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WO2016133165A1 - Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法 - Google Patents

Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法 Download PDF

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WO2016133165A1
WO2016133165A1 PCT/JP2016/054735 JP2016054735W WO2016133165A1 WO 2016133165 A1 WO2016133165 A1 WO 2016133165A1 JP 2016054735 W JP2016054735 W JP 2016054735W WO 2016133165 A1 WO2016133165 A1 WO 2016133165A1
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WO
WIPO (PCT)
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voltage
electrodes
distance
mrna
per
Prior art date
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PCT/JP2016/054735
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English (en)
French (fr)
Inventor
橋本　昌和
龍也 竹本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bex Co Ltd
University of Tokushima NUC
Original Assignee
Bex Co Ltd
University of Tokushima NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bex Co Ltd, University of Tokushima NUC filed Critical Bex Co Ltd
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Priority to US15/551,791 priority patent/US20180064073A1/en
Priority to CN201680010946.3A priority patent/CN107406846A/zh
Priority to EP16752551.8A priority patent/EP3260539B1/en
Publication of WO2016133165A1 publication Critical patent/WO2016133165A1/ja
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    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing mRNA encoding Cas9 protein (Cas9 mRNA) into a fertilized egg of a mammal by electroporation.
  • the present invention also uses the above-described method to produce a mammalian fertilized egg that expresses Cas9, to perform genome editing on the mammalian fertilized egg, and to produce a genome-edited mammalian fertilized egg Or producing a genetically modified animal.
  • ZFN Zinc-Finger Nucleases
  • TALEN Transcription Activator-Like Effector Nucleases
  • CRISPR / Cas system grouping etc.
  • systems using artificial restriction enzymes such as the short interval palindromic system (ClusteredClusterRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System) have attracted attention.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Gene-modified animals by genome editing are usually produced by microinjecting artificial restriction enzyme genes into pronuclear embryos.
  • this method is the mainstream, but skilled techniques are required to prevent cell damage.
  • DNA and / or RNA must be injected into pronuclear embryos one by one using a dedicated machine, which is inconvenient when processing a large number of cells simultaneously.
  • Electroporation is a useful means for introducing a target gene into a cell or tissue, and has been widely used in many biological species. In mice, this technique has been used on a variety of tissues including the brain, testis and muscles of fetuses and postnatal individuals.
  • gene introduction into fertilized eggs has been mainly performed by microinjection. For example, microinjection into the pronucleus is used to insert linear DNA into the genome, and circular plasmid or mRNA microinjection is used to transiently express the desired gene without inserting it into the genome. Have been used.
  • Non-patent Document 1 Recently established mouse genome editing was also performed by microinjecting Cas9 mRNA and gRNA (guide RNA) or plasmids expressing these RNAs one by one into the cytoplasm or pronucleus of fertilized eggs. ing. Microinjection requires a considerable amount of time and a skilled procedure, and has become a technical rate-limiting step in the production of genetically modified mice by genome editing (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Electroporation has hardly been used to introduce genes into fertilized eggs of mice. As an exception, it has been reported that dsRNA that does not encode a protein was introduced into a fertilized mouse by electroporation in order to knock down an endogenous gene (Non-patent Document 2). This method requires a treatment to remove or thin the zona pellucida with an acidic tyrode solution before electroporation, but the zona pellucida is an important structure for the embryo before implantation, This method is not practical because the treatment is known to have toxic effects on mouse embryos. Also, this method only introduced short RNAs of less than 1 kb. Although electroporation without acid tyrode treatment has been reported, dsDNA of about 500 bp has only been introduced into a mouse blastocyst stage embryo (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 the efficiency of genome editing is very low, with less than 9% of offspring born to genome editing.
  • the inventors of the present invention determined the optimum electroporation conditions for introducing Cas9 mRNA into a fertilized egg of a mammal after intensive studies, and completed the present invention.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 990 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes.
  • a method including the following steps is provided.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 990 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes.
  • a method including the following steps is provided.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 990 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes.
  • a method including the following steps is provided.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 990 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes.
  • a method including the following steps is provided.
  • the present invention also provides a method for producing a genetically modified animal, comprising transplanting a fertilized egg obtained by the above method to a recipient animal.
  • Cas9 mRNA can be introduced into a fertilized egg of a mammal by electroporation.
  • FIG. 1-1 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 1-2 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 1-3 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • 1-4 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 2 shows an electroporation apparatus.
  • FIG. 3 shows the mCherry fluorescence intensity and the survival rate to the blastocyst stage of embryos electroporated with mCherry mRNA under various conditions.
  • FIG. 4 is a graph in which mRNA introduction efficiency at each energization time is predicted for each voltage based on FIG. FIG.
  • FIG. 5 shows the mCherry fluorescence intensity and viability to the blastocyst stage of embryos electroporated with mCherry mRNA using bi-directional pulses.
  • FIG. 6 shows genome editing of Fgf10 in the CRISPR / Cas system by electroporation.
  • FIG. 7 shows genome editing by electroporation using high concentrations of Cas9 mRNA.
  • FIG. 8 shows ssODN (single-stranded oligodeoxynucleotide) HDR (Homology-Directed-Repair) at the mCherry locus by electroporation.
  • FIG. 9 shows HDR by ssODN at the mCherry locus by electroporation.
  • Electroporation means an electric pulse generator and may be any one as long as it can carry out the steps (a) and (b) of the present invention. Electroporators can be purchased from, for example, BioRad, BTX, BEX, Intracel, Eppendorf, and the like.
  • the “electroporation electrode” includes all electrodes used in the conventional electroporation method.
  • the electrode which consists of metals, such as platinum, gold
  • a mixture of a solution and a fertilized egg in which two electrodes are arranged with a gap of about 0.25 mm to about 10 mm, for example, about 0.5 mm to about 4 mm or about 1 mm to about 2 mm, and containing Cas9C mRNA in the gap Can be put.
  • the electrode may be a cuvette electrode combined with a container for containing the mixture.
  • Electroporation electrodes can be purchased from, for example, BioRad, BTX, BEX, Intracel, and Eppendorf.
  • the solution containing Cas9 mRNA contains, for example, about 30ng / ⁇ l to about 2000ng / ⁇ l, about 50ng / ⁇ l to about 1000ng / ⁇ l, about 50ng / ⁇ l to about 500ng / ⁇ l. ⁇ l, about 50 ng / ⁇ l to about 300 ng / ⁇ l, about 50 ng / ⁇ l to about 200 ng / ⁇ l, about 200 ng / ⁇ l to about 1000 ng / ⁇ l, about 200 ng / ⁇ l to about 500 ng / ⁇ l, or about 200 ng / ⁇ l to about 300 ng / Contains at a concentration of ⁇ l.
  • the solution comprises about 200 ng / ⁇ l Cas9 mRNA. Under certain electrical conditions, the higher the Cas9 mRNA concentration in the solution, the greater the amount of mRNA introduced.
  • the solution containing Cas9 mRNA is obtained by dissolving Cas9 mRNA in an arbitrary solution that can be used for electroporation.
  • the solution that can be used for electroporation may be a medium or buffer that allows a fertilized egg to survive during electroporation.
  • a medium such as Opti-MEM-I, PBS, HBS, HBSS, Hanks, HCMF, or the like Contains a buffer.
  • the solution does not contain serum.
  • step (a) of the present invention a mixture of a solution containing Cas9 mRNA and a fertilized egg is placed between the electrodes for electroporation.
  • a solution containing Cas9 mRNA and a fertilized egg mixed in advance may be added between the electrodes, or a solution containing Cas9 mRNA and a fertilized egg may be added separately between the electrodes.
  • the mixture is used in a volume that fills the gap of the electrode, for example, in a volume of about 1 ⁇ l to about 50 ⁇ l, preferably about 1.5 ⁇ l to about 15 ⁇ l, more preferably about 2 ⁇ l to about 10 ⁇ l. In one embodiment of the invention, the volume of the mixture is about 5 ⁇ l.
  • step (b) of the present invention a voltage is applied between the electrodes so as to achieve an mRNA introduction efficiency (R) equal to or higher than the minimum mRNA introduction efficiency (R min ) defined by the Cas9 mRNA concentration.
  • the minimum mRNA introduction efficiency (R min ) is calculated from the Cas9 mRNA concentration c (ng / ⁇ l) by the following equation (A).
  • R min 882 / c
  • the mRNA introduction efficiency depends on the voltage applied between the electrodes and the energization time.
  • the mRNA introduction efficiency (R) may be not less than the minimum mRNA introduction efficiency (R min ) calculated from the Cas9 mRNA concentration of the solution in the step (a).
  • R min the minimum mRNA introduction efficiency calculated from the Cas9 mRNA concentration of the solution in the step (a).
  • R min the minimum mRNA introduction efficiency calculated from the Cas9 mRNA concentration of the solution in the step (a).
  • R min the minimum mRNA introduction efficiency calculated from the Cas9 mRNA concentration of the solution in the step (a).
  • R min is 17.6 and R may be 17.6 or more, for example, 25 or more, preferably 27.1 or more.
  • R min is 4.41
  • R may be 4.41 or more, preferably 7.9 or more, more preferably 14.7 or more. Most preferably, it is 27.1 or more.
  • R min when the Cas9 mRNA concentration is 50 ng / ⁇ l, R min is 17.6.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm distance between electrodes is about 31 msec or more, a voltage of about 30 V is about 17 msec or more, and a voltage of about 40 V is about 11 msec or more.
  • a voltage of about 50 V is applied for about 7.5 msec or more.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm distance between electrodes is applied for about 36 msec or more, a voltage of about 30 V is applied for about 21 msec or more, a voltage of about 40 V is applied for about 14 msec or more, and a voltage of about 50 V is applied for about 11 msec or more.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm between electrodes is applied for about 37 msec or more, a voltage of about 30 V is applied for about 22 msec or more, a voltage of about 40 V is applied for about 15 msec or more, or a voltage of about 50 V is applied for about 12 msec or more.
  • a voltage of about 30 V per mm distance between electrodes is applied for about 21 msec.
  • R min is 4.41.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm distance between electrodes is about 15 msec or more
  • a voltage of about 30 V is about 5 msec or more
  • a voltage of about 40 V is about 3.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm distance between electrodes is applied for about 21 msec or more, a voltage of about 30 V is applied for about 9 msec or more, a voltage of about 40 V is applied for about 6 msec or more, and a voltage of about 50 V is applied for about 3 msec or more. More preferably, a voltage of about 20 V per 1 mm between electrodes is applied for about 29 msec or more, a voltage of about 30 V is applied for about 15 msec or more, a voltage of about 40 V is applied for about 10 msec or more, and a voltage of about 50 V is applied for about 6 msec or more.
  • a voltage of about 20 V per 1 mm between electrodes is applied for about 37 msec or more, a voltage of about 30 V is applied for about 22 msec or more, a voltage of about 40 V is applied for about 15 msec or more, or a voltage of about 50 V is applied for about 12 msec or more. In one embodiment, a voltage of about 30 V per mm distance between electrodes is applied for about 21 msec.
  • step (b) of the present invention mRNA introduction efficiency increases with voltage and energization time, but if the voltage is too high or if the energization time is too long, the survival rate of the fertilized egg tends to decrease.
  • the voltage is from about 20 V to about 55 V, preferably from about 20 V to about 40 V, more preferably from about 25 V to about 35 V, most preferably about 30 V per mm distance between the electrodes.
  • the energization time is set such that the product of the voltage and the energization time is about 990 Vmsec or less, more preferably about 810 msec or less, more preferably about 630 Vmsec or less per 1 mm of the interelectrode distance.
  • the voltage in step (b) may be constant or may vary. In one embodiment of the invention, the voltage in step (b) is constant. In that case, a conventional square pulse electroporator can be used as the electroporator.
  • the voltage is divided into a plurality of pulses.
  • the voltage is divided into 2 to 15 times, 3 to 11 times, 5 to 9 times, or 6 to 8 times.
  • the voltage is applied in 7 pulses.
  • the time of each pulse is, for example, about 0.01 msec to about 33 msec, about 0.5 msec to about 15 msec, about 1 msec to about 10 msec, about 2 msec to about 5 msec, for example, about 3 msec.
  • the interval between each pulse is, for example, about 0.5 to about 500 msec, preferably about 5 to about 250 msec, more preferably about 10 to about 150 msec, and further preferably about 80 to 120 msec. In one embodiment of the invention, the interval between pulses is about 97 msec.
  • the magnitude of each pulse may be the same or different.
  • the direction of each pulse when the voltage is applied to a plurality of pulses, the direction of each pulse may be the same, and the direction of at least one pulse may be opposite to the other pulses.
  • the pulses in each direction may be in any order. For example, pulses in one direction may be applied successively after pulses in one direction are continuously applied, pulses in each direction may be applied alternately, or pulses in each direction may be applied randomly.
  • reverse pulse means a pulse when the anode and the cathode are interchanged with respect to a pulse in which one of the two electroporation electrodes is an anode and the other is a cathode.
  • reverse voltage means a voltage when the anode and the cathode are switched with respect to a voltage in which one of the two electroporation electrodes is an anode and the other is a cathode.
  • the mRNA introduction efficiency (R) is determined from the energization time t (msec)
  • the equation (I) R 0.0005 ⁇ t 3 ⁇ 0.0057 ⁇ t 2 + 0.2847 ⁇ t
  • the equation (II) R 0.0015 ⁇ t 3 ⁇ 0.0191 ⁇ t 2 + 0.989 ⁇ t, When the voltage is about
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 630 V msec or less, preferably 540 V msec or less per 1 mm distance between electrodes, and the voltage is divided into two or more pulses. It ’s okay, (D) A voltage that achieves an mRNA introduction efficiency (R) that is equal to or higher than the minimum mRNA introduction efficiency (R min ) calculated by the equation (B), and a voltage in the direction opposite to that in step (c) between the electrodes.
  • R mRNA introduction efficiency
  • R min minimum mRNA introduction efficiency
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes
  • the product of the voltage and the energization time is about 630 V msec or less, preferably 540 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes, and the voltage is 2 times or more.
  • steps (c) and (d) conditions such as voltage and energization time can be determined according to step (b).
  • Genome editing means modifying one or more genes of mammalian cells using artificial restriction enzymes. Genome editing alters one or both alleles.
  • genome editing is performed using a CRISPR / Cas system derived from bacteria. Details of the CRISPR / Cas system are described, for example, in Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) and US Pat. No. 8,697,359, which are incorporated herein by reference. Part.
  • gRNA is a combination of bacterial crRNA and tracrRNA into a single chimeric RNA. Accordingly, gRNA has both the target sequence specificity of crRNA and the characteristics of tracrRNA that serves as a scaffold for Cas9 protein. When gRNA and Cas9 are expressed in cells, the target sequence in the genome can be permanently altered.
  • the gRNA / Cas9 protein complex is recruited to the target sequence by complementary base binding between the gRNA sequence and the target sequence in the genomic DNA.
  • the target sequence in the genome must contain a PAM (Protospacer Adjacent Motif) sequence immediately after the target sequence.
  • PAM Protospacer Adjacent Motif
  • DSBs can be repaired by NHEJ (Non-Homologous End Joining) DNA repair pathway or HDR (Homologous recombination repair) pathway.
  • NHEJ Non-Homologous End Joining
  • HDR Homologous recombination repair
  • the NHEJ repair pathway often provides base insertion / deletion at the DSB site, which can lead to frameshifts and / or stop codons and destroy the open reading frame of the target gene.
  • the HDR pathway requires the presence of a repair template to repair the DSB. In HDR, the repair template sequence is faithfully copied to the cleaved target sequence.
  • a desired mutation can be introduced into a target gene using a repair template and HDR.
  • Cas9 protein Wild-type Cas9 protein has two functional nuclease domains, RuvC and HNH, each of which cleaves a different strand of the double stranded DNA. When both of these domains are active, the Cas9 protein causes a DSB (double strand break) in the genomic DNA.
  • a Cas9 protein having only the catalytic activity of either RuvC or HNH has also been developed. In this case, the Cas9 protein cleaves only one strand of the target DNA.
  • the RuvC domain of the Cas9 protein from Streptococcus pyogenes is inactivated by the D10A mutation and the HNH domain is inactivated by the H840A mutation.
  • Cas9 protein inactive as a nuclease can be used as a molecular biological tool.
  • gRNA can be used as a transcriptional regulator that activates or suppresses gene expression by binding dCas9 protein to a known transcriptional regulatory domain.
  • a dCas9 protein fused to a transcriptional activator can activate transcription of a target sequence.
  • transcription can be suppressed when only the dCas9 protein binds to the target sequence.
  • genomic DNA can be purified by using dCas9 protein fused to an epitope tag with gRNA targeting any genomic DNA sequence, such as in chromatin immunoprecipitation.
  • a dCas9 protein fused with a fluorescent protein marker such as GFP or mcherry can also be used as a DNA label that can be detected in living cells in combination with a gRNA targeting any genomic DNA sequence.
  • Cas9 protein means a protein having the ability to bind to DNA in a gRNA-dependent manner, and those having both RuvC and HNH nuclease activity have either or both of RuvC and HNH nuclease activity. Some that don't.
  • the DNA binding activity and nuclease activity of Cas9 protein can be measured, for example, by the method described in Samuel H. Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014), which is incorporated herein by reference.
  • Cas9 mRNA means mRNA encoding Cas9 protein, and may have any nucleotide sequence as long as it can be translated into the amino acid sequence of Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is derived from a bacterium having a CRISPR system.
  • Bacteria known to have the CRISPR system include Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Arcaeoglobus, Halocarcula, Methanobacteria (Methanobacteriumn), Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Corynebacterium Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria (L isteria), Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azoarcus, Chromobacterium , Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Micrococcus, Campylobacter, W
  • the Cas9 protein can be a fusion protein with another protein or peptide.
  • Other proteins or peptides include, for example, fluorescent proteins, transcriptional regulators, epitope tags, protein purification tags, nuclear translocation signal peptides, and the like.
  • the Cas9 protein comprises an amino acid sequence having about 80% or more sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 shown in FIG. 1, and the Cas9 protein is gRNA-dependent. It may be a protein having a selective DNA binding activity and optionally having either or both of a RuvC nuclease activity and an HNH nuclease activity.
  • the Cas9 protein includes any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, or consists of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the Cas9 protein comprises an amino acid sequence having about 80% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has the gRNA-dependent DNA binding activity of the Cas9 protein, optionally RuvC and / or HNH It may be a protein having nuclease activity.
  • Cas9 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NOs: 1 to 4 are amino acid sequences of Cas9 protein derived from Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, and Treponema denticola, respectively.
  • the Cas9 protein comprises about 80% or more, such as about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4. More preferably about 97% or more, more preferably about 98% or more, more preferably about 99% or more, more preferably about 99.5% or more.
  • Amino acid sequence identity refers to the percentage of amino acid residues that are identical in the two sequences when the sequences are optimally aligned. Thus, for example, 90% amino acid sequence identity means that 90% of the amino acids are identical in two optimally aligned amino acid sequences.
  • Methods for calculating alignment and identity of amino acid sequences are well known to those skilled in the art. For example, a program such as BLAST can be used.
  • Cas9 mRNA can be obtained by cloning a DNA encoding the amino acid sequence of a desired Cas9 protein into an in vitro transcription vector and transcribing in vitro.
  • Suitable in vitro transcription vectors are known to those skilled in the art.
  • In vitro transcription vectors in which DNA encoding Cas9 protein has been cloned are also known, and include, for example, pT7-Cas9 that can be purchased from Origene.
  • In vitro transcription methods are known to those skilled in the art.
  • the solution containing Cas9 mRNA contains one or more additional nucleic acid molecules, which are introduced into the fertilized egg along with Cas9 mRNA.
  • the additional nucleic acid molecule can be, for example, gRNA, crRNA, tracrRNA or ssODN, gRNA alone, a combination of crRNA and tracrRNA, a combination of gRNA and ssODN, or a combination of crRNA, tracrRNA and ssODN.
  • the concentration of gRNA in the solution may be 1:20 to 1: 1 by weight, for example 1: 2, with respect to the concentration of Cas9 mRNA.
  • the solution may contain 200 ng / ⁇ l Cas9 mRNA and 100 ng / ⁇ l gRNA.
  • the concentration of crRNA and tracrRNA in the solution can be 1: 1: 20 to 1: 1: 1, eg 1: 1: 2, by weight relative to the concentration of Cas9 mRNA.
  • the solution may contain 200 ng / ⁇ l Cas9 mRNA, 100 ng / ⁇ l crRNA and 100 ng / ⁇ l tracrRNA.
  • the concentration of ssODN in the solution can be 200-1000 ng / ⁇ l, for example 600 ng / ⁇ l.
  • gRNA Genome editing requires target-specific gRNA.
  • guide RNA or “gRNA” means an artificial single-stranded RNA in which crRNA and tracrRNA are fused. There may be a linker sequence between crRNA and tracrRNA.
  • Cas9 protein can bind to genomic DNA in a target-specific manner in the presence of gRNA.
  • CrRNA is derived from bacterial endogenous RNA and is responsible for the sequence specificity of gRNA.
  • crRNA includes a target sequence in genomic DNA or a sequence complementary thereto.
  • a target sequence a nucleotide sequence having a PAM sequence immediately after is selected in genomic DNA.
  • the target sequence may be on any strand of genomic DNA.
  • the target sequence in genomic DNA needs to have a PAM sequence immediately after the target sequence.
  • the PAM sequence is present immediately after the target sequence in genomic DNA, but not immediately after the target sequence in gRNA.
  • the Cas9 protein can bind to any DNA sequence having a PAM sequence immediately after the target sequence.
  • the PAM sequence varies depending on the bacterial species from which the Cas9 protein is derived.
  • the most widely used Cas9 protein is derived from Staphylococcus pyogenis, and the corresponding PAM sequence is that of NGG located immediately after the 3 'end of the target sequence.
  • N represents any one of A, T, G, and C.
  • TracrRNA binds complementarily with a part of crRNA to form a hairpin structure. This structure is recognized by Cas9, and a complex of crRNA, tracrRNA and Cas9 is formed. Therefore, tracrRNA is responsible for the Cas9 protein binding ability of gRNA.
  • the tracrRNA is derived from bacterial endogenous RNA and has a sequence that varies depending on the bacterial species.
  • the tracrRNA of the present invention may be from a bacterium known to have the above-described CRISPR system, and preferably, the tracrRNA and Cas9 protein used for genome editing are derived from the same bacterial species. For example, tracrRNAs of Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, and Treponema denticola can be used.
  • a gRNA can be obtained by cloning a DNA having a desired gRNA sequence into an in vitro transcription vector and transcribing it in vitro. Suitable in vitro transcription vectors are known to those skilled in the art. In addition, in vitro transcription vectors containing sequences other than the target sequence of gRNA are known in the art. A gRNA can be obtained by synthesizing an oligonucleotide of the target sequence, inserting it into such a vector, and in vitro transcription.
  • Such vectors include, for example, pUC57-sgRNA expression vector, pCFD1-dU6: 1gRNA, pCFD2-dU6: 2gRNA pCFD3-dU6: 3gRNA, pCFD4-U6: 1_U6: 3tandemgRNAs, pRB17, pMB60, DR274, which can be purchased from addgene SP6-sgRNA-scaffold, pT7-gRNA, DR274, pUC57-Simple-gRNA backbone, and pT7-Guide-IVT available from Origene. In vitro transcription methods are known to those skilled in the art.
  • crRNA and tracrRNA are each separate RNA molecules, and their weight ratio can be 1:10 to 10: 1, such as 1: 1.
  • HDR Homologous recombination repair
  • CRISPR / Cas system can also be used to modify specific nucleotides of the target sequence.
  • a DNA repair template containing the desired sequence must be present during HDR.
  • ssODN single-stranded oligodeoxynucleotide
  • ssODN has high homology to sequences upstream and downstream of DSB. The length and position of each homology region depends on the size of the modification to be introduced.
  • HDR can modify specific nucleotides at the DSB site by the Cas9 protein.
  • the ssODN is designed not to include a target sequence having a PAM sequence immediately after it, so that the repaired gene is not cleaved by the Cas9 protein.
  • the ssODN can be prevented from being cleaved by the Cas9 protein by making the sequence corresponding to the PAM sequence different in the ssODN. Details of the design method of ssODN are described in, for example, Yang, H. et al., Cell, 154 (6), 1370-9 (2013), which is incorporated herein by reference.
  • ssODN is usually introduced into cells along with gRNA and Cas9 mRNA.
  • introducing mRNA encoding Cas9 protein into a fertilized egg” or “introducing Cas9 mRNA into a fertilized egg” means at least an electroporated fertilized egg or a cell derived from the fertilized egg. In one, it means introducing Cas9 mRNA into a fertilized egg in such an amount that Cas9 protein can be expressed.
  • the fertilized eggs are in an amount capable of genomic editing of at least one target gene in the genome in the presence of gRNA.
  • Cas9 mRNA is introduced.
  • the method of the invention further comprises the step of confirming that genome editing has occurred.
  • the occurrence of genome editing can be confirmed by various methods known in the art. For example, when the phenotype of the target gene is known, by detecting the change in the phenotype, or in the embryo cell generated from the fertilized egg, the genomic DNA sequence containing the target sequence is changed. This can be confirmed by decoding. In the case of HDR, RFLP (restriction fragment length polymorphism) can be evaluated by incorporating a restriction enzyme cleavage site into ssODN. These methods are well known in the art.
  • mammal includes any organism classified as a mammal. Mammals include, for example, primates (eg, monkeys, humans, etc.), rodents (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, etc.), cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, etc. Including. In certain embodiments, the mammal is a rodent. In certain embodiments, the mammal is a mouse.
  • fertilized egg means an egg or embryo after fertilization, and includes a fertilized egg (1 cell stage) and an early developmental embryo from the 2 cell stage to the blastocyst stage.
  • a fertilized egg may be a fertilized egg fertilized in vivo or in vitro, and may be frozen and stored as an ovum or a fertilized egg. Methods for preparing, culturing and storing fertilized eggs are known in the art. Preferably, before use in electroporation, the fertilized egg is washed with a solution for electroporation and the culture medium is removed.
  • the fertilized egg is in the 1-cell stage to the morula stage, preferably in the 1-cell stage to 8-cell stage, more preferably in the 1-cell stage to 4-cell stage, more preferably in the 1-cell stage to 2 stages.
  • electroporation is performed after about 6 hours, preferably after about 9 hours, more preferably after about 12 hours after fertilization.
  • electroporation is performed about 6 hours to about 18 hours after fertilization, preferably about 9 hours to about 15 hours, more preferably about 11 hours to 13 hours, such as about 12 hours. carry out.
  • a fertilized egg usually has a protective film called a zona pellucida.
  • the zona pellucida can be removed or thinned by acid tyrode solution treatment or the like, but in the method of the present invention, the zona pellucida may or may not be removed or thinned.
  • a fertilized egg from which the zona pellucida has not been removed or thinned is used.
  • One embodiment of the present invention includes culturing an electroporated fertilized egg and confirming the survival of the fertilized egg. Methods for culturing fertilized eggs are well known to those skilled in the art. The survival of the fertilized egg can be confirmed by observing that at least one cell division of the fertilized egg has occurred after electroporation.
  • a genome-edited mammalian fertilized egg can be obtained.
  • An embodiment of the present invention also provides a method for producing a genetically modified animal comprising transplanting a fertilized egg obtained by the method of the present invention to a recipient animal.
  • the recipient animal is usually a pseudopregnant female of the same animal species as the fertilized egg, and the fertilized egg is transplanted into the oviduct. Depending on the stage of development of the fertilized egg (embryo), it may be transplanted into the uterus. Recipient animals transplanted with fertilized eggs can give birth to genetically modified animals.
  • Methods for producing genetically modified animals are known to those skilled in the art. For example, the methods described in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, F th Edition (Cold Spring Harbor Press), which is incorporated herein by reference, are used.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 990 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 990 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 990 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg at the 1 cell stage between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg at the 1 cell stage between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and a fertilized egg at the 1 cell stage between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a mixture of fertilized eggs between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a mixture of fertilized eggs between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of a solution containing about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a 1 cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) Applying a voltage of about 20 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 15 msec or more, or applying a voltage of about 30 V or more per 1 mm distance between electrodes for about 9 msec or more between the electrodes; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a 1 cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of about 200 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA and gRNA and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA and tracrRNA and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of about 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, gRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the method of the invention comprises: (A) placing a mixture of approximately 50 ng / ⁇ l or more of Cas9 mRNA, crRNA, tracrRNA and ssODN and a 1-cell stage fertilized egg between the electrodes for electroporation; (B) applying a voltage of about 30 V or more per electrode distance of 1 mm or more between the electrodes for about 21 msec or more; However, the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes. Including each stage.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes, and the product of the voltage and the energization time is about 990 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes
  • the product of the voltage and the energization time is about 630 V msec or less per 1 mm distance between the electrodes
  • the voltage may be divided into two or more pulses.
  • (D) A voltage that achieves an mRNA introduction efficiency (R) that is equal to or higher than the minimum mRNA introduction efficiency (R min ) calculated by the equation (B), and a voltage in the direction opposite to that in step (c) between the electrodes.
  • the voltage is about 20 V to about 55 V per 1 mm distance between the electrodes
  • the product of the voltage and the energization time is about 630 Vmsec or less per 1 mm distance between the electrodes
  • the voltage is applied in two or more pulses. May be Each stage of When the voltage is divided into two or more pulses in steps (c) and (d), a pulse in the reverse direction may be applied after continuously applying a pulse in one direction, and pulses in each direction are alternately applied. You may apply random pulses in each direction. Method.
  • the Cas9 protein is a protein comprising an amino acid sequence having about 90% or more sequence identity to any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and binding to DNA in a gRNA-dependent manner.
  • the Cas9 protein comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
  • a method for producing a fertilized egg of a mammal expressing Cas9 which comprises introducing Cas9 mRNA into the fertilized egg of a mammal by the method according to any one of items [1] to [39].
  • Genomic editing is performed on a fertilized egg of a mammal, including introducing Cas9 mRNA and an additional nucleic acid molecule into the fertilized egg of the mammal by the method according to any one of items [35] to [38].
  • Method. [42] The method of item [41], further comprising the step of confirming that genome editing has occurred.
  • a genome-edited mammalian fertilized egg comprising introducing Cas9 mRNA and a further nucleic acid molecule into the mammalian fertilized egg by the method according to any of items [35] to [38].
  • Manufacturing method [44] A method for producing a genetically modified animal, comprising transplanting a fertilized egg obtained by the method according to item [43] to a recipient animal.
  • Cas9 mRNA can be efficiently and rapidly introduced into a fertilized egg of a mammal by electroporation.
  • the advantages of electroporation are high embryo viability and a time consuming technique that does not require special procedures.
  • electroporation can be achieved in a few minutes with a simple operation.
  • commercially available electroporation systems are generally cheaper than microinjection systems. Therefore, the present invention can contribute to increasing the efficiency, speeding up, and reducing the cost of genome editing using the CRISPR / Cas system and the production of genetically modified animals using the genome editing.
  • hCas9 plasmid (pX330) was purchased from Addgene (Cambridge, Massachusetts, USA). hCas9 excised from pX330 was ligated downstream of the SP6 promoter of pSP64 vector (Promega) (pSP64-hCas9) and used for mRNA synthesis.
  • pCS2-mCherry and pSP64-hCas9 were linearized with NotI and SalI, respectively.
  • MCherry and hCas9 mRNA were synthesized using an in vitro RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, Austin, TX, USA) using the linear plasmid as a template.
  • mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion, Austin, TX, USA
  • Oligonucleotide pairs targeting Fgf10 or mCherry were annealed and inserted into the BsaI restriction enzyme site of the pDR274 vector (addgene).
  • the sequence of the oligonucleotide is as follows. Fgf10 (5'-GGAGAGGACAAAAAACAAGA-3 '(SEQ ID NO: 5) and its complementary sequence) and mCherry (5'-GGCCACGAGTTCGAGATCGAGGG-3' (SEQ ID NO: 6) and its complementary sequence).
  • gRNA was synthesized using MEGAshortscript T7 Transcription Kit (Ambion, Austin, TX, USA).
  • RNA Synthesized RNA (mRNA and gRNA) was purified by phenol chloroform isoamyl alcohol extraction and isopropanol precipitation. The precipitated RNA was dissolved in Opti-MEM-I at a concentration of 2-4 ⁇ g / ⁇ l and stored at ⁇ 20 ° C. until use. RNA was quantified with a spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. ssODN was purchased dry from Sigma®, dissolved in Opti-MEM® I at a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l, and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • mice of mouse strain ICR (Clea Japan) or B6D2F1 (C57BL / 6xDBA2F1) (Japan SLC) were used.
  • the ICR line was mainly used for determination of electroporation conditions, and the B6D2F1 line was used for genome editing.
  • mWM medium (arc resources, Japan) or KSOM medium (95mM NaCl, 2.5mM KCl, 0.35mM KH 2 PO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.2mM MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.2 mM glucose, 10 mM sodium lactate, 25 mM NaHCO 3 , 0.2 mM sodium pyruvate, 1.71 mM CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.01 mM Na 2 -EDTA ⁇ 2H 2 O, 1 mM L-glutamine, 1 mg / ml BSA).
  • An electroporation platinum block electrode (length: 10 mm, width: 3 mm, height: 0.5 mm, gap: 1 mm) (Vex Co., Ltd. (hereinafter referred to as BEX), Tokyo, Japan) was outsourced and used ( FIG. 2a).
  • the signal intensity of mCherry fluorescence was measured 15 hours after electroporation.
  • An Axio Observer.Z1 inverted microscope (Zeiss, Germany) equipped with a Nipcor disc confocal unit CSU-W1 (Yokogawa, Japan) was used.
  • the fluorescence signal was detected by EM-CCD camera ImageM (Hamamatsu Photonics, Japan), and the data was analyzed by HC image software and NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
  • the measured fluorescence intensity is a relative value depending on the conditions of acquisition and analysis of the fluorescence signal, and can be compared only when all the conditions match.
  • Fgf10 and H2b-mCherry genome-edited Cas9 mRNA and gRNA targeting Fgf10 or H2b-mCherry were introduced into fertilized eggs recovered from B6D2F1 females by electroporation as described above.
  • ssODN was introduced together with Cas9 mRNA and gRNA.
  • Sequences ssODN for H2b-mCherry are as follows; 5'-AGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCC-3 '(SEQ ID NO: 7), and, 5'-CGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC-3' (SEQ ID NO: 8).
  • Surviving 2-cell stage embryos were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice on the day the vaginal plug occurred. Alternatively, embryos were cultured in vitro to the blastocyst stage (E4.5).
  • Fgf10Fwd (5′-CAGCAGGTCTTACCCCTTCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
  • Fgf10Rev 5′-TACAGGGGTTGGGGACATAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10 )
  • H2b-mCherryFwd GAGGGCACTAAGGCAGTCAC (SEQ ID NO: 11)
  • H2b-mCherryRev CCCATGGTCTTCTTCTGCAT (SEQ ID NO: 12)
  • PCR amplification products of Fgf10 or H2b-mCherry were cloned into pMD20 (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) vector. Ten plasmids were isolated from each embryo and the genomic region was sequenced. Sequencing was performed using BigDye TM Terminator TM Cycle TM Sequencing Kit TM ver. 3.1 TM and ABI TM 3500 Genetic TM Analyser TM (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA).
  • Electroporation conditions for introducing mRNA into mouse fertilized eggs The electroporation conditions for introducing mRNA into mouse fertilized eggs without treating the zona pellucida with acid were examined.
  • the electroporation system shown in FIG. 2a was prepared.
  • a platinum block electrode (FIG. 2c) having a gap distance of 1 mm, a length of 10 mm, a width of 3 mm, and a height of 0.5 mm and capable of holding 5 ⁇ l of solution between the electrodes was set on a stereomicroscope (FIG. 2a left), and an electroporator (CUY21EDIT II) (Fig. 2a right).
  • a stereomicroscope FIG. 2a left
  • an electroporator CUY21EDIT II
  • FIG. 2a is a photograph of the electroporation apparatus used in this experiment.
  • FIG. 2b is an enlarged view of a portion surrounded by a square in FIG. 2a.
  • FIG. 2c is a schematic diagram of a platinum block electrode. The fertilized egg is placed in the mRNA solution in the gap between the electrodes.
  • FIG. 2d is a microscopic image of a fertilized egg placed in the gap between the electrodes.
  • FIG. 2e is a schematic diagram of electroporation conditions for introducing mRNA into fertilized eggs of mice, and shows that 10V to 50V, 3 msec square pulses are repeated 3 to 11 times at 97 msec intervals. .
  • FIG. 3b is a plot of the fluorescence intensity ( ⁇ ) and survival to the blastocyst stage ( ⁇ ) of embryos electroporated with various pulse repetitions.
  • the fluorescence intensity of mCherry is 7.9 for 3 times, 14.7 for 5 times, 27.1 for 7 times, 40.6 for 9 times, 65.9 for 11 times, and increases with the number of pulses. did. Survival to the blastocyst stage began to decline in 7 iterations and reached about 50% in 11 iterations.
  • the approximate expression of the graph shown in FIG. 4 was created using Excel software.
  • the mRNA introduction efficiency R at each voltage is expressed by the following approximate expression using the energization time t (msec).
  • 20V R 0.0005 ⁇ t 3 ⁇ 0.000057 ⁇ t 2 + 0.2847 ⁇ t
  • 30V R 0.0015 ⁇ t 3 ⁇ 0.0191 ⁇ t 2 + 0.9498 ⁇ t
  • 40V R 0.0005 ⁇ t 3 + 0.0508 ⁇ t 2 + 0.9922 ⁇ t 50V
  • R 0.0078 ⁇ t 3 ⁇ 0.1414 ⁇ t 2 + 3.0103 ⁇ t
  • Electroporation using pulses in both directions As in Example 1, mCherry mRNA was introduced into E0.5 fertilized eggs by electroporation. The voltage and pulse time were fixed at 30 V and 3 msec, and the number of pulse repetitions and the voltage direction were changed as shown in FIG. 5c.
  • x6 indicates that six pulses were given from one direction.
  • X + 3-3 indicates that three pulses were given from one direction, followed by three pulses from the reverse direction.
  • Xalt ⁇ 3 indicates that pulses from both directions were alternately given three times. The same applies to x + 6-6 and xalt ⁇ 6.
  • the fluorescence intensity of mCherry increased with the number of pulses regardless of the voltage direction (FIG. 5a). Survival rates up to the blastocyst stage were both high (FIG. 5b), especially at x + 6-6 and xalt ⁇ 6 compared to when 12 pulses were given from one direction.
  • Fgf10 gene which is essential for limb development, was targeted. Fgf10 homozygous mutant embryos have already been shown to develop in the absence of extremities (Sekine, K. et al., Nature Genetics 21, 138-141, which is incorporated herein by reference). 1999)), gene disruption can be easily confirmed by phenotype. Furthermore, disruption of this gene by the CRISPR / Cas system has been carried out by microinjection of Cas9 mRNA and gRNA (Yasue, A. et al., Scientific Reports 4, 5705, which is incorporated herein by reference). 2014).
  • FIG. 6a shows the genomic structure of the Fgf10 locus, including the target sequence used in this experiment (underlined) and the PAM sequence (AGG, capital letters). Embryos were developed to the 2-cell stage and transferred to pseudopregnant females. Mice were dissected with E15 or E16 and the morphology of the embryo was observed.
  • FIG. 6b shows representative examples of three categories of embryos showing different limb phenotypes: no limb, limb abnormality (left: hind limb loss, right: forelimb and hindlimb shortening) or normal.
  • FIG. 6c is a graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electroporation on limb development. The concentration of RNA used in each experiment is shown on the left of the graph. The numbers in each column represent the number of embryos showing the phenotype of each category.
  • Table 1 shows the concentrations of Cas9 mRNA and gRNA used, 2 cell stage viability, embryo viability at E15 or E16.
  • Table 2 shows the generation of Fgf10 mutant embryos by electroporation of Cas9 RNA and gRNA.
  • Table 1 Survival rate of electroporated embryos
  • Table 2 Morphological abnormalities of electroporated embryos The survival rate of electroporated fertilized eggs at the 2-cell stage (94 to 95% in Table 1) is significantly higher than that of microinjection (34 to 35% in Yasue, A. et al.). It was expensive.
  • Genomic editing of mCherry gene by electroporation of Cas9 mRNA and gRNA Fertilized egg with Histon2b (H2b) -mCherry gene at the Rosa26 locus was used for electroporation.
  • H2b-mCherry is ubiquitously expressed under the control of the Rosa26 promoter, and mCherry fluorescence is observed in all nuclei at the 4-8 cell stage.
  • mCherry fluorescence disappears.
  • RNA concentration enabling genome editing was examined by electroporation in which 30 V, 3 msec electric pulses were repeated seven times.
  • Cas9 mRNA and gRNA targeting H2b-mCherry were introduced into fertilized eggs (E0.5), cultured in KSOM medium in vitro to the blastocyst stage (E4.5), and the nuclear mCherry fluorescence was examined.
  • E0.5 fertilized eggs
  • KSOM medium in vitro to the blastocyst stage
  • the nuclear mCherry fluorescence was examined.
  • electroporated with fertilized eggs at concentrations of 200 ng / ⁇ l Cas9 mRNA and 100 ng / ⁇ l mCherry gRNA, the mCherry fluorescence disappeared completely.
  • Genome editing by electroporation using high concentrations of Cas9 mRNA 2000 ng / ⁇ l of Cas9 mRNA and 1000 ng / ⁇ l of gRNA were used to examine the electrical conditions to achieve genome editing.
  • Cas9 mRNA and gRNA were introduced into E0.5 mouse fertilized eggs, cultured in vitro to the blastocyst stage (E4.5), and the nuclear mCherry fluorescence was examined. The results are shown in FIG. In embryos that were not electroporated, mCherry fluorescence was seen in all blastomeres (FIG. 7a).
  • 8a is a schematic diagram of a ssODN for inserting a target sequence and a 37 base loxP sequence and an EcoRI recognition site.
  • the replaced allele loses function due to a stop codon in the loxP sequence and the nuclear mCherry fluorescence disappears.
  • Substitution with ssODN was screened by EcoRI digestion and RFLP (restriction fragment length polymorphism).
  • FIG. 8b is a photograph of a representative electroporated embryo.
  • FIG. 8c shows the results of RFLP analysis of the recovered embryos.
  • the allele with the EcoRI recognition site inserted is cleaved into two bands (138 bps and 374 bps) by EcoRI.
  • the uncleaved allele is 497 bps. Cleaved bands were observed in # 3, 6, 8, and 9 embryos. That is, of the embryos in which mCherry fluorescence disappeared, 4 were positive for EcoRI cleavage.
  • the unexpected bands of # 1 and 7 indicate a long deletion of the target gene.
  • FIG. 9a is a schematic diagram of a target sequence and ssODN (SEQ ID NO: 8) for inserting an EcoRV recognition site.
  • FIG. 9b shows the results of RFLP analysis of the recovered embryos. The allele with EcoRV inserted is cleaved into two bands (341 bps and 92 bps). The uncut allele is 431 bps. Cleaved bands were observed in # 2, 3, 5 and 6 embryos.

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Abstract

　本発明は、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）を導入する方法であって、（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、（ｂ）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、の各段階を含む方法に関する。

Description

Ｃａｓ９　ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１５－０３１００６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本発明は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）を哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法に関する。本発明は、また、上記方法を利用して、Ｃａｓ９を発現する哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することに関する。
　遺伝子改変動物は、現在、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-Finger Nucleases））、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases））およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System））などの人工制限酵素を利用する系が、近年注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。
　ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製は、通常、前核期胚に人工制限酵素の遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行われる。現在はこの方法が主流であるが、細胞の損傷を防ぐには、熟練された手技を要する。さらに、マイクロインジェクションでは、専用の機械を使用して前核期胚に１つずつＤＮＡおよび／またはＲＮＡを注入しなければならず、多数の細胞を同時に処理する場合には不便である。
　エレクトロポレーションは、目的の遺伝子を、細胞または組織に導入するのに有用な手段であり、多くの生物種で幅広く用いられてきた。マウスでは、この技法は、胎児および出生後の個体の脳、精巣および筋肉を含む様々な組織に使用されてきた。一方、受精卵への遺伝子導入は、主にマイクロインジェクションにより行われてきた。例えば、直鎖状ＤＮＡをゲノムに挿入するために前核へのマイクロインジェクションが使用され、所望の遺伝子をゲノムに挿入せず、一過性に発現させるために、環状プラスミドまたはｍＲＮＡのマイクロインジェクションが使用されてきた。最近になって確立されたマウスのゲノム編集も、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、または、これらのＲＮＡを発現するプラスミドを受精卵の細胞質または前核に１つずつマイクロインジェクションすることにより実施されている。マイクロインジェクションは、かなりの時間と熟練された手技を必要とし、ゲノム編集による遺伝子改変マウスの作製において技術的律速段階となっている（非特許文献１）。
　マウス受精卵に遺伝子を導入するのに、エレクトロポレーションは今まで殆ど使用されていない。例外としては、内在性遺伝子をノックダウンするために、タンパク質をコードしないｄｓＲＮＡをエレクトロポレーションによりマウス受精卵に導入したことが報告されている（非特許文献２）。この方法は、エレクトロポレーションの前に酸性タイロード液により透明帯を除去または薄化する処理を必要とするが、透明帯は着床前の胚にとって重要な構造であり、その酸性タイロードによる処理はマウス胚に対して毒性作用があることが知られているので、この方法は実用的ではない。また、この方法では１ｋｂ未満の短いＲＮＡが導入されたにすぎない。酸性タイロード処理を行わないエレクトロポレーションも報告されているが、５００ｂｐ程度のｄｓＤＮＡを、マウスの胚盤胞期胚に導入したにすぎない（非特許文献３）。
　ごく最近、透明帯を処理していないラット受精卵へのエレクトロポレーションによるＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの導入が報告された（非特許文献４）。この報告では、１０００～２０００ｎｇ／μｌの高濃度のｍＲＮＡが使用されたにも拘わらず、ゲノム編集の効率は非常に低く、出生児の９％未満がゲノム編集されたに留まる。
米国特許第８６９７３５９号
Wang, H. et al., Cell 153, 910-918 (2013) Grabarek, JB. et al., Genesis 32:269-276 (2002) Soares, ML. et al., BMC Developmental Biology 2005, 5:28 Kaneko, T. et al., Scientific Reports 4, 6382 (2014) Peng, H. et al., (2012) PLos  ONE 7(8): e43748 Ohnishi Y. et al., Nucleic Acids Research, 2010, Vol.38, No.15 5141-5151 Mazari, E. et al., Development (2014) 141, 2349-2359 Yasue A., et al., Scientific Reports 4, 5705 (2014) Yang, H. et al., Cell 154, 1370-1379 (2013) Mashiko, D. et al., Scientific Reports 3, 3355 (2013)
　本発明者らは、鋭意研究の末、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵に導入するためのエレクトロポレーションの最適条件を決定し、本発明を完成した。
　本発明は、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）を導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
　本発明は、また、Ｃａｓ９を発現する哺乳動物の受精卵の製造方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
　本発明は、また、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、さらなる核酸分子は、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）の組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
　本発明は、また、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、さらなる核酸分子は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
　本発明は、また、上記の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、遺伝子改変動物の作製方法を提供する。
　本発明により、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより哺乳動物の受精卵に導入することができる。
図１－１は、配列番号１のアミノ酸配列を示す。 図１－２は、配列番号２のアミノ酸配列を示す。 図１－３は、配列番号３のアミノ酸配列を示す。 図１－４は、配列番号４のアミノ酸配列を示す。 図２は、エレクトロポレーション装置を示す。 図３は、様々な条件でｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションされた胚のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度および胚盤胞期までの生存率を示す。 図４は、図３に基づいて、各通電時間でのｍＲＮＡ導入効率を電圧毎に予想したグラフである。 図５は、両方向のパルスを用いてｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションされた胚のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度および胚盤胞期までの生存率を示す。 図６は、エレクトロポレーションによる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系でのＦｇｆ１０のゲノム編集を示す。 図７は、高濃度のＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用するエレクトロポレーションによるゲノム編集を示す。 図８は、エレクトロポレーションによる、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子座でのｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（single-stranded oligodeoxynucleotide））によるＨＤＲ（相同組換え修復（Homology Directed Repair））を示す。 図９は、エレクトロポレーションによる、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子座でのｓｓＯＤＮによるＨＤＲを示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、発生生物学、細胞生物学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般的に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「２０±１０％～３０±１０％」を含むものとする。
エレクトロポレーション
　本発明で使用するエレクトロポレーターは、電気パルスの発生装置を意味し、本発明の段階（ａ）および（ｂ）を実施できるものであればどのようなものでもよい。エレクトロポレーターは、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
　本発明において、「エレクトロポレーション用電極」は、従来のエレクトロポレーション法において使用されるあらゆる電極を含む。例えば、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。通常、２本の電極が約０.２５ｍｍないし約１０ｍｍ、例えば約０.５ｍｍないし約４ｍｍまたは約１ｍｍないし約２ｍｍのギャップをあけて配置され、そのギャップにＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くことができる。電極は、混合物を入れるための容器と組み合わせたキュベット電極であってもよい。エレクトロポレーション用電極は、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
　本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、例えば、約３０ｎｇ／μｌないし約２０００ｎｇ／μｌ、約５０ｎｇ／μｌないし約１０００ｎｇ／μｌ、約５０ｎｇ／μｌないし約５００ｎｇ／μｌ、約５０ｎｇ／μｌないし約３００ｎｇ／μｌ、約５０ｎｇ／μｌないし約２００ｎｇ／μｌ、約２００ｎｇ／μｌないし約１０００ｎｇ／μｌ、約２００ｎｇ／μｌないし約５００ｎｇ／μｌまたは約２００ｎｇ／μｌないし約３００ｎｇ／μｌの濃度で含む。本発明のある実施態様では、溶液は約２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む。一定の電気条件下では、溶液中のＣａｓ９ ｍＲＮＡの濃度が高いほど、ｍＲＮＡ導入量は多くなる。
　本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液は、エレクトロポレーションに使用できる任意の溶液にＣａｓ９ ｍＲＮＡを溶解したものである。エレクトロポレーションに使用できる溶液は、エレクトロポレーションを実施する間に受精卵が生存できる培地またはバッファーであればよく、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ、ＰＢＳ、ＨＢＳ、ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋｓ、ＨＣＭＦなどの培地またはバッファーが含まれる。好ましくは、溶液は血清を含まない。
　本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物をエレクトロポレーション用電極の間に置く。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵を予め混合したものを電極間に添加しても、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵を別々に電極間に添加してもよい。混合物は、上記電極のギャップを満たす体積で、例えば、約１μｌないし約５０μｌ、好ましくは約１.５μｌないし約１５μｌ、より好ましくは、約２μｌないし約１０μｌの体積で使用する。本発明のある実施態様では、混合物の体積は約５μｌである。
　本発明の段階（ｂ）では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度によって規定される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成するように、電極間に電圧をかける。最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）は、下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される。
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
　本発明の段階（ｂ）において、ｍＲＮＡ導入効率は、電極間にかける電圧と通電時間に依存する。ｍＲＮＡ導入効率は、通電時間がｔ（ｍｓｅｃ）であり、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される。但し、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖの場合は式（ＩＩ）を用いてｍＲＮＡ導入効率を算出し、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖの場合は式（ＩＩＩ）を用いてｍＲＮＡ導入効率を算出し、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖの場合は式（ＩＶ）を用いてｍＲＮＡ導入効率を算出する。
　本発明の段階（ｂ）において、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、段階（ａ）の溶液のＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上であればよい。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が５０ｎｇ／μｌのとき、Ｒｍｉｎは１７.６であり、Ｒは１７.６以上であればよく、例えば２５以上、好ましくは２７.１以上である。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が２００ｎｇ／μｌのとき、Ｒｍｉｎは４.４１であり、Ｒは４.４１以上であればよく、好ましくは７.９以上であり、より好ましくは１４.７以上であり、最も好ましくは２７.１以上である。 
　例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が５０ｎｇ／μｌのとき、Ｒｍｉｎは１７.６である。このＲｍｉｎ以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成するには、例えば、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約３１ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約１７ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約１１ｍｓｅｃ以上、約５０Ｖの電圧を約７.５ｍｓｅｃ以上かける。好ましくは、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約３６ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約２１ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約１４ｍｓｅｃ以上、約５０Ｖの電圧を約１１ｍｓｅｃ以上かける。特に好ましくは、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約３７ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約２２ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、約５０Ｖの電圧を約１２ｍｓｅｃ以上かける。ある実施態様では、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖの電圧を約２１ｍｓｅｃかける。
　例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が２００ｎｇ／μｌのとき、Ｒｍｉｎは４.４１である。このＲｍｉｎ以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成するには、例えば、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約５ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約３.８ｍｓｅｃ以上、約５０Ｖの電圧を約１.６ｍｓｅｃ以上かける。好ましくは、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約２１ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約９ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約６ｍｓｅｃ以上、約５０Ｖの電圧を約３ｍｓｅｃ以上かける。より好ましくは、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約２９ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約１０ｍｓｅｃ以上、約５０Ｖの電圧を約６ｍｓｅｃ以上かける。特に好ましくは、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖの電圧を約３７ｍｓｅｃ以上、約３０Ｖの電圧を約２２ｍｓｅｃ以上、約４０Ｖの電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、約５０Ｖの電圧を約１２ｍｓｅｃ以上かける。ある実施態様では、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖの電圧を約２１ｍｓｅｃかける。
　本発明の段階（ｂ）において、ｍＲＮＡ導入効率は電圧および通電時間に伴って増加するが、電圧が高すぎると、あるいは、通電時間が長すぎると、受精卵の生存率が低下する傾向がある。本発明の段階（ｂ）において、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖ、好ましくは約２０Ｖないし約４０Ｖ、さらに好ましくは約２５Ｖないし約３５Ｖ、最も好ましくは約３０Ｖである。通電時間は、電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下、さらに好ましくは約８１０ｍｓｅｃ以下、より好ましくは約６３０Ｖｍｓｅｃ以下であるように設定する。
　段階（ｂ）における電圧は一定であっても、変動してもよい。本発明のある実施態様では、段階（ｂ）における電圧は一定である。その場合、エレクトロポレーターとして、従来のスクエアパルス式エレクトロポレーターを使用できる。
　本発明のある実施態様では、電圧を複数のパルスに分けてかける。例えば、電圧を２回ないし１５回、３回ないし１１回、５回ないし９回、または、６回ないし８回のパルスに分けてかける。本発明のある実施態様では、電圧を７回のパルスに分けてかける。各パルスの時間は、例えば、約０.０１ｍｓｅｃ～約３３ｍｓｅｃ、約０.５ｍｓｅｃ～約１５ｍｓｅｃ、約１ｍｓｅｃ～約１０ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃないし約５ｍｓｅｃ、例えば、約３ｍｓｅｃである。各パルス間の間隔は、例えば、約０.５ないし約５００ｍｓｅｃ、好ましくは約５ないし約２５０ｍｓｅｃ、より好ましくは約１０ないし約１５０ｍｓｅｃ、さらに好ましくは約８０ないし１２０ｍｓｅｃである。本発明のある実施態様では、パルス間の間隔は約９７ｍｓｅｃである。
　本発明において、電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの大きさは同じであっても、異なっていてもよい。
　本発明において、電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの方向は同じであってもよく、少なくとも１つのパルスの方向が他のパルスと逆であってもよい。また、両方向のパルスを用いる場合、各方向のパルスはいかなる順序であってもよい。例えば、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい。
　本発明において、「逆方向のパルス」は、２本のエレクトロポレーション用電極の一方を陽極とし、他方を陰極とするパルスに対して、陽極と陰極を入れ替えた場合のパルスを意味する。同様に、「逆方向の電圧」は、２本のエレクトロポレーション用電極の一方を陽極とし、他方を陰極とする電圧に対して、陽極と陰極を入れ替えた場合の電圧を意味する。
　本発明において、段階（ｂ）の代わりに、下記の段階（ｃ）および（ｄ）を実施してもよい。
（ｃ）下式（Ｂ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ｂ）　　　Ｒｍｉｎ＝４４１／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下、好ましくは５４０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
（ｄ）式（Ｂ）により算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階（ｃ）とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下、好ましくは５４０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
の各段階を含み、
段階（ｃ）および（ｄ）で電圧を２回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい。
　段階（ｃ）および（ｄ）では、段階（ｂ）に準じて、電圧および通電時間等の条件を決定し得る。
ゲノム編集
　本発明において、「ゲノム編集」は、人工制限酵素を使用して哺乳動物細胞の１つまたはそれ以上の遺伝子を改変することを意味する。ゲノム編集により、対立遺伝子の一方または両方が改変される。本発明では、細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム編集を行う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第８６９７３５９号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
　一般的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集には、エンドヌクレアーゼのＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡが必要である。ｇＲＮＡは、細菌のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて１つのキメラＲＮＡにしたものである。従って、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的配列特異性と、Ｃａｓ９タンパク質の足場となるｔｒａｃｒＲＮＡの特性を併せ持つ。ｇＲＮＡとＣａｓ９が細胞内で発現されると、ゲノム内の標的配列が永続的に改変され得る。
　ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ内の標的配列との相補的塩基結合により、標的配列にリクルートされる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が標的配列に結合するためには、ゲノム内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（Protospacer Adjacent Motif））配列を含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的配列への結合は、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の標的配列に局在化させ、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの両方の鎖を切断し、ＤＳＢ（二本鎖切断（Double Strand Break））を引き起こす。ＤＳＢは、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（Non-Homologous End Joining））ＤＮＡ修復経路、または、ＨＤＲ（相同組換え修復）経路により修復され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢの部位にしばしば塩基の挿入／欠損を与え、それはフレームシフトおよび／または停止コドンをもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し得る。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを修復するために、修復鋳型の存在を必要とする。ＨＤＲでは、修復鋳型の配列が、切断された標的配列に忠実に複写される。修復鋳型とＨＤＲを利用して、標的遺伝子に所望の変異を導入できる。
Ｃａｓ９タンパク質
　野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、ＤＮＡの二本鎖の異なる鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９タンパク質はゲノムＤＮＡにＤＳＢ（二本鎖切断）を引き起こす。ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかの触媒活性のみを有するＣａｓ９タンパク質も開発されている。この場合、Ｃａｓ９タンパク質は標的ＤＮＡのいずれかの鎖のみを切断する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ変異により不活性化され、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ変異により不活性化される。
　Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性は、そのヌクレアーゼ活性から独立している。ヌクレアーゼ活性を担うＲｕｖＣおよびＨＮＨが不活性であり、Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を全く持たない場合でも、Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を保持する。従って、ヌクレアーゼとして不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９タンパク質）を、分子生物学的ツールとして利用することができる。例えば、ｇＲＮＡを利用してｄＣａｓ９タンパク質を既知の転写調節ドメインに結合させることにより、遺伝子の発現を活性化または抑制する転写レギュレーターとして利用することができる。例えば、転写活性化因子と融合させたｄＣａｓ９タンパク質は、標的配列の転写を活性化できる。逆に、ｄＣａｓ９タンパク質のみが標的配列に結合すると、転写を抑制し得る。遺伝子のプロモーターに近い領域にあるｇＲＮＡ標的配列を選択することにより、様々な遺伝子の転写を調節することができる。あるいは、クロマチン免疫沈降などにおいて、エピトープタグに融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと共に使用することにより、ゲノムＤＮＡを精製できる。ＧＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質マーカーと融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて、生きている細胞で検出可能なＤＮＡ標識として使用することもできる。
　本発明において、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を有するタンパク質を意味し、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を有するものも、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有さないものも含まれる。Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性およびヌクレアーゼ活性は、例えば、引用により本明細書の一部とするSamuel H. Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014) に記載の方法により測定できる。
　本発明において、「Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ」は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味し、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列であれば、どのようなヌクレオチド配列を有してもよい。
　本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌には、アエロピュルム属（Aeropyrum）、ピュロバクルム属（Pyrobaculum）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、ハロアーキュラ属（Halocarcula）、メタノバクテリウム属（Methanobacteriumn）、メタノコックス属（Methanococcus）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノピュルス属（Methanopyrus）、ピュロコックス属（Pyrococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクウィフェクス属（Aquifex）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、クロロビウム属（Chlorobium）、サーマス属（Thermus）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、アゾアルカス属（Azoarcus）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、デスルフォビブリオ属（Desulfovibrio）、ジオバクター属（Geobacter）、マイクロコッカス属（Micrococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ウォリネラ属（Wolinella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、レジオネラ属（Legionella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、パスツレラ属（Pasteurella）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ザントモナス属（Xanthomonas）、エルシニア属（Yersinia）、トレポネーマ属（Treponema）およびテルモトガ属（Thermotoga）などに属する細菌が含まれる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）などの細菌に由来するものである。
　本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質であり得る。他のタンパク質またはペプチドには、例えば、蛍光タンパク質、転写調節因子、エピトープタグ、タンパク質精製用タグ、核移行シグナルペプチドなどが含まれる。
　本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、図１に示す配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣヌクレアーゼ活性およびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列からなる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１のアミノ酸配列からなる。配列番号１ないし４は、各々、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラ由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列である。
　本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に、約８０％以上、例えば約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以上、より好ましくは約９９.５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、配列を最適にアライメントした場合に、２つの配列において同一であるアミノ酸残基の割合を意味する。従って、例えば、９０％アミノ酸配列同一性とは、最適にアライメントされた２つのアミノ酸配列において９０％のアミノ酸が同一であることを意味する。アミノ酸配列のアライメントおよび同一性の計算の方法は当業者に周知であり、例えば、BLAST等のプログラムを利用することができる。
　所望のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされているインビトロ転写用ベクターも公知であり、例えば、Origene 社から購入できる pT7-Cas9 が含まれる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
　本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液は、１種またはそれ以上のさらなる核酸分子を含み、当該核酸分子がＣａｓ９ ｍＲＮＡと共に受精卵に導入される。さらなる核酸分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｓＯＤＮであり得、ｇＲＮＡ単独、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せ、または、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せを使用できる。
　溶液中のｇＲＮＡの濃度は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの濃度に対して、重量で１：２０～１：１、例えば１：２であり得る。例えば、溶液は、２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを含み得る。溶液中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの濃度は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの濃度に対して、重量で１：１：２０～１：１：１、例えば１：１：２であり得る。例えば、溶液は、２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、１００ｎｇ／μｌのｃｒＲＮＡおよび１００ｎｇ／μｌのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。溶液中のｓｓＯＤＮの濃度は、２００～１０００ｎｇ／μｌ、例えば６００ｎｇ／μｌであり得る。
ｇＲＮＡ
　ゲノム編集には、標的特異的なｇＲＮＡが必要である。本発明において、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡの存在下で標的特異的にゲノムＤＮＡに結合できる。
　ｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、ｇＲＮＡの配列特異性を担う。本発明において、ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内の標的配列またはそれに相補的な配列を含む。標的配列としては、ゲノムＤＮＡ内で、その直後にＰＡＭ配列を有するヌクレオチド配列を選択する。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。
　Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡに結合するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有する必要がある。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列の直後に存在するが、ｇＲＮＡ内の標的配列の直後には存在しない。Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有するいかなるＤＮＡ配列にも結合できる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌の種により異なる。最も広く使用されているＣａｓ９タンパク質はスタフィロコッカス・ピオゲニスに由来し、対応するＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端の直後に位置するＮＧＧの配列である。様々な細菌の種とＰＡＭ配列の組合せが知られており、例えば、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。
　ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合し、ヘアピン構造を形成する。この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９の複合体が形成される。従って、ｔｒａｃｒＲＮＡはｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担う。ｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、細菌の種によって異なる配列を有する。本発明のｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌のものであり得、好ましくは、ゲノム編集に使用するｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、同じ細菌の種に由来する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラのｔｒａｃｒＲＮＡを使用できる。
　所望のｇＲＮＡ配列を有するＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが当分野で公知である。標的配列のオリゴヌクレオチドを合成し、そのようなベクターに挿入し、インビトロ転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。そのようなベクターには、例えば、addgene から購入できる、pUC57-sgRNA expression vector、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs、pRB17、pMB60、DR274、SP6-sgRNA-scaffold、pT7-gRNA、DR274、pUC57-Simple-gRNA backbone、並びに、Origene社から購入できるpT7-Guide-IVTが含まれる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
　ｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用してもよい。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用する場合、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは各々分離したＲＮＡ分子であり、これらの重量比は１：１０～１０：１、例えば１：１であり得る。
ＨＤＲ（相同組換え修復）
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、また、ＨＤＲを利用して、標的配列の特定のヌクレオチドを改変することもできる。ＨＤＲによりゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオチドを改変するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。本発明のある実施態様では、ＤＮＡ修復鋳型として、ｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を用いることができる。ｓｓＯＤＮは、ＤＳＢの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＳＢの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ｓｓＯＤＮを設計する際には、修復された遺伝子がＣａｓ９タンパク質により切断されないように、ｓｓＯＤＮが、直後にＰＡＭ配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、ＰＡＭ配列に対応する配列をｓｓＯＤＮ中では別の配列にすることにより、ｓｓＯＤＮがＣａｓ９タンパク質により切断されないようにできる。ｓｓＯＤＮの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ｓｓＯＤＮは、通常、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡと共に細胞に導入される。
　本発明において、「受精卵にＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡを導入する」または「受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入する」は、エレクトロポレーションされた受精卵、または、当該受精卵に由来する細胞の少なくとも１個において、Ｃａｓ９タンパク質が発現され得る量で、受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入することを意味する。好ましくは、エレクトロポレーションされた受精卵、または、当該受精卵に由来する細胞の少なくとも１個において、ｇＲＮＡの存在下でゲノム中の少なくとも１つの標的遺伝子のゲノム編集が起こり得る量で、受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入する。
　本発明のある実施態様では、本発明の方法は、ゲノム編集が起こったことを確認する段階をさらに含む。ゲノム編集が起こったことは、当分野で知られている様々な方法により確認できる。例えば、標的遺伝子の表現型が知られている場合に、その表現型の変化を検出することにより、あるいは、受精卵または受精卵から発生した胚の細胞において、標的配列を含むゲノムＤＮＡの配列を解読することにより確認できる。ＨＤＲの場合は、ｓｓＯＤＮに制限酵素切断部位を組み込むことにより、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）で評価することも可能である。これらの方法は、当分野で周知である。
　本発明において、「哺乳動物」は、哺乳綱に分類されるあらゆる生物を含む。哺乳動物は、例えば、霊長目（例えば、サル、ヒトなど）、齧歯目（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどを含む。ある実施態様では、哺乳動物は齧歯目である。ある実施態様では、哺乳動物はマウスである。
　本発明において、「受精卵」は、受精後の卵または胚を意味し、受精卵（１細胞期）および２細胞期から胚盤胞期までの発生初期胚を含む。受精卵は、体内または体外で受精した受精卵であり得、卵子または受精卵として冷凍保存されたものであってもよい。受精卵の調製、培養および保存の方法は、当分野で公知である。好ましくは、エレクトロポレーションに使用する前に、エレクトロポレーション用の溶液で受精卵を洗浄し、培養培地を除去する。本発明のある実施態様では、受精卵は、１細胞期ないし桑実胚期、好ましくは１細胞期ないし８細胞期、より好ましくは１細胞期ないし４細胞期、より好ましくは１細胞期ないし２細胞期、例えば１細胞期のものである。本発明のある実施態様では、受精の約６時間後以降、好ましくは約９時間後以降、より好ましくは約１２時間後以降にエレクトロポレーションを実施する。本発明のある実施態様では、受精の約６時間～約１８時間後、好ましくは約９時間～約１５時間後、より好ましくは約１１時間～１３時間後、例えば約１２時間後にエレクトロポレーションを実施する。受精卵は、通常、透明帯と呼ばれる保護膜を有する。透明帯は、酸性タイロード液処理などにより除去または薄化できるが、本発明の方法においては、透明帯は除去または薄化しても、しなくてもよい。好ましくは、透明帯を除去または薄化していない受精卵を使用する。
　本発明のある実施態様は、エレクトロポレーションされた受精卵を培養し、受精卵の生存を確認する段階を含む。受精卵の培養方法は、当業者に周知である。受精卵の生存は、エレクトロポレーション後に受精卵の少なくとも１回の細胞分裂が起こったことを観察することにより確認できる。
　本発明のある実施態様では、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を得ることができる。本発明のある実施態様は、また、本発明の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む遺伝子改変動物の作製方法を提供する。レシピエント動物は、通常、受精卵と同じ動物種の偽妊娠状態のメスであり、その卵管に受精卵を移植する。受精卵（胚）の発生段階によっては、子宮に移植する場合もあり得る。受精卵を移植されたレシピエント動物は、遺伝子改変動物を出産することができる。遺伝子改変動物の作製方法は当業者に公知であり、例えば、引用により本明細書の一部とするManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Press) に記載の方法を用いる。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上の電圧を約１５ｍｓｅｃ以上、または、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約９ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約２００ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　ある実施態様では、本発明の方法は、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、約５０ｎｇ／μｌ以上のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを含む溶液および１細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に、電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上の電圧を約２１ｍｓｅｃ以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む。
　以下に、本発明の実施態様を例示する。
［１］哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）を導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
の各段階を含む、方法。
［２］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約４０Ｖである、項目［１］に記載の方法。
［３］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２５Ｖないし約３５Ｖである、項目［１］または項目［２］に記載の方法。
［４］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖである、項目［１］ないし項目［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ｍＲＮＡ濃度が約５０ｎｇ／μｌないし約１０００ｎｇ／μｌである、項目［１］ないし項目［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ｍＲＮＡ濃度が約５０ｎｇ／μｌないし約２００ｎｇ／μｌである、項目［１］ないし項目［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ｍＲＮＡ濃度が約５０ｎｇ／μｌ以上であり、ｍＲＮＡ導入効率が約２５以上である、項目［１］ないし項目［６］のいずれかに記載の方法。
［８］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上であり、通電時間が約３６ｍｓｅｃ以上である、項目［７］に記載の方法。
［９］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上であり、通電時間が約２１ｍｓｅｃ以上である、項目［７］に記載の方法。
［１０］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖ以上であり、通電時間が約１４ｍｓｅｃ以上である、項目［７］に記載の方法。
［１１］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上であり、通電時間が約１１ｍｓｅｃ以上である、項目［７］に記載の方法。
［１２］ｍＲＮＡ濃度が約２００ｎｇ／μｌ以上であり、ｍＲＮＡ導入効率が約４.４１以上である、項目［１］ないし項目［６］のいずれかに記載の方法。
［１３］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上であり、通電時間が約１５ｍｓｅｃ以上である、項目［１２］に記載の方法。
［１４］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上であり、通電時間が約５ｍｓｅｃ以上である、項目［１２］に記載の方法。
［１５］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上であり、通電時間が約９ｍｓｅｃ以上である、項目［１２］に記載の方法。
［１６］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖ以上であり、通電時間が約３.８ｍｓｅｃ以上である、項目［１２］に記載の方法。
［１７］電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上であり、通電時間が約１.６ｍｓｅｃ以上である、項目［１２］に記載の方法。
［１８］電圧が一定である、項目［１］ないし項目［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］電圧と総通電時間の積が、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下である、項目［１］ないし項目［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］電圧を２回ないし１５回のパルスに分けてかける、項目［１］ないし項目［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］電圧を５回ないし１１回のパルスに分けてかける、項目［１］ないし項目［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］パルス間に約１０ないし約１５０ｍｓｅｃの間隔を空ける、項目［２０］または項目［２１］に記載の方法。
［２３］各パルスの方向が同じである、項目［２０］ないし項目［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］少なくとも１つのパルスの方向が他のパルスと逆である、項目［２０］ないし項目［２２］のいずれかに記載の方法。
［２５］哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｃ）下式（Ｂ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
　　式（Ｂ）　　　Ｒｍｉｎ＝４４１／ｃ
ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
（ｄ）式（Ｂ）により算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階（ｃ）とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
の各段階を含み、
段階（ｃ）および（ｄ）で電圧を２回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい、
方法。
［２６］受精卵が１細胞期または２細胞期のものである、項目［１］ないし項目［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］受精卵が１細胞期のものである、項目［１］ないし項目［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］受精の約１２時間後にエレクトロポレーションを実施する、項目［１］ないし項目［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］齧歯目の受精卵を使用する、項目［１］ないし項目［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］マウスの受精卵を使用する、項目［１］ないし項目［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質である、項目［１］ないし項目［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性およびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有する、項目［１］ないし項目［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含む、項目［１］ないし項目［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目［１］ないし項目［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］溶液が１種またはそれ以上のさらなる核酸分子を含み、該核酸分子がＣａｓ９ ｍＲＮＡと共に受精卵に導入される、項目［１］ないし項目［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］さらなる核酸分子がｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せである、項目［３５］に記載の方法。
［３７］さらなる核酸分子がｇＲＮＡである、項目［３５］または項目［３６］に記載の方法。
［３８］溶液がｓｓＯＤＮをさらに含む、項目［３６］または項目［３７］に記載の方法。
［３９］エレクトロポレーションされた受精卵を培養し、受精卵の生存を確認する段階をさらに含む、項目［１］ないし項目［３８］のいずれかに記載の方法。
［４０］項目［１］ないし項目［３９］のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入することを含む、Ｃａｓ９を発現する哺乳動物の受精卵の製造方法。
［４１］項目［３５］ないし項目［３８］のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法。
［４２］ゲノム編集が起こったことを確認する段階をさらに含む、項目［４１］に記載の方法。
［４３］項目［３５］ないし項目［３８］のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法。
［４４］遺伝子改変動物の作製方法であって、項目［４３］に記載の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、方法。　
　本発明により、エレクトロポレーションで、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵に、効率的かつ迅速に導入することができる。エレクトロポレーションの利点は、胚の生存率が高いこと、および、特別な手技を必要とせず、時間のかからない技術であることである。１００個の受精卵の細胞質または前核にｍＲＮＡをマイクロインジェクションする場合、熟練者であっても１時間以上を要するが、エレクトロポレーションは、これを数分で、単純な作業で、達成できる。加えて、市販のエレクトロポレーションシステムの価格は、マイクロインジェクションシステムよりも一般的に安い。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集およびこれを利用した遺伝子改変動物の作製の効率を高め、迅速化し、コストを低減することに貢献し得る。
材料と方法
ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの調製
　ｐＣＳ２－ｍＣｈｅｒｒｙは、木下典行博士（基礎生物学研究所、日本）から譲り受けた。ｈＣａｓ９プラスミド（ｐＸ３３０）は、Addgene（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ｐＸ３３０から切り出したｈＣａｓ９を、ｐＳＰ６４ベクター（Promega）のＳＰ６プロモーターの下流につなぎ（ｐＳＰ６４－ｈＣａｓ９）、ｍＲＮＡ合成に使用した。ｐＣＳ２－ｍＣｈｅｒｒｙおよびｐＳＰ６４－ｈＣａｓ９を、各々ＮｏｔＩおよびＳａｌＩにより直鎖状にした。直鎖状プラスミドを鋳型として、インビトロＲＮＡ転写キット（mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, オースティン、テキサス州、米国）を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｈＣａｓ９のｍＲＮＡを合成した。
　Ｆｇｆ１０またはｍＣｈｅｒｒｙを標的とするオリゴヌクレオチド対をアニーリングし、ｐＤＲ２７４ベクター（addgene）のＢｓａＩ制限酵素部位に挿入した。オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。Ｆｇｆ１０（５’－ＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡ－３’（配列番号５）およびその相補的配列）およびｍＣｈｅｒｒｙ（５’－ＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧ－３’（配列番号６）およびその相補的配列）。ＤｒａＩによる切断後、MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）を使用してｇＲＮＡを合成した。
　合成したＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）は、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。沈殿したＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉに２～４μｇ／μｌの濃度で溶解し、使用するまで－２０℃で保存した。ＲＮＡを吸光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量した。ｓｓＯＤＮは、Sigma から乾燥状態で購入し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉに１μｇ／μｌの濃度で溶解し、使用するまで－２０℃で保存した。
マウス系統
　ＩＣＲ（日本クレア）またはＢ６Ｄ２Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ２Ｆ１）（日本ＳＬＣ）のメスのマウスを使用した。ＩＣＲ系統は主にエレクトロポレーション条件の決定に使用し、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統はゲノム編集に使用した。
受精卵の回収
　同系統のオスと自然交配させたＩＣＲまたはＢ６Ｄ２Ｆ１のメスの卵管からＥ０.５（Ｅの後の数字は、受精後の日数を示す。Ｅ０.５は、腟栓を確認した日の暗期の中間点から１２時間後である。）で受精卵を回収した。１％ヒアルロニダーゼ／Ｍ２培地（Sigma）でインキュベートすることにより、受精卵を覆っている卵丘細胞を除去した。Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするゲノム編集実験では、Ｒ２６－Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙのオス（RIKEN CDB、日本）と交配させたＢ６Ｄ２Ｆ１メスに由来する受精卵を使用した。回収した受精卵を、エレクトロポレーションに使用するまで、ｍＷＭ培地（アーク・リソース、日本）またはＫＳＯＭ培地（９５ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、０.３５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０.２ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０.２ｍＭ グルコース、１０ｍＭ 乳酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０.２ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１.７１ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０.０１ｍＭ Ｎａ２－ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、１ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）中で培養した。
エレクトロポレーション
　白金ブロック電極（長さ：１０ｍｍ、幅：３ｍｍ、高さ：０.５ｍｍ、ギャップ：１ｍｍ）（株式会社ベックス（以下、BEXと称する）、東京、日本）を外注して使用した（図２ａ）。CUY21EDIT II（BEX）またはCUY21 Vivo-SQ（BEX）に接続した電極を、実体顕微鏡上にセットした。ｍＷＭ培地中で培養されている受精卵をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Life technologies）で３回洗浄し、血清含有培地を除去した。次いで、ＲＮＡを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液（５μｌ）で満たした電極のギャップに受精卵を並べ、エレクトロポレーションを行った。電気的条件は、特記しない限り、３０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×７回であった。エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、Ｍ２培地で４回、ｍＷＭ培地で２回洗浄した。次いで、受精卵を、ｍＷＭ培地中、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で、２細胞期まで培養した。
蛍光シグナルの検出および分析
　ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のシグナル強度を、エレクトロポレーションの１５時間後に測定した。ニプコー円板共焦点ユニットＣＳＵ－Ｗ１（横河電機、日本）を備えた Axio Observer.Z1 倒立顕微鏡（Zeiss、ドイツ）を使用した。蛍光シグナルは、EM-CCD カメラImageM（浜松ホトニクス、日本）により検出し、データはＨＣイメージソフトウェアならびにNIH ImageJ(http://imagej.nih.gov/ij/)で分析した。測定される蛍光強度は、蛍光シグナルの取得および解析の条件に依存する相対値であり、条件が全て一致する場合にのみ比較可能である。
Ｆｇｆ１０およびＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙのゲノム編集
　Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび、Ｆｇｆ１０またはＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするｇＲＮＡを、上記の通り、Ｂ６Ｄ２Ｆ１のメスから回収した受精卵に、Ｅ０.５でエレクトロポレーションにより導入した。ＨＤＲによるノックインの研究には、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡと共にｓｓＯＤＮを導入した。Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ用のｓｓＯＤＮの配列は、以下の通りである；５’－ＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣ－３’（配列番号７）、および、５’－ＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣ－３’（配列番号８）。生存している２細胞期の胚を、偽妊娠マウスの卵管に、膣栓が生じた日に移植した。あるいは、胚をインビトロで胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養した。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＦｇｆ１０またはＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の変異を調べるために、胚の卵黄嚢からゲノムを調製した。ｇＲＮＡ標的に隣接するゲノム領域を、特異的プライマーを使用するＰＣＲにより増幅させた：Ｆｇｆ１０Ｆｗｄ（５’－ＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡ－３’（配列番号９））およびＦｇｆ１０Ｒｅｖ（５’－ＴＡＣＡＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡ－３’（配列番号１０））、Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙＦｗｄ（ＧＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣ（配列番号１１））およびＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙＲｅｖ（ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号１２））。Ｆｇｆ１０またはＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙのＰＣＲ増幅産物を、ｐＭＤ２０（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）ベクターにクローニングした。各胚から１０種のプラスミドを単離し、ゲノム領域を配列解読した。配列解読は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 および ABI 3500 Genetic Analyser （Applied Biosystems, フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行った。
ｍＲＮＡをマウス受精卵に導入するためのエレクトロポレーションの条件
　透明帯を酸で処理せずにマウス受精卵にｍＲＮＡを導入するためのエレクトロポレーションの条件を調べた。図２ａに示すエレクトロポレーションシステムを用意した。ギャップ距離１ｍｍ、長さ１０ｍｍ、幅３ｍｍ、高さ０.５ｍｍであり、電極間に５μｌの溶液を保持できる白金ブロック電極（図２ｃ）を実体顕微鏡（図２ａ左）にセットし、エレクトロポレーター（CUY21EDIT II）（図２ａ右）に連結した。このシステムを使用して、約４０個～５０個の受精卵を同時に処理できる。エレクトロポレーションに先立ち、マウスの受精卵を手技により一列に並べた。インビトロで転写した４００ｎｇ／μｌのｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより受精卵に導入し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度および胚盤胞期までの胚の生存率をモニタリングすることにより、ｍＲＮＡ導入の効率を評価した。図２ａは、この実験で使用したエレクトロポレーション装置の写真である。図２ｂは、図２ａの四角で囲んだ部分の拡大図である。図２ｃは、白金ブロック電極の模式図である。受精卵は、電極間のギャップ中のｍＲＮＡ溶液中に置かれている。図２ｄは、電極間のギャップに置かれた受精卵の顕微鏡像である。図２ｅは、マウスの受精卵にｍＲＮＡを導入するためのエレクトロポレーション条件の模式図であり、１０Ｖないし５０Ｖ、３ｍｓｅｃのスクエアパルスを、９７ｍｓｅｃの間隔で、３回ないし１１回反復することを示す。
　Ｅ０.５の受精卵を使用して、パルス時間を３ｍｓｅｃに、パルスの回数を５回に固定し、様々な電圧（１０Ｖ～５０Ｖ）でエレクトロポレーションを行った。図３ａは、様々な電圧でエレクトロポレーションされた胚のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度（●）および胚盤胞期までの生存率（■）をプロットしたものである。２０Ｖ以上の電圧で蛍光が観察され、蛍光強度は、２０Ｖで４.４１、３０Ｖで１４.７、４０Ｖで２６.４６、５０Ｖで３９.６９であり、電圧に伴って上昇した。蛍光強度の相対比率は、２０Ｖ：３０Ｖ：４０Ｖ：５０Ｖ＝０.３：１.０：１.８：２.７であった。生存率は３０Ｖまでは１００％であったが、４０Ｖ以上で電圧に伴って低下し、５０Ｖで約５０％に至った。
　電圧およびパルス時間を３０Ｖおよび３ｍｓｅｃに固定し、パルスの反復回数を変化させた（３回、５回、７回、９回および１１回）。図３ｂは、様々なパルスの反復回数でエレクトロポレーションされた胚のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度（●）および胚盤胞期までの生存率（■）をプロットしたものである。ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度は、３回で７.９、５回で１４.７、７回で２７.１、９回で４０.６、１１回で６５.９であり、パルスの回数に伴って増大した。胚盤胞期までの生存率は７回の反復で低下し始め、１１回の反復で約５０％に至った。
　ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度はｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの導入量に比例するので、上記の実験で測定された蛍光強度を、ｍＲＮＡ導入効率の相対値とみなすことができる。図４は、図３ｂに示した電圧３０Ｖでの各通電時間における蛍光強度および図３ａから導かれる電圧毎の蛍光強度の相対比率（２０Ｖ：３０Ｖ：４０Ｖ：５０Ｖ＝０.３：１.０：１.８：２.７）に基づいて、各通電時間でのｍＲＮＡ導入効率Ｒを電圧毎に予想したグラフである。
　Excel ソフトウェアを使用して、図４に示すグラフの近似式を作成した。各電圧でのｍＲＮＡ導入効率Ｒは、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）を用いて、以下の近似式で表される。
２０Ｖ　Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔ
３０Ｖ　Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔ
４０Ｖ　Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔ
５０Ｖ　Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔ
両方向のパルスを用いるエレクトロポレーション
　実施例１と同様に、Ｅ０.５の受精卵にエレクトロポレーションによりｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを導入した。電圧およびパルス時間を３０Ｖおよび３ｍｓｅｃに固定し、パルスの反復回数および電圧の方向を図５ｃに示す通りに変化させた。図５において、×６は、一方向から６回のパルスを与えたことを示す。×＋３－３は、一方向から３回のパルスを与え、続いて逆方向から３回のパルスを与えたことを示す。×ａｌｔ±３は、両方向からのパルスを交互に３回ずつ与えたことを示す。×＋６－６および×ａｌｔ±６も同様である。ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度は、電圧の方向に拘わらず、パルスの回数に伴って増加した（図５ａ）。胚盤胞期までの生存率はいずれも高く（図５ｂ）、特に、×＋６－６および×ａｌｔ±６で、一方向から１２回のパルスを与えた場合に比べて高かった。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのエレクトロポレーションによる、Ｆｇｆ１０遺伝子のゲノム編集
　上記のエレクトロポレーション条件をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集に利用できるか否かを調べた。
　肢の発生に必須であるＦｇｆ１０遺伝子を標的とした。Ｆｇｆ１０のホモ接合性変異胚は、四肢がない状態で発生することが既に示されており（引用により本明細書の一部とするSekine, K. et al., Nature Genetics 21, 138-141(1999)）、遺伝子の破壊を表現型により容易に確認できる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるこの遺伝子の破壊が、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのマイクロインジェクションにより実施されている（引用により本明細書の一部とするYasue, A. et al., Scientific Reports 4, 5705 (2014)）。
　Yasue, A. et al. で使用されたのと同じ＃５６３と呼ばれるＦｇｆ１０の標的配列を有するｇＲＮＡ（配列番号５のヌクレオチド配列を含む）およびＣａｓ９ ｍＲＮＡを、種々の濃度で、３０Ｖ、３ｍｓｅｃの電気パルスを７回繰り返すエレクトロポレーションにより、Ｅ０.５の受精卵に導入した。図６ａは、本実験で使用した標的配列（下線）およびＰＡＭ配列（ＡＧＧ、大文字）を含む、Ｆｇｆ１０座位のゲノム構造を示す。胚を２細胞期まで発生させ、偽妊娠のメスに移植した。Ｅ１５またはＥ１６でマウスを解剖し、胚の形態を観察した。肢の異常によって、胚を３つの表現型のカテゴリーに分類した：タイプＩの胚には肢がなく、タイプＩＩの胚は形態に種々の異常を有し（例えば、後肢の欠損、前肢および後肢の短縮など）、タイプＩＩＩの胚は正常に見える。図６ｂは、異なる肢の表現型を示す３つのカテゴリーの胚の代表例、即ち、肢なし、肢の異常（左：後肢の欠損、右：前肢および後肢の短縮）または正常を示す。図６ｃは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのエレクトロポレーションの肢の発生に対する影響をまとめたグラフである。各実験で使用したＲＮＡの濃度をグラフの左に示す。各列の数字は、各カテゴリーの表現型を示す胚の数を表す。
　表１は、使用したＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの濃度、２細胞期の生存率、Ｅ１５またはＥ１６での胚の生存率を示す。表２は、Ｃａｓ９ ＲＮＡおよびｇＲＮＡのエレクトロポレーションによるＦｇｆ１０変異胚の生成を示す。
表１：エレクトロポレーションされた胚の生存率
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
表２：エレクトロポレーションされた胚の形態異常
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　エレクトロポレーションされた受精卵の２細胞期の生存率（表１において、９４～９５％）は、マイクロインジェクションの場合（Yasue, A. et al.において、３４～３５％）と比較して大幅に高かった。
　４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡをエレクトロポレーションに使用すると、９７％（３８／３９）の胚が特異的な肢の異常を示した。これらの胚のうち、３４個の胚は完全に前肢および後肢を失っており、従来の標的遺伝子組換えにより得られたＦｇｆ１０のホモ接合性変異体の表現型と同様であった。残りの４個の胚は、様々な肢の異常を有した。２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡをエレクトロポレーションに使用すると、８２％（３１／３８）の胚が肢の異常を示した。１００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび５０ｎｇ／μｌのｇＲＮＡでは４６％（１９／４１）の胚が、全部分および一部分的な肢の異常を示した。５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２５ｎｇ／μｌのｇＲＮＡでは、形態観察では殆どの胚が正常に見えた。
　これらの胚でＦｇｆ１０遺伝子が破壊されたか否かを調べるために、胚のゲノム配列を分析した。４個の無作為に選択された胚に由来する各１０個のクローンにおいて、標的配列の周辺のゲノム領域を増幅させ、配列を解読した。標的配列の周辺のゲノム領域の野生型配列は、ｔｇａａｔｇｇａａａａｇｇａｇｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｇａｃａａａａａａｃａａｇａＡＧＧａａａａａｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｃａである（下線は標的として使用した配列を示す。大文字はＰＡＭ配列（ＡＧＧ）を示す）（配列番号１３）。結果を表３に示す。
表３：Ｆｇｆ１０変異体の配列分析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 表中、同一の受精卵について同じ変異のタイプが２回以上記載されている場合、各クローンの配列は異なる。
　４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを使用すると、配列解読した全てのクローンが塩基の挿入または欠失（インデル）または変異を有し、野生型配列は検出されなかった。これらの結果は、Ｆｇｆ１０遺伝子の両対立遺伝子が、４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２００ｎｇ／μｌｇのｇＲＮＡを用いるエレクトロポレーションにより破壊されたことを示す。さらに、各胚は、４種以下のインデルを有した。従って、ゲノム編集はエレクトロポレーション後に非常に迅速に、１細胞期または２細胞期に起こったと推定できる。５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２５ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを使用すると、殆どの胚が正常に見えたが、配列分析により、これらの胚に由来するクローンのいくつかにインデルまたは変異が検出された。
　これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集にエレクトロポレーションを利用できること、および、ゲノム編集の効率はＲＮＡ濃度に依存することを示し、高濃度のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡでは両対立遺伝子がほぼ全ての細胞で破壊されたが、低濃度では、変異細胞（いずれかまたは両方の対立遺伝子に変異を有する細胞）と野生型細胞のキメラ胚が得られたことを示唆する。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのエレクトロポレーションによる、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノム編集
　Ｒｏｓａ２６遺伝子座にＨｉｓｔｏｎ２ｂ（Ｈ２ｂ）－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する受精卵（引用により本明細書の一部とするAbe et al., Genesis 49, 579-590 (2011)）をエレクトロポレーションに使用した。この受精卵から発生した胚では、Ｒｏｓａ２６プロモーターの制御下でＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙが遍在性に発現され、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が４～８細胞期の全ての核で観察される。Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするゲノム編集が起こり、遺伝子が破壊されると、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は消失する。
　この実験では、３０Ｖ、３ｍｓｅｃの電気パルスを７回繰り返すエレクトロポレーションで、ゲノム編集を可能にするＲＮＡ濃度の下限を調べた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするｇＲＮＡを受精卵（Ｅ０.５）に導入し、ＫＳＯＭ培地中、インビトロで胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養し、核のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を調べた。２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇ／μｌのｍＣｈｅｒｒｙ ｇＲＮＡ以上の濃度で受精卵をエレクトロポレーションすると、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は完全に消失した。５０～１００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび２５～５０ｎｇ／μｌのｇＲＮＡの濃度では、いくつかの割球はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光陰性であり、いくつかは陽性であった。２５ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１２.５ｎｇ／μｌのｇＲＮＡでのエレクトロポレーションは、Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙの発現に影響を与えなかったので、この濃度は、３０Ｖ、３ｍｓｅｃの電気パルスを７回繰り返すエレクトロポレーションによりゲノム編集を達成するには低すぎることが示された。
　次に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡのどちらの濃度がゲノム編集の成否を定めているのかを調べた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度を２５ｎｇ／μｌに固定し、ｇＲＮＡ濃度を変動させたところ、２００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを使用してもゲノム編集は起こらなかった。一方、２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用すると、ｇＲＮＡを１０ｎｇ／μｌに減らしてもゲノム編集は起こった。Ｆｇｆ１０を標的とするｇＲＮＡを使用しても、同じ結果が得られた。これらの結果は、エレクトロポレーションによるゲノム編集の成否は、ｇＲＮＡの濃度ではなく、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの濃度に依存することを示す。
高濃度のＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用するエレクトロポレーションによるゲノム編集
　実施例４と同様の実験により、２０００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを使用し、ゲノム編集を達成する電気条件を調べた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをＥ０.５のマウス受精卵に導入し、インビトロで胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養し、核のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を調べた。結果を図７に示す。エレクトロポレーションを行わなかった胚では全ての割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が見られた（図７ａ）。３０Ｖ、０.０５ｍｓｅｃ×２回では、一部の割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が消失し、３０Ｖ、０.１０ｍｓｅｃ×２回では、全ての割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が消失した（図７ｂ）。２０Ｖ、０.０５ｍｓｅｃ×２回では、全ての割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が残り、２０Ｖ、０.２０ｍｓｅｃ×２回では、一部の割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が消失し（矢頭）、２０Ｖ、１.００ｍｓｅｃ×２回では、全ての割球でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が消失した（図７ｃ）。
ゲノム編集のためのエレクトロポレーション条件の検討
　実施例４と同様の実験により、２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを使用して、ゲノム編集を達成するエレクトロポレーションの条件を検討した。様々な電圧（２０～５０Ｖ）およびパルスの時間（６～３３ｍｓｅｃ）のエレクトロポレーションにより、Ｅ０.５の受精卵５～１２個に同時に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを導入した。表３に示すエレクトロポレーション条件により、Ｅ４.５の時点でｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が消失している割球が観察され、ゲノム編集が起こったことが示された。
表４：ゲノム編集を達成するエレクトロポレーション条件
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　２００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用すると、電圧２０Ｖ、通電時間１５ｍｓｅｃでゲノム編集が起こった。実施例１で測定した通り、この電気条件でのｍＲＮＡ導入効率は４.４１である。
エレクトロポレーションによるｓｓＯＤＮの導入およびＨＤＲ
　エレクトロポレーションによりｓｓＯＤＮをマウスの受精卵に導入でき、ＨＤＲによるノックイン対立遺伝子を生成できるか否かを調べた。ｌｏｘＰおよびＥｃｏＲＩ認識配列（３７塩基）の両側に隣接する４０塩基長の相同領域を有する１１７塩基のｓｓＯＤＮ（配列番号７）を使用した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を標的とするｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮを、実施例４で使用したものと同様のＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する受精卵にエレクトロポレーションした。胚を２細胞期まで発生させ、偽妊娠のメスに移植した。図８ａは、標的配列および、３７塩基のｌｏｘＰ配列およびＥｃｏＲＩ認識部位を挿入するためのｓｓＯＤＮの模式図である。置き換えられた対立遺伝子は、ｌｏｘＰ配列中の停止コドンにより機能を失い、核のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は消失する。ｓｓＯＤＮによる置換を、ＥｃｏＲＩ切断およびＲＦＬＰ（制限断片長多型）によりスクリーニングした。
　エレクトロポレーションした１１個すべての胚で、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が消失した。図８ｂは、エレクトロポレーションされた代表的な胚の写真である。エレクトロポレーションされた胚ではｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は完全に消失し、一方、エレクトロポレーションしなかった対照の胚は蛍光シグナルを示した。図８ｃは、回収した胚のＲＦＬＰ分析の結果を示す。ＥｃｏＲＩ認識部位が挿入された対立遺伝子はＥｃｏＲＩにより２本のバンド（１３８ｂｐｓおよび３７４ｂｐｓ）に切断される。切断されていない対立遺伝子は４９７ｂｐｓである。＃３、６、８および９の胚で、切断されたバンドが観察された。即ち、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が消失した胚のうち、４個がＥｃｏＲＩ切断陽性であった。＃１および７の予想外のバンドは、標的遺伝子の長い欠損を示す。
　ＥｃｏＲＩ切断陽性の胚の配列分析の結果を表５に示す。標的配列の周辺のゲノム領域の野生型配列は、ｇｔｇａａｃｇｇｃｃａｃｇａｇｔｔｃｇａｇａｔｃｇａＧＧＧｃｇａである（下線は標的として使用した配列を示す。大文字はＰＡＭ配列（ＧＧＧ）を示す）（配列番号１４）。
表５：ＨＤＲによるｌｏｘＰおよびＥｃｏＲＩ部位ノックイン胚の配列分析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　配列分析により、これらの胚のすべてがＨＤＲ置換された対立遺伝子を有することが明らかになった。これらのうち、３個の胚（＃６、８、９）は、ＨＤＲ置換された対立遺伝子に加えて、１種ないし３種のインデルを有する対立遺伝子を有した。残りの１個の胚（＃３）は、ＨＤＲ置換された対立遺伝子のみを有した。これは、全ての細胞の両方の対立遺伝子がＨＤＲ置換された配列を有することを示す。
　また、ＨＤＲによるＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子へのＥｃｏＲＶ部位のノックインにも成功した（表６および図９）。図９ａは、標的配列、およびＥｃｏＲＶ認識部位を挿入するためのｓｓＯＤＮ（配列番号８）の模式図である。図９ｂは、回収した胚のＲＦＬＰ分析の結果を示す。ＥｃｏＲＶが挿入された対立遺伝子は２本のバンド（３４１ｂｐｓおよび９２ｂｐｓ）に切断される。切断されていない対立遺伝子は４３１ｂｐｓである。＃２、３、５および６の胚で、切断されたバンドが観察された。
　これらの胚の配列分析の結果を表６に示す。標的配列の周辺のゲノム領域の野生型配列は、ｇｔｇａａｃｇｇｃｃａｃｇａｇｔｔｃｇａｇａｔｃｇａＧＧＧｃｇａである（下線は標的として使用した配列を示す。大文字はＰＡＭ配列（ＧＧＧ）を示す）（配列番号１４）。
表６：ＨＤＲによるＥｃｏＲＶ部位ノックイン胚の配列分析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 表中、同一の受精卵について同じ変異のタイプが２回以上記載されている場合、各クローンの配列は異なる。
　また、Ｆｇｆ１０遺伝子へのＸｂａＩ部位のノックインにも成功した（データ非開示）。これらの結果は、エレクトロポレーションにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのみならず、ｓｓＯＤＮも受精卵に導入でき、ＨＤＲによるノックイン対立遺伝子が得られることを示す。

Claims (21)

  1. 　哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）を導入する方法であって、
    （ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
    （ｂ）下式（Ａ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
    　　式（Ａ）　　　Ｒｍｉｎ＝８８２／ｃ
    ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
    ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下である、
    の各段階を含む、方法。
  2. 　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２５Ｖないし約３５Ｖである、請求項１に記載の方法。
  3. 　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 　Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が約５０ｎｇ／μｌ以上であり、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上であり、通電時間が約３６ｍｓｅｃ以上である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
  5. 　Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が約５０ｎｇ／μｌ以上であり、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上であり、通電時間が約２１ｍｓｅｃ以上である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
  6. 　Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が約２００ｎｇ／μｌ以上であり、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖ以上であり、通電時間が約１５ｍｓｅｃ以上である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
  7. 　Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ濃度が約２００ｎｇ／μｌ以上であり、電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖ以上であり、通電時間が約５ｍｓｅｃ以上である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
  8. 　哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入する方法であって、
    （ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
    （ｃ）下式（Ｂ）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡ濃度ｃ（ｎｇ／μｌ）から算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
    　　式（Ｂ）　　　Ｒｍｉｎ＝４４１／ｃ
    ただし、ｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）は、通電時間ｔ（ｍｓｅｃ）から、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約３０Ｖのとき、式（Ｉ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３－０.００５７×ｔ２＋０.２８４７×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約３０Ｖないし約４０Ｖのとき、式（ＩＩ）Ｒ＝０.００１５×ｔ３－０.０１９１×ｔ２＋０.９４８９×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約４０Ｖないし約５０Ｖのとき、式（ＩＩＩ）Ｒ＝０.０００５×ｔ３＋０.０５０８×ｔ２＋０.９９２２×ｔにより、
    　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約５０Ｖ以上のとき、式（ＩＶ）Ｒ＝０.００７８×ｔ３－０.１４１４×ｔ２＋３.０１０３×ｔにより、算出される値である、
    ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
    （ｄ）式（Ｂ）により算出される最低ｍＲＮＡ導入効率（Ｒｍｉｎ）以上のｍＲＮＡ導入効率（Ｒ）を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階（ｃ）とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約２０Ｖないし約５５Ｖであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離１ｍｍ当たり約６３０Ｖｍｓｅｃ以下であり、電圧は２回以上のパルスに分けてかけてもよい、
    の各段階を含み、
    段階（ｃ）および（ｄ）で電圧を２回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい、
    方法。
  9. 　齧歯目の受精卵を使用する、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
  10. 　マウスの受精卵を使用する、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
  11. 　Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質である、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性およびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有する、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　溶液が１種またはそれ以上のさらなる核酸分子を含み、該核酸分子がｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せであり、該核酸分子がＣａｓ９ ｍＲＮＡと共に受精卵に導入される、請求項１ないし請求項１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　さらなる核酸分子がｇＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
  17. 　溶液が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）をさらに含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
  18. 　請求項１ないし請求項１７のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡを導入することを含む、Ｃａｓ９を発現する哺乳動物の受精卵の製造方法。
  19. 　請求項１５ないし請求項１７のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法。
  20. 　請求項１５ないし請求項１７のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法。
  21. 　遺伝子改変動物の作製方法であって、請求項２０に記載の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、方法。
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