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WO2020235247A1 - 触媒反応の生成物の電気化学的検出方法およびトランスデューサ - Google Patents

触媒反応の生成物の電気化学的検出方法およびトランスデューサ Download PDF

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WO2020235247A1
WO2020235247A1 PCT/JP2020/016079 JP2020016079W WO2020235247A1 WO 2020235247 A1 WO2020235247 A1 WO 2020235247A1 JP 2020016079 W JP2020016079 W JP 2020016079W WO 2020235247 A1 WO2020235247 A1 WO 2020235247A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liquid
catalytic reaction
liquid mass
reaction product
working electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2020/016079
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English (en)
French (fr)
Inventor
亮太 國方
篤史 須田
林　泰之
浩介 伊野
末永　智一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Japan Aviation Electronics Industry Ltd
Original Assignee
Tohoku University NUC
Japan Aviation Electronics Industry Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CN202410574212.4A priority patent/CN118518741A/zh
Priority to SG11202112403UA priority patent/SG11202112403UA/en
Priority to US17/609,073 priority patent/US12320773B2/en
Priority to EP20809596.8A priority patent/EP3974513B1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a technique for electrochemically detecting a product produced by a catalytic reaction that proceeds in a solution and dissolved in the solution.
  • the detection sensitivity of a catalytic reaction product produced by a catalytic reaction such as an enzymatic reaction and dissolved in a solution is determined by the concentration of the product in the solution.
  • concentration of the product in the solution for example, a longer catalytic reaction time is preferred, or a smaller volume of the solution is preferred.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose a configuration that can avoid evaporation of the solution.
  • Patent Document 1 is a technique related to ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), in which droplets of a hydrophilic solvent, which is an enzyme reaction field, are placed in a storage portion (well), and the storage portion is placed. A configuration that is sealed with a hydrophobic solvent is disclosed.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Non-Patent Document 1 describes, in a technique related to ELISA, a droplet (that is, an enzyme reaction field) located in a pattern of a hydrophilic region by forming a pattern of the hydrophilic region by forming a hydrophobic region on a hydrophilic surface. Discloses a configuration in which the oil is covered.
  • the evaporation of the solution can be prevented by covering the solution which is the catalytic reaction field with a liquid different from the solution. Therefore, highly sensitive detection can be realized.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are spectroscopic detection techniques using a fluorescent substrate, and require a large-scale measuring device.
  • fluorescent substrates are expensive. Therefore, these techniques are costly.
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of inexpensively and easily performing highly sensitive detection of a product of a catalytic reaction.
  • the technical matters described herein are not intended to expressly or implicitly limit the invention described in the claims, and further, other than those who benefit from the present invention (for example, the applicant and the right holder). It is not an expression of the possibility of accepting such a limitation by a person, but is merely described for easy understanding of the gist of the present invention.
  • the outline of the present invention from another point of view can be understood from, for example, the claims at the time of filing of this patent application.
  • the technique disclosed herein is a technique in which a technique of covering a first liquid mass in which a catalytic reaction proceeds with a second liquid mass is applied to an electrochemical detection technique. This technique uses a liquid tank that houses the working electrode, the counter electrode, the first liquid mass, and the second liquid mass.
  • the first liquid mass has conductivity.
  • the working electrode is located in the first liquid mass.
  • the second liquid mass has conductivity.
  • the first liquid mass and the second liquid mass form a liquid-liquid interface, and the product of the catalytic reaction is insoluble in the second liquid mass.
  • the counter electrode is located in the second liquid mass. The redox reaction between the product of the catalytic reaction and the working electrode detects the current flowing through the working electrode.
  • FIG. 4A is a schematic view of the well.
  • FIG. 4B is a schematic view showing a state in which the first liquid mass is introduced into the well.
  • FIG. 4C is a schematic view showing a state in which the second liquid mass covers the first liquid mass.
  • FIG. 6A It is a figure for demonstrating the arrangement of the electrode in the transducer shown in FIG. 6A.
  • the product produced by the catalytic reaction proceeding in the first liquid mass (that is, the mass of the solution which is the catalytic reaction field) and dissolved in the first liquid mass is electrochemically detected.
  • FIG. 1 schematically shows a configuration example of the detection device 1 of the embodiment.
  • the detection device 1 includes a liquid tank 10, a working electrode 40, a counter electrode 50, a reference electrode 60, and a potentiostat 80.
  • the liquid tank 10 houses the first liquid mass 20 and the second liquid mass 30.
  • the first liquid mass 20 and the second liquid mass 30 form a liquid-liquid interface (that is, an interface between the liquid phases). As shown in FIG. 1, the first liquid mass 20 is located on the bottom surface 11 of the liquid tank 10 and is covered with the second liquid mass 30.
  • the working electrode 40 is installed on the bottom surface 11 of the liquid tank 10 and is covered with the first liquid mass 20. That is, the working electrode 40 is in contact with the first liquid mass 20, but is not in contact with the second liquid mass 30.
  • the counter electrode 50 and the reference electrode 60 are installed in the second liquid mass 30, and are electrically connected to the working electrode 40 via the liquid-liquid interface between the first liquid mass 20 and the second liquid mass 30. Has been done.
  • reference numeral 70 indicates a salt bridge.
  • the working pole 40, counter pole 50 and reference pole 60 are connected to the potentiostat 80 in this example.
  • the potentiometer 80 functions as a constant voltage power supply and includes a variable power supply 81, a voltmeter 82, and an ammeter 83.
  • the product of the catalytic reaction is confined in the first liquid mass 20 and does not dissolve in the second liquid mass 30 (that is, the product does not move from the first liquid mass 20 to the second liquid mass 30). ).
  • An electric current flows through the working electrode 40 by a redox reaction between the product of the catalytic reaction and the working electrode 40. By detecting this current, the product of the catalytic reaction is detected or quantitatively analyzed.
  • the detection device 1 includes two or more working electrodes 40
  • the detection device 1 includes two or more first liquid masses 20.
  • Each of the two or more working poles 40 is covered by a corresponding one of the two or more first liquid masses 20.
  • the individual first liquid lumps 20 are independent liquid lumps, and the different first liquid lumps 20 are separated by the second liquid lump 30.
  • the second liquid mass 30 is one liquid mass.
  • Each of the two or more first liquid lumps 20 and the second liquid lump 30 form a liquid-liquid interface.
  • Each of the two or more first liquid masses 20 is covered by a second liquid mass 30.
  • ELISA for example, detection of an antigen-antibody complex or by labeling an antigen or antibody (ie, immunoglobulin) contained in a sample with an enzyme and detecting the product obtained by the reaction of the enzyme with the substrate.
  • Quantitative analysis is performed. For example, in a combination of sandwich ELISA (sandwich ELISA protocol) and an electrochemical detection method, the following operations are performed. However, the explicit description of operations such as washing and incubation (leaving at a constant temperature) was omitted.
  • (1) Adsorption of the capture antibody to the solid phase (however, the solid phase includes the surface of the working electrode or the surface of a solid located in the vicinity of the working electrode).
  • the second liquid mass 30 is a liquid that is insoluble in the conductive first liquid mass 20 and has conductivity.
  • the first liquid mass 20 is usually an aqueous solution having a buffering ability, so that the second liquid mass 30 is, for example, insoluble in water and can dissolve the supporting electrolyte for obtaining conductivity. It is an organic solvent.
  • a liquid that is easy to handle as a solvent for electrochemical detection that is, a liquid that is liquid at room temperature and has low reactivity with water and an electrode material (gold, platinum, etc.) within the detection potential range.
  • a supporting electrolyte that is soluble in these organic solvents and can impart conductivity to the organic solvent
  • a supporting electrolyte used for electrochemical detection in a general non-aqueous solution can be adopted.
  • chloride ion chloride ion
  • bromide ion bromide ion
  • iodide ion iodide ion
  • sulfate ion sulfate ion
  • nitrate ion nitrate ion
  • perchloric acid ion hypochloric acid ion
  • fluoroboric acid ion tetrafluoroboric acid ion
  • hexafluorophosphoric acid ion hexafluorophosphoric acid ion
  • sulfonic acid ion sulfonic acid ion
  • lithium ion lithium ion and sodium.
  • ions sodium ion
  • potassium ion potassium ion
  • rubidium ion rubidium ion
  • rubidium ion rubidium ion
  • cesium ion cesium ion
  • ammonium ion ammonium ion
  • tetraalkylammonium ion having an arbitrary alkyl chain length.
  • a salt having any one of them as a cation is preferable.
  • the combination of the labeling enzyme and the substrate a combination having electrochemical activity and capable of producing a product soluble in the first liquid mass 20 and insoluble in the second liquid mass 30 is selected.
  • the combination of the labeling enzyme and the substrate is, for example, alkaline phosphatase and p-aminophenyl phosphate.
  • a combination of (phosphoric acid 4-aminophenylester) or a combination of western wasabi peroxidase (horseradish peroxydase) and potassium ferricyanide (potassium ferricyanide) is preferable.
  • the first liquid mass 20 is held in contact with the working pole 40 as shown in FIG. 1, and the working pole 40, the counter electrode 50, and the reference pole 60 are further arranged.
  • a state of being electrically connected to each other is constructed via the first liquid mass 20 and the second liquid mass 30 covering the first liquid mass 20.
  • the first liquid mass 20 is dropped, for example, on the working electrode 40 located on the bottom surface 11 of the liquid tank 10, and then the second liquid mass 30 is introduced into the liquid tank 10 without any special measures, the second liquid mass 20 is introduced.
  • the first liquid mass 20 is swept away from the top surface of the working electrode 40 by the hydraulic action of the liquid mass 30.
  • the density of the first liquid mass 20 is smaller than the density of the second liquid mass 30, the first liquid mass 20 is separated from the working electrode 40 by the action of buoyancy. Therefore, it is necessary to strongly hold the first liquid mass 20 on the top surface of the working electrode 40 to the extent that it exceeds such hydraulic action and buoyancy action.
  • the following holding structure is adopted in the embodiment.
  • B A structure in which each of the annular portions surrounding the surface of the working electrode 40 of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 is hydrophilized.
  • C A structure in which the surfaces of all working electrodes 40 and all the annular sites are hydrophilized.
  • D A structure in which all or part of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 except the surface of all working electrodes 40 is hydrophobized (however, this structure is the second liquid of the bottom surface 11 of the liquid tank 10). Including a structure in which the portion in contact with the mass 30 is hydrophobized).
  • FIGS. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3A, 3B, 3C show an example of the holding structure of the first liquid mass 20.
  • reference numeral 91 indicates a hydrolyzed region
  • reference numeral 92 indicates a hydrophobized region.
  • FIGS. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3A, 3B, and 3C only one working pole 40 is illustrated from the viewpoint of easy-to-understand illustration, and the working pole 40 located on the bottom surface 11 of the liquid tank 10 is illustrated.
  • the surface of the working electrode 40 and the annular portion of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 surrounding the surface of the working electrode 40 are hydrophilized, and the surface and the annular portion of the working electrode 40 of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 are hydrophilized.
  • An example (g) in which a portion other than the above is hydrophobized is shown.
  • the surface of the working electrode 40 is not hydrophilized, only the annular portion surrounding the surface of the working electrode 40 is hydrophilized on the bottom surface 11 of the liquid tank 10, and the bottom surface 11 of the liquid tank 10 is further hydrophilized.
  • An example (f) in which the surface of the pole 40 and the portion other than the annular portion are hydrophobized is shown.
  • FIG. 2C shows an example (c) in which the surface of the working electrode 40 and the annular portion surrounding the surface of the working electrode 40 of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 are hydrophilized.
  • FIG. 2D shows an example (b) in which the surface of the working electrode 40 was not hydrophilized, and only the annular portion surrounding the surface of the working electrode 40 was hydrophilized on the bottom surface 11 of the liquid tank 10.
  • FIG. 2E shows an example (d) in which the bottom surface 11 of the liquid tank 10 except for the surface of the working electrode 40 and the annular portion was hydrophobized without being hydrophilized.
  • FIG. 3A shows an example in which the surface of the working electrode 40 is hydrophilized, and the portion of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 other than the surface of the working electrode 40, that is, the portion in contact with the second liquid mass 30, is hydrophobized ( e) is shown.
  • FIG. 3B shows an example (a) in which the surface of the working electrode 40 is hydrophilized.
  • FIG. 3C shows an example (d) in which a portion of the bottom surface 11 of the liquid tank 10 other than the surface of the working electrode 40, that is, a portion in contact with the second liquid mass 30, was hydrophobized without being hydrophilized. There is.
  • the size of one first liquid mass 20 on the bottom surface 11 of the liquid tank 10 is larger than the size of the working electrode 40. Therefore, the holding structure of the first liquid mass 20 as shown in FIGS. 2A-2E is adopted. However, depending on the size of the working electrode 40 and the size of the liquid mass of the first liquid mass 20, a holding structure of the first liquid mass 20 as shown in FIGS. 3A-3C can also be adopted.
  • the structures (e), (f), and (g) are preferable from the viewpoint of strongly holding the first liquid mass 20 on the surface of the working electrode 40.
  • the hydrophilic treatment of the working electrode 40 significantly reduces the electron transfer rate at the solid-liquid interface between the surface of the working electrode 40 and the first liquid mass 20, thereby reducing the detection sensitivity.
  • the holding structure of the first liquid mass 20 shown in FIGS. 2B, 2D, 2E or 3C is preferable.
  • the hydrophilization treatment of the surface of the working pole 40 can be performed by a chemical treatment of the surface of the working pole 40 using a hydrophilic agent having a hydrophilic group.
  • a hydrophilic agent having a hydrophilic group When the material of the working electrode 40 is gold or platinum, 2-mercaptoethanesulfonic acid, 2-amino-1-ethanethiol, and 3-mercaptopropionic acid are used as hydrophilic agents. 3-mercaptopropionic acid) can be exemplified. Since these hydrophilic agents have functional groups in the molecule that can be selectively bonded to gold or platinum, the working electrode 40 can be simply applied to the bottom surface 11 of the liquid tank 10 by applying a solution containing these hydrophilic agents. Only the surface of the surface can be selectively chemically treated.
  • the hydrophilizing agent is 2-aminoethanethiol, 3-mercaptopropionic acid, etc.
  • the active amino group or carboxyl introduced on the working electrode 40 in the process of adsorption of the capture antibody on the working electrode 40, which is performed later.
  • the group can also be used as an anchor molecule.
  • the working electrode 40 is usually formed on a substrate or the like, and this substrate or the like is located on the bottom surface 11 of the liquid tank 10. Therefore, the annular portion surrounding the surface of the working electrode 40 is, for example, the surface of the substrate.
  • the hydrophilic treatment of the substrate surface is ashing treatment or UV (ultraviolet).
  • ashing treatment or UV (ultraviolet) This can be done by temporarily activating the surface by ozone treatment or the like, and then treating the surface with a silane coupling agent or the like having hydrophilic groups such as hydroxyl groups, amino groups, and carboxyl groups in the molecule.
  • the second liquid mass 30 is located on the substrate.
  • the hydrophobic treatment of the substrate surface can be performed by photolithography using a hydrophobic photosensitive resin. By this method, only a predetermined region can be selectively hydrophobized.
  • the surface of the substrate is selectively selected by masking only the portion that is not hydrophobized with an appropriate photosensitive resin, treating the entire surface of the substrate with a hydrophobizing agent, and then dissolving and removing the photosensitive resin used for the mask with a solvent. Hydrophobization treatment can be performed.
  • an organic silane compound having a hydrophobic group for example, hexamethyldisilazane (di (trimethylsilyl) amine), dimethyloctadecylsilane (chlorodimethyl (octadecyl) silane) Etc.
  • hexamethyldisilazane di (trimethylsilyl) amine
  • dimethyloctadecylsilane chlorodimethyl (octadecyl) silane
  • FIG. 4 (1) shows a state in which the well 100 is formed on the bottom surface 11 of the liquid tank 10.
  • the working electrode 40 is located at the bottom of the well 100.
  • Such a well 100 can be formed by, for example, photolithography using a photosensitive resin.
  • reference numeral 101 indicates a cured resin layer.
  • FIG. 4 (2) shows a state in which the first liquid mass 20 is introduced into the well 100 by dropping.
  • FIG. 4 (3) shows a state in which the second liquid mass 30 is further introduced into the liquid tank 10.
  • the above-mentioned first liquid mass 20 can be used as the first liquid mass 20, and the above-mentioned second liquid mass 30 can be used as the second liquid mass 30.
  • the first liquid mass 20 can be held on the working electrode 40.
  • FIG. 5 shows the surface of the working electrode 40 and the bottom surface of the liquid tank 10 located at the bottom of the well 100, specifically, the working electrode 40 in order to better hold the first liquid mass 20 in the well 100.
  • An example is shown in which the surface of the substrate surrounding the surface is subjected to the same hydrophilization treatment as the above-mentioned hydrophilization treatment. In this way, the inner bottom surface of the well 100 may be hydrophilized.
  • the hydrophilization treatment region 91 may be only the surface of the working pole 40, or may be only the annular portion surrounding the surface of the working pole 40 on the inner bottom surface of the well 100.
  • a relatively large-scale measuring device such as spectroscopic measurement is required, and an object to be detected can be detected at low cost with a compact device configuration as compared with a method using an expensive substrate.
  • the multipoint detection process (that is, the comprehensive multipoint detection process) in which N is simultaneously performed by N action poles 40 with N as two or more predetermined integers, the first liquids are different from each other. Since the mass 20 is separated by the second liquid mass 30, crosstalk can be prevented. Therefore, the object to be detected can be detected with high sensitivity.
  • one counter electrode 50 and one reference electrode 60 may be prepared in the liquid tank 10 for a plurality of working electrodes 40. Therefore, the object to be detected can be detected with high sensitivity with a compact device configuration.
  • the product of the catalytic reaction that proceeds in the first liquid mass 20 is the detection target, and the first liquid mass of the product of the catalytic reaction as the catalytic reaction progresses. It can be applied to a detection scheme in which the concentration in 20 is increased, the product of the catalytic reaction is electrochemically detectable, and the second liquid mass 30 in which the product of the catalytic reaction is insoluble can be selected.
  • an enzyme is used as a catalyst, but the catalyst is not limited to the enzyme.
  • the catalyst include metal catalysts, ribozymes, cells having enzymes on the surface or inside, organelles, fine particles artificially adsorbed or artificially bound to these, vesicles, and the like. ..
  • the catalyst is indirectly adsorbed on the solid phase by forming a complex of a capture antibody, an antigen, a primary antibody, and an enzyme-labeled secondary antibody, but the method for adsorbing the catalyst is not limited to this. ..
  • the catalyst is indirectly transferred to the solid phase by hybridizing a single-stranded DNA complementary to the probe DNA and labeled with a catalyst to the probe DNA previously adsorbed on the surface of the solid phase. May be adsorbed.
  • the catalyst is produced by interacting with an antigen, peptide, sugar chain, etc. previously adsorbed on the surface of the solid phase with an antibody, lectin, etc. that is specifically adsorbed on these molecules and labeled with a catalyst. May be indirectly adsorbed on the solid phase.
  • Such an adsorption method is already well known in expression analysis using a DNA chip or a protein chip.
  • the catalyst when measuring the activity of the catalyst itself, the catalyst may be directly adsorbed on the solid phase surface.
  • the transducer of the embodiment has a configuration in which a liquid tank 120 capable of accommodating a solution 110 is mounted on an LSI chip (large scale integrated chip) 130.
  • a hole 121 is formed in the center of the liquid tank 120, and the LSI chip 130 is arranged at the lower end of the hole 121 to close the hole 121.
  • the LSI chip 130 and the liquid tank 120 are fixed to the substrate 140, and a wiring pattern 141 for connecting the LSI chip 130 to an external device that controls the transducer is formed on the substrate 140.
  • reference numeral 150 indicates a bonding wire that connects the LSI chip 130 and the wiring pattern 141.
  • a sensor region 131 is formed on the upper surface of the LSI chip 130.
  • the sensor region 131 is located in the hole 121 on the bottom surface of the liquid tank 120.
  • 400 ⁇ 40 ⁇ m electrodes 132 that function as working electrodes are formed in the sensor region 131.
  • the 400 electrodes 132 form a 20 ⁇ 20 array at 250 ⁇ m intervals.
  • FIG. 8 shows a part of the sensor region 131 in which the electrode 132 is formed.
  • the material of the electrode 132 is gold in this example, and a silicon nitride film is formed on the upper surface of the LSI chip 130 including at least the sensor region 131 excluding the electrode 132.
  • the LSI chip 130 has a function of detecting a current generated by a redox reaction between each electrode 132 and a substance to be detected and amplifying each of the detected currents.
  • the above-mentioned holding structure (see FIGS. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3A, 3B, 3C, 4, 5) is applied to each electrode 132 and the sensor area 131.
  • the surface of each electrode 132 and the annular surface surrounding the surface of each electrode 132 are subjected to the hydrophilic treatment shown in FIGS. 2 and 3, or the wells shown in FIGS. 4 and 5 are formed.
  • the transducer of the embodiment can strongly hold the first liquid mass in which the catalytic reaction proceeds on each electrode 132.
  • the solution 110 is a second liquid mass covering the first liquid mass, and the illustration of the first liquid mass is omitted.
  • the counter electrode 160 and the reference electrode 170 shown in FIGS. 6A and 6B are not necessarily essential components of the transducer.
  • the counter electrode 160 and the reference electrode 170 are charged into the second liquid mass before carrying out the method of the embodiment.

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Abstract

第１の液塊２０内で進行する触媒反応によって生成されて第１の液塊２０に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に検出する触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、液槽１０に、第１の液塊２０と、第１の液塊２０と液液界面を形成して接し、触媒反応生成物が溶解しない第２の液塊３０とを収容し、第１の液塊２０内に作用極４０を配置し、第２の液塊３０内に対極５０及び参照極６０を配置し、触媒反応生成物が作用極４０において酸化又は還元反応をすることで作用極４０に流れる電流を検出する。

Description

触媒反応の生成物の電気化学的検出方法およびトランスデューサ
　この発明は、溶液内で進行する触媒反応によって生成され且つ当該溶液に溶解している生成物を電気化学的に検出する技術に関する。
　酵素反応などの触媒反応によって生成され且つ溶液に溶解している触媒反応の生成物の検出感度は、溶液中の生成物の濃度によって決まる。溶液中の生成物の濃度を向上させるために、例えば、より長い触媒反応時間が好ましい、あるいは、溶液のより小さい体積が好ましい。
　しかし、溶液の体積が極微小であると、溶液の蒸発によって溶液の体積が減少し、検出できなくなる。このような問題は、長い触媒反応時間の場合に顕著に発生する。
　溶液の蒸発を回避できる構成が特許文献１および非特許文献１に開示されている。特許文献１は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）に関連する技術において、酵素反応場である親水性溶媒の液滴を収容部（ウェル）内に置き、当該収容部を疎水性溶媒によって密閉する構成を開示している。
　非特許文献１は、ＥＬＩＳＡに関連する技術において、親水性表面に疎水性領域を形成することによって親水性領域のパターンを形成し、親水性領域のパターンに位置する液滴（つまり酵素反応場）をオイルで覆う構成を開示している。
ＷＯ２０１２／１２１３１０号公報
S. Sakakihara et al., "A Single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array", Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362
　上述したように、触媒反応場である溶液を、当該溶液と異なる液体で覆うことによって、溶液の蒸発を防ぐことができる。よって、高感度の検出を実現できる。
　特許文献１および非特許文献１に開示されている技術は、蛍光基質を用いる分光学的検出技術であり、大規模な測定装置を必要とする。さらに、蛍光基質は高価である。したがって、これらの技術は、大きなコストを要する。
　この発明の目的は、触媒反応の生成物の高感度検出を安価且つ簡便に実施できる技術を提供することである。
　ここで述べる技術事項は、請求の範囲に記載された発明を明示的にまたは黙示的に限定するためではなく、さらに、本発明によって利益を受ける者（例えば出願人と権利者である）以外の者によるそのような限定を容認する可能性の表明でもなく、単に、本発明の要点を容易に理解するために記載される。他の観点からの本発明の概要は、例えば、この特許出願の出願時の請求の範囲から理解できる。
　ここに開示される技術は、触媒反応が進行する第１の液塊を第２の液塊で覆う技術を電気化学的検出技術に適用した技術である。
　この技術は、作用極と対極と第１の液塊と第２の液塊を収容する液槽を用いる。
　第１の液塊は導電性を有する。第１の液塊内に作用極が位置している。
　第２の液塊は導電性を有する。第１の液塊および第２の液塊は液液界面を形成しており、且つ、触媒反応の生成物は第２の液塊に不溶である。第２の液塊内に対極が位置している。
　触媒反応の生成物と作用極との間の酸化還元反応によって作用極に流れる電流が検出される。
　この発明によると、触媒反応の生成物の高感度検出を安価且つ簡便に実施できる。
検出装置の概略図である。 第１の液塊を保持する構造の第１の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第２の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第３の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第４の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第５の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第６の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第７の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の第８の例を示す図である。 第１の液塊を保持する構造の一例を説明するための図である。図４（ａ）は、ウェルの概略図である。図４（ｂ）は、ウェルに第１の液塊が導入された状態を示す概略図である。図４（ｃ）は、第２の液塊が第１の液塊を覆っている状態を示す概略図である。 第１の液塊を保持する構造の他の例を示す図である。 トランスデューサの実施形態を示す平面図である。 トランスデューサの実施形態を示す断面図である。 図６Ａに示すトランスデューサの斜視図である。 図６Ａに示すトランスデューサにおける電極の配列を説明するための図である。
　この発明の実施形態を、図面を参照しながら説明する。
　実施形態では、第１の液塊（つまり、触媒反応場である溶液の塊）内で進行する触媒反応によって生成され且つ第１の液塊に溶解している生成物が、電気化学的に検出される。図１は、実施形態の検出装置１の構成例を模式的に示している。
　検出装置１は、液槽１０と、作用極４０と、対極５０と、参照極６０と、ポテンショスタット８０を含む。液槽１０は、第１の液塊２０と第２の液塊３０を収容している。第１の液塊２０と第２の液塊３０は液液界面（つまり、液相と液相の間の界面）を形成する。第１の液塊２０は、図１に示すように、液槽１０の底面１１上に位置しており、第２の液塊３０によって覆われている。
　作用極４０は、液槽１０の底面１１に設置されており、第１の液塊２０によって覆われている。つまり、作用極４０は、第１の液塊２０と接触しているが、第２の液塊３０と接触していない。対極５０および参照極６０は、第２の液塊３０内に設置されており、第１の液塊２０と第２の液塊３０の液液界面を経由して作用極４０と電気的に接続されている。図１中、符号７０は塩橋を示す。
　作用極４０、対極５０および参照極６０は、この例ではポテンショスタット８０に接続されている。ポテンショスタット８０は、定電圧電源装置として機能し、可変電源８１と電圧計８２と電流計８３を含む。
　触媒反応の生成物は、第１の液塊２０内に閉じ込められ、第２の液塊３０に溶解しない（つまり、生成物は、第１の液塊２０から第２の液塊３０に移動しない）。触媒反応の生成物と作用極４０との間の酸化還元反応によって作用極４０に電流が流れる。この電流を検出することによって、触媒反応の生成物の検出または定量分析が行われる。
　図１では１個の作用極４０だけが図示されているが、通例、例えばアレイ状に配置された２個以上の作用極４０が液槽１０の底面１１に設置される。検出装置１が２個以上の作用極４０を含む場合、検出装置１は２個以上の第１の液塊２０を含む。２個以上の作用極４０のそれぞれは、２個以上の第１の液塊２０のうちの対応する一つによって覆われている。個々の第１の液塊２０は互いに独立した液塊であり、互いに異なる第１の液塊２０は第２の液塊３０によって分離されている。第２の液塊３０は１個の液塊である。２個以上の第１の液塊２０のそれぞれと第２の液塊３０は液液界面を形成する。２個以上の第１の液塊２０のそれぞれは、第２の液塊３０によって覆われている。
　以下、ＥＬＩＳＡに適用した実施形態の電気化学的検出方法を説明する。
　ＥＬＩＳＡによると、例えば、試料中に含まれる抗原または抗体（つまり、免疫グロブリン）を酵素で標識し、酵素と基質との反応によって得られる生成物を検出することによって、抗原抗体複合体の検出あるいは定量分析が行われる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ（sandwich ELISA protocol）と電気化学的検出方法の組み合わせでは、下記の操作が行われる。ただし、洗浄、インキュベーション（incubation；定温放置）などの操作の明示を省略した。
　（１）捕捉抗体の固相への吸着（ただし、固相は、作用極の表面または作用極の近傍に在る固体の表面を含む）
　（２）固相のブロッキング処理
　（３）抗原（検出対象である蛋白質）の添加
　（４）一次抗体の添加
　（５）酵素標識された二次抗体の添加
　（６）基質を含む第１の液塊の添加（酵素反応によって作用極の近傍に酵素反応の生成物が蓄積する）
　（７）酵素反応による生成物の、作用極を用いる電気化学的検出
　実施形態では、図１に示すように、第１の液塊２０全体を第２の液塊３０で覆う操作が追加される。
　第２の液塊３０は、導電性を有する第１の液塊２０に不溶であり、且つ、導電性を有する液体である。ＥＬＩＳＡにおいて第１の液塊２０は通例、緩衝能を有する水溶液であるので、第２の液塊３０は、例えば、水に不溶であり、且つ、導電性を得るための支持電解質を溶解可能な有機溶媒である。
　このような有機溶媒として、電気化学的検出の溶媒として扱いやすい、即ち、常温において液状であり、且つ、検出電位範囲内において水および電極材料（金や白金等）との反応性が低い液体が好ましい。例えば、ニトロベンゼン（nitrobenzene）、1,2-ジクロロベンゼン（1,2-dichlorobenzene）、2-ニトロフェニルオクチルエーテル（1-nitro-2-(n-octyloxy)benzene）、1,2-ジクロロエタン（1,2-dichloroethane）、1,4-ジクロロブタン（1,4-dichlorobutane）、1,6-ジクロロヘキサン（1,6-dichlorohexane）、1-オクタノール（1-octanol）、1,9-デカジエン（1,9-decadiene）が好適である。
　また、これらの有機溶媒に可溶であり、且つ、有機溶媒に導電性を付与できる支持電解質として、一般的な非水溶液中での電気化学的検出に使用される支持電解質を採用できる。例えば、塩化物イオン（chloride ion）、臭化物イオン（bromide ion）、ヨウ化物イオン（iodide ion）、硫酸イオン（sulfate ion）、硝酸イオン（nitrate ion）、過塩素酸イオン（hyperchloric acid ion）、テトラフルオロホウ酸イオン（tetrafluoroboric acid ion）、ヘキサフルオロリン酸イオン（hexafluorophosphoric acid ion）およびスルホン酸イオン（sulfonic acid ion）のうち、いずれか１つをアニオンとして有し、リチウムイオン（lithium ion）、ナトリウムイオン（sodium ion）、カリウムイオン（potassium ion）、ルビジウムイオン（rubidium ion）、セシウムイオン（cesium ion）、アンモニウムイオン（ammonium ion）および任意のアルキル鎖長を有するテトラアルキルアンモニウムイオン（tetraalkylammonium ion）のうち、いずれか１つをカチオンとして有する塩が好適である。
　標識酵素および基質の組み合わせとして、電気化学活性を有し、且つ、第１の液塊２０に可溶で第２の液塊３０に不溶な生成物を生成できる組み合わせが選択される。第１の液塊２０が水溶液であり、且つ、第２の液塊３０が前述した有機溶媒である場合、標識酵素と基質の組み合わせとして、例えばアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）とｐ－アミノフェニルリン酸（phosphoric acid 4-aminophenyl ester）の組み合わせ、あるいは、西洋わさびぺルオキシダーゼ（horseradish peroxydase）とフェリシアン化カリウム（potassium ferricyanide）の組み合わせが好適である。
　実施形態では、高感度検出のために、極微量の第１の液塊２０が図１に示すように作用極４０と接触した状態で保持され、さらに作用極４０、対極５０、参照極６０が第１の液塊２０および第１の液塊２０を覆う第２の液塊３０を経由して互いに電気的に接続されている状態が構築される。しかし、液槽１０の底面１１に位置する作用極４０に第１の液塊２０を例えば滴下した後、特段の工夫をすることなく第２の液塊３０を液槽１０に導入すると、第２の液塊３０の水力学的作用によって第１の液塊２０が作用極４０の頂面から押し流される。あるいは、第１の液塊２０の密度が第２の液塊３０の密度より小さい場合、浮力の作用によって第１の液塊２０は作用極４０から引き離される。このため、このような水力学的作用および浮力の作用を上回る程度に、第１の液塊２０を作用極４０の頂面に強く保持する必要がある。
　第１の液塊２０の保持のため、実施形態では、例えば、下記の保持構造を採用する。
　（ａ）全ての作用極４０の表面が親水化処理されている構造。
　（ｂ）液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位のそれぞれが親水化処理されている構造。
　（ｃ）全ての作用極４０の表面および全ての上記環状部位が親水化処理されている構造。
　（ｄ）全ての作用極４０の表面を除く液槽１０の底面１１の全部または一部が疎水化処理されている構造（ただし、この構造は、液槽１０の底面１１のうち第２の液塊３０と接触する部位が疎水化処理されている構造を含む）。
　（ｅ）全ての作用極４０の表面が親水化処理されており、且つ、全ての作用極４０の表面を除く液槽１０の底面１１の全部または一部が疎水化処理されている構造。
　（ｆ）液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位のそれぞれが親水化処理されており、且つ、全ての作用極４０の表面および全ての環状部位を除く液槽１０の底面１１の全部または一部が疎水化処理されている構造。
　（ｇ）全ての作用極４０の表面および全ての上記環状部位が親水化処理されており、且つ、全ての作用極４０の表面および全ての環状部位を除く液槽１０の底面１１の全部または一部が疎水化処理されている構造。
　図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ，２Ｅ，３Ａ，３Ｂ，３Ｃは、第１の液塊２０の上記保持構造の例を示している。図中、符号９１は親水化処理された領域を示し、符号９２は疎水化処理された領域を示す。図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ，２Ｅ，３Ａ，３Ｂ，３Ｃでは、分かり易い図示の観点から、１個の作用極４０だけを例示しており、液槽１０の底面１１に位置する作用極４０はこの例では円形の表面形状を有する。
　図２Ａは、作用極４０の表面と、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位を親水化処理し、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面および環状部位を除く部位を疎水化処理した例（ｇ）を示している。
　図２Ｂは、作用極４０の表面を親水化処理せず、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位のみを親水化処理し、さらに液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面および環状部位を除く部位を疎水化処理した例（ｆ）を示している。
　図２Ｃは、作用極４０の表面と、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位を親水化処理した例（ｃ）を示している。
　図２Ｄは、作用極４０の表面を親水化処理せず、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位のみを親水化処理した例（ｂ）を示している。
　図２Ｅは、親水化処理をせず、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面および環状部位を除く部位を疎水化処理した例（ｄ）を示している。
　図３Ａは、作用極４０の表面を親水化処理し、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面以外の部位、即ち第２の液塊３０と接触する部位を疎水化処理した例（ｅ）を示している。
　図３Ｂは、作用極４０の表面を親水化処理した例（ａ）を示している。
　図３Ｃは、親水化処理せず、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面以外の部位、即ち第２の液塊３０と接触する部位を疎水化処理した例（ｄ）を示している。
　一般的に、液槽１０の底面１１における１個の第１の液塊２０の大きさは作用極４０の大きさより大きい。よって、図２Ａ-２Ｅに示すような第１の液塊２０の保持構造が採用される。しかし、作用極４０の大きさおよび第１の液塊２０の液塊の大きさに応じて、図３Ａ-３Ｃに示すような第１の液塊２０の保持構造も採用できる。
　第１の液塊２０を作用極４０の表面上に強く保持する観点から、図２Ａまたは図３Ａに示すように、上記（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）の構造が好ましい。しかし、作用極４０の親水化処理によって作用極４０表面と第１の液塊２０との間の固液界面における電子移動速度が著しく低下し、それによって検出感度が低下する可能性を完全に否定できない。この感度低下を回避したい場合、図２Ｂ，２Ｄ，２Ｅまたは図３Ｃに示す第１の液塊２０の保持構造が好ましい。
　作用極４０の表面の親水化処理は、親水基を有する親水化剤を用いた作用極４０の表面の化学処理によって行うことができる。作用極４０の材料が金または白金の場合、親水化剤として２－メルカプトエタンスルホン酸（2-mercaptoethanesulfonic acid）、２－アミノエタンチオール（2-amino-1-ethanethiol）、３－メルカプトプロピオン酸（3-mercaptopropionic acid）などを例示できる。これらの親水化剤は、分子内に金または白金と選択的に結合可能な官能基を有するので、これらの親水化剤を含む溶液を液槽１０の底面１１に塗布するだけで、作用極４０の表面だけを選択的に化学処理することができる。
　親水化剤が２－アミノエタンチオール、３－メルカプトプロピオン酸などの場合、後に行う捕捉抗体の作用極４０上への吸着処理の過程で、作用極４０上に導入された活性なアミノ基あるいはカルボキシル基をアンカー分子として利用することもできる。
　次に、液槽１０の底面１１のうち作用極４０の表面を囲む環状部位の親水化処理を説明する。作用極４０は通例、基板などに形成されており、この基板などが液槽１０の底面１１に位置する。よって、作用極４０の表面を囲む環状部位は例えば基板の表面である。
　基板材料がガラス、石英、酸化アルミニウム（aluminium oxide）、シリコン（silicon）などの場合、あるいはシリコン表面にシリコン窒化膜が形成されている場合、基板表面の親水化処理は、アッシング処理やＵＶ（ultraviolet）オゾン処理などによって一時的に表面を活性化した後、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基などの親水基を分子内に有するシランカップリング剤などで表面を処理することによって行うことができる。
　液槽１０の底面１１に作用極４０が形成された基板が位置する場合、第２の液塊３０は基板上に位置する。
　基板表面の疎水化処理は、疎水性の感光性樹脂を用いたフォトリソグラフィによって行うことができる。この方法によって所定の領域だけを選択的に疎水化処理することができる。あるいは、適当な感光性樹脂によって疎水化しない部分だけをマスクし、基板表面全体を疎水化剤で処理した後、マスクに用いた感光性樹脂を溶媒によって溶解除去することによって基板表面の選択的な疎水化処理を行うことができる。このような疎水化剤として、基板材料が上述の材料である場合、疎水基を有する有機シラン化合物、例えば、ヘキサメチルジシラザン（di(trimethylsilyl)amine）、ジメチルオクタデシルクロロシラン（chlorodimethyl(octadecyl)silane）などを用いることができる。
　次に、ウェル（well）による第１の液塊２０の保持構造について図４を参照して説明する。
　図４（１）は、液槽１０の底面１１上にウェル１００が形成された状態を示している。作用極４０はウェル１００の底に位置している。このようなウェル１００は、例えば感光性樹脂を用いたフォトリソグラフィによって形成することができる。図中、符号１０１は硬化した樹脂層を示す。
　図４（２）は、ウェル１００に第１の液塊２０が滴下によって導入された状態を示している。図４（３）は、さらに第２の液塊３０が液槽１０に導入された状態を示している。この第１の液塊２０として前述した第１の液塊２０を用いることができ、この第２の液塊３０として前述した第２の液塊３０を用いることができる。ウェル１００を形成することによって、第１の液塊２０を作用極４０上に保持できる。
　アレイ状に配列されている２個以上の作用極４０が液槽１０の底面１１に位置する場合、２個以上の作用極４０と１対１で対応し且つアレイ状に配列されている２個以上のウェル１００が液槽１０の底面１１上に形成されており、且つ、作用極４０のそれぞれは対応するウェル１００の底に位置する。２個以上のウェル１００のそれぞれに、第１の液塊２０の液塊が導入される。
　図５は、ウェル１００において第１の液塊２０をさらに良好に保持するため、作用極４０の表面および、ウェル１００の底に位置する液槽１０の底面、具体的に言えば作用極４０の表面を囲む基板の表面、を前述の親水化処理と同じ親水化処理した例を示している。このようにウェル１００の内部底面を親水化処理してもよい。なお、親水化処理領域９１は、作用極４０の表面だけでもよく、あるいは、ウェル１００の内部底面における作用極４０の表面を囲む環状部位だけでもよい。
　実施形態の電気化学的検出方法によると、以下の効果が得られる。
　１）第１の液塊２０が第２の液塊３０によって覆われているので、第１の液塊２０の蒸発を防ぐことができる。よって、検出対象物を高感度に検出できる。
　２）分光学的測定のような、比較的大がかりな測定装置を必要とし、さらに高価な基質を用いる方法と比べて、コンパクトな装置構成で安価に検出対象物を検出できる。
　３）Ｎを２以上の予め定められた整数として、Ｎ個の作用極４０によってＮ個の検出処理を同時に行う多点検出処理（つまり網羅的多点検出処理）において、互いに異なる第１の液塊２０が第２の液塊３０によって分離されているため、クロストークを防止できる。よって、検出対象物を高感度に検出できる。
　４）触媒反応の生成物の濃度を向上させるために微小量の第１の液塊２０を使用するが、対極５０および参照極６０は第２の液塊３０に配置されるので、極小の対極５０および参照極６０を使用する必要が無い。よって、先行技術で使用される対極５０および参照極６０を使用できる。
　５）多点検出において、複数の作用極４０に対して１個の対極５０および１個の参照極６０を液槽１０に準備すればよい。よって、コンパクトな装置構成で検出対象物を高感度に検出できる。
　この実施形態の電気化学的検出方法は、第１の液塊２０中で進行する触媒反応の生成物が検出対象であり、触媒反応の進行に伴って触媒反応の生成物の第１の液塊２０中での濃度が増大し、触媒反応の生成物が電気化学的に検出可能であって、かつ、触媒反応の生成物が溶解しない第２の液塊３０を選択できる検出スキームに適用できる。
　ＥＬＩＳＡでは触媒として酵素を用いるが、触媒は酵素に限らない。触媒として、金属触媒、リボザイム（ribozyme）、酵素を表面あるいは内部に有する細胞、オルガネラ（organelle）、これらを人工的に吸着した或いはこれらと人工的に結合した微粒子、ベシクル（vesicle）などを例示できる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡでは、捕捉抗体と抗原と一次抗体と酵素標識された二次抗体とによる複合体を形成することによって、触媒を固相に間接的に吸着させるが、触媒の吸着方法はこれに限らない。例えば、予め固相表面に吸着させたプローブＤＮＡに対して、プローブＤＮＡと相補的であって且つ触媒で標識された一本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーション（hybridization）させることによって、触媒を固相に間接的に吸着させてもよい。
　あるいは、予め固相表面に吸着させた抗原、ペプチド、糖鎖などに対して、これら分子に特異的に吸着し且つ触媒で標識された抗体、レクチン（lectin）などを相互作用させることによって、触媒を固相に間接的に吸着させてもよい。
　このような吸着方法は、ＤＮＡチップまたはプロテインチップを用いた発現解析において既によく知られている。
　あるいは、触媒そのものの活性を測定する場合、触媒を直接、固相表面に吸着させてもよい。
　次に、上述した触媒反応の生成物の電気化学的検出に好適なトランスデューサの実施形態を、図６-８を参照しながら説明する。
　実施形態のトランスデューサは、溶液１１０を収容できる液槽１２０がＬＳＩチップ（large scale integrated chip）１３０に搭載された構成を持つ。液槽１２０の中央に穴１２１が形成されており、ＬＳＩチップ１３０は、穴１２１の下端に配置されており、穴１２１を塞いでいる。
　ＬＳＩチップ１３０および液槽１２０は、基板１４０に固定されており、ＬＳＩチップ１３０をトランスデューサの制御を行う外部装置と接続するための配線パターン１４１が基板１４０に形成されている。図６Ｂ中、符号１５０はＬＳＩチップ１３０と配線パターン１４１とを接続するボンディングワイヤを示す。
　ＬＳＩチップ１３０の上面にセンサ領域１３１が形成されている。センサ領域１３１は、液槽１２０の底面の穴１２１に位置している。
　図６Ａ，６Ｂ，７では詳細の図示を省略しているものの、この例では、センサ領域１３１に、作用極として機能する４００個のφ４０μｍの電極１３２が形成されている。４００個の電極１３２は、２５０μｍ間隔で２０×２０アレイを構成する。図８は、電極１３２が形成されているセンサ領域１３１の一部を示している。電極１３２の材料はこの例では金であり、電極１３２を除く、少なくともセンサ領域１３１を含むＬＳＩチップ１３０の上面に、シリコン窒化膜が形成されている。ＬＳＩチップ１３０は、各電極１３２と検出対象物質との間の酸化還元反応によって生じる電流を検出し、検出された電流のそれぞれを増幅する機能を備えている。
　ＬＳＩチップ１３０において、各電極１３２とセンサ領域１３１に上述の保持構造（図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ，２Ｅ，３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，４，５参照）が適用される。例えば、各電極１３２の表面と、各電極１３２の表面を囲む環状表面に、図２および図３に示す親水化処理が施されており、あるいは、図４および図５に示すウェルが形成されている。保持構造によって、実施形態トランスデューサは触媒反応が進行する第１の液塊を各電極１３２上に強く保持することができる。図６Ａ，６Ｂ，７において、溶液１１０は第１の液塊を覆う第２の液塊であり、第１の液塊の図示は省略している。
　図６Ａ，６Ｂ中に示した対極１６０および参照極１７０は、必ずしもトランスデューサの必須構成要素ではない。対極１６０および参照極１７０は、実施形態の方法を実施する前に第２の液塊に投入される。
＜補遺＞
　例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、当業者は本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、その要素を均等物で置き換えることができることを理解するであろう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定のシステム、デバイス、またはそのコンポーネントを本発明の教示に適合させるために、多くの修正を加えることができる。したがって、本発明は、本発明を実施するために開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の請求の範囲に含まれるすべての実施形態を含むものとする。
　さらに、「第１」、「第２」などの用語の使用は順序や重要性を示すものではなく、「第１」、「第２」などの用語は要素を区別するために使用される。本明細書で使用される用語は、実施形態を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものでは決してない。用語「含む」とその語形変化は、本明細書および/または添付の請求の範囲で使用される場合、言及された特徴、ステップ、操作、要素、および/またはコンポーネントの存在を明らかにするが、1つまたは複数の他の特徴、ステップ、操作、要素、コンポーネント、および/またはそれらのグループの存在または追加を排除しない。「および/または」という用語は、それがもしあれば、関連するリストされた要素の1つまたは複数のありとあらゆる組み合わせを含む。請求の範囲および明細書において、特に明記しない限り、「接続」、「結合」、「接合」、「連結」、またはそれらの同義語、およびそのすべての語形は、例えば互いに「接続」または「結合」されているか互いに「連結」している二つの間の一つ以上の中間要素の存在を必ずしも否定しない。
　特に断りが無い限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書で定義されている用語などの用語は、関連技術および本開示の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、明示的に定義されていない限り、理想的にまたは過度に形式的に解釈されるものではない。
　本発明の説明において、多くの技法およびステップが開示されていることが理解されるであろう。これらのそれぞれには個別の利点があり、それぞれ他の開示された技法の一つ以上、または場合によってはすべてと組み合わせて使用することもできる。したがって、煩雑になることを避けるため、本明細書では、個々の技法またはステップのあらゆる可能な組み合わせを説明することを控える。それでも、明細書および請求項は、そのような組み合わせが完全に本発明および請求項の範囲内であることを理解して読まれるべきである。
　以下の請求項において手段またはステップと結合したすべての機能的要素の対応する構造、材料、行為、および同等物は、それらがあるとすれば、他のクレームされた要素と組み合わせて機能を実行するための構造、材料、または行為を含むことを意図する。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更と変形が許される。選択され且つ説明された実施形態は、本発明の原理およびその実際的応用を解説するためのものである。本発明は様々な変更あるいは変形を伴って様々な実施形態として使用され、様々な変更あるいは変形は期待される用途に応じて決定される。そのような変更および変形のすべては、添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれることが意図されており、公平、適法および公正に与えられる広さに従って解釈される場合、同じ保護が与えられることが意図されている。
１０　液槽　　　　　　　　　　　　　　　
１１　底面
２０　第１の液塊　　　　　　　　　　　　
３０　第２の液塊
４０　作用極　　　　　　　　　　　　　　
５０　対極
６０　参照極　　　　　　　　　　　　　　
７０　塩橋
８０　ポテンショスタット　　　　　　　　
８１　可変電源
８２　電圧計　　　　　　　　　　　　　　
８３　電流計
９１　親水化処理領域　　　　　　　　　　
９２　疎水化処理領域
１００　ウェル　　　　　　　　　　　　　
１０１　樹脂層
１１０　溶液　　　　　　　　　　　　　　
１２０　液槽
１２１　穴　　　　　　　　　　　　　　　
１３０　ＬＳＩチップ
１３１　センサ領域　　　　　　　　　　　
１３２　電極
１４０　基板　　　　　　　　　　　　　　
１４１　配線パターン
１５０　ボンディングワイヤ　　　　　　　
１６０　対極
１７０　参照極

Claims (12)

  1. 　第１の液塊内で進行する触媒反応によって生成されて前記第１の液塊に溶解している触媒反応生成物を電気化学的に検出する触媒反応生成物の電気化学的検出方法であって、
    　液槽に、前記第１の液塊と、前記第１の液塊と液液界面を形成して接し、前記触媒反応生成物が溶解しない第２の液塊とを収容し、
    　前記第１の液塊内に作用極を配置し、前記第２の液塊内に対極及び参照極を配置し、
    　前記触媒反応生成物が前記作用極において酸化又は還元反応をすることで前記作用極に流れる電流を検出することを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  2. 　請求項１に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記液槽は１つとされ、
    　前記作用極は複数配置され、
    　前記第１の液塊は前記作用極の各々に対応して相互に連続することなく各独立に前記液槽に収容された複数の液塊とされ、
    　前記第２の液塊は前記第１の液塊の前記複数の液塊のすべてとそれぞれ液液界面を形成して接する連続した１つの液塊とされ、
    　前記対極及び前記参照極はそれぞれ１つとされていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記作用極は前記液槽の底面に位置し、
    　前記第１の液塊は前記底面上に位置して前記第２の液塊によって覆われていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  4. 　請求項３に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記作用極の表面と、前記底面の、前記作用極の表面を囲む環状部位との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  5. 　請求項３又は４に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記底面の前記第２の液塊が位置する部位が疎水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  6. 　請求項１に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記液槽の底面上にウェルが構成され、
    　前記作用極及び前記第１の液塊は前記ウェルに位置していることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  7. 　請求項２に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記液槽の底面上に複数のウェルが構成され、
    　複数の前記作用極はそれぞれ前記ウェルに位置し、
    　前記第１の液塊の前記複数の液塊はそれぞれ前記ウェルに位置していることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  8. 　請求項６又は７に記載の触媒反応生成物の電気化学的検出方法において、
    　前記作用極の表面と、前記ウェルに位置する前記底面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とする触媒反応生成物の電気化学的検出方法。
  9. 　溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的検出に用いるトランスデューサであって、
    　前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、前記ＬＳＩチップにアレイ状に配列されて設けられている複数の電極が位置し、
    　前記ＬＳＩチップは、前記複数の電極の表面と、前記複数の電極の表面をそれぞれ囲む複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とするトランスデューサ。
  10. 　請求項９に記載のトランスデューサにおいて、
    　前記センサ領域における前記複数の電極の表面と前記複数の環状表面以外の部位もしくは前記複数の電極の表面以外の部位が疎水化処理されていることを特徴とするトランスデューサ。
  11. 　溶液を収容することができる液槽がＬＳＩチップ上に搭載された構造を有し、前記溶液内で進行する触媒反応によって生成される触媒反応生成物の電気化学的検出に用いるトランスデューサであって、
    　前記液槽の底面に画定されたセンサ領域には、アレイ状に配列された複数のウェルが形成されており、
    　前記ＬＳＩチップに設けられている複数の電極はそれぞれ前記複数のウェルに位置していることを特徴とするトランスデューサ。
  12. 　請求項１１に記載のトランスデューサにおいて、
    　前記ＬＳＩチップは、前記複数の電極の表面と、前記複数の電極の表面をそれぞれ囲んで前記複数のウェルに位置する複数の環状表面との少なくとも一方が親水化処理されていることを特徴とするトランスデューサ。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005227096A (ja) * 2004-02-12 2005-08-25 Suenaga Tomokazu イムノアッセイ分析装置、チップ電極、および検査チップ
JP2006266795A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Toshiba Corp 生体分子の定量分析チップ、及び、定量分析方法、定量分析装置及びシステム
WO2012121310A1 (ja) 2011-03-08 2012-09-13 独立行政法人科学技術振興機構 ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置
JP2013092437A (ja) * 2011-10-25 2013-05-16 Tohoku Univ 複数の電極を備えたｉｃチップ
JP2015059929A (ja) * 2013-09-20 2015-03-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子計測装置
WO2016006208A1 (ja) * 2014-07-08 2016-01-14 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
JP2017096721A (ja) * 2015-11-20 2017-06-01 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
WO2018105454A1 (ja) * 2016-12-07 2018-06-14 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定方法および電気化学測定装置
WO2018181488A1 (ja) * 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
WO2019168200A1 (ja) * 2018-03-02 2019-09-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6682649B1 (en) * 1999-10-01 2004-01-27 Sophion Bioscience A/S Substrate and a method for determining and/or monitoring electrophysiological properties of ion channels
US7348183B2 (en) * 2000-10-16 2008-03-25 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Self-contained microelectrochemical bioassay platforms and methods
US20030194709A1 (en) * 2002-04-10 2003-10-16 Xing Yang Hydrophobic zone device
US20050064482A1 (en) 2003-08-27 2005-03-24 Norihisa Mino Microchip, process of manufacturing the same, and analytical method using the same
US8940143B2 (en) * 2007-06-29 2015-01-27 Intel Corporation Gel-based bio chip for electrochemical synthesis and electrical detection of polymers
JP2010158201A (ja) 2009-01-08 2010-07-22 Olympus Corp 光シグナルの検出方法及び核酸増幅方法
JP4996738B2 (ja) * 2010-12-28 2012-08-08 日本航空電子工業株式会社 電気化学計測チップ用電極装置
JP4933656B1 (ja) * 2010-12-28 2012-05-16 日本航空電子工業株式会社 電気化学計測チップ用電極装置
GB2557801A (en) * 2015-11-12 2018-06-27 Haliburton Energy Services Inc Detection of porphyrins in subterranean formations
JP6116080B1 (ja) 2016-04-26 2017-04-19 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
WO2018043733A1 (ja) 2016-09-05 2018-03-08 国立研究開発法人科学技術振興機構 病原性微生物検出のための方法及びキット
JP6218199B1 (ja) 2016-10-06 2017-10-25 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定装置及びトランスデューサ
JP6380962B1 (ja) 2017-03-15 2018-08-29 国立大学法人東北大学 ハイドロゲルの電気化学的な作製方法、細胞がパターニングされたハイドロゲルの作製方法、ハイドロゲル作製装置及びトランスデューサ

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005227096A (ja) * 2004-02-12 2005-08-25 Suenaga Tomokazu イムノアッセイ分析装置、チップ電極、および検査チップ
JP2006266795A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Toshiba Corp 生体分子の定量分析チップ、及び、定量分析方法、定量分析装置及びシステム
WO2012121310A1 (ja) 2011-03-08 2012-09-13 独立行政法人科学技術振興機構 ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置
JP2013092437A (ja) * 2011-10-25 2013-05-16 Tohoku Univ 複数の電極を備えたｉｃチップ
JP2015059929A (ja) * 2013-09-20 2015-03-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子計測装置
WO2016006208A1 (ja) * 2014-07-08 2016-01-14 国立研究開発法人科学技術振興機構 物質封入方法及びターゲット分子を検出する方法
JP2017096721A (ja) * 2015-11-20 2017-06-01 日本航空電子工業株式会社 電気化学測定方法、電気化学測定装置及びトランスデューサ
WO2018105454A1 (ja) * 2016-12-07 2018-06-14 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定方法および電気化学測定装置
WO2018181488A1 (ja) * 2017-03-29 2018-10-04 国立研究開発法人科学技術振興機構 微小物質検出方法及び微小物質検出用デバイス
WO2019168200A1 (ja) * 2018-03-02 2019-09-06 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素反応生成物の検出方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S. SAKAKIHARA ET AL.: "A Single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array", LAB CHIP, vol. 10, 2010, pages 3355 - 3362

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