WO2018105454A1 - 電気化学測定方法および電気化学測定装置 - Google Patents

Abstract

生体試料の状態を以下の電気化学測定方法により電気化学的に測定する。作用電極を備え、測定液が作用電極と接するように測定液が充填された電気化学測定デバイスを準備する。測定液に生体試料を入れる。作用電極に測定電位を印加して作用電極に流れる電流値を測定する。作用電極に酸化電位を印加して作用電極の表面を酸化させる。この電気化学測定方法により、生体試料の周囲の環境の測定を安定して行うことができる。

Description

電気化学測定方法および電気化学測定装置

　本開示は、細胞又は組織等の活動状態を測定、解析するための電気化学測定方法および電気化学測定装置に関する。

　細胞や組織は、様々な物質を輸送、消費することによって活動している。例えば、胚は、周囲の酸素を消費しながら細胞分裂を行う。そのため、細胞や組織等の試料の周囲の環境を測定することにより、その試料の活動状態について解析することができる。

　試料の周囲の環境を測定する方法としては、例えば、作用電極が設けられた電気化学測定デバイスを用いて、試料を含む溶液の電気化学測定を行う方法がある（例えば、特許文献１参照）。

国際公開第２０１０／０５５９４２号

　生体試料の状態を以下の電気化学測定方法により電気化学的に測定する。作用電極を備え、測定液が作用電極と接するように測定液が充填された電気化学測定デバイスを準備する。測定液に生体試料を入れる。作用電極に測定電位を印加して作用電極に流れる電流値を測定する。作用電極に酸化電位を印加して作用電極の表面を酸化させる。

　この電気化学測定方法により、生体試料の周囲の環境の測定を安定して行うことができる。

図１は実施の形態における電気化学測定デバイスの斜視図である。 図２は実施の形態における電気化学測定装置の概念図である。 図３Ａは図１に示す電気化学測定デバイスの線３Ａ－３Ａにおける断面図である。 図３Ｂは図３Ａに示す電気化学測定デバイスの拡大上面図である。 図４は実施の形態における電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図５は図４に示す電気化学測定方法での電位印加プロトコルを示す図である。 図６は図４に示す電気化学測定方法の他の電位印加プロトコルを示す図である。 図７は図４に示す電気化学測定方法のさらに他の電位印加プロトコルを示す図である。 図８は実施の形態における他の電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図９は図８に示す電気化学測定方法の電位印加プロトコルを示す図である。 図１０は実施の形態における他の電気化学測定デバイスの上面図である。 図１１は実施の形態におけるさらに他の電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図１２は図１１に示す電気化学測定方法の電位印加プロトコルを示す図である。 図１３Ａは図１１に示す電気化学測定方法の電位印加プロトコルの拡大図である。 図１３Ｂは図１３Ａに示す電位印加プロトコルにおいて１つの作用電極に印加される電位を示す図である。 図１４Ａは図１１に示す電気化学測定方法の他の電位印加プロトコルの拡大図である。 図１４Ｂは図１４Ａに示す電位印加プロトコルにおいて１つの作用電極に印加される電位を示す図である。

　以下では、本開示の実施の形態に係る電気化学測定方法について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置及び接続形態などは、一例であり、本開示を限定する趣旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

　また、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。各図において、実質的に同一の構造については同一の符号を付しており、重複する説明は省略または簡略化している。

　図１は実施の形態における電気化学測定デバイス１０の斜視図である。図２は実施の形態における電気化学測定装置３０を模式的に示した概念図である。図３Ａは図１に示す電気化学測定デバイス１０の線３Ａ－３Ａにおける断面図であり、電気化学測定デバイス１０の動作を模式的に示す。

　電気化学測定デバイス１０は胚等の細胞または生体の組織などの生体試料１０１の活動状態を測定するためのデバイスである。

　電気化学測定デバイス１０は、容器１１と電極チップ１２とを備える。容器１１は、上容器１１ａと下容器１１ｂとを有する。

　容器１１は、容器１１の内部に実装された電極チップ１２を有する。容器１１は、測定液１０２を溜めるための貯留部１３を有する容器である。貯留部１３の底面１３ｂには逆円錐形状の複数のウェル１４が設けられている。生体試料１０１はウェル１４の内部に配置される。容器１１は、例えば、樹脂成型等により作製される。

　電極チップ１２は、互いに反対側の上面１２ａと下面１２ｂとを有する。電極チップ１２の上面１２ａは領域１５を有する。電極チップ１２の上面１２ａには作用電極１６が設けられている。領域１５は、電極チップ１２の上面１２ａに生体試料１０１を載置するための載置部である。作用電極１６は、生体試料の電気化学測定に用いられる。

　載置部である領域１５は、例えば電極チップ１２の上面１２ａに設けられる凹部で構成されている。なお、領域１５は、電極チップ１２に設けられる凹部に限られない。例えば、領域１５は、電極チップ１２の上面１２ａの平坦な部分に設けられていてもよい。

　作用電極１６は、領域１５の周囲を取り囲むように設けられている。作用電極１６は電極チップ１２の上面１２ａに設けられる。電極チップ１２に領域１５の周囲を取り囲む作用電極１６を設けることにより、領域１５に配置される生体試料１０１と作用電極１６との距離を一定に保つことができる。

　図２に示すように、電気化学測定装置３０は、電気化学測定デバイス１０と、電気化学測定デバイス１０に接続された制御部３４と、制御部３４に接続された測定部３６と、測定部３６に接続された演算部３７とを有する。

　図３Ｂは電気化学測定デバイス１０の拡大上面図であり、ウェル１４の底面１４ｂを示す。図３Ａと図３Ｂに示すように、複数の作用電極１６は領域１５を中心とする実質的に同心円形状を有し、領域１５の中心からの距離が異なる位置に配置されている。これにより、電気化学測定デバイス１０は、生体試料１０１から距離の異なる複数の位置で電気化学測定を行うことができる。

　電気化学測定デバイス１０において、下容器１１ｂと、電極チップ１２と、上容器１１ａがこの順に積層されている。ウェル１４は、貯留部１３の底面１３ｂに繋がる側壁面１４ａと、側壁面１４ａに繋がる底面１４ｂとを有する。ウェル１４の底面１４ｂには貫通孔５３が形成されている。つまり、貫通孔５３は、上容器１１ａの下部を貫通している。ウェル１４の底面１４ｂにおいて、電極チップ１２の作用電極１６は貫通孔５３から露出している。電極チップ１２はウェル１４の下方に配置される。

　下容器１１ｂには、電極チップ１２の下方に位置する貫通孔５４が設けられている。電極チップ１２の下面１２ｂには、作用電極１６と電気的に接続された接続端子１７が設けられている。接続端子１７は、貫通孔５４を介して下容器１１ｂの下面すなわち電気化学測定デバイス１０の外部に露出している。接続端子１７は電気化学測定装置３０の制御部３４等の外部の計測機器に接続される。

　上容器１１ａと電極チップ１２との間には、測定液１０２の漏出を抑制するため、シール材１８が設けられている。

　なお、作用電極１６は、領域１５の中に設けられていてもよい。また、接続端子１７は、容器１１の側面に設けられていてもよい。

　また、電気化学測定デバイス１０は、ウェル１４の底面１４ｂに形成される貫通孔５３および電極チップ１２を有しなくてもよい。この場合、領域１５および作用電極１６は、電極チップ１２上ではなく、上容器１１ａのウェル１４の底面１４ｂに直接的に設けられる。

　電気化学測定装置３０は、電気化学測定デバイス１０を用いて、生体試料１０１の電気化学測定を行う。電気化学測定装置３０の制御部３４は、例えば、作用電極１６へ電圧を印加し、作用電極１６に流れる電流を測定する。

　電気化学測定装置３０は、ステージ３１、設置部３２、端子３３およびカバー３５をさらに有する。

　電気化学測定デバイス１０は、ステージ３１上の設置部３２に設置される。設置部３２は、例えば、ステージ３１の上面に設けられる凹部である。電気化学測定デバイス１０は、設置部３２の凹部に固定される。

　ステージ３１には端子３３が設けられている。端子３３は、電気化学測定デバイス１０の接続端子１７と接触する。これにより、作用電極１６は、端子３３と電気的に接続される。また、端子３３は、制御部３４と電気的に接続される。

　制御部３４は、作用電極に印加する電位の大きさおよび電位の印加のタイミングを制御する。制御部３４は、電源回路および電位印加回路などを含む。これにより、制御部３４は、電位を印加する指令信号の生成や作用電極への電位の印加を行うことができる。

　測定部３６は、例えば、印加された電位により作用電極１６に流れる電流を測定する。演算部３７は、測定した電流値に基づいて、例えば、生体試料１０１の活性度を算出する。

　図２に示すように、制御部３４、測定部３６および演算部３７は、それぞれ独立した回路で構成されていてもよい。あるいは、制御部３４と、測定部３６と、演算部３７とは１つの集積回路で構成されていてもよい。

　電気化学測定装置は、設置部３２を覆うカバー３５を有してもよい。カバー３５はステージ３１の上方に設けられる。カバー３５とステージ３１とは、電気化学測定デバイス１０が配置される空間を形成している。これにより、設置部３２に設置される電気化学測定デバイス１０はカバー３５に完全に覆われる。カバー３５は、生体試料１０１の測定環境を適切な環境に保持するために設けられる。つまり、カバー３５は、外気と隔離された測定環境を形成する。カバー３５を設けることにより、電気化学測定装置３０は、適切な環境で生体試料１０１を測定できる。適切な環境とは、例えば、インキュベーター内と同様の環境である。インキュベーター内の環境とは、例えば、３７℃で空気中に５％の二酸化炭素を有する環境である。

　なお、電気化学測定装置３０は、カバー３５を備えていなくてもよい。この場合には、電気化学測定デバイス１０を設置した電気化学測定装置３０のステージ３１をインキュベーター内に配置した状態で測定を行うことができる。

　以下、図３Ａを参照して、生体試料１０１を測定する際の電気化学測定デバイス１０の動作を説明する。

　生体試料１０１は、例えば、胚である。胚は、未分化および卵割した受精卵を含む。

　胚は、周囲の酸素を消費しながら卵胞内部で分割している。電気化学測定デバイス１０は、作用電極１６を用いて胚周辺の測定液１０２の部分に溶存する酸素量を計測できる。そして、計測した酸素量により、胚の酸素消費の活動状態を確認することができる。

　貯留部１３には、参照電極２３および対極２４が設けられている。

　測定液１０２は、作用電極１６と参照電極２３と対極２４とに接するように、貯留部１３およびウェル１４に充填される。

　作用電極１６、参照電極２３および対極２４は、電気化学測定装置３０の制御部３４に電気的に接続される。

　電気化学測定装置３０は、例えばポテンショスタットである。ポテンショスタットは、参照電極２３に対する作用電極１６の電位を一定にする装置である。

　生体試料１０１は、電極チップ１２の上面１２ａに設けられた領域１５に配置される。

　生体試料１０１の周辺の測定液１０２の部分に溶存する酸素量を計測する際は、ポテンショスタットを用いて作用電極１６に酸素還元電位を印加する。これにより、作用電極１６の周辺の測定液１０２に溶存する酸素が還元される。酸素が還元されることにより、作用電極１６に電流が流れる。作用電極１６に流れる電流は、測定部３６により測定される。

　作用電極１６に流れる電流値は、作用電極１６の周囲の測定液１０２の部分に溶存する酸素量と相関がある。そのため、生体試料１０１の周囲に配置された作用電極１６の電流値を計測することで、生体試料１０１の周辺の測定液１０２の部分の溶存酸素量である溶存酸素濃度を検出することができる。

　なお、対極２４は設けなくてもよい。この場合、参照電極２３は、参照電極２３としての役割のほかに、対極２４としての役割を有してもよい。

　図４は実施の形態における電気化学測定方法のフローチャートである。図５は、図４に示す電気化学測定方法において作用電極１６に印加される電位の印加のタイミングを示す電位印加プロトコルである。図５において、縦軸は作用電極１６に印加される電位を示し、横軸は時間を示す。

　以下、図４および図５を参照して、胚等の単一の生体試料１０１の酸素消費量の電気化学測定方法について説明する。ここで、単一の生体試料１０１は、１つの細胞、１つの細胞塊および１つの組織である。測定液１０２中で分散した状態で含まれている複数の細胞は単一の生体試料１０１に含まない。

　電極チップ１２の上面１２ａには、領域１５から異なる距離に配置される複数の作用電極１６が設けられている。

　図４に示す電気化学測定方法では、容器１１に測定液１０２を注入する（ステップＳ０１０）。その後、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前のブランク状態の電流値Ｉ１を測定する（ステップＳ０２０）。その後、作用電極１６に酸化電位を印加して、作用電極１６の表面を酸化させる（ステップＳ０３０）。その後、生体試料１０１を投入する（ステップＳ０４０）。その後、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入した後の電流値Ｉ２を測定する（ステップＳ０５０）。その後、作用電極１６に酸化電位を印加して、作用電極１６の表面を酸化させる（ステップＳ０６０）。その後、生体試料１０１を回収する（ステップＳ０７０）。その後、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後のブランク状態の電流値Ｉ３を測定する（ステップＳ０８０）。その後、作用電極１６に酸化電位を印加して、作用電極１６の表面を酸化させる（ステップＳ０９０）。その後、測定した電流値Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３から測定液１０２中の物質の濃度である溶存酸素量すなわち溶存酸素濃度を算出する（ステップＳ１００）。算出された溶存酸素濃度から、生体試料１０１の活性度を計ることができる。

　以下に各ステップにつき詳述する。

　ステップＳ０１０では、容器１１の貯留部１３及びウェル１４に測定液１０２を入れる。測定液１０２は、作用電極１６、参照電極２３および対極２４と接触している。そして、電気化学測定デバイス１０を電気化学測定装置３０の設置部３２に設置する。このとき、接続端子１７は端子３３と接触している。なお、実施の形態においては、作用電極１６および対極２４として白金電極を用いて説明する。また、参照電極２３として、白金の擬似参照電極を用いて説明する。ただし、電極材料は、これらに限定されるものではない。例えば、参照電極は、銀電極または塩化銀電極でもよい。

　なお、測定液１０２が容器１１に予め充填されている場合には、ステップＳ０２０から始めてもよい。

　生体試料１０１を測定液１０２に入れる前に、ステップＳ０２０では図５に示す期間Ｔ１のうちの期間Ｔ１ａにおいて作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前の作用電極１６に流れる電流値Ｉ１を測定する。測定電位Ｖｍは、酸素還元電位である。実施の形態において、測定電位Ｖｍは参照電極２３に対して負の電位である。例えば、測定電位Ｖｍは－０．６Ｖである。測定電位Ｖｍは６０秒から１００秒までの４０秒の期間Ｔ１ａに作用電極１６に印加される。期間Ｔ１ａの長さは、例えば、１０秒間から１２０秒間である。測定電位Ｖｍが作用電極１６に印加されることにより、作用電極１６の周辺の測定液１０２の部分中の溶存酸素が還元されるため、作用電極１６に酸素還元電流が流れる。電気化学測定装置３０は、作用電極１６に流れるこの酸素還元電流の電流値Ｉ１を測定する。なお、測定電位Ｖｍの正負の極性は、測定対象となる物質により異なる。測定電位Ｖｍが参照電極２３に対して正の電位となる場合もある。例えば、測定液１０２中の過酸化水素の濃度を測定する場合は、測定電位Ｖｍは参照電極２３に対して正の電位である。

　ステップＳ０２０では、生体試料１０１の影響を受けないブランク状態の測定液１０２に含まれる溶存酸素の量すなわち溶存酸素の濃度に起因する電流値Ｉ１を測定できる。

　なお、期間Ｔ１ａの前には作用電極１６に電位が印加されていない。つまり、作用電極１６は電気的に参照電極２３から浮いている。

　ステップＳ０３０では、作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。酸化電位Ｖｏは、作用電極１６の表面を酸化させるために必要な電位である。酸化電位Ｖｏは、例えば、＋０．７Ｖである。酸化電位Ｖｏ大きさは、測定液１０２の電気分解が生じない電位の最大値より小さく、作用電極１６の表面の酸化が十分に生じる電位の最小値より大きいことが好ましい。好ましくは、酸化電位Ｖｏは、０．１Ｖ以上、１．３Ｖ以下である。

　酸化電位Ｖｏは、期間Ｔ１ａに続く１００秒から１０４秒までの４秒の期間Ｔ１ｂにおいて作用電極１６に印加される。これにより、作用電極１６の表面は酸化する。作用電極１６の表面を酸化することにより、作用電極１６の表面状態を一定の状態で維持することができる。これにより、その後の測定を安定して行うことができる。

　期間Ｔ１は、測定電位Ｖｍを印加する期間Ｔ１ａと酸化電位Ｖｏを印加する期間Ｔ１ｂとの合計の期間である。

　ステップＳ０４０では、期間Ｔ１に続く期間Ｔ２において、生体試料１０１を電気化学測定デバイス１０に投入する。期間Ｔ２は、１０４秒から１６４秒までの６０秒間である。期間Ｔ２の長さは、操作者が生体試料１０１の投入に必要な時間が設定される。例えば、期間Ｔ２の長さは３０秒間から１２０秒間である。

　期間Ｔ２において、作用電極１６は電気的に参照電極２３から浮いている。図５において、期間Ｔ２の点線は特定の電位を示すものではなく、作用電極１６が電気的に浮いており作用電極１６に電位が印加されていないことを示す。つまり、生体試料１０１は、作用電極１６に電位を印加していない期間Ｔ２に測定液１０２に入れられる。このとき、作用電極１６には電流が流れないため、生体試料１０１の投入に伴う電流ノイズの発生を抑えることができる。また、生体試料１０１が作用電極１６に接触してしまった場合でも、生体試料１０１には電流が流れず、したがって、生体試料１０１が電流に起因するダメージを受けるということを防止できる。

　ステップＳ０５０では、期間Ｔ２に続く期間Ｔ３ａにおいて作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入した後の生体試料１０１が測定液１０２に入っている状態で作用電極１６に流れる電流の電流値Ｉ２を測定する。測定電位Ｖｍは、酸素還元電位である。実施の形態において、測定電位Ｖｍは、例えば－０．６Ｖである。測定電位Ｖｍは、１６４秒から２０４秒までの４０秒の期間Ｔ３ａにおいて作用電極１６に印加される。期間Ｔ３ａの長さは、生体試料１０１の大きさや種類によって適宜決められ、実施の形態では、例えば、１０秒間から１２０秒間である。測定電位Ｖｍが作用電極１６に印加されることにより、作用電極１６の周辺の測定液１０２の部分の中の溶存酸素が還元されるため、作用電極１６に酸素還元電流が流れる。電気化学測定装置３０は、作用電極１６に流れるこの酸素還元電流の電流値Ｉ２を測定する。

　ステップＳ０５０では、生体試料１０１の呼吸活動の影響を受ける溶存酸素量（溶存酸素濃度）に起因する電流値Ｉ２を測定することができる。

　載置された生体試料１０１は、呼吸活動に伴い、測定液１０２に含まれる周囲の溶存酸素を消費する。そのため、測定液１０２中の溶存酸素は、生体試料１０１の近傍では薄い状態になる。また、測定液１０２中の溶存酸素の量は、生体試料１０１から遠くなるほど測定液１０２の飽和溶存酸素の量に近づく。

　生体試料１０１の呼吸活動が活発であるほど、生体試料１０１の近傍では酸素が多く消費される。すなわち、生体試料１０１の周辺に形成される酸素濃度の勾配の大きさは、生体試料１０１である受精卵の呼吸活動量によって決定される。

　ステップＳ０６０では、２０４秒から２０８秒までの４秒間の期間Ｔ３ａに続く期間Ｔ３ｂにおいて作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。酸化電位Ｖｏは、作用電極１６の表面を酸化させるために必要な電位である。酸化電位Ｖｏは、例えば、＋０．７Ｖである。これにより、作用電極１６の表面は酸化する。作用電極１６の表面を酸化することにより、作用電極１６の表面状態を一定の状態で維持することができる。これにより、その後の測定を安定して行うことができる。

　期間Ｔ３は、測定電位Ｖｍを印加する期間Ｔ３ａと酸化電位Ｖｏを印加する期間Ｔ３ｂとの合計の期間である。

　ステップＳ０７０では、期間Ｔ３に続く期間Ｔ４において、生体試料１０１を電気化学測定デバイス１０から回収する、すなわち測定液１０２から生体試料１０１を出す。期間Ｔ４は、２０８秒から２６８秒までの６０秒間である。期間Ｔ４の長さは、操作者が生体試料１０１の回収に必要な時間が設定される。例えば、３０秒間から１２０秒間である。

　期間Ｔ４において、作用電極１６は参照電極２３から電気的に浮いている。図５において、期間Ｔ４の点線は作用電極１６に電位が印加されていないことを示し、特定の電位を示すものではない。つまり、期間Ｔ４では生体試料１０１は作用電極１６に電位を印加していない状態で回収され、測定液１０２から出される。このとき、作用電極１６には電流が流れないため、生体試料１０１の回収に伴う電流ノイズの発生を抑えることができる。また、生体試料１０１が作用電極１６に接触してしまった場合でも、生体試料１０１には電流が流れないので、生体試料１０１が電流に起因するダメージを受けるということを防止できる。

　ステップＳ０８０では、期間Ｔ４に続く２６８秒から３０８秒までの４０秒間の期間Ｔ５ａにおいて作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後の作用電極１６に流れる電流の電流値Ｉ３を測定する。測定電位Ｖｍは、酸素還元電位である。実施の形態において、測定電位Ｖｍは、例えば－０．６Ｖである。期間Ｔ５ａの長さは、例えば、１０秒間から１２０秒間である。測定電位Ｖｍが作用電極１６に印加されることにより、作用電極１６の周辺の測定液１０２の部分の中の溶存酸素が還元されるため、作用電極１６に酸素還元電流が流れる。電気化学測定装置３０は、作用電極１６に流れるこの酸素還元電流の電流値Ｉ３を測定する。

　ステップＳ０８０では、生体試料１０１の影響を受けないブランク状態の測定液１０２に含まれる溶存酸素量（溶存酸素濃度）に起因する電流値Ｉ３を測定できる。

　ステップＳ０９０では、期間Ｔ５ａに続く３０８秒から３１２秒までの４秒間の期間Ｔ５ｂにおいて作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。酸化電位Ｖｏは、作用電極１６の表面を酸化させるために必要な電位である。酸化電位Ｖｏは、例えば、＋０．７Ｖである。これにより、作用電極１６の表面は酸化する。作用電極１６の表面を酸化することにより、作用電極１６の表面状態を一定の状態で維持することができる。これにより、その後の測定を安定して行うことができる。

　期間Ｔ５は、測定電位Ｖｍを印加する期間Ｔ５ａと酸化電位Ｖｏを印加する期間Ｔ５ｂとの合計の期間である。

　なお、ステップＳ０８０の後に、作用電極１６に電位を印加して電流値の測定を行わない場合は、作用電極１６の表面状態を維持する必要がないのでステップＳ０９０を行わなくてもよい。

　なお、ステップＳ０２０、Ｓ０５０、Ｓ０８０の測定電位Ｖｍは同じ値であることが好ましい。また、ステップＳ０３０、Ｓ０６０、Ｓ０９０の酸化電位Ｖｏは同じ値であることが好ましい。

　さらに、期間Ｔ１、Ｔ３、Ｔ５において、測定電位Ｖｍを印加する期間Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａの長さは同じであることが好ましい。また、期間Ｔ１、Ｔ３、Ｔ５において、酸化電位Ｖｏを印加する期間Ｔ１ｂ、Ｔ３ｂ、Ｔ５ｂの長さは同じであることが好ましい。

　ステップＳ１００では、測定した電流値Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３を用いて、生体試料１０１の周囲の測定液１０２の部分の溶存酸素濃度を算出する。

　以下に、ステップＳ０５０で計測した電流値Ｉ２を用いて、ステップＳ０５０における生体試料１０１の周囲の溶存酸素濃度の算出方法について説明する。

　まず、複数の作用電極１６のうちの或る作用電極１６で測定した電流値Ｉ１で、その作用電極１６の電流値Ｉ２を割ることにより、その作用電極１６での電流変化率Ｉ＊２を求める。

　Ｉ＊２＝Ｉ２／Ｉ１　　・・・（１）
　複数の作用電極１６に流れる電流値Ｉ１、Ｉ２の絶対値が異なっても、電流変化率Ｉ＊２として規格化できる。

　ステップＳ０５０において、各作用電極で消費された酸素濃度Ｃ＊は、測定液１０２のバルク部分の溶存酸素濃度Ｃを用いて式（２）で表せる。

　Ｃ＊＝Ｉ＊２×Ｃ＝（Ｉ２／Ｉ１）×Ｃ　　・・・（２）
　先述のように、ステップＳ０５０では、生体試料１０１の酸素消費に伴い生体試料１０１の近傍で溶存酸素濃度が薄い状態になる。また、生体試料１０１から遠くなるほど、生体試料１０１が測定液１０２中の溶存酸素に及ぼす影響は小さくなる。

　よって、ステップＳ０５０では、複数の作用電極１６のうち、生体試料１０１により近い作用電極１６の電流変化率Ｉ＊２は大きくなる。また、複数の作用電極１６のうち、生体試料１０１からより遠い作用電極１６の電流変化率Ｉ＊２は小さくなる。

　作用電極１６での電流変化率Ｉ＊２は、作用電極１６の生体試料１０１からの距離に反比例する。

　したがって、生体試料１０１の酸素消費に伴い形成される酸素濃度勾配ΔＣは生体試料１０１の半径ｒと、生体試料１０１の中心から作用電極１６の中心までの距離Ｒとを用いて式（３）で表される。

　　ΔＣ＝（Ｃ－Ｃ＊）×Ｒ／ｒ　　・・・（３）
　距離Ｒは、上面視における、生体試料１０１の中心から作用電極１６の中心までの距離であってもよい。また、生体試料１０１の中心は、領域１５である載置部の中心であってもよい。

　胚などの球形の生体試料１０１においては、呼吸活動により、生体試料１０１の中心から球面状に酸素濃度勾配が形成される。そのため、球形の生体試料１０１の表面への酸素流束の総和である酸素消費量ＦはＦｉｃｋの第一法則に従うので、測定液１０２中の溶存酸素の拡散係数Ｄを用いて式（４）で表される。

　Ｆ＝４×π×ｒ×Ｄ×ΔＣ　　・・・（４）
　実施の形態では、生体試料１０１は平面である電極チップの上面１２ａの領域１５に配置されているので、溶存酸素は領域１５の中心から半球面状に拡散している。

　したがって、実施の形態における生体試料１０１の酸素消費量Ｆは式（５）で表される。

　Ｆ＝２×π×ｒ×Ｄ×ΔＣ　　・・・（５）
　ステップＳ０２０、Ｓ０８０での溶存酸素濃度および酸素流束も、上記と同じようにして求められる。

　なお、実際には、作用電極１６の表面の付着物等により、各作用電極１６に流れる酸素還元電流の値は経時的に減少する。

　また、ウェル１４の内部の測定液１０２の対流の影響により、ブランク状態においてもウェル１４の内部に酸素流束が形成されている場合がある。

　そのため、算出された生体試料１０１の酸素消費量Ｆの精度を上げるため、ステップＳ０５０で求めた酸素流束を、ステップＳ０２０、ステップＳ０８０のブランク状態での酸素流束で補正してもよい。

　また、生体試料１０１を測定液１０２に入れた状態において作用電極１６に流れる電流値を複数回測定してもよい。この場合は、ステップＳ０４０、Ｓ０７０の間で、ステップＳ０５０、Ｓ０６０を交互に繰り返し行うことにより、生体試料１０１を測定液１０２入れた状態における電流値を複数回測定することができる。

　また、上記の電気化学測定方法をインキュベーター内で実施してもよい。

　なお、算出する物質の濃度は、溶存酸素濃度に限られない。例えば、物質の濃度は、生体試料１０１の活性を示す物質の濃度であってもよい。

　また、生体試料１０１の電気化学測定は、実施の形態における電気化学測定方法のステップＳ０１０～Ｓ１００のうちの一部のステップのみを行い、他の一部のステップは行わなくてもよい。例えば、ステップＳ０８０～Ｓ０９０における電流値Ｉ３の測定は行わず、ステップＳ０１０～Ｓ０７０で電流値Ｉ１、Ｉ２だけを測定してもよい。また、ステップＳ０２０、Ｓ０３０での電流値Ｉ１の測定を行わず、ステップＳ０１０、Ｓ０４０からＳ１００で電流値Ｉ２、Ｉ３だけを測定してもよい。もしくは、ステップＳ０２０、Ｓ０３０、Ｓ０８０、Ｓ０９０での電流値Ｉ１、Ｉ３の測定は行わず、ステップＳ０１０、Ｓ０４０～Ｓ０７０、Ｓ１００で電流値Ｉ２だけを測定してもよい。

　前述のように、電気化学測定装置３０の制御部３４は、上述の実施の形態における電気化学測定方法を行うために、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して生体試料１０１を投入する前の電流値Ｉ１を測定するステップと、作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加するステップと、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して生体試料１０１を投入した後の電流値Ｉ２を測定するステップと、作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加するステップと、作用電極１６に測定電位Ｖｍを印加して生体試料１０１を回収した後の電流値Ｉ３を測定するステップとを行う。

　制御部３４は、上記ステップの少なくとも一部は行わなくてもよい。

　前述の従来の電気化学測定において、生体試料の周囲の環境の測定は、生体試料の投入の前後、または、回収の前後で作用電極に測定電位を印加する方法により行われる。しかしながら、この方法では、生体試料の投入または回収の前後での測定、または、試料の経時的な測定において、測定電位の印加により作用電極に流れる電流値が安定せず、測定結果の再現性が低い。そのため、生体試料の周囲の環境の測定を安定して行うことができない場合がある。

　前述のように、実施の形態における電気化学測定方法により、生体試料１０１の周囲の環境の測定を安定して行うことができる。

　（実施の形態における変形例１）
　図６は実施の形態における図４に示す電気化学測定方法での他の電位印加プロトコルを示す。

　この電位印加プロトコルは、図５に示す電位印加プロトコルに対して、期間Ｔ１、Ｔ３、Ｔ５（Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａ）における測定電位Ｖｍの印加方法が異なり、各期間において測定電位Ｖｍは複数のパルスよりなるパルス状の波形で印加される。すなわち、ステップＳ０２０、Ｓ０５０、Ｓ０９０にそれぞれ対応する期間Ｔ１、Ｔ３、Ｔ５のうちの期間Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａのそれぞれにおいて、制御部３４は測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して作用電極１６に印加する。非測定電位Ｖｎは、電気化学測定装置３０の開回路電位であり、すなわち、作用電極１６を開放したときの作用電極１６の電位である。非測定電位Ｖｎが印加された状態では、作用電極１６に電流が流れない。非測定電位Ｖｎは、例えば、０．０５Ｖである。各期間において、測定電位Ｖｍの１つのパルスの幅は１秒から１０秒であることが好ましい。

　制御部３４は、期間Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａにおいて測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎからなるパルス状の波形の測定電位Ｖｍを作用電極１６に印加した後、引き続き期間Ｔ１ｂ、Ｔ３ｂ、Ｔ５ｂにおいて酸化電位Ｖｏを作用電極１６に印加する。

　期間Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａで印加される測定電位Ｖｍのパルス波形は互いに同じであることが好ましい。つまり、図５に示す測定電位Ｖｍのパルス波形の複数のパルスの幅および周期は互いに等しいことが好ましい。

　パルス形状を有する測定電位Ｖｍを印加することにより、計測される電流値Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３の波形もパルス形状を有する。例えば、期間Ｔ１ａの測定電位Ｖｍの最初のパルスにより得られた電流値Ｉ１を用いて、他の電流値Ｉ２、Ｉ３を規格化してもよい、すなわち電流値Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３をそれぞれ電流値１、Ｉ２／Ｉ１、Ｉ３／Ｉ１で置き換えてもよい。これにより、規格化された酸素還元電流の値を得ることができる。

　測定電位Ｖｍをパルス状にすることで、生体試料１０１が領域１５に配置された状態で測定電位Ｖｍを印加する時間の積算時間を短くすることができる。

　測定電位Ｖｍの印加の積算時間を短くすることにより、酸素の還元によって生じる還元物が作用電極１６の表面に蓄積することを抑えることができる。また、生体試料１０１が還元物によって受けうる影響も小さくすることができる。

　なお、期間Ｔ１ａ、Ｔ３ａ、Ｔ５ａにおいて、制御部３４は、測定電位Ｖｍと０Ｖとを交互に繰り返すパルス形状の波形の電位を作用電極１６に印加してもよい。

　（実施の形態における変形例２）
　図７は実施の形態における図４に示す電気化学測定方法でのさらに他の電位印加プロトコルを示す。

　この電位印加プロトコルは、図５に示す電位印加プロトコルに対して、期間Ｔ１、Ｔ３、Ｔ５における酸化電位Ｖｏを印加するタイミングが異なる。

　図７に示す電位印加プロトコルにおいて、酸化電位Ｖｏは期間Ｔ１のはじめに印加される。つまり、期間Ｔ１において制御部３４は測定電位Ｖｍを作用電極１６に印加する前に、酸化電位Ｖｏを作用電極１６に印加する。実施の形態では、酸化電位Ｖｏは、期間Ｔ１が始まる６０秒から６４秒までの４秒間の期間Ｔ１ｂにおいて作用電極１６に印加され、期間Ｔ１ｂに続く期間Ｔ１ａにおいて酸化電位Ｖｏが作用電極１６に印加される。作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加することにより、作用電極１６の表面は酸化する。これにより、電流値Ｉ１を測定する前に作用電極１６の表面に付着した汚染物等の物質を取り除くことができる。また、作用電極１６の表面の状態をリセットすることができる。

　期間Ｔ３、Ｔ５においても期間Ｔ１と同様に酸化電位Ｖｏと測定電位Ｖｍが印加される。つまり、期間Ｔ３では、期間Ｔ３が始まる期間Ｔ３ｂにおいて酸化電位Ｖｏが作用電極１６に印加され、期間Ｔ３ｂに続く期間Ｔ３ａにおいて酸化電位Ｖｏが作用電極１６に印加される。期間Ｔ５では、期間Ｔ５が始まる期間Ｔ５ｂにおいて酸化電位Ｖｏが作用電極１６に印加され、期間Ｔ５ｂに続く期間Ｔ５ａにおいて酸化電位Ｖｏが作用電極１６に印加される。

　なお、最初の作用電極１６の表面に汚染物等の物質が付着しておらず表面の状態が好ましい場合は、期間Ｔ１ａにおいて酸化電位Ｖｏを作用電極１６に印加しなくてもよい。

　なお、図７に示す電位印加プロトコルにおいて、期間Ｔ１ａ、Ｔ２ａ、Ｔ５ａにおいて印加される測定電位Ｖｍの波形は図６に示す電位印加プロトコルと同様に、複数のパルスよりなるパルス波形であってもよい。

　（実施の形態における変形例３）
　図８は実施の形態における他の電気化学測定方法のフローチャートである。図９は図８に示す電気化学測定方法での電位印加プロトコルを示す。図８と図９において図４と図６と同じ部分には同じ参照番号を付す。図８に示す電気化学測定方法と図９に示す電位印加プロトコルでは、図４に示す電気化学測定方法と図６に示す電位印加プロトコルに対して、期間Ｔ１の前に還元電位Ｖｒと酸化電位Ｖｏとを交互に作用電極１６に印加する期間Ｔ１１０がさらに設けられている点で異なる。

　図８に示す電気化学測定方法では、測定液１０２を注入するステップ１０１の後でかつ電流値Ｉ１を測定するステップＳ０２０の前に、作用電極１６を安定化させる（ステップＳ０１５）。ステップＳ０１５を行うことにより、作用電極１６の表面状態が改善され、測定される電流値が安定する。

　ステップＳ０１５では、期間Ｔ１の前の期間Ｔ１１０において制御部３４は作用電極１６に還元電位Ｖｒを印加する。具体的には、ステップＳ０１５では、期間Ｔ１の前の期間Ｔ１１０において制御部３４は還元電位Ｖｒと酸化電位Ｖｏとを交互に繰り返して複数のパルスよりなるパルス波形で作用電極１６に印加する。還元電位Ｖｒは、例えば、－０．６Ｖである。還元電位Ｖｒと測定電位Ｖｍとは同じ値であってもよく、異なる値であってもよい。酸化電位Ｖｏは、例えば、＋０．７Ｖである。

　図８に示す電気化学測定方法では、ステップＳ０１５を行った後、図４に示す電気化学測定方法と同様にステップＳ０２０以降のステップを順に行う。

　期間Ｔ１１０は、作用電極１６が安定化するために必要な時間である。期間Ｔ１１０において、制御部３４は作用電極１６に流れる電流の値をモニタリングしながら、還元電位Ｖｒと酸化電位Ｖｏを印加する時間を決定してもよい。

　作用電極１６に流れる電流値は、しばらくの間、作用電極１６に電位を印加することにより安定する。そのため、電流値Ｉ１を測定する前に予め酸化電位Ｖｏと還元電位Ｖｒを作用電極１６に印加することにより、ステップＳ０２０において計測される電流値Ｉ１の電流変動を小さくすることができる。

　また、ステップＳ０１５を設けることで、作用電極１６および電気化学測定装置３０の異常を、ステップＳ０２０の測定を行う前に検出することができる。例えば、制御部３４はステップＳ０１５で得られる電流値を元にエラーを示す指標を表示することができる。

　なお、制御部３４は、ステップＳ０１５に対応する期間Ｔ１１０においてパルス波形で作用電極１６に電位を印加しなくてもよい。例えば、制御部３４は期間Ｔ１１０において酸化電位Ｖｏを所定の長さの期間Ｔ１１０に作用電極１６に印加し続けてもよい。

　なお、図９に示す電位印加プロトコルにおいて、期間Ｔ１ａ、Ｔ２ａ、Ｔ５ａにおいてパルス波形ではなく、制御部３４は測定電位Ｖｍを作用電極１６に印加し続けてもよい。

　（実施の形態における変形例４）
　図１０は実施の形態における他の電気化学測定デバイス５０の上面図である。図１０において、図１から図３Ｂに示す電気化学測定デバイス１０と同じ部分には同じ参照番号を付す。

　電気化学測定デバイス５０では、貯留部１３の底面１３ｂに複数のウェル４１、４２、４３、４４が設けられている。ウェル４１、４２、４３、４４を総称して、ウェル１４とする。ウェル１４の数は２～６個が好ましい。複数のウェル１４（４１～４４）のそれぞれは、図３Ａと図３Ｂに示す電気化学測定デバイス１０のウェル１４と同様の構造を有する。各ウェル１４の下方に電極チップ１２がそれぞれ配置されている。ウェル４１の内部には作用電極６１が設けられる。ウェル４２の内部には作用電極６２が設けられる。ウェル４３の内部には作用電極６３が設けられる。ウェル４４の内部には作用電極６４が設けられる。作用電極６１、６２、６３、６４を総称して作用電極１６とする。電気化学測定デバイス５０では複数のウェル１４に配置された複数の生体試料１０１を並列して測定することができる。

　生体試料１０１は、それぞれのウェル１４内の領域１５に１つずつに配置される。

　電気化学測定デバイス５０は電気化学測定デバイス１０と同様に動作する。

　図１１は電気化学測定デバイス５０を用いた電気化学測定方法を示すフローチャートである。以下に、本変形例における複数の生体試料１０１の活性状態を測定する方法を説明する。

　図１１に示す電気化学測定方法では、容器１１に測定液１０２を注入する（ステップＳ０１１）。その後、各ウェル１４において測定液１０２に生体試料１０１を投入する前のブランク状態の電流値Ｉ１ｘを測定する（ステップＳ０２１）。その後、各作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する（ステップＳ０３１）。その後、複数の生体試料１０１を各ウェル１４に１つずつ投入する（ステップＳ０４１）。その後、各ウェル１４において生体試料１０１を投入した後の電流値Ｉ２ｘを測定する（ステップＳ０５１）。その後、各作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する（ステップＳ０６１）。その後、各ウェル１４から生体試料１０１を回収して出す（ステップＳ０７１）。その後、各ウェル１４において生体試料１０１を回収した後のブランク状態の電流値Ｉ３ｘを測定する（ステップＳ０８１）。その後、測定した電流値Ｉ１ｘ、Ｉ２ｘ、Ｉ３ｘから各ウェル１４の測定液１０２中の溶存酸素濃度を算出する（ステップＳ１０１）。

　図１２は図１１に示す電気化学測定方法での電位印加プロトコルを示す。図１２において、縦軸は作用電極１６に印加される電位を示し、横軸は時間を示す。

　以下に、図１１に示す電気化学測定方法を詳述する。

　ステップＳ０１１では、容器１１の貯留部１３に測定液１０２を注入し、複数のウェル１４に測定液１０２を充填する。

　ステップＳ０２１では、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前の電流値Ｉ１ｘを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、電流値Ｉ１ｘは、各ウェル１４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電位Ｖｍは、期間Ｔ１２１において、作用電極１６に印加される。

　図１３Ａは、図１２における期間Ｔ１２１を拡大して示す。図１３Ａに示す電位印加プロトコルは、期間Ｔ１２１において、各ウェル１４の作用電極１６に流れる電流値Ｉ１ｘを１回ずつ測定する。

　期間Ｔ１２１は、期間Ｔ１２１ａと、期間Ｔ１２１ａに続く期間Ｔ１２１ｂよりなる。期間Ｔ１２１ａは、期間ＴａＡと、期間ＴａＡに続く期間ＴａＢと、期間ＴａＢに続く期間ＴａＣと、期間ＴａＣに続く期間ＴａＤよりなる。期間Ｔ１２１ｂは、期間ＴｂＡと、期間ＴｂＡに続く期間ＴｂＢと、期間ＴｂＢに続く期間ＴｂＣと、期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤよりなる。

　期間ＴａＡでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４１に配置された作用電極６１に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＡでは、作用電極６１に非測定電位Ｖｎと測定電位Ｖｍとを交互に繰り返して印加する。制御部３４は、期間ＴａＡにおいて作用電極６１に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４１内の作用電極６１に流れる電流値Ｉ１１を測定する。期間ＴａＡでは、複数のウェル１４のうちの他のウェル４２～４４に配置された作用電極６２～６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＢでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４２に配置される作用電極６２に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＢでは、作用電極６２に非測定電位Ｖｎと測定電位Ｖｍとを交互に繰り返して印加する。制御部３４は、期間ＴａＢにおいて作用電極６２に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４２内の作用電極６２に流れる電流値Ｉ１２を測定する。期間ＴａＢでは、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１、４３、４４に配置された作用電極６１、６３、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＣでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４３に配置される作用電極６３に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＣでは、作用電極６３に非測定電位Ｖｎと測定電位Ｖｍとを交互に繰り返して印加する。制御部３４は、期間ＴａＣにおいて作用電極６３に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４３内の作用電極６３に流れる電流値Ｉ１３を測定する。期間ＴａＣでは、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１、４２、４４に配置された作用電極６１、６２、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＤでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４４に配置される作用電極６４に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＤでは、非測定電位Ｖｎと測定電位Ｖｍとを交互に繰り返して印加する。制御部３４は、期間ＴａＤにおいて作用電極６４に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４４内の作用電極６４に流れる電流値Ｉ１４を測定する。期間ＴａＤでは、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１～４３に配置された作用電極６１～６３は参照電極２３から電気的に浮いている。

　上述のように、それぞれの期間において、作用電極１６に印加する測定電位Ｖｍはパルス形状の波形で印加されている。なお、それぞれの期間において、作用電極１６に印加する測定電位Ｖｍは、パルス形状ではない一定の電位であってもよい。

　このように、測定電位Ｖｍを印加する作用電極１６を順に切り替えることにより、各作用電極１６に流れる電流値Ｉ１ｘを順に測定できる。

　ステップＳ０３１では、期間Ｔ１２１ａに続く期間Ｔ１２１ｂにおいて、複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。これにより、各作用電極１６の表面を酸化させる。酸化電位Ｖｏは、各作用電極１６での電流値Ｉ１ｘを測定した後、各作用電極１６に順に印加される。

　詳細には、期間Ｔ１２１ａ中の最後の期間ＴａＤに続く期間ＴｂＡにおいて、作用電極６１に酸化電位Ｖｏを印加し、他の作用電極６２～６４は参照電極２３から電気的に浮いている。期間ＴｂＡに続く期間ＴｂＢでは、作用電極６２に酸化電位Ｖｏを印加し、他の作用電極６１、６３、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。期間ＴｂＢに続く期間ＴｂＣでは、作用電極６３に酸化電位Ｖｏを印加し、他の作用電極６１、６２、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤでは、作用電極６４に酸化電位Ｖｏを印加し、他の作用電極６１～６３は参照電極２３から電気的に浮いている。

　図１３Ｂは図１３Ａに示す電位印加プロトコルでの期間Ｔ１２１において作用電極６１に印加される電位を示す。前述のように、期間Ｔ１２１ａの最初の期間ＴａＡにおいて、制御部３４は作用電極６１に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６１に流れる電流値Ｉ１１を測定する。期間ＴａＡに続く期間ＴａＢ～ＴａＤにおいて、制御部３４は作用電極６１を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤに続く期間Ｔ１２１ｂの最初の期間ＴｂＡにおいて、制御部３４は作用電極６１に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＡに続く期間ＴｂＢ～ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６１を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＡにおいて作用電極６１に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　制御部３４は、他の作用電極６２～６４にも作用電極６１とタイミングをずらして測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎと酸化電位Ｖｏとを印加する。

　すなわち、期間ＴａＡにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＡに続く期間ＴａＢにおいて、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６２に流れる電流値Ｉ１２を測定する。期間ＴａＢに続く期間ＴａＣ、ＴａＤにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤに続く期間ＴｂＡにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＡに続く期間ＴｂＢにおいて、制御部３４は作用電極６２に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＢに続く期間ＴｂＣ、ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＢにおいて作用電極６２に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　期間ＴａＡ、ＴａＢにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＢに続く期間ＴａＣにおいて、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６３に流れる電流値Ｉ１３を測定する。期間ＴａＣに続く期間ＴａＤにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤに続く期間ＴｂＡ、ＴｂＢにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＢに続く期間ＴｂＣにおいて、制御部３４は作用電極６３に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＣにおいて作用電極６３に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　期間ＴａＡ～ＴａＣにおいて、制御部３４は作用電極６４を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＣに続く期間ＴａＤにおいて、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６４に流れる電流値Ｉ１４を測定する。期間ＴａＤに続く期間ＴｂＡ～ＴｂＣにおいて、制御部３４は作用電極６４を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６４に酸化電位Ｖｏを印加する。前述のように、制御部３４は期間ＴａＣにおいて作用電極６４に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　ステップＳ０４１では、期間Ｔ１２２において、複数の生体試料１０１を複数のウェル１４のそれぞれに１つずつ投入する。ステップＳ０４１において、各作用電極１６は、電気的に浮いている状態である。

　ステップＳ０５１では、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入した後の電流値Ｉ２ｘを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、電流値Ｉ２ｘは、各ウェル１４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電位Ｖｍは、期間Ｔ１２３において、作用電極１６に印加される。ステップＳ０５１において測定電位Ｖｍは、ステップＳ０２１と同じ電位印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、電流値Ｉ２ｘを測定することができる。

　ステップＳ０６１では、複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。これにより、各作用電極１６の表面を酸化させる。酸化電位Ｖｏは、各作用電極１６での電流値Ｉ２ｘを測定した後、各作用電極１６に順に印加される。ステップＳ０６１において、酸化電位Ｖｏは、ステップＳ０３１と同じ電位印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、各作用電極１６の表面は、順に酸化される。

　ステップＳ０７１では、期間Ｔ１２４において、複数のウェル１４のそれぞれから生体試料１０１を回収する。ステップＳ０７１において、各作用電極１６は、電気的に浮いている状態である。

　ステップＳ０８１では、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電位Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後の電流値Ｉ３ｘを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、電流値Ｉ３ｘは、各ウェル１４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電位Ｖｍは、期間Ｔ１２５において、作用電極１６に印加される。ステップＳ０８１において測定電位Ｖｍは、ステップＳ０２１と同じ電位印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、電流値Ｉ３ｘを測定することができる。

　ステップＳ０９１では、複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６に酸化電位Ｖｏを印加する。これにより、各作用電極１６の表面を酸化させる。酸化電位Ｖｏは、各作用電極１６での電流値Ｉ２ｘを測定した後、各作用電極１６に順に印加される。ステップＳ０６１において、酸化電位Ｖｏは、ステップＳ０３１と同じ電位印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、各作用電極１６の表面は、順に酸化される。

　なお、ステップＳ０８１の後に、各作用電極１６に電位を印加して電流値の測定を行わない場合は作用電極１６の表面状態を維持する必要がないので、ステップＳ０９１を設けなくてもよい。

　ステップＳ１０１では、測定した電流値Ｉ１ｘ、Ｉ２ｘ、Ｉ３ｘから各ウェル１４の測定液１０２中の溶存酸素濃度を算出する。

　なお、ステップＳ０３１、Ｓ０６１、Ｓ０９１において、各ウェルで電流値を測定する前または測定した後に、複数のウェル１４に酸化電位Ｖｏを一度に同時に印加してもよい。

　図１４Ａは図１１と図１２に示す電気化学測定方法での他の電位印加プロトコルの期間Ｔ１２１を拡大して示す。図１４Ａにおいて、縦軸は作用電極１６に印加される電位を示し、横軸は時間を示す。図１４Ａに示す電位印加プロトコルでは、期間Ｔ１２１ａは、この順で続く期間ＴａＡ１、ＴａＢ１、ＴａＣ１、ＴａＤ１、ＴａＡ２、ＴａＢ２、ＴａＣ２、ＴａＤ２、ＴａＡ３、ＴａＢ３、ＴａＣ３、ＴａＤ３よりなる。

　図１４Ａに示す電位印加プロトコルでは、図１１に示すステップＳ０２１、Ｓ０５１、ステップＳ０８１において、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電位Ｖｍを印加する操作を複数回繰り返す。これにより、電流値Ｉ１ｘ、Ｉ２ｘ、Ｉ３ｘを測定する。つまり、各ステップにおける電流値の計測において期間ＴａＡ～ＴａＤが複数回繰り返される。以下にその動作を詳述する。

　期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３では、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４１に配置された作用電極６１に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３では非測定電位Ｖｎを印加した後で測定電位Ｖｍを印加する。制御部３４は、期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３において作用電極６１に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４１内の作用電極６１に流れる電流値Ｉ１１を測定する。期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３では、複数のウェル１４のうちの他のウェル４２～４４に配置された作用電極６２～６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３にそれぞれ続く期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３では、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４２に配置された作用電極６２に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３では非測定電位Ｖｎを印加した後で測定電位Ｖｍを印加する。制御部３４は、期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３において作用電極６２に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４２内の作用電極６２に流れる電流値Ｉ１２を測定する。期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３では、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１、４３、４４に配置された作用電極６１、６３、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３にそれぞれ続く期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３では、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４３に配置された作用電極６３に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３では非測定電位Ｖｎを印加した後で測定電位Ｖｍを印加する。制御部３４は、期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３において作用電極６３に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４３内の作用電極６３に流れる電流値Ｉ１３を測定する。期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３では、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１、４２、４４に配置された作用電極６１、６２、６４は参照電極２３から電気的に浮いている。

　期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３にそれぞれ続く期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３では、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４４に配置された作用電極６４に測定電位Ｖｍを印加する。実施の形態では、期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３では非測定電位Ｖｎを印加した後で測定電位Ｖｍを印加する。制御部３４は、期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３において作用電極６４に測定電位Ｖｍを印加し続けて、非測定電位Ｖｎを印加しなくてもよい。これにより、ウェル４４内の作用電極６４に流れる電流値Ｉ１４を測定する。期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３では、複数のウェル１４のうちの他のウェル４１～４３に配置された作用電極６１～６３は参照電極２３から電気的に浮いている。

　図１４Ａに示す電位印加プロトコルでは制御部３４は期間Ｔ１２１ｂにおいて図１３Ａと図１３Ｂに示す電位印加プロトコルと同様に作用電極２６（６１～６４）に酸化電位Ｖｏを印加する。

　図１４Ｂは図１４Ａに示す電位印加プロトコルでの期間Ｔ１２１において作用電極６１に印加される電位を示す。前述のように、期間Ｔ１２１ａの最初の期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３において、制御部３４は作用電極６１に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に印加して作用電極６１に流れる電流値Ｉ１１を測定する。期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３にそれぞれ続く期間ＴａＢ１～ＴａＤ１において、制御部３４は作用電極６１を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤ３に続く期間Ｔ１２１ｂの最初の期間ＴｂＡにおいて、制御部３４は作用電極６１に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＡに続く期間ＴｂＢ～ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６１を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３において作用電極６１に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　制御部３４は、他の作用電極６２～６４にも作用電極６１とタイミングをずらして測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎと酸化電位Ｖｏとを印加する。

　すなわち、期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３において、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３にそれぞれ続く期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３において、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に印加して作用電極６２に流れる電流値Ｉ１２を測定する。期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３に続く期間ＴａＣ１、ＴａＤ１、ＴａＣ２、ＴａＤ２、ＴａＣ３、ＴａＤ３において、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤ３に続く期間ＴｂＡにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＡに続く期間ＴｂＢにおいて、制御部３４は作用電極６２に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＢに続く期間ＴｂＣ、ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６２を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＢにおいて作用電極６２に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３、ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３において、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３にそれぞれ続く期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３において、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６３に流れる電流値Ｉ１３を測定する。期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３にそれぞれ続く期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３において、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＤ３に続く期間ＴｂＡ、ＴｂＢにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＢに続く期間ＴｂＣにおいて、制御部３４は作用電極６３に酸化電位Ｖｏを印加する。期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６３を参照電極２３から電気的に浮かせる。前述のように、制御部３４は期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３において作用電極６３に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　期間ＴａＡ１、ＴａＡ２、ＴａＡ３、ＴａＢ１、ＴａＢ２、ＴａＢ３、ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３において、制御部３４は作用電極６４を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３にそれぞれ続く期間ＴａＤ１、ＴａＤ２、ＴａＤ３において、制御部３４は作用電極６２に測定電位Ｖｍと非測定電位Ｖｎとを交互に繰り返して印加して作用電極６４に流れる電流値Ｉ１４を測定する。期間ＴａＤ３に続く期間ＴｂＡ～ＴｂＣにおいて、制御部３４は作用電極６４を参照電極２３から電気的に浮かせる。期間ＴｂＣに続く期間ＴｂＤにおいて、制御部３４は作用電極６４に酸化電位Ｖｏを印加する。前述のように、制御部３４は期間ＴａＣ１、ＴａＣ２、ＴａＣ３において作用電極６４に非測定電位Ｖｎを印加せず測定電位Ｖｍを印加し続けてもよい。

　電気化学測定装置３０は、各ウェル１４の作用電極１６に印加する測定電位Ｖｍの１つのパルス毎に作用電極１６を切り替えて印加する。このように、１パルス毎にウェル１４の切り替えを行うことによって、ステップＳ０２１、Ｓ０８１でのブランク測定およびステップＳ０５１での生体試料の活性測定における各ウェル１４の測定の時間間隔を、ほぼ同じにすることができる。なお、１回の操作のそれぞれの区間に作用電極１６に印加される測定電位Ｖｍは、１つパルスに限らず、複数のパルスを有してもよい。

　測定電位Ｖｍのパルス数の総和は測定する生体試料１０１の数の整数倍である。

　なお、１つの作用電極６１に印加される測定電位Ｖｍのパルスの数と幅は、他の作用電極６２、６３、６４に印加される測定電位Ｖｍのパルスの数と幅とそれぞれ等しいことが好ましい。

　上記した実施の形態では、溶存酸素濃度を測定するにあたり測定電位Ｖｍは還元電位Ｖｒである。しかし、電気化学測定においては、測定電位Ｖｍとして酸化電位Ｖｏを用いる場合がある。この場合、作用電極１６に酸化電位Ｖｏの代わりに還元電位Ｖｒを印加する、すなわち上述の電位印加プロファイルにおいて、測定電位Ｖｍと酸化電位Ｖｏとを互いに入れ替えることで、作用電極１６の表面の状態を一定に維持することができる。

　以上、一つまたは複数の態様に係る電気化学測定方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、一つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。

　上記の実施の形態において、「上面」「下面」「上容器」「下容器」等の方向を示す用語は電極チップや容器等の電気化学測定デバイスの構成部材の相対的な位置関係でのみ決まる相対的な方向を示し、鉛直方向等の絶対的な方向を示すものではない。

１０，５０　　電気化学測定デバイス
１１　　容器
１２　　電極チップ
１３　　貯留部
１４，４１～４４　　ウェル
１５　　領域
１６，６１～６４　　作用電極
１７　　接続端子
１８　　シール材
１０１　　生体試料
１０２　　測定液
２３　　参照電極
２４　　対極
３０　　電気化学測定装置
３３　　端子
３４　　制御部
３５　　カバー
３６　　測定部
３７　　演算部

Claims (12)

1. 生体試料の状態を電気化学的に測定する電気化学測定方法であって、
   　　　作用電極を備え、測定液が前記作用電極と接するように前記測定液が充填された電気化学測定デバイスを準備するステップと、
   　　　前記測定液に前記生体試料を入れるステップと、
   　　　前記作用電極に測定電位を印加して前記作用電極に流れる電流値を測定するステップと、
   　　　前記作用電極に酸化電位を印加して前記作用電極の表面を酸化させるステップと、
   を含む電気化学測定方法。
2. 前記作用電極に流れる前記電流値を測定する前記ステップは、
   　　　前記測定液に前記生体試料を入れる前記ステップの前に前記作用電極に前記測定電位を印加して前記作用電極に流れる第１の電流値を測定するステップと、
   　　　前記測定液に前記生体試料が入っている間に前記作用電極に前記測定電位を印加して前記作用電極に流れる第２の電流値を測定するステップと、
   を含み、
   前記作用電極の前記表面を酸化させる前記ステップは、前記第１の電流値を測定する前記ステップの後で前記作用電極に前記酸化電位を印加して、前記作用電極の前記表面を酸化させるステップを含む、請求項１に記載の電気化学測定方法。
3. 前記測定液から前記生体試料を出すステップをさらに含み、
   前記作用電極の前記表面を酸化させる前記ステップは、前記第２の電流値を測定する前記ステップの後で前記作用電極に前記酸化電位を印加して前記作用電極の前記表面を酸化させるステップをさらに含み、
   前記作用電極に流れる前記電流値を測定する前記ステップは、前記測定液から前記生体試料を出す前記ステップの後で前記作用電極に前記測定電位を印加して前記作用電極に流れる第３の電流値を測定するステップをさらに含む、請求項２に記載の電気化学測定方法。
4. 前記作用電極の前記表面を酸化させる前記ステップは、前記第３の電流値を測定する前記ステップの後で前記作用電極に前記酸化電位を印加して前記作用電極の前記表面を酸化させるステップをさらに含む、請求項３に記載の電気化学測定方法。
5. 前記第１の電流値を測定する前記ステップの前に前記作用電極に前記酸化電位を印加して前記作用電極の前記表面を酸化させるステップをさらに含む、請求項２に記載の電気化学測定方法。
6. 前記第１の電流値を測定する前記ステップの前に前記作用電極に前記酸化電位を印加して前記作用電極の前記表面を酸化させる前記ステップは、前記第１の電流値を測定する前に前記作用電極を還元させる還元電位と前記酸化電位とを交互に前記作用電極に印加するステップを含む、請求項５に記載の電気化学測定方法。
7. 前記測定電位はパルス状の波形を有する、請求項１に記載の電気化学測定方法。
8. 前記測定電位は負の電位であり、前記酸化電位は正の電位である、請求項１に記載の電気化学測定方法。
9. 前記電気化学測定デバイスは参照電極をさらに備え、
   前記電気化学測定デバイスを準備するステップは、前記測定液が前記作用電極と前記参照電極とに接するように前記測定液が充填された電気化学測定デバイスを準備するステップを含み、
   前記測定電位は前記参照電極に対して負の電位であり、前記酸化電位は前記参照電極に対して正の電位である、請求項８に記載の電気化学測定方法。
10. 生体試料の状態を電気化学的に測定する電気化学測定方法であって、
    　　　作用電極を備え、前記作用電極と接するように測定液が充填された電気化学測定デバイスを準備するステップと、
    　　　前記測定液に前記生体試料を入れるステップと、
    　　　前記作用電極に測定電位を印加して前記作用電極に流れる電流値を測定するステップと、
    　　　前記作用電極に還元電位を印加して前記作用電極の表面を還元させるステップと、
    を含む、電気化学測定方法。
11. ウェルと、前記ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスと、
    前記電気化学測定デバイスの前記作用電極に電気的に接続された端子と、
    　　　前記作用電極に流れる電流値を計測するために前記作用電極に測定電位を印加して前記作用電極に流れる電流値を計測し、
    　　　前記作用電極の表面を酸化させるために前記作用電極に酸化電位を印加して前記作用電極の表面を酸化させる、
    ように構成された制御部と、を備えた電気化学測定装置。
12. 前記電気化学測定デバイスを覆うカバーをさらに備えた、請求項１１に記載の電気化学測定装置。

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