<Desc/Clms Page number 1>
La présent* invention est relative à un nouveau produit utilisable en médecine pour produire une immunité non spécifique*
La demanderesse a trouvé que l'on peut isoler@ à
EMI1.1
partir d'extraits d'organes d'animaux, un produit qui pO'8- de la propriété de produire une immunité non-spéoifique et qui, étant sensiblement apyrogàne et non-.antigér4que, peut ; itre administré, par exemp4op par injection,sans réaction tissulaire potable.
L'expression "immunité non-8p'oitqu.M est utilisée ici aana son sens général et vise à inclure non eau.- lement la résistance aux infections tant bactériennes que
EMI1.2
virales main également à conférer une immunité vis-à-vis de strass@ par exemple, le stress dO au froid, le choc traumati- que, le stress andotoxique,-etc. La demanderesse a également trouvé que le produit possède des propriétée antimitotiques
EMI1.3
V1s-à-T8 de diverses cellules, par exemple, les cellules de Héla et de Chang.
Du point de vue chimique, le produit cet un polypep-
EMI1.4
tide ou un mélange de polypoptidee, ce terme étant utilisé, dans son sont le plue large, pour définir de* aubatanoea pos-
EMI1.5
l6daat une structure de base polypeptidique, indépendamment du fait que d'autres groupes tel. que des carbobydrates soient également présenta.
Par hydrolyse, le produit donne un certain
EMI1.6
nombre dfamino acides et de* substances donnant des réaction* de aaccharideso Les aaino totale détectables sont les acides glutamique et aspartiques leureinines la lysine, l'alanine, la serine, la valine, la leuoine, liloo-loucine, la glycine, la phénylalanine, lehlatidinop la pralin., la tyrosine et
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
EMI2.2
la tbxèoulmoo ta produit donne un réaction de bluret poottl- Te un r4l0t1on d'anthron. positive, ce qui indique la pî4i- censé dh<eea< *t une indications positive cS'h.xo.&I!11n.. pU'!.. : réaction 4'18on.organ édifiée il 3yonnerboluf 3pp ala : tatar.-tor.n1ng. 'orhandlunr, il. ,(19'6), 287# p-41aÍtblia, a1no-b.nzal44b,y4. dans ac,.tt11 acétone), lit produit donne habitu,11.men1;'\ùl' réaction 801...
1* point 1.0'1.ct1u. étant .1tu'dan. la région de pli 4-S, le acides glutamique ot aspartique vont présente en quantité* considérables dans la ixol4oule et sont probabl*ment r.8pOn'.., , blés de l'aoidité .u..n'1onné.. Des polype;tidou neutre ac-
EMI2.3
tire peuvent également être présents,
EMI2.4
Le poids Moléculaire dit facteur actif est d'au aoift* # 10 et l'on préfère des produite dAn6 lesquels il ne aubois- te oen4iblement pas de matière provenant de l'extrait "or,.- ne d1 animal , qui possède un poids ao14oula1rt lutérîtur i 80001 mi général les produite préféré ne ooutl*xutont ru 4 matière d'un p014.. 1II014ou1&1r.
Inférieur à 13 , le produit est # #BSiiclenenti xempt de phcaphoctt ,| ce qui indique la plupart du taxé* un* abounit 4ceplète '4#UF,. puretés due aux acides Auo14iqu...t et produit ooctieot 13 à 15 t deatotef Il *et précipité par de 10*ztds phowphctuajjpf tique mais il ne l'est pas par de l'ao14, .ulto.a11cl11qt est il ont d'autre part soluble dan* l'eau, le acides et le baie , -par exemploq le phénol liquide, l'hydroxyde de .ot1:
' à 10 %# otoos le produit est soluble dan. l'étumnol aqueux à 70 $9 il est légèrement soluble dan. 114thanol à 96 . et il est insalbule dans l'4th.r, le oblarotome et l'âth*r d4 pî.
EMI2.5
EMI2.6
tro18. 'I le produit *et *table à la chaleur jusqu'à au 801àa' , 100*0 et il $,*et révélé résister au chauffage à 100*0 dans
<Desc/Clms Page number 3>
de l'eau pendant 1/2 heur*. En solution en milieu aqueux, la produit *et d'une fluorescence vert* qui varie du Jaune. vert au bleu-vert selon la pureté.
Comme indiqué ci-dessus, le produit ont sensiblement apyrogène et ne montre pas d'activité antigénique substantiel-
EMI3.1
le. Far inaction, il provoque l'immunité vis-à-ils du v1ru'#b vaccin* i vie-à-vie de X*Coli et vie-4-vla d'un nombre cons±. dérable d'autres bactéries et d'outrée virus et ce produit est également efficace pour engendrer une résistance .18-1-Y18 de virus combina provoquant des refroidissement! , par exemple, en le pulvérisant directement dans la muqueuse nasale,
Le nouveau produit selon la présent* invention peut être préparé pour l'administration en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques.
La ,nature de l'excipient
EMI3.2
ou des excipients utilisée dépend du type de préparation à laquelle ils vont destinés. Les compositions peuvent, de ma- nière approprié., prendre la forma de doute unitaires, chacun* d'elle. contenant avantageusement 5 à 20 mg du polypeptide actif* En termes généraux, on peut réaliser des préparation* pour l'administration parentérale, auquel cas l'excipient
EMI3.3
doit fttro un liquide parentéral.ment acceptable, tel que de l'eau pyrogène stérile ou pour l'administration oral*, auquel can les excipient.
peuvent comprendre de l'eau, simultanément avec un ou plusieurs agents aromatisant., agents de conserva-
EMI3.4
tien, agent. dispersants, agents colorants, agent* 4oulcorant. et analogues* Les préparations peuvent également prendre la for- ma de préparation* solides, par exemple, tablettes contenant
EMI3.5
le facteur aotif, Dans une forma de réalisation préférée, une solution finalement obtenu* est 11opb11i.de, redi..out. dans de. l'eau apyrogène stérile et stérilisée par pasoage dans
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
des filtre* en Terre fritte1 appropriée, Le facteur actif peut également être prépare en vue de l'administration topique, parexemple, à partir d'un* solution aqueuoe pour pulvérisations, qui peut également cou- tenir un agent de conservation tel que de l'éthaaol ou du p-bydxoacybanoate de méthyle ou d'thyl.
La solution pour pulvérisation peut, par exemple,
EMI4.2
contenir de 0,01 à 10 e en poids, de préférence, 0,05 a;5 . en poids de Matière active,
La matière active polypeptidique selon la présent*' invention peut avantageusement être préparée à partir d'extraits aqueux d'organes d'animaux par des procédés de fractionnement en tirant avantage de la découverte faîte par la demanderas%*
EMI4.3
que la matière possède un poids moléculaire élevé. ta présents ;
invention t, par conséquent, pour objet un procède de produc- tion d'une matière polypeptidique procurant une immunité non* spécifique, ce procède étant caractériel en ce qu'on soumet un extrait aqueux d'organe d'animal à un fractionnement pour
EMI4.4
séparer la matière à poids moléculaire élevé de la matlèrelà bas poids moléculaire et en ce qu'on récupère ainsi la frac- tion polypeptidique possédant un poids moléculaire d'au moins 1000..
Le produit actif selon la présente invention peut être obtenu à partir de divers organes d'animaux, des exemples préférée en étant le foie, les reins, la rate et de sang.
L'extrait aqueux d'organes qui doit êtrre utilisé dans le prisent procède, peut, par exemple, tire simplement un extrait aqueux de cet organe, par exemple, du foie frais de
EMI4.5
boeuf, mais il est avantageux do eousettre l'extrait à un
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
traitement ultérieur, principalement en vue d'éliminer lei t protéines non désirées. Le ohauffage de l'extrait est parti- culiorement désirable et, par exempte, dans le cas du foie, oe foie peut être haché et ensuite chauffé avec de l'eau tout en agitant, à 100*0 et le liquide surnageant peut être séparé et concentré afin de précipiter la matière solide contenant
EMI5.2
le facteur actif.
La p&teain.1 obtenue, peut également si on le désire, être extraite par de l'alcool et on peut ensuite chasser le solvant, par exemple, par distillation sous vide.
Il est également possible de précipiter la matière non désiré* ;
EMI5.3
par de l'alcool ou d'extraire la solution aqueuse par du ph$. nol et de récupérer ensuite la matière active, par exemple, par une précipitation à le-éther,
Les extraits aqueux d'autres organes solides peuvent , être prépares de manière analogue.
Sans le cas du sang, celui-ci peut être chauffé pour coaguler les protéines présentes et il peut ensuite être filtré. Un agnt de précipitation de protéines sélectif, par
EMI5.4
exemple, l'acide aulfoaaliçylique peut être ajouté au filtrat afin d'éliminer les protéines résiduelles et le mélange peut être refiltré. Le liquide résultant est approprié à l'utilisa- tion dans le présent procédé.
EMI5.5
Il est également "possible de soumettre l'extrait d'organe à un autre pré-traitement encore, en précipitant la
EMI5.6
matière active à un pU compris entre 5 et 10, sec l'aide d'un sel d'un métal polyvalent, soluble dans l'eau, en présence d'un
EMI5.7
alcool minsible à l'eau.
Ainsi, par exemple, l'extrait d'orga- ne aqueux peut, si on la désire, être traité, après les stades .
EMI5.8
de purification décrits C1-dlG8ue, par de l'acétate de cal- clum, de baryum ou de plomba du chlorure de zinc ou de magnésium
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
etc., en présence d'éthanol, afin de précipiter la polypeptide actif t les Ions métallique* peuvent ensuite itre <Mi<Ein)t, par exemple en séparant le précipité, par *xtaplo$ par filtra* tion, entr1t\at1on..t. en ro41.aolyant le précipité ainsi Obhnu)aJ\8 de l'eau et en t&1'i.
Passer lu*eolutton à tra-0 .1 vers uni résine acide échangouse allons* De aan1rt 81aîli1- re, un-sel insoluble du métil peut itrt précipite} par ,x...1:.,,; le baryum peut étre précipité soue.forme de sulfate de )a
EMI6.2
à l'aide d'acide sulfurique*
EMI6.3
Le traitement par 1...1 de métal pol7Y&l.nt' .t l'alcool peut t'ri &yanta8ue.aent suivi# *très f11a1aa'loa don ion* a4tal11qu.., par un traitement par une rfa1n. baatique 4cb&n8tu.. 4 '1onR, afin d'adsorber 1.. polypoptidw actif... 104lution peut 4tre effectuée à l'aide de. 'luticat léèreseat . ' aloal1ne,. Le procédé peut également Stre ai-plîqui# ¯1' OR 1.
44111'(;, avant ou après le ,raotl0nn..f.U\t .,1.on la ''''8'11\''
EMI6.4
Invention*
EMI6.5
Va procédé particulièrement intéressant de fraotteu- nement selon la présente laitution réaldt ,..t.. l'extrait .
EMI6.6
EMI6.7
en contact alto un a.or8IA' oerv=t à adsorber 1 tMtijfw à poids moléculaire élevé, tin vue 4'aêsorber la aatlère poil- p.pt141q. ao'1...i à faire suivre cette Of4rt*tlo par um élution à tta14. d'un 11'tuS.t. obotel ans le graiaft f m4 fat les liquides basiques et soldes et VA* solution 4*aae OQ8' tration U.otrol1t,..1...... lisa lub.tana...4'ol"ut.. qui tendent fréféreatlal- 1...ni à 644orber ....'11'1'" .. p01t...l'oulatn <3Lov< oxmt bien couve** De ,,11...u.i..o...0.' 44adna #gtat t.......
EMI6.8
tances inorganiques telle* que des silicates %*le
EMI6.9
que bentonite, aontaorillonlte, 0'tlitt, tt t ta 'ea.a4.n...
a
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
cependant trouvé que Itimiante est un adsorbant particulière-
EMI7.2
sont efficace et, pour cette raie on, on préfère utiliser cette
EMI7.3
dernière matière. Le CU de l'extrait au coure de itadeorption ont de préférence comprip entre 4 et 7 plus partleulikrozuntg entre environ 5 et 6. L'adsorption peut 4tre effectuée à la température ambiante ou à de* températures supérieure@ ou 1 t#.. rieur*@ à celle-oie te polypeptide actif est stable juatuli au moins 10000, 'é3utian du*polypeptide actif peut Itrt #ff otu4t
EMI7.4
EMI7.5
à ltaide d'un liquide basique ou aci4s ou à l'aide d'une solu- ! tiou d'un* concentration tfleotrolytique ilev4t, Si on utilise un liquide acideu celui-ci peut Otre un acide faible liquide, par exemple, du phénol liquide.
On peut é4ja ement utiliser
EMI7.6
des acides aqueux, de préférence, due solution* aqueuses d'un acide faible tel que l'acide acétique ou l'acide fornique ,
EMI7.7
*3,ant un pH intérieur à 4* -Comme liquides basiques approprias . à l'élut Ion, on peut citer des alcalis *4ueux# tels que la coude caustique aqueuse, par exemple, déa3nazrral et de l'aa- aonia4us aqueux normal , Il est souvent avantageux de lever lladuarbat par du phénol et d'effectuer ensuite l ilut.vrt 1 l'aide d'un alcalt aqueux, âpre avoir éliminé le phénol par lavage. Lorsque le liquide d'elution doit être anhydre, par exemple, du phénol & 100 Of leaniante est de préférence adobe avant l'élution, par exewple, sur du p2ü,.
Don solutions d'une
EMI7.8
concentration en électrolyte élevée, qui peuvent être utilisées
EMI7.9
pour ltêlutîoa# englobe des-solutions salines aqueuses, par exemple, du KtCl aqueux Molaire*
EMI7.10
Selon la présente invention, la préparation *queue*
EMI7.11
de 11,organe est avantageusement mous une forme relativement
EMI7.12
concentrée lorsqu'elle est airs en contact avec la matière
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
adeorbante, par exemples à une concentration d'environ 25 g de solide/100 ta.
La demanderesse a trouvé qu'étant donné que lu po-
EMI8.2
lypeptide désiré possède un poids moléculaire élevé, apparem-
EMI8.3
ment d'au moins 8000 et que et polypeptide *et plir coneueat
EMI8.4
incapable de passer à travers des matières à cribla mole**
EMI8.5
aulaire qui sont Imperméables aux molécules de cette dibenaioà ou de dimensions plus importantes$ par exemple, un dérivé de #>
EMI8.6
dextrane réticulé par exemple, du dextrane réticule par dit
EMI8.7
l'oxyde d'éthylène (par exemple, le produit 9eph&&ex 0 509 vendu par A#B, Pharmacia of Uppaala 3ude, qui est laper
EMI8.8
néable-aux molécules d'un poids moléculaire supérieur à 800'0
EMI8.9
à 10 000, il est possible de séparer par fractionnement lee iwpuretea à poids moléculaire plus faible, de la xatière con" tenant le facteur actif,
par des tectmiquea de criblée noie** - j laire, par exemple, en faisant passer une solution aqueuse de la matière à travers une colonne de dexarane réticulé ou par dialyse electrodialyao ou ultrafiltration à travers de membranes de structure appropriée. l'utilisation fie produite du typedextr&ne ou de matières à crible moléculaire est dé- crite par Per flodin dans *Dextran gels and thetr application in gel ,filtration* Itppar3.e 1962.
D'autres matierea à crible "'""' moléculaire, englobent certains galacto-jaar-aitole réticulé (Douel et al - Advanaea tu Clitzlotry Sériée 1954, 11, 51) et des bopolymerea d'acrylamide et de méthylène bit acrylassi- de (Canadian Journal 01 Ohesiatry 1962, 0, 159), Il faut noter que par l1 expression ncatière à poids . , moléculaire élevé* telle qu'elle est utilisé* dans le présent #
EMI8.10
mémoire, on comprend une matière ayant un poids moléculaire
EMI8.11
da l'ordre de 8000 ou d'un poids moléculaire supérieur, par
<Desc/Clms Page number 9>
exemple, une matière d'un poids moléculaire non inférieur à 10 000.
l'expression "matière à bas poids moléculaire "tellen qu'elle est utilisée dans le présent mémoire, vise à définir une matière possédant un poids moléculaire intérieur à envi- ron 8000, par exemple, inférieur à 5000. Naturêement, il est utile d'éliminer toute matière à bas poids moléculaire indé- sirable présenta et on obtiendra de bons résultats, même avec des oribles moléculaires qui sont imperméables à des molécules d'un poids moléculaire considérablement intérieur. par exemple$ ' 103.
Cependant, en vue d'obtenir une séparation aussi efficace que possible, la matière à crible moléculaire doit de préféren- ce être perméable aux molécules d'un poids moléculaire d'envi- ron 8000 maie ne laissant pas passer la matière active et les dextranes réticules comme décrit oi-dessus, sont parti- culièrement efficaces.
Une autre méthode de fractionement selon la pré- sente invention est de mettre l'extrait aqueux en contact avec une matière à crible moléculaire imperméable aux molécules de poids moléculaire supérieure à 1000, afin de adparer les- dites moléculs de substances à poids moléculaire moine élevée
Les dextranes réticuléset lea matières à crible mo- léculaire citées ci-dessus, qui travaillent sous la forme par- ticulaire, en adsorbant la entière à bas poids moléculaire dans leurs particules, sont -de préférence utilises dans des colonnes, selon les techniques de chromatographie .
Dans de telles colonnes, le polypeptide actif subsiste dans le liquide en mouvement dans l'espace compris entre les particules et passe rapidement à travers la colonne. la colonne peut être lavée par de l'eau, afin d'en laver le polypeptide et bien que la matière à bas poids moléculaire est légèrement élués par
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
et proodddu la matière active peut normalement Otre éliminé* avant- que la matière indésirable ne coaxence à quitter 4& ? colonne.
Ka général, la natiere polypeptidique active peut.. étre .détectée par dés tests biologlquee approprié réalisé*- , sur dea fractions éludeb do la colonne* 190 iragusÉtda à bas . ' po.tdq moléculaire sont 6ndra.eaaat associées à dee substances brunes ou jaune'se dont le mouvement paut être 'outil riass7.3.'e
EMI10.2
ment
EMI10.3
le fractionnement par criblago aoléculairt selon la présente Invention peut tiré effectué à basse t *p<r4tùr*,- ; par ogemple# tt7 afin d'briter une croissance fieatér3txut** à des températures plus ilevioog il tot bon d'incorporez une-.'* substance antJA6b&otèriowie tel que phénol, nrrfaol, wto. ' j Dans la préparation de lu oolotuitt de di-mtrome ré. ticul4 la matière particulalre est de prd:'éronat agité* une ## ou rluaierre foin Avec du chlorure kit aodiua aqu4ux# par #xêt.- ;
flot cto5 nt et finalement lavde avec de l'eau afin d'îllaultr les înnn chloeure, latextrait orgtuîque auqueux uaeti afi là coin=*# èi contient, de préférence, un leatx0:rta, pur exemple, na bel neutre tel que le chlorure 44 xodima, tant donné que Is matière active *et rr4queuxent de nature acide, l'<l t1:y<)ft<t peut également Otre un elloglig par extasie, la triude srruati:
. que,-La concentration de 1141#ctrolyte peut varier entre 0f05î et 0,5!tt par exemple, 1#4100%rolyto peut tire du WotOl d'une concentration de 0,1 1i ou du ïaOH d'un* ootoentretion a* 0f01, te àutour actif peut également ltro' ara,nta,ouarent Zayd à travers le aextrane réticulé à l'aide d'un* solution alcaline au lieu d'eau, une tolution 0#05 - t5 Y pur extmpào, une solution 0,1 S de soude caustique étant très ettîozai*Mto* La solution résultante peut Otre neutralisée par traitement
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
à l'aJ.de d'une rénine échan'éeune de cations colle la fora* hydrogène, par exemple, un lèamberlite IR20.
Un autte procédé avantageux de fractionnement oonaiz- te en la précipitation de la matière polypeptidique désirée à l'aide d'un agent de précipitation inerte de protéines, pour autant que cet agent de précipitation ne détruise pas ou ns
EMI11.2
dénature pas les protéines ou les matières polypeptidiques et qu'il précipite 8jplemont leur solution*
Logent de précipitation de protéines peut être ajouté nous la forme d'une substance solide, telle qu'un* substance inorganique soluble dans l'eau, par exemple, un
EMI11.3
..1, 'par exemple, sulfate d'ammonium, chlorure de sodiumo eto, ou l'acide phoaphotungatique ou bittai cet agent de précipita- tion de protéines peut 4tre un liquide, par exemple une solut tion concentrée de telles substances.
La matière à poids moléculaire élevé contenant le polypeptide actif peut être précipitée de l'extrait aqueux et
EMI11.4
peut être épurée, par exemple, par filtration, oentrifuga- tion, etc ou bien, on pout la d1saouàr t dans une phase ores- nique séparée La phase organique peut être un liquide non miscible à l'eau ou, de préférence, un liquide polaire qui est normalement miscible à l'eau mais qui forme une phase se parée lorsqu* la phare aqueuse contient de grandes quantités
EMI11.5
de matière d1u8oute, comme a'eet le cas lorsque un agent de précipitation d'un nel inorganique est utilisé,
lit facteur actif ont beaucoup plue soluble dans de tolu nolvante polaire* que dans des solvants non polaires*
Dans une forme de réalisation préférée de procédé selon la présente invention, l'agent de précipitation de pro-
EMI11.6
U1nee est ajouté h une solution aquoUIJ6 contenant le poly-
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
peptide actif et à un solvant mi8c.ble z, l'eau, opération 4w coure de laquelle deux phase* se forait, la phase organique , . étant séparée et le polypeptide actif étant récupéré de celle- :
EMI12.2
ci. '¯# Ott
En gdnéral, le pH de l'extrait aqueux influencera la séparation et la quantité d'agent de précipitation utilisé doit. être en corrélation avec le pH. La présence d'autres substances dissoutes, par exemple, dee liquides organiques
EMI12.3
miscibles à l'eau, télé que éthanol, acétone, etc., affecte également la concentration de l'agent de précipitation en donnant des résultats optima.
EMI12.4
En général, lorsqu'on utilise 4u sulfate d'amon1ua comme agent de précipitation, la concentration optimale du
EMI12.5
col est comprise entre 25 et 60 de saturation, le pH étant . de préférence compris entre 5 et 8. Lorsqu'un liquide organdi- que miscible à l'eau est également utilisé, par exemple, de l'ethanol, la quantité de ce liquide est de préférence coapri- ee entre environ 30 et 60 ;
de la phase aqueuse, les prcpor- tions précises de sulfate 4'amon1u# et de liquide miscible à l'eau étant choisies de manière à donner naissance à deux phases* Par exemple, si une concentration de 46% d'éthanol
EMI12.6
cet utilisée, la concentration en sulfate d'asnoniua peut 'tr6 te 25 en poids* La quantité de liquide organique ajoutée est de pré-
EMI12.7
firenoet calculée pour donner un volume relativement petit , dans la phase séparée@ de manière à ce qu'une concentration du polypeptide actif boit engendrée* Il faut noter que lors-
EMI12.8
que de ldthanol out ajouté,
une certaine quantité de matière Indésirable cet normalement précipitée et peut tire jetée avant la traot1onnmont à l'aide d'un sel inorganique.
<Desc/Clms Page number 13>
Le fractionnement selon la présente invention est de préférence réalisé à la température ambiante et les concen- trations préférées d'agent de précipitation données ci-dessus ne sont pas toujours applicables à des températures élevées.
Le facteur actif est, cependant, stable jusqu'à 90 C et des températures plus élevées pourraient être utilisées, sans qu'une inactivation ait lieu.
Le fractionnaient' selon le procède de la présente invention peut être utilisé directement sur l'extrait aqueux
EMI13.1
d'organe d'animal ou sur les solutions aqeu8es résultant d'autres procédés de purification. De plue, d'autres métho- des de purification peuvent Être appliquée à la matière ré-
EMI13.2
sultant du présent procédé et, en généralo le fractionnement peut être effectué à n'importe quel stade de la purification globale du facteur actif.
La demanderesse a également trouve que le polypep- tide actif peut encore être* purifie d'une manière particuliè-
EMI13.3
rement avantageuse, par adaorption sur une matière cellulosi- que écbangeuse d'ions faiblement basique, cette adeorption étant suivie d'une ('lut1on' l'aide d'un electrolyte aqueux, par exemple, une solution neutre ou une solution acide ou uen solution faiblement alcaline.
Ce procède est utilement ap- pliqué en combinaison evec l'un des procédés selon la présente
EMI13.4
invention décrite ci-deeeuà, soit avant suit après l'opération de fractionnement. " La résine cellulosique échangeuie d'ions utilisée dans le présent procédé peut, par exemple, être des type* dé- ori't* par Peterson ene Sombere J.A.C.S. 76. 751 (1956) de telles matières englobent la cel.!.\ÜIJIt8 cbim1quQtHiu1 modifiée de manière à contenir des groupes faiblentnt basiques, tels que des groupes amino, des 'groupes dlalcoylamino, des groupes dialcoylamino alcoyl , etc.
La matière échangeuse d'ions
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
*pp*14* 2CI20LA ont particulibremont appropriée. t'C!lOtA est 1 produit de réaction d4p1cblorhd.r1nc. de triéthanols- ain. et de cellulore eodique, La cellulose DUS ou le alpha- dox DIU peuvent 4g'ect 4tre utilisés* la matière cellulosique éohaneu.. d'ionw *<t dit pr6t6nce utilisé nous un* fora* p*rticulaires dan.
UA* 00- looaw et ut de préférence tamponnée jusque un pH comprit entre 6 et 10, avantageusement un pH d'environ $ 5¯âV$* Un* solution tampon appropriée cet ccnetitu'!9 par une-solu- tion 0,m de bicarbonate d'n1u.'ou un tampon 0$005 V bi- oar1xmatt de et4up. anhydride carbonique à ?H 6,8-, 1.' u:trùto l' aqueux d'organe out de préférence également tamporm4 it envi- ron le m8me ph avant d'Otre Introduit dans Lit colonne tt Il est avantageux d'ut1l:18I3r une solution tampon pouy 611a1ner par Ravage les bpuretÓo inèt68irabha. l'extrait mquwux d'or. gane Mt, de prézérencop uonparat1v' tnt dilué et ooutte-ntj tv4atoLgeunement, 1 à 2 ji un po148 da solides état, Après lavr4o# lit polypeptide eetif peut h:-..1\1" :.;
de la colonne à 18a14 d'un* elut1ou 1.6re..n alonlint, Une solution <tqu m< 411\11. 4'h":oxyde de aodiW8 de 'I-ot.....- ttiuM ou 48tJIUAon1uII, par exemple, 0,C5-2M ou de çarbou*tt 48 ' potuneium est appropriée oomme Gluant eV bien ou peut au..l utiliser 00.. éluant un* solution relatlyonort e'tnewaty<0t de bitrtrbcwt* ci' UJlon:
hllZl, l'al' exemple# une solution appM ttiveaent Mitir"* 1,'41\1Uol\ peut ,.l.1Ia.n otre effectuée à ltai4. d'unw olution 8Q111., dt préférence, oonhnant égalteutnt un gel soluble# une solution 4"0140 aoétique et d'aoitate de .C'd1ulI rupeot1v8l1ltnt normal et .1i/!J étant ottixftiwMttw, #"#
EMI14.2
EMI14.3
pr6tÍh'.no. cependant, on utilise m phosphate tampon à un pu
<Desc/Clms Page number 15>
d'environ 7,5 ou un halogénure de métal alcalin tel que le chlorure de sodium, avantageusement en concentration* crois. canton, les Ions inorganiques indésirables présents dans
EMI15.1
l'lluat peuvent tiré élimin4a par traitement 4 l'aide de ma- tières à crible moléculaire, par exemple, par dialyse ou par mine en contact avec dea substance*, telle* que 9apkiudax 0-50 (vendu par J1.8.
Pbar=a1a of Uppsala 8w.d, ) citées ci-dessus. Le* cations peuvent également litre éliminée par traitement avec une eduine dchangeuae de cations Réticulée du type Âmberlite IR 120.
EMI15.2
Le* exemples non limitatifs suivant b illustrent la présente Inventions EXEMPLE 1.
EMI15.3
(*).Préparation d'une nâte de foiot 8 Kg de foie de boeuf fraie ont .tb haon4e, addition- née de 16 litres d'eau et de 108 de phénol (afin de préve- nir une contamination bactérie=*), Le mélange a été agité pendant 2 heures, chauffe soue agitation jusqu'à 100*0 pendant
EMI15.4
1/2 heure et laissé au repos jusqu'au lendemain à température ambiante. Le mélange a ensuite été chauffé jusqu'à 70 C et filtrat le résidu a été lavé par de l'eau contenant 0,5 de phénol. Les filtrats combinés (17,8 1.) contenaient 2,8 g de
EMI15.5
matières solides sèches par 100 ml.
La solution a été conavt1 tr4o à, 60*70*0 Doue vide jusqu'à former une pit. jaune pesant 760 g et contenant 65 de matière solide obche* On a ajouté à la ptte de l'éthanol à 75 (v/v) jusqu'à obtenir un volume do 394 1 et le mélange a été agité pendant 6 heures à la tom- pérature ambiante. Le lendemain, le précipité a été séparé
EMI15.6
par filtration et levé à l'aide d'éthanol à 70 (v/vj
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
les t'iltrata éthanoliquea combinés d'un volume de 4#6 1 contenaient 266 g ,de matière solide sèche. On a concentra à >0-40ÎC nous vide eunqu'à obtenir une pats d'un noir brunâtre Posant,375 g et contenant 71% de matière solide sèche.
(b) Adsorption sur amiante.
EMI16.2
600 g de pftte de foie ont été dissous dans 2ea 1 d'eaufraiotenent distillée contenant 0#3 jet de tricreaol, Ltt à solution avait un pH de .4,9 et on y a ajouté 11,2 g de poudre d'amiante. Le mélange a été agité pendant 24 heures à la température ambiante et a été laissé au repos cane agitation pendant 24 heures supplémentaires. L'amiante a été éliminé
EMI16.3
par.lavage à l'aide d'eau contenant 0#3 % de trierdool, 'Les couche-a aumageantes combinées ont été traiter d'une manière identique par 11#2 g d'amiante supplémentaires L'amiante la- vée a etë séchée sous vidé sur du p2O 5 et pesait 25#2 gs L'amiante a été dluie en une seule masse, à l'aide de phénol < liquide
EMI16.4
à 100 e!$/'U 50-60*C,
une première foie avec 200 g, une seconde foin avec 109 g et une troisième fois avec 200 g. les djuate combinés ont été ajoutée à 5 foie leur poids diéthvr# le préci- pite a été séparé par filtration et lavé à l'aide d'éther* La
EMI16.5
matière1 brun n'était pas complètement soluble dans l'eau Baie l'addition de- n0ü 0,1 bt Jusqu'à obtenir un pH de 7,5 a pruva.qu6 la mine en solution de la aatière non aissoute, L'amiante a été lavée par de l'éther afin d'éliminer le phe- nol et a été subséquemment élue à l'aide 0 200 ml d'NÜ 1, j L'eluat a été concentre sous vide,
ce qui a provoqué l'appa- rition d'un précipité La couche surnageant* a été utilisé* en vue d'un traitement ultérieur.
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
La fraction élude au phénol et la fraction élude à l'ammoniaque ont été purifiée sur des colonnes de Sephadex 050(diametret 2,8 emi hauteurs '2,5 cm) et la fraction à poids moléculaire élevé a été recueillie dans chaque case les deux fractions purifiées (12 mg provenant de la fraction phénolique et 18 mg provenant de la fraction aamonique) n'é- taient ni pyrogène chez le lapin ni antigénique chez l'homme et elles ont protégé dos souris contre une infection due à E. Coli et des poussins embryonnaires contre le virus de la variole vaocinique.
L'activité biologique est donc évitée et avec le
EMI17.2
phénol à 100 x et avec l'amraoniaque-N. Il t'est également rêvé-. lé que l'activité biologique est éliminée de l'amiante avec du
EMI17.3
laOIi, 0,1N. Les fractions actives présentaient dans l'eau une fluorescence bleu-vert et ont donné un précipité avec l'acide phosphotungatique.
EXEMPLE 2.
EMI17.4
0,5 1 de sang humain a été chauffé pendant 30 .insu- . ee à 100*0 et on y a ensuite ajouté 500 ml d'une solution aqumt. se à 3 t en poids de tricréscl. Le mélange a été filtré puis on a ajouté au filtrat 20 ml d'une solution aqueuse à 20 % en
EMI17.5
poids d'acide sulfosalicyli,que et le tout a de nouveau été filtré. On a ajouté 1,84 g d'amiante au filtrat ot on a laissé ! le tout au repos à température ambiante pendant 2jours.
L'a- miante a été séparée de la phase liquide par centrifugation
EMI17.6
et a été élude à l'aide de q90 g de phénol (100 ) à 10'0, pais on a ajouté 450 ml d'éther à l'éluat phonétique et le précipité résultant a été séparé par filtration. Le solide ob-
EMI17.7
tenu a été redincout datte de l'eau et le pll a td ajust 7 fi à l'aide de soude Clr.Ust1quEI aqueuse, La solution résultante
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
présentait des propriétés 8u11aireo à colles du produit d< . l*exeapl 1.. (a) préparation de la colonne de Sephadexs Du Séphadex G50 (A.B, Phanuoi&, Uppualaj a été . ait OU- suspension dans du chlorure de sodium 0 "X et le ul1m- jf ce 4 été o4J.td- pendant 30 l:11.nuiu. Après 10-1' minutes 49 xyz ! Pool fe liquide surnageant contenant les particules plus fin.. a It4'e6pard par décantation.
Après avoir remplacé la couche surnageant par du chlorure de aodiua 0,05 X traie, le proiddd r
EMI18.2
EMI18.3
entier a dt4 répété quatre toit, le Zéphadox m ensuite été. aggloméré par agitation et pesanteur dans une colonne (tiamèto 4i 45 cmî hauteur; 70 oz), La colonne a dt4 lavé* à 4*0 #i à l'aide d'eau fraîchement distillée 3ulutl, itrt exeuple de ion. 01.. - , ;..
D (b) Séparation par fr&ctionnesmRt de la fraction poids aolculnir* élevé de la préparai ion - jà2ueuLq.,.% de par trAcUonnemor..t tra,.t:1on *. *# ' ¯)v Un extrait de foie (provenant da 6 kg de toit frais) été préparé d. la man1re habituelle à partir de foie ±1'81. ' de bovin. par protéolyse 4 l'aide de papalut, précipitation du p1'Ot40118.t . l'aide d'l-t:, 4Y.poratto partielle du filtrat et extraction do lt aolutica concentré* par du phénol saturé 4'.au, dilution de l'extrait pbénoliqut par de l'éther " et extraction du all&n68 phénol-éther pse de l'eau. 600 ail de cet extrait aqueux on a ajouté un* solution à 5 4'hl4gxr.
4* do potassiua, de manière à obtenir un p àt 8924 Oc sa suite ajouté 7,32 e 4>aoétate de b&tyU8 $&(Ch 3 00 2)290,20 et la solution a été laissés au repos pendant 12 bourtit. 0*0 La petite quantité de précipité fora 5 a été -il1=tu4t par cou. tr1!u.at.ion. Au liquide surnageant dn a ajouté 2#8 1. d'alcool à 96 # et le précipité formé a été centrifugé de la solution
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
le jour auivant, puis il * été lavé par de l'alcool et .n.u1- : te par de l'éther et il a été finalement séché. Le précipité pesait 10,95 g.
Le précipité a été dissous dasn 500 ml d'eau et on a fait N'écouler la solution goutte à goutte à travers une
EMI19.2
colonne contenant 140 mJ. d'une résine acide dchangouse d'ions La. colonne a été lavée l'aide d'eau jusqu'à ce que la solu-
EMI19.3
tion qui s'écoulait gouttas guutte travers elle avait un JIll- de 5,5*'6 et ôtait incolore* A la solution on a ensuite ajouté du NaOH 2a Jusqu'à obtenir un pU de fi,5| la solution a été concentrée soue vide et linaleswnt séchée par congé- lation. le produit panait 2,9 g l'état bec, 0,5 g du produit (équivalent à 1 kg de foie frai a, a été dissous dans 50 ml d'eau* A la solution, qui présentait
EMI19.4
un pH de 6,6, on a ajouté 1,5 g de carbone qui avait au pra.
'labié été lavé par de l'eau et ensuite par de l'alcool. Après avoir laissé la solution au repos pendit 19 heures$ le car- bone a été empare par filtration de la solution et a été levé par de l'eau jusqu'à ce que le filtrat fut incolore. Les fil.
EMI19.5
. trate recueillis ont été concentrés eouu vide et pesée, après -séchage par congélation, ils pesaient 0,250 g.
EMI19.6
1tuf g de cette matière e60hh par congélation ont été dissous dans 40 ml d'eau et ont été amenda à passer à truvera la colonne qui a été 8ubutSqu.tnt lavé* par ae 1,'eau. Los premiers 70 ml ont été Jetés; les 200 ml suivants (couleur légèrement brunâtrequi contenaient la ratière à poids molé-
EMI19.7
culaire élevé ont été recueillie et evaporéa Jusqu'à .1ao1t. sous vida à l'état congelé.
La fraction pesait 150 mg.
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
La aa3eure partie de 1a matière de couleur sombre dans la pr6,r paration de fois se déplaçait très lentement vers le bas de la colonne et était pour cette raison, d'un poids moléculai- re peu élevé. Dans l'eau, la fraction active présentait une fluorescence bleu-vert et a donné un précipité avec l'acide
EMI20.2
phoegh,0tungat.que..
(o) Ant1g&n1c1td, La fraction active à poids moléculaire élevé ne
EMI20.3
présentait pas de réaction antiéniquss .an juger par le test de la peau, lorsqu'elle était administrée par injection
EMI20.4
à un homme à une dose de 0,1 me- 1 .l"'::;;t.. dj rottetîoa contre l'infection due à S, coli chez 1.,; ..' sour/is,
La fraction active à haut poids moléculaire s'est révélée posséder un effet protecteur comme montré par les @ donnée suivantes.
EMI20.5
Mous d'attaque baotér1baef 1,2; x z organisée par OU18. 0,1 ag (dissous dans de l'eau contenant 0,3 % de tr1oté'.1 ) de fraction à poids moléculaire élevé injecté par la. voie snamu8cul&1r. par sour.l.s. Un groupe dt 6 sou ont reçu la fraction à poids' moléculaire élevé? heures avant l'attique bactérienne et un.autre groupe 6 heurt$ avant l'attaque, 6 sour/is ont seulement reçu la dose d'attaque bactérienne et ont servi de contrôle. Les résultats tout donnés dans le tableau ci-dessous.
EMI20.6
'-""' .JJt.IJ.L... '##"### t'tal " '#'"' rr , L ¯,.¯ SurrlT*nt8/noBbr /de eourrri CoatçÔl . 0/6 3 tour#* avomt Itadul- 3/6 nistretion de la dote
EMI20.7
<tb> bactérie=*
<tb>
EMI20.8
6 heur avant l'admi- 2/6 niotration de la dont d'attaqut bactérietine
<Desc/Clms Page number 21>
Dans,une seconde expérience la dose d'attaque était de 3,5 x 108 organismes par sour/is. la dans de frac- tion à poids molécuiaire élevé injectée par la voie intra- musculaire était de 0,2 mg (dissous dans ! solution salino 0,1 ml). Quant au reste', l'expérience n'est déroulée comme décrit ei-dessus.
Les résultats sont donnée dans le tableau suivant.
EMI21.1
<tb> total
<tb>
<tb>
<tb> Survivnt/hombre/de <SEP> sour/is
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Contrôle <SEP> 0/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> heures <SEP> avant <SEP> l'adminis-
<tb>
<tb>
<tb> tration <SEP> de <SEP> la <SEP> dose <SEP> d'atta-
<tb>
<tb>
<tb> que4/6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> heurta <SEP> avant <SEP> l'adminis-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tration <SEP> de <SEP> la <SEP> dose <SEP> d'atta-
<tb>
<tb>
<tb> que <SEP> 3/6
<tb>
(e) Protection vis-à-vis du virus de la variole vacoinique.
La fraction à poids moléculaire élevé protège des poussins embryonnaires contre l'infection due au virus de la variole vaccinique (à une dose de 2,55 ug). La fraction à poids moléculaire élevé, en solution dans de l'eau, a été introduite dans la membrane chorioàlantoïque de poussins ambryonnaires agés de 10 à 11 jours.
Après 24 beur.., les ambryona ont été infectés .par le virus ae la variole vacoi- nique. lies ambryens ont ensuite été incubée pendant 5 jours, Les résultats sont donnée dans le tableau suivant
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
Dilution praction à poids molicul*4r* tltvé controle
EMI22.2
<tb> du <SEP> vaccin <SEP> reçu*
<tb>
EMI22.3
zü6 certaines colonwtoe 84par4en n6sbr u*c embryons vivtuète et 1 mort colonleot
EMI22.4
<tb> tous <SEP> les
<tb>
EMI22.5
wabyyono.aoat atortw' ]if7 Pou de colonies n4pardes; noabr ua t 6 mbryono vivante colonie #eabryon
EMI22.6
<tb> morts <SEP> et <SEP> 1 <SEP>
<tb>
EMI22.7
wnc r't .,eu vs 10 quelques colonie ;
nc&br<mw 6 embryons vivanta peu de ai3o. aient 6<)Ka" bryont encart
EMI22.8
<tb> en <SEP> via. <SEP>
<tb>
EMI22.9
EXEMPLE 4.
EMI22.10
6 litres de sang de bovidé* ont 4-t4 agités pour prévenir la coagulation et on a ajouté à et sang dû.tr1or4.Ó1 &0,3 ï t le tout a été chauffé à 100.0 .nd.nt 1 heg* puis on à laissé* le 'lang8 ou repos pendant 12 heurta. I* #41aa± a été tl1.tré et le filtrat (4 1) a 6U additionné d. 2,5 ',#' al d' ao1de .ultooù1u,y11qUtt 20 le pl'. u1;it6 t4.\,t.l'ht a été séparé* le Itltrat r, tU concentré et le pH été ajusté à 8, La *ttlbre a *tA enuwice 4 un lraet1Qnn.=tnt sur du Siphadox 0 50 (4 on x 3tom) dans du W*0!ï ge0l 1l et la trao. tton -à poids lIoltoula1N élevé n été J'tou8;.Uh. Lftzebe de Na Cl! t été dliaind à 1$aïde d'b.r11'. lit 120 (8) busquez obtenir un pH de 790 et la solution rio-4it4mte a été .4ah4. par oOI1&.11.Uon. R.nd'lI1nt. 481 iii- ympL8 ?.
,raQt1opnernQnt ou± ICTE2kÀj Une Pite 4* foie oorr..pon4ant . Ot4 g de .'i1r. solide $balle a dt4 dixoouto dans 25'ml de KU|HO03 0,01 M...
La pli a du ajusté à 815 par l'addition 4'a.awon184196on.'I1'r" .
<Desc/Clms Page number 23>
La solution a été amenée à panser à travers une colonne
EMI23.1
d'iECTEOLA (1,25 cm de diamètre x 5 cm de hauteur) qui avait préalablement été équilibrée z l'aide d'une solution tampon à pH Ei,S de i;üIiCO 0,07. M. La matière non adsorbée été éliminée par lavage z l'aide de 30 cl de la solution tampon à pH 8#5 de MI.IiCO, 0,01 it, La colonne a ensuite été élude à l'aide de IH4 iico3molaire# ce qui a stoppé l'activité bio- logique. Cette activité aurait également pu être éliminée d'une telle colonne à l'aide de NAOS ou d'on1aqu. aqueux.
Drrr.a le eau d'une élution là l'aide de NaOH, le pH cet amené à 7 par l'addition de Hole Le 1...01 et le 4lIl4H003 peuvent être éliminée par traitement avec du Sephadex G 50.
EXEMPEL 6.
Fractionnement sur ECTEOIA.
EMI23.2
(a) Traitement du ECTEOLA avant utilisation. 5 g d'EctBOU ont été laissée au repos à température ambiante pendant 2-3 heures avec 100 ml de IleOn normal, La couche ournageaute a été emparée par décantation, puis on a ajouté 100 ml dfliydroxyd%l de sodium et le mélange a été laissé au repos pendant 1 heu- re, La matière a été versée dans une colonne (1,5 cm x 7 en) et l'hydroxyde de podium a été éliminé par lavage à l'aide d'eau. La colonne a ensuite été équilibrée à l'aide d'une so-
EMI23.3
fluxion tampon 6. pH 6,8 de NaIiCO-COtp5lA..
(b) 25 mg de la fraction à poids moléculaire élevé provenant de la colonne de Sephadex, préparée selon l'exemple 3, à partir d'une fraction de foie précipitée, ont été dissous dans 10 ml d'une solution tampon à pH 6,8 de NaH CO2 0,005 M et ont été amenée à paaeer h travers la colonne. La colonne a été lavée à l'aide de la solution tampon. La colonne a ensuite été élue*
EMI23.4
à l'aide de NIi3 Zii et ensuite h l'aide de NaOH 0,5 D1 ce qui a permi d'enlever la fraction active. La solution a été traitée
<Desc/Clms Page number 24>
par -de l'imberlite IR 120 (H) jmqu'à obtenir un pH de 6,0.
La solution a été séchée par congellation et à donné 24 mg dont-Une partie était constituée par du bicarbonate de sodium, qui pouvaient être enlevée par un traitement ultérieur à l'aide de Sephudesx.
EXEMPLE 7,
Une colonne d'ECTEOLA (5 cm x 1 cm) préparée passe dans. l'exemple 6a a été utilisée. 12,5 mg de matière (obtenue par traitement d'une pite de foie à l'aide d'amiante, par élution à l'aide de NaOH, par neutralisation à l'aide de BC1 et par élimination de NaC1 sur Sepoadex, ont été dissous dans 10 ml d'une solution tampon à pH 6,7 de NaHCO3-CO2 0,005 M et le tout a été amené à passer à travers la colonne. La co- lonne a été lavée à l'aide de la solution tampon, puis elle a été éluée à l'aide de 40 ml de NaOH 0,11 H.
Il en a résulte une fraction possédant une fluorescence jaune. Le NaOH a été éliminé par addition d'Amberlite IR 120 (H) jusqu'à obtenir un pH de 7,0 et la solution a été séché* par congélation.
La matière solide sèche pesait 10 mg dont une certaine frac- tion était constituée par du NaHCO3.
EXEMPLE 8.. '
A 50 litres de sang de bovidé agite, on a ajouté 150 ml de trcrésol et on a chauffé le tout à 90 C sousre- flux pendant 2 1/2 heures, 82 litres de EtOH à 96% ont été ajoutée à la solution chaude et celle-ci a été agitée pendant 1 heure sans chauffage* Le mélange a été ensuite 'laissé au repos-pendant 12 heures pour refroidir jusqu'à la températu- re ambiante et il a ensuite été filtre de manière à donner 80 1 de filtrat, 43 1 d'eau ont été ajoutée et on a ajouté au mélange une solution aqueuse d'acide sulfacllaiclyique à 20 % jusqu'à obtenir un pH de 1, Le précipité a été jeté
<Desc/Clms Page number 25>
et le pH du filtrat a été,ajusté à 8, 8,
3 .. l'aide de MaCH à 30 %. 0,25 kg de (NH4)2SO4 par litre ont été ajoutée à la solution tout en agitant/Par repos, le mélange s'est séparé en deux couches. La couche supérieure (phase alcoolique ) a - été recueillie et concentrée noue vide jusqu'à un volume de 51 et elle a ensuite été'dialyséo peneant 12 heures, Le pH a été ajusté à 7,5-8 par addition de NaOH et la solution a été filtrée et concentrée sous vide jusqu'à un volume de 450 ml.
Une colonne de Sepnadex G50 (9,2 cm x 95 ont, dia- mètre x hauteur) a été équilibrée à l'aide de NaOH 0,01 M et 250 ml du concentrat ci-dessus, ajustée à pH 11-12 à l'aide de NaOH à 30 %, ont été introduite dans la colonne.
On a utilisé du NaCH (0,01 N comme éluant). 1 1 de l'éluat (volume vide) a été jeté et on a recueilli 1,46 litre aube'- quant. Cette solution contenait la matière à poids moléculai- re élevé et a donné un précipité avec l'acide phosphotungs- tique. La solution a été neutralisée par addition d'Amber- lite IR 120H ( réai ne échangeuae de cations sous la forme hydrogène), la résine a été éliminée par filtration et le filtrat a été séché par congélation. Le rendement a varié entre 0,05 g et 0,1 g par litre de sang.
EXEMPLE 9.
20 kg de foie de bovidé haché ont été chauffés tout en agitant, à 90 C, avec 50 litres d'eau. Du phénol a été ajouté, de mainère à obtenir une concentration finale de 0,5 %. Le mélange a été laissé au repos pendant 12 heurs@ et le filtrat a été concentré sous vide jusqu'à obtenir un volume de 3 litres. On a ajouté 5,3 1 de EtOH à 96% et le mélange a été laissé au repos, à température ambiante, pendant
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
toute la nuit. te filtrat * été concentré eu* vide jusqu'à un Diluant de 2,6 1 et, afin de provenir une oantaaaix,atiat:. bactérienne, on a ajouté 3,4 ml de tricrésol.
A 500 ni de la solution on 4: ajoité 750 ni d'un . solution saturés ds(3fii; et on a laiend le précipité <t . séparer toute la nuit à température Mibi<mtWt Le riaip3ti. a été lavé à l'aide de EIJ3id)28t74 tstituri et a été dissout dan de l'eau en ajustant le pH à 7,0 à l'aide de U&OH* Lébaltittogi a été di*lyode#co qui a élictlntf une certaine natière colorée ? La solution dialysée a été néch4o par congélation et t don- né 1,53 ## Activité biolRifme.
Les produits décrite dans ces excuples possèdent une activité via-à-via du virus de la vericle vacoinique dans la peau de lapins et inhibant la mitose de cellules de Ilola dans un milieu de Pucke. 5F .7Cs ":,,, lra,ç,:annamen,t de matiè,.-n, au± $e±liedex, 0 *jù. <i.ua du lie0j 4..',.;.
La solution contenait du tricr 5st\ k in %, afin 4e j prévenir la croienancoo 0,22 g de matière sot dtv dissous dans 10 nul d'eau,, puis on a ajouté 4 MI d'aolde #ulfoaalojrlique à 20 7G, Le filtrat a été neutralité par du 9*014 juwtlult obtenir un pH de 7,5, pute il a été introduit dont une colonne de 8apxtsdtx , ! 0 50 t35 on x 3g5 on# hauteur x diamètre) et il a été itquili- br4 e l'aida de :daC1 0,1 1 contenant du trierinoi à oui La colonne a tJ éluta h l'aide de cette dernière Holution.
Les premiers 95 ml t'diunt ont itu jutdu. loo r35 ul suivants; contenant la matière à poida c<M4oultirw élevé ont été re-
<Desc/Clms Page number 27>
cueillis, dialysée et séchée par congélation. Rendement. SO mg i
EXEMPLE 11.
EMI27.1
Un* OOlON1. de diéthylaminoéthyl oellul08o (DSAE) (7 x i,8, hauteur x diamètre) * été équilibrée à l'aide d'une solution tampon à ill 7,5 de phosphate 0,005 Bd. 200 c5g de matière (de aang) ont été dissous das 40 ml du tampon et ont été amende à passer à travers la. colonne* La colonne a été subséquemment lavée a l'aide de la solution tampon. La colonne a ensuite été éluée à l'aide d'une solution tampon
EMI27.2
à pH 7,5 de phosphate 0,005 It contenant du 9*01 0,08 X, une #ol'tlon tampon de phosphate 0,05 U contenant du NACI 0,1 Y et une solution tampon à pH 7,5 de phosphate 0,1 M contenant du
EMI27.3
Nacl 0,5 M. Les trois fractions ont été dialysées et ,doh'o8 par congélation.
La première fraction a donné 22 siet la Meconde a doruté 55 mg et la troisième fraction a donné 55 nig également* Toutes les fractions possédaient une activité
EMI27.4
tiologique.
EL.;t#LE 12.
Solution pour ndbul1enti !t nanales.
1 g de matière séchée par oongalation préparée par le procédé de l'exemple 4 a été discoue dans 400 al d'une solution aqueuse de chlorure de sodium (0,9% en poids) con-
EMI27.5
tenant 0,1 en poids d'un mélange de p-hjrdroxybeneoates de méthyle et d'éthyle (Nipa ester 82 121).
Rtls'?tDTOA'IOlf9y ¯ 1.- Procédé de production d'une mat1r'POypePti- dique ptt)d.ui'..LI1t une isuaunité non-apéoi.tlque, caractérisé en ce qu'on soumet un extrait aqueux d'organe d'animal à un fractionnement afin de séparer la matière à poids moléculaire élevé de la matière à bas poids moléculaire et en ce qu'on
<Desc/Clms Page number 28>
récupère ainsi une fraction polypeptidique possédant un poids moléculaire d'au moins 1000,
2.- Procédé melon la revendication 1,
caractérise en ce que le fractionnant est réalisé afin.de recueillir une -fraction sensiblement exempte de polypeptides possédant un poide moléculaire inférieur à 1000.
3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce.,que le fractionnement est effectue afin de récupérer une fraction sensiblement exempte de polypeptides possédant un poids moléculaire inférieur à 8000.
4.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revend!- cations précédentes, caractérisé en ce que les organes d'ani- maux'sont constitués par le .foie, les reins, la rate et le sang' seuls ou en mélange entre eux.
5,- Procédé 'Ion l'une ou l'autre des revendica- tiens précédentes, caractérisé en ce que, avant le fraction- cément, l'extrait d'organe est traité pour éliminer les pro- téines,
6.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'extrait aqueux d'organe est chauffé, avant ledit fractionnement, afin de coaguler les protéines indésirables et en ce que la matière Insoluble en est séparée.
7.- Procède selon la revendication 6, caractérise en ce que l'extrait est chauffé jsuqu'à environ 100*0. ,
8.- procède suivant l'une ou l'autre dès revendica- tions 5 à 7, caractérisé en ce que avant ledit fractionnement, l'extrait aqueux est concentré afin de précipiter la matière solide contenant le polypeptide désiré qui est alors obtenu par extraction à l'alcool suivie d'une élimination du solvant et d'une redissolution dans de l'eau..
<Desc/Clms Page number 29>
9.- Procédé selon l'une ou l'autre des revendica-
EMI29.1
tions à 8', caractériel en ce qu'on ajoute de l'acide sulto- allayligu ' T'extrait aqueux pour éliminer les protéines indésirables, @ 10.- Procédé ouiyant l'une ou l'autre des revendica-
EMI29.2
fions prdaédslteà,';
çaraotdrlaé en ce que l'extrait aqueux est soumis audit fractionnement par mise en contact avec un ad- norbant sortant a adaerber la matière à poids moléculaire -élevé en vue d'adsorber la matière polypeptidique active, cette opération étant suivie par l'élut ion à l'aide d'un li- quide choisi, dans le groupe forme par les liquides basiques
EMI29.3
, et acides ltaide de a alitions d'une concentration élevée #'#en éleotr&2t9.
11.- procède suivant 1 revendication 10, attractéri- aé en ce que l'adsorbant est un,silicate complexe,
EMI29.4
l4 procédé suivant la revendication 11, caractéri- el en ce qu l'adsorbant est de la montmorillonite, de la 1,bontonite "dé 'délite. ' 13.- Procédé selon la revendication 11, caractériel ,, rn oe 4ttS.Va.*f0*Wt iatd. râlante.
14t.. ,roa:3dé 8eÇ:on..,ll'une"ou l'autre des revendica.
'fions 10 â 1a2, caractérisé en. ce que le pH de l'extrait est jcompris entre 4 et 7 pendant l'sdsorption.
EMI29.5
3j5.-jP'oced colon la revendication 14, oaraoteri- !né en ce que ' le )11 est cospris entre 5 et 6 pendant l'adaorp- 'tion.
16 -Procède selon 'l'eune ou l'autre des revendiam- tione 10 à 15, caractériel en ce que l'extrait contient, li=édiatem 1't axant Iladisarptòzt, une forte concentration de isolidos...i*'-*11!
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
17#- Procédé neloni "11= % ou l'autre des nT.nd1oa.. tions 10 iL 16, caractérisé en ce que 1.'é3,ution cet.effectuée) à l'aide d'un e-ofde faible i,.:1!'i\ l-'.1d. d'un v' ao!de ta.:.1.bl. .4ui. , 18.-.roa3dd telcn it revendication 17t oarirtfri ed en ce que l'acide faible est st phénol aJùWI1'to..
19.- Procédé selon 1 r vendicati .7 o<n'dt<rjt.$< Vv,xle 19.- Proédé 'don ftTend1at11iZ''ltcar..ot'f'1""" et% os que l'acid..ta1blo est de l'acide 10 ;. o 4. lt:d...: acétique anhyare ou aqueux 1\ ' ' ..".fr" 20." Procédé Belon ïfvtt ou 1 sult q* Îendios.
'- V' 1 Ul il S 1 , . ';. . tione 20.- prc6d ..lon ci0 u 1,.\r1'4;Y.nd1o ' tlOM 10 à 16.'f'Ctddd \'" d¯. l'éll,t\A,''.'} 'ti.ctu4., ; à l'aide d eule ou d'une btt , :or g .z; û'a dilué** aqueu ou d'une solution de chlorure fdaN,eadlum. ## '# i ou llai%tre dtta voudied- 21. 1'roçpidé nelo!vrua ou l'autre dt! stxtdlcr- tions 1 à 9, cnracUrl8Ó on ce que ledit r..ot1cliinelÎaut est ' effectue en mettant en contact n'entrait aqueux <iLVco un* matieye h crible 1'ful"1.:"e 11>IÓ.bl. eux Olhu.10I; #$un - poids xolGnui,aire supérieur 100(Aaj'in 4,t é,ar.r .rna3,tse 'f. molécules de 8u'QatlU\OU d'un .p.n1dIlVI10.1."'Ot.&a1' plnt faible. ';# 22 * 2:rop4d atlon 3<: 3ti\,'nd1oILUon 1,'otr,i:ir ;
est out que la matière à <lrtblt IÎÓlu.la1. ut 11HU..'ft:bl. *? >.!# fi. substances d'un poids I/IOUQU1-.JrtÍ supérieur 'Ca4Ë F 23*- eroé4d* selon Ida lo%& lo&utro 4ftp iY*Udtc&.
23," rooi4...on l'nQ l'tutre <J /1 revend le a- , tion< 21 et 22. 1I.t'r11' enoet ue la 8&tilre ,rlîa xoléculaîre est: du dsxtrazu r<IU4ul4 à l'de d'oxyde 4#4thy.
Iéna, #'# ' .., , zigue 24,-' Prooôdé aelqn revendication 23, , ,. . oéra t4ri < ) -t-' en ce que la matibrt% 3 oxibxe est du S<tp&A4ex 0 50.. ! ' '' {\& t'bf1.1t : ' a 50. '\ . I.!, I, 25.- Procède selon l'une ou l'autre oos t J'.'y.n41c..- , ! t tions 21 <t 24 as.raatri.ea en ce que la matière 4 crible acl4-- oula1r. sort utilisée euua une òrme p<i)'ticuleirt.
<Desc/Clms Page number 31>
26.- Procède selon l'une ou l'autre des revendica-
EMI31.1
tions 23 à 25, oaraot6r1é en oe que le dextrane réticulé est mis en contact avec une solution aqueuse ou un sel de métal alcalin avant le fractionnement et en ce que les unions dudit
EMI31.2
Del sont éliminés par 1.Tage.
27.- Procédé selon la revendication 26, caractérisé, en ce que ledit sol est un sel dé sodium.
28.- Procédé selon l'une au l'autre des revendioa-' tione 23 à 27, caractérisé en ce que l'extrait à traiter con- tient un électrolyte,
29.- Procédé selon la revendication 28, caractérisé
EMI31.3
en ce que les cations de 1$électrciVte sont les mêmes que ceux du sel par lequel le dextrane réticule est traité.
30; Procédé selon l'une ou l'autre des revendica- tions 28 et 299'caractérisé en ce que la concentration de l'électrolyte dans l'extrait tarie de 0,05 à 0,5 M.
31.- Procédé selon l'une ou l'autre des rovendioa-
EMI31.4
tions 23 à '0. caractéried on ce que la solution de la matière polypeptidique désirée .et séparée par lavage du dextrans réticulé à l'aide d'une solution alcaline.
EMI31.5
32*- Procéda selon l'une ou l'autre des r.v8ndioa- ! tiona 1 à 99 carnot6rleé en ce que ledit fractionnement .et j effectué en ajoutent un agent de précipitation de protéines
EMI31.6
inertes h l'extrait aqueux' d'organe afin de séparer le eatie- re polypeptidique désirée de l'extrait.
33.- Procède selon la rE rendlaatian ï2p caractérisé1 eu ce que l'agent de précipitation est une substance inorga- nique soluble dans l'eau*
EMI31.7
34.- Prca6d6 selon la revendication 32, caractérisé il en ce que l'agent de précipitation est du bullute d'ammonium, du chlorure d'ammonium ou do l'acide phoophotungatique,
<Desc/Clms Page number 32>
EMI32.1
35*- Procédé salon l'une ou l'autre des revendiez- tions 32 à 34, caractérisé en ce que la matière polypeptidi- que désiré* *et amenée à précipiter et eat ensuite séparée de l'extrait.
EMI32.2
36.. Procédé selon l'une ou l'autre de* TeT.nd1oa- tione z J4. oaraatdriad en ce qu'est présent un liquide, qui, en présénce de l'agent de précipitation de protéines
EMI32.3
ajouté à l'extrait aqueux, forme une phase séparée dansa la- quelle te polypeptide ont extrait.
'7.- Procéda selon la revendication 36, oaraeteriee en ce que le liquide est un solvant polaire miscible à l'eau.
38.- Procédé eelon la revendication 37,caractérisé
EMI32.4
en ce'que le liquide est de lléthanol.
39." Procédé selon l'une ou l'autre des revendioa- | tiona-'D2 à 38, caractérisé en ce que lorsque l'agent de priai- pitation est du sulfate' d' ammon1wn..a concentration finale dans l'extrait est de 25 à 60% en poids.
EMI32.5
40.- 1 ro,oédtS selon la revendication 39t caractériel en et/que lorsque un liquide susceptible de former une phase séparée est présent, la concentration de l'agent de précipita- tion est faible.
41.- Procédé selon l'une ou l'autre des revendica-
EMI32.6
iion8-,6 40, caractérisé en ce que la quantité de liquide de la phase séparés est inférieure à la quantité de liquide de l'extrait, de manière à ce que le polypeptide déliré soit concentré.
EMI32.7
J' 42.- Procédé selon l'une ou l'autre des revendica- tiens précédentes, caractérisé en ce que les procédés de
EMI32.8
ract1Ór':ent selon les revendications 10,. 21 et 32 sont ui1 .
Usés dans n'iaporte quel ordre.
<Desc/Clms Page number 33>
43. Procéda suivant l'une ou l'autre des revendi- cation précédentes caractérisé en ce que l'extrait d'orga- ne ou une solution aqueuse dérivant d'un procédé de fraction- nement appliqua audit extrait et contenant le polypeptide désiré est mis en contact, avec une matière faiblement basique,
EMI33.1
celj-ulcsique échangeuse d'ions, afin que dette matière adsor- be le polypeptide désiré, le polypeptide désiré étant ensuite élue de la matière échan"euse d'ions à l'aide d'un élsatrolyte aqueux.
44.- Procédé selon la revendication 43, caractérise '
EMI33.2
en et que la matière échangeune d'ions est constituée par de la cellulose chimiquement modifiée de manière à porter un ou plusieurs groupes anino, dialcoylanirio ou dialcoylamincal- ooyle.
Procédé selon la revendication $4, caractéri-
EMI33.3
sé en ce que la matière echangeuee d'ions est constituée par le produit de la réaction d'épichlorhydrines de triéthanola- mine et de cellulose sodique ou par de la diéthylaminoothyl- cellulone.
EMI33.4
4È4- Procédé sejon l'une ou l'autre des revendioa4 tiens 43 a-45t caractérisa en ce que la matière échangeuse 'd'ions eat,,tampannée jusqu'à un pH compris entre 6 et 10.
41.- Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que le pli est compris entre 6,5 et 8,5.
48.- Procédé selon l'une ou l'autre des revendica- tions 46 et 47 caractérisé en ce que la solution apprêtée est tamponnée jusqu'à un pH sensiblement identique au pH de
EMI33.5
la matière échmbausa d'ions*
<Desc/Clms Page number 34>
EMI34.1
49.- Procédé belon l'un* ou l'autre do retenais- tions 43 k 48# caractérisé en ce que la solution à traiter contient de 1 à 2 0 en poids de matières solides saches.
50.- Procédé selon l'une ou l'autre de revwndiet- tion 2 43 à 49# caractérisé en et que l'élut ion est attaotu8'1r . à l'aide d'hydroxyde de sodium# de potassiun ou d'MKaocimt Y dilué ou. à l'aide de carbonate de potassium ou d<<mmoMlua/ 51.- Procédé union 1$une ou l'autre des revendica- tioni 43 à 49# caructéried en ce que 1ilutiou. asi eftactufe à l'aide d'un tampon de phosphate d'un pli de 7,5 ou 4 l'aide d'un hg1ogénure de métal alcalin.
52.- ?roo<!d Ion l'une ou J'autre des rotendioa- tione prdeddonte4f carsatiriad en et que 3,'extic'tJ.t d'organe ou une solution aqueuse dérive* de cet extrait ï t nant'waxrx ' le polypeptide désiré out ajusté k un pH ocaprit entre 5 et 10 et ari ce qu'OR ajoute un avl soluble dans l'eau d'un s4tal polyvalolit et en alcool soluble doits l'eau afin d-f pr4oipts. ter le polypeptide ddeîr4o 53*- Froo<id selon la rcvaudioaxior. 2, carautdri" en os que le sil es% de Itacet4ti de baryu ou de sine ou, du chlorure de R*6adoluo ou de sine et un ce que 1 xloaal *os' de 1 ithanal.
54*w frooddd selon la refan4ioaticn 1, en substance, tel que décrit oi-deseus, notamneat dan l'wv des
EMI34.2
exemple* précédente*
EMI34.3
5$,- Matière polypeptidique cokairint une ilmur4ti non-apicitiquag lorsqu'elle est préparée pqr le procédé selon l'une ou l'autre des i,4tvtiidicatlons précédoi)tea.
5<t- Matiera pplypwptidiqut 0981.'?ér4it une taauulté non-spéoifique, w<m)ti'jl<'a<'at aunu *Ctivltô prro3niaue où' mtigitriquo nenuiblement exempta de polypcptidm 'i'mt poids, moléoulairo inférieur à 1000, stable a la clirlitur uqu; -
<Desc/Clms Page number 35>
EMI35.1
au oins 100*0, soluble dans le phénol liquida, dune l'eau
EMI35.2
et dans lea baaea aqu.uaea"préc1pitablt . partir de solutions aqueuses par de l'acide phoaphotungat1qu., noluble dans de l'acide sulfanalicyllque aqueux, possédant une fluorescence
EMI35.3
verte et contenant les acides aminée suivants nous tome
EMI35.4
polypeptidique, notamawat l'acide glutamique et l'avide tapartique, l'arginine, la lysine# l'alanine, la serine, la Une, la leucine l'isoleuoine, la glycine et la ph4"11ala- nine.
z5?.- matière polypeptidique conférant une immunité' zlon-b'eécitique sensiblement sans activité pyrogénique ou gntigdniquel sensiblement exempte 4 polypeptides d'un poids moléculaire inférieur à 1000, stable à la chaleur Juaqu'à au
EMI35.5
moins 100*0, soluble dans le phénol liquide, dans l'eau et
EMI35.6
dans les baste aqueuses@ pr6oi1tab1.s partir de solutions aqueuse par de l'acide phoephtun88t1u., soluble dans 1'.01- de aulfonalicylique aqueux, poae3datt une tluor'8.ne.
verte et contenant les acides amin6a suivants moue toi-me polypeptide que, notamment, lea acides glytamique eQpart1qu., l'argl- ningo la lysine, l'alanine, la serine, la valine, la laucinet litsoltuoino# la glycine la phénl1ulan1no, l'hiatidine, la praline, la tyroeine et la tbr4onin.,aeneiblemQnt exempte de phosphore combiné, poaoédant lea réactions caractéristiques des boxonam4nen et une réaction d'anthrone et de biuret p081.1. vu et possédant une activité antimitotique vis-à-vis des oeil-
EMI35.7
lulee de Héla et de Chang. '
EMI35.8
58.- Matière selon l'une ou l'autre deu revendioa- tione 56 et 57, caractérisée en ce qu'elle cet exempte de
EMI35.9
matière polypuptidique possédant un poids moléculaire inférieur
EMI35.10
à 80UO.
<Desc/Clms Page number 36>
EMI36.1
59.- Matière selon la revendication 56, en substance# telle que décrite oi-deaaua, notamment dans l'un. quelconque des exemples précédents.
60.- composition$ pharmaceutique contenant un* ma-
EMI36.2
tière polypeptidique Selon la revendication 56 et un ou plu- sieurs, excipients ou véhicules pharmaceutiques Compositions selon la revendication 60, sous force de dose-5 unitaire$$
EMI36.3
62,- Compositions selon la revendication 61, earao-- t8r.iaéee en ce que chaque dose unitaire contient 5 à 20 rag de la* matière polypeptidique 63*- Compooltions selon L'une ou ligutre des reygi%. dications 61 et 62# sous forme de tablettes, capsules, dra., &des-ou suppositoires* 64.- Compositions selon la revendicatioa 60, pour . l'injection, caract4riedon en ce que le véhicule est un liqui.
de parentéralement acceptable.
65.- Compositions selon la revendication 64# çaiac- tdrisées en ce que ledit liquide est de l'eau apyrogene sté- rile.,
66.- Compositions selon la revendication 60 pour l'administration orale, caractérisées en ce que les véhicules ou excipients comprennent un ou plusieurs véhicule* ou exci- pients servant à préparer des tablettes.
*(
EMI36.4
compositions **Ion la revendication 6Q# çaar'xa térisées en et que le véhicule ou l'excipient comprend une ou plusieurs buste pour suppositoires*
68.- Compositions colon la revendication 60, tous
EMI36.5
lonsede sirops, d'élixirs, d'esiuleions ou da .inparl.es.
<Desc/Clms Page number 37>
69,- Compositions selon la revendication 60, sous forme de solutions pour pulvérisations* 70,- Compositions selon la revendication 69, ca- Ractérisées/en ce que ladite solution pour poulvérisation contient de 0,1 à 10% enpoids de la matière polypeptidique.
71.- Compositions selon la revendication 60 en substance) telles que décrites c-dessus.