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WO2018162806A1 - Composés-clips surfactants pour l'extraction et la stabilisation en solution de protéines membranaires - Google Patents

Composés-clips surfactants pour l'extraction et la stabilisation en solution de protéines membranaires Download PDF

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Publication number
WO2018162806A1
WO2018162806A1 PCT/FR2017/053857 FR2017053857W WO2018162806A1 WO 2018162806 A1 WO2018162806 A1 WO 2018162806A1 FR 2017053857 W FR2017053857 W FR 2017053857W WO 2018162806 A1 WO2018162806 A1 WO 2018162806A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
nmr
mhz
esi
ppm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2017/053857
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Falson
Julien DAUVERGNE
Ahcène BOUMENDJEL
Marine Peuchmaur
Kim Anh NGUYEN
Sandrine Magnard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Grenoble Alpes
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Grenoble Alpes
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Grenoble Alpes, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to US16/492,005 priority Critical patent/US11440932B2/en
Priority to JP2019548705A priority patent/JP2020510026A/ja
Priority to CN201780088093.XA priority patent/CN110650967A/zh
Priority to EP17832306.9A priority patent/EP3592754A1/fr
Publication of WO2018162806A1 publication Critical patent/WO2018162806A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
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    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
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    • C07D249/04—1,2,3-Triazoles; Hydrogenated 1,2,3-triazoles
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    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation

Definitions

  • the present invention relates to surfactant compounds and their use for the extraction and solution stabilization of membrane proteins extracted in aqueous solution.
  • the present invention finds an industrial application in the field of biochemistry as well as in the medical field, and in particular in the field of drug design assisted by the target structure.
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • targets are mostly accessible on the surface of pathogens and thus anchored or embedded in the plasma membrane. Extract and maintain target PMs, sometimes homo- and / or hetero-oligomeric, in their native state for as long as they are being supported by the immune system helps to improve the quality of antibodies, their effectiveness being directly related to the structural integrity of the injected proteins. It is also important in terms of the production of antigens, which correctly conformed can be injected at a lower dose, which allows a gain of scale.
  • LNG lauryl maltoside neopentyl glycols
  • MNG Maltose-neopentyl glycol
  • the compounds of the invention consist of a series of amphiphilic surfactants allowing the extraction of membrane proteins (PMs), while having a small impact on the native and functional state of the PM.
  • the compounds of the invention significantly increase the stability of the PMs extracted in aqueous solution.
  • These molecules have the unique property of encircling the hydrophobic region of the PMs as clips by a triple interaction capacity: 1 / hydrophobic interaction between the residues of the membrane region of the protein and the fatty chain of detergents, 21 Hydrogen type interaction , in particular reinforced by the presence of osides or polyether chain and 3 / ionic interaction between the weak acidic functions of the polar head of the detergent and the basic residues whose abundance is particularly high at the membrane-cytoplasmic interface of the PMs .
  • the molecules of the invention also make it possible to extract and stabilize the PM at 4 ° C. in the short and long terms (several tens of days).
  • a first subject of the invention relates to compounds of formula (I):
  • X is -OH, , -S (CH 2 ) n CH 3 ,
  • Y represents - (CH 2 ) n CH 3 , (CH 2 ) M CH 3 --CO 2 R 2 - (CH 2 ) 2 OR 1 or
  • ⁇ Z represents -NHCO (CH 2) n CH (CH 2) m CH 3 (CH 2) n Cy - 2.
  • R 1 represents a monosaccharide, a disaccharide or polyethylene glycol
  • R 2 is H, Na or K
  • M is an integer from 4 to 21;
  • N is an integer ranging from 4 to 21;
  • P is an integer from 1 to 3;
  • Q is an integer from 1 to 5;
  • R is an integer from 1 to 10;
  • Cy represents cyclohexyl
  • the term "monosaccharide” refers to a carbohydrate monomer comprising from 3 to 14 carbon atoms. It may be, for example, a monosaccharide chosen from glyceraldehyde, dihydroxyacetone, erythrose, threose, erythrulose, deoxyribose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, ribulose, xylulose, allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, psicose, sorbose, tagatose, fucose, rhamnose, sedoheptulose, mannoheptulose, heptahydroxyoctanal, neuraminic acid and sialic acid, as well as their derivatives.
  • it may be glucose. It may be a cyclic or acyclic monosaccharide. Among the cyclic monosaccharides, it may be a monosaccharide of pyranic or furan form, for example ⁇ -D-glucopyranose.
  • the term "disaccharide” means a diholoside formed by two carbohydrate monomers via a saccharide bond. he may be a homodiholoside or a heterodiholoside. If it is a homodiholoside, it may be for example a fructose homodiholoside, such as inulobiose, or mannose, such as 2alpha-mannobiose or 3alpha-mannobiose, or glucose, as trehalose, kojibiose, nigerose, maltose, isomaltose, sophorose, laminaribiose, cellobiose or gentiobiose, or their derivatives.
  • a fructose homodiholoside such as inulobiose, or mannose, such as 2alpha-mannobiose or 3alpha-mannobiose, or glucose, as trehalose, kojibiose, nigerose, malto
  • ethylmaltoside It may be for example ethylmaltoside.
  • it may be a glucose-fructose heterodiholoside, for example chosen from, such as for example trehalulose, sucrose, turanose, maltulose, leucrose, isomaltulose and gentiobiulose, and derivatives thereof, or a heterodiholoside selected from melibiose, lactulose, lactose and rutinose, and derivatives thereof.
  • m may be chosen from among the integers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21.
  • n can be chosen from the integers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21. It can be for example numbers 10, 12 or 14.
  • p may be chosen from integers 1, 2 and 3.
  • q may be chosen from integers 1, 2, 3, 4 and 5.
  • r can be chosen from integers 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • integers m, n, p, q and r are independent of each other, and all combinations of these integers are part of the invention.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts” includes salts prepared with non-toxic acids or bases, depending on the substituents present on the compounds.
  • the corresponding salts can be obtained by addition of a base organic or inorganic on the compound in neutralized form in the presence of a solvent, preferably inert.
  • a base addition salt may be sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organic), or magnesium salts.
  • the invention includes, for example, a compound of formula (I) in which:
  • ⁇ X ⁇
  • Y represents C ° 2R or CONHCH 2 CO 2 R o
  • Z represents -NHCO (CH 2 ) n CH 3 or (CH 2 ) M CH 3 .
  • R 1 represents a monosaccharide, for example glucose, a disaccharide, for example maltose, or polyethylene glycol;
  • R 2 is H, Na or K
  • M is an integer ranging from 4 to 21, for example equal to 1 1;
  • N is an integer ranging from 4 to 21, for example equal to 8.10, 11, 12, 14 or 17;
  • P is an integer equal to 1 to 3, for example equal to 2;
  • they may be for example compounds of group 3.7, for example 3.7b, 3.7c, 3.7e, 3.7g, 3.7j, 3.7I, or of group 4.6, for example 4.6b or 4.6d, as described in the "Examples" section below.
  • the invention includes, for example, a compound of formula (I) in which:
  • X is -S (CH 2 ) n CH 3;
  • Y is - (CH 2 ) 2 OR 1 ; - H N- I "I-
  • Z represents (CH 2 ) P CO 2 R 2 .
  • ⁇ R 1 represents a monosaccharide, a disaccharide, for example matlose, or polyethylene glycol;
  • R 2 is H, Na or K
  • N is an integer ranging from 4 to 21, for example equal to 1 1, 13, 15 or 17;
  • P is an integer equal to 1 to 3, for example equal to 2;
  • they may be for example compounds of group 5.3, for example 5.3a, b, c or d, and in particular of compound 5.3a, as described in the "Examples" section below.
  • each of the compounds corresponding to formula (I), and described in the "Examples” part, and in particular in Tables 1 and 2 of the “Examples” part, are molecules that are the subject of the invention.
  • the molecules of the present invention do not absorb, or negligibly, from 220 to 500 nm (and beyond), and thus do not prevent the detection of proteins at 280 nm.
  • the molecules of the invention do not form an insoluble complex with divalent metals.
  • This lack of interaction with metals is, for example, very useful during the affinity-metal chromatography steps, which use nickel or cobalt, and which can not be carried out with high concentrations of conventional detergents, unlike the molecules of the invention. It is also very useful to avoid the precipitation of complexes in the presence of calcium and magnesium which are protein co-factors commonly found in living conditions.
  • the inventors have experimentally demonstrated that it is possible to vary the CMC (critical micelle concentration) of the compounds of the invention by varying their substituents, for example by varying the length of the aliphatic chain and / or the size of the polar heads, depending on the purpose, for example to easily remove a high CMC detergent by dialysis or ultrafiltration or to retain it using lower CMC compounds .
  • the inventors have experimentally demonstrated that it is possible to carry out selective extractions, as a function of the membrane extract proteins, by means of the molecules of the invention, by varying their technical characteristics, in particular their substituents, in particular when Membrane proteins of interest are typically co-purified using conventional techniques with a contaminant.
  • the extraction of membrane proteins using the molecules of the invention does not cause a decrease in the functional activity of the PM once they are extracted.
  • the extraction by means of the molecules of the invention may allow an increase in the functional activity of the extracted PM, this being a function of the nature of the PM to be extracted.
  • the inventors have furthermore experimentally demonstrated that the molecules of the invention stabilize membrane proteins in solution at least twice as long, for example twice, three times, four times, five times or more, than a detergent. classic.
  • the compounds of the invention may be prepared using any suitable method known to those skilled in the art, including at least one of the methods comprising peptide coupling, deprotection of the Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) group, formation of amides, catalytic hydrogenation, deprotection of the fBu (tert-butyl) group, deprotection of the methyl or ethyl esters, deprotection of the Boc groups, Huisgen cycloaddition, deacetylation reaction, formation of the carboxylate salts (Na, K) and trityl deprotection and thiol coupling. ene.
  • a second subject of the invention relates to a method for extracting membrane proteins associated with a biological membrane, comprising a step of contacting an aqueous solution of membrane proteins associated with the biological membrane with at least one compound of formula (I) as defined above.
  • biological membrane is intended to mean any assembly of lipophilic molecules into a double layer separating a cell from its environment, composed of a bilayer of amphiphilic lipids, in particular phospholipids, each membrane lipid consisting of a hydrophilic polar head oriented towards the outside of the membrane and a hydrophobic tail oriented inwardly. It can be a prokaryotic cell membrane, eukaryotic cell, animal - with the exception of human embryonic stem cells - or plant, or a virus.
  • a eukaryotic cell it may be for example a plasma membrane, an intracellular membrane, such as a nuclear membrane, a lysosome, an exosome, a proteoliposome, an endoplasmic reticulum membrane. smooth or rough, or a membrane of the Golgi apparatus, this list not being limiting. It may also be a transgenic isolated host cell derived from a cell line in which one or more antigens of interest are expressed, for example by genetic engineering techniques of DNA, or of Recombinant RNA, or by infection of a cell with a viral vector expressing one or more vaccine antigens of interest. Any genetic engineering technique known to those skilled in the art allowing the expression of a transgene in a cell can be used.
  • the cell can be any cell isolated, especially with the exception of human embryonic stem cells, for example an isolated human cell - human embryonic stem cells being for example excluded - or an isolated animal - non-human or plant cell.
  • the isolated cell may be from a cell line selected from Vero (ATCC No. CCL-81) such as Vero 76 (ATCC No.
  • CRL-1587 CHO as CHO-KI (CCL 61, ATCC), BHK as BHK 21 [C-13] (ATCC® CCL-10 TM), HELA, ® PerC6 (Crucell), HEK293 (ATCC® CRL-1573 TM), Sf9 (ATCC CRL-171 1), MDCK, e.g. MDCK (NBL -2) (ATCC® CCL-34 TM), this list not being limiting.
  • the biological membrane may be entire, that is, integral, or be a biological membrane fraction, i.e., a part of a biological membrane.
  • membrane protein in the sense of the present invention, a protein associated with biological membranes, that is to say, is anchored or integral, and not free diffusion in aqueous media.
  • Membrane proteins that may be mentioned include, for example, plasma membrane proteins and intracellular membrane proteins, for example mitochondrial, nuclear or lysosomal membrane proteins. It may be, for example, a transport protein, for example an ABC transporter, optionally chosen from the group comprising P (Pgp / ABCB1), MRP1 / ABCC1, MRP2 / ABCC2, BCRP / ABCG2 and BmrA glycoproteins.
  • it may be a protein of interest expressed transgenically in a biological membrane, for example the above-mentioned proteins expressed in eukaryotic cells, as described by Baiceanu et al. (Baiceanu E et al .:
  • the biological membrane may be brought into contact with at least one compound of formula (I) as defined above, or at least two or at least three of these compounds, or even more.
  • the selection of several of one or more compound (s) of the invention can allow the selective extraction of a membrane protein, for example to overcome contaminants.
  • the biological membrane may be previously dissolved in aqueous solution, for example in a buffer solution.
  • the step of contacting an aqueous solution comprising the membrane protein to be extracted with at least one compound of formula (I) may be carried out at a pH at which the carboxylic groups of the molecules of the invention are ionized, in order to maximize the clip effect of the molecules.
  • the pH is a pH of between 5.0 and 12, for example a pH of 5.0, or 6.0, or 7.0, or 8.0, or 9.0, or 10.0, or 1 1, 0, or 12.0.
  • the extraction process of the invention may further comprise a step of incubating the membrane protein and the compound of the invention.
  • the incubation time can be adapted so that all or part of the membrane proteins to be extracted are in solution.
  • the incubation time may be determined by those skilled in the art who will be able to adapt it according to the membrane to be solubilized and / or the protein to be extracted and / or the desired extraction yield.
  • the incubation time may be, for example, 15 minutes, or 30 minutes, or 1 hour, or 2 hours, or 3 hours, or even greater than 3 hours.
  • the incubation step may be carried out at a temperature that is suitable for the protein to be extracted, in particular to avoid denaturation thereof, especially with respect to heat.
  • the temperature can be adapted accordingly by those skilled in the art; typically, for non-thermostable proteins, it may be between 4 and 40 ° C and for thermostable proteins, 40-90 ° C.
  • the extraction process of the invention may further comprise a separation step, to obtain the fraction containing the desired protein. It may be any method known to those skilled in the art, for example a centrifuge. At the end of the separation step, a fraction containing the protein extracted from the membrane is obtained.
  • the protein may be stored in a solution comprising at least one compound of the invention.
  • the compounds of the invention allow the functional stabilization of proteins, especially after they have been extracted from their membrane.
  • Another subject of the invention thus relates to a method for stabilizing membrane proteins in solution, that is to say outside the biological membrane in which they were originally in an aqueous solution, comprising a step ( i) comprising contacting an aqueous solution of a membrane protein in solution with at least one compound of formula (I) of the invention.
  • the stabilization of the protein may be a conservation of all or part of the functional properties of the latter with respect to its native state. It can be a conservation of at least 50% of the activity of the protein compared to its native state, or at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%, or 100% of this activity.
  • the protein is thus stabilized at a temperature of between 0 ° C. and 10 ° C. for a period of time greater than 1 day, for example greater than 5 days, or greater than 10 days, or greater than 20 days or greater. at 30 days, or more than 40 days.
  • the membrane proteins may have been dissolved by an extraction step using a compound of the invention, as defined above, or by means of an extraction step with another detergent, that is, ie a commercial detergent, for example DDM (n-dodecyl ⁇ -d-maltoside), LMNG (lauryl maltose neopentyl glycol), Triton X100 or FA3 (amphiphilic facial 3).
  • a commercial detergent for example DDM (n-dodecyl ⁇ -d-maltoside), LMNG (lauryl maltose neopentyl glycol), Triton X100 or FA3 (amphiphilic facial 3).
  • Figure 1 shows the ABC BmrA transporter topology and the transport cycle of substrates across the plasma membrane.
  • Figure 2 shows the absorption spectra of calix [4] arenic detergents (exemplified with C4C7) compared to those of the clip molecules of the invention. The wavelengths are expressed in nm.
  • Panel A the absorption spectrum of the DDM (1 mM) is represented in a continuous line; that of C4C7 (1 mM) is shown in dotted lines.
  • Panel B the absorption spectrum of compound 2.3b (1 mM) is represented in -; that of compound 2.3c (1 mM) is represented in a continuous line; that of compound 2.3d (1 mM) is represented as TM .
  • Panel C the absorption spectrum of the compound 3.7e (1 mM) is represented in -; that of compound 3.7f (1 mM) is represented as ⁇ ; that of the compound 3.7g (1 mM) is represented in; that of compound 3.7h (1 mM) is represented in; that of compound 3.7j (1 mM) is represented in a continuous line.
  • Panel D the absorption spectrum of compound 4.6b (1 mM) is represented in ⁇ ; that of compound 4.6c (1 mM) is represented in a continuous line; that of the compound 4.6d (1 mM) is represented in -
  • Panel F the absorption spectrum of the compound 3.9a (1 mM) is represented in a continuous line.
  • Panel G the absorption spectrum of compound 3.7a (1 mM) is represented in; that of compound 3.7b (1 mM) is represented in; 3.7k that of compound (1 mM) is shown in TM -; that of compound 3.7I (1 mM) is represented in a continuous line; that of compound 3.7c (1 mM) is represented in ⁇ ; that of the compound 3.7d (1 mM) is represented in: -> - > .
  • Figure 3 shows the interaction of divalent cations with the molecules of the invention as opposed to detergents arenic calix [4], here exemplified with C4C12, and shows the lack of interaction of divalent cations with the molecules of the invention as opposed to calix [4] arenic detergents.
  • Absorbance is measured at 600 nm for different concentrations of MgC (mM).
  • Panel A Absorption of Compound 3.7b at 0.45 mM (round), 1.5 mM (squares) and 4.5 mM (triangles).
  • Panel B Absorption of Compound 3.7c at concentrations of 0.2 mM (cross), 0.5 mM (round), 2 mM (squares) and 6 mM (triangles).
  • Panel C Absorption of Compound 3.7d at concentrations 0.0045 mM (round), 0.0015 mM (squares) and 0.045 mM (triangles).
  • Panel D absorption of compound 3.7e at concentrations 0.2 mM (cross), 0.5 mM (round), 2 mM (squares) and 6 mM (triangles).
  • Panel E Absorption of 3.7f at concentrations of 0.006 mM (round), 0.02 mM (squares) and 0.06 mM (triangles).
  • Panel F Absorption of 3.7g at concentrations of 0.003 mM (round), 0.01 mM (squares) and 0.03 mM (triangles).
  • Panel G Absorption of 3.7h at 0.003 mM (round), 0.01 mM (squares) and 0.05 mM (triangles).
  • Panel H Absorption of Compound 3.7i at 0.3 mM (round), 1 mM (squares) and 3 mM (triangles).
  • Panel I Absorption of 3.7j at concentrations 0.006 mM (round), 0.02 mM (squares) and 0.06 mM (triangles).
  • Panel J Absorption of compound 3.7k at 0.3 mM (round), 1 mM (squares) and 3 mM (triangles) concentrations.
  • Panel K absorption of compound 3.7I at concentrations 0.3 mM (round), 1 mM (squares) and 3 mM (triangles).
  • Panel L Absorbance of compound 2.3f at concentrations of 0.24 mM (round), 0.8 mM (squares) and 2.4 mM (triangles).
  • Panel M Absorption of compound 2.3g at 0.03 mM (round), 0.1 mM (squares) and 0.3 mM (triangles).
  • Panel N absorption of compound 2.3h at 0.15 mM (round), 0.5 mM (squares) and 1.5 mM (triangles) concentrations.
  • Panel O Absorption of compound 4.5c at 0.3 mM (round), 1 mM (squares) and 3 mM (triangles) concentrations.
  • Panel P Absorption of Compound 4.5d at 0.15 mM (round), 0.5 mM (squares) and 1.5 mM (triangles).
  • Panel Q absorption of compound 4.6c at concentrations
  • Panel R absorption compound 4.6d at concentrations 1mM (round), 3mM (squares) and 9mM (triangles).
  • Panel S Absorption of Compound 3.9a at 0.01 mM (round), 0.1 mM (squares) and 1 mM (triangles).
  • Panel T Absorption of the compound C4C12 (calixarene) at concentrations 0.03 mM (round), 0.1 mM (squares) and 0.3 mM (triangles).
  • FIG. 4 represents the fluorescence (%) of DPH (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene) in the presence of increasing concentrations (0.0001 mM, 0.001 mM, 0.01 mM, 0.1 mM, 1 mM and 10 mM) of clips (compounds of the invention), exemplified with compounds # 3.7e (C13, points represented by squares) and 3.7f (C18, points represented by circles). The experiment is performed in triplicates. In agreement with Chattopadhyay, A. & London, E ([22]), the CMC corresponds to the concentration from which the slope break is observed, here 20 ⁇ for 3.7f and 2 mM for 3.7e (black symbols) .
  • Figure 5 shows the light scattering (DLS) of clips, Intensity (%, left A column) and number (%, B column right), as a function of wavelength (nm). The estimated diameters are indicated on each panel (column A). Columns A and B, from top to bottom: compound 3.7c (10mM, 5xCMC), compound 3.7d (10mM, 5xCMC), compound 3.7e (2mM, 5xCMC), compound 3.7f (10mM, 500xCMC), compound 3.7h (1mM, 100xCMC), compound 3.7j (2mM, 100xCMC), compound 3.9a (1mM, 50xCMC).
  • DLS light scattering
  • Figure 6 shows the extraction of membrane proteins BmrA (panels A and C) and AcrB (panels B and D) using commercial detergents and molecules of the invention (panels A and B, from left to right: SDS, DDM, FC12, TX100, compounds of the invention 1 .4, 1, 5, 2.3a, 2.3b, 2.3c, 2.3d, 2.3e, 2.3f, 2.3g, 2.3h, 2.3i, 3.7a , 3.7b, panel C: compounds of the invention 3.7c 0.8%, 3.7d 0.16%, 3.7e 0.8%, 3.7f 0.3%, 3.7g 0.4%, 3.7h 0 , 2%, 3.7i 0.07%, 3.7j 0.09%, 3.7k, 3.7I 0.25%, 3.9a, 4.5a, 4.5b, 4.5c, 4.5d 0.34%, 4.6a, 4.6b, 4.6c, 4.6d, 5.3a, 5.3b, 5.3c 0.3%, 5.3d 0.3%, panel D:
  • Figure 7 shows the effect of the detergents of the invention on the functionality of BmrA (ATPase activity,%).
  • the membrane fraction enriched in BmrA (-25%) diluted to 2 g / L is added compounds at the concentrations (mM) indicated (panel A, from top to bottom: 3.7e 10.7 mM, 3.7e 8.6 mM, 3.7e 6.4mM, 3.7e 4.3mM, 3.7e 2.2mM, 3.7e 1, 1mM, 3.7d 4mM, 3.7d 3mM, 3.7d 2mM, 3.7d 1mM, 3.7d 0.8mM, 3.7d 0.6mM, 3.7d 0.05mM, 3.7d 0.03mM, 3.7d 0.02mM, 3.7c 13mM, 3.7c 10.4mM, 3.7c 10mM, 3.7b 1.5mM, 3.7b 0.7mM, 3.7b 0.5mM, 2.3gNa2 20.5mM, 2.3gK2 19.
  • the solutions are then centrifuged for 1 h at 4 ° C., 100,000 ⁇ g and the supernatants deposited on SDS PAGE 10% (cf. FIG. 8).
  • the gray and black histograms correspond to the concentrations at which BmrA is partially (gray) or completely (black) extracted from these SDSPAGE.
  • the ATPase activity is in% relative to that of the protein without compound, 0.7 ⁇ ATP hydrolysed / min / mg proteins.
  • FIG. 8 represents the extraction of BmrA tested at different concentrations (expressed in mM and in xCMC) of different detergents (DDM, LMNG and FA3) and molecules of the invention (3.7b, 3.7c, 3.7d, 3.7 e, 3.7f, 3.7h, 3.7g, 3.7j, 3.71, 3.9a, 4.3d, 5.3b) as shown in Fig. 7.
  • the total (T) and soluble (S) fractions of the solutions prepared in Figure 7 are deposited on SDSPAGE 10% after separation by centrifugation at 100,000xg 30 min, 4 ° C.
  • DDM ⁇ -D-dodecyl maltoside
  • LMNG lauryl maltoside neopentyl glycol
  • FA3 amphiphilic facial # 3 (Lee, S.C. et al. ([9])).
  • Figure 9 shows the stability in time of purified BmrA in DDM (points represented by circles) and added compounds of the invention (3.7c, points represented by squares and 3.7g, points represented by diamonds), or of FA3 (points represented by triangles).
  • the ATPase activity (%) is measured according to the post-purification incubation days, as explained in Example 13.
  • FIG. 10 shows the separation by Superdex S200 5/150 column exclusion chromatography of the ABC BmrA membrane protein in the presence of either DDM (dashed line) or the compound of the invention 3.7c (line drawing). full).
  • the membrane fraction was extracted and purified by Ni-NTA metal-affinity and Size-exclusion Superdex 200 DDM before being reloaded on Ni-NTA to exchange the DDM either against itself or against the compound 3.7c. Chapque pool was then loaded onto a 3 mL Superdex S200 5/150 size-exclusion column, and eluted in the presence of 2 CMCs of the same detergent, as indicated.
  • the proteins are labeled by absorbance at 280 nm.
  • FIG. 1 1 represents the heat stability of the membrane protein BmrA in the presence of compounds of the invention.
  • AT. Thermostabilization of BmrA by detergents and compounds of the invention (from left to right: DDM, LMNG, 3.7d, 3.7c, 3.7b, 3.7a, 3.7I, 3.7j, 3.7k, 3.7f and 3.7
  • Membrane fractions were extracted with 10 mM DDM with or without 1 mM detergents and compounds of the invention, clarified and subjected to 30 min at the indicated temperatures followed by centrifugation and SDS-PAGE + Western blot supernatants to quantify membrane proteins remaining (2 -4 experiments)
  • detergents belonging to formula (I) are prepared according to the following protocols:
  • reaction mixture is stirred under an inert atmosphere and at RT for 3 h. After adding water (15 mL / mmol), the reaction medium is extracted with ethyl ether. The organic phases are combined, washed with distilled water and saturated aqueous NaCl solution, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The crude product is purified by chromatographic column on silica gel.
  • Example 2 Example of Compounds 1.1 to 1.5
  • the organic phase is washed successively with a saturated solution of NaCl, a solution of HCl (0.1 N) and then with a solution of NaHCO 3 (5%) before being dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated in vacuo.
  • the residue obtained is taken up in a piperidine / DMF mixture (20:80, 300 mL). After stirring for 1 h at RT, the reaction medium is then concentrated in vacuo.
  • the crude product obtained is purified by chromatography column on silica gel (CH 2 Cl 2 / MeOH 98: 2) to give the expected compound (2.44 g, 7.43 mmol, 95%) in the form of a yellow oil. .
  • Example 3 Compounds 2.1 to 2.3
  • the compound 2.2i (white solid, 162 mg, 0.24 mmol, 83%) was obtained from the compound 2.1 b according to the general protocol A (purification: chromatographic column on silica gel, eluent: cyclohexane / AcOEt 9 : 1 to 7: 3)
  • R 1 Ac-saccharide or PEG
  • R 1 a saccharide or PEG
  • R 2 -OBn or - NHCh COOBn
  • R 2a -OH or -NHCH 2 COOH
  • R 3 - (CH 2 ) n CH 3 , - CH [(CH 2 ) n CH 3 ] 2 or - (CH 2 ) n cyclohexyl.
  • the compound 3.2b (yellowish oil, 1.91 g, 3.45 mmol, 77%) was obtained from the compound 3.1 a by following the general protocol A (purification: chromatographic column on silica gel, eluent: cyclohexane / AcOEt 9: 1 to 7: 3).
  • the compound 3.5h (white solid, 91 mg 0.09 mmol, 88%) was obtained from the compound 3.3g following the general procedure I (purification: chromatographic column on silica gel, eluent: CH 2 Cl 2 / 99: 1 to 97: 3 MeOH).
  • the compound 3.7k (white solid, 60 mg, 0.09 mmol, 82%) was obtained from the compound 3.5k following the general protocols J and F.
  • Example 6 Compounds 5.1 to 5.3
  • Compound 5.1a (white solid, 1.051 g, 2.06 mmol, 60%) was obtained from L-Fmoc-Cys (Trt) -OH and dodecene according to the general protocol L.
  • NHFmoc Compound 5.1b (white solid, 1.050 g, 1.95 mmol, 57%) was obtained from L-Fmoc-Cys (Trt) -OH and tetradecene according to the general protocol L.
  • Compound 5.2a (colorless solid, 1.036 g, 0.87 mmol, 60%) was obtained from 5.1a and 2'-aminoethyl-4-O- (2,3,4,6-). tetra-O-acetyl- ⁇ -D-glucopyranosyl) -2,3,6-tri-O-acetyl-D-glucopyranoside (not described) following the general protocol A.
  • BmrA and AcrB 2 bacterial polytopic membrane proteins.
  • BmrA is characterized by a functional topology sensitive to extraction with detergents.
  • BmrA is a polytopic membrane protein organized into 3 domains, cytosolic, membrane and extracellular ( Figure 1).
  • the cytosolic domain is made up of 2 parts called nucleotide-binding domains, NBD, which when united bind and then hydrolyze ⁇ .
  • the membrane domain is also formed of 2 parts called trans-membrane domains, TMD, each connected to a NBD. TMDs adopt different conformations directed towards the inside or the outside of the cell according to the catalytic cycle.
  • BmrA This allows BmrA to capture substrates (S in Figure 1) present in the intracellular space (or plasma membrane) and evacuate them to the outside.
  • This type of efflux pump is ubiquitous. They belong to the family of ABC transporters that cells overexpress in case of chemical stress caused by antibiotic, anticancer, antifungal or antiviral treatments.
  • This transport is effected via a conformational change that changes the internal or external orientation of the drug binding sites located in the membrane region of the protein ( Figure 1). After transport, the protein resumes its initial conformation using the energy from ATP hydrolysis (Ward, AB et al., Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and nucleotide-binding domain epitope.
  • the molecules of the present invention do not absorb, or negligibly, from 220 to 500 nm (and beyond), as evidenced in Figure 2. They do not therefore prevent the detection of proteins. at 280 nm.
  • the arix [4] arenic structure associated with 3 acid functions causes the corresponding detergents to chelate the divalent metals very effectively.
  • the new design of the molecules of the invention eliminates this effect.
  • Example 9 Measurement of the critical micelle concentration (CMC) of the molecules of the invention.
  • the molecules of the invention were prepared in a concentration range from 0.1 ⁇ l to 10 mM in 50 mM Tris-HCl pH 8.0 and neutralized at this pH. To 80 ⁇ l of each solution (triplicate) is added the same volume of 10 ⁇ 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH, Sigma, D208000), prepared at 100 ⁇ l in tetrahydrofuran and then diluted 10 ⁇ in H2O. . The increase of the fluorescence of the DPH occurs when it finds micelles of clips in which to insert (Chattopadhyay, A. & London, E. Fluorimetric determination of critical micelle concentration avoiding interference from detergent load.
  • DPH 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene
  • the fluorescence reading is performed with a SAFAS Xenius fluorimeter by exciting at 358 nm and recording fluorescence emission at 430 nm, with 9 to 10 nm slots for excitation and emission and a gain of 100 at 150, depending on the case.
  • the CMC of detergents is the concentration from which they associate to form micelles, in which, in aqueous solution, the hydrophobic parts are grouped in the center and the hydrophilic regions exposed to the solvent.
  • This CMC was measured here by following the increase in fluorescence of a compound, DPH, whose fluorescence increases significantly when it is inserted into the micelles (Chattopadhyay, A. & London, E. ([22]) ).
  • DPH whose fluorescence increases significantly when it is inserted into the micelles
  • FIG. 4 A typical result obtained with a 3.7 compound having a C13 (3.7e) or C18 (3.7h) aliphatic chain is illustrated in FIG. 4.
  • the following table 1 summarizes the values obtained for the molecules of the invention. .
  • Another physico-chemical parameter of detergent micelles is their diameter, assuming that they are spherical. This magnitude is obtained by the light scattering technique (DLS).
  • the molecules of the invention tested were prepared in a concentration range of 0.1 to 1000 x CMC in 30 mM Tris-HCl, pH 8.0 and neutralized at this pH.
  • the solutions are filtered on 0.22 ⁇ .
  • the measurement is made on 100 ⁇ , in triplicate on a Zetasizer Nano-S from Malvern Instruments.
  • the estimated diameters of the clips tested are, with the exception of compound 3.7j, of the order of 3 to 5 nm, ie objects of relatively small size for detergents.
  • the micelles therefore have reduced sizes, independently of their CMC, which varies for the compounds tested, from 20 ⁇ to 2 mM.
  • Compound 3.7j is an exception, forming objects of very large size, of the order of 60 nm. It is likely to behave like lauryl maltosides neopentyl glycols (Chae, PS et al ([6]), Chaptal, V. et al., Quantification of detergents complexed with membrane proteins. [23])). Results are illus- trated in Figure 5.
  • Example 11 Extraction of BmrA and AcrB with the Molecules of the Invention
  • Operating procedure BmrA represents 25% of the proteins present in the overexpression system used (E. coli, C41 DE3). These membranes are prepared as previously described (Matar-Merheb, R. et al. ([11])). AcrB-containing membranes (about 20% of membrane proteins, same expression system as BmrA) were prepared as previously described (Seeger, M.A. et al ([21])).
  • the detergents are used at 10 g / L unless otherwise indicated and the proteins diluted to 2 g / L in a 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 100 mM NaCl, 15% glycerol, supplemented with antiproteases (Roche) at a rate of one tablet / 100 mL.
  • the whole (T) is incubated for 2 h at 4 ° C. and then centrifuged for 1 h at 4 ° C. to 100 000 ⁇ g to separate the fraction extracted (supernatant, S) from that which is not (pellet).
  • the supernatants are deposited on SDSPAGE of 10%, stained after migration with Coomassie blue.
  • Foscholine 12, DDM and LMNG come from Anatrace
  • SDS and Triton X100 come from Sigma-Aldrich.
  • the extradating compounds are 1 .4, 2.3 [a, d, f, g, h, i], 3.7 [c, f, g, h, I], 4.5 [d], 4.6d, 5.3 [ad].
  • the group of partial extractants we find 1 .5, 3.7 [d, j], 4.5 [b, c], and in that of non-extractants 2.3 [b, c], 3.7 [a, b, e, i, k], 3.9a, 4.5a and 4.6a.
  • the extractant compounds are 1 .5, 2.3 [a, b, c, d, e, f, g, h, i], 3.7 [c, d, e, f, h, j, I], 4.5 [b, c, d], 4.6 [c, d] those that partially extract, 4.5a, 4.6d, and those that do not extract, 3.7 [a, b, i, k] and 4.6a.
  • the molecules of the invention which extract BmrA in the preceding example were tested at different sub-solubilizing and solubilizing concentrations, to evaluate their impact on the native and functional state of the protein.
  • the latter is monitored by the hydrolysis of ATP that the protein performs during the transport cycle, coupled with solute translocation.
  • the ATPase activity of BmrA is a very sensitive marker of the state of the protein, the latter being particularly sensitive to the detergents used during the extraction step where they replace the lipids in contact with the membrane protein.
  • Operating procedure BmrA produced and enriched in the plasma membrane of E. coli C41 DE3 is prepared as previously described (Matar-Merheb, R. et al ([1 1])).
  • the membranes are diluted to 2 g / L in a 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 100 mM NaCl, 15% glycerol, supplemented with antiproteases (Roche) at a rate of one tablet / 100 mL.
  • the detergents are added at the concentrations indicated in FIG. 7.
  • the whole (T) is incubated for 2 h at 4 ° C. and the ATPase activity is measured using the coupled enzyme system, subtracting the Vanadate activity.
  • DDM very widely used in the field, induces the same effects, decreasing the ATPase activity of BmrA by 50 to 15% at concentrations that allow its extraction, beyond 5 mM.
  • FA3 a newly developed steroid-coupled dimaltoside (Lee, SC et al (2013) ([9]), produced the same effect by inactivating 75% and 80% of BmrA ATPase activity at concentrations that extract the protein.
  • the most effective compounds are grouped in series 3.7, the best of which are 3.7 [b, c, e, g, j, l]. These extract BmrA while preserving (3.7j, l), or increasing 1.5x (3.7b, c, g) or 2x (3.7) the ATPase activity of the protein. It should be noted that this increase in activity is a characteristic of ABC transporters, whose basal activity can be multiplied up to 2.5 times in the presence of solutes; it shows a perfect functional state.
  • Compounds 3.7b and 3.7c share the same design, including a molecule-linked ose via a triazole, 2 carboxylic functions and a C 1 and C 13 aliphatic chain.
  • Compounds 3.7e and 3.7g are a variant of 3.7c with either a maltoside or a pegylated chain in place of oside.
  • Operating procedure BmrA produced and enriched in the plasma membrane of E. coli C41 DE3 is prepared as previously described (Matar-Merheb, R. et al ([1 1])). Twenty milligrams of this membrane fraction are diluted at 4 ° C to 1 g / L in 100 mM NaPi pH 8.0, 15% glycerol, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole, 1 mM DTT. The suspension is supplemented with antiproteases (Roche, 1 tablet / 50 ml) and benzonase (Sigma, 30 U / ml). The membrane proteins are then extracted by adding 1% DDM (20 mM), for 1 h at 4 ° C. .
  • the solution is centrifuged for 1 hour at 100,000xg, 4 ° C (Optima XPN-80, 50.2%).
  • the supernatant is loaded at 2 mL / min on a 5 mL Ni-NTA resin (GE Healthcare, HiTrap chelating HP) equilibrated in buffer A, 100 mM NaPi pH 8.0, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.05 % DDM (1mM, 5xCMC).
  • BmrA is eluted with buffer A gradient and buffer C (100 mM NaPi, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 250 mM Imidazole, 0.05% DDM (1 mM, 5xCMC)) spread over 10 mL and collected by fraction of 1 mL at 3 mL / min. The fractions of the peak are united
  • the solution is separated into 4 fractions diluted to 0.2 g / L of proteins with buffer A without imidazole and DDM.
  • the final [DDM] is 0.25 mM.
  • Each aliquot is supplemented with 0.087 mM DDM, F A3, 3.7c or 3.7g and stored at 4 ° C for 40 days.
  • Vanadate-sensitive ATPase activity Centeno, F. et al. ([25])) is measured at the times shown in Figure 9 in duplicate.
  • BmrA was extracted into DDM and purified by Ni-NTA affinity chromatography as described in Example 13 and loaded onto a Superdex 200 10/300 size exclusion column and eluted with 50 mM Hepes-HCl pH 8. 0.10 mM NaCl, 0.4 mM DDM (2xCMC). Fractions containing BmrA were pooled and separated into several aliquots (-100 g) stored at 4 ° C. An aliquot was then refilled on a column affinity containing 1 mL of resin. The DDM was then exchanged for 10 volumes of Hepes-NaCl buffer containing either 2 CMCs of DDM (control experiment) or 2 CMCs of Compound 3.7c (2 mM).
  • BmrA was then eluted in the respective buffers plus 100 mM imidazole.
  • the fractions containing the proteins were pooled and concentrated on amicon 50 kDa (regenerated cellulose) up to 50 ⁇ which were then deposited on a 3 ml Superdex 200 5/150 size exclusion column, equilibrated in 50 mM Hepes. -HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, and 2 CMC of DDM (0.4 mM) or 3.7c (2 mM). Elution was then performed at 0.3 mL / min in the respective buffers and BmrA detected at 280 nm.
  • thermostability gain is equivalent to that obtained previously by introducing 17 mutations in an A2AR protein fusion protein with a C-terminal truncation of 96 residues (Magnani et al., ([32])).

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Abstract

La présente invention se rapporte à un composé de formule (I) : (I) telle que définie dans la description. La présente invention se rapporte également à un procédé d'extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d'une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de l'invention. La présente invention se rapporte en outre à un procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d'une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de l'invention.

Description

COMPOSÉS-CLIPS SURFACTANTS POUR L'EXTRACTION ET LA STABILISATION EN SOLUTION DE PROTÉINES MEMBRANAIRES
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à des composés surfactants et leur utilisation pour l'extraction et la stabilisation en solution de protéines membranaires extraites en solution aqueuse.
La présente invention trouve une application industrielle dans le domaine de la biochimie ainsi que dans le domaine médical, et notamment dans le domaine de la conception de médicaments assistée par la structure des cibles. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
État de la technique
La structure des protéine membranaires (PMs) est instable en dehors de la membrane lipidique qui les entoure. C'est le cas lorsqu'on les extrait des membranes à l'aide de détergents, pour ensuite les purifier et les cristalliser ou les utiliser comme antigènes. Il est cependant impératif que cette structure soit effectivement celle qu'adopte la PM dans sa membrane d'origine et ne soit pas plus ou moins altérée par le processus d'extraction qui est réalisé à l'aide de détergents.
Plus d'une centaine de détergents sont proposés sur le marché pour extraire les PMs. Excellents compétiteurs des lipides dans lesquels sont enchâssées les PMs, ils extraient ces dernières avec une grande efficacité. Celle-ci tient en partie au fait que les détergents s'échangent très vite avec le milieu, contrairement aux lipides (Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J. & Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 470, 185-201 (1977) ([1])). Cette forte capacité d'échange entraîne par contre une déstabilisation du domaine membranaire des PMs qui, moins bien maintenu qu'avec des lipides, tend à se déstructurer dans le temps. On observe aussi une agrégation des PMs du fait de l'exposition temporaire des régions hydrophobes des PMs qui s'associent entre-elles pour se protéger mutuellement du milieu aqueux.
Sur le plan de la conception de médicaments, l'enjeu est majeur pour les industries qui adoptent une stratégie de conception de médicaments assistée par la structure des cibles (« Structure-Based Drug Design »). En effet, parmi les 324 cibles pharmacologiques identifiées à ce jour, plus de 60% sont des PMs, et on estime que le nombre de cibles dépassera à terme les 3000 dont 80 % seront membranaires (Overington, J. P., Al-Lazikani, B. & Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat Rev Drug Discov 5, 993-996 (2006) ([2])). Cette stratégie implique de connaître la structure 3D de la cible, apo ou associée à son ligand, pour développer une génération de modulateurs optimisés sur une base structurale (Mason, J. S., Bortolato, A., Congreve, M. & Marshall, F. H. New insights from structural biology into the druggability of G protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33, 249-260 (2012) ([3]) ; Schaffhausen, J. Advances in structure- based drug design. Trends in Pharmacological Sciences 33, 223 (2012) ([4]) ; Shoichet, B. K. & Kobilka, B. K. Structure-based drug screening for G-protein- coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 33, 268-272 (2012) ([5])). Pour autant, il faut disposer de données structurales, effectivement représentatives de l'état natif de la protéine. C'est ce qui est nettement le plus limitant quand la cible est membranaire, et dans ce contexte, de nouveaux outils qui lèvent cette limitation ont un impact majeur sur ce type d'approches.
Sur le plan de la vaccination, les cibles sont majoritairement accessibles à la surface des pathogènes et donc ancrées ou enchâssées dans la membrane plasmique. Extraire et maintenir des PMs cibles, quelquefois homo- et/ou hétéro-oligomériques, dans leur état natif le temps qu'elles soient prises en charge par le système immunitaire permet d'améliorer la qualité des anticorps, leur efficacité étant directement liée à l'intégrité structurale des protéines injectées. C'est également important sur le plan de la production des antigènes, qui correctement conformés peuvent être injectés à plus faible dose, ce qui permet un gain d'échelle.
La conception de détergents plus stabilisants est un champ de recherches très actif. Ainsi parmi les meilleurs détergents stabilisants, ont été récemment développés les lauryl maltoside néopentyl glycols (LMNG), comportant 2 chaînes grasses courtes pour mimer les lipides (Chae, P. S. et al. Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat Meth 7, 1003- 1008, (2010) ([6])). Des détergents basés sur des acides biliaires ont aussi été développés (Chae, P. S. et al. Tandem Facial Amphiphiles for Membrane Protein Stabilization. Journal of the American Chemical Society 132, 16750- 16752 (2010) ([7]) ; Zhang, Q. et al. Designing Facial Amphiphiles for the Stabilization of Intégral Membrane Proteins. Angewandte Chemie International Edition 46, 7023-7025 (2007) ([8]) ; Lee, S. C. et al. Steroid- based facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1 10, E1203-121 1 (2013) ([9])). La conception de ces molécules est basée sur des concepts classiques tel que balance hydrophile- hydrophobe, ce qui limite leur potentiel. Une autre génération de détergents incorporant des fonctions acide faible a permis de gagner en stabilité, basés sur un squelette calix[4]arénique (Suwinska, K. et al. Tri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Derivatives: Synthesis, Solid-State Structures and
Self-Assembly Properties. New Journal of Chemistry 32, 1988-1998, (2008) ([10]); Matar-Merheb, R. et al. Structuring détergents for extracting and stabilizing functional membrane proteins. PLoS One 6, e18036, (201 1 ) ([1 1 ])). Ces fonctions acide favorisent la formation de ponts salins multiples avec les acides aminés localisés à l'interface membrane-cytoplasme, en nombre plus important qu'ailleurs dans la protéine (von Heijne, G. The distribution of positively charged residues in bacterial inner membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. Embo J 5, 3021 -3027 (1986) ([12]) ; Nilsson, J ., Persson, B. & von Heijne, G. Comparative analysis of amino acid distributions in intégral membrane proteins from 107 génomes. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 60, 606-616, (2005) ([13]) ; von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 909-918 (2006) ([14])). Ces détergents calix[4]aréniques absorbent fortement dans l'UV, notamment à 280 nm où les protéines sont le plus souvent détectées, et chélatent les métaux divalents, ce qui peut-être indésirable.
II existe donc un réel besoin de nouveaux outils palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier de nouveaux outils permettant d'extraire les protéines membranaires et d'augmenter leur stabilité en solution aqueuse. Description de l'invention
Aux termes d'importantes recherches, les Demandeurs ont conçu de nouveaux composés permettant de résoudre ce problème technique.
Les composés de l'invention consistent en une série de surfactants amphiphiles permettant l'extraction de protéines membranaires (PMs), tout en ayant un faible impact sur l'état natif et fonctionnel des PM.
Avantageusement, les composés de l'invention augmentent significativement la stabilité des PMs extraites en solution aqueuse.
Ces molécules présentent la propriété unique de ceinturer la région hydrophobe des PMs comme des clips par une triple capacité d'interaction : 1 / interaction hydrophobe entre les résidus de la région membranaire de la protéine et la chaîne grasse des détergents, 21 interaction de type Hydrogène, notamment renforcée par la présence d'osides ou chaîne polyéther et 3/ interaction ionique entre les fonctions de type acide faible de la tête polaire du détergent et les résidus basiques dont l'abondance est particulièrement élevée à l'interface membrane-cytoplasme des PMs. Les molécules de l'invention permettent en outre d'extraire et stabiliser à court et long termes (plusieurs dizaines de jours) les PM à 4°C.
Ces molécules ont en outre la propriété de ne pas absorber dans l'UV et ne pas chélater les cations divalents.
Ainsi, un premier objet de l'invention se rapporte à des composés de formule (I):
Figure imgf000007_0001
Formule (I)
dans laquelle :
■ X représente -OH,
Figure imgf000007_0002
, -S(CH2)nCH3,
Figure imgf000007_0003
H .
HC-(CH2)NCH3 -C-(CH2)PC02R2
■ Y représente -(CH2)nCH3, (CH2)MCH3 _ CO2R2 _ _(CH2)2OR1 ou
H ,
-C -(CH2)PC02R2
CONHCH2C02R2 ■ -|— (CH2)nCH3
■ Z représente -NHCO(CH2)nCH (CH2)mCH3 (CH2)nCy - 2 .
Figure imgf000008_0001
et dans laquelle :
■ R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ m est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;
■ q est un nombre entier allant de 1 à 5 ;
■ r est un nombre entier allant de 1 à 10 ;
■ Cy représente le cyclohexyle ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
On entend par « monosaccharide », au sens de la présente invention un monomère de glucide comprenant de 3 à 14 atomes de carbone. Il peut s'agir par exemple d'un monosaccharide choisi parmi le glycéraldéhyde, la dihydroxyacétone, l'érythrose, le thréose, l'érythrulose, le désoxyribose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, le ribulose, le xylulose, l'allose, l'altrose, le galactose, le glucose, le gulose, l'idose, le mannose, le talose, le fructose, le psicose, le sorbose, le tagatose, le fucose, le rhamnose, le sédoheptulose, le mannoheptulose, l'heptahydroxyoctanal, l'acide neuraminique et l'acide sialique, ainsi que leurs dérivés. De préférence, il peut s'agir du glucose. Il peut s'agir d'un monosaccharide cyclique ou acyclique. Parmi les monosaccharides cycliques, il peut s'agir d'un monosaccharide de forme pyranique ou de forme furanique, par exemple le β-D-Glucopyranose.
On entend par « disaccharide », au sens de la présente invention, un diholoside formé par deux monomères de glucide via une liaison osidique. Il peut s'agir d'un homodiholoside ou d'un hétérodiholoside. S'il s'agit d'un homodiholoside, il peut s'agir par exemple d'un homodiholoside de fructose, comme l'inulobiose, ou de mannose, comme le 2alpha-mannobiose ou le 3alpha-mannobiose, ou de glucose, comme le tréhalose, le kojibiose, le nigerose, le maltose, l'isomaltose, le sophorose, le laminaribiose, le cellobiose ou le gentiobiose, ou leurs dérivés. Il peut s'agir par exemple de l'éthylmaltoside. Alternativement, s'il s'agit d'un hétérodiholoside, il peut s'agir d'un hétérodiholoside de glucose-fructose, par exemple choisi parmi, comme par exemple le tréhalulose, le saccharose, le turanose, le maltulose, le leucrose, l'isomaltulose et le gentiobiulose, ainsi que leurs dérivés, ou bien d'un hétérodiholoside choisi parmi le mélibiose, le lactulose, le lactose et le rutinose, ainsi que leurs dérivés.
Dans le cadre de l'invention, m peut être choisi parmi les nombres entiers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 et 21 .
Dans le cadre de l'invention, n peut être choisi parmi les nombres entiers 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 et 21 . Il peut s'agir par exemple des nombres 10, 12 ou 14.
Dans le cadre de l'invention, p peut être choisi parmi les nombres entiers 1 , 2 et 3.
Dans le cadre de l'invention, q peut être choisi parmi les nombres entiers 1 , 2, 3, 4 et 5.
Dans le cadre de l'invention, r peut être choisi parmi les nombres entiers 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10.
Les nombres entiers m, n, p, q et r sont indépendants les uns des autres, et toutes les combinaisons de ces nombres entiers font partie de l'invention.
Dans le cadre de la présente invention, le terme "sels pharmaceutiquement acceptables" comprend les sels préparés avec des acides ou bases, non toxiques, en fonction des substituants présents sur les composés. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions acides, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'une base organique ou inorganique sur le composé sous forme neutralisée en présence éventuellement d'un solvant de préférence inerte. Des exemples de sel d'addition d'une base peuvent être les sels de sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organique), ou magnésium.
Ainsi, l'invention s'entend par exemple d'un composé de formule (I) dans lequel :
■ X représente
Figure imgf000010_0001
■
-C-(CH2)pC02R2 -C -(CH2)pC02R2
Y représente C°2R ou CONHCH2CO2R o
-N " i (CH2)NCH3
■ Z représente -NHCO(CH2)nCH3 ou (CH2)MCH3 .
■ R1 représente un monosaccharide, par exemple le glucose, un disaccharide, par exemple le maltose, ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ m est un nombre entier allant de 4 à 21 , par exemple égal à 1 1 ;
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 , par exemple égal à 8,10, 1 1 , 12, 14 ou 17 ;
■ p est un nombre entier égal à 1 à 3, par exemple égal à 2 ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Dans ce cas, il peut s'agir par exemple des composés du groupe 3.7, par exemple 3.7b, 3.7c, 3.7e, 3.7g, 3.7j, 3.7I, ou du groupe 4.6, par exemple 4.6b ou 4.6d, tels que décrits dans la partie « Exemples » ci-dessous.
Alternativement, l'invention s'entend par exemple d'un composé de formule (I) dans lequel :
" X représente -S(CH2)nCH3 ;
■ Y représente -(CH2)2OR1 ; — H N— I "I— |— C02R2
■ Z représente (CH2)PCO2R2 .
■ R1 représente un monosacchahde, un disaccharide, par exemple le matlose, ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 , par exemple égal à 1 1 , 13, 15 ou 17 ;
■ p est un nombre entier égal à 1 à 3, par exemple égal à 2 ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Dans ce cas, il peut s'agir par exemple des composés du groupe 5.3, par exemple 5.3a, b, c ou d, et en particulier du composé 5.3a, tels que décrits dans la partie « Exemples » ci-dessous.
D'une manière générale, chacun des composés répondant à la formule (I), et décrits dans la partie « Exemples », et notamment dans les tableaux 1 et 2 de la partie « Exemples » sont des molécules objet de l'invention.
Avantageusement, les molécules de la présente invention n'absorbent pas, ou de façon négligeable, de 220 à 500 nm (et au-delà), et n'empêchent donc pas la détection des protéines à 280 nm.
Avantageusement, les molécules de l'invention ne forment pas un complexe insoluble avec des métaux divalents. Cette absence d'interaction avec des métaux est par exemple très utile lors des étapes de chromatographie de type affinité-métal, qui utilisent du Nickel ou du Cobalt, et qui ne peuvent être mises en œuvre avec des fortes concentrations de détergents classiques, contrairement aux molécules de l'invention. Elle est aussi très utile pour éviter la précipitation des complexes en présence de calcium et magnésium qui sont des cofacteurs protéiques couramment rencontrés dans le vivant.
Les inventeurs ont mis en évidence expérimentalement qu'il est possible de faire varier la CMC (concentration micellaire critique) des composés de l'invention en faisant varier leurs substituants, par exemple en faisant varier la longueur de la chaîne aliphatique et/ou la taille des têtes polaires, en fonction du but recherché, par exemple éliminer facilement par dialyse ou ultrafiltration un détergent à CMC élevée ou bien conserver celui-ci en utilisant des composés à CMC plus faible.
Les inventeurs ont mis en évidence expérimentalement qu'il est possible de réaliser des extractions sélectives, en fonction des protéines membranaires à extraires, au moyen des molécules de l'invention, en faisant varier leurs caractéristiques techniques, notamment leurs substituants, en particulier lorsque des protéines membranaires d'intérêt est généralement co- purifié au moyen des techniques classiques avec un contaminant.
Avantageusement, l'extraction de protéines membranaires au moyen des molécules de l'invention ne provoque pas une diminution de l'activité fonctionnelle des PM une fois celles-ci extraites. Facultativement, l'extraction au moyen des molécules de l'invention peut permettre une augmentation de l'activité fonctionnelle de la PM extraite, ceci étant fonction de la nature de la PM à extraire.
Les inventeurs ont en outre mis en évidence expérimentalement que les molécules de l'invention stabilisent en solution des protéines membranaires au moins 2 fois plus longtemps, par exemple 2 fois, 3 fois, 4 fois, 5 fois, voire plus, qu'un détergent classique.
Les composés de l'invention peuvent être préparés au moyen de toute méthode appropriée connue de l'homme du métier, incluant au moins une des méthodes comprenant le couplage peptidique, déprotection du groupement Fmoc (fluorénylméthoxycarbonyle), formation d'amides, hydrogénation catalytique, déprotection du groupement fBu (terf-butyle), déprotection des esters de méthyle ou d'éthyle, déprotection des groupements Boc, cycloaddition de Huisgen, réaction de désacétylation, formation des sels de carboxylate (Na, K) et déprotection trityle et couplage thiol-ène. Des protocoles de synthèse de chacun des composés de l'invention sont décrits par exemple dans la partie « Exemple » ci-après. Un deuxième objet de l'invention se rapporte à un procédé d'extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d'une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-avant.
On entend par « membrane biologique », au sens de la présente invention, tout assemblage de molécules lipophiles en un double feuillet séparant une cellule de son environnement, composée d'une bicouche de lipides amphiphiles, notamment des phospholipides, chaque lipide membranaire étant constitué d'une tête polaire hydrophile orientée vers l'extérieur de la membrane et d'une queue hydrophobe orientée vers l'intérieur. Il peut s'agir d'une membrane de cellule procaryote, de cellule eucaryote, animale - à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines - ou végétale, ou d'un virus. S'il s'agit d'une cellule eucaryote, il peut s'agir par exemple d'une membrane plasmique, d'une membrane intracellulaire, comme une membrane nucléaire, un lysosome, un exosome, un proteoliposome, une membrane du réticulum endoplasmique lisse ou rugueux, ou une membrane de l'appareil de Golgi, cette liste n'étant pas limitative. Il peut s'agir en outre d'une cellule-hôte isolée transgénique issue d'une lignée cellulaire dans laquelle un ou plusieurs antigènes d'intérêts sont exprimés, par exemple par des techniques de génie génétique de l'ADN, ou de l'ARN recombinant, ou par infection d'une cellule par un vecteur viral exprimant un ou des antigènes vaccinaux d'intérêt. Toute technique de génie génétique connue de l'homme du métier permettant l'expression d'un transgène dans une cellule peut être utilisée. Il peut s'agir d'une technique impliquant l'expression d'un ADN ou d'un ARN, par exemple un ARNm codant synthétique, introduit dans une cellule par transduction, par exemple par électroporation, micro-injection, ultra-sons, infection, transfection. L'expression peut être par exemple transitoire et/ou inductible et/ou constitutive d'au moins un antigène d'intérêt, comme par exemple décrit dans le document WO02090533 ([29]). La cellule peut en outre être toute cellule isolée, notamment à l'exception des cellules souches embryonnaires humaines, par exemple une cellule humaine isolée - les cellules souches embryonnaires humaines étant par exemple exclues -, ou une cellule isolée animale - non-humaine- ou végétale. La cellule isolée peut être issue d'une lignée cellulaire choisie parmi Vero (ATCC No. CCL-81 ) comme Vero 76 (ATCC No. CRL-1587), CHO comme CHO-KI (CCL 61 , ATCC), BHK comme BHK-21 [C-13] (ATCC® CCL-10™), HELA, perC6® (Crucell), HEK293 (ATCC® CRL-1573™), Sf9 (ATCC, CRL-171 1 ), MDCK, par exemple MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™), cette liste n'étant pas limitative.
La membrane biologique peut être entière, c'est-à-dire intègre, ou être une fraction de membrane biologique, c'est-à-dire une partie d'une membrane biologique.
On entend par " protéine membranaire " au sens de la présente invention, une protéine associée aux membranes biologiques, c'est-à-dire soit ancrée, soit intégrale, et non libre de diffusion dans les milieux aqueux. Parmi les protéines membranaires, on peut citer par exemple les protéines de membranes plasmiques et les protéines de membranes intracellulaires, comme par exemple les protéines de membranes mitochondriales, nucléaires ou lysosomales. Il peut s'agir par exemple d'une protéine de transport, par exemple un transporteur ABC, éventuellement choisi dans le groupe comprenant la glycoprotéines P (Pgp/ABCB1 ), MRP1/ABCC1 , MRP2/ABCC2, BCRP/ABCG2 et BmrA. Alternativement, il peut s'agir d'une protéine d'intérêt exprimée de manière transgénique dans une membrane biologique, par exemple les protéines citées ci-dessus et exprimées dans des cellules eucaryotes, comme décrit par Baiceanu et al. (Baiceanu E et al. :
« 2-lndolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors of ABCC2 », Eur J Med Chem. 2016 Oct 21 ;122:408-18 ([30])) pour ABCB1 , C1 , C2 et G2, ou BmrA exprimé dans des bactéries (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])).
La membrane biologique peut être mise en contact avec au moins un composé de formule (I) tel que défini ci-avant, ou au moins deux, ou au moins trois de ces composés, voire plus. Avantageusement, la sélection de plusieurs d'un ou de plusieurs composé(s) de l'invention peut permettre l'extraction sélective d'une protéine membranaire, par exemple pour s'affranchir des contaminants.
Dans le cadre de l'invention, la membrane biologique peut être préalablement mise en solution aqueuse, par exemple dans une solution tampon.
L'étape de mise en contact d'une solution aqueuse comprenant la protéine membranaire à extraire avec au moins un composé de formule (I) peut être réalisée à un pH auquel les groupements carboxyliques des molcules de l'invention sont ionisés, pour maximaliser l'effet clip des molécules. Avantageusemen, le pH est un pH compris entre 5,0 et 12, par exemple un pH de 5,0, ou 6,0, ou 7,0, ou 8,0, ou 9,0, ou 10,0, ou 1 1 ,0, ou 12,0.
Le procédé d'extraction de l'invention peut en outre comprendre une étape d'incubation de la protéine membranaire et du composé de l'invention. Le temps d'incubation peut être adapté pour que tout ou partie des protéines membranaires à extraire se retrouvent en solution. Le temps d'incubation peut être déterminé par l'homme du métier qui saura l'adapter en fonction de la membrane à solubiliser et/ou de la protéine à extraire et/ou du rendement d'extraction souhaité. Le temps d'incubation peut être par exemple de 15 minutes, ou de 30 minutes, ou de 1 heure, ou de 2 heure, ou de 3 heures, voire être supérieur à 3 heures.
L'étape d'incubation peut être réalisée à une température adaptée à la protéine à extraire, notamment pour éviter la dénaturation de celle-ci, notamment à la chaleur. La température peut être adaptée en conséquence par l'homme du métier ; typiquement, pour des protéines non thermostables, elle peut être comprise entre 4 et 40°C et pour les protéines thermostables, 40-90°C.
Le procédé d'extraction de l'invention peut en outre comprendre une étape de séparation, pour obtenir la fraction contenant la protéine recherchée. Il peut s'agir de toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple une centrifigation. A l'issue de l'étape de séparation, une fraction contenant la protéine extraite de la membrane est obtenue.
Avantageusement, à l'issue de l'extraction, la protéine peut être conservée dans une solution comprenant au moins un composé de l'invention. Avantageusement, les composé de l'invention permettent la stabilisation fonctionnelle des protéines, notamment après que celles-ci aient été extraites de leur membrane.
Un autre objet de l'invention se rapporte ainsi à un procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution, c'est-à-dire donc hors de la membrane biologique dans laquelle elles se trouvaiten initialement, dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d'une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de formule (I) de l'invention.
La stabilisation de la protéine peut être une conservation de tout ou partie des propriétés fonctionnelles de celle-ci par rapport à son état natif. Il peut s'agir d'une conservation d'au moins 50% de l'activité de la protéine par rapport à son état natif, ou au moins 60%, ou au moins 70%, ou au moins 80%, ou au moins 90%, ou 100% de cette activité.
Avantageusement, la protéine est ainsi stabilisée à une température comprise de 0°C à 10°C, pendant une durée de temps supérieure à 1 journée, par exemple supérieure à 5 jours, ou supérieure à 10 jours, ou supérieure à 20 jours ou supérieure à 30 jours, ou supérieure à 40 jours.
Les protéines membranaires peuvent avoir été mises en solution par une étape d'extraction au moyen d'un composé de l'invention, tel que défini précédemment, ou au moyen d'une étape d'extraction par un autre détergent, c'est-à-dire un détergent commercial, par exemple le DDM (n-dodecyl β-d- maltoside), le LMNG (lauryl maltose neopentyl glycol), le Triton X100 ou le FA3 (facial amphiphile 3). D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures
La Figure 1 représente la topologie du transporteur ABC BmrA et le cycle de transport de substrats à travers la membrane plasmique. S = substrat ; NBD = nucleotide-binding domain ; ATP = adénosine triphosphate.
La Figure 2 représente les spectres d'absorption des détergents calix[4]aréniques (exemplifié avec le C4C7) comparés à ceux des molécules- clips de l'invention. Les longueurs d'ondes sont exprimées en nm. Panneau A : le spectre d'absorption du DDM (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du C4C7 (1 mM) est représenté en pointillés. Panneau B : le spectre d'absorption du composé 2.3b (1 mM) est représenté en — ; celui du composé 2.3c (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du composé 2.3d (1 mM) est représenté en™ . Panneau C : le spectre d'absorption du composé 3.7e (1 mM) est représenté en - ; celui du composé 3.7f (1 mM) est représenté en ■ ; celui du composé 3.7g (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7h (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7j (1 mM) est représenté en ligne continue. Panneau D : le spectre d'absorption du composé 4.6b (1 mM) est représenté en ^ ; celui du composé 4.6c (1 mM) est représenté en ligne continue ; celui du composé 4.6d (1 mM) est représenté en - Panneau F : le spectre d'absorption du composé 3.9a (1 mM) est représenté en ligne continue. Panneau G : le spectre d'absorption du composé 3.7a (1 mM) est représenté en ; celui du composé 3.7b (1 mM) est représenté en— ; celui du composé 3.7k (1 mM) est représenté en™- ; celui du composé 3.7I (1 mM) est représenté en ligne continue; celui du composé 3.7c (1 mM) est représenté en ·· ; celui du composé 3.7d (1 mM) est représenté en■> >-■>:.
- La Figure 3 (A et B) représente l'interaction des cations divalents avec les molécules de l'invention par opposition aux détergents calix[4]aréniques, ici exemplifié avec le C4C12, et montre l'absence d'interaction des cations divalents avec les molécules de l'invention par opposition aux détergents calix[4]aréniques. L'absorbance est mesurée à 600 nm pour différentes concentrations en MgC (mM). Panneau A : absorption du composé 3.7b aux concentrations 0,45 mM (ronds), 1 ,5 mM (carrés) et 4,5 mM (triangles). Panneau B : absorption du composé 3.7c aux concentrations 0,2 mM (croix), 0,5 mM (ronds), 2 mM (carrés) et 6 mM (triangles). Panneau C : absorption du composé 3.7d aux concentrations 0,0045 mM (ronds), 0,0015 mM (carrés) et 0,045 mM (triangles). Panneau D : absorption du composé 3.7e aux concentrations 0,2 mM (croix), 0,5 mM (ronds), 2 mM (carrés) et 6 mM (triangles). Panneau E : absorption du composé 3.7f aux concentrations 0,006 mM (ronds), 0,02 mM (carrés) et 0,06 mM (triangles). Panneau F : absorption du composé 3.7g aux concentrations 0,003 mM (ronds), 0,01 mM (carrés) et 0,03 mM (triangles). Panneau G : absorption du composé 3.7h aux concentrations 0,003 mM (ronds), 0,01 mM (carrés) et 0,05 mM (triangles). Panneau H : absorption du composé 3.7i aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau I : absorption du composé 3.7j aux concentrations 0,006 mM (ronds), 0,02 mM (carrés) et 0,06 mM (triangles). Panneau J : absorption du composé 3.7k aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau K : absorption du composé 3.7I aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau L : absorption du composé 2.3f aux concentrations 0,24 mM (ronds), 0,8 mM (carrés) et 2,4 mM (triangles). Panneau M : absorption du composé 2.3g aux concentrations 0,03 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 0,3 mM (triangles). Panneau N : absorption du composé 2.3h aux concentrations 0,15 mM (ronds), 0,5 mM (carrés) et 1 ,5 mM (triangles). Panneau O : absorption du composé 4.5c aux concentrations 0,3 mM (ronds), 1 mM (carrés) et 3 mM (triangles). Panneau P : absorption du composé 4.5d aux concentrations 0,15 mM (ronds), 0,5 mM (carrés) et 1 ,5 mM (triangles). Panneau Q : absorption du composé 4.6c aux concentrations
1 ,5 mM (ronds), 5 mM (carrés) et 15 mM (triangles). Panneau R : absorption du composé 4.6d aux concentrations 1 mM (ronds), 3 mM (carrés) et 9 mM (triangles). Panneau S : absorption du composé 3.9a aux concentrations 0,01 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 1 mM (triangles). Panneau T : absorption du composé C4C12 (calixarène) aux concentrations 0,03 mM (ronds), 0,1 mM (carrés) et 0,3 mM (triangles).
La Figure 4 représente la fluorescence (%) du DPH (1 ,6-diphenyl- 1 ,3,5-hexatriene) en présence de concentrations croissantes (0,0001 mM, 0,001 mM, 0,01 mM, 0,1 mM, 1 mM et 10 mM) de clips (composés de l'invention), exemplifié avec les composés #3.7e (C13, points représentés par des carrés) et 3.7f (C18, points représentés par des ronds). L'expérience est réalisée en triplicats. En accord avec Chattopadhyay, A. & London, E ([22]), la CMC correspond à la concentration à partir de laquelle la rupture de pente est constatée, ici 20 μΜ pour 3.7f et 2 mM pour 3.7e (symboles noirs).
La Figure 5 représente la diffusion de la lumière (DLS) de clips, en Intensité (%, colonne A à gauche) et en nombre (%, colonne B à droite), en fonction de la longueur d'onde (nm). Les diamètres estimés sont indiqués sur chaque panneau (colonne A). Colonnes A et B, de haut en bas : composé 3.7c (10 mM, 5xCMC), composé 3.7d (10 mM, 5xCMC), composé 3.7e (2 mM, 5xCMC), composé 3.7f (10 mM, 500xCMC), composé 3.7h (1 mM, 100xCMC), composé 3.7j (2 mM, 100xCMC), composé 3.9a (1 mM, 50xCMC).
La Figure 6 représente l'extraction des protéines membranaires BmrA (panneaux A et C) et AcrB (panneaux B et D) à l'aide de détergents commerciaux et des molécules de l'invention (panneaux A et B, de gauche à droite : SDS, DDM, FC12, TX100, composés de l'invention 1 .4, 1 .5, 2.3a, 2.3b, 2.3c, 2.3d, 2.3e, 2.3f, 2.3g, 2.3h, 2.3i, 3.7a, 3.7b ; panneau C : composés de l'invention 3.7c 0,8%, 3.7d 0,16%, 3.7e 0,8%, 3.7f 0,3%, 3.7g 0,4%, 3.7h 0,2%, 3.7i 0,07%, 3.7j 0,09%, 3.7k, 3.7I 0,25%, 3.9a, 4.5a, 4.5b, 4.5c, 4.5d 0,34%, 4.6a, 4.6b, 4.6c, 4.6d, 5.3a, 5.3b, 5.3c 0,3%, 5.3d 0,3% ; panneau D : 3.7c, 3.7d, 3.7e, 3.7f, 3.7h, 3.7i 0,1 %, 3.7j, 3.7k, 3.7I, 3.9a, 4.5a, 4.5b, 4.5c, 4.5d, 4.6a, 4.6b, 4.6c, 4.6d . Les détergents sont ajoutés à 10 g/L (1 %) sauf indication. L'équivalent de 20 g de protéines de la fraction extraite après centrifugation 100 000xg 30 min est déposé sur SDSPAGE 10%, coloré au bleu de Coomassie après migration. BmrA migre sous sa forme monomérique à hauteur de la bande de 55 kDa ; AcrB migre sous forme monomérique à hauteur de 100 kDa. SDS = dodécyle sulfate de sodium ; DDM = β-D-dodécyle maltoside ; FC12= foscholine 12 ; TX100= triton X-100.
La Figure 7 représente l'effet des détergents de l'invention sur la fonctionnalité de BmrA (activité ATPasique, %). La fraction membranaire enrichie en BmrA (-25%) diluée à 2 g/L est additionnée des composés aux concentrations (mM) indiquées (panneau A, de haut en bas : 3.7e 10,7 mM, 3.7e 8,6 mM, 3.7e 6,4 mM, 3.7e 4,3 mM, 3.7e 2,2 mM, 3.7e 1 ,1 mM, 3.7d 4 mM, 3.7d 3 mM, 3.7d 2 mM, 3.7d 1 mM, 3.7d 0,8 mM, 3.7d 0,6 mM, 3.7d 0,05 mM, 3.7d 0,03 mM, 3.7d 0,02 mM, 3.7c 13 mM, 3.7c 10,4 mM, 3.7c 10 mM, 3.7b 1 ,5 mM, 3.7b 0,7 mM, 3.7b 0,5 mM, 2.3gNa2 20,5 mM, 2.3gK2 19,3 mM, 2.3f 21 ,1 mM, 2.3e 22 mM, 2.3d 23,2 mM, 2.3a 3,2 mM, 1 .5a 22 mM, DDM 20 mM, DDM 2mM, DDM 10 mM, DDM 2mM, DDM 1 mM, LMNG 10 mM, LMNG 1 mM, LMNG 0,1 mM, LMNG 0,01 mM, FA3 27 mM, FA3 9 mM, FA3 2 mM, FA3 1 mM, TX100 16 mM ; panneau B de haut en bas : composés de l'invention 5.3d 3,2 mM, 5.3c 3,3 mM, 5.3b 1 1 ,7 mM, 5.3b 2,9 mM, 5.3a 3 mM, 4.6c 14,6 mM, 4.6b 15,2 mM, 4.5c 18,6 mM, 4.5b 19,6 mM, 3.9a 8 mM, 3.9a 0,51 mM, 3.9a 0,31 mM, 3.9a 0,1 1 mM, 3.7I 12,01 mM, 3.7I 6,01 mM, 3.7I 3mM, 3.7I 1 mM, 3.7k 10 mM, 3.7k 3 mM, 3.7j 3 mM, 3.7j 2 mM, 3.7j 1 mM, 3.7j 0,6 mM, 3.7j 0,03 mM, 3.7j 0,02 mM, 3.7j 1 mM, 3.7i 0,3 mM, 3.7h 3 mM, 3.7h 2 mM, 3.7h 1 mM, 3.7h 0,6 mM, 3.7h 0,58 mM, 3.7h 0,5 mM, 3.7h 0,35 mM, 3.7h 0,1 mM, 3.7h 0,5 mM, 3.7h 0,35 mM, 3.7h 0,1 mM, 3.7h 0,05 mM, 3.7h 0,03 mM, 3.7h 0,02 mM, 3.7g 12,5 mM, 3.7g 9 mM, 3.7g 7,5 mM, 3.7g 5 mM, 3.7g 3 mM, 3.7g 1 mM, 3.7f 3,2 mM, 3.7f 2 mM, 3.7f 1 mM, 3.7f 0,061 mM, 3.7f 0,031 mM, 3.7f 0,015 mM). Après incubation 2 h à 4°C, l'activité ATPasique est mesurée. Les solutions sont ensuite centrifugées 1 h à 4°C, 100 000xg et les surnageants déposés sur SDS PAGE 10% (cf Figure 8). Les histogrammes gris et noirs correspondent aux concentrations auxquelles BmrA est partiellement (gris) ou complètement (noir) extrait d'après ces SDSPAGE. L'activité ATPasique est en % par rapport à celle de la protéine sans composé, 0.7 μιτιοΙ ATP hydrolysé/min/mg protéines.
- La Figure 8 représente l'extraction de BmrA testée à différentes concentrations (exprimées en mM et en xCMC) de différents détergents (DDM, LMNG et FA3) et de molécules de l'invention (3.7b, 3.7c, 3.7d, 3.7e, 3.7f, 3.7h, 3.7g, 3.7j, 3.71, 3.9a, 4.3d, 5.3b) comme indiqué dans la Figrure 7. Les fractions totales (T) et solubles (S) des solutions préparées dans la Figure 7 sont déposées sur SDSPAGE 10% après séparation par centrifugation à 100 000xg 30 min, 4°C. DDM = β-D-dodécyle maltoside ; LMNG : lauryl maltoside neopentyl glycol (Chae, P. S. et al. ([6])). FA3= facial amphiphile #3 (Lee, S. C. et al. ([9])).
La Figure 9 représente la stabilité dans le temps de BmrA purifiée en DDM (points représentés par des ronds) et additionnée des composés de l'invention (3.7c, points représentés par des carrés et 3.7g, points représentés par des losanges), ou de FA3 (points représentés par des triangles). L'activité ATPasique (%) est mesurée en fonction des jours d'incubation post-purification, comme expliqué dan l'exemple 13.
- La Figure 10 montre la séparation par chromatographie d'exclusion sur colonne Superdex S200 5/150 de la protéine membranaire ABC BmrA en présence, soit de DDM (tracé en pointillé), soit du composé de l'invention 3.7c (tracé en trait plein). La fraction membranaire a été extraite et purifiée en DDM par affinité métal Ni-NTA et Size-exclusion Superdex 200 avant d'être rechargée sur Ni-NTA pour échanger le DDM soit contre lui- même, soit contre du composé 3.7c. Chapque pool a été ensuite chargé sur une colonne de size-exclusion Superdex S200 5/150 de 3 mL, et élué en présence de 2 CMC du même détergent, comme indiqué. Les protéines sont repérées par absorbance à 280 nm.
- La Figure 1 1 représente la stabilité à la chaleur de la protéine membranaire BmrA en présence de composés de l'invention. A. Thermostabilisation de la BmrA par des détergents et des composés de l'invention (de gauche à droite : DDM, LMNG, 3.7d, 3.7c, 3.7b, 3.7a, 3 .7i, 3.7j, 3.7k, 3.7f et 3.7e. Les fractions membranaires ont été extraites avec DDM 10 mM avec ou sans détergents 1 mM et composés de l'invention, clarifiées et soumises 30 min aux températures indiquées suivies par centrifugation et SDS-PAGE + Western blot des surnageants pour quantifier les protéines membranaires restant (2 -4 expériences). B: exemples avec DDM et 3.7c. EXEMPLES
Exemple 1 : Procédés de préparation des composés de l'invention
Les différents exemples des détergents appartenant à la formule (I) sont préparés selon les protocoles suivants :
Protocole général A: couplage peptidique
D'après Corzana et al, 2006 (Corzana, F. et al. New Insights into a- GalNAc-Ser Motif: Influence of Hydrogen Bonding versus Solvent Interactions on the Preferred Conformation. Journal of the American Chemical Society 128, 14640-14648 (2006) ([15])). A une solution de dérivé d'acide aminé possédant une fonction acide carboxylique libre (1 équiv.) dans le DMF anhydre (15 mL/mmol) sont ajoutés l'acide aminé possédant une fonction amine libre ou sous forme de sel de tosylate (2 équiv.), la DIEA (5 équiv.) et le TBTU (1 ,2 équiv.). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte et à TA pendant 3 h. Après ajout d'eau (15 mL/mmol), le milieu réactionnel est extrait à l'éther éthylique. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par de l'eau distillée et une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général B1 : déprotection du groupement Fmoc
A une solution d'amine protégée sous forme de Fmoc (1 équiv.) dans du CH2CI2 anhydre (20 mL/mmol) est ajoutée la diéthylamine (20 équiv.). Après une nuit d'agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2. Cette solution est lavée avec une solution saturée de NaHCO3, séchée sur K2CO3 puis concentrée sous vide.
Protocole général B2 : déprotection du groupement Fmoc
Protocole identique à B1 , excepté la diéthylamine qui est remplacée par la pipéridine.
Protocole général C : formation d'amides
A une solution d'amine déprotégée (1 équiv.) dans du CH2CI2 anhydre (30 mL/mmol) sont ajoutés un chlorure d'acide (2 équiv.), la DMAP (0,5 équiv.) et la pyridine (34 équiv.). Après une nuit d'agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est acidifié (pH = 3) par ajout d'une solution aqueuse de HCI 10 %. Le milieu réactionnel est extrait au CH2CI2. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général D1 : hydrogénation catalvtique
A une solution d'ester de benzyle (1 équiv.) dans du MeOH (100 mL/mmol) est ajouté le Pd/C 10 % (200 mg/mmol). Après 4 h à une nuit d'agitation sous H2 et à TA, le milieu réactionnel est filtré sur Célite® puis concentré sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l'étape suivante sans purification. Dans le cas des détergents PEGylés, le résidu est lavé par du cyclohexane et/ou CH2CI2.
Protocole général D2 : hydrogénation catalvtique
A une solution d'ester de benzyle (1 équiv.) dans du THF (30 mL/mmol) est ajouté le Pd/C 5 % (120 mg/mmol). Après une nuit d'agitation sous H2 et à TA, le milieu réactionnel est filtré sur Célite® puis concentré sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l'étape suivante sans purification. Protocole général E : déprotection du groupement tert-butyl (fBu)
D'après Christensen et al., 2005 (Christensen, C. A. & Meldal, M. Efficient solid-phase synthesis of peptide-based phosphine ligands: towards combinatorial libraries of sélective transition métal catalysts. Chemistry 1 1 , 4121 -4131 , doi:10.1002/chem.200500105 (2005) ([16])). A une solution d'alcool protégé sous forme d'éther i-butylique (1 équiv.) dans du CH2CI2 (12 mL/mmol) est ajouté à 0°C l'acide trifluoroacétique TFA (4 mL/mmol). Après une nuit d'agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2 puis une solution aqueuse de NaOH 2 M est ajoutée (pH = 1 1 -12). La phase aqueuse est lavée par de l'AcOEt puis acidifiée par une solution concentrée de HCI (pH = 1 -2) avant d'être extraite par l'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est lavé par du CH2CI2 pour éliminer l'acide gras restant.
Protocole général F : déprotection des esters de méthyle ou d'éthyle
A une solution d'acide protégé sous forme d'ester de méthyle ou d'éthyle (1 équiv.) dans du THF (10,4 mL/mmol) est ajoutée une solution de LiOH (5 équiv.) dans l'eau (10,4 mL/mmol). Le milieu réactionnel est agité 4 h à TA. Après ajout d'une solution aqueuse de HsPO4 5 % (pH = 1 -2), le milieu réactionnel est extrait à l'AcOEt (à moins que le composé souhaité précipite, dans ce cas, il est lavé avec de l'eau distillée préalablement refroidie). Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aqueuse saturée de NaCI, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié par chromatographie sur colonne en phase inverse C18 (éluant : H2O puis MeOH).
Protocole général G : déprotection des groupements Boc
A une solution d'amine protégée par un groupement Boc (1 équiv.) dans le CH2CI2 anhydre (5 mL/g) est ajoutée, à 0°C, le TFA (2,5 mL/g). Après 4-5 h d'agitation à TA et sous N2, le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est repris dans du CH2CI2 et une solution aqueuse de NaOH (2 M) est ajoutée (pH = 1 1 -12). La phase aqueuse est lavée par AcOEt, acidifiée par une solution concentrée de HCI (pH = 1 -2), lavée par du CH2CI2 puis extraite par AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut obtenu est directement utilisé dans l'étape suivante sans purification.
Protocole général I : cvcloaddition de Huisqen
D'après Munteanu et al., 2008 (Munteanu, M., Choi, S. & Ritter, H. Cyclodextrin Methacrylate via Microwave-Assisted Click Reaction. Macromolecules 41 , 9619-9623 (2008) ([18])). A une solution d'alcyne (1 équiv.), d'azido-saccharide protégé sous forme d'acétate ou azido-PEG (1 - 1 ,5 équiv.), de CuSO4.5H2O (0,1 équiv.) et d'ascorbate de sodium (0,2 équiv.) dans le DMF (6 mL/mmol) sont ajoutées quelques gouttes d'eau. Le milieu réactionnel est agité sous irradiation micro-onde à 140°C pendant 1 h. Après ajout d'eau, le milieu réactionnel est extrait à l'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées puis concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Protocole général J : réaction de désacétylation
D'après Chae, P.S. et al., 2010 ([6]). A une solution de dérivé saccharidique protégé sous forme d'acétate (1 équiv.) dans du MeOH (16,7 mL/mmol) est ajouté MeONa (0,2 équiv.). Après une nuit d'agitation à TA, la résine échangeuse de proton (Dowex-H+) est ajoutée et le milieu réactionnel est agité 30 min. avant d'être filtré. Le filtrat est concentré sous vide et le produit brut obtenu est utilisé directement dans l'étape suivante sans purification.
Protocole général K : formation des sels de carboxylate (Na, K)
A une solution d'acide carboxylique (1 équiv.) dans un minimum de MeOH est ajouté MeONa ou MeOK (1 équiv. par fonction carboxylate à salifier). Après 5 min. d'agitation, le solvant est évaporé et le produit final est récupéré sous forme de solide. Protocole général L : déprotection trityle et couplage thiol-ène
A une suspension de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH (1 équiv.) dans du CH2CI2 (10 mL/g) en présence de EtsSiH (1 ,5 équiv.), est ajouté à 0°C du TFA (5 mL/g). Après 3 h d'agitation, le milieu réactionnel est concentré sous vide pour donner un solide gris. Ce résidu, l'alcène (1 ,2 équiv.) et le photoinitiateur DMPA (0,5 équiv.) sont dissous dans du THF (7,5 mL/g). Le milieu est agité 3 h à TA et sous UV. Après concentration sous vide, le produit brut est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice.
Exemple 2 : Exemple de composés 1.1 à 1.5
Figure imgf000026_0001
i. CH3(CH2)iiNH2, TBTU, DIEA, DMF; ii. Pipéridine/DMF 20:80; iii. Acrylate d'éthyle, MeOH ; iv. Acrylate de benzyle, 70°C ; v. LiOH, THF, H2O, TA ; vi. TFA, CH2CI2, TA ; vii. H2, Pd/C 10%, MeOH. Composé 1 .1
Figure imgf000027_0001
A une solution de Fmoc-Ser(fBu)-OH (3,0 g, 7,82 mmol, 1 équiv.) dans le DMF (300 ml_) sont ajoutés le dodécylamine (2,9 g, 15,64 mmol, 2 équiv.) puis la DIEA (6,8 ml_, 39,1 1 mmol, 5 équiv.) et le TBTU (3,01 g, 9,38 mmol, 1 ,2 équiv.). Après 4 h d'agitation à TA, le milieu réactionnel est concentré sous vide et dilué par l'éther. La phase organique est lavée successivement par une solution saturée de NaCI, une solution d'HCI (0,1 N) puis par une solution de NaHCO3 (5 %) avant d'être séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est repris dans un mélange pipéridine/DMF (20:80, 300 mL). Après 1 h d'agitation à TA, le milieu réactionnel est ensuite concentré sous vide. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2/MeOH 98:2) pour donner le composé attendu (2,44 g, 7,43 mmol, 95 %) sous forme d'une huile jaune. Rf = 0,45 (CH2CI2/MeOH 95:5) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1 ,20 (s, 9H), 1 ,26-1 ,35 (m, 22H), 3,25 (q, J = 4,4 Hz, 2H), 3,42-3,51 (m, 2H), 3,62 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1 H), 7,39 (m, 1 H) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,4 (CH3), 23,0 (CH2), 27,3 (CH2), 27,8 (3xCH3), 29,6 (2xCH2), 29,9 (3xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,8 (CH2), 39,4 (CH2), 55,7 (CH), 64,3 (CH2), 73,7 (C), 173,2 (C) ; Masse (ESI+) : m/z (%) 329 [M+H]+ (100).
Composé 1 .2
Figure imgf000027_0002
A une solution d'intermédiaire 1 .1 (1 ,06 g, 3,22 mmol, 1 équiv.) dans le méthanol (3,5 ml) est ajouté l'acrylate d'éthyle (1 ,37 ml, 12,9 mmol, 2,5 équiv.). Le mélange a été purgé à l'azote, couvert de papier aluminium et agité pendant 5 jours à TA. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2/MeOH 95:5) pour donner le composé attendu (1 ,24 g, 2,90 mmol, 83 %) sous forme d'une huile jaune. Rf = 0.56 (CH2CI2/MeOH 98:2) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,13 (s, 9H), 1 ,22-1 ,25 (m, 25H), 1 ,46-1 ,49 (m, 2H), 2,04 (m, 1 H), 2,44 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,79-2,83 (m, 2H), 3,16 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1 H), 3,20 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 3,29 (t, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,62 (dd, J = 4,0, 4,0 Hz, 1 H), 4,12 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,46 (t, J = 4,8 Hz, 1 H) ; RMN 13C (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 14,4 (CH3), 22,8 (CH2), 27,1 (CH2), 27,7 (3xCH3), 29,5-29,8 (7xCH2), 32,1 (CH2), 35,0 (CH2), 39,2 (CH2), 44,0 (CH2), 60,7 (CH2), 62,6 (CH), 63,5 (CH2), 73,5 (C), 172,0 (C), 172,7 (C) ; Masse (ESI+) : m/z (%) 429 [M+H]+ (100) ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C24H49N2O4 429,3692, trouvée 429,3696.
Composé 1 .3
Figure imgf000028_0001
Une solution d'intermédiaire 1 .2 (1 ,40 g, 3,26 mmol, 1 équiv.) et d'acrylate de benzyle (1 ,32 g, 8,16 mmol, 2,5 équiv.) est agitée à 70°C pendant 7 jours puis le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le produit brut obtenu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (CH2CI2 100%) pour donner le composé attendu (640 mg, 1 ,07 mmol, 33 %) sous forme d'une huile jaune. Rf = 0,47 (CH2CI2/MeOH 98:2) ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,80 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,10 (s, 9H), 1 ,13-1 ,25 (m, 22H), 1 ,40 (m, 2H), 2,30-2,52 (m, 4H), 2,87-3,04 (m, 4H), 3,09 (q, J = 6,4 Hz, 2H), 3,38 (dd, J = 8,8, 4,4 Hz, 1 H), 3,57 (ddd, J = 19,2, 12,8, 3,2 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 6,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,04 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 5,04 (s, 2H), 7,23-7,33 (m, 5H), 7,51 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), ; RMN 13C (400 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 14,2 (CH3), 22,7 (CH2), 27,0 (CH2), 27,5 (3xCH3), 29,4-29,7 (7xCH2), 31 ,9 (2xCH2), 33,5 (CH2), 39,2 (CH2), 47,0 (2xCH2), 60,0 (CH2), 60,4 (CH2), 65,1 (CH), 66,3 (CH2), 73,3 (C), 128,3-128,6 (5xCH), 136,3 (C), 171 ,6 (C), 172,4 (C), 172,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 613 (46) [M+Na]+, 591 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour
Figure imgf000029_0001
591 ,4373, trouvée 591 ,4384. Composé 1 .4
Figure imgf000029_0002
Le composé 1 .4 (huile jaune, 17 mg, 0,05 mmol, 38 %) a été obtenu à partir du composé 1 .2 (59 mg, 0,13 mmol) en suivant les protocoles généraux F puis K (sans toutefois effectuer les lavages acido-basiques) ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,64 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 1 ,06-1 ,07 (m, 18H), 1 ,27-1 ,31 (m, 2H), 2,55 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,04-3,05 (m, 2H), 3,60 (dd, J = 8,0, 8,0 Hz, 1 H), 3,69-3,77 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,3 (CH3), 23,6 (CH2), 27,4 (CH2), 27,8 (CH2), 30,1 (CH2), 30,2 (CH2), 30,3 (CH2), 30,5 (CH2), 30,6 (3xCH2), 32,9 (CH2), 40,8 (CH2), 43,5 (CH2), 60,4 (CH), 60,9 (CH2), 167,0 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 345 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour Οι8Η37Ν2Ο4 345,2747, trouvée 345,2746.
Composé 1 .5
Figure imgf000029_0003
Le composé 1 .5 (huile jaune, 147 mg, 0,35 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 1 .3 (300 mg, 0,50 mmol) en suivant les protocoles généraux D1 , F puis K (sans toutefois effectuer les lavages acido-basiques) ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, 3H, J = 8,0 Hz), 1 ,22-1 ,37 (m, 22H), 1 ,53-1 ,57 (m, 2H), 2,90 (t, J = 8,0 Hz, 4H), 3,18-3,29 (m, 3H), 3,64 (m, J = 8,0 Hz, 4H), 4,08 (t, J = 4,0 Hz, 1 H), 4,16-4,18 (m, 1 H), 8,42 (t, J = 4,0 Hz, NH); RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,5 (CH3), 17,9 (CH2), 23,8 (CH2), 24,3 (CH2), 28,1 (CH2), 29,8 (CH2), 30,2 (CH2), 30,5 (CH2), 30,6 (CH2), 30,8 (2xCH2), 33,2 (2xCH2), 41 ,0 (CH2), 54,9 (2xCH2), 59,4 (CH), 69,2 (CH2), 173,8 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 417 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C2iH4iN2O6 417,2959, trouvée 417,2956.
Exemple 3: Composés 2.1 à 2.3
Figure imgf000030_0001
i. TBTU, DIEA, DMF ; ii. Et2NH, CH2CI2 ; Ni. RCOCI, DMAP, pyridine, CH2CI2 ; iv. RCOOH, TBTU, DIEA, DMF ; v. H2, Pd/C, MeOH ; vi. TFA, CH2CI2. Exemple 2.1 a
Figure imgf000030_0002
Le composé 2.1 a (solide blanc, 2,95 g, 4,34 mmol, 83%) a été obtenu à partir des composés commerciaux Fmoc-L-Ser(f-Bu)-OH (2,00 g, 5,22 mmol) et H-D-Asp(OBn)-OBn.p-tosylate (5,07 g, 10,43 mmol) en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,32 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 1 15-1 17 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1 ,15 (s, 9H), 2,82-2,96 (m, 1 H), 3,06 (dd, J = 17,1 , 4,6 Hz, 1 H), 3,38 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1 H), 3,74-3,77 (m, 1 H), 4,19-4,26 (m, 2H), 4,35- 4,37 (m, 2H), 4,88-4,93 (m, 1 H), 5,01 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 5,74 (d, J = 3,6 Hz, 1 H), 7,25-7,34 (m, 12H, H3"), 7,38 (dd, J = 7,5, 7,5 Hz, 2H), 7,59-7,61 (m, 2H), 7,65 (d, J = 6,3 Hz, 1 H), 7,74 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,5 (3xCH3), 36,6 (CH2), 47,3 (CH), 49,0 (CH), 54,8 (CH), 61 ,7 (CH2), 66,9 (CH2), 67,3 (CH2), 67,7 (CH2), 74,4 (C), 120,1 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 128,4 (CH), 128,5 (CH), 128,6 (CH), 128,6 (CH), 128,7 (CH), 135,3 (C), 135,5 (C), 141 ,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,2 (C), 170,3 (2xC), 170,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z {%) 426 (100), 701 (60) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C 0H43N2O8 679,3019, trouvée 679,3013. Exemple 2.1 b
Figure imgf000031_0001
Le composé 2.1 b (solide blanc, 5,14 g, 7,42 mmol, 81 %) a été obtenu à partir des composés commerciaux Fmoc-L-Ser(f-Bu)-OH (3,5 g, 9,12 mmol) et H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (9 g, 18,24 mmol) en suivant le protocole général A (modification : après ajout d'eau, le composé souhaité précipite et a été purifié par recristallisation dans un mélange CH2CI2/Et2O).
Rf = 0,50 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 126-128 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1 ,19 (s, 9H), 1 ,99-2,1 1 (m, 1 H), 2,22-2,35 (m, 1 H), 2,32- 2,55 (m, 2H), 3,41 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1 H), 3,75-3,87 (m, 1 H), 4,23 (t, J = 7,1 Hz, 1 H), 4,24-4,33 (m, 1 H), 4,40 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,68-4,76 (m, 1 H), 5,09 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 5,78 (bs, 1 H), 7,21 -7,46 (m, 15H), 7,61 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 30,0 (CH2), 47,1 (CH), 51 ,8 (CH), 54,6 (CH), 61 ,7 (CH2), 66,5 (CH2), 67,2 (CH2), 67,4 (CH2), 74,3 (C), 120,0 (2xCH), 125,1 (2xCH), 127,1 (2xCH), 127,7 (2xCH), 128,2-128,7 (10xCH), 135,1 (C), 135,7 (C), 141 ,3 (2xC), 143,7 (2xC), 156,1 (C), 170,1 (C), 171 ,2 (C), 172,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 426 (100), 570 (3), 715 (1 ) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C iH45N2O8693,3176, trouvée 693,3156.
Exemple 2.2a
Figure imgf000032_0001
Le composé 2.2a (solide blanc, 105 mg, 0,16 mmol, 27%) a été obtenu à partir du composé 2.1 a en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,30 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 59-61 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,16 (s, 9H), 1 ,18-1 ,36 (m, 20H), 1 ,56- 1 ,67 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 17,1 , 4,7 Hz, 1 H), 3,07 (dd, J = 17,1 , 4,7 Hz, 1 H), 3,27 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz, 1 H), 3,79 (dd, J = 8,6, 4,1 Hz, 1 H), 4,43-4,50 (m, 1 H), 4,87-4,93 (m, 1 H), 5,06 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,36 (d, J = 6,3 Hz, 1 H, NH), 7,26-7,38 (m, 10H), 7,60 (d, J = 8,1 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,4 (3xCH3), 29,4-29,8 (8xCH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 36,7 (CH2), 48,9 (CH), 53,1 (CH), 61 ,3 (CH2), 66,9 (CH2), 67,6 (CH2), 74,3 (C), 128,5-128,8 (10xCH), 135,3 (C), 135,5 (C), 170,3 (C), 170,6 (C), 170,6 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 690 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H59N2O7 667,4322, trouvée 667,4318.
Exemple 2.2b
Figure imgf000032_0002
Le composé 2.2b (solide blanc, 67 mg, 0,1 1 mmol, 39 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,35 (7:3 cyclohexane/AcOEt) ; Tf = 86°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1 ,17 (s, 9H), 1 ,23-1 ,38 (m, 8H), 1 ,57- 1 ,72 (m, 2H), 1 ,98-2,1 1 (m, 1 H), 2,19-2,35 (m, 3H), 2,35-2,53 (m, 2H), 3,38 (t, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 8,8, 4,2 Hz, 1 H), 4,53-4,60 (m, 1 H), 4,67- 4,75 (m, 1 H), 5,10 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,66 (d, J = 6,9 Hz, 1 H, NH), 7,27- 7,38 (m, 10H), 7,45 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,6 (2xCH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29.0-30.0 (3xCH2), 31 ,7 (CH2), 36,6 (CH2), 51 ,8 (CH), 53,0 (CH), 61 ,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,41 (CH2), 74,4 (3xCH3), 128,3-128,7 (10xCH), 135,1 (C), 135,8 (C), 170,36 (C), 171 ,23 (C), 172,34 (C), 173,34 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 597 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C34H49N2O7 597,3540, trouvée 597,3538.
Exemple 2.2c
Figure imgf000033_0001
Le composé 2.2c (solide blanc, 69 mg, 0,1 1 mmol, 39 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,38 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 91 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,17 (s, 9H), 1 ,22-1 ,38 (m, 10H), 1 ,56- 1 ,70 (m, 2H), 1 ,98-2,10 (m, 1 H), 2,18-2,34 (m, 3H), 2,36-2,53 (m, 2H), 3,41 (t, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,76 (dd, J = 8,9, 4,1 Hz, 1 H), 4,57-4,64 (m, 1 H), 4,68- 4,76 (m, 1 H), 5,09 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 6,75 (d, J = 6,9 Hz, 1 H, NH), 7,26- 7,38 (m, 10H), 7,53 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (2xCH2), 27,5 (3xCH3), 27,7 (CH2), 29.3-30.1 (4xCH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51 ,9 (CH), 53,1 (CH), 61 ,4 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 74,5 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 170,5 (C), 171 ,3 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 633 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H5iN2O7 61 1 ,3696, trouvée 61 1 ,3681 .
Exemple 2.2d
Figure imgf000034_0001
Le composé 2.2d (solide blanc, 195 mg, 0,31 mmol, 45 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,18 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 82-85 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,16 (s, 9H), 1 ,19-1 ,35 (m, 12H), 1 ,55- 1 ,66 (m, 2H), 1 ,96-2,07 (m, 1 H), 2,21 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,21 -2,30 (m, 1 H), 2,32-2,50 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1 H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1 H), 4,44-4,50 (m, 1 H), 4,65-4,72 (m, 1 H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,40 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, NH), 7,27-7,36 (m, 1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 14,1 (CH3), 22,7 (2xCH2), 25,6 (CH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29,3-29,44 (4xCH2), 30,0 (CH2), 31 ,9 (CH2), 36,6 (CH2), 51 ,8 (CH), 53,0 (CH), 61 ,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,3 (CH2), 74,3 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,4 (C), 171 ,2 (C), 172,3 (C), 173,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 626 (30) [M+H]+, 648 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C36H53N2O7 625,3853, trouvée 625,3846.
Exemple 2.2e
Figure imgf000034_0002
Le composé 2.2e (solide blanc, 182 mg, 0,28 mmol, 48 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,12 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 67-69°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,17 (s, 9H), 1 ,19-1 ,35 (m, 16H), 1 ,56- 1 ,67 (m, 2H), 1 ,96-2,08 (m, 1 H), 2,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,21 -2,32 (m, 1 H), 2,32-2,50 (m, 2H), 3,30 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1 H), 3,81 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1 H), 4,42-4,49 (m, 1 H), 4,64-4,72 (m, 1 H), 5,09 (s, 2H), 5,16 (s, 2H), 6,38 (d, J = 6,3 Hz, 1 H, NH), 7,23-7,39 (m, 1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CHs), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,5 (3xCH3), 27,6 (CH2), 29,4-29,7 (6xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51 ,9 (CH), 53,1 (CH), 61 ,4 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 74,4 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 170,4 (C), 171 ,3 (C), 172,4 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 131 (30), 199 (40), 654 (50) [M+H]+, 677 (100), 699 (20) ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssHs/NbO/ 653,4166, trouvée 653,4158.
Exemple 2.2f
Figure imgf000035_0001
Le composé 2.2f (solide blanc, 233 mg, 0,35 mmol, 50 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,24 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 68-71 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,17 (s, 9H), 1 ,20-1 ,36 (m, 18H), 1 ,55- 1 ,67 (m, 2H), 1 ,96-2,08 (m, 1 H), 2,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,21 -2,32 (m, 1 H), 2,32-2,50 (m, 2H), 3,31 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1 H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1 H), 4,44-4,50 (m, 1 H), 4,63-4,73 (m, 1 H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,41 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, NH), 7,25-7,37 (m, 1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CHs), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 29,3-29.7 (7xCH2), 29,9 (CH2), 31 ,9 (CH2), 36,5 (CH2), 51 ,8 (CH), 53,0 (CH), 61 ,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,3 (CH2), 74,2 (C), 128,3-128,6 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,4 (C), 171 ,2 (C), 172,3 (C), 173,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 668 (20) [M+H]+, 690 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H59N2O7 667,4322, trouvée 667,4334.
Exemple 2.2g
Figure imgf000036_0001
Le composé 2.2g (solide blanc, 187 mg, 0,27 mmol, 48 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C.
Rf = 0,07 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 71 -73°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,17 (s, 9H), 1 ,20-1 ,36 (m, 20H), 1 ,56- 1 ,67 (m, 2H), 1 ,97-2,08 (m, 1 H), 2,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,23-2,50 (m, 3H), 3,29 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1 H), 3,80 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1 H), 4,41 -4,49 (m, 1 H), 4,63-4,72 (m, 1 H), 5,09 (s, 2H), 5,14 (d, J = 12,3 Hz, 1 H), 5,18 (d, J = 12,3 Hz, 1 H), 7,25-7,39 (m, 1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,5 (3xCH3), 27,6 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,0 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 51 ,9 (CH), 53,1 (CH), 61 ,4 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 74,4 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,5 (C), 171 ,3 (C), 172,4 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 131 (65), 199 (100), 682 (60) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C40H6iN2O7 681 ,4479, trouvée 681 ,4447. Exemple 2.2h
Figure imgf000036_0002
Le composé 2.2h (solide blanc, 93 mg, 0,13 mmol, 30 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant les protocoles généraux B puis C. Rf = 0,1 1 (cyclohexane/AcOEt 8:2) ; Tf = 69-71 °C ; RMN 1 H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,15 (s, 9H), 1 ,19-1 ,31 (m, 24H), 1 ,56-1 ,63 (m, 2H), 1 ,96-2,05 (m, 1 H), 2,19 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,23-2,47 (m, 3H), 3,27 (dd, J = 8,7, 8,7 Hz, 1 H), 3,79 (dd, J = 8,7, 4,2 Hz, 1 H), 4,41 -4,45 (m, 1 H), 4,63- 4,68 (m, 1 H), 5,07 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 7,22-7,37 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,9 (CH2), 25,7 (CH2), 27,6 (3xCH3), 27,7 (CH2), 29,5-30,2 (1 1 xCH2), 32,1 (CH2), 36,8 (CH2), 52,0 (CH), 53,2 (CH), 61 ,5 (CH2), 66,7 (CH2), 67,6 (CH2), 74,6 (C), 128,5-128,9 (1 OxCH), 135,3 (C), 136,0 (C), 170,5 (C), 171 ,4 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 199 (15), 710 (100) [M+H]+, 732 (15) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C 2H65N2O7 709,4792, trouvée 709,4805.
Exemple 2.2i
Figure imgf000037_0001
Le composé 2.2i (solide blanc, 162 mg, 0,24 mmol, 83 %) a été obtenu à partir du composé 2.1 b en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3)
Rf = 0,28 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 70-72°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1 ,15 (s, 9H), 1 ,94-2,06 (m, 1 H), 2,17-2,29 (m, 1 H), 2,29-2,48 (m, 2H), 3,29 (dd, J = 8,6, 8,6 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 8,6, 4,1 Hz, 1 H), 4,39- 4,48 (m, 1 H), 4,60-4,71 (m, 1 H), 5,06 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,36 (d, J = 6,4 Hz, 1 H, NH), 7,22-7,35 (m, 1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 13,1 (st, JC,D = 18,6 Hz, CD3), 21 ,4 (qt, JC,D = 18,4 Hz, CD2), 24,5 (qt, JC,D = 19,2 Hz, CD2), 27,4 (3xCH3), 27,5 (CH2), 27,2-28,8 (6xCD2), 30,0 (CH2), 30,5 (qt, J = 18,7 Hz, CD2), 35,7 (qt, J = 19,5 Hz, CD2), 51 ,8 (CH), 53,0 (CH), 61 ,4 (CH2), 66,5 (CH2), 67,4 (CH2), 74,3 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 170,4 (C), 171 ,2 (C), 172,3 (C), 173,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 199 (40), 265 (100), 677 (80) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C38H34D23N2O7 676,5610, trouvée 676,5610.
Exemple 2.3a
Figure imgf000038_0001
Le composé 2.3a (solide blanc, 55 mg, 0,13 mmol, 98 %) a été obtenu à partir du composé 2.2a en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 125-135°C ; RMN 1 H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,2 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,42 (m, 20H), 1 ,54-1 ,71 (m, 2H), 2,23-2,33 (m, 2H), 2,76-2,93 (m, 2H), 3,71 -3,83 (m, 2H), 4,47 (dd, J = 5,4, 5,4 Hz, 1 H), 4,74 (dd, J = 5,4, 5,4 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 30,4-30,9 (8xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 37,0 (CH2), 50,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2), 172,2 (C), 174,3 (C), 176,5 (C), 176.5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2iH37N2O7 429,2601 , trouvée 429,2591 . Exemple 2.3b
Figure imgf000038_0002
Le composé 2.3b (solide incolore hygroscopique, 27 mg, 0,07 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2b en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 39-40°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,23-1 ,39 (m, 8H), 1 ,57-1 ,67 (m, 2H), 1 ,90-2,02 (m, 1 H), 2,16-2,32 (m, 3H), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,72-3,84 (m, 2H), 4,42-4,50 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,1 -31 ,1 (3xCH2), 32,8 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2), 172,6 (C), 175,0 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 360 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ci6H27N2O7 359,1818, trouvée 359,1803.
Exemple 2.3c
Figure imgf000039_0001
Le composé 2.3c (solide incolore hygroscopique, 31 mg, 0,08 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2c en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 46°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,40 (m, 10H), 1 ,56-1 ,68 (m, 2H), 1 ,90-2,02 (m, 1 H), 2,15-2,32 (m, 3H), 2,40 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 3,73-3,83 (m, 2H), 4,43-4,50 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2- 31 ,1 (4xCH2), 33.0 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,7 (CH), 63,0 (CH2), 172,6 (C), 175,1 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 373 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ci7H29N2O7 373,1975, trouvée 373,1992.
Exemple 2.3d
Figure imgf000039_0002
Le composé 2.3d (solide blanc, 182 mg, 0,47 mmol, 94 %) a été obtenu à partir du composé 2.2d en suivant les protocoles généraux D1 puis K. Tf = 53-57°C; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,38 (m, 12H), 1 ,56-1 ,69 (m, 2H), 1 ,90-2,03 (m, 1 H), 2,14-2,26 (m, 1 H), 2,29 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 3,73-3,84 (m, 2H), 4,42-4,52 (m, 2H). RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,3-30,5 (4xCH2), 31 ,1 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,5 (C), 174,9 (C), 176,5 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 387 (100) [M-H]", 404 (20) ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ci8H3iN2O7 387,2131 , trouvée 387,2140. Exemple 2.3e
Figure imgf000040_0001
Le composé 2.3e (solide blanc, 1 ,683 g, 4,04 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 2.2e en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 100-102°C ; RMN 1 H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,38 (m, 16H), 1 ,57-1 ,67 (m, 2H), 1 ,91 -2,01 (m, 1 H), 2,15-2,26 (m, 1 H), 2,29 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,37-2,44 (m, 2H), 3,72-3,81 (m, 2H), 4,43-4,51 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,7 (6xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 53,1 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,6 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%)157 (40), 199 (30), 387 (80), 415 (100) [M-H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2oH35N2O7 415,2444, trouvée 415,2447. Exemple 2.3f
Figure imgf000040_0002
Le composé 2.3f (solide blanc, 1 15 mg, 0,27 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 2.2f en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 58-63°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,41 (m, 16H), 1 ,54-1 ,68 (m, 2H), 1 ,90-2,04 (m, 1 H), 2,14-2,27 (m, 1 H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,48 (m, 2H), 3,71 -3,83 (m, 2H), 4,43-4,53 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,8 (CH2), 30,3-30,9 (7xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2), 53,1 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,6 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 429 (100) [M-H]-, 446 ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2i Η37Ν2Ο7 429,2601 , trouvée 429,2599.
Exemple 2.3q
Figure imgf000041_0001
Le composé 2.3g (solide blanc, 57 mg, 0,13 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 2.2g en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 109-1 12°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,39 (m, 20H), 1 ,57-1 ,67 (m, 2H), 1 ,90-2,02 (m, 1 H), 2,16-2,26 (m, 3H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,45 (m, 2H), 3,71 -3,84 (m, 2H), 4,43-4,52 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,9 (8xCH2), 31 ,1 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2), 53,3 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,9 (C), 176,5 (C), 176,5 (C). Masse (ESI-) m/z (%) 443 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C22H39N2O7 443,2757, trouvée 443,2754.
Exemple 2.3h
Figure imgf000041_0002
Le composé 2.3h (solide blanc, 36 mg, 0,08 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composé 2.2h en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf = 1 1 1 -1 13°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,37 (m, 24H), 1 ,55-1 ,68 (m, 2H), 1 ,90-2,03 (m, 1 H), 2,15-2,26 (m, 1 H), 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,36-2,44 (m, 2H), 3,72-3,82 (m, 2H), 4,43-4,52 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,8 (10xCH2), 31 ,1 (CH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 53,2 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,7 (C), 176,5 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 471 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C24H43N2O7 471 ,3070, trouvée 471 ,3057.
Exemple 2.3i
Figure imgf000042_0001
Le composé 2.3i (solide blanc, 33 mg, 0,08 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 2.2i en suivant les protocoles généraux D1 puis K.
Tf > 80 °C (décomposé) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1 ,90-2,03 (m, 1 H), 2,14-2,27 (m, 1 H), 2,33-2,48 (m, 2H), 3,72-3,84 (m, 2H), 4,41 -4,54 (m, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 13,3 (st, JC,D = 19,8 Hz, CD3), 22,4 (qt, JC,D = 19,6, Hz, CD2), 25,7 (qt, JC,D = 20,2 Hz, CD2), 27,9 (CH2), 28,6-29,9 (6xCD2), 31 ,1 (CH2), 31 ,7 (qt, JC,D = 16,9 Hz, CD2), 36,1 (qt, JC,D = 21 ,1 Hz, CD2), 53,2 (CH), 56,6 (CH), 63,1 (CH2), 172,6 (C), 174,8 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 438 (100) [M-H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C20Hi2D23N2O7 438,3888, trouvée 438,3889. Exemple 4: Composés 3.1 à 3.9
Figure imgf000043_0001
i. Bromure d'allyle ou de propargyle, NaH, DMF ; ii. H-D-Glu(OBn)-OBn.p- tosylate ou H-L-Glu(OBn)-Gly-OBn, TBTU, DIEA, DMF ; iii. TFA, CH2CI2 ; iv. R3COCI, DMAP, pyridine, CH2CI2 ; ; vi. Azido-saccharide (acétate) ou PEG- N3 ou N3-PEG-N3, CuSO .5H2O, ascorbate de sodium, DMF, H2O ; vii. MeONa, MeOH puis Dowex ; viii. LiOH, THF/H2O ; ix. H2,Pd/C, MeOH. Avec R1 = Ac-saccharide ou PEG ; R1 a = saccharide ou PEG R2 = -OBn ou - NHCh COOBn ; R2a = -OH ou -NHCH2COOH ; R3 = -(CH2)nCH3, - CH[(CH2)nCH3]2 ou -(CH2)ncyclohexyle.
Composé 3.1 b
Figure imgf000044_0001
Le produit 3.1 b (huile jaunâtre, 915 mg, 3,76 mmol, 77 %) a été obtenu en suivant le protocole ci-dessus (exemple 3.1 a) en utilisant le bromure de propargyle. Le produit brut obtenu (huile incolore) est directement utilisé pour l'étape suivante.
Composé 3.2b
Figure imgf000044_0002
Le composé 3.2b (huile jaunâtre, 1 ,91 g, 3,45 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composés 3.1 a en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,33 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; RMN 1 H (400 MHz, CDCI3) δ ppm
1 ,44 (s, 9H), 1 ,95-2,08 (m, 1 H), 2,22-2,32 (m, 1 H), 2,32-2,53 (m, 3H), 3,66 (dd, J = 9,3, 6,1 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 9,3, 4,0 Hz, 1 H), 4,08 (dd, J = 15,9, 2,4 Hz, 1 H), 4,15 (dd, J = 15,9, 2,4 Hz, 1 H), 4,25-4,38 (m, 1 H), 4,66-4,74 (m, 1 H), 5,08 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,38 (s, 1 H, NH), 6,98 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,26-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 27,4 (CH2), 28,3 (3xCH3), 30,0 (CH2), 51 ,7 (CH), 54,0 (CH), 58,6 (CH2), 66,5 (CH2), 67,4 (CH2), 69,3 (CH2), 75,4 (CH), 79,0 (C), 80,4 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 155,6 (C), 170,0 (C), 171 ,4 (C), 172,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 453 (40), 497 (35), 553 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CsoHs/N Os 553,2550, trouvée 553,2528.
Composé 3.2c
Figure imgf000045_0001
Le composé 3.2c (huile jaunâtre, 886 mg, 1 ,45 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composés 3.1 b et le H-L-Glu(OBn)-Gly-OBn (non décrit) en suivant le protocole général A (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : cyclohexane/AcOEt 9:1 à 7:3).
Rf = 0,28 (cyclohexane/AcOEt 5:5) ; RMN 1 H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1 ,43 (s, 9H), 1 ,99-2,13 (m, 1 H), 2,15-2,27 (m, 1 H), 2,39 (t, J = 2,4 Hz, 1 H), 2,42-2,54 (m, 1 H), 2,54-2,66 (m, 1 H), 3,69 (dd, J = 9,2, 5,6 Hz, 1 H), 3,86 (dd, J = 9,3, 4,4 Hz, 1 H), 3,95 (dd, J = 17,9, 5,1 Hz, 1 H), 4,12 (dd, J = 17,9, 6,0 Hz, 1 H), 4,09 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1 H), 4,14 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1 H), 4,22-4,32 (m, 1 H), 4,52-4,61 (m, 1 H), 5,1 1 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,12 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 5,14 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,17 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 5,41 (d, J = 5,3 Hz, 1 H, NH), 7,15 (bs, 1 H, NH), 7,28-7,43 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 26,9 (CH2), 28,4 (3xCH3), 30,5 (CH2), 52,9 (CH), 54,7 (CH), 58,8 (CH2), 66,8 (CH2), 67,2 (CH2), 69,5 (CH2), 75,6 (CH), 78,9 (C), 80,8 (C), 128,4-128,7 (10xCH), 135,4 (C), 135,8 (C), 155,9 (C), 169,5 (C), 170,3 (C), 171 ,2 (C), 174,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 610 (15) [M+H]+, 632 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C32H40N3O9 610,2765, trouvée 610,2764.
Composé 3.3d
Figure imgf000046_0001
Le composé 3.3d (solide blanc, 813 mg, 1 ,34 mmol, 67 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,13 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 93-94°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,35 (m, 12H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,97-2,10 (m, 1 H), 2,16-2,32 (m, 3H), 2,32-2,51 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1 H), 3,88 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,18 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,58-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,32 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,02 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, NH), 7,28-7,40 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,3 (CH2), 29,4-29,5 (4xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 169,8 (C), 171 ,3 (C), 172,6 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 491 (100), 608 (20) [M+H]+, 630 (95) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H47N2O7 607,3383, trouvée 607,3373.
Composé 3.3e
Figure imgf000046_0002
Le composé 3.3e (solide blanc, 651 mg, 1 ,03 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,16 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 99-100°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,35 (m, 16H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,96-2,09 (m, 1 H), 2,16-2,31 (m, 3H), 2,32-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,18 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,59-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,32 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,02 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, NH), 7,27-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,3 (CH2), 29,4-29,7 (6xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,7 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,7 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,9 (C), 169,8 (C), 171 ,3 (C), 172,6 (C), 173,5 (C1 ') ; Masse (ESI+) m/z (%) 636 (25) [M+H]+, 658 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C37H5iN2O7 635,3696, trouvée 635,3697. Composé 3.3f
Figure imgf000047_0001
Le composé 3.3f (solide blanc, 1 ,085 g, 1 ,64 mmol, 84 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,21 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 101 -103°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,37 (m, 20H), 1 ,56-1 ,66 (m, 2H), 1 ,97-2,08 (m, 1 H), 2,14-2,32 (m, 3H), 2,32-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,1 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,17 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,62-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,39 (d, J = 7,1 Hz, 1 H, NH), 7,10 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,28-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,2 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,6 (CH2), 51 ,9 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,8 (C), 171 ,3 (C), 172,6 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 199 (15), 664 (100) [M+H]+, 686 (20) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C39H55N2O7 663,4009, trouvée 663,4006.
5 Composé 3.3g
Figure imgf000048_0001
Le composé 3.3g (solide blanc, 467 mg, 0,64 mmol, 47 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,18 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 105-108°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,18-1 ,36 (m, 30H), 1 ,56-1 ,68 (m, 2H), 1 ,96-2,09 (m, 1 H), 2,15-2,32 (m, 3H), 2,33-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,17 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,60-4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,35 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,05 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,29-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 27,2 (CH2), 29,4-29,8 (13xCH2), 30,1 (CH2), 32,0 (CH2), 36,6 (CH2), 52,0 (CH), 52,4 (CH), 58,7 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C) ; 128,4-128,8 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,8 (C), 171 ,3 (C), 172,6 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 734 (55) [M+H]+, 756 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C4 H64N2O7Na 755,461 1 , trouvée 755,4612. Composé 3.3h
Figure imgf000048_0002
Le composé 3.3h (solide blanc, 206 mg, 0,32 mmol, 65 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,38 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 87-90°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,84 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,15-1,32 (m, 12H), 1,32-1,46 (m, 2H), 1,51-1,67 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 2H), 2,37 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1 H), 2,21-2,50 (m, 3H), 3,63 (dd, J = 9,2, 6,3 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,7 Hz, 1H), 4,09 (dd, J= 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,14 (dd, J= 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,65-4,77 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,11 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 6,44 (d, J = 7,1 Hz, 1H, NH), 7,16 (d, J = 8,0 Hz, 1H, NH), 7,24- 7,37 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (2xCH3), 22,4 (CH2), 22,5 (CH2), 27,2, 27,2 (2xCH2), 27,4 (CH2), 29,9 (CH2), 31,8 (CH2), 31,9 (CH2), 32,8 (CH2), 32,9 (CH2), 47,7 (CH), 51,6 (CH), 52,2 (CH), 58,5 (CH2), 66,4 (CH2), 67,3 (CH2), 69,1 (CH2), 75,4 (CH), 78,9 (C), 128,2-128,6 (10xCH), 135,1 (C), 135,8 (C), 169,6 (C), 171,1 (C), 172,3 (C), 176,3 (C). Masse (ESI+) m/z{%) 413 (30), 635 (40) [M+H]+, 657 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C37H5oN2O7Na 657,3516, trouvée 657,3532.
Composé 3.3i
Figure imgf000049_0001
Le composé 3.3i (solide blanc, 361 mg, 0,43 mmol, 40 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,52 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 91-93°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,11-1,33 (m, 40H), 1,35-1,47 (m, 2H), 1,50-1,65 (m, 2H), 1,94-2,14 (m, 2H), 2,37 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1H), 2,21-2,50 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,6 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,10 (dd, J= 16,0, 2,4 Hz, 1H), 4,18 (dd, J= 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,62-4,75 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 6,34 (d, J = 7,0 Hz, 1 H, NH), 7,01 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,26-7,38 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (2xCH3), 22,8 (2xCH2), 27,5 (CH2), 27,7 (2xCH2), 29,5- 30,0 (16xCH2), 32,0 (CH2), 32,9 (CH2), 33,1 (CH2), 47,9 (CH), 51 ,8 (CH), 52,2 (CH), 58,6 (CH2), 66,6 (CH2), 67,5 (CH2), 69,0 (CH2), 75,5 (CH), 79,0 (C), 128,4-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,6 (C), 171 ,2 (C), 172,4 (C), 176,5 (C). Masse (ESI+) m/z (%) 853 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C5iH78N2O7Na 853,5707, trouvée 853,5693.
Composé 3.3j
Figure imgf000050_0001
Le composé 3.3j (solide blanc, 337 mg, 0,54 mmol, 66 %) a été obtenu à partir du composé 3.2b en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,13 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 100-102°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,76-0,91 (m, 2H), 1 ,05-1 ,24 (m, 6H), 1 ,23-1 ,35 (m, 2H), 1 ,53-1 ,73 (m, 7H), 1 ,94-2,08 (m, 1 H), 2,13-2,31 (m, 3H), 2,31 -2,52 (m, 3H), 3,62 (dd, J = 9,2, 6,5 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,2, 4,1 Hz, 1 H), 4,09 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,16 (dd, J = 16,0, 2,4 Hz, 1 H), 4,61 -4,72 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,38 (d, J = 7,1 Hz, 1 H, NH), 7,1 1 (d, J = 7,9 Hz, 1 H, NH), 7,28-7,39 (m, 10H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 25,9 (CH2), 26,5
(2xCH2), 26,6 (CH2), 26,8 (CH2), 27,2 (CH2), 30,1 (CH2), 33,4 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 37,5 (CH), 51 ,9 (CH), 52,3 (CH), 58,6 (CH2), 66,6 (CH2), 67,4 (CH2), 69,0 (CH2), 75,4 (CH), 79,0 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 169,8 (C), 171 ,2 (C), 172,6 (C), 173,5 (C). Masse (ESI+) m/z (%) 619 (60) [M+H]+, 641 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour
Cs6H46N2O7Na 641 ,3203, trouvée 641 ,3199. Composé 3.3k
Figure imgf000051_0001
Le composé 3.3k (solide blanc, 506 mg, 0,70 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 3.2c en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,19 (cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 122-123°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,15-1 ,35 (m, 20H), 1 ,54-1 ,69 (m, 2H), 2,01 -2,29 (m, 4H), 2,39 (dd, J = 2,4, 2,4 Hz, 1 H), 2,43-2,66 (m, 2H), 3,67 (dd, J = 9,3, 6,0 Hz, 1 H), 3,89 (dd, J = 9,3, 4,3 Hz, 1 H), 3,96 (dd, J = 17,9, 5,4 Hz, 1 H), 4,10 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1 H), 4,14 (dd, J = 17,9, 6,2 Hz, 1 H), 4,15 (dd, J = 15,8, 2,4 Hz, 1 H), 4,54-4,63 (m, 2H), 5,1 1 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 5,16 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 6,45 (d, J = 6,8 Hz, 1 H, NH), 7,21 (dd, J = 6,2, 5,4 Hz, 1 H, NH), 7,28-7,38 (m, 10H), 7,57 (d, J = 7,7 Hz, 1 H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 26,7 (CH2), 29,4-29,8 (8xCH2), 30,5 (CH2), 32,0 (CH2), 36,5 (CH2), 41 ,4 (CH2), 53,0 (CH), 53,1 (CH), 58,8 (CH2), 66,8 (CH2), 67,2 (CH2), 69,4 (CH2), 75,6 (CH), 78,9 (C), 128,3-128,7 (10xCH), 135,4 (C), 135,7 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 171 ,1 (C), 173,9 (C), 174,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 720 (20) [M+H]+, 742 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C4iH57N3O8Na 742,4043, trouvée 742,4042.
Composé 3.5a
Figure imgf000051_0002
Le composé 3.5a (huile jaunâtre, 541 mg, 0,53 mmol, 71 %) a été obtenu à partir du composé 3.3d en suivant le protocole général I.
Rf = 0,07 (CH2CI2/AcOEt 1 :1 ) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,88 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 1 ,20-1 ,36 (m, 12H), 1 ,54-1 ,65 (m, 2H), 1 ,91 (s, 3H), 1 ,93 (s, 3H), 1 ,99 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1 ,96-2,09 (m, 1 H), 2,15-2,30 (m, 3H), 2,34- 2,48 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1 H), 3,77 (dd, J = 9,5, 5,1 Hz, 1 H), 3,85 (ddd, J = 9,6, 4,7, 1 ,8 Hz, 1 H), 3,90-3,99 (m, 1 H), 4,12 (dd, J = 12,5, 1 ,8 Hz, 1 H), 4,12-4,20 (m, 1 H), 4,26 (dd, J = 12,5, 4,7 Hz, 1 H), 4,45-4,69 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,90 (dd, J = 9,5, 8,0 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1 H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12.5 Hz, 1 H), 5,17 (d, J = 12.5 Hz, 1 H), 5,23 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1 H), 7,24-7,40 (m, 10H), 7,83 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (2xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3, 30,4, 30,5, 30,6 (4xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,3 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101 ,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171 ,1 (2xC), 171 ,5 (C), 172,2 (2xC), 172,6 (C), 174,0 (C), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1047 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C51 H70N5O17 1024,4767, trouvée 1024,4784.
Composé 3.5b
Figure imgf000052_0001
Le composé 3.5b (huile jaunâtre, 181 mg, 0,17 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 3.3e en suivant le protocole général I.
Rf = 0,1 1 (CH2CI2/AcOEt 1 :1 ) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,20-1 ,36 (m, 12H), 1 ,54-1 ,65 (m, 2H), 1 ,91 (s, 3H), 1 ,93 (s, 3H), 1 ,99 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1 ,94-2,06 (m, 1 H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,36- 2,44 (m, 2H), 3,65-3,73 (m, 1 H), 3,73-3,81 (m, 1 H), 3,85 (ddd, J = 10,0, 4,7, 2,4 Hz, 1H), 3,91-3,99 (m, 1H), 4,12 (dd, J= 12,4, 2,4 Hz, 1H), 4,14-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,48-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 10,1 , 9,7 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,23 (dd, J= 9,7, 9,7 Hz, 1H), 7,26-7,37 (m, 10H), 7,83 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (2xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3-30,7 (6xCH2), 31.0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,2 (CH2), 53,2 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,3 (C), 171,1 (C), 171,2 (C), 171,5 (C), 172,2 (C), 172,6 (C), 174,0 (C), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C53H74N5O171052,5080, trouvée 1052,5117. Com osé 3.5c
Figure imgf000053_0001
Le composé 3.5c (huile jaunâtre, 568 mg, 0,53 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,08 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,21-1,34 (m, 20H), 1,53-1,65 (m, 2H) ; 1,91, 1,93, 1,99, 2,02 (s, 12H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,34-2,48 (m, 2H), 3,69 (dd, J = 9,6, 5,4 Hz, 1H), 3,77 (dd, J = 9,6, 5,1 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J = 10,1, 4,7, 2,4 Hz, 1 H), 3,92-3,99 (m, 1 H), 4,12 (dd, J = 12,3, 2,4 Hz, 1 H), 4,13-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,3, 4,7 Hz, 1H), 4,47-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,88 (dd, J = 9,5, 7,9 Hz, 1H), 5,01 (dd, J = 10,1 , 9,5 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,11 -5,20 (m, 2H), 5,23 (dd, J = 9,5, 9,5 Hz, 1 H), 7,27-7,37 (m, 10H), 7,84 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,6 (CH3), 20,7 (2xCH3), 20,9 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 33,1 (CH2), 31,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51,3 (CH2), 53,2 (CH), 54,6 (CH), 61,5 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,6 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2- 129,6 (10xCH), 137,2 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171,1 (C), 171,2 (C), 171,5 (C), 172,3 (C), 172,6 (C), 173,0 (C), 174,1 (C), 176,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%)130 (35), 199 (40), 1081 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C55H78N5O171080,5393, trouvée 1080,5375.
Composé 3.5d
Figure imgf000054_0001
Le composé 3.5d (solide blanc, 160 mg, 0,14 mmol, 87 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,09 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; Tf = 58-60°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,83 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,08-1,30 (m, 30H), 1,49-1,64 (m, 2H), 1,87, 1,93, 1,96, 2,02 (s, 12H), 1,86-1,99 (m, 1H), 2,11-2,85 (m, 3H), 2,26-2,45 (m, 2H), 3,51-3,60 (m, 1H), 3,66 (ddd, J = 10,1, 4,7, 1,9 Hz, 1H), 3,78-3,97 (m, 2H), 4,08 (dd, J = 12,4, 1,9 Hz, 1H), 4,11-4,18 (m, 1H), 4,21 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,33-4,69 (m, 6H), 4,43 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,95 (dd, J = 9,5, 8,0 Hz, 1 H), 5,03 (dd, J = 10,1 , 9,5 Hz, 1 H), 5,03 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,13 (dd, J= 9,5, 9,5 Hz, 1H), 6,80 (bs, 1H), 7,18-7,35 (m, 10H), 7,39 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,58 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,1 (CH3), 20,5, 20,5, 20,5 (3xCH3), 20,6 (CH3), 22,6 (CH2), 25,5 (CH2), 26,9
(CH2), 29,3-29,6 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31,8 (CH2), 36,3 (CH2), 49,9 (CH2), 51,8 (CH), 52,5 (CH), 61,7 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4 (CH2), 67,1 (CH2), 67,7 (CH2), 68,1 (CH), 69,7 (CH2), 70,9 (CH), 71,9 (CH), 72,4 (CH), 100,4 (CH), 124,0 (CH), 128,1-128,5 (10xCH), 135,2 (C), 135,8 (C), 144,1 (C), 169,3 (C), 169,5 (C), 170,0 (C), 170,0 (C), 170,5 (C), 171,2 (C), 172,4 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1151 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C60H88N5O171150,6175, trouvée 1150,6163.
Composé 3.5e
Figure imgf000055_0001
Le composé 3.5e (solide blanc, 302 mg, 0,22 mmol, 74 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,06 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; Tf = 78-80°C ; RMN 1H (400 MHz, CDsOD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,22-1,37 (m, 20H), 1,54-1,65 (m, 2H), 1,89, 1,96, 1,98, 2,00, 2,01, 2,05, 2,09 (s, 21 H), 1,91-2,03 (m, 1H), 2,15- 2,29 (m, 3H), 2,39-2,42 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,6, 5,5 Hz, 1H), 3,76 (dd, J = 9,6, 5,1 Hz, 1H), 3,79-3,83 (m, 1H), 3,92-4,00 (m, 2H), 4,03-4,07 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 6,3, 2,5 Hz, 1H), 4,14-4,17 (m, 1H), 4,20-4,28 (m, 2H), 4,48- 4,63 (m, 7H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,76 (dd, J = 9,1, 7,9 Hz, 1H) ; 4,81- 4,85 (m, 1H), 5,04 (dd, J = 10,0, 10,0 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,11-5,20 (m, 2H), 5,27 (dd, J = 9,1, 9,1 Hz, 1H), 5,33-5,38 (m, 2H), 7,26-7,39 (m, 10H), 7,83 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 20,5-21,2 (7xCH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,3 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 63,0 (CH2), 64,1 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2) ; 69,6 (CH), 69,8 (CH), 70,7 (CH), 70,9 (CH2), 71,6 (CH), 73,3 (CH), 73,5 (CH), 74,7 (CH), 76,3 (CH), 97,1 (CH), 101,4 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 145,5 (C), 137,2 (C), 137,6 (C), 171,1-172,2 (7xC), 172,2 (C), 172,6 (C), 174,1 (C), 176,3 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1369 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C67H94N5O251368,6238, trouvée 1368,6237. Composé 3.5f
Figure imgf000056_0001
Le composé 3.5f (solide blanc, 192 mg, 0,13 mmol, 83 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I.
Rf = 0,10 (CH2CI2/AcOEt 4:6) ; Tf = 90-94°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,84 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,14-1 ,31 (m, 30H), 1 ,52-1 ,62 (m, 2H), 1 ,87, 1 ,94, 1 ,96, 1 ,98, 1 ,99, 2,05, 2,09 (s, 21 H), 1 ,91 -2,03 (m, 1 H), 2,13-2,26 (m, 3H), 2,26-2,43 (m, 2H), 3,50-3,59 (m, 1 H), 3,60-3,66 (m, 1 H), 3,80-3,99 (m, 4H), 4,02 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1 H), 4,09-4,25 (m, 3H), 4,33-4,70 (m, 7H), 4,46 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,75-4,85 (m, 2H), 5,02 (dd, J = 9,8, 9,8 Hz, 1 H), 5,04 (s, 2H), 5,09 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,13 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,19 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, 1 H), 5,32 (dd, J = 10,3, 9,8 Hz, 1 H), 5,36 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 6,70 (d, J = 6,0 Hz, 1 H, NH), 7,23-7,37 (m, 1 1 H), 7,55 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 20,5-20,8 (7xCH3), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 27,0 (CH2), 29,3-29,7 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31 ,9 (CH2), 36,4 (CH2), 49,9 (CH2), 51 ,9 (CH), 52,5 (CH), 61 ,5 (CH2), 62,5 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4 (CH2), 67,2 (CH2), 67,8 (CH2), 68,0 (CH), 68,5 (CH), 69,3 (CH), 69,6 (CH2), 70,0 (CH), 71 ,8 (CH), 72,4 (CH), 72,5 (CH), 75,0 (CH), 95,6 (CH), 100,2 (CH), 123,9 (CH), 128,1 -128,6 (CH of Ph), 135,3 (C), 135,8 (C), 144,3 (C), 169,4-170,5 (7xC), 170,0 (C), 171 ,2 (C), 172,5 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1439 (100) [M+H]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C72Hi04N5O25 1438,7020, trouvée 1438,7031 .
Composé 3.5g
COOBn
COOBn
NH
(CH2)i2CH3 Le composé 3.5g (cire blanc, 207 mg, 0,21 mmol, 85 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f en suivant le protocole général I (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : CH2CI2/MeOH 99 :1 à 97:3).
Rf = 0,18 (CH2CI2/MeOH 97:3) ; Tf = 50-52°C ; RMN 1H (500 MHz,
CDsOD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,36 (m, 20H), 1 ,53-1 ,65 (m, 2H), 1 ,91 -2,01 (m, 1 H), 2,15-2,29 (m, 3H), 2,34-2,46 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,49-3,53 (m, 2H), 3,54-3,64 (m, 18H), 3,64-3,70 (m, 1 H), 3,71 -3,77 (m, 1 H), 3,85 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,49-4,63 (m, 6H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 5,16 (d, J = 12,4 Hz, 1 H), 7,25-7,37 (m, 10H), 7,96 (s, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CDsOD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,6 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,5 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 70,2 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,3-71 ,5 (9xCH2), 73,0 (CH2), 125,9 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 172,5 (C), 174,0 (2xC), 176,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 985 (20) [M+H]+, 1007 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C52H82N5Oi 3 984,5909, trouvée 984,5892.
Composé 3.5h
Figure imgf000057_0001
Le composé 3.5h (solide blanc, 91 mg 0,09 mmol, 88 %) a été obtenu à partir du composé 3.3g en suivant le protocole général I (purification : colonne chromatographique sur gel de silice, éluant : CH2CI2/MeOH 99 :1 à 97:3).
Rf = 0,20 (CH2CI2/MeOH 97:3) ; Tf = 61 -63°C ; RMN 1H (500 MHz, CDCIs) <5 ppm 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,32 (m, 30H), 1 ,53-1 ,64 (m, 2H), 1 ,93-2,04 (m, 1 H), 2,14-2,26 (m, 3H), 2,26-2,43 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,48- 3,52 (m, 2H), 3,52-3,66 (m, 19H), 3,81 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,88-3,95 (m, 1H), 4,46 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 4,53-4,69 (m, 4H), 5,05 (s, 2H), 5,10 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 5,9 Hz, 1H, NH), 7,24-7,35 (m, 10H), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H, NH), 7,71 (s, 1H) ; RMN 13C (125 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,7 (13xCH2), 30,0 (CH2), 31,9 (CH2), 36,4 (CH2), 50,3 (CH2), 51,9 (CH), 52,5 (CH), 59,0 (CH3), 65,1 (CH2), 66,4 (CH2), 67,2 (CH2), 70,2 (CH2), 70,8 (CH2), 70,5-70,6 (9xCH2), 71,9 (CH2), 123,8 (CH), 128,2-128,6 (10xCH), 135,3 (C), 135,8 (C), 144,1 (C), 170,1 (C), 171,2 (C), 172,5 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 892 (100), 1077 (70) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C57H92N5Oi31054,6692, trouvée 1054,6696.
Composé 3.5i
Figure imgf000058_0001
Le composé 3.5i (cire jaunâtre, 115 mg, 0,11 mmol, 38%) a été obtenu à partir du composé 3.3h en suivant le protocole général I.
Rf = 0,40 (CH2CI2/AcOEt 1:1) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,84, 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1,15-1 ,39 (m, 12H), 1 ,31 -1 ,44 (m, 2H), 1 ,47-1 ,63 (m, 2H), 1,91, 1,93, 1,99, 2,02 (s, 12H), 1,89-2,05 (m, 1H), 2,14-2,25 (m, 1H), 2,26-2,35 (m, 1 H), 2,34-2,46 (m, 2H), 3,68 (dd, J = 9,6, 5,7 Hz, 1 H), 3,76 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J = 9,7, 4,7, 2,4 Hz, 1H), 3,90-3,99 (m, 1H), 4,12 (dd, J= 12,4, 2,4 Hz, 1H), 4,13-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J= 12,4, 4,7 Hz, 1H), 4,49-4,62 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,89 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz, 1H), 5,02 (dd, J = 9,7, 9,5 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,13, 5,17 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 5,23 (dd, J= 9,7, 9,5 Hz, 1H), 7,27-7,37 (m, 10H), 7,83 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 8,13 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDsOD) δ ppm 14,4 (CH3), 14,5 (CH3), 20,6 (CH3), 20,6 (CH3), 20,7 (CH3), 20,7 (CH3), 23,5 (CH2), 23,6 (CH2), 27,9 (CH2), 28,2 (CH2), 28,3 (CH2), 30,9 (CH2), 32,9 (CH2), 33,0 (CH2), 34,0 (CH2), 34,1 (CH2), 47,9 (CH), 51 ,3 (CH2), 53,0 (CH), 54,2 (CH), 63,0 (CH2), 65,2 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,7 (CH), 71 ,0 (CH2), 72,5 (CH), 72,9 (CH), 74,0 (CH), 101 ,6 (CH), 125,8 (CH), 129,2-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,4 (C), 171 ,1 (C), 171 ,2 (C), 171 ,5 (C), 172,0 (C), 172,2 (C), 172,5 (C), 173,8 (C), 179,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1075 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssH/sNsOuNa 1074,4899, trouvée 1074,4904.
Composé 3.5j
Figure imgf000059_0001
Le composé 3.5j (solide blanc, 190 mg, 0,15 mmol, 90%) a été obtenu à partir du composé 3.3i en suivant le protocole général I.
Rf = 0,40 (CH2CI2/AcOEt 1 :1 ) ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 0,84, 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1 ,13-1 ,31 (m, 40H), 1 ,33-1 ,44 (m, 2H), 1 ,48-1 ,63 (m,
2H), 1 ,90, 1 ,95, 1 ,99, 2,04 (s, 12H), 1 ,93-2,03 (m, 1 H), 2,06-2,15 (m, 1 H), 2,16-2,45 (m, 3H), 3,50-3,60 (m, 1 H), 3,67 (ddd, J = 9,7, 4,7, 2,2 Hz, 1 H), 3,81 -3,90 (m, 1 H), 3,90-3,99 (m, 1 H), 4,10 (dd, J = 12,3, 2,2 Hz, 1 H), 4,14- 4,20 (m, 1 H), 4,23 (dd, J = 12,3, 4,7 Hz, 1 H), 4,35-4,71 (m, 6H), 4,44 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 4,97 (dd, J = 9,7, 7,9 Hz, 1 H), 5,05 (dd, J = 9,7, 9,7 Hz, 1 H), 5,05 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,15 (dd, J = 9,7, 9,7 Hz, 1 H), 6,69 (d, J = 6,0 Hz, 1 H, NH), 7,23-7,40 (m, 1 1 H), 7,57 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 14,1 (2xCH3), 20,5 (CH3), 20,6 (2xCH3), 20,7 (CH3), 22,7 (2xCH2), 27,3 (CH2), 27,7 (2xCH2), 29,4-30,3 (16xCH2), 31 ,9 (CH2), 32,9 (CH2), 33,0 (CH2), 47,7 (CH), 50,0 (CH2), 51 ,8 (CH), 52,4 (CH), 61 ,8 (CH2), 64,6 (CH2), 66,4
(CH2), 67,2 (CH2), 67,7 (CH2), 68,3 (CH), 69,8 (CH2), 71 ,0 (CH), 72,0 (CH), 72,5 (CH), 100,6 (CH), 124,0 (CH), 128,2-128,6 (10xCH), 135,3 (C), 135,9 (C), 144,4 (C), 169,4 (C), 169,5 (C), 170,0 (2xC), 170,6 (C), 171,2 (C), 172,3 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1271 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour Ce/HioiNsOi/Na 1270,7090, trouvée 1270,7128.
Composé 3.5k
Figure imgf000060_0001
Le composé 3.5k (gomme jaunâtre, 200 mg, 0,19 mmol, 80%) a été obtenu à partir du composé 3.3j en suivant le protocole général I.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH 97,5:2,5) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,77-0,92 (m, 2H), 1,10-1,25 (m, 6H), 1,25-1,37 (m, 2H), 1,51-1,73 (m, 7H), 1,91, 1,93, 1,98, 2,02 (s, 12H), 1,94-2,08 (m, 1H), 2,14-2,30 (m, 3H), 2,34- 2,48 (m, 2H), 3,69 (dd, J = 9,6, 5,5 Hz, 1H), 3,78 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J= 9,7, 4,6, 2,1 Hz, 1H), 3,95 (m, 1H), 4,12 (dd, J= 12,4, 2,1 Hz, 1H), 4,12-4,20 (m, 1H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,6 Hz, 1H), 4,48-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 4,89 (dd, J = 9,5, 7,9 Hz, 1 H), 5,02 (dd, J = 9,7, 9,5 Hz, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 9,5, 9,5 Hz, 1H), 7,25-7,38 (m, 10H), 7,82 (s, 1H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 20,6 (2xCH3), 20,7 (2xCH3), 27,0 (CH2), 27,4 (2xCH2), 27,5 (CH2), 27,6 (CH2), 27,7 (CH2), 31,0 (CH2), 34,5 (2xCH2), 36,8 (CH2), 38,3 (CH2), 38,7 (CH), 51,2 (CH2), 53,1 (CH), 54,4 (CH), 63,0 (CH2),
65,1 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 68,9 (CH2), 69,7 (CH), 70,9 (CH2), 72,5 (CH), 72,8 (CH), 73,9 (CH), 101,6 (CH), 125,7 (CH), 129,1-129,6 (10xCH), 137,1 (C), 137,5 (C), 145,3 (C), 171,1 (2xC), 171,4 (C), 172,1 (C), 172,2 (C), 172,5 (C), 174,0 (C), 176,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1059 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C52H7oN5Oi71036,4767, trouvée 1036,4760. Composé 3.51
Figure imgf000061_0001
Le composé 3.51 (solide jaunâtre, 153 mg, 0,13 mmol, 61 %) a été obtenu à partir du composé 3.3k en suivant le protocole général I.
Rf = 0,21 (CH2CI2/MeOH 97,5:2,5) ; Tf = 60-63°C ; RMN 1H (400 MHz, CDsOD) δ ppm 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,34 (m, 20H), 1 ,53-1 ,65 (m, 2H), 1 ,92, 1 ,94, 1 ,99, 2,02 (s, 12H), 1 ,93-2,10 (m, 1 H), 2,15-2,31 (m, 3H), 2,42-2,52 (m, 2H), 3,71 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1 H), 3,79-3,88 (m, 2H), 3,91 - 4,00 (m, 3H), 4,09-4,20 (m, 2H), 4,26 (dd, J = 12,4, 4,7 Hz, 1 H), 4,47-4,64 (m, 6H), 4,66 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,88 (dd, J = 9,6, 8,0 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1 H), 5,1 1 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,23 (dd, J = 9,6, 9,6 Hz, 1 H), 7,25-7,40 (m, 10H), 7,84 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,6 (CH3), 20,7 (CH3), 20,7 (CH3), 20,8 (CH3), 20,8 (CH3), 23,8 (CH2), 26,8 (CH2), 28,1 (CH2), 30,5-30,9 (8xCH2), 31 ,2 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 42,2 (CH2), 51 ,3 (CH2), 53,7 (CH), 55,2 (CH), 63,1 (CH2), 65,3 (CH2), 67,4 (CH2), 68,0 (CH2), 69,0 (CH2), 69,8 (CH), 70,9 (CH2), 72,6 (CH), 73,0 (CH), 74,1 (CH), 101 ,7 (CH), 125,9 (CH), 129,3-129,7 (10xCH), 137,2 (C), 137,7 (C), 145,3 (C), 171 ,0 (C), 171 ,2 (C), 171 ,3 (C), 171 ,6 (C), 172,3 (C), 172,3 (C), 173,8 (C), 174,4 (C), 176,9 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1 160 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour Cs/HsiNeOis 1 137,5607, trouvée 1 137,5610.
Composé 3.7a
Figure imgf000061_0002
Le composé 3.7a (solide blanc, 81 mg, 0,12 mmol, 70 %) a été obtenu à partir du composé 3.5a en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 72-75°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : δ ppm 0,89 (t, J = 6,2 Hz, 3H), 1 ,20-1 ,38 (m, 12H), 1 ,54-1 ,67 (m, 2H), 1 ,86-1 ,99 (m, 1 H), 2,10-2,24 (m, 1 H), 2,24-2,40 (m, 4H), 3,21 (dd, J = 8,9, 8,0 Hz, 1 H), 3,25-3,41 (m, 3H), 3,62-3,75 (m, 2H), 3,80 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 1 1 ,8, 1 ,3 Hz, 1 H), 3,94-4,06 (m, 1 H), 4,20-4,29 (m, 1 H), 4,32 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,45 (dd, J = 8,7, 4,6 Hz, 1 H), 4,57-4,71 (m, 5H), 8,14 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,8 (CH2), 30,3, 30,4, 30,4, 30,5 (4xCH2), 30,9 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,0 (CH), 54,5 (CH), 62,6 (CH2), 65,0 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (2xCH), 104,4 (CH), 126,2 (CH), 145,2 (C), 172,1 (C), 174,5 (C), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 674 (100) [M-H]" ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C29H5oN5Oi3676,3405, trouvée 676,3409.
Figure imgf000062_0001
Le composé 3.7b (solide blanc, 108 mg, 0,15 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 3.5b en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 1 18-120°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) : δ ppm 0,89 (t, J = 5,9 Hz, 3H), 1 ,16-1 ,38 (m, 16H), 1 ,52-1 ,67 (m, 2H), 1 ,85-2,00 (m, 1 H), 2,10-2,25 (m, 1 H), 2,22-2,42 (m, 4H), 3,21 (dd, J = 8,4, 7,8 Hz, 1 H), 3,23-3,42 (m, 3H), 3,63-3,74 (m, 2H), 3,79 (dd, J = 9,6, 5,2 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 1 1 ,8, 1 ,3 Hz, 1 H), 3,94-4,06 (m, 1 H), 4,17-4,28 (m, 1 H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,46 (dd, J = 8,8, 4,6 Hz, 1 H), 4,55-4,70 (m, 5H), 8,10 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,3-30,7 (6xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,0 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,5 (CH), 62,6 (CH2), 65,0 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,4 (CH), 74,9 (CH), 77,8 (CH), 77,9 (CH), 104,4 (CH), 126,2 (CH), 145,2 (C), 172,0 (C), 174,8 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 702 (100) [M-H]~ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C31 H54N5O13704,3718, trouvée 704,3703.
Composé 3.7c
Figure imgf000063_0001
Le composé 3.7c (solide blanc, 358 mg, 0,49 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 3.5c en suivant les protocoles généraux J puis F
Tf = 154-156°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,37 (m, 20H), 1 ,54-1 ,67 (m, 2H), 1 ,86-1 ,99 (m, 1 H), 2,13-2,25 (m, 1 H), 2,25-2,31 (m, 2H), 2,31 -2,38 (m, 2H), 3,19 (dd, J = 9,7, 8,0 Hz, 1 H), 3,24-3,38 (m, 3H), 3,62-3,68 (m, 1 H), 3,71 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 9,5, 5,4 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 1 1 ,8, 1 ,5 Hz, 1 H), 3,96-4,03 (m, 1 H), 4,21 - 4,28 (m, 1 H), 4,30 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,47 (dd, J = 9,1 , 4,7 Hz, 1 H), 4,58- 4,67 (m, 5H), 8,09 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,9 (CH2), 27,9 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,1 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,1 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,1 (2xC), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 365 (30) [M-2H]2", 550 (20), 730 (100) [M-H]", 752 (20) ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C33H56N5O13 730,3875, trouvée 730,3886.
Composé 3.7d
Figure imgf000063_0002
Le composé 3.7d (solide blanc, 74 mg, 0,09 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 3.5d en suivant les protocoles généraux J puis F. (LiOH/Dioxane-h O).
Tf = 175-185°C ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ ppm 0,85 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1 ,1 1 -1 ,32 (m, 30H), 1 ,39-1 ,51 (m, 2H), 1 ,68-1 ,83 (m, 1 H), 1 ,90-2,04 (m, 1 H), 2,07-2,16 (m, 2H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,96 (dd, J = 8,3, 8,3 Hz, 1 H), 3,03 (dd, J = 8,8, 8,8 Hz, 1 H), 3,08-3,17 (m, 2H), 3,34-3,46 (m, 1 H), 3,51 - 3,60 (m, 2H), 3,64-3,70 (m, 1 H), 3,85-3,93 (m, 1 H), 4,03-4,12 (m, 1 H), 4,17- 4,28 (m, 2H), 4,44-4,63 (m, 5H), 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1 H, NH), 8,09 (s, 1 H), 8,20 (d, J = 7,8 Hz, 1 H, NH) ; RMN 13C (125 MHz, DMSO-c/6) δ ppm 14,0 (CH3), 22,1 (CH2), 25,2 (CH2), 26,5 (CH2), 28,7-29,1 (13xCH2), 29,8 (CH2), 31 ,3 (CH2), 35,1 (CH2), 49,6 (CH2), 51 ,1 (CH), 52,2 (CH), 61 ,1 (CH2), 63,6 (CH2), 67,3 (CH2), 69,9 (CH2), 70,0 (CH), 73,3 (CH), 76,6 (CH), 77,0 (CH), 102,9 (CH), 124,7 (CH), 143,5 (C), 169,6 (C), 172,3 (C), 173,0 (C), 173,8 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 399 (95) [M-2H]2", 620 (70), 638 (30), 800 (100) [M-H]-, 822 (85) [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour CssHeeNsOis 800,4657, trouvée 800,4636.
Composé 3.7e
Figure imgf000064_0001
Le composé 3.7e (solide blanc, 163 mg, 0,18 mmol, 79 %) a été obtenu à partir du composé 3.5d en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 167-169°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,39 (m, 20H), 1 ,57-1 ,67 (m, 2H), 1 ,86-1 ,98 (m, 1 H), 2,13-2,24 (m, 1 H), 2,28 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,31 -2,40 (m, 2H), 3,22-3,33 (m, 2H), 3,39 (ddd, J = 9,2, 4,7, 1 ,9 Hz, 1 H), 3,44 (dd, J = 9,7, 3,8 Hz, 1 H), 3,53 (dd, J = 9,2, 9,2 Hz, 1 H), 3,56-3,73 (m, 5H), 3,74-3,92 (m, 4H), 3,95-4,03 (m, 1 H), 4,19-4,29 (m, 1 H), 4,33 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,46 (dd, J = 9,0, 4,6 Hz, 1 H), 4,56-4,68 (m, 5H), 5,16 (d, J = 3,8 Hz, 1 H), 8,09 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,0 (CH2), 30,3-30,8 (8xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,6 (CH), 62,1 (CH2), 62,8 (CH2), 65,1 (CH2), 69,1 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,1 (CH), 74,5 (CH), 74,8 (CH), 75,0 (CH), 76,7 (CH), 77,7 (CH), 81 ,1 (CH), 102,9 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,1 (C), 174,7 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 446 (100) [M-H]2", 892 (100) [M-H]~ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CsgHeeNsOis 892,4403, trouvée 892,4398. Composé 3.7f
Figure imgf000065_0001
Le composé 3.7f (solide blanc, 101 mg, 0,10 mmol, 92 %) a été obtenu à partir du composé 3.5e en suivant les protocoles généraux J puis F (LiOH/Dioxane-H2O).
Tf = 214-216°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,23-1 ,39 (m, 30H), 1 ,56-1 ,66 (m, 2H), 1 ,88-1 ,97 (m, 1 H), 2,15-2,24 (m, 1 H), 2,25-2,31 (m, 2H), 2,31 -2,39 (m, 2H), 3,22-3,29 (m, 2H), 3,39 (ddd, J = 9,4, 4,7, 1 ,9 Hz, 1 H), 3,44 (dd, J = 9,7, 3,8 Hz, 1 H), 3,53 (dd, J = 9,4, 9,2 Hz, 1 H), 3,57-3,74 (m, 5H), 3,75-3,85 (m, 3H), 3,89 (dd, J = 12,1 , 1 ,9 Hz, 1 H), 3,96-4,03 (m, 1 H), 4,21 -4,27 (m, 1 H), 4,33 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,47 (dd, J = 9,1 , 4,7 Hz, 1 H), 4,57-4,69 (m, 5H), 5,16 (d, J = 3,8 Hz, 1 H), 8,09 (s, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,9 (CH2),
27,9 (CH2), 30,4-30,8 (13xCH2), 31 ,0 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,1 (CH), 54,5 (CH), 62,1 (CH2), 62,8 (CH2), 65,1 (CH2), 69,2 (CH2), 70,9 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,2 (CH), 74,5 (CH), 74,8 (CH), 75,1 (CH), 76,7 (CH), 77,7 (CH), 81 ,2 (CH), 102,9 (CH), 104,5 (CH), 126,2 (CH), 145,3 (C), 172,2 (C), 174,5 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 481 (55) [M-2H]2", 963 (100) [M-H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C44H76N5Oi8 962,5185, trouvée 962,521 1 .
Com osé 3.7g
Figure imgf000066_0001
Le composé 3.7g (cire blanc, 41 mg, 0,05 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 3.5g en suivant le protocole général D1 .
Tf = 54-57°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,23-1 ,37 (m, 20H), 1 ,55-1 ,66 (m, 2H), 1 ,88-1 ,98 (m, 1 H), 2,13-2,22 (m, 1 H), 2,23-2,39 (m, 4H), 3,35 (s, 3H), 3,51 -3,55 (m, 2H), 3,56-3,66 (m, 18H), 3,71 (dd, J = 9,7, 5,2 Hz, 1 H), 3,79 (dd, J = 9,7, 5,4 Hz, 1 H), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 4,40 (dd, J = 8,1 , 4,7 Hz, 1 H), 4,55-4,67 (m, 5H), 8,03 (s, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,4 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 31 ,2 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51 ,4 (CH2), 53,9 (CH), 54,7 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 70,3 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,1 - 71 ,3 (9xCH2), 72,8 (CH2), 125,9 (CH), 145,5 (C), 171 ,7 (2xC), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 827 (100) [M+Na]+; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C38H7oN5Oi 3 804,4970, trouvée 804,4975.
Composé 3.7h
Figure imgf000066_0002
Le composé 3.7h (solide blanc, 58 mg, 0,07 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 3.5h en suivant le protocole général D1 . Tf = 76-79°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,23-1,38 (m, 30H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,88-1,98 (m, 1H), 2,13-2,22 (m, 1H), 2,23-2,39 (m, 4H), 3,35 (s, 3H), 3,50-3,55 (m, 2H), 3,56-3,67 (m, 18H), 3,71 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,79 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1H), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 4,42 (dd, J = 8,5, 4,8 Hz, 1 H), 4,55-4,67 (m, 5H), 8,03 (s, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (CH2), 26,9 (CH2), 28,2 (CH2), 30,4-30,9 (13xCH2), 31,1 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 51,4 (CH2), 53,6 (CH), 54,6 (CH), 59,1 (CH3), 65,1 (CH2), 70,3 (CH2), 70,9 (CH2), 71,2- 71,4 (9xCH2), 72,9 (CH2), 125,9 (CH), 145,4 (C), 171,8 (C), 175,1 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 231 (50), 897 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C 3H8oN5Oi3874,5753, trouvée 874,5761.
Composé 3.7i
Figure imgf000067_0001
Le composé 3.7i (solide blanc, 31 mg, 0,04 mmol, 46 %) a été obtenu à partir du composé 3.5i en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 100-103°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H), 1,18-1,36 (m, 12H), 1,33-1,46 (m, 2H), 1,47-1,68 (m, 2H), 1,86-1,97 (m, 1H), 2,13-2,24 (m, 1H), 2,24-2,40 (m, 3H), 3,20 (dd, J = 9,0, 7,9 Hz, 1H), 3,31-3,39 (m, 3H), 3,62-3,73 (m, 2H,), 3,79 (dd, J = 9,5, 5,3 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 11,5, 1,3 Hz, 1H), 3,96-4,04 (m, 1H), 4,21-4,28 (m, 1H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,42 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, 1 H), 4,59-4,71 (m, 5H), 8,10 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,4 (2xCH3), 23,5 (CH2), 23,6 (CH2), 28,2 (CH2), 28,3 (CH2), 28,5 (CH2), 31,1 (CH2), 32,9 (CH2), 33,1 (CH2), 34,1 (CH2), 48,0 (CH), 51,6 (CH2), 53,5 (CH), 54,4 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,9 (CH2), 71,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH),
126,2 (CH), 145,3 (C), 171,7 (C), 175,1 (C), 176,5 (C), 179,2 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 351 (25) [M-2H]2", 702 (100) [M-H]~ ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C31H52N5O13 702,3562, trouvée 702,3550.
Composé 3.7j
Figure imgf000068_0001
Le composé 3.7j (solide blanc, 40 mg, 0,04 mmol, quantitatif) a été obtenu à partir du composé 3.5j en suivant les protocoles généraux J puis F (LiOH/Dioxane-h O).
Tf > 160°C (avec décomposition) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1 ,20-1 ,36 (m, 40H), 1 ,36-1 ,47 (m, 2H), 1 ,49-1 ,65 (m, 2H), 1 ,86-1 ,97 (m, 1 H), 2,14-2,23 (m, 1 H), 2,26-2,38 (m, 3H), 3,20 (dd, J = 9,1 , 7,8 Hz, 1 H), 3,26-3,39 (m, 3H), 3,64-3,69 (m, 1 H), 3,70 (dd, J = 9,7, 5,7 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 9,7, 5,3 Hz, 1 H), 3,87 (dd, J = 1 1 ,5, 1 ,3 Hz, 1 H), 3,97- 4,03 (m, 1 H), 4,21 -4,28 (m, 1 H), 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,44 (dd, J = 8,3, 4,9 Hz, 1 H), 4,61 -4,70 (m, 5H), 8,10 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) : δ ppm 14,5 (2xCH3), 23,7 (2xCH2), 28,5 (2xCH2), 28,6 (CH2), 30,5-30,8 (14xCH2), 31 ,1 (CH2), 33,1 (2x- CH2), 34,0 (2xCH2), 47,9 (CH), 51 ,6 (CH2), 53,5 (CH), 54,4 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,9 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,9 (CH), 77,9 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH), 126,1 (CH), 145,3 (C), 171 ,7 (C), 175,0 (C), 176,5 (C), 179,2 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 449 (40) [M-2H]2", 899 (100) [M-H]-; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C 5H8oN5Oi3 898,5753, trouvée 898,5754.
Composé 3.7k
Figure imgf000068_0002
Le composé 3.7k (solide blanc, 60 mg, 0,09 mmol, 82 %) a été obtenu à partir du composé 3.5k en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf = 1 14-1 16°C ; RMN 1 H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,81 -0,94 (m, 2H) ;
1 ,12-1 ,28 (m, 6H) ; 1 ,27-1 ,38 (m, 2H) ; 1 ,53-1 ,76 (m, 7H) ; 1 ,86-1 ,98 (m, 1 H) ; 2,13-2,23 (m, 1 H) ; 2,28 (t, J = 7,7 Hz, 2H) ; 2,31 -2,39 (m, 2H) ; 3,20 (dd, J = 9,1 , 7,8 Hz, 1 H) ; 3,27-3,39 (m, 3H) ; 3,64-3,68 (m, 1 H) ; 3,70 (dd, J = 9,6, 5,5 Hz, 1 H) ; 3,79 (dd, J = 9,6, 5,3 Hz, 1 H) ; 3,87 (dd, J = 1 1 ,7, 1 ,1 Hz, 1 H) ; 3,96-4,04 (m, 1 H) ; 4,21 -4,28 (m, 1 H) ; 4,32 (d, J = 7,8 Hz, 1 H) ; 4,47 (dd, J = 9,1 , 4,7 Hz) ; 4,61 -4,69 (m, 5H) ; 8,09 (s, 1 H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) : δ ppm 27,1 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,5 (CH2) ; 27,8 (CH2) ; 27,9 (CH2) ; 31 ,0 (CH2) ; 34,5 (CH2) ; 34,5 (CH2) ; 36,8 (CH2) ; 38,3 (CH2) ; 38,8 (CH) ; 51 ,6 (CH2) ; 53,0 (CH) ; 54,5 (CH) ; 62,7 (CH2) ; 65,0 (CH2) ; 69,0 (CH2) ; 70,8 (CH2) ; 71 ,5 (CH) ; 74,9 (CH) ; 77,9 (CH) ; 78,0 (CH) ; 104,5 (CH) ; 126,2 (CH) ; 145,3 (C) ; 172,1 (C) ; 174,5 (C) ; 176,4 (C) ; 176,4 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 343 (30) [M-2H]2", 506 (25), 686 (100) [M-H]" ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C3oH48N5Oi3 686,3249, trouvée 686,3229. Composé 3.7I
Figure imgf000069_0001
Le composé 3.7I (solide blanc, 70 mg, 0,09 mmol, 94 %) a été obtenu à partir du composé 3.5I en suivant les protocoles généraux J puis F.
Tf > 170°C (avec décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,23-1 ,38 (m, 20H), 1 ,54-1 ,67 (m, 2H), 1 ,86-2,03 (m, 1 H), 2,13-2,43 (m, 5H), 3,19 (dd, J = 8,9, 7,9 Hz, 1 H), 3,25-3,38 (m, 3H), 3,62-3,69 (m, 1 H), 3,72 (dd, J = 9,7, 4,8 Hz, 1 H), 3,82 (dd, J = 9,7, 5,3 Hz, 1 H), 3,84-3,94 (m, 3H), 3,95-4,05 (m, 1 H), 4,20-4,28 (m, 1 H), 4,31 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 4,40-4,70 (m, 6H), 8,1 1 (s, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,6 (CH2), 30,4-30,8 (8xCH2), 32,8 (CH2), 33,1 (CH2), 36,8 (CH2), 41 ,9 (CH2), 51 ,6 (CH2), 53,2 (CH), 54,9 (CH), 62,7 (CH2), 65,1 (CH2), 69,0 (CH2), 70,8 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,9 (CH), 78,0 (CH), 78,0 (CH), 104,5 (CH), 126,3 (CH), 145,3 (C), 172,2 (C), 173,1 (C), 174,5 (C), 175,4 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z {%) 393 (100) [M-H]2", 787 (80) [M-H]" ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H6iN6Oi 789,4246, trouvée 789,4238.
Composé 3.8a
Figure imgf000070_0001
Le composé 3.8a (cire blanche, 162 mg, 0,10 mmol, 43 %) a été obtenu à partir du composé 3.3f et du 1 ,17-diazido-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecane (non décrit) en suivant le protocole général I.
Rf = 0,15 (CH2CI2/MeOH 96:4) ; RMN 1H (500 MHz, CDCI3) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1 ,18-1 ,34 (m, 40H), 1 ,53-1 ,67 (m, 4H), 1 ,94-2,08 (m, 2H), 2,13-2,29 (m, 6H), 2,29-2,51 (m, 4H), 3,49-3,66 (m, 18H), 3,79-3,89 (m, 4H), 3,87-4,06 (m, 2H), 4,39-4,53 (m, 4H), 4,53-4,79 (m, 8H), 5,07 (s, 4H), 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 2H), 5,15 (d, J = 12,5 Hz, 2H), 6,67 (bs, 2H, NH), 7,24-7,39 (m, 20H), 7,45 (s, 2H), 7,73 (bs, 2H, NH) ; RMN 13C (125 MHz, CDCI3) δ ppm 14,2 (2xCH3), 22,8 (2xCH2), 25,7 (2xCH2), 27,1 (2xCH2), 29,4-29,8 (16xCH2), 30,1 (2xCH2), 32,0 (2xCH2), 36,6 (2xCH2), 50,5 (2xCH2), 52,0 (2xCH), 52,6 (2xCH), 64,5 (2xCH2), 66,6 (2xCH2), 67,3 (2xCH2), 69,4 (2xCH2), 69,6 (2xCH2), 70,6 (8xCH2), 123,9 (2xCH), 128,3-128,7 (20xCH), 135,4 (2xC), 135,9 (2xC), 144,2 (2xC), 170,2 (2xC), 171 ,3 (2xC), 172,6 (2xC), 173,7 (2xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 721 (30), 1072 (100), 1680 (75) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C90H133N10O19 1657,9748, trouvée 1657,9785.
Composé 3.9a
Figure imgf000071_0001
Le composé 3.9a (solide blanc, 107 mg, 0,08 mmol, 95 %) a été obtenu à partir du composé 3.8a en suivant le protocole général D1 .
Tf = 74-76°C ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 1 ,22-1 ,37 (m, 40H), 1 ,56-1 ,66 (m, 4H), 1 ,85-2,00 (m, 2H), 2,13-2,25 (m, 2H), 2,24-2,32 (m, 4H), 2,29-2,42 (m, 4H), 3,53-3,66 (m, 16H), 3,68-3,75 (m, 2H), 3,75-3,83 (m, 2H), 3,89 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 4,37-4,51 (m, 2H), 4,57 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 4,59-4,69 (m, 6H), 8,04 (s, 2H) ; RMN 13C (125 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (2xCH3), 23,7 (2xCH2), 26,8 (2xCH2), 28,1 (2xCH2), 29,3-29,7 (16xCH2), 31 ,1 (2xCH2), 33,1 (2xCH2), 36,8 (2xCH2), 51 ,4 (2xCH2), 52,2 (2xCH), 54,6 (2xCH), 65,1 (2xCH2), 70,3 (2xCH2), 70,9 (2xCH2), 71 ,4-71 ,5 (8xCH2), 126,0 (2xCH), 145,4 (2xC), 171 ,9 (2xC), 174,9 (2xC), 176,4 (2xC), 176,4 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 647 (100) [M-2H]2" ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C62Hi09NioOi9 1297,7870, trouvée 1297,7860. Exemple 5: Composés 4.1 à 4.6
Figure imgf000072_0001
i. H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (2 équiv.), TBTU (1 ,2 équiv.), DIEA (5 équiv.), DMF ; ii. H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (3 équiv.), TBTU (1 ,2 équiv.), DIEA (10 équiv.), DMF ; iii. TFA, CH2CI2 ; iv. CH3(CH2)nCOCI, DMAP, pyridine, CH2CI2 ; v. Pd/C 5%, THF. Composé 4.1
Figure imgf000073_0001
L'ensemble des réactifs, acide /V-Boc-L-aspartique 4-benzyl ester (2,00 g, 6,19 mmol), H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (6,18 g, 12,37 mmol, 2 équiv.), TBTU (2,39 g, 7,43 mmol, 1 ,2 équiv.) et DIEA (4,0 g, 30,9 mmol, 5 équiv.), est solubilisé dans du DMF (80 mL). Après 16 h d'agitation à TA, le milieu réactionnel est dilué avec de l'eau et extrait à l'AcOEt. Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée de NaHCO3, à l'eau, avec une solution aqueuse saturée de NaCI puis séchées sur MgSO4 et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de CH2CI2 et le produit est précipité avec de l'éther à froid. Le précipité est récupéré par filtration sur Buchner en utilisant un papier filtre pour donner 2,07 g d'un solide blanc avec 53% de rendement.
Rf = 0,44 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 102 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 1 ,44 (s, 9H), 1 ,95-2,06 (m, 1 H), 2,18-2,47 (m, 3H), 2,72 (dd, J = 17,0, 5,9 Hz, 1 H), 3,01 (dd, J = 17,1 , 4,0 Hz, 1 H), 4,50-4,59 (m, 1 H), 4,59- 4,66 (m, 1 H), 5,05-5,20 (m, 6H), 5,63 (d, J = 8,1 Hz, NH), 7,16 (d, J = 7,3 Hz, NH), 7,28-7,41 (m, 15H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 27,2 (CH2), 28,2 (3xCH3), 30,0 (CH2), 35,8 (CH2), 50,6 (CH), 51 ,8 (CH), 66,5 (CH2), 66,8 (CH2), 67,3 (CH2), 80,7 (C), 128,1 -128,7 (15xCH), 135,1 (C), 135,4 (C), 135,7 (C), 155,6 (C), 170,7 (C), 171 ,1 (C), 171 ,5 (C), 172,4 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 655 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C35H40N2O9Na 655,2632 [M+Na]+, trouvée 655,2624.
Composé 4.2
Figure imgf000073_0002
L'ensemble des réactifs, acide /V-Boc-L-aspartique (1 ,00 g, 4,28 mmol), H-D-Glu(OBn)-OBn.p-tosylate (6,22 g, 12,84 mmol, 3 équiv.), TBTU (3,3 g, 10,27 mmol, 1 ,2 équiv.) et DIPEA (5,54 g, 42,8 mmol, 10 équiv.), est solubilisé dans du DMF (60 mL). Après 16 h d'agitation à TA, le milieu réactionnel est dilué avec de l'eau et extrait à l'AcOEt. Les phases organiques combinées sont lavées avec une solution saturée de NaHCO3, à l'eau, avec une solution aqueuse saturée de NaCI puis séchées sur MgSO4 et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de CH2CI2 et le produit est précipité avec de l'éther à froid. Le précipité est récupéré par filtration sur Buchner en utilisant un papier filtre pour donner 3,13 g d'un solide blanc avec 86% de rendement.
Rf = 0,56 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 89 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm 1 ,43 (s, 9H), 1 ,93-2,05 (m, 2H), 2,15-2,28 (m, 2H), 2,29-2,45 (m, 4H), 2,47-2,56 (m, 1 H), 2,79-2,89 (m, 1 H), 4,47 (m, 1 H), 4,54-4,62 (m, 2H), 5,07 (s, 4H), 5,1 1 (s, 4H), 5,96 (d, J = 5,5 Hz, NH), 6,78 (d, J = 7,4 Hz, NH), 7,38- 7,27 (m, 20H), 7,41 (d, J = 7,0 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCI3) δ ppm 26,8 (CH2), 27,0 (CH2), 28,4 (3xCH3), 30,2 (CH2), 30,3 (CH2), 37,5 (CH2), 51 ,5 (CH), 52,0 (CH), 52,1 (CH), 66,6 (CH2), 66,7 (CH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 80,6 (C), 128,3-128,8 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (C), 135,9 (C), 155,9 (C), 170,8 (2xC), 171 ,4 (C), 171 ,7 (C), 172,5 (C), 172,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 850,4 [M-H]", 886,4 (100) [M+CI]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C 7H52N3Oi2 850,3551 [M-H]-, trouvée 850,3510.
Composé 4.3a
Figure imgf000074_0001
Le composé 4.3a (solide blanc, 431 mg, 0,63 mmol, 79 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,30 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 87 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,15-1 ,36 (m, 12H), 1 ,50-1 ,64 (m, 2H), 1 ,94-2,05 (m, 1 H), 2,14 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,14-2,45 (m, 3H), 2,76-2,92 (m, 2H, H3'), 4,59-4,67 (m, 1 H), 4,96-5,02 (m, 1 H), 5,03-5,16 (m, 6H), 7,13 (d, J = 7,7 Hz, NH), 7,20-7,36 (m, 15H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 13,9 (CH3), 22,5 (CH2), 25,3 (CH2), 26,7 (CH2), 29,8 (CH2), 29,0-29,3 (4xCH2), 31 ,7 (CH2), 35,8 (CH2), 36,0 (CH2), 49,0 (CH), 51 ,7 (CH), 66,2 (CH2), 66,4 (CH2), 66,9 (CH2), 127,9-128,4 (15xCH), 135,1 (C), 135,4 (C), 135,6 (C), 170,6 (C), 170,8 (C), 170,9 (C), 172,2 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 687 [M+H]+, 709 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C 0H5iN2O8Na 709,3465 [M+Na]+, trouvée 709,3461 . Composé 4.3b
Figure imgf000075_0001
Le composé 4.3b (solide blanc, 424 mg, 0,59 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,31 (cyclohexane/AcOEt7:3) ; Tf = 75 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,15-1 ,36 (m, 16H), 1 ,50-1 ,64 (m, 2H), 1 ,93-2,04 (m, 1 H), 2,13 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,14-2,45 (m, 3H), 2,73-2,93 (m, 2H), 4,57-4.66 (m, 1 H), 4,91 -5,00 (m, 1 H), 5,01 -5,16 (m, 6H), 7,01 (bs, NH), 7,22-7,36 (m, 15H), 7,50 (bs, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,5 (CH2), 25,4 (CH2), 26,8 (CH2), 29,0-29,6 (6xCH2), 29,9 (CH2), 31 ,8 (CH2), 35,7 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51 ,7 (CH), 66,3 (CH2), 66,6 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C), 135,4 (C), 135,7 (C), 170,5 (C), 171 ,0 (2xC), 172,3 (C), 173,6 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 715 [M+H]+, 737 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C42H54N2O8Na 737.3778 [M+Na]+, trouvée 737,3781 .
Composé 4.3c
Figure imgf000076_0001
Le composé 4.3c (solide blanc, 523 mg, 0,71 mmol, 86 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,34 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 75 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,16-1 ,36 (m, 20H), 1 ,49-1 ,65 (m, 2H), 1 ,93-2,04 (m, 1 H), 2,13 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,16-2,45 (m, 3H), 2,74-2,91 (m, 2H), 4,57-4,65 (m, 1 H), 4,95-5,02 (m, 1 H), 5,02-5,14 (m, 6H), 7,17 (d, J = 8,4 Hz, NH), 7,20-7,34 (m, 15H), 7,61 (d, J = 8,0 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,6 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 29,0-29,6 (8xCH2), 29,9 (CH2), 31 ,8 (CH2), 35,8 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51 ,8 (CH), 66,3 (CH2), 66,5 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C), 135,4 (C), 135,7 (C), 170,7 (C), 170,9 (2xC), 172,3 (C), 173,7 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 743 [M+H]+, 765 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C44H58N2O8Na 765,4091 [M+Na]+, trouvée 765,4079.
Composé 4.3d
Figure imgf000076_0002
Le composé 4.3d (solide blanc, 523 mg, 0,68 mmol, 89 %) a été obtenu à partir du composé 4.1 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,37 (cyclohexane/AcOEt 7:3) ; Tf = 85-86°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,15-1 ,35 (m, 24H), 1 ,49-1 ,63 (m, 2H), 1 ,92- 2,04 (m, 1 H), 2,12 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,13-2,45 (m, 3H), 2,73-2,93 (m, 2H), 4,57-4,65 (m, 1 H), 4,92-5,01 (m, 1 H), 5,01 -5,14 (m, 6H), 7,17 (bs, NH), 7,19-7,36 (m, 15H), 7,61 (bs, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,0 (CH3), 22,5 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 29,0-29,6 (1 1 xCH2), 29,9 (CH2), 31 ,8 (CH2), 35,7 (CH2), 36,1 (CH2), 49,1 (CH), 51 ,7 (CH), 66,1 (CH2), 66,5 (CH2), 67,0 (CH2), 127,9-128,5 (15xCH), 135,2 (C), 135,4 (C), 135,7 (C), 170,6 (C), 171 ,0 (2xC), 172,2 (C), 173,5 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 793 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C46H62N2O8Na 793,4404 [M+Na]+, trouvée 793,4420. Composé 4.4a
Figure imgf000077_0001
Le composé 4.4a (solide blanc, 437 mg, 0,48 mmol, 82 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,27 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 130-133 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,18-1 ,38 (m, 12H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,94-2,06 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,30-2,48 (m, 5H), 2,88 (dd, J = 14,9, 3,2 Hz, 1 H), 4,52-4,63 (m, 2H), 4,73-4,80 (m, 1 H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,93 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,13 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,51 (d, J = 7,6 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,7 (CH2), 25,5 (CH2), 26,6 (CH2), 26,8 (CH2), 29,2-29,5 (3xCH2), 30,1 (CH2), 30,2 (CH2), 31 ,9 (2xCH2), 36,4 (CH2), 37,1 (CH2), 49,9 (CH), 51 ,9 (CH), 52,1 (CH), 66,5 (2xCH2), 67,2 (CH2), 67,4 (CH2), 128,1 -128,7 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (2xC), 170,0 (C), 171 ,1 (C), 171 ,3 (C), 171 ,8 (C), 172,3 (C), 172,5 (C), 174,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 907 [M+H]+ , 929 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour C52H63N3Oi iNa 928,4360 [M+Na]+, trouvée 928,4380.
Composé 4.4b COOBn
BnOOC
COOBn
BnOOC
Le composé 4.4b (solide blanc, 430 mg, 0,46 mmol, 78 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,33 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 1 12-1 14°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,37 (m, 16H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,94-2,07 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,30-2,47 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 14,9, 3,3 Hz, 1 H), 4,52-4,63 (m, 2H), 4,74-4,80 (m, 1 H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,96 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,14 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,52 (d, J = 7,6 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,1 (CH3), 22,6 (CH2), 25,5 (CH2), 26,7 (2xCH2), 29,2-29,7 (5xCH2), 30,0 (CH2), 30,2 (CH2), 31 ,8 (2xCH2), 36,3 (CH2), 37,1 (CH2), 49,9 (CH), 51 ,8 (CH), 52,0 (CH), 66,4 (2xCH2), 67,1 (CH2), 67,2 (CH2), 128,0-128,6 (20xCH), 135,1 (C), 135,2 (C), 135,7 (C), 135,8 (C), 170,9 (C), 171 ,0 (C), 171 ,3 (C), 171 ,7 (C), 172,3 (C), 172,4 (C), 174,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z {%) 935 [M+H]+, 957 (100) [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour
Figure imgf000078_0001
956,4673 [M+Na]+, trouvée 956,4682.
Composé 4.4c
Figure imgf000078_0002
Le composé 4.4c (solide blanc, 437 mg, 0,45 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0,39 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 1 12-1 16 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H) , 1 ,16-1 ,35 (m, 20H), 1 ,56-1 ,65 (m, 2H), 1 ,93-2,06 (m, 2H), 2,15-2,28 (m, 4H), 2,30-2,47 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 14,9, 3,0 Hz, 1 H), 4,51 -4,63 (m, 2H), 4,72-4,80 (m, 1 H), 5,05-5,14 (m, 8H), 6,94 (d, J = 7,4 Hz, NH), 7,1 1 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 10H), 7,50 (d, J = 7,7 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6 (CH2), 26,7 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,9 (7xCH2), 30,3 (CH2), 30,4 (CH2), 32,1 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 49,9 (CH), 52,2 (CH), 52,3 (CH), 66,7 (2xCH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 128,3-128,9 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,9 (2xC), 171 ,2 (2xC), 171 ,3 (C), 171 ,9 (C), 172,5 (C), 172,6 (C), 174,1 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 963 (100) [M+H]+, 985 [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CseH/iNsOnNa 984,4986 [M+Na]+, trouvée 984,4996.
Composé 4.4d
Figure imgf000079_0001
Le composé 4.4d (solide blanc, 436 mg, 0,44 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 4.2 en suivant les protocoles généraux G puis C.
Rf = 0.42 (CH2CI2/AcOEt 8:2) ; Tf = 120-124 °C ; RMN 1H (400 MHz
CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,19-1 ,35 (m, 24H), 1 ,55-1 ,66 (m, 2H), 1 ,94-2,07 (m, 2H), 2,16-2,28 (m, 4H), 2,29-2,50 (m, 5H), 2,88 (dd, J = 14,9, 3,3 Hz, 1 H), 4,52-4,64 (m, 2H), 4,73-4,81 (m, 1 H), 5,04-5,17 (m, 8H), 6,99 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,16 (d, J = 7,5 Hz, NH), 7,27-7,38 (m, 20H), 7,53 (d, J = 7,6 Hz, NH) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 25,6
(CH2), 26,7 (CH2), 26,9 (CH2), 29,3-29,9 (1 1xCH2), 30,3 (CH2), 30,4 (CH2), 32,1 (2xCH2), 36,6 (CH2), 37,2 (CH2), 49,9 (CH), 52,2 (2xCH), 66,6 (CH2), 66,7 (CH2), 67,4 (CH2), 67,6 (CH2), 128,3-128,8 (20xCH), 135,2 (C), 135,3 (C), 135,8 (C), 135,9 (C), 171 ,2 (2xC), 171 ,3 (C), 171 ,9 (C), 172,5 (C), 172,6 (C), 174,2 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 991 (100) [M+H]+, 1013 [M+Na]+ ; SMHR (ESI+) m/z calculée pour CssH/sNsOn Na 1012,5299 [M+Na]+, trouvée 1012,5296.
Composé 4.5a
Figure imgf000080_0001
Le composé 4.5a (solide blanc, 175 mg, 0,42 mmol, 72 %) a été obtenu à partir du composé 4.3a en suivant le protocole général D2.
Tf = 160-162°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,39 (m, 12H), 1 ,55-1 ,68 (m, 2H), 1 ,90-2,02 (m, 1 H), 2,14-2,24 (m, 1 H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,42 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,3 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,4 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,3, 6,4 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 33,0 (CH2), 30,2-31 ,1 (4xCH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51 ,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,4 (C), 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 397 (100) [M-F]", 415 [M-H]", 437 [M+Na- 2H]- ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ci9H3iN2O8 415,2080 [M-H]", trouvée 415,2093.
Composé 4.5b
Figure imgf000080_0002
Le composé 4.5b (solide blanc, 190 mg, 0,43 mmol, 77 %) a été obtenu à partir du composé 4.3b en suivant le protocole général D2.
Tf = 151 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 1 ,20-1 ,41 (m, 16H), 1 ,55-1 ,68 (m, 2H), 1 ,90-2,02 (m, 1 H), 2,14-2,24 (m, 1 H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,42 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,2 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,5 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,7, 4,8 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,2, 6,5 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31 ,1 (6xCH2), 33,06 (CH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51 ,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 425 [M-F]~, 443 (100) [M-H]", 465 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C2iH35N2O8 443,2393 [M-H]-, trouvée 443,2396.
Composé 4.5c
Figure imgf000081_0001
Le composé 4.5c (solide blanc, 194 mg, 0,41 mmol, 76 %) a été obtenu à partir du composé 4.3c en suivant le protocole général D2.
Tf = 145-148 RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J
3H), 1 ,20-1 ,40 (m, 20H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,91 -2,02 (m, 1 H), 2,14-2,24 (m, 1 H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,7, 7,2 Hz, 1 H), 2,85 (dd, J = 16,7, 6,4 Hz, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,2, 6,4 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31 ,1 (10xCH2), 33,1 (CH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51 ,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,8 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 453 [M-F]", 471 (100) [M-H]", 493 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C23H39N2O8 471 ,2706 [M-H]", trouvée 471 ,2686.
Composé 4.5d
Figure imgf000081_0002
Le composé 4.5d (solide blanc, 243 mg, 0,49 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 4.3d en suivant le protocole général D2.
Tf = 138-141 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1 ,23-1 ,38 (m, 24H), 1 ,56-1 ,67 (m, 2H), 1 ,91 -2,02 (m, 1 H), 2,15-2,24 (m, 1 H), 2,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-2,43 (m, 2H), 2,66 (dd, J = 16,6, 7,2 Hz, 1 H), 2,86 (dd, J = 16,6, 6,3, 1 H), 4,43 (dd, J = 8,8, 4,8, Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 7,2, 6,3 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 30,2-31 ,1 (12xCH2), 33,1 (CH2), 36,7 (CH2), 36,9 (CH2), 51 ,1 (CH), 53,2 (CH), 173,0 (C), 173,9 (C), 174,5 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 481 [M-F]", 499 (100) [M-H]", 521 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C25H43N2O8 499,3019 [M-H]-, trouvée 499,3027.
Composé 4.6a
Figure imgf000082_0001
Le composé 4.6a (solide blanc, 221 mg, 0,40 mmol, 93 %) a été obtenu à partir du composé 4.4a en suivant le protocole général D2.
Tf = 170-175°C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,37 (m, 12H), 1 ,54-1 ,66 (m, 2H), 1 ,87-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J = 15,1 , 8,0 Hz, 1 H), 2,80 (dd, J = 15,1 , 6,1 Hz, 1 H), 4,40-4,48 (m, 2H), 4,80 (dd, J = 8,0 6,1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2), 30,4 (2xCH2), 30,5 (CH2), 30,6 (CH2), 31 ,1 (CH2), 31 ,2 (CH2), 33,0 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51 ,6 (CH), 53,0 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 544 (100) [M-H]", 566 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C24H38N3On 544,2506 [M-H]", trouvée 544,2514. Composé 4.6b
Figure imgf000083_0001
Le composé 4.6b (solide blanc, 247 mg, 0,43 mmol, 98 %) a été obtenu à partir du composé 4.4b en suivant le protocole général D2.
Tf = 165-170 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) 1 ,20-1 ,38 (m, 16H), 1 ,54-1 ,66 (m, 2H), 1 ,88-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J = 15,1 8,1 Hz, 1 H), 2,80 (dd, J = 15,1 , 6,1 Hz, 1 H), 4,39-4,48 (m, 2H), 4,79 (dd, J = 8,1 , 6,1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 28,0 (CH2), 28,1 (CH2), 30,3-31 ,3 (8xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51 ,7 (CH), 53,2 (CH), 53,3 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,7 (C), 175,2 (C), 176,5 (C), 176,6 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 572 [M-H]", 594 (100) [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour C26H42N3Oii 572,2819 [M-H]", trouvée 572,2817.
Composé 4.6c
Figure imgf000083_0002
Le composé 4.6c (solide blanc, 208 mg, 0,35 mmol, 80 %) a été obtenu à partir du composé 4.4c en suivant le protocole général D2.
Tf = 155-160 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,22-1 ,38 (m, 20H), 1 ,54-1 ,67 (m, 2H), 1 ,87-2,02 (m, 2H), 2,13-2,29 (m, 4H), 2,36-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J = 15,0, 8,0 Hz, 1 H), 2,81 (dd, J = 15,0, 6,1 Hz, 1 H), 4,40-4,48 (m, 2H), 4,77-4,83 (dd, J = 8,0, 6,1 , 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2), 31 ,3-30,3 (10xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51 ,6 (CH), 53,0 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 600 (100) [M-H]~, 622 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI-) m/z calculée pour Ο28Η46Ν3Οιι 600,3132 [M-H]~ ; trouvée 600,3108.
Composé 4.6d
Figure imgf000084_0001
Le composé 4.6d (solide blanc, 208 mg, 0,33 mmol, 75 %) a été obtenu à partir du composé 4.4d en suivant le protocole général D2.
Tf = 158-160 °C ; RMN 1H (400 MHz, MeOD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H) , 1 ,22-1 ,37 (m, 24H), 1 ,54-1 ,66 (m, 2H), 1 ,85-2,02 (m, 2H), 2,13-2,28 (m, 4H), 2,35-2,44 (m, 4H), 2,63 (dd, J = 15,1 , 8,0 Hz, 1 H), 2,80 (dd, J = 15,1 , 6,1 Hz, 1 H), 4,42-4,48 (m, 2H), 4,79 (dd, J = 8,0, 6,1 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, MeOD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (CH2), 26,8 (CH2), 27,9 (CH2), 28,0 (CH2), 30,3-31 ,3 (12xCH2), 33,1 (CH2), 36,9 (CH2), 38,4 (CH2), 51 ,7 (CH), 53,1 (CH), 53,2 (CH), 172,1 (C), 173,1 (C), 174,6 (C), 175,0 (C), 176,4 (C), 176,5 (2xC) ; Masse (ESI-) m/z (%) 628 (100) [M-H]", 650 [M+Na-2H]" ; SMHR (ESI- ) m/z calculée pour C30H50N3O11 628,3445 [M-H]- ; trouvée 628,3448.
Exemple 6: Composés 5.1 à 5.3
Figure imgf000085_0001
i. EtsSiH, TFA, CH2CI2 puis CH3(CH2)n-2CHCH2, DMPA, THF ; ii. Ethylaminomaltoside (acétate), TBTU, DIEA, DMF ; iii. Et2NH, CH2CI2 ; iv. RCOOH (R = EtO2C(CH2)2CHCO2Me), TBTU, DIEA, DMF ; v. MeONa, MeOH puis Dowex ; vi. LiOH, THF/H2O.
Composé 5.1 a
Figure imgf000085_0002
NHFmoc
Le composé 5.1 a (solide blanc, 1 ,051 g, 2,06 mmol, 60 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et du dodécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 66-68°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,40 (m, 18H), 1 ,57 (m, 2H), 2,56 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H), 4,41 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 4,63 (m, 1 H), 5,65 (d, J = 7,8 Hz, NHFmoc), 7,32 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 28,8- 32,1 (9xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2), 120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 175,0 (C) ; Masse (ESI+) m/z {%) 512 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C3oH42NO S 512,2829, trouvée 512,2823.
Composé 5.1 b
Figure imgf000086_0001
NHFmoc Le composé 5.1 b (solide blanc, 1 ,050 g, 1 ,95 mmol, 57 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et du tetradécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 71 -72°C; RMN 1 H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,40 (m, 22H), 1 ,57 (m, 2H), 2,55 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H), 4,41 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,63 (m, 1 H), 5,65 (d, J = 7,8 Hz, NHFmoc), 7,31 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,2 (CH3), 22,8 (CH2), 28,8- 32,1 (1 1xCH2), 33,1 (CH2), 34,3 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2), 120,1 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,4 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 175,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 316 (100), 538 (40) [M+H]- ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C32H44NO4S 538,2991 [M-H]", trouvée 538,2970. Composé 5.1 c
Figure imgf000087_0001
Le composé 5.1 c (solide blanc, 1 ,248 g, 2,20 mmol, 64 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et de l'hexadécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 70°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,14-1 ,40 (m, 26H), 1 ,57 (m, 2H), 2,56 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,5 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H), 4,41 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,62 (m, 1 H), 5,65 (d, J = 7,7 Hz, NHFmoc), 7,31 (m, 2H,), 7,40 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 28,8-32,1 (13xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,3 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2), 120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 174,9 (C) ; Masse (ESI+) m/z (%) 568 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C34H5oNO S 568,3455 [M+H]+, trouvée 568,3451 . Composé 5.1 d
Figure imgf000087_0002
NHFmoc
Le composé 5.1 d (solide blanc, 1 ,230 g, 2,07 mmol, 60 %) a été obtenu à partir de L-Fmoc-Cys(Trt)-OH et de l'octadécène en suivant le protocole général L.
Rf = 0,16 (CH2CI2/MeOH/AcOH 99:0,5:0,5) ; Tf = 74°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,13-1 ,40 (m, 30H), 1 ,57 (m, 2H), 2,56 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 3,03 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 7,0 Hz, 1 H), 4,42 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 4,62 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 5,64 (d, J = 7,6 Hz, NHFmoc), 7,32 (m, 2H), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 22,8 (CH2), 28,9- 32,1 (15xCH2), 33,1 (CH2), 34,2 (CH2), 47,2 (CH), 53,6 (CH), 67,6 (CH2), 120,2 (2xCH), 125,3 (2xCH), 127,3 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,8 (C), 143,9 (C), 156,1 (C), 174,8 (C) ; Masse (ESI+) m/z {%) 596 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C36H54NO S 596,3768 [M+H]+, trouvée 596,3762. Composé 5.2a
Figure imgf000088_0001
Le composé 5.2a (solide incolore, 1 ,036 g, 0,87 mmol, 60 %) a été obtenu à partir du composé 5.1 a et du 2'-aminoéthyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0- acétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 84-85°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,16-1 ,38 (m, 18H), 1 ,50-1 ,62 (m, 2H), 1 ,99, 1 ,99, 2,01 , 2,01 , 2,03, 2,08, 2,1 1 (s, 21 H), 2,45-2,60 (m, 2H), 2,76-2,96 (m, 2H), 3,32-3,44 (m, 1 H), 3,46-3,56 (m, 1 H), 3,61 -3,71 (m, 2H), 3,75-3,84 (m, 1 H), 3,90-3,98 (m, 2H), 4,03 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1 H), 4,15 (dd, J = 12,2, 4,4 Hz, 1 H), 4,18-4,28 (m, 3H), 4,34-4,47 (m, 2H), 4,51 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,52 (dd, J = 12,2, 2,5 Hz, 1 H), 4,79 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1 H), 4,84 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,23 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,7 Hz, 1 H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 5,77 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,27- 7,33 (m, 2H), 7,41 -7,47 (m, 2H), 7,59 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,4 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 20,6-21 ,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (9xCH2), 32,8 (CH2), 34,8 (CH2), 39,7 (CH2), 47,3 (CH), 54,5 (CH), 61 ,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,2 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH), 100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (CH), 125,3 (CH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C), 170,5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1 196 (100) [M+Na]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C58H8iN2O2iS 1 195,4872 [M+Na]+, trouvée 1 195,4875.
Composé 5.2b
Figure imgf000089_0001
Le composé 5.2b (solide incolore, 708 mg, 0,60 mmol, 63 %) a été obtenu à partir du composé 5.1 b et du 2'-aminoéthyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0- acétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 90-91 °C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1 ,18-1 ,39 (m, 22H), 1 ,52-1 .62 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,12 (s, 21 H), 2,48-2,60 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,31 -3,45 (m, 1 H), 3,49-3,58 (m, 1 H), 3,62-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1 H), 3,91 -3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1 H), 4,16 (dd, J = 12,1 , 4,4 Hz, 1 H), 4,20-4,28 (m, 3H), 4,35-4,48 (m, 2H), 4,53 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,54 (dd, J = 12,1 , 2,5 Hz, 1 H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1 H), 4,85 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,25 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,7 Hz, 1 H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 5,75 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,28- 7,34 (m, 2H), 7,3-7,43 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 20,6-21 ,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (1 1 xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,7 (CH2), 47,3 (CH), 54,5 (CH), 61 ,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH), 100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C), 170,5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1201 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C6oH85N2O2iS 1201 .5360 [M+H]+, trouvée 1201 .5359.
Composé 5.2c
Figure imgf000090_0001
Le composé 5.2c (solide incolore, 331 mg, 0,27 mmol, 31 %) a été obtenu à partir du composé 5.1 c et du 2'-aminoéthyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0- acétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 98-99°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,16-1 ,40 (m, 26H), 1 ,52-1 .62 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,12 (s, 21 H), 2,49-2,59 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,34-3,45 (m, 1 H), 3,47-3,58 (m, 1 H), 3,62-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1 H), 3,91 -3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1 H), 4,15 (dd, J = 12,1 , 4,4 Hz, 1 H), 4,20-4,28 (m, 3H), 4,35-4,47 (m, 2H), 4,53 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 4,54 (dd, J = 12,1 , 2,5 Hz, 1 H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,9 Hz, 1 H), 4,85 (dd, J = 10,4, 4,0 Hz, 1 H), 5,05 (t, J = 9,6 Hz, 1 H), 5,24 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,35 (dd, J = 10,4, 9,6 Hz, 1 H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 5,75 (s, NH), 6,66 (s, NH), 7,28- 7,34 (m, 2H), 7,37-7,43 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 20,6-21 ,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (13xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,6 (CH2), 47,3 (CH), 54,6 (CH), 61 ,6 (CH2), 62,6 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH), 100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C), 170,5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1230 (100) [M+Na]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C62H89N2O2iS 1229,5673 [M+H]+, trouvée 1229,5680.
Composé 5.2d
Figure imgf000091_0001
Le composé 5.2d (solide incolore, 679 mg, 0,54 mmol, 63 %) a été obtenu à partir du composé 5.1 d et du 2'-aminoéthyl-4-0-(2,3,4,6-tetra-0- acétyl-a-D-glucopyranosyl)-2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranoside (non décrit) en suivant le protocole général A.
Rf = 0,29 (Cyclohexane/AcOEt 5:5) ; Tf = 100°C ; RMN 1H (400 MHz, CDCIs) δ ppm 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,17-1 ,40 (m, 30H), 1 ,52-1 .63 (m, 2H), 2,00, 2,00, 2,02, 2,02, 2,04, 2,09, 2,13 (s, 21 H), 2,48-2,60 (m, 2H), 2,77-2,97 (m, 2H), 3,34-3,46 (m, 1 H), 3,47-3,58 (m, 1 H), 3,63-3,73 (m, 2H), 3,77-3,85 (m, 1 H), 3,91 -3,99 (m, 2H), 4,04 (dd, J = 12,4, 2,2 Hz, 1 H), 4,16 (dd, J = 12,2, 4,4 Hz, 1 H), 4,20-4,29 (m, 3H), 4,36-4,48 (m, 2H), 4,52 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 4,54 (dd, J = 12,2, 2,6 Hz, 1 H), 4,80 (dd, J = 9,3, 7,8 Hz, 1 H), 4,85 (dd, J = 10,5, 4,0 Hz, 1 H), 5,06 (t, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,25 (t, J = 9,3 Hz, 1 H), 5,36 (dd, J = 10,5, 9,7 Hz, 1 H), 5,39 (d, J = 4,0 Hz, 1 H), 5,75 (s, NH), 6,64 (s, NH), 7,29- 7,34 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,60 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H) ; RMN 13C (100 MHz, CDCIs) δ ppm 14,3 (CH3), 20,5-21 ,1 (7xCH3), 22,8 (CH2), 28,9-32,1 (15xCH2), 32,8 (CH2), 34,7 (CH2), 39,6 (CH2), 47,3 (CH), 54,6 (CH), 61 ,6 (CH2), 62,7 (CH2), 67,3 (CH2), 68,1 (CH), 68,6 (CH2), 68,7 (CH), 69,5 (CH), 70,2 (CH), 72,3 (CH), 72,6 (2xCH), 75,3 (CH), 95,7 (CH), 100,5 (CH), 120,2 (2xCH), 125,2 (2xCH), 127,2 (2xCH), 127,9 (2xCH), 141 ,5 (2xC), 143,9 (2xC), 156,0 (C), 169,6 (C), 170,0 (C), 170,1 (C), 170,3 (C), 170,5 (C), 170,7 (3xC) ; Masse (ESI+) m/z (%) 1258 (100) [M+H]+ ; HRMS (ESI+) m/z calculée pour C64H93N2O21S 1257,5986 [M+H]+, trouvée 1257,5984.
Composé 5.3a
Figure imgf000092_0001
Le composé 5.3a (solide blanc, 50 mg, 0,06 mmol, 35 %) a été obtenu sous forme d'un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2a et de l'acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf = 96-98°C ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,44 (m, 18H), 1 ,53-1 ,63 (m, 2H), 1 ,70-1 ,82 (m, 1 H), 1 ,84-1 ,98 (m, 1 H), 2,08-2,22 (m, 2H), 2,34-2,43 (m, 2H), 2,52-2,60 (m, 2H), 2,70-2,89 (m, 1 H), 2,90-3,07 (m, 1 H), 3,22-3,31 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,46 (dd, J = 9,8, 3,8 Hz, 1 H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,73 (m, 5H), 3,77-3,95 (m, 4H), 4,29-4,35 (m, 1 H), 4,46-4,58 (m, 1 H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1 H) ; RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,8 (9xCH2), 32,1 -32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,3-34,8 (CH2), 40,6- 40,8 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-55,0 (CH), 62,0-62,2 (CH2), 62,7 (CH2), 69,1 -69,4 (CH2), 71 ,4 (CH), 74,1 (CH), 74,6-74,7 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,5-77,7 (CH), 81 ,0-81 ,3 (CH), 102,8 (CH), 104,1 -104,4 (CH), 171 ,3-171 ,6 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3-176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 384 (25) [M-CO2H]2", 813 (100) [M-H]" ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C35H6iN2Oi7S 813,3686 [M-H]-, trouvée 813,3651 . Composé 5.3b
Figure imgf000093_0001
Le composé 5.3b (solide blanc, 52 mg, 0,06 mmol, 26 %) a été obtenu sous forme d'un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2b et de l'acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 130°C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,44 (m, 22H), 1 ,53-1 ,63 (m, 2H), 1 ,72-1 ,83 (m, 1 H), 1 ,82-2,00 (m, 1 H), 2,07-2,23 (m, 2H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,52-2,61 (m, 2H), 2,70-2,90 (m, 1 H), 2,90-3,07 (m, 1 H), 3,22-3,30 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,43-3,48 (m, 1 H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,73 (m, 5H), 3,77-3,95 (m, 4H), 4,29-4,35 (m, 1 H), 4,46-4,58 (m, 1 H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1 H). RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,4 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,8 (1 1 xCH2), 32,1 -32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,3-34,8 (CH2), 40,6-40,8 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-55,0 (CH), 62,0-62,2 (CH2), 62,7 (CH2), 69,1 -69,4 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,6-77,7 (CH), 81 ,0-81 ,1 (CH), 102,9 (CH), 104,2- 104,4 (CH), 171 ,0-171 ,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3-176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z {%) 841 (100) [M-H]- ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C37H65N2Oi7S 841 ,4004 [M-H]", trouvée 841 ,4025.
Composé 5.3c
Figure imgf000093_0002
Le composé 5.3c (solide blanc, 82 mg, 0,09 mmol, 41 %) a été obtenu sous forme d'un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2c et de l'acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 145°C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,44 (m, 26H), 1 ,53-1 ,63 (m, 2H), 1 ,72-1 ,82 (m, 1 H), 1 ,82-2,00 (m, 1 H), 2,08-2,23 (m, 2H), 2,32-2,45 (m, 2H), 2,52-2,61 (m, 2H), 2,70-2,90 (m, 1 H), 2,90-3,07 (m, 1 H), 3,22-3,31 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,46 (dd, J = 9,7, 3,7 Hz, 1 H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,74 (m, 5H), 3,78- 3,95 (m, 4H), 4,30-4,35 (m, 1 H), 4,46-4,57 (m, 1 H), 5,16 (d, J = 3,7 Hz, 1 H). RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,9 (13xCH2), 32,1 -32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,2-34,7 (CH2), 40,6-40,9 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,3-54,9 (CH), 61 ,9-62,1 (CH2), 62,7 (CH2), 69,0-69,4 (CH2), 71 ,4 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,5 (CH), 77,6 (CH), 81 ,0-81 ,2 (CH), 102,8 (CH), 104,1 -104,3 (CH), 171 ,0-171 ,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3- 176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z (%) 412 (25) [M-CO2H]2", 869 (100) [M-H]" ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour CsgHegNbOi/S 869,4317 [M-H]", trouvée 869,4340.
Composé 5.3d
Figure imgf000094_0001
Le composé 5.3d (solide blanc, 81 mg, 0,09 mmol, 30 %) a été obtenu sous forme d'un mélange de diastéréoisomères à partir du composé 5.2d et de l'acide 5-éthoxy-2-(méthoxycarbonyl)-5-oxopentanoïque (non décrit) en suivant les protocoles généraux B, puis A, J et enfin F.
Tf > 155 °C (décomposition) ; RMN 1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1 ,21 -1 ,43 (m, 30H), 1 ,53-1 ,63 (m, 2H), 1 ,71 -1 ,82 (m, 1 H), 1 ,86-1 ,98 (m, 1 H), 2,07-2,22 (m, 2H), 2,32-2,43 (m, 2H), 2,52-2,60 (m, 2H), 2,69-2,90 (m, 1 H), 2,90-3,07 (m, 1 H), 3,22-3,30 (m, 2H), 3,33-3,43 (m, 2H), 3,45 (dd, J = 9,7, 3,7 Hz, 1 H), 3,48-3,58 (m, 2H), 3,58-3,74 (m, 5H), 3,77- 3,95 (m, 4H), 4,29-4,35 (m, 1 H), 4,46-4,57 (m, 1 H), 5,17 (d, J = 3,5 Hz, 1 H). RMN 13C (100 MHz, CD3OD) δ ppm 14,5 (CH3), 23,7 (2xCH2), 24,7-25,6 (CH2), 29,8-30,9 (15xCH2), 32,1 -32,3 (CH2), 33,0 (CH2), 33,0-33,2 (CH2), 34,3-34,7 (CH2), 40,6-40,9 (CH2), 52,0-52,5 (CH), 54,4-54,9 (CH), 61 ,9-62,2 (CH2), 62,7 (CH2), 69,0-69,4 (CH2), 71 ,5 (CH), 74,1 (CH), 74,6 (CH), 74,7 (CH), 75,0 (CH), 76,4-76,6 (CH), 77,6 (CH), 81 ,0-81 ,2 (CH), 102,7-102,9 (CH), 104,1 -104,4 (CH), 171 ,1 -171 ,7 (C), 172,6-172,8 (C), 172,9-173,2 (C), 176,3-176,5 (C) ; Masse (ESI-) m/z {%) 426 (40) [M-CO2H]2", 898 (100) [M-H]- ; HRMS (ESI-) m/z calculée pour C iH73N2Oi7S 897,4630 [M-H]", trouvée 897,4646.
Exemple 7: Tests d'absorbance à 280 nm des molécules de l'invention
Les molécules de l'invention ont été testées et comparées en utilisant
BmrA et AcrB, 2 protéines membranaires polytopiques bactériennes. BmrA est caractérisée par une topologie fonctionnelle sensible à l'extraction avec des détergents. BmrA est une protéine membranaire polytopique organisée en 3 domaines, cytosolique, membranaire et extracellulaire (Figure 1 ). Le domaine cytosolique est formé de 2 parties appelées nucleotide- binding domains, NBD, qui lorsqu'elles sont réunies lient puis hydrolysent ΑΤΡ. Le domaine membranaire est lui aussi formé de 2 parties appelées trans-membrane domains, TMD, chacune connectée à un NBD. Les TMDs adoptent différentes conformations orientées vers l'intérieur ou l'extérieur de la cellule en fonction du cycle catalytique. Cela permet à BmrA de capter des substrats (S dans la Figure 1 ) présents dans l'espace intracellulaire (ou dans la membrane plasmique) et les évacuer à l'extérieur. Ce type de pompe d'efflux est ubiquitaire. Elles appartiennent à la famille des transporteurs ABC que les cellules surexpriment en cas de stress chimiques occasionnés par les traitements antibiotiques, anticancéreux, antifongiques ou antiviraux. Ce transport est effectué par l'intermédiaire d'un changement de conformation qui change l'orientation interne ou externe des sites de liaison des drogues situés dans la région membranaire de la protéine (Figure 1 ). Après transport, la protéine reprend sa conformation initiale en utilisant l'énergie provenant de l'hydrolyse d'ATP (Ward, A. B. et al. Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on the nucleotide-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1 10, 13386-13391 (2013) ([19]); Martinez, L. et al. Understanding polyspecificity within the substrate-binding cavity of the human multidrug résistance P-glycoprotein. FEBS Journal 281 , 673-682 (2014) ([20])). L'hydrolyse d'ATP n'est possible qu'avec une protéine fonctionnelle dont la topologie, notamment au niveau de la région membranaire, est native. L'extraction par des détergents est en général délétère, par exemple avec le dodecyl maltoside (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])).
Certains tests ont aussi été réalisés avec la protéine AcrB, un trimère procaryotique de 3x100 kDa enchâssé dans la membrane interne des bactéries Gram- dont la structure 3D a été résolue (Seeger, M. A. et al. Structural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism. Science 313, 1295-1298 (2006) ([21])). Mode opératoire. Les molécules de l'invention ainsi que le C4C7 (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])) (fourni par la société CALIXAR) ont été préparés aux concentrations indiquées dans la Figure 2, dans 50 mM Tris- HCI, pH 8.0 et neutralisés à ce pH. Leur spectre d'absorption a été enregistré comme indiqué à l'aide d'un spectrophotomètre Xenius SAFAS.
Résultats. Le concept des clips est dérivé de celui des calix[4]arènes aliphatiques, C4Cn, développé dans le document WO2009144419 ([28]) et le document Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ]). Malgré leur intérêt, démontré dans leur capacité à stabiliser les protéines membranaires, ces détergents absorbent fortement dans les basses longueurs d'onde, notamment de 220 à 330 nm. Ceci est illustré avec le C4C7 dans le 1 er panneau de la Figure 2. Leur coefficient d'absorption molaire à 280 nm est très élevé, 15 000 mol/L/cm. Tous les détergents C4Cn étant bâtis sur le même support calix[4]arénique, ils présentent tous cette caractéristique. Dès lors, ils écrantent l'absorption des protéines que l'on détecte aussi à 280 nm et empêchent donc de les suivre ou de les quantifier par ce moyen très communément utilisé en biochimie, notamment dans un protocole de purification.
En revanche, les molécules de la présente invention n'absorbent pas, ou de façon négligeable, de 220 à 500 nm (et au-delà), comme mis en évidence à la Figure 2. Ils n'empêchent donc pas la détection des protéines à 280 nm.
Exemple 8 : Test de chélation des métaux divalents par les molécules de l'invention
La structure calix[4]arénique associée à 3 fonctions acide fait que les détergents correspondants chélatent très efficacement les métaux divalents. Le nouveau design des molécules de l'invention supprime cet effet.
Mode opératoire. Les molécules de l'invention ainsi que le C4C12 (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])) ont été préparés aux concentrations indiquées dans la Figure 3, dans 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. Une solution concentrée de MgC a été ensuite ajoutée jusqu'à 0, 5 et 10 mM. La turbidité de la solution résultante a été enregistrée à 600 nm.
Résultats. La capacité de chélation des cations divalents des détergents calix[4]aréniques précédemment développés est illustrée dans la Figure 3 ci- dessous. Elle montre que l'addition de concentration croissante de MgC en présence de C4C12 entraine une augmentation de la turbidité de la solution qui traduit une précipitation du complexe C4C12-magnésium. La précipitation est complète dès 5 mM de MgC . Cette interaction peut être un inconvénient pour les réactions enzymatiques qui requièrent la présence de métaux, calcium, magnésium, comme par exemple la mesure de l'activité ATPasique des ATPases telles que BmrA qui nécessite plus de 7 mM de MgC . Les molécules de la présente invention, malgré le fait qu'elles possèdent de 2 à 4 fonctions carboxyliques, surmontent ce problème technique. En effet, comme illustré dans la Figure 3, testées dans les mêmes conditions que le C4C12, elles ne forment pas un complexe insoluble avec le magnésium quand celui- ci est ajouté, même jusqu'à 10 mM.
Cette absence d'interaction avec des métaux est aussi très utile lors des étapes de chromatographie de type affinité-métal, qui utilisent du Nickel ou du Cobalt, et qui ne peuvent être mises en œuvre avec des fortes concentrations de C4Cn, contrairement aux molécules de l'invention.
Exemple 9 : Mesure de la concentration micellaire critique (CMC) des molécules de l'invention.
Mode opératoire. Les molécules de l'invention ont été préparées dans une gamme de concentrations allant de 0.1 μΜ à 10 mM dans 50 mM Tris- HCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. A 80 μί de chaque solution (triplicat) est ajouté le même volume de 10 μΜ 1 ,6-diphényl-1 ,3,5-hexatriene (DPH, Sigma, D208000), préparé à 100 μΜ dans du tétrahydrofurane puis dilué 10x dans H2O. L'augmentation de la fluorescence du DPH survient quand celui-ci trouve des micelles de clips dans lesquelles s'insérer (Chattopadhyay, A. & London, E. Fluorimetric détermination of critical micelle concentration avoiding interférence from détergent charge. Anal Biochem 139, 408-412 (1984) ([22])). La lecture de la fluorescence est réalisée avec un fluorimètre Xenius SAFAS en excitant à 358 nm et en enregistrant l'émission de fluorescence à 430 nm, avec des fentes de 9 à 10 nm pour l'excitation et l'émission et un gain de 100 à 150, selon les cas.
Résultats. La CMC des détergents est la concentration à partir de laquelle ils s'associent pour former des micelles, dans lesquelles, en solution aqueuse, les parties hydrophobes sont regroupées au centre et les régions hydrophiles exposées au solvant. Cette CMC a été mesurée ici en suivant l'augmentation de fluorescence d'un composé, le DPH, dont la fluorescence augmente significativement lorsqu'il s'insère dans les micelles (Chattopadhyay, A. & London, E. ([22])). Un résultat typique obtenu avec un composé 3.7 doté d'une chaîne aliphatique en C13 (3.7e) ou en C18 (3.7h) est illustré dans la Figure 4. Le tableau 1 qui suit résume les valeurs obtenues pour les molécules de l'invention.
Tableau 1
Figure imgf000099_0001
3.7f C18 0.02 4.0 5.3d C18 0.005 -
On observe, classiquement, que la CMC diminue avec la longueur de la chaîne aliphatique pour les composés 2.3b-g, et 3.7a-d. C'est moins vrai pour les composés de la série 4 dont la CMC est élevée et varie peu (#4.5-4.6), suggérant que leur tête polaire contribue trop à l'hydrophilicité de l'ensemble. Ces composés portent en effet 3 à 4 fonctions carboxyliques. Compte tenu de la grande taille des têtes polaires, ces CMC sont relativement élevées. Ainsi, l'utilisateur pourra faire varier la longueur de la chaîne en fonction du but recherché, par exemple éliminer facilement par dialyse ou ultrafiltration un détergent à CMC élevée ou bien conserver celui-ci en utilisant des composés à CMC plus faible.
Exemple 10 : Diamètre des molécules de l'invention
Un autre paramètre physico-chimique des micelles de détergents est leur diamètre, assumant que celles-ci sont sphériques. Cette grandeur est obtenue par la technique de diffusion de la lumière (DLS).
Mode opératoire. Les molécules de l'invention testées ont été préparées dans une gamme de concentrations allant de 0.1 à 1000 xCMC dans 30 mM Tris-HCI, pH 8.0 et neutralisées à ce pH. Les solutions sont filtrées sur 0,22 μιτι. La mesure est faite sur 100 μί, en triplicat sur un Zetasizer Nano-S de Malvern Instruments.
Résultats. Les diamètres estimés des clips testés sont, à l'exception du composé 3.7j, de l'ordre de 3 à 5 nm, soit des objets de taille relativement petite pour des détergents. Les micelles ont donc des tailles réduites, indépendamment de leur CMC, qui varie pour les composés testés, de 20 μΜ à 2 mM. Le composé 3.7j est une exception, formant des objets de très grande taille, de l'ordre de 60 nm. Il est probable qu'il se comporte comme les lauryl maltosides néopentyl glycols (Chae, P. S. et al. ([6]) ; Chaptal, V. et al. Quantification of détergents complexed with membrane proteins. Scientific Reports in press (2017) ([23])). Des résultats sont illutrés en Figure 5. Exemple 11 : Extraction de BmrA et AcrB avec les molécules de l'invention.
La capacité d'extraction des détergents de la série est testée sur des membranes dans lesquelles BmrA ou AcrB sont fortement exprimées. L'extraction avec les clips (molécules de l'invention) est comparée à celle obtenue avec des détergents du commerce, utilisés comme référence.
Mode opératoire. BmrA représente 25% des protéines présentes dans le système de surexpression utilisé (E. coli, C41 DE3). Ces membranes sont préparées comme décrit précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])). Les membranes contenant AcrB (environ 20% des protéines membranaires, même système d'expression que BmrA) ont été préparées comme décrit précédemment (Seeger, M. A. et al. ([21 ])). Les détergents sont utilisés à 10 g/L sauf indication différente et les protéines diluées à 2 g/L dans un tampon 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCI, 15 % glycérol, additionné d'antiprotéases (Roche) à raison d'une tablette/100 mL. L'ensemble (T) est incubé 2 h à 4°C puis centrifugé 1 h à 4°C à 100 000xg pour séparer la fraction extraite (surnageant, S) de celle qui ne l'est pas (culot). Les surnageants sont déposés sur SDSPAGE de 10 %, colorés après migration au bleu de Coomassie. La foscholine 12, le DDM et le LMNG proviennent de chez Anatrace, le SDS et le Triton X100 proviennent de chez Sigma-AIdrich.
Résultats. En absence de détergent, BmrA et AcrB sédimentent lorsqu'ils sont centrifugés à haute vitesse (puits « T- » vs « S- ») ; une petite fraction résiste néanmoins à ce traitement et demeure en suspension, elle correspond à l'essai négatif (puits « S- »). En présence de SDS ou FC12, les détergents de référence utilisés pour extraire toutes les protéines membranaires, BmrA et AcrB sont efficacement extraites et se retrouvent dans les surnageants correspondants, « SDS » ou « FC12 », utilisé ici comme témoin positif d'extraction. DDM, TX100 et FC12, utilisés ici comme références commerciales, permettent de solubiliser les 2 protéines (Figure 6). Parmi les molécules de l'invention, certaines extraient les 2 protéines, d'autres partiellement et enfin d'autres pas du tout comme résumé dans le Tableau 2. Pour BmrA, les composés extradants sont 1 .4, 2.3[a, d, f, g, h, i], 3.7[c, f, g, h, I], 4.5[d], 4.6d, 5.3[a-d]. Dans le groupe des partiellement extractants on trouve 1 .5, 3.7[d, j], 4.5[b, c], et dans celui des non-extractants 2.3[b, c], 3.7[a, b, e, i, k], 3.9a, 4.5a et 4.6a. Pour AcrB, les composés extractants sont 1 .5, 2.3[a, b, c, d, e, f, g, h, i], 3.7[c, d, e, f, h, j, I], 4.5[b, c, d], 4.6[c, d] ceux qui extraient partiellement, 4.5a, 4.6d, et ceux qui n'extraient pas, 3.7[a, b, i, k] et 4.6a.
Tableau 2
Figure imgf000102_0001
Extraction sélective. AcrB est un contaminant de cristallisation bien connu dans le domaine des protéines membranaires. Co-purifié, il cristallise à l'état de trace conduisant à de nombreux artéfacts (Psakis, G., Polaczek, J. & Essen, L.-O. AcrB et al.: Obstinate contaminants in a picogram scale. One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline. Journal of Structural Biology 166, 107-1 1 1 (2009) ([24])). Développer un détergent qui limite cette contamination en extrayant pas ou peu cette protéine est donc d'une grande aide, d'autant plus que les détergents disponibles sur le marché ne sont pas sélectifs. Dans ce contexte, les composés 4.6b et 4.6d sont remarquables par leur capacité à ne pas ou peu extraire AcrB contrairement à BmrA. A l'inverse, les composés 1 .5 et 3.9a extraient plus efficacement AcrB.
Exemple 12 : Stabilisation fonctionnelle des protéines membranaires après extraction avec des détergents
Les molécules de l'invention qui extraient BmrA dans l'exemple précédent ont été testées à différentes concentrations sub-solubilisantes et solubilisantes, pour évaluer leur impact sur l'état natif et fonctionnel de la protéine. Ce dernier est monitoré par l'hydrolyse d'ATP que la protéine effectue au cours du cycle de transport, couplé à la translocation de soluté. Comme reporté précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])), l'activité ATPasique de BmrA est un marqueur très sensible de l'état de la protéine, cette dernière étant particulièrement sensible aux détergents utilisés lors de l'étape d'extraction où ceux-ci remplacent les lipides au contact de la protéine membranaire.
Mode opératoire. BmrA produit et enrichi dans la membrane plasmique de E. coli C41 DE3 est préparé comme décrit précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])). Les membranes sont diluées à 2 g/L dans un tampon 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCI, 15 % glycérol, additionné d'antiprotéases (Roche) à raison d'une tablette/100 mL. Les détergents sont ajoutés aux concentrations indiquées dans la Figure 7. L'ensemble (T) est incubé 2 h à 4°C et l'activité ATPasique est mesurée à l'aide du système d'enzymes couplées, en retranchant l'activité Vanadate-insensible de l'activité totale Centeno, F. et al. Expression of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in yeast. FEBS Lett 354, 1 17-122 (1994) ([25])). Les solutions sont ensuite centrifugées 1 h à 4°C à 100 000xg pour séparer la fraction extraite (surnageant, S) de celle qui ne l'est pas (culot). Les surnageants sont déposés sur SDSPAGE de 10%, colorés après migration au bleu de Coomassie (Figure 8). Le DDM, LMNG (Chae, P. S. et al. ([6])), ThtonXI OO et FA3 (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])) sont testés comme détergents de référence. Le DDM et le LMNG proviennent de chez Anatrace, le Triton X100 provient de chez Sigma-AIdrich et le FA3 de chez Avanti-Polars.
Résultats. Comme illustré dans la Figure 7, l'addition de détergent, à une concentration sub-solubilisante ou solubilisante induit des changements de structure de BmrA qui impactent sa fonctionnalité. Ainsi, parmi les détergents de référence, le LMNG, récemment développé avec succès pour résoudre la structure d'un récepteur à G-protéine (Rasmussen, S. G. et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature 477, 549-555 (201 1 ) ([26])), impacte peu l'activité de BmrA jusqu'à 1 mM mais la réduit à 25% à 10 mM, une concentration nécessaire pour solubiliser la protéine. Le DDM, très largement utilisé dans le domaine, induit les mêmes effets, diminuant l'activité ATPasique de BmrA de 50 à 15% aux concentrations qui permettent son extraction, au-delà de 5 mM. Le FA3, correspondant à 1 dimaltoside couplé à un stéroïde, récemment développé (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])), produit le même effet en inactivant 75% et 80% de l'activité ATPasqiue de BmrA aux concentrations qui extraient la protéine.
Les composés les plus efficaces sont regroupés dans la série 3.7, dont les meilleurs sont 3.7[b,c,e,g,j,l]. Ceux-ci extraient BmrA tout en préservant (3.7j,l), ou en augmentant 1 ,5x (3.7b,c,g) ou 2x (3 .7e) l'activité ATPasique de la protéine. A noter que cette augmentation d'activité est une caractéristique des transporteurs ABC, dont l'activité basale peut être multipliée jusqu'à 2,5 fois en présence de solutés ; elle témoigne d'un parfait état fonctionnel. Les composés 3.7b et 3.7c partagent le même design, incluant un ose couplé à la molécule via un triazole, 2 fonctions carboxyliques et une chaîne aliphatique en C1 1 et C13. Les composés 3.7e et 3.7g sont une variante de 3.7c avec soit un maltoside soit une chaîne péguylée à la place de l'oside.
Exemple 13 : Etude de la stabilité dans le temps des protéines membranaires en présence des composés de l'invention
Deux des meilleurs composés de l'invention issus du test précédent, 3.7c et 3.7g, ont été évalués pour leur capacité à stabiliser une forme active de BmrA sur une très longue période de temps, après purification et stockage à 4°C. Ces 2 détergents ont été comparés au DDM, très largement utilisé pour ces étapes de purification, ainsi que le FA3 récemment développé et très prometteur sur le plan de la stabilité fonctionnelle (Lee, S. C. et al. (2013) ([9])). Pour permettre leur comparaison, les détergents ont été ajoutés à une solution de BmrA purifiée en DDM, stockée ensuite à 4°C pendant 40 jours. L'activité ATPasique de BmrA a été mesurée au cours du temps comme illustré dans la Figure 9.
Mode opératoire. BmrA produit et enrichi dans la membrane plasmique de E. coli C41 DE3 est préparé comme décrit précédemment (Matar-Merheb, R. et al. ([1 1 ])). Vingt milligrammes de cette fraction membranaire sont dilués à 4°C à 1 g/L dans 100 mM NaPi pH 8.0, 15 % glycérol, 100 mM NaCI, 10 mM imidazole, 1 mM DTT. La suspension est additionnée d'antiprotéases (Roche, 1 tablette/50 mL) et benzonase (Sigma, 30 U/mL)/ Les protéines membranaires sont ensuite extraites en ajoutant 1 % DDM (20 mM), pendant 1 h à 4°C. La solution est centrifugée 1 h à 100 OOOxg, 4°C (Optima XPN-80, 50.2ΤΊ). Le surnageant est chargé à 2 mL/min sur une résine Ni-NTA de 5 mL (GE healthcare, HiTrap chelating HP) équilibrée en tampon A, 100 mM NaPi pH 8.0, 10% glycérol, 100 mM NaCI, 10 mM imidazole, 0.05 % DDM (1 mM, 5xCMC). La résine est lavée une 1 ère fois avec 25 mL de tampon A, puis une 2ème fo i s avec 25 mL de tampon B (= A avec 500 mM NaCI et 15 mM imidazole) et enfin une 3ème fois avec 20 mL de tampon A. BmrA est éluée avec un gradient de tampon A et tampon C (100 mM NaPi, 10% glycérol, 100 mM NaCI, 250 mM imidazole, 0.05% DDM (1 mM, 5xCMC)) étalé sur 10 mL et collecté par fraction de 1 mL à 3 mL/min. Les fractions du pic sont réunies
(3 mL) et l'ensemble est dialysé dans un boudin de cut-off 12-14000 daltons contre 400 mL de tampon D froid (50 mM Hepes-HCI, pH 8.0), 10 % glycérol, 100 mM NaCI, 0.05% DDM (1 mM, 5xCMC) pendant 2 h 30 min à 4°C, puis contre 600 mL dans les mêmes conditions pendant 1 nuit. Le contenu protéique (0.8 g/L) du dialysat est quantifié par dosage avec l'acide bicinchoninique Smith, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150, 76-85 (1985) ([27])). La solution est séparée en 4 fractions diluées à 0.2 g/L de protéines avec du tampon A sans imidazole et DDM. La [DDM] finale est de 0.25 mM. Chaque aliquot est additionné de 0.087 mM de DDM, F A3, 3.7c ou 3.7g et stocké à 4°C pendant 40 jours. L'activité ATPasique Vanadate-sensible Centeno, F. et al. ([25])) est mesurée aux temps indiqués dans la Figure 9 en duplicat.
Résultats. Comme le montre la Figure 9, BnnrA une fois purifiée et en présence de faible concentration de détergent est stable pendant au moins 20 jours à 4°C. Au-delà, elle perd en activité quand elle est seulement en présence de DDM ou additionnée de FA3. Ces 2 détergents n'ont donc pas la capacité de stabiliser à long terme une protéine membranaire comme BnnrA. En revanche, l'addition de 3.7c ou 3.7g dans des conditions identiques permet d'aller au-delà de ces 20 jours, stabilisant BmrA au moins 2 fois plus longtemps, 40 jours. Ces 2 composés démontrent donc une propriété remarquable de stabilisation à long terme, la meilleure reportée à ce jour pour une protéine membranaire.
Exemple 14 : Comportement en solution des protéines membranaires en présence des composés de l'invention
La capacité des composés de l'invention à maintenir les protéines membranaires dans un état natif a été exemplifiée avec le composé 3.7c de l'invention, contrôlé par chromatographie d'exclusion de taille et comparé au détergent de référence, le DDM. Les résultats sont montrés dans la Figure 10.
Mode opératoire : BmrA a été extraite en DDM et purifiée par chromatographie d'affinité Ni-NTA comme décrit dans l'exemple 13 puis chargée sur colonne d'exclusion de taille Superdex 200 10/300 et éluée avec 50 mM Hepes-HCI pH 8,0, 100 mM NaCI, 0.4 mM DDM (2xCMC). Les fractions contenant BmrA ont été poolées et séparées en plusieurs aliquots (-100 g) conservés à 4°C. Un aliquot a été ensuite rechargé sur colonne d'affinité contenant 1 mL de résine. Le DDM a alors été échangé contre 10 volumes de tampon Hepes-NaCI contenant soit 2 CMC de DDM (expérience contrôle) soit 2 CMC de composé 3.7c (2 mM). BmrA a été ensuite élué dans les tampons respectifs additionnés de 100 mM d'imidazole. Les fractions contenant les protéines ont été réunies et concentrées sur amicon 50 kDa (cellulose régénérée) jusqu'à 50 μί qui ont ensuite été déposés sur une colonne d'exclusion de taille Superdex 200 5/150 de 3 mL, équilibrée dans 50 mM Hepes-HCI pH 8,0, 100 mM NaCI, et 2 CMC de DDM (0.4 mM) ou 3.7c (2 mM). L'élution a ensuite été réalisée à 0,3 mL /min dans les tampons respectifs et les BmrA détéctée à 280 nm.
Résultats. Comme le montre la Figure 10, une fois le détergent initial (DDM) échangé soit par lui-même, soit par le composé 3.7c, BmrA présente un comportement équivalent en solution, s'éluant à -1 ,6 ml. L'échange du DDM par 3.7c n'a donc pas modifié son état dimérique en solution et n'entraine ni son agrégation qui se traduirait par un pic avec un maximum vers 1 ,2 mL (octamère) ou 1 ,4 mL (tétramère), ni sa dissociation, visible par un pic à 1 ,8 mL (monomère). En conséquence, le composé de l'invention 3.7c préserve l'état d'oligomérisation natif de la protéine membranaire. Exemple 15 : Gain de stabilité thermique des protéines membranaires en présence des composés de l'invention
Nous avons étudié la stabilité des protéines membranaires par rapport à la température en présence ou en l'absence de composés de l'invention (figure 12B-E), une expérience qui permet d'évaluer la capacité des détergents à maintenir la cohésion moléculaire d'une protéine malgré l'agitiation imposée par la temérature. Nous les avons testé sur BmrA (panels A, B). En suivant le mode opératoire de Ashok et coll. (Y. Ashok, R. Nanekar, V.-P. Jaakola, Protein Eng. Des. Sel. 2015, 28, 539-542 ([34])., Nous avons comparé les composés de l'invention avec le DDM comme standard et deux détergents récemment conçus, LMNG (Chae et al., ([6])) et FA3 (Lee et al., ([9])), qui affichent des propriétés de stabilisation dans ces conditions.
Mode opératoire. Basé sur Y. Ashok et al. ([34]). Les membranes de BmrA (2g protéines/L) ont été solubilisées avec 0.5% (-10 mM) DDM et avec ou sans 1 mM de 3.7d, 3.7c, 3.7b, 3.7a, 3.7i, 3.7k, 3.7f, 3.7e, DDM, LMNG ou FA3 dans un volume final de 2 mL, pendant 2 h à 4 °C. Les fractions solubilisées ont été ensuite clarifiées par centrifugation à 100, OOOxg pendant
I h à 4 °C. Le surnageants ont été ensuite aliquotés par 50- L, soumis chacun 30 min à une température de 25 à 90 °C, en utilisant un appareil de PCR (PeqSTAR 2x gradient; Peqlab). Les essais ont été ensuite centrifugés 40 min à 20 OOOxg et les surnageants ont été analysés par SDS-PAGE et Western-blot en utilisant un anticorps anti-His. L'intensité relative de la bande de BmrA à chaque température a ensuite été quantifiée en utilisant le logiciel Image Lab software 4.1 , Bio-Rad. Chaque essai a été dupliqué. L'intensité a ensuite été plottée en function de la température puis fittée par une équation sigmoidale à 3 paramètres ; Sigmaplot v12).
Une expérience complète est présentée dans le panneau A de la figure
I I pour chaque fraction protéique incubée avec 3.7c, permettant d'estimer les températures de fusion apparentes, Tm, à laquelle 50% de BmrA reste en solution (lignes en pointillé). Comme indiqué, les composés de l'invention 3.7d , 3.7c, 3.7j, 3.7f et 3.7e induisent un décalage thermique de 20 à 29°C pour BmrA, tandis que les autres n'ont pas produit de changement marqué. Un effet clair a été observé en ce qui concerne le composant hydrophobe, le plus grand étant le meilleur. Il est à noter que ce gain de thermostabilité est équivalent à celui obtenu précédemment en introduisant 17 mutations dans une protéine de fusion protéine A2AR avec une troncature C-terminale de 96 résidus (Magnani et al., ([32])). Ce résultat place les composés de l'invention à l'avant-garde de la très petite série de détergents stabilisants, tels que LMNG (Chae et al., ([6])), FA3 (Lee et al., ([9])) et les maltosides à base de norbornane (NBM) récemment publiés (M. Das, Y. Du, O. Ribeiro, P. Hariharan, J. S. Mortensen, D. Patra, G. Skiniotis, C. J. Loland, L. Guan, B. K. Kobilka, et al., J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 3072-3081 , ([35])) qui sont capables de générer une augmentation de plus de 1 log de Tm.
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34. Y. Ashok, R. Nanekar, V.-P. Jaakola, Protein Eng. Des. Sel. 2015, 28, 539-542.
35. M. Das, Y. Du, O. Ribeiro, P. Hariharan, J. S. Mortensen, D. Patra, G. Skiniotis, C. J. Loland, L. Guan, B. K. Kobilka, et al., J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 3072-3081 .

Claims

REVENDICATIONS
Composé de formule
Figure imgf000114_0001
(I) dans laquelle :
X représente -OH,
Figure imgf000114_0002
Figure imgf000114_0003
HC-(CH2)NCH3 -C-(CH2)pC02R^
Y représente -(CH2)nCH3j (CH2)MCH3 _ CO2R2 _ _(CH2)2OR1 ou
H
C -(CH2)pC02R2
CONHCH2C02R2
O
H
-N- -(CH2)NCH3 |_| O
Z représente -NHCO(CH2)nCH3, (CH2)mCH3 _ -N-"-(CH2)ncy
Figure imgf000114_0004
et dans laquelle : ■ R1 représente un monosacchande, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ m est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;
■ q est un nombre entier allant de 1 à 5 ;
■ r est un nombre entier allant de 1 à 10 ;
■ Cy représente le cyclohexyle ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Composé selon la revendication 1 , dans lequel :
■ X représente
Figure imgf000115_0001
-C-(CH2)PC02R2 -C -(CH2)PC02R2
■ Y représente C°2R ou CONHCH2CO2R
-N 11 i (CH2)NCH3
■ Z représente -NHCO(CH2)nCH3 ou (CH2)MCH3 .
■ R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ m est un nombre entier allant de 4 à 21
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Composé selon la revendication 2, choisi parmi :
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000116_0002
10
Figure imgf000116_0003
Figure imgf000116_0004
Figure imgf000116_0005
Figure imgf000116_0006
Figure imgf000116_0007
COOH
HOOC
COOH
HOOC
(CH2)14CH3
4. Composé selon la revendication 1 , dans lequel :
■ X représente -S(CH2)nCH3 ;
■ Y représente -(CH2)2OR1 ;
o
- HN— U II— |— C02R2
■ Z représente (CH2)PCO2R .
■ R1 représente un monosaccharide, un disaccharide ou le polyéthylène glycol ;
■ R2 représente H, Na ou K ;
■ n est un nombre entier allant de 4 à 21 ;
■ p est un nombre entier allant de 1 à 3 ;
ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.
5. Composé selon la revendication 4, ledit composé étant le composé de formule :
Figure imgf000117_0001
6. Procédé d'extraction de protéines membranaires associées à une membrane biologique, comprenant une étape de mise en contact d'une solution aqueuse de protéines membranaires associées à la membrane biologique avec au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la protéine membranaire est présente dans une fraction membranaire biologique issue d'organisme procaryotique ou eucaryotique, sain ou altéré.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel la protéine membranaire est une protéine de transport.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la protéine de transport est un transporteur ABC, choisi dans le groupe comprenant la glycoprotéines
P (Pgp/ABCB1 ), MRP1/ABCC1 , MRP2/ABCC2, BCRP/ABCG2 et BmrA.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel l'étape de mise en contact d'une solution aqueuse comprenant la protéine membranaire à extraire avec au moins un composé de formule (I) est réalisée à un pH allant de 5.5 à 10.
1 1 . Procédé de stabilisation de protéines membranaires en solution dans une solution aqueuse, comprenant une étape (i) consistant à mettre en contact une solution aqueuse d'une protéine membranaire en solution avec au moins un composé de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3.
12. Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel les protéines membranaires sont mises en solution au moyen d'une étape d'extraction telle que définie dans l'une quelconque des revendications 6 à 10, ou au moyen d'une étape d'extraction par un autre détergent.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 1 ou 12, dans lequel ladite protéine en solution est stabilisée à une température comprise de 0°C à 10°C pendant une durée de temps supérieure à 1 jour.
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