇ L ssODN2 400 ng / ⁇ L
  • Electroporation A fertilized egg 24 to 27 hours after the hCG injection was used for electroporation. When performing two-step electroporation, the second electroporation was performed at 42-44 hours (2 cell stage) after hCG. In this experiment, a Cas9 / gRNA / ssODN solution stock solution was used in both the 1-step and 2-step cases.
  • the electroporator was CUY21 EDIT (BEX), and electroporation was performed under the conditions of 30 V (3 msec ON + 97 msec OFF) ⁇ 7 times pulse unless otherwise specified. Embryos that became tetraploid due to electrofusion were removed after about 30 minutes and used only in experiments after that.
  • ⁇ 1-5> In vitro culture and embryo transfer A portion of the treated embryos obtained in ⁇ 1-3> and ⁇ 1-4> above is subjected to in vitro culture until the blastocyst stage, and the incidence and genotype are tested Went. Other treated embryos were transplanted into the fallopian tubes of pseudopregnant mice at the 2-cell stage. A litter was obtained about 20 days after transplantation.
  • Genotype test DNA was extracted from the blastocyst or the tail of the litter. Using this as a template, a region containing two loxPs was amplified by PCR. The primer sets used are shown in Table 5.
  • the restriction enzyme site inserted with loxP (NheI and EcoRI for MeCP2 and BamHI and EcoRI for Tet3) can be cleaved by restriction enzyme treatment. Therefore, the PCR product was treated with a restriction enzyme and then subjected to agarose gel electrophoresis, and the presence or absence of ssODN insertion was confirmed by the length of the band. In addition, a part of MeCP2 gene and all samples of Tet3 gene were subjected to TA-cloning using PCR products, and the nucleotide sequence was confirmed.
  • FIG. 1 shows data of Flox efficiency (Flox number / blastocyst number) in the MeCP2 gene in the blastocyst stage embryo.
  • FIG. 2 shows the survival rate (number of blastocysts / number of fertilized eggs) with MeCP2 gene in blastocyst stage embryos.
  • the data of the Flox efficiency and chromosome deletion rate in the MeCP2 gene in the offspring are shown in FIG.
  • an animal having a pair of recombinase recognition sequences on a chromosome such as a Flox animal, can be efficiently produced.
  • SEQ ID NOs: 1-4 gRNA
  • SEQ ID NOs: 5 to 8 ssODN
  • SEQ ID NOs: 9 to 12 Primers for genotyping
  • SEQ ID NOs: 13 to 19 Wild type recombinase recognition sequences
  • SEQ ID NOs: 20 to 35 Variants of recombinase recognition sequences

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Abstract

条件付きノックアウト動物の製造方法およびその関連技術（効率的なFlox動物の製造方法、等）を提供する。loxP等のリコンビナーゼ認識配列を染色体上の標的部位の両端に異なるタイミングで導入することにより、Flox動物等の、染色体上にリコンビナーゼ認識配列のペアを有する動物を製造する。

Description

条件付きノックアウト動物の製造方法
　本発明は、条件付き（コンディショナル）ノックアウト動物の製造方法およびその関連技術に関する。
　遺伝子の働きは、その遺伝子を破壊（ノックアウト）した個体を作製し、正常な個体と表現型を比較することによって推定することができる。マウスは比較的ヒトと遺伝子の働きが似ており、取り扱いも容易なため、これまでに数多くのノックアウトマウスが作成され、遺伝子機能解析に利用されてきた。しかし、遺伝子が全身で機能し、且つその役割が重要である場合には、その遺伝子の通常のノックアウトでは胎生致死（胎児期に死亡して産まれてこない）となるため、個体での遺伝子機能解析を行うことができない。それを解決するために開発された方法が条件付きノックアウト（conditional knockout）である。条件付きノックアウトでは、組織特異的または時期特異的に遺伝子をノックアウトできるため、胎生致死とならず、産まれてきた個体での遺伝子機能解析が可能となる。
　条件付きノックアウトマウスの作製法として、例えば、Cre/loxPシステムやFlp/FRTシステムが利用される。最もよく利用されるCre/loxPシステムでは、例えば、まず、ノックアウトしたい遺伝子のエクソン（タンパク質をコードする領域）の両端のイントロン部分（タンパク質をコードしない領域）にそれぞれloxPという34塩基からなる配列を同方向に配置されるように挿入する。エクソンが２つのloxPに挟まれた状態をFlox（Flanked loxP）という。この段階ではエクソンは破壊されていないため、遺伝子は正常に機能する。loxPが同方向に配置されている場合、Flox染色体にCreリコンビナーゼが働くと、loxPに挟まれた領域が切り出され、欠失する。よって、Floxマウスと組織特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させれば、特定の組織でのみ遺伝子がノックアウトされた条件付きノックアウトマウスを得ることができる。
　条件付きノックアウトマウスの作製は、従来、ES細胞とターゲティングカセットを用いて染色体にloxPが導入された相同組換えES細胞を樹立し、それらをマウスの初期胚に導入してキメラマウスを作製し、さらに交配をさせて子孫を得るという煩雑な作業により行われてきた。近年、CRISPR/Casを初めとするゲノム編集技術の台頭により、受精卵の染色体を直接改変することが可能となった。これにより、例えば、２つのloxPを１ステップで受精卵の染色体に導入し、短時間でFloxマウスを作製することができる（非特許文献１～３）。
Hui Yang, et al., One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas mediated genome engineering. Cell. 2013 Sep 12; 154(6): 1370-1379. Nakagawa Y, et al., Hyperlipidemia and hepatitis in liver-specific CREB3L3 knockout mice generated using a one-step CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 2016 Jun 13;6:27857. Yoshiko Nakagawa, et al., Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biology Open 2016 5: 1142-1148.
　上述の通り、２つのloxPを１ステップで受精卵の染色体に導入し、短時間でFloxマウスを作製する技術が報告されている。しかしながら、それらの技術によるFlox効率（Flox動物が得られる効率）は低い。
　本発明は、効率的な条件付きノックアウト動物の製造方法およびその関連技術（効率的なFlox動物の製造方法、等）を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記技術によるFlox効率が低い主な原因は、染色体を同時に２箇所で切断するため、染色体の欠失が優先的に起こることであると考えた。本発明者らは、２つのloxPを相異なるタイミングで（すなわち２ステップに分けて）染色体に導入することにより、高いFlox効率が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
　下記工程
（Ａ）非ヒト動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、前記動物細胞の前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
（Ｃ）前記工程（Ｂ）の後に、前記動物細胞から前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上に導入された形質転換非ヒト動物を得る工程；
　を含む、形質転換非ヒト動物の製造方法であって：
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が、リコンビナーゼによりそれらの間で組み換えが起こる塩基配列であり、前記染色体上の標的部位を挟むように導入される、方法。
［２］
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が、loxP、VloxP、SloxP、rox、FRT、RS、またはgixである、前記方法。
［３］
　前記リコンビナーゼが、Cre、VCre、SCre、Dre、FLP、R、またはGinである、前記方法。
［４］
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、CRISPR/Cas法、TALEN法、またはZFN法により実施される、前記方法。
［５］
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、エレクトロポレーション法により実施される、前記方法。
［６］
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、マイクロインジェクション法により実施される、前記方法。
［７］
　前記工程（Ａ）および（Ｂ）が受精卵または胚に対して実施される、前記方法。
［８］
　前記工程（Ａ）が受精卵に対して実施され、前記工程（Ｂ）が２細胞期胚に対して実施される、前記方法。
［９］
　前記形質転換非ヒト動物がサル、チンパンジー、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、またはネコである、前記方法。
［１０］
　前記標的部位が、標的遺伝子のエクソンを含む部位である、前記方法。
［１１］
　前記非ヒト動物細胞が条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物の細胞であり、前記工程（Ａ）～（Ｃ）により条件付き染色体改変非ヒト動物が得られる、条件付き染色体改変非ヒト動物の製造方法である、前記方法。
［１２］
　下記工程（Ｘ）および（Ｙ）を含む、条件付き染色体改変非ヒト動物の製造方法：
（Ｘ）前記方法により前記形質転換非ヒト動物を得る工程；
（Ｙ）前記形質転換非ヒト動物と条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物を交配し、条件付き染色体改変非ヒト動物を得る工程。
［１３］
　条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物が、前記リコンビナーゼを組織特異的または時期特異的に発現する非ヒト動物、または特定の条件下で機能するリコンビナーゼを発現する非ヒト動物である、前記方法。
マウス胚盤胞期胚におけるMeCP2遺伝子でのFlox効率（Flox数／胚盤胞数）のデータを示す図。 マウス胚盤胞期胚におけるMeCP2遺伝子での生存率（胚盤胞数／受精卵数）のデータを示す図。 マウス産仔におけるMeCP2遺伝子でのFlox効率および染色体欠失率のデータを示す図。 Creリコンビナーゼを発現する受精卵を用いたFloxマウスの構築手順を示す図。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞形質転換動物細胞および形質転換動物の製造方法
　本発明の形質転換動物細胞の製造方法は、動物細胞の染色体上に第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程を含む、形質転換動物細胞の製造方法であって、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が相異なるタイミングで（すなわち２ステップに分けて）実施される、方法である。同方法により製造される形質転換動物細胞を、「本発明の動物細胞」ともいう。同方法において、第１のリコンビナーゼ認識配列の導入が先に、第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が後に実施されるものとする。以下、第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程を「工程（Ａ）」又は「工程Ａ」、第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程を「工程（Ｂ）」又は「工程Ｂ」ともいう。
　すなわち、本発明の形質転換動物細胞の製造方法は、言い換えると、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、形質転換動物細胞の製造方法である：
（Ａ）動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、前記動物細胞の前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程。
　また、得られた形質転換動物細胞から形質転換動物を得ることができる。すなわち、本発明の形質転換動物の製造方法は、前記方法により形質転換動物細胞を生成する工程、および該形質転換動物細胞から形質転換動物を得る工程を含む、形質転換動物の製造方法である。同方法により製造される形質転換動物を、「本発明の形質転換動物」ともいう。以下、形質転換動物細胞から形質転換動物を得る工程を「工程（Ｃ）」又は「工程Ｃ」ともいう。
　すなわち、本発明の形質転換動物の製造方法は、言い換えると、下記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む、形質転換動物の製造方法である：
（Ａ）動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、前記動物細胞の前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
（Ｃ）前記工程（Ｂ）の後に、前記動物細胞から形質転換動物を得る工程。
　本発明の動物細胞および本発明の動物を総称して「本発明の形質転換体」ともいう。
　動物の種類はヒト以外の動物（非ヒト動物）であれば特に制限されない。非ヒト動物は、本発明の形質転換体の用途等の諸条件に応じて適宜選択できる。非ヒト動物としては、非ヒト哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類が挙げられる。非ヒト動物としては、特に、非ヒト哺乳類が挙げられる。非ヒト哺乳類としては、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等のその他の各種非ヒト哺乳類が挙げられる。
　「動物細胞」とは、動物の細胞をいう。細胞の種類は、特に制限されない。細胞は、本発明の形質転換体の用途等の諸条件に応じて適宜選択できる。細胞は、単細胞であってもよく、多細胞であってもよい。細胞としては、受精卵（未分割の受精卵）、胚、胚盤胞、幹細胞、体細胞、生殖細胞が挙げられる。胚としては、２細胞期胚やそれ以降の胚が挙げられる。
　各工程を実施する細胞の種類は、本発明の形質転換体が得られる限り特に制限されない。細胞の種類は、例えば、各工程の進行に伴って変動し得る。例えば、工程Ｂは、工程Ａの実施後、細胞が細胞分裂する前に実施してもよく、細胞が細胞分裂した後に実施してもよい。工程Ｂは、工程Ａの実施後、特に、細胞が１回またはそれ以上細胞分裂した後に実施してよく、さらに特には、細胞が１回細胞分裂した後に実施してよい。工程Ａを実施する細胞としては、特に受精卵や胚が挙げられ、さらに特には受精卵が挙げられる。工程Ｂを実施する細胞としては、特に受精卵や胚が挙げられ、さらに特には胚が挙げられる。すなわち、具体的には、例えば、工程Ａを受精卵に対して実施し、工程Ｂを胚に対して実施してよい。また、特には、工程Ａを受精卵に対して実施し、工程Ｂを２細胞期胚に対して実施してよい。工程Ｃを実施する細胞としては、特に動物の個体へと直接発生し得る細胞が挙げられ、さらに特には受精卵、胚、胚盤胞が挙げられる。
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、染色体上の標的部位を挟むように導入される。すなわち、第２の改変染色体は、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列、ならびにそれらに挟まれた部位（標的部位）を有する。同様に、第２の形質転換動物細胞（本発明の動物細胞）および本発明の動物は、染色体上に、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列、ならびにそれらに挟まれた部位（標的部位）を有する。
　標的部位は、後述する条件付き染色体改変動物において、リコンビナーゼによる改変対象となる部位である。標的部位は、特に制限されない。標的部位は、本発明の形質転換体の用途等の諸条件に応じて適宜設定できる。標的部位としては、遺伝子の一部または全部を含む部位が挙げられる。遺伝子としては、例えば、条件付きノックアウトを希望する遺伝子（標的遺伝子）が挙げられる。遺伝子の一部としては、エクソン、イントロン、発現制御配列（プロモーター等）が挙げられる。遺伝子の一部としては、特に、エクソンが挙げられる。標的部位は、例えば、１つの遺伝子の一部または全部を含んでいてもよく、２つまたはそれ以上の遺伝子の一部または全部を含んでいてもよい。また、標的部位は、例えば、これら遺伝子の一部から選択される１つの部位を含んでいてもよく、２つまたはそれ以上の部位を含んでいてもよい。
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、染色体上の標的部位の両端にそれぞれ導入される。具体的には、例えば、エクソンの両端のイントロンに第１および第２のリコンビナーゼ認識配列をそれぞれ導入することにより、該エクソンを挟むように第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を導入することができる。
　標的部位のいずれの端に先にリコンビナーゼ認識配列を導入するか、すなわち、標的部位のいずれの端に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入するか、は特に制限されない。
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、染色体上で同方向に配置されていてもよく、染色体上で逆方向に配置されていてもよい。
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼによりそれらの間で組み換えが起こる塩基配列である。第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼによりそれらの間での組み換えが起こる限り、特に制限されない。該リコンビナーゼ（第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の間での組み換えを起こすリコンビナーゼ）を「第１および第２のリコンビナーゼ認識配列に対応するリコンビナーゼ」ともいう。「リコンビナーゼにより第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の間での組み換えが起こる」とは、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が対応するリコンビナーゼにより認識され、以て、それらに挟まれた部位（標的部位）の改変が起こることをいう。標的部位の改変としては、標的部位の欠損や逆位が挙げられる。標的部位の改変としては、特に、標的部位の欠損が挙げられる。一般的に、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上で同方向に配置されていれば標的部位の欠損が生じ得る。また、一般的に、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上で逆方向に配置されていれば標的部位の逆位が生じ得る。
　リコンビナーゼ認識配列とそれを認識するリコンビナーゼの組み合わせを「組換えシステム」ともいう。組換えシステムとしては、Cre/loxPシステム（B Sauer, Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol.: 1987, 7(6);2087-96.）、VCre/VloxPシステム（WO2010/143606）、SCre/SloxPシステム（WO2010/143606）、Dre/roxシステム（US2006-094029A1）、FLP/FRTシステム（J R Broach, et al., Recombination within the yeast plasmid 2mu circle is site-specific. Cell: 1982, 29(1);227-34.）、R/RSシステム（H Araki, et al., Molecular and functional organization of yeast plasmid pSR1. J. Mol. Biol.: 1985, 182(2);191-203.）、Gin/gixシステム（S Maeser, R Kahmann, The Gin recombinase of phage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. Mol. Gen. Genet.: 1991, 230(1-2);170-6.）が挙げられる。
　すなわち、リコンビナーゼ認識配列としては、loxP、VloxP、SloxP、rox、FRT、RS、gixが挙げられる。また、リコンビナーゼとしては、それぞれ、loxP、VloxP、SloxP、rox、FRT、RS、gixに対応する、Cre、VCre、SCre、Dre、FLP、R、Ginが挙げられる。これらリコンビナーゼ認識配列の塩基配列を表１に示す。表１に示す塩基配列からなるリコンビナーゼ認識配列を「野生型リコンビナーゼ認識配列」ともいう。リコンビナーゼ認識配列は、一般的に、両端の逆方向反復配列とそれらに挟まれたスペーサー領域からなり、スペーサー領域がリコンビナーゼ認識配列の方向を規定する。例えば、loxPは、両端のそれぞれ13 bpの逆方向反復配列とそれらに挟まれた8 bpのスペーサー領域からなる。「第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上で同方向に整列する」とは、それらリコンビナーゼ認識配列のスペーサー領域が染色体上で同方向を向いていることをいう。また、「第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上で逆方向に整列する」とは、それらリコンビナーゼ認識配列のスペーサー領域が染色体上で逆方向を向いていることをいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、リコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼにより第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の間で組み換えが起こる限り、上記例示した塩基配列のバリアントであってもよい。リコンビナーゼ認識配列のバリアントは、例えば、上記例示した塩基配列に対し、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の同一性を有する塩基配列からなるものであってよい。また、リコンビナーゼ認識配列のバリアントは、例えば、上記例示した塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列からなるものであってもよい。「１または数個」とは、例えば、１～１５個、１～１２個、１～１０個、１～８個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個であってよい。例えば、loxPのバリアントとしては、lox66、lox71、lox511、lox2272、loxFAS、lox RE、lox LEが挙げられる。VloxPのバリアントとしては、Vlox2272、VloxM1、VloxM2、Vlox43R、Vlox43Lが挙げられる。SloxPのバリアントとしては、Slox2272、SloxM1、SloxV1R、SloxV1Lが挙げられる。これらバリアントの塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記例示した名称で特定されるリコンビナーゼ認識配列は、上記例示した野生型リコンビナーゼ認識配列に限られず、それらのバリアントも包含する。すなわち、例えば、「loxP」という用語は、野生型loxP（配列番号１３のloxP）に限られず、lox66、lox71、lox511、lox2272、loxFAS、lox RE、lox LE等のloxPのバリアントも包含する。
　「リコンビナーゼ認識配列を染色体に導入する」とは、上記例示したようなリコンビナーゼ認識配列の塩基配列からなる塩基配列を染色体に導入する場合に限られず、それらの塩基配列を含む塩基配列を染色体に導入する場合も包含する。すなわち、例えば、上記例示したようなリコンビナーゼ認識配列の塩基配列に制限酵素の認識部位等の所望の配列が付加されてなる配列を染色体に導入する場合も、「リコンビナーゼ認識配列を染色体に導入する」ことに含まれる。
　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列は、リコンビナーゼによりそれらの間での組み換えが起こる限り、同一の塩基配列からなるものであってよく、そうでなくてもよい。例えば、いずれかの野生型リコンビナーゼ認識配列およびそのバリアントからなる群より選択される単一の塩基配列を第１および第２のリコンビナーゼ認識配列として共通に用いることができる。具体的には、例えば、loxP（野生型loxPおよびそのバリアント）から選択される単一の塩基配列を第１および第２のリコンビナーゼ認識配列として共通に用いることができる。また、例えば、いずれかの野生型リコンビナーゼ認識配列およびそのバリアントからなる群より選択される２種の塩基配列を第１および第２のリコンビナーゼ認識配列として用いることができる。具体的には、例えば、loxP（野生型loxPおよびそのバリアント）から選択される２種の塩基配列を第１および第２のリコンビナーゼ認識配列として用いることができる。いずれの場合にも、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列としては、適宜、リコンビナーゼによりそれらの間での組み換えが起こる組み合わせを選択する。例えば、loxP（野生型loxPおよびそのバリアント）はいずれもCreにより認識されるが、このことは、いずれのloxPの組み合わせでもCreにより組換えが起こることは意味しない。よって、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列としてloxPを用いる場合、適宜、Creにより組換えが起こるloxPの組み合わせを選択する。一般的に、野生型loxP同士やlox2272同士等の同一の塩基配列からなるリコンビナーゼ認識配列同士ではCreによる組換えが起こる。一方、loxPとlox2272との間ではCreによる組換えが起こらない（実験医学 2014年11月号 Vol.32 No.18）。Creによって組み換えが起こる相異なる塩基配列からなるリコンビナーゼ認識配列の組み合わせとして、具体的には、lox66とlox71の組み合わせが挙げられる。
　工程Ａは、動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程である。
　なお、工程Ａを実施することを、例えば、「動物細胞に対して工程Ａを実施する」または「染色体に対して工程Ａを実施する」ともいう。
　工程Ａを実施することにより、第１のリコンビナーゼ認識配列が導入された染色体（すなわち第１のリコンビナーゼ認識配列を有する染色体）が生成する。該染色体（工程Ａにより生成した染色体）を「第１の改変染色体」ともいう。すなわち、工程Ａは、より具体的には、動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入し、第１の改変染色体を生成する工程であってよい。また、工程Ａを実施することにより、染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列が導入された動物細胞（すなわち染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を有する動物細胞）、言い換えると、第１の改変染色体を保持する動物細胞が生成する。該動物細胞（工程Ａにより生成した動物細胞）を「第１の形質転換動物細胞」ともいう。すなわち、工程Ａは、より具体的には、動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入し、第１の形質転換動物細胞を生成する工程であってもよい。
　なお、「第１の改変染色体」とは、第１のリコンビナーゼ認識配列を有する限り、工程Ａで第１のリコンビナーゼ認識配列の導入が起こった染色体そのものに限られず、該導入の後に該染色体から複製等の過程を経て生じた染色体も包含される。例えば、第１の形質転換動物細胞が細胞分裂して第１の改変染色体の娘染色体を保持する娘細胞が生じた場合、該娘染色体も「第１の改変染色体」に該当する。同様に、「第１の形質転換動物細胞」とは、第１の改変染色体を保持する限り、工程Ａで染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列の導入が起こった動物細胞そのものに限られず、該導入の後に該動物細胞から細胞分裂等の過程を経て生じた細胞も包含される。例えば、第１の形質転換動物細胞が細胞分裂して第１の改変染色体の娘染色体を保持する娘細胞が生じた場合、該娘細胞も「第１の形質転換動物細胞」に該当する。
　工程Ｂは、前記工程Ａの後に、前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程である。工程Ｂは、より具体的には、前記工程Ａの後に、前記動物細胞の前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程である。工程Ｂは、工程Ａの後に実施される。工程Ｂにおいていう「前記染色体」とは、工程Ａの実施対象となった染色体であって、工程Ａの実施後のものをいう。すなわち、工程Ｂにおいていう「前記染色体」とは、工程Ａにより第１のリコンビナーゼ認識配列が導入された染色体であり、言い換えると、第１の改変染色体であり、より具体的には、第１の形質転換動物細胞が保持する第１の改変染色体である。また、工程Ｂにおいていう「前記動物細胞」とは、工程Ａの実施対象となった動物細胞であって、工程Ａの実施後のものをいう。すなわち、工程Ｂにおいていう「前記動物細胞」とは、工程Ａにより染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列が導入された動物細胞であり、言い換えると、第１の形質転換動物細胞である。すなわち、工程Ｂは、言い換えると、第１の改変染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程であり、より具体的には、第１の形質転換動物細胞が保持する第１の改変染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程である。
　なお、工程Ｂを実施することを、例えば、「動物細胞（具体的には第１の形質転換動物細胞）に対して工程Ｂを実施する」または「染色体（具体的には第１の改変染色体）に対して工程Ｂを実施する」ともいう。
　工程Ｂを実施することにより、第２のリコンビナーゼ認識配列がさらに導入された第１の改変染色体（すなわち第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を有する染色体）が生成する。該染色体（工程Ｂにより生成した染色体）を「第２の改変染色体」ともいう。すなわち、工程Ｂは、より具体的には、第１の改変染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入し、第２の改変染色体を生成する工程であってよい。また、工程Ｂを実施することにより、第１の改変染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列がさらに導入された動物細胞（すなわち染色体上に第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を有する動物細胞）、言い換えると、第２の改変染色体を保持する動物細胞が生成する。該動物細胞（工程Ｂにより生成した動物細胞）を「第２の形質転換動物細胞」ともいう。第２の形質転換動物細胞は、言い換えると、「本発明の動物細胞」である。すなわち、工程Ｂは、より具体的には、第１の改変染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入し、第２の形質転換動物細胞（本発明の動物細胞）を生成する工程であってもよい。
　なお、「第２の改変染色体」とは、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を有する限り、工程Ｂで第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が起こった染色体そのものに限られず、該導入の後に該染色体から複製等の過程を経て生じた染色体も包含される。例えば、第２の形質転換動物細胞が細胞分裂して第２の改変染色体の娘染色体を保持する娘細胞が生じた場合、該娘染色体も「第２の改変染色体」に該当する。同様に、「第２の形質転換動物細胞」とは、第２の改変染色体を保持する限り、工程Ｂで染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が起こった動物細胞そのものに限られず、該導入の後に該動物細胞から細胞分裂等の過程を経て生じた細胞も包含される。例えば、第２の形質転換動物細胞が細胞分裂して第２の改変染色体の娘染色体を保持する娘細胞が生じた場合、該娘細胞も「第２の形質転換動物細胞」に該当する。
　このように、工程ＡおよびＢを実施することにより、本発明の動物細胞が得られる。本発明の動物細胞は、第２の改変染色体について、ヘテロ接合体であってもよく、ホモ接合体であってもよい。また、本発明の動物細胞が複数個の細胞で構成される場合、本発明の動物細胞は、第２の改変染色体についてモザイク（すなわち、第２の改変染色体をヘテロで有する細胞、第２の改変染色体をホモで有する細胞、および第２の改変染色体を有さない細胞から選択される２種またはそれ以上の細胞のモザイク）であってもよい。
　工程Ｃは、前記工程Ｂの後に、前記動物細胞から形質転換動物を得る工程である。工程Ｃは、工程Ｂの後に実施される。工程Ｃにおいていう「前記動物細胞」とは、工程ＡおよびＢの実施対象となった動物細胞であって、工程ＡおよびＢの実施後のものをいう。すなわち、工程Ｃにおいていう「前記動物細胞」とは、工程ＡおよびＢにより染色体上に第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が導入された動物細胞であり、言い換えると、第２の形質転換動物細胞である。すなわち、工程Ｃは、言い換えると、第２の形質転換動物細胞から形質転換動物を得る工程である。
　なお、工程Ｃを実施することを、例えば、「動物細胞（具体的には第２の形質転換動物細胞）に対して工程Ｃを実施する」ともいう。
　工程Ｃを実施することにより、染色体上に第１および第２のリコンビナーゼ認識配列を有する動物、言い換えると、第２の改変染色体を保持する動物が得られる。該動物（工程Ｃにより得られた動物）は、言い換えると、「本発明の動物」である。すなわち、工程Ｃは、より具体的には、第２の形質転換動物細胞から本発明の動物を得る工程であってもよい。
　なお、「本発明の動物」とは、第２の改変染色体を保持する限り、工程Ｃにおいて第２の形質転換動物細胞から直接発生した動物個体そのものに限られず、該個体から交配、繁殖、クローニング等の過程を経て生じた個体も包含される。
　このように、工程Ａ～Ｃを実施することにより、本発明の動物が得られる。本発明の動物は、第２の改変染色体について、ヘテロ接合体であってもよく、ホモ接合体であってもよい。本発明の動物が第２の改変染色体についてヘテロ接合体である場合、適宜、第２の改変染色体についてホモ接合体である動物個体を得ることができる。例えば、第２の改変染色体についてヘテロ接合体である親同士を交配し、生まれた子から第２の改変染色体についてホモ接合体である個体を選抜することができる。また、本発明の動物は、第２の改変染色体についてモザイクであってもよい。本発明の動物が第２の改変染色体についてモザイクである場合、適宜、第２の改変染色体についてモザイクでない（具体的には、第２の改変染色体についてヘテロ接合体またはホモ接合体である）動物個体を得ることができる。例えば、第２の改変染色体についてモザイクである親と、野生型の同種の親とを交配し、生まれた子から第２の改変染色体についてヘテロ接合体であるものを選抜することができる。
　本発明の形質転換体が第２の改変染色体を保持することは、例えば、染色体構造を決定する公知の手法により確認できる。そのような手法としては、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が導入された領域の塩基配列解析、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が導入された領域のＰＣＲ増幅断片のサイズの決定が挙げられる。本発明の形質転換体が第２の改変染色体を保持することは、具体的には、例えば、実施例に記載の手法により確認することができる。
　リコンビナーゼ認識配列を染色体に導入する手段は、リコンビナーゼ認識配列を染色体の所定の箇所に導入できる限り、特に制限されない。リコンビナーゼ認識配列の導入は、例えば、公知の部位特異的なゲノム編集法により実施することができる。部位特異的なゲノム編集法としては、各種ヌクレアーゼを利用した手法が挙げられる。そのような手法として、具体的には、CRISPR/Cas（CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeat， Cas：CRISPR-associated protein）法、TALEN（transcription-activator like effector nuclease）法、ZFN（Zinc finger nuclease）法が挙げられる。これらの手法では、それぞれ、Cas、TALEN、ZFNがヌクレアーゼとして用いられる。
　CRISPR/Cas法は、例えば、Cas、ガイドRNA（gRNA）、およびドナーDNAを利用して実施できる。Casとしては、Cas9やCpf1が挙げられる。CasとしてCas9を用いるCRISPR/Cas法を「CRISPR/Cas9法」、CasとしてCpf1を用いるCRISPR/Cas法を「CRISPR/Cpf1法」ともいう。ガイドRNAは、リコンビナーゼ認識配列を染色体の所定の箇所に導入できるように適宜設計できる。また、ガイドRNAに代えて、crRNAおよびtracrRNAを組み合わせて用いることもできる。なお、Cpf1の場合は、ガイドRNAとしてcrRNAを単独で用いることができる。
　TALEN法は、例えば、TALENおよびドナーDNAを利用して実施できる。TALENは特定の塩基配列を認識するモジュールであるTAL effectorを備えており、TAL effectorは、リコンビナーゼ認識配列を染色体の所定の箇所に導入できるように適宜設計できる。
　ZFN法は、例えば、ZFNおよびドナーDNAを利用して実施できる。ZFNは特定の塩基配列を認識するモジュールであるジンクフィンガードメインを備えており、ジンクフィンガードメインは、リコンビナーゼ認識配列を染色体の所定の箇所に導入できるように適宜設計できる。
　ヌクレアーゼは、野生型のヌクレアーゼであってもよく、そのバリアントであってもよい。バリアントは、リコンビナーゼ認識配列を染色体の所定の箇所に導入できる限り、特に制限されない。例えば、Cas9のバリアントとしては、ニッカーゼとして機能するCas9(D10A)やCas9(H840A)が挙げられる。CRISPR/Cas法でニッカーゼを利用する場合は、２種のガイドRNAを組み合わせて用いることができる。また、例えば、TALENのバリアントとしては、Platinum TALEN（Sakuma T, et. al., (2013) Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. Sci Rep 3: 3379.）やGoldyTALEN（Bedell VM, et al., In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 2012 Nov 1;491(7422):114-8.）が挙げられる。
　ドナーDNAは、リコンビナーゼ認識配列を含むDNAである。上記手法では、ドナーDNAを利用した相同組換え修復によりリコンビナーゼ認識配列が染色体上に組み込まれ得る。ドナーDNAは、選択した手法の種類等の諸条件に応じて選択できる。ドナーDNAは、例えば、線状であってもよく、環状であってもよい。ドナーDNAは、例えば、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。ドナーDNAは、具体的には、例えば、一本鎖線状DNAであってもよい。
　リコンビナーゼ認識配列の導入は、具体的には、選択した手法に応じた必要物を細胞内に導入することにより実施できる。必要物としては、CRISPR/Cas法の場合、ヌクレアーゼ、gRNA等のRNA、ドナーDNAが挙げられる。また、必要物としては、TALEN法やZFN法の場合、ヌクレアーゼやドナーDNAが挙げられる。
　ヌクレアーゼは、例えば、直接細胞に導入してもよく、細胞内で発現させることにより間接的に細胞に導入してもよい。例えば、ヌクレアーゼをコードするmRNAまたはヌクレアーゼをコードするベクターを細胞に導入し、該mRNAまたは該ベクターからヌクレアーゼを発現させることができる。同様に、gRNA等のRNAは、例えば、直接細胞に導入してもよく、細胞内で発現させることにより間接的に細胞に導入してもよい。例えば、gRNA等のRNAをコードするベクターを細胞に導入し、該ベクターからgRNA等のRNAを発現させることができる。同様に、ドナーDNAは、例えば、直接細胞に導入してよい。用いるDNAは一本鎖でも2本鎖でもよい。PCR断片、合成オリゴ、ベクターを用いてもよい。ベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。２種またはそれ以上の必要物をベクターから発現する場合、それら必要物は、単一のベクターにまとめてコードされていてもよいし、複数のベクターに分けてコードされていてもよい。ベクターは、ドナーDNAを兼ねていてもよい。
　必要物やそれらをコードするmRNAやベクター（以下、まとめて「必要物等」ともいう）としては、いずれも、利用可能な場合は市販品を用いてもよく、適宜製造したものを用いてもよい。ヌクレアーゼは、例えば、異種タンパク質発現系または無細胞タンパク質発現系を利用して製造できる。mRNAやgRNA等のRNAは、例えば、化学合成またはin vitro転写により製造できる。ドナーDNAは、例えば、化学合成またはPCR増幅により製造できる。ヌクレアーゼやgRNA等のRNAをコードするベクターは、例えば、化学合成またはクローニングにより製造できる。
　必要物等を細胞に導入する手段は特に制限されない。必要物等の導入は、例えば、タンパク質や核酸等の成分を細胞に導入する公知の手法により実施することができる。そのような手法として、具体的には、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法が挙げられる。また、ウイルスベクターの場合、該ベクターを細胞に感染させることにより、該ベクターを細胞内に導入することができる。そのような手法として、特に、エレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法が挙げられる。そのような手法として、さらに特には、エレクトロポレーション法が挙げられる。特に、エレクトロポレーション法を利用することにより、マイクロインジェクション法等の他の手法を利用した場合と比較して、本発明の方法の成功率を向上させることができると期待される。本発明の方法の成功率を向上としては、細胞の生存率の向上や、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入効率の向上が挙げられる。
　第２の形質転換動物細胞（本発明の動物細胞）から本発明の動物を得る手段は特に制限されない。「細胞から動物を得る」とは、具体的には、細胞から動物の個体を発生させることをいう。細胞からの動物の個体の発生は、例えば、公知の手法により実施することができる。例えば、細胞が受精卵、胚、胚盤胞等の動物の個体へと直接発生し得る細胞である場合は、該細胞から動物の個体を直接発生させることができる。具体的には、例えば、該細胞を偽妊娠母体に移植して発生および出産させることより、産仔として動物の個体を得ることができる。また、例えば、幹細胞や体細胞等の細胞からのクローン化により、動物の個体を発生させることもできる。
＜２＞条件付き染色体改変動物の製造方法
　本発明の形質転換動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物との交配により、条件付き染色体改変動物が得られる。すなわち、本発明の条件付き染色体改変動物の製造方法は、前記方法により本発明の形質転換動物を得る工程、および得られた形質転換動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物を交配する工程を含む、条件付き染色体改変動物の製造方法である。同方法により製造される条件付き染色体改変動物を、「本発明の条件付き染色体改変動物」ともいう。
　すなわち、本発明の条件付き染色体改変動物の製造方法は、言い換えると、下記工程（Ｘ）および（Ｙ）を含む、条件付き染色体改変非ヒト動物の製造方法である：
（Ｘ）前記工程（Ａ）～（Ｃ）を行い、前記動物細胞から形質転換非ヒト動物を得る工程；
（Ｙ）前記形質転換動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物を交配し、条件付き染色体改変非ヒト動物を得る工程。
　工程（Ｙ）は、本発明の動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物を交配する工程である。
　なお、工程（Ｙ）を実施することを、例えば、「動物（具体的には本発明の動物）に対して工程（Ｙ）を実施する」ともいう。
　「条件付きリコンビナーゼ発現動物」とは、条件付きで第１および第２のリコンビナーゼ認識配列に対応するリコンビナーゼを発現する動物をいう。各リコンビナーゼ認識配列に対応するリコンビナーゼについては上述の通りである。
　リコンビナーゼは、野生型のリコンビナーゼであってもよく、そのバリアントであってもよい。バリアントは、第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の間での組み換えを起こせる限り、特に制限されない。例えば、Creのバリアントとしては、Cre-ERが挙げられる。
　条件付きリコンビナーゼ発現動物としては、リコンビナーゼを組織特異的または時期特異的に発現する動物が挙げられる。リコンビナーゼを組織特異的または時期特異的に発現することは、例えば、組織特異的プロモーターまたは時期特異的プロモーターの制御下でリコンビナーゼを発現することにより達成できる。すなわち、リコンビナーゼを組織特異的または時期特異的に発現する動物としては、組織特異的プロモーターまたは時期特異的プロモーターの制御下で発現するリコンビナーゼ遺伝子を有する動物が挙げられる。
　また、条件付きリコンビナーゼ発現動物としては、特定の条件下で機能するリコンビナーゼを発現する動物も挙げられる。特定の条件下で機能するリコンビナーゼとしては、CreのバリアントであるCre-ERが挙げられる。Cre-ERは、Creと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質であり、通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、loxPの組換えを起こす。すなわち、Cre-ERは、タモキシフェン存在下で機能するリコンビナーゼである。
　条件付きリコンビナーゼ発現動物としては、利用可能な場合は市販品を用いてもよく、適宜製造したものを用いてもよい。条件付きリコンビナーゼ発現動物は、例えば、組織特異的または時期特異的に発現する遺伝子の開始コドン部位にリコンビナーゼ遺伝子をノックインすることや、組織特異的プロモーターまたは時期特異的プロモーターとその下流に接続したリコンビナーゼ遺伝子をノックインすることにより製造することができる。遺伝子のノックインは常法により実施できる。また、条件付きリコンビナーゼ発現動物は、例えば、特定の条件下で機能するリコンビナーゼを発現可能にノックインすることにより製造することができる。また、組織特異的または時期特異的転写制御配列の下流にリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトのトランスジェニック動物、特定の条件下で機能するリコンビナーゼコンストラクトのトランスジェニック動物を用いてもよい。
　工程（Ｙ）を実施することにより、薬剤誘導型、組織特異的または時期特異的のような条件付きでリコンビナーゼが機能し、それにより、染色体上の標的部位が改変される。すなわち、工程（Ｙ）を実施することにより、具体的には、染色体上の標的部位が条件付きで改変される、あるいは染色体上の標的部位が条件付きで改変された、動物が得られる。該動物（工程（Ｙ）により得られた動物）は、言い換えると、「本発明の条件付き染色体改変動物」である。すなわち、工程（Ｙ）は、より具体的には、本発明の動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物を交配し、本発明の条件付き染色体改変動物を得る工程であってもよい。
　標的部位の改変としては、標的部位の欠損や逆位が挙げられる。標的部位の改変により、例えば、遺伝子が破壊（ノックアウト）され得る。具体的には、例えば、標的部位が遺伝子の一部や全部を含む場合、標的部位の改変により、当該遺伝子が破壊され得る。すなわち、条件付き染色体改変動物としては、条件付き遺伝子破壊動物（条件付き遺伝子ノックアウト動物）が挙げられる。
　なお、「本発明の条件付き染色体改変動物」とは、条件付きでリコンビナーゼが機能するよう改変されている（すなわち、染色体上の標的部位が条件付きで改変される、あるいは染色体上の標的部位が条件付きで改変されている）限り、工程（Ｙ）において本発明の動物と条件付きリコンビナーゼ発現動物との交配により直接産まれた動物個体そのものに限られず、該個体から交配、繁殖、クローニング等の過程を経て生じた個体も包含される。
　このように、工程（Ａ）～（Ｃ）および（Ｙ）を実施することにより、本発明の条件付き染色体改変動物が得られる。
　なお、条件付きリコンビナーゼ発現動物の細胞に対し工程（Ａ）～（Ｃ）を実施することにより、工程（Ｙ）を実施することなしに、本発明の条件付き染色体改変動物を得ることもできる。すなわち、一態様において、本発明の動物は本発明の条件付き染色体改変動物で同義であってもよい。また、本発明の形質転換動物細胞の製造方法の一態様は、前記動物細胞（工程（Ａ）～（Ｃ）が実施される動物細胞）が条件付きリコンビナーゼ発現動物の細胞であり、工程（Ａ）～（Ｃ）により条件付き染色体改変動物が得られる、条件付き染色体改変動物の製造方法であってもよい。
　また、本発明の条件付き染色体改変動物から、条件付き染色体改変動物細胞を得ることもできる。
　本発明の条件付き染色体改変動物やその細胞（条件付き染色体改変動物細胞）は、例えば、染色体上の標的部位（例えば遺伝子）の機能解析に利用することができる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
実施例：２ステップ導入によるFloxマウスの作製
＜１＞材料と方法
＜１－１＞受精卵の準備
　受精卵の準備は、基本的にはHorii et al., Sci Rep. 4:4513, 2014に準じて行った。すなわち、８～１０週齢のBDF1雌マウス（日本クレア）に7.5 Uの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（pregnant mare serum gonadotropin；PMSG）を腹腔内注射し、その４８時間後に7.5 Uのヒト絨毛性ゴナドトロピン（Human chorionic gonadotropin；hCG）を腹腔内注射し、同系統の雄マウスと交配させた。翌日、膣栓の有無により交尾の成立を確認した。同日の午後に、交尾の成立が確認された雌マウスを安楽死させて卵管を回収し、卵管内の受精卵をM2ヒアルロニダーゼ液に取り出した。卵丘細胞の分離を確認後、受精卵をM16培地に移し、操作までCO2インキュベータ（５％ CO2、37℃）で培養した。
＜１－２＞Cas9、gRNA、およびssODN
　Cas9は、市販のリコンビナントタンパク質（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。
　gRNAとしては、MeCP2遺伝子用およびTet3遺伝子用に、表３に示す塩基配列（ＴはＵに読み替えるものとする）からなるRNAを合成した。表中、下線は染色体との結合部位を示す。gRNAの合成は、合成オリゴDNAを鋳型とする方法またはgRNAベクターからPCR増幅したDNAを鋳型とする方法（Horii et al., Int J Mol Sci. 14:19774-81, 2013）に準じて行った。具体的には、MEGAshortscript T7 Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いてin vitro転写を行った後、MEGAclear Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ドナーDNAとして用いるssODN（１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）としては、MeCP2遺伝子用およびTet3遺伝子用に表４に示すloxPを含む塩基配列からなるDNAを合成した。表中、大文字はloxP配列、太字下線は外来の制限酵素サイトを示す。MeCP2遺伝子用のMeCP2-L2-lox66およびMeCP2-R1-lox71は、それぞれ、lox66およびlox71を含む。Tet3遺伝子用のTet3Ex8-2loxPLおよびTet3Ex9-3loxPRは、いずれも、loxPを共通で含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Cas9/gRNA/ssODN溶液（Cas9、gRNA、およびssODNを含む溶液）を導入直前に以下のように調製し、これを基準濃度とした。濃度は最終濃度を示す。インジェクション用はRNaseフリー水に、エレクトロポレーション用はOpti-MEM（Thermo Fisher Scientific社）に希釈した。
＜１ステップ用溶液組成＞
Cas9 nuclease　　　　　　100 ng/μL
gRNA1　　　　　　　　　　 24 ng/μL
gRNA2　　　　　　　　　　 24 ng/μL
ssODN1　　　　　　　　　 400 ng/μL
ssODN2　　　　　　　　　 400 ng/μL
＜２ステップ用溶液組成＞
＜１回目＞
Cas9 nuclease　　　　　　100 ng/μL
gRNA1　　　　　　　　　　 24 ng/μL
ssODN1　　　　　　　　　 400 ng/μL
＜２回目＞
Cas9 nuclease　　　　　　100 ng/μL
gRNA2　　　　　　　　　　 24 ng/μL
ssODN2　　　　　　　　　 400 ng/μL
＜１－３＞マイクロインジェクション
　hCG注射後、24-27時間経過した受精卵をインジェクションに用いた。Cas9/gRNA/ssODN溶液を、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて前核に注入した。２ステップのインジェクションを行う場合は、hCG後42-44時間目（２細胞期）に２回目のインジェクションを行った。なお、予備実験においてCas9/gRNA/ssODN溶液を原液、1/2希釈、1/4希釈で１ステップのインジェクションを行い、胚盤胞までの発生率を確認した。その結果、原液ではほとんどの胚が発生停止した。よって、この実験では、１ステップおよび２ステップの場合ともに、1/2希釈のCas9/gRNA/ssODN溶液を用いた。
＜１－４＞エレクトロポレーション
　hCG注射後、24-27時間経過した受精卵をエレクトロポレーションに用いた。２ステップのエレクトロポレーションを行う場合は、hCG後42-44時間目（２細胞期）に２回目のエレクトロポレーションを行った。この実験では、１ステップおよび２ステップの場合ともに、Cas9/gRNA/ssODN溶液の原液を用いた。エレクトロポレーターはCUY21 EDIT（BEX社）を用い、特に表記が無い場合は、30 V (3 msec ON + 97 msec OFF)×7回パルスの条件でエレクトロポレーションを行った。電気融合して４倍体になった胚を約３０分後に取り除き、２倍体胚のみ以降の実験に用いた。
＜１－５＞体外培養および胚移植
　上記＜１－３＞および＜１－４＞で得られた処理胚の一部は、胚盤胞期まで体外培養を行い、発生率および遺伝子型の検定を行った。それ以外の処理胚は、２細胞期に偽妊娠マウスの卵管内に移植した。移植してから約２０日後に産仔が得られた。
＜１－６＞遺伝子型検定
　胚盤胞または産仔の尻尾からDNAを抽出した。それを鋳型として２つのloxPを含む領域をPCRにより増幅した。用いたプライマーセットを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ssODNが挿入されていれば、loxPと共に挿入された制限酵素サイト（MeCP2の場合はNheIおよびEcoRI、Tet3の場合はBamHIおよびEcoRI）を制限酵素処理により切断することができる。よって、PCR産物を制限酵素処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの長さによりssODNの挿入の有無を確認した。また、MeCP2遺伝子の一部およびTet3遺伝子の全てのサンプルについて、PCR産物を用いてTA-cloningを行い、塩基配列の確認を行った。
＜２＞結果
　胚盤胞期胚におけるMeCP2遺伝子でのFlox効率（Flox数／胚盤胞数）のデータを図１に示す。また、胚盤胞期胚におけるMeCP2遺伝子での生存率（胚盤胞数／受精卵数）のデータを図２に示す。また、産仔におけるMeCP2遺伝子でのFlox効率および染色体欠失率のデータを図３に示す。
　図１に示すように、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法のいずれの場合でも、２つのloxPを１ステップで導入した場合と比較して、２つのloxPを２ステップに分けて導入した場合には、Flox効率の向上が認められた。特に、２ステップのエレクトロポレーション法の場合に最も高いFlox効率が得られた。具体的には、従来法（１ステップでのマイクロインジェクション法）でのFlox効率は5%弱であったのに対し、２ステップのエレクトロポレーション法でのFlox効率は23%であり、4.6倍に向上した。
　また、図２に示すように、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法のいずれの場合でも、２つのloxPを１ステップで導入した場合と比較して、２つのloxPを２ステップに分けて導入した場合には、生存率の低下が認められた。しかしながら、マイクロインジェクション法の場合と比較して、エレクトロポレーション法の場合には、生存率の向上が認められた。エレクトロポレーション法における生存率の向上は、エレクトロポレーション法はマイクロインジェクション法と比較して胚へ与える物理的ダメージが少ないことに起因するものと考えられる。特に、２ステップのエレクトロポレーション法の場合には、従来法（１ステップでのマイクロインジェクション法）の場合の1.4倍の生存率が認められた。
　すなわち、２ステップのエレクトロポレーション法の場合には、従来法（１ステップでのマイクロインジェクション法）の場合と比較して、6.4倍（4.6倍×1.4倍）のFlox胚が得られた。
　また、図３に示すように、産仔において、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法のいずれの場合でも、１ステップと比べて２ステップでは得られるFlox個体が多く、染色体欠失が劇的に減少していた。すなわち、従来法（１ステップのマイクロインジェクション法）ではFlox個体が1匹も得られなかったのに対し、最も効率の良かった２ステップのエレクトロポレーション法では13%がFlox個体であった。また、MeCP2遺伝子の他、Tet3遺伝子でも、２ステップのエレクトロポレーション法により50%（８匹中４匹）の高効率でFlox個体を得ることができた。
　また、別途、同様の手順で、図４に示すようにCreリコンビナーゼを発現する受精卵に２ステップのエレクトロポレーション法を適用したところ、MeCP2遺伝子で20%（５匹中１匹）、Tet3遺伝子で25%（４匹中１匹）の効率でCreリコンビナーゼを発現するFloxマウス（Cre/loxマウス）を得ることができた。
　以上より、２ステップ法により、特に２ステップのエレクトロポレーション法により、Floxマウス等の染色体上にリコンビナーゼ認識配列のペアを有する動物を効率的に製造できることが明らかとなった。また、Creリコンビナーゼを発現する受精卵に２ステップ法を適用することで、直接Cre/loxマウスを得られることが明らかとなった。
　本発明によれば、Flox動物等の、染色体上にリコンビナーゼ認識配列のペアを有する動物を効率的に製造することができる。
〔配列表の説明〕
配列番号１～４：gRNA
配列番号５～８：ssODN
配列番号９～１２：遺伝子型検定用プライマー
配列番号１３～１９：野生型リコンビナーゼ認識配列
配列番号２０～３５：リコンビナーゼ認識配列のバリアント

Claims (13)

  1. 　下記工程
    （Ａ）非ヒト動物細胞の染色体上に第１のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
    （Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、前記動物細胞の前記染色体上に第２のリコンビナーゼ認識配列を導入する工程；
    （Ｃ）前記工程（Ｂ）の後に、前記動物細胞から前記第１及び第２のリコンビナーゼ認識配列が染色体上に導入された形質転換非ヒト動物を得る工程；
    　を含む、形質転換非ヒト動物の製造方法であって：
    　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が、リコンビナーゼによりそれらの間で組み換えが起こる塩基配列であり、前記染色体上の標的部位を挟むように導入される、方法。
  2. 　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列が、loxP、VloxP、SloxP、rox、FRT、RS、またはgixである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記リコンビナーゼが、Cre、VCre、SCre、Dre、FLP、R、またはGinである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、CRISPR/Cas法、TALEN法、またはZFN法により実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、エレクトロポレーション法により実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　第１および第２のリコンビナーゼ認識配列の導入が、マイクロインジェクション法により実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記工程（Ａ）および工程（Ｂ）が受精卵または胚に対して実施される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記工程（Ａ）が受精卵に対して実施され、前記工程（Ｂ）が２細胞期胚に対して実施される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記形質転換非ヒト動物が、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、またはネコである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記標的部位が標的遺伝子のエクソンを含む部位である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記非ヒト動物細胞が条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物の細胞であり、前記工程（Ａ）～（Ｃ）により条件付き染色体改変非ヒト動物が得られる、条件付き染色体改変非ヒト動物の製造方法である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　下記工程（Ｘ）および（Ｙ）を含む、条件付き染色体改変非ヒト動物の製造方法：
    （Ｘ）請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により前記形質転換非ヒト動物を得る工程；
    （Ｙ）前記形質転換非ヒト動物と条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物を交配し、条件付き染色体改変非ヒト動物を得る工程。
  13. 　条件付きで前記リコンビナーゼを発現する非ヒト動物が、前記リコンビナーゼを組織特異的または時期特異的に発現する非ヒト動物、または特定の条件下で機能するリコンビナーゼを発現する非ヒト動物である、請求項１１または１２に記載の方法。
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