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CN120138057A - 子宫内膜细胞条件性敲除zxdb基因小鼠模型的构建方法和应用 - Google Patents

子宫内膜细胞条件性敲除zxdb基因小鼠模型的构建方法和应用 Download PDF

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CN120138057A
CN120138057A CN202510148350.0A CN202510148350A CN120138057A CN 120138057 A CN120138057 A CN 120138057A CN 202510148350 A CN202510148350 A CN 202510148350A CN 120138057 A CN120138057 A CN 120138057A
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CN
China
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zxdb
mouse
gene
sgrna
mice
Prior art date
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Application number
CN202510148350.0A
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陈松长
田亚飞
李梦如
张杨
卢大儒
陈红岩
徐晨明
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Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Fudan University
Original Assignee
Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Fudan University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子两端添加loxP位点；将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠，获得F0代小鼠；对F0代小鼠基因型鉴定，筛选出带loxP位点的阳性小鼠；将阳性小鼠与子宫内膜组织特异性Cre小鼠交配，对其子代进行基因型鉴定，得子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型。本发明的构建方法，简单高效，制得的ZXDB基因条件性敲除小鼠模型，为研究ZXDB基因在子宫内膜组织的作用和机制提供了很好的动物模型，具有广阔的应用前景。

Description

子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法和 应用
技术领域
本发明属于小鼠模型基因编辑技术领域，具体涉及一种子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法和应用。
背景技术
条件性敲除(Conditional Knockout)技术是指在特定时间点或特定组织中敲除目标基因，从而避免全身敲除所带来的致死性或严重表型，提供更精确的基因功能解析的一种方法或工具。条件性敲除通过空间(组织特异性)或时间(诱导型)控制基因敲除，可实现对目标基因在特定条件下的研究。
显微注射是一种通过显微镜将液体物质直接注入细胞或胚胎的技术。在进行基因编辑时，可以将显微注射与CRISPR/Cas9技术结合，在同源模板存在的情况下，DNA切割后，进行同源重组，把loxP位点整合进入基因组，显微注射技术在模型构建过程中发挥着重要的角色。
ZXDB基因是染色体Xp11.21上一对复制的锌指基因之一，其同源基因是ZXDA。ZXDB和ZXDA基因起源于非常古老且高度保守的基因复制。在多个物种中高度保守。此外，ZXDB在生物体内相比ZXDA有超高的表达水平，其在生物体内可能扮演更重要的角色。ZXDB基因的突变或变异可能与一些X染色体相关的遗传病有关。为进一步研究ZXDB基因在子宫内膜组织的作用和机制，需要构建条件性敲除ZXDB基因的动物模型，然而，目前尚无ZXDB基因条件性敲除小鼠模型的相关报道。
发明内容
本发明要解决目前缺乏ZXDB基因条件性敲除小鼠模型的技术问题，提供一种子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，该构建方法采用双loxP位点分别插入敲除法，相比于传统跨外显子一个同源模板的方法，更加简单高效。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；
制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子上下游sgRNA切割位点处，分别向左右添加同源臂，并在该左右同源臂中各插入loxP位点；
将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
对F0代小鼠进行基因型鉴定，筛选出带有loxP位点的阳性F0代小鼠即为条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠；
将阳性flox小鼠与子宫内膜组织特异性Cre小鼠进行交配，并对其子代进行基因型鉴定，选出同时携带flox等位基因和Cre转基因的子代即为子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠的构建方法，包括以下步骤：
设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；
制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子上下游sgRNA切割位点处，分别向左右添加同源臂，并在该左右同源臂中各插入loxP位点；
将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
对F0代小鼠进行基因型鉴定，筛选出带有loxP位点的阳性F0代小鼠即为条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠。
在本发明具体实施例中，所述sgRNA包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA1和SEQ IDNO.4所示的sgRNA2。
所述同源模板为单链寡核苷酸同源模板。本发明使用的单链寡核苷酸(ssODN，single-stranded oligodeoxynucleotides)同源模板通常有100到200个碱基长,两侧是40-80个碱基的同源臂。相比之下，双链DNA(dsDNAs)常被用作插入较长序列的项目的修复模板(如报告基因/重组酶敲入蛋白)。与ssODN供体的插入效率相比，dsDNA供体的插入效率较低。本发明所使用的ssODN修复同源模板为单链模板，同源重组具有更高的效率。
在本发明具体实施例中，含loxP位点的左同源臂为80bp，其序列如SEQ ID NO.16所示；含loxP位点的右同源臂为80bp，其序列如SEQ ID NO.17所示。
在本发明的另一方面，还提供了特异性靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，包括SEQ IDNO.1所示的sgRNA1和SEQ ID NO.4所示的sgRNA2。
在本发明的另一方面，还提供了包含上述sgRNA的重组载体。
在本发明的另一方面，还提供了子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的应用，用于研制与X染色体相关遗传病的治疗药物。
在本发明的另一方面，还提供了用于条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠在制备组织特异性敲除ZXDB基因的动物模型中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)现有的CRISPR/Cas9技术一般采用单位点敲除法，本发明采用双loxP位点分别插入敲除法，因为插入的片段比较短，相比于传统跨外显子一个同源模板，具有更高的效率，更容易实现；
(2)本发明针对高GC含量的单一长外显子ZXDB基因在CDS区域设计了两个sgRNA位点，利用显微注射小鼠受精卵同时对小鼠该基因进行编辑，为其他类似基因模型提供了一个很好的借鉴；
(3)本发明基于注射后的胚胎进行直接sgRNA效率的验证以及胚胎编辑的验证，与传统的细胞系验证效率相比，更能模拟基因编辑动物的实际情况，且可以提前验证被移植胚胎是否编辑，不必等到F0小鼠出生即可以评估小鼠编辑的情况，以便后续的改进优化，缩短了科研周期，效率得到提升。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明双sgRNA制备时模板质粒LZP13的图谱图；
图2是本发明为体外转录并纯化后得到的sgRNA1和sgRNA2的电泳检测结果图；
图3是本发明小鼠ZXDB基因Flox位点的设计示意图；
图4是本发明条件性敲除ZXDB基因小鼠的配繁示意图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
本发明子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术在小鼠ZXDB基因的外显子(该ZXDB基因只含有一个外显子)两端添加Cre重组酶靶向序列loxP位点，将体外制备的单链DNA模板、sgRNA与cas9蛋白一起孵育，再用显微注射的方法注入小鼠受精卵，制得可用于ZXDB基因条件性基因敲除的flox小鼠。本发明的构建方法简单高效，制得的ZXDB基因条件性敲除小鼠模型可用于研究ZXDB基因在子宫内膜组织的作用和机制。本发明方法制得的flox小鼠可与不同的组织特异性启动子Cre小鼠进行交配繁育，可产生在某些组织特定敲除ZXDB的动物模型。
本发明通过CRISPR/Cas9实现条件性敲除的方法，主要包含三个步骤，在目标基因的关键外显子两侧插入loxP位点，形成floxed基因；通过特定的启动子驱动Cre重组酶在目标组织或在诱导条件下表达；在Cre表达的条件下，Cre重组酶介导loxP位点之间的DNA片段切除，导致目标基因功能丧失，实现条件性敲除。
本发明方法是一种利用CRISPR/Cas9系统条件性敲入loxP位点，并与特定Cre酶小鼠繁育产生条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的方法，包括：
对小鼠ZXDB基因进行flox修饰，得flox小鼠；
将flox小鼠与组织特异性Cre工具鼠配繁,将所得后代相互配繁，得到ZXDB基因条件性敲除动物模型；
所述flox修饰，是利用CRISPR/Cas9技术，并通过同源重组对小鼠ZXDB基因的外显子两端(该ZXDB基因只含有一个外显子)特定位点进行flox修饰；
所述Cre工具鼠的Cre酶特异性表达于子宫内膜组织。
在同源重组过程中，Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点，进而造成ZXDB基因DNA双链断裂，靶位点位于ZXDB基因外显子的两侧。
本发明的子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，具体包括以下步骤：
设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；
制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子上下游sgRNA切割位点处，分别向左右添加同源臂，并在该左右同源臂中各插入loxP位点；
将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
对F0代小鼠进行基因型鉴定，筛选出带有loxP位点的阳性F0代小鼠即为条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠；
将阳性flox小鼠与子宫内膜组织特异性Cre小鼠进行交配，并对其子代进行基因型鉴定，选出同时携带flox等位基因和Cre转基因的子代即为子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型。
在本发明的具体实施例中，子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
1)靶向小鼠ZXDB基因的外显子外双sgRNA位点的设计，包括ZXDB sgRNA1和ZXDBsgRNA2，ZXDB sgRNA1的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，ZXDB sgRNA2的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
2)靶向小鼠ZXDB基因的双sgRNA的制备，包括ZXDB sgRNA1和ZXDB sgRNA2，包括以下步骤：
步骤1，使用BspQI酶切质粒模板LZP13获得线性化载体，将线性化载体与靶向序列ZXDB sgRNA1和ZXDB sgRNA2利用overlap重组的方式进行连接，获得重组质粒LZP13-ZXDBsgRNA1及LZP13-ZXDB sgRNA2；
步骤2，利用特异性引物LZP13-SG-F/LZP13-SG-R，以重组质粒LZP13-ZXDB sgRNA1及LZP13-ZXDB sgRNA2为模板进行PCR扩增，纯化得到体外转录模板ZXDB sgRNA-IVT-1及ZXDB sgRNA-IVT-2后进行体外转录。
3)单链DNA模板的制备；包括左侧和右侧DNA模板，模板设计好后由测序公司合成。设计如下，在1号外显子上下游100bp处的sgRNA切割位点处，左右各拉80bp同源臂，并在左右同源臂中插入loxP位点。
4)显微注射获得F0小鼠：
PMSG处理ICR/C57B6J雌性小鼠，再注射hCG，与C57B6J雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵；上述1)2)中设计得到的2条sgRNA进行纯化，并与Cas9蛋白以及两侧单链DNA模板混合孵育共同注射小鼠胚胎。二细胞胚胎移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠。
5)鉴定F0代小鼠基因型：
提取F0代的幼鼠基因组DNA，PCR扩增目的片段，Sanger测序鉴定基因型，筛选出两侧均带有loxP位点的阳性F0代小鼠。
将完成flox修饰的阳性F0代小鼠和野生型小鼠交配并获得子代小鼠，子代小鼠中保留有flox修饰的杂合转基因小鼠即可用于与Cre工具鼠配繁。
优选的，将F1小鼠与Cre工具鼠交配，获得Cre阳性的杂合转基因F2代小鼠，将F2代小鼠进行相互交配，获得Cre阳性的纯合转基因F3代小鼠。
下述实施例使用的小鼠为C57B6J小鼠，购自上海杰思捷实验动物有限公司，小鼠的ZXDB基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示。
下述实施例使用的质粒LZP13的质粒图谱如图1所示，LZP13的核苷酸序列为SEQID NO:12所示。
实施例1子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建
子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因模型小鼠的构建方法，包括以下步骤：
1.构建并获取sgRNA体外转录重组质粒
1.1靶向ZXDB基因设计sgRNA
从NCBI数据库中下载小鼠ZXDB基因的核苷酸序列。利用CRISPR在线设计工具CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)筛选特异性靶点，找到PAM序列(即NGG)后，取NGG前面的20bp作为目标靶序列，核酸序列如下：
表1sgRNA寡核苷酸序列
1.2CRISPR寡核苷酸链的设计
根据目标靶序列ZXDB sgRNA1及ZXDB sgRNA2设计2对CRISPR寡核苷酸链，在模板链5’端添加AGG，非编码链模板3’端添加AAC，与BspQI酶切模板质粒LZP13后形成的粘性末端互补，寡核苷酸链序列如下：
表2CRISPR寡核苷酸链序列
1.3构建体外转录重组质粒
按表3的体系及程序将两对互补的CRISPR寡核苷酸链进行退火处理后，使用T4PNK磷酸化寡核苷酸链。同时使用BspQI按表4的体系及程序酶切质粒模板LZP13获得线性化载体并用rSAP进行去磷酸化处理。使用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)纯化线性化后的模板质粒，将线性化载体与所述的靶向序列ZXDB sgRNA1和ZXDB sgRNA2利用overlap重组的方式按表5的体系及程序进行连接，获得重组质粒LZP13-ZXDB sgRNA1及LZP13-ZXDB sgRNA2。
表3退火体系第一步：
程序：
第二步；
程序：
温度 时间
37℃ 30min
65℃ 20min
表4质粒线性化体系
程序：
温度 时间
室温 过夜
表5连接体系
程序：
温度 时间
室温 过夜
1.4获取重组质粒
将连接后的产物质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至含氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃恒温培养14h，挑出单克隆。Sanger测序验证后用8ml含氨苄抗性的LB液体培养基扩大培养，使用TIANGEN无内毒素质粒小提中量试剂盒抽提重组质粒LZP13-ZXDB sgRNA1及LZP13-ZXDB sgRNA2。
2体外转录
2.1IVT模板扩增
根据目的片段设计特异性引物LZP13-SG-F/LZP13-SG-R，引物序列如表6所示。目的片段包括T7 promoter，靶序列及sgRNA scaffold，序列如表7所示。按表8的体系及程序PCR扩增目的片段，使用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)纯化后得到体外转录模板ZXDB sgRNA-IVT-1及ZXDB sgRNA-IVT-2。
表6特异性引物序列
表7IVT模板序列：
表8IVT模板扩增体系：
重组质粒 1ng
LZP13-SG-F(100μM) 0.5μl
LZP13-SG-R(100μM) 0.5μl
2×Fast Pfu Master Mix(novoprotein E035-01A) 25μl
RNase Free Water To 50μl
50μl Total
程序：
2.2IVT
获得体外转录模板ZXDB sgRNA-IVT-1及ZXDB sgRNA-IVT-2后，利用模板按表9的体系及程序进行体外转录，转录后的产物电泳(图2)，使用5mM NaAc和异丙醇纯化后最终获得目的sgRNA。
表9体外转录体系
程序：
温度 时间
37℃ 2h
3.单链同源模板的制备
包括左侧和右侧DNA模板，模板设计好后由测序公司合成。设计如下：
在1号外显子上下游100bp处的sgRNA切割位点处，左右各拉80bp同源臂，并在左右同源臂中插入loxP位点(见图3小鼠ZXDB基因Flox位点的设计示意图)。
所述loxP位点序列如下：
ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO.15)
所述左侧单链DNA模板序列如下：
TCTGGGCTGTGTCTTGTGTTCCAGAGCCGCGGTCCCAGCATATTTAAATCACGGTGGCGTTAAATACGTTTTAATATCTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATAGGGCCAGTTTCTGCGCATTGCACTTTTTTTCCTTTCAGGAACGTGTTCGGGCCCGCGGCAGGGGGCGGGGTCGCGCC(SEQ ID NO.16)
所述右侧单链DNA模板序列如下：
TTGTTGTTTTTATCACACTCAAATGTGAGAATGTTCTGGAAGGAGCGCTTGCTTGCC
TGCAGTTGTTTCTTGCTGCCTTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCAAA
GGAACGCATCTGTGGATTACCAATTTAGGGATTTCAGTTCTCATCTTGAGTCTGGGACTG
ATAAGTTCTCTGACTG(SEQ ID NO.17)
4.构建基因敲除小鼠模型
4.1制备假孕母鼠
使用输精管结扎法制备结扎雄性小鼠两周后，与雌性小鼠合笼，诱导形成假孕雌性小鼠。
4.2获取F0代小鼠
PMSG处理ICR雌性小鼠，48h后注射hCG，将处理后的雌性小鼠与ICR雄性小鼠合笼交配。次日取受精卵进行显微注射，将目的sgRNA，同源模板与Cas9蛋白孵育后共同注射小鼠胚胎。将胚胎移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
4.3F0代小鼠的基因型鉴定
将F0代小鼠的鼠尾剪下后，打上耳标，提取F0代的小鼠的尾部基因组DNA。根据靶向位点信息设计特异性引物，左侧位点引物：loxP-F1及loxP-R1；右侧位点引物：loxP-F2及loxP-R2；引物序列如表10所示。按表11的体系及程序PCR扩增目的片段，Sanger测序鉴定基因型，筛选出阳性F0代小鼠。
表10小鼠基因型鉴定特异性引物序列：
使用F1和R2引物进行扩增并使用F1和R2引物分别进行一代测序。用于判定两侧loxP位点是否被添加进去，即单倍型。所述F1和R2引物扩增产物条带3133bp，所述扩增序列如SEQ ID NO.22所示。
表11小鼠基因型鉴定体系
模板 2μl
10*PCR Buffer for KOD-Plus-Neo(TOYOBO) 2.5μl
2mM dNTPs 2.5μl
25mM MgSO4 1.2μl
F/R(10μM) 0.5μl each
KOD-Plus-Neo(TOYOBO KOD-401) 0.5μl
DMSO 1μl
ddH2O 14.3μl
25μl Total
体系：
LoxP-1位点的引物F1和R1，扩增后的产物，野生型条带：147bp；阳性条带：181bp。
LoxP-2位点的引物F2和R2，扩增后的产物，野生型条带：111bp；阳性条带：145bp。
4.4ZXDB条件敲除小鼠模型的获取及扩繁
阳性floxed的F0代小鼠与子宫内膜组织特异性cre小鼠进行交配，采用PCR分析对子代进行基因型鉴定，确认其携带flox等位基因和Cre转基因。
选择同时携带flox等位基因和Cre转基因的子代，作为未来的条件性敲除模型。
将选出的双阳性小鼠与适当的同性或杂交小鼠进行配对(配繁示意图见图4)，以维持或扩繁特定基因型的种群。
如图4所示，将阳性flox杂合转基因小鼠与Cre工具鼠交配，获得Cre阳性的杂合转基因F2代小鼠，将该F2代小鼠进行交配，获得Cre阳性的纯合转基因F3代小鼠。
根据Cre表达载体的启动子，确认特定位点的目标基因是否被有效敲除。可通过PCR、Western blot或免疫组化等方法验证。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；
制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子上下游sgRNA切割位点处，分别向左右添加同源臂，并在该左右同源臂中各插入loxP位点；
将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
对F0代小鼠进行基因型鉴定，筛选出带有loxP位点的阳性F0代小鼠即为条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠；
将阳性flox小鼠与子宫内膜组织特异性Cre小鼠进行交配，并对其子代进行基因型鉴定，选出同时携带flox等位基因和Cre转基因的子代即为子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型。
2.一种用于条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
设计靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，构建包含该sgRNA的重组载体，再通过体外转录扩增获得目的sgRNA；
制备同源模板，在小鼠ZXDB基因的外显子上下游sgRNA切割位点处，分别向左右添加同源臂，并在该左右同源臂中各插入loxP位点；
将目的sgRNA、同源模板与Cas9蛋白孵育后，通过显微注射注入小鼠受精卵，然后将其移植入假孕母鼠中，获得F0代小鼠；
对F0代小鼠进行基因型鉴定，筛选出带有loxP位点的阳性F0代小鼠即为条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA1和SEQ ID NO.4所示的sgRNA2。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述同源模板为单链寡核苷酸同源模板。
5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述含loxP位点的左同源臂的序列如SEQ ID NO.16所示。
6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述含loxP位点的右同源臂的序列如SEQ ID NO.17所示。
7.特异性靶向小鼠ZXDB基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括SEQ ID NO.1所示的sgRNA1和SEQ ID NO.4所示的sgRNA2。
8.包含权利要求7所述sgRNA的重组载体。
9.子宫内膜细胞条件性敲除ZXDB基因小鼠模型的应用，用于研制与X染色体相关遗传病的治疗药物。
10.用于条件性敲除ZXDB基因的flox小鼠在制备组织特异性敲除ZXDB基因的动物模型中的应用。
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