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WO1992002544A1 - Peptides de la famille des chromostatines - Google Patents

Peptides de la famille des chromostatines Download PDF

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Publication number
WO1992002544A1
WO1992002544A1 PCT/FR1991/000657 FR9100657W WO9202544A1 WO 1992002544 A1 WO1992002544 A1 WO 1992002544A1 FR 9100657 W FR9100657 W FR 9100657W WO 9202544 A1 WO9202544 A1 WO 9202544A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
residue
formula
peptides
peptide
chromostatin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1991/000657
Other languages
English (en)
Inventor
Dominique Aunis
Marie-France Bader
Estelle Galindo
Michèle ROMMAIN
Karen Helle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of WO1992002544A1 publication Critical patent/WO1992002544A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present application relates to new peptides of the chromostatin family, the preparation and the application as medicaments of these new peptides.
  • the present invention thus relates to new peptides corresponding to the general formula (I): in which :
  • R represents a residue of formula:
  • X ⁇ represents a residue D or GX 2 represents a residue D or AX represents a residue S or T Xg represents a residue V or A or R j represents a residue of formula:
  • * X4 represents a residue D, A or P
  • R 2 represents a residue of formula: -GLGPGP or of formula
  • the peptides as defined above are such that:
  • R ⁇ represents a residue of formula:
  • R 2 represents a residue -GLGPGP
  • Such peptides can correspond to the formula (II) corresponding to bovine chromostatin:
  • R ⁇ represents a residue of formula
  • the present invention also relates to the fragments of the peptides described above.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of peptides or fragments as defined above, characterized in that a synthesis in solid phase is carried out by sequentially introducing onto a support of polystyrene type crosslinked the amino acids duly protected using a coupling agent, the amino acids are deprotected, and the peptide chain thus formed is released from the resin to obtain the peptide thus sought.
  • a synthesis in solid phase is carried out by sequentially introducing onto a support of polystyrene type crosslinked the amino acids duly protected using a coupling agent, the amino acids are deprotected, and the peptide chain thus formed is released from the resin to obtain the peptide thus sought.
  • the process described above is characterized in that:
  • crosslinked polystyrene type is a resin of the "Boc-AA-CM" type in which Boc is a tert-butyloxycarbonyl group, AA is the first amino acid and CM denotes the crosslinked polystyrene support, or
  • the coupling agent is (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate or BOP, or
  • the release of the support of the peptide chain as well as the deprotection of amino acids are carried out by means of hydrofluoric acid by operating at low temperature preferably towards O'C.
  • the peptides, or fragments, according to the present invention have very interesting pharmacological properties; there are in particular anticatecholamine properties and activity in the cardiovascular field in particular a decontracturing action of the venous walls has also been observed.
  • Another subject of the invention is the use of the new peptides or of fragments corresponding to formula (I) above as medicaments.
  • the peptides corresponding to formulas (II), (III) or (IV) will be used as medicaments in particular.
  • These drugs find, for example, their use in the treatment of pathologies occurring within the framework of a hypersecretion of catecholamines and corticoids, in particular in situations of stress, in gastric ulcer, in hypertension and during hypertensive attacks in patients with secreting pheochromocytoma tumors.
  • These drugs can also be used to combat the side effects of glucocorticoids; they also make it possible to combat disorders due to a hypersecretion of glucocorticoids and in particular against aging in general and more particularly against hypertension, glaucoma, atherosclerosis, osteoporosis, diabetes, obesity as well as depression immunity and insomnia. These drugs can also be used in the cardiovascular field and in particular for a decontracturing action on the venous walls.
  • the usual dose which varies according to the product used, the subject treated and the condition in question, may for example be 0.1 to 10 mg per day intravenously in humans.
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions which contain at least one aforementioned peptide or fragment as active principle.
  • the peptides corresponding to the general formula (I) can be incorporated into pharmaceutical compositions intended for the digestive or parenteral route.
  • compositions can be, for example, solid or liquid and can be presented in the pharmaceutical forms commonly used in human medicine, such as for example simple or coated tablets, capsules, capsules, granules, suppositories, injectable preparations , aerosols; they are prepared according to the usual methods.
  • the active ingredient (s) can be incorporated into excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives. Examples of implementation of the invention will now be given without implied limitation in which:
  • FIGS. 1A and 1B represent families of recording currents obtained by the "patch-clamp” technique in the absence (1A) and in the presence (1B) of peptide.
  • the numbers indicated on the curves indicate the applied membrane potentials.
  • FIGs 1C and 1D are curves illustrating the relationships between the membrane potentials (on the abscissa) and the intensity of the currents (on the ordinate).
  • Figure 1C shows in the absence of peptide the evolution of intensity / potential relationships 9 minutes apart in a control cell.
  • FIG. 1D shows the evolution of the intensity / potential relationships before the addition of peptide and 9 minutes after the addition.
  • - Figure 1E illustrates the evolution of the relationship between the incoming current measured at a given time and the incoming current measured 10 minutes after the cell-pipette connection (Ipic / Ipic (3 min.)).
  • FIG. 2A is a curve showing the evolution of the quantity of synthetic bovine chromostatin linked to chromaffin cells as a function of chromostatin concentration.
  • Figure 2B shows the relationship between the bound / free chromostatin ratio (ordinate) and the concentration of bound chromostatin.
  • FIG. 3A illustrates the effect on the binding of synthetic chromostatin from bovine iodine (peptide of Example 2) by human synthetic chromostatin (hChS) or its fragments of 20 or 24 amino acids (Ch S 20 or 24 aa ), by chromogranin A (CGA), synthetic rat chromostatin (Ch S rat), by pancrastatin, or by CAP 14.
  • the binding percentage of bound iodinated bovine chromostatin is expressed on the ordinate, the concentration of peptide on the abscissa.
  • FIG. 3B illustrates the effect of bovine chromostatin, in the presence of the peptides cited in FIG. 3A, on the release of catecholamine by chromaffin cells. The results are expressed relative to the release in the absence of chromostatin.
  • Figure 4A is a photograph of a one-dimensional electrophoresis gel. Wells 1 to 4 and 5 to 7 correspond respectively to the membrane and soluble fractions. Bovine chromostatin (ChS) concentrations are indicated in ⁇ M.
  • Figure 4B is an autoradiogram of the gel of Figure 4A. In these two figures the molecular weight (Mr) is indicated in kD.
  • FIG. 4C is a histograph indicating the percentage of radioactivity relative to the control, of the corresponding wells.
  • FIG. 5 is a histogram illustrating the effect of various concentrations (2; 20 and 200 nM) of human chromostatin (h Chr S), of the N-terminal fragment of CGA (bN22) at 35 nM or of fragment 1-40 of CGA (bLE-40) at a concentration substantially greater than 100 nM, on the contraction of saphenous vein fragments in response to an 80 mM K concentration.
  • EXAMPLE 1 Preparation of peptide of formula: E-V-E-K-S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P Stage A; Assembly of the peptide chain.
  • a support of the "Boc-Pro-CM-rupport" type is used in which Boc is a tert-butyloxycarbonyl group, Pro represents a proline group and CM-support designates the cross-linked polystyrene support.
  • the support containing 0.6 mmol Trp / g was prepared according to the technique described by Plaue S. and Heissler D. [(1987) Tetrahedron Letter 18, 1401].
  • Stage B Release of the protected peptide chain - resin complex.
  • 1.5 g of protected peptide chain-resin complex are reacted for 60 minutes with 15 ml of hydrofluoric acid at 0 ° C. in the presence of anisole (1 ml) and dimethyl sulfide (0.5 ml).
  • the resin is washed with ether; the crude peptide is extracted with a 20% aqueous solution of acetic acid. After lyophilization, 660 mg of non-cyclized crude product is obtained which is used directly in the following stage.
  • STAGE C Closure and purification.
  • This peptide can be labeled with iodine using the technique of Bolton & Hunter [(1973), Biochem J. 133, 529-539]. A specific activity of approximately 200 Ci / mmol is obtained.
  • the peptide thus labeled is purified on a SEP-PAK C ⁇ g column using a gradient of acetonitrile acid and water.
  • composition of the excipient lactose, starch, talc, magnesium stearate.
  • Chromaffin cells in culture were preincubated for 10 minutes, with the products studied. The cells were then stimulated with 0.5 mM carbamylcholine (acetylcholine analog) or directly depolarized with 59 mM potassium.
  • the compound of Example 2 produces a dose-dependent inhibition of the release of catecholamines in the concentration zone between 10 -9 and 10 -6 M.
  • the ID 50 value was m _Q practically determined at 5 ⁇ 10 M.
  • the compound of Example 1 produces a curve similar to Example 2 with an ID50 also similar.
  • the cells are stimulated by supplying successive pulses of 1,1-dimethyl-4-phenyl-piperazinium-iodide, in the presence of 1 micromole of compound of example 2.
  • the repeated pulses induce a progressive desensitization of the cellular responses.
  • there is a 40% inhibition of the first secretion peak obtained by stimulating the cells with piperaziniu then a complete inhibition of the successive secretory responses is observed.
  • the elimination of the peptide allows a return to normal, but which takes a very long time, since after 10 min, only 31% of the control values are found.
  • Chromaffin cells were isolated and cultured as previously described (Galindo et al.
  • a connection with a high resistance is obtained in the measuring cell (the resistance of the pipette head is 5 M ⁇ ).
  • the ionic composition of the pipette is as follows: CsCl 70 mmol / 1; cesium aspartate 70 mmol / 1; CaCl 1 mmol / 1; EGTA 11 mmol / 1; MgCl 2 1 mmol / 1; Mg-ATP 2.5 mmol / 1; Hepes 10 mmol / 1; nystatin 200 ⁇ g / ml; pH 7.2.
  • the method using nystatin was applied in order to record all of the C & cell currents in the chromaffin cells. This technique has the advantage of not causing the escape of proteins and small metabolites from the cytoplasm. On the other hand, the membrane currents remain stable for more than an hour.
  • FIG. 1A clearly shows a current of Ca ⁇ towards the interior.
  • FIG. 1B The results of FIG. 1B were obtained on the same cell as those of FIG. 1A.
  • the results of FIG. 1B are recorded 9 minutes after introduction of the peptide.
  • FIG. 1C shows that during the diffusion period, there is no significant decrease in the amplitude due to the current of Ca 2+ in the absence of peptide.
  • the open circles represent the current obtained 16 minutes after the cell-pipette connection.
  • the triangles represent the current obtained 25 minutes after the formation of this bond.
  • the addition of the peptide at a concentration of 1 ⁇ M to the bath induces a significant reduction in the peak of the current of all the membrane potentials studied as shown in FIG. ID.
  • the open circles correspond to the current obtained in the absence of peptide 16 minutes after formation of the bond, the peptide being added at the 17th minute.
  • the closed circles represent the current obtained 25 minutes after the formation of the bond, that is to say 8 minutes after the addition of the peptide to the bath.
  • the action time of the peptide inhibitory effect was studied by repeating the measurements every 3 minutes both for the control and for the cells treated with the peptide.
  • the ratio between the maximum reentry current obtained at any time and the maximum reentry current obtained 3 minutes after binding of the cell to the pipette was measured.
  • Chromaffin cells (250,000 cells per well) were washed with Locke's solution and incubated with iodinated microprotein in the presence of various concentrations of unlabeled microproteins or various concentrations of peptides derived from CGA. The experiments are carried out in 0.5 ml of Locke solution containing 0.25% bovine serum albumin. The equilibrium state is reached after a two hour incubation at 15 ° C. The stamp of 17
  • the binding curves indicate the presence of a single site having a Kd of approximately 6.51 nM, and a B ma ⁇ 2.7 pmol / mg protein.
  • the kD value is comparable to the concentration inhibiting by 50% the release of catecholamine as indicated in B) or as calculated from FIG. 3B.
  • the iodized peptide of Example 2 therefore shows a high degree of specificity of binding with respect to chromaffin cells but not with respect to cells of the endothelial or fibroplastic type present in the culture, since the treatment of cultures with 6-hydroxy dopamine or differential inoculations induce a complete disappearance of the specific bond.
  • This bond is independent of calcium but decreases by 70% when the external magnesium concentration is reduced from 2.5 mM to 0.
  • the binding is very dependent on pH reaching a maximum for a pH of 7.5 and showing a significant reduction with changes as small as 0.5 pH unit.
  • the binding specificity of the microprotein of Example 2 was tested on intact chromaffin cells by displacing the microprotein iodized by peptides derived from CGA.
  • the binding of the iodized peptide is not affected by the increase in the concentrations of pancrastatin, of CAP. 14, which has a highly conserved peptide sequence corresponding to amino acids 316-329 of the sequence of bovine CGA, and of synthetic rat chromostatin.
  • the iodine compound of Example 2 or bovine chromostatin is displaced by bovine chromostatin as well as by bovine chromostatin to which the four amino acids EVEK have been added at its N-terminal end.
  • pancrastatin, CAP 14, nor rat chromostatin are capable of modulating the release of catecholamine from bovine chromaffin cells, while both bovine chromostatin and elongated bovine chromostatin strongly inhibits secretion as shown in Figure 3B.
  • human chromostatin which is 50% identical to bovine chromostatin and which has a highly conserved region of 6 amino acids in its internal sequence displaces bovine chromostatin iodized with an IC 50 of 50 nM (FIG. 3 A).
  • Binding of bovine iodine chromostatin is affected neither by non-CGA peptides such as substance P or enkephaline nor by 1,1 - dimethyl-4-phenyl-piperazinium and apomorphine, which excludes the possibility of interference of chromostatin with nicotinic or dopaminergic receptors present on chromaffin cells.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminepropyl) carbodimimide
  • the coupling reaction is stopped by rapid washing of the cells with a 50 mM Tris solution (pH 7.6) and 160 mM NaCl.
  • the cells are then homogenized and centrifuged at 55 rpm for 30 minutes so as to separate the membranes from the soluble fractions.
  • the two samples are dissolved in sodium dodecylsulfate (SDS) and analyzed on a 12% polyacrylamide electrophoresis gel. The radioactivity is then quantified on the dried gel.
  • FIGS. 4A, 4B, 4C correspond respectively to the monodimensional gel electrophoresis, to autoradiography, and to the calculation of radioactivity associated with the labeled proteins.
  • the saphenous vein fragments are coated with endothelium.

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Abstract

Nouveaux peptides de la famille des chromostatines de formule générale (I): R1-G-X4-R-P-Q-A-X5-P-R2 dans laquelle R1 peut représenter notamment, un résidu de formule: S-D-E-D-S-D- ou -S-G-E-A-T-D- ou D-A-F-E-G-T-T-E-; X4 représente un résidu D, A ou P; X5 représente un résidu S, L ou F; R2 peut représenter un résidu de formule: -G-L-G-P-G-P, ou -E-P-K-Q-E-S. Application à titre de médicaments pour le traitement des affections ou troubles dus à une hypersécrétion des catécholamines, des corticoïdes ou des glucocorticoïdes ainsi que des affections d'ordre cardiovasculaire.

Description

PEPTIDES DE LA FAMILLE DES CHROMOSTATINES
La présente demande concerne de nouveaux peptides de la famille des chromostatines , la prépa- ration et l'application à titre de médicaments de ces nouveaux peptides .
La présente invention a ainsi pour objet de nouveaux peptides répondant à la formule générale (I):
Figure imgf000003_0001
dans laquelle :
* R représente un résidu de formule :
E- 6-E-KS-X1-E-X2-X3-O- ou un résidu de formule
-S-X^E-Xj^-D- dans lesquelles :
X^ représente un résidu D ou G X2 représente un résidu D ou A X représente un résidu S ou T Xg représente un résidu V ou A ou Rj représente un résidu de formule :
D-A-F-E-G-T-T-E-
* X4 représente un résidu D, A ou P
* Xc représente un résidu S, L ou F
* R2 représente un résidu de formule : -G-L-G-P-G-P ou de formule
-E-P-X7-Q-E-S dans laquelle X7 est un résidu M ou K.
De manière préférentielle , les peptides tels que définis précédemment sont tels que :
R^ représente un résidu de formule :
E-V-E-K-S-D-E-D-S-D- ou S-D-E-D-S-D-
R2 représente un résidu -G-L-G-P-G-P
De tels peptides peuvent répondre à la formule ( II ) correspondant à la chromostatine bovine:
S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P Un autre mode de réalisation préférentiel de
1'invention est celui dans lequel les peptides répondent à la formule (I) dans laquelle :
R^ représente un résidu de formule
S-G-E-A-T-D- et R2 représente un résidu de formule :
-E-P-M-Q-E-S auquel cas le peptide peut répondre à la formule (III), correspondant à la chromostatine humaine :
S-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P- -Q-E-S- Un autre cas de peptides répondant à la formule (I) est celui dans lequel :
Ri représente le résidu de formule :
D-A-F-E-G-T-T-E- auquel cas le peptide peut répondre à la formule ( IV) correspondant à la chromostatine de rat :
D-A-F-E-G-T-T-E-G-P-R-P-Q-A-F-P-E-P-K-Q-E-S
La présente invention est en outre relative aux fragments des peptides décrits ci-dessus .
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des peptides ou fragments tels que définis ci-dessus , caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les amino-acides dûment protégés à l'aide d'un agent de couplage , on déprotège les amino- acides, et on libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée pour obtenir le peptide ainsi recherché. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre , le procédé ci-dessus décrit est caractérisé en ce que :
- le support de type polystyrène réticulé est une résine de type "Boc-AA-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl , AA est le premier amino-acide et CM désigne le support de polystyrène réticulé , ou
- l'agent de couplage est le (benzotriazol- 1-yloxy) tris (diméthylamino) phosphonium hexafluo- rophosphate ou BOP, ou
- la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides sont effectuées au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préférence vers O'C. Les peptides , ou fragments , selon la présente invention présentent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; on note en particulier des propriétés anticatécholamines et une activité dans le domaine cardiovasculaire en particulier une action décontracturante des parois veineuses a aussi été observée .
Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale .
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des nouveaux peptides ou de fragments répondant à la formule (I) ci-dessus à titre de médicaments . On retiendra particulièrement à titre de médicaments les peptides répondant aux formules (II), (III ) ou ( IV ) .
Ces médicaments trouvent , par exemple , leur emploi dans le traitement des pathologies se situant dans le cadre d'une hypersécrétion des catecholamines et des corticoïdes , notamment dans les situations de stress, dans l'ulcère gastrique, dans l'hypertension artérielle et lors de poussées hypertensives chez les malades porteurs de tumeurs de type phéochromocytome sécrétant .
Ces médicaments peuvent aussi être utilisés pour lutter contre les effets secondaires des glucocorticoides ; ils permettent de lutter également contre les troubles dus à une hypersécrétion de glucocorticoides et notamment contre le vieillissement en général et plus particulièrement contre l'hypertension , le glaucome , l'athérosclérose , l'ostéoporose, le diabète , l'obésité ainsi que la dépression de l'immunité et l'insomnie . Ces médicaments peuvent aussi être utilisés dans le domaine cardiovasculaire et en particulier en vue d'une action décontracturante des parois veineuses.
La dose usuelle , variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause peut être par exemple de 0,1 à 10 mg par jour par voie intraveineuse chez l'homme .
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment au moins un peptide ou fragment précité à titre de principe actif .
A titre de principe actif , les peptides répondant à la formule générale (I) , peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale .
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple , solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine , comme par exemple , les comprimés simples ou dragéifiés , les gélules , les capsules , les granulés , les suppositoires , les préparations injectables , les aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles . Le ou les principes actifs peuvent être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques , tels que le talc, la gomme arabique , le lactose , l'amidon, le stéarate de magnésium , le beurre de cacao , les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale , les dérivés paraffiniques , les glycols , les divers agents mouillants , dispersants ou émulsifiants , les conservateurs . II va être donné maintenant à titre non limitatif , des exemples de mise en oeuvre de l'invention dans lesquels :
- Les figures 1A et 1B représentent des familles d'enregistrement des courants obtenus par la technique de "patch-clamp " en absence (1A) et en présence (1B) de peptide . Les nombres indiqués sur les courbes indiquent les potentiels de membrane appliqués.
- les figures 1C et 1D sont des courbes illustrant les relations entre les potentiels de membrane ( en abscisse ) et l'intensité des courants (en ordonnée ) . La figure 1C montre en absence de peptide l'évolution des relations intensité /potentiel à 9 minutes d'intervalle dans une cellule témoin . La figure 1D montre 1'évolution des relations intensité/potentiel avant l'addition de peptide et 9 minutes après l'addition . - la figure 1E illustre l'évolution du rapport entre le courant rentrant mesuré à un temps donné et le courant rentrant mesuré 10 minutes après la liaison cellule-pipette .(Ipic/Ipic ( 3 min.) ) .
La figure 2A est une courbe montrant l'évolution de la quantité de chromostatine synthétique de bovin liée aux cellules chromaffines en fonction de concentration en chromostatine .
La figure 2B montre la relation entre le rapport chromostatine liée/libre ( en ordonnée ) et la concentration de chromostatine liée .
La figure 3A illustre l'effet sur la liaison de la chromostatine synthétique de bovin iodée (peptide de l'exemple 2 ) par de la chromostatine synthétique humaine (hChS ) ou ses fragments de 20 ou 24 acides aminés ( Ch S 20 ou 24 aa) , par de la chromogranine A ( CGA ) , de la chromostatine synthétique de rat ( Ch S rat ) , par de la pancréastatine , ou encore par le CAP 14 . Le pourcentage de liaison de la chromostatine de bovin iodée liée est exprimée en ordonnée , la concentration en peptide en abscisse .
La figure 3B illustre l'effet de la chromostatine bovine , en présence des peptides cités dans la figure 3A , sur la libération de catécholamine par les cellules chromaffines . Les résultats sont exprimés par rapport à la libération en absence de chromostatine . La figure 4A est une photographie d'un gel d'électrophorèse mono-dimensionnel . Les puits 1 à 4 et 5 à 7 correspondent respectivement aux fractions membranaire et soluble . Les concentrations en chromostatine bovine ( ChS ) sont indiquées en μM.
La figure 4B est un autoradiogramme du gel de la figure 4A. Sur ces deux figures le poids moléculaire (Mr ) est indiqué en kD.
La figure 4C est un histographe indiquant le pourcentage de radioactivité par rapport au témoin , des puits correspondants .
La figure 5 est un histogramme illustrant l'effet de diverses concentrations ( 2;20 et 200 nM ) de chromostatine humaine ( h Chr S) , du fragment N- terminal du CGA ( bN22) à 35 nM ou du fragment 1-40 du CGA ( bLE-40 ) à une concentration sensiblement supérieure à 100 nM, sur la contraction de fragments de veine saphène en réponse à une concentration 80 mM en K . EXEMPLE 1 : Préparation de peptide de formule : E-V-E-K-S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P Stade A ; Assemblage de la chaîne peptidique .
On utilise un support de type "Boc-Pro-CM- rupport" dans lequel Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl , Pro représente un groupement proline et CM-support désigne le support de polystyrène réticulé .
Le support renfermant 0,6 mmol Trp/g a été préparé selon la technique décrite par Plaue S. et Heissler D. [ ( 1987 ) Tetrahedron Letter 18, 1401 ] .
Tous les aminoacides sont N-protégés par le groupement tertiobutylcarbonyl , les groupements protecteurs des chaînes latérales ont été les suivants:
- ester de cyclohexyl pour l'acide aspartique ,
- benzyl pour la serine , - o-chlorobenzyloxycarbonyl pour la lysine ,
- tosyl pour 1'arginine .
Les réactions de couplage ont été effectuées en utilisant le BOP ou (benzotriazol-1-yloxy tris (diméthylamino ) phosphonium hexafluorophosphate . Un cycle de couplage peut être résumé comme suit : Déprotection ;
1 - Traitement avec une solution d'acide tri- fluoroacétique ( 50 % ) dans le dichlorométhane contenant 3 % d'éthanedithiol pendant 1 minute .
2 - Vidange puis traitement avec une solution d'acide trifluoroacétique à 50% dans le dichlorométhane contenant 3 % d'éthanedithiol pendant 30 minutes . 3 - Vidange puis lavage avec de 1'isopropanol contenant 5 % d'éthanedithiol.
4 - Lavage au dichlorométhane , 2 fois . Couplage :
1 - Addition de BOP et de Boc-acide aminé . 2 - Addition de diisopropyléthylamine ( 6 équiva¬ lents ) puis de solvant (dichlorométhane ou diméthylformamide ) sous agitation .
3 - Après réaction négative à la ninhydrine lavage 2 fois au dichlorométhane . Les tests de contrôle utilisant la ninhydrine ont été effectués suivant le procédé décrit par Kaiser, E., Colescott, R.L. , Bossinger, CD. et Cook , P.I. (1970 Anal. Biochem. 24, 595-598 ) . Avant le traitement par 1'acide fluo¬ rhydrique le dernier groupement Boc est éliminé par l'acide trifluoroacétique .
Au départ de 2 g de résine " Boc-Lys-CM- résine" on a ainsi obtenu en opérant manuellement 5,25 g de complexe chaîne peptidique protégée, résine que l'on utilise directement au stade suivant . Stade B : Libération du complexe chaîne peptidique protégée - résine . On fait réagir 1,5 g de complexe chaîne peptidique protégée-résine pendant 60 minutes avec 15 ml d'acide fluorhydrique à 0°C en présence d'anisole (1 ml ) et de diméthylsulfide (0,5 ml) . La résine est lavée à 1'éther ; le peptide brut est extrait par une solution aqueuse d'acide acétique à 20 %. Après lyophilisation , on obtient 660 mg de produit brut non cyclisé que l'on utilise directement au stade suivant. STADE C : Cvclisation et purification .
On dissout 500 mg du peptide brut obtenu ci- dessus , dans 250 ml d'eau , on agite vigoureusement , ajoute de la diisopropyléthylamine jusqu'à obtention d'un pH 8 . Une goutte de mélange est recueillie toutes les heures et ajoutée à une goutte d'une solution contenant de l'acide dithiobis ( 2- nitrobenzoïque ) dans un tampon molaire de K2HP04 ( pH 8 ) pour suivre la réaction d'oxydation
Pendant toute la réaction on maintient le pH à 8 par addition de diisopropyléthylamine . La réaction est suivie par chromatographie liquide haute performance (HPLC).
Après 28 heures , on constate l'absence de coloration jaune dans le test à l'acide dithiobis ( 2- nitrobenzoïque ) . Le produit obtenu est purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne Whatman M20 ODS3 et élue par un mélange eau- acétonitrile renfermant 0,1 % d'acide trifluoroacé- tique.
On lyophilise la fraction obtenue et on recueille finalement 30 mg de produit attendu . EXEMPLES 2 et 3.
En opérant de la même manière qu'à 1'exemple 1 mais avec d'autres amino-acides , on a préparé les deux autres peptides qui figurent ci-après : EXEMPLE 2: Peptide de formule :
S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P
Ce peptide peut être marqué à 1'iode en utilisant la technique de Bolton & Hunter [ (1973) , Biochem J. 133, 529-539 ] . On obtient une activité spécifique d'environ 200 Ci/mmole . Le peptide ainsi marqué est purifié sur une colonne SEP-PAK C^g à l'aide d'un gradient d'acide acétonitrile et d'eau . EXEMPLE 3; Peptide de formule ;
E-A-E-K-S-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P-M-Q-U-E-S EXEMPLE 4:
On a préparé un soluté injectable répondant à la formulation suivante : - Produit de l'exemple 1 1 mg
- excipient aqueux stérile 2 ml. EXEMPLE 5-
On a préparé des comprimés répondant à la formule suivante : - Produit de l'exemple 1 2 mg
- excipient q.s.p. un comprimé terminé à 150 mg 11
(composition de l'excipient : lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium ) . ETUDE DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE DES PRODUITS .
A) Des cellules chromaffines en culture ont été préincubées 10 minutes, avec les produits étudiés . Les cellules ont alors été stimulées par la carbamylcholine ( analogue de l'acetylcholine ) 0,5 mM ou dépolarisées directement par du potassium 59 mM.
Les résultats obtenus avec les produits des exemples figurent dans le tableau I ci-après .
Le composé de l'exemple 2 produit une inhibition dose-dépendante de la libération des catecholamines dans la zone de concentration comprise entre 10 -9 et 10 -6 M. La valeur ID 50 été m _Q pratiquement déterminée a 5 x 10 M . Le compose de l'exemple 1 produit une courbe similaire à l'exemple 2 avec un ID50 également voisin .
B) Par ailleurs , ces expériences ont été complétées par la mesure des entrées de calcium extracellulaire dans l'espace intracellulaire , en mesurant après 30 secondes de stimulation avec 0,5 mM de carbamyl-choline ou 59 mM de potassium , l'accumulation de 45ca++"
Produits étudiés Accumulation de 4^Ca++ (pmol/30 sec/106 cellules ) Carbamyl-choline K+ 59 mM
Témoin 3,34 ( 0%) 4,20 ( 0%) Exemple 2 10 -6 0,19 (94,4%) 0,85(80 %)
Entre parenthèses sont portés les pourcentages d'inhibition . Ces résultats montrent que le composé de 1'exemple 2 bloque 1'entrée de calcium provoqué soit par la carbamylcholine soit par une concentration dépolarisante de potassium, l'inhibition atteignant 86 ou 77 % respectivement. Ceci suggère que l'inhibition de la libération des catecholamines est la conséquence d'une réduction des flux de calcium au travers des canaux calcium sensibles au voltage de ces cellules excitables . Des expériences complémentaires ont montré une absence d'effets sur les canaux sodium sensibles au voltage de la même cellule .
C ) Dans ces expériences , la libération des catecholamines est suivie en temps réel en mesurant les catecholamines par la technique électrochimique en continu à partir d'une suspension cellulaire incubée dans une chambre de perfusion.
Les cellules sont stimulées en fournissant des impusions successives de l,l-diméthyl-4-phényl- pipérazinium-iodure , en présence de 1 micromole de composé de l'exemple 2. Les impulsions répétées induisent une désensibilisation progressive des réponses cellulaires. En présence de composé de l'exemple 2, on assiste à une inhibition de 40% du premier pic de sécrétion obtenu en stimulant les cellules avec le pipéraziniu , puis on observe une inhibition complète des réponses sécrétoires successives . L'élimination du peptide permet un retour à la normale , mais qui prend un temps très long , puisque après 10 mn, on ne retrouve que 31% des valeurs des témoins . Ces résultats indiquent que ces peptides exercent une inhibition prolongée dans le temps de l'activité sécrétrice des cellules chromaffines et qu'ils accentuent aussi de façon spectaculaire le processus de désensibilisation de la réponse sécrétoire.
D) Effet du peptide de l'exemple 2 sur les courants de calcium dépendant du potentiel de membrane.
Des cellules chromaffines ont été isolées et cultivées comme décrit précédemment ( Galindo et al.
(1991) , Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88,1426-1430 ; Bader et al , (1986 ) J. Biol. Chem. 261, 5777-5783) jusqu'à une densité de 250.000 cellules par puits .
Les cellules sont ensuite transférées dans une solution ayant la composition suivante : Choline
Cl, 140 mmol/1 , KC15 mmol/1 ; CaCl2 2,5 mmol/1; MgCl2; 1 mmol/1 ; Hepes 10 πunol/1 ; glucose 11 mmol/1 pH 7,4.
L'expérience est menée comme décrit par Horn et Marty ( 1988, J. Gen. Physiol, 92;145-159 ).
Une liaison ayant une résistance importante (supérieure à 20 G Ω ) est obtenue dans la cellule de mesure ( la résistance de la tête de la pipette est de 5 M Ω ).
La composition ionique de la pipette est quant à elle la suivante : CsCl 70 mmol/1 ; aspartate de césium 70 mmol/1 ; CaCl 1 mmol/1 ; EGTA 11 mmol/1; MgCl2 1 mmol/1 ; Mg-ATP 2,5 mmol/1 ; Hepes 10 mmol/1; nystatine 200 μg/ml ; pH 7,2 .
Les fluctuations de capacité ont été supprimées de manière connue et le potentiel de la pipette a été fixé à - 80 mV.
Après 2 ou 3 minutes , une petite fluctuation de capacité indiquant la continuité électrique entre l'intérieur de la cellule et la solution de la pipette est observée . La taille de la fluctuation se stabilise environ 5 minutes après formation de la liaison entre la cellule de mesure et la pipette . Des familles d'enregistrement ont été obtenues 10 minutes après la formation de la liaison et ont été répétées toutes les trois minutes durant 15 minutes. Les fluctuations de courant ont été éliminées toutes les cinq secondes par des phases de dépolarisation ( 10 mV , 60 msec ) .
La méthode utilisant la nystatine a été appliquée afin d'enregistrer la totalité des courants cellulaires de C& dans les cellules chromaffines . Cette technique a pour avantage de ne pas provoquer la fuite des protéines et des petits métabolites du cytoplasme . D'autre part , les courants membranaires restent stables durant plus d'une heure .
La dépolarisation des cellules chromaffines à partir d'un potentiel de -80 mV dans des étapes de dépolarisation de 10 mV induit l'activation des canaux de Ca2+ dépendants de la tension . On observe sur la figure 1A de manière claire un courant de Ca~ vers 1'intérieur .
L'amplitude et la cinétique de ce courant de Ca2+ ne change pas de manière substantielle en fonction du temps jusqu'à 30 minutes après établissement d'une continuité électrique entre l'intérieur de la cellule et la solution de la pipette. Après introduction du peptide , à une concentration de 1 μM , on observe une réduction de l'amplitude du courant vers l'intérieur qui diminue jusqu'à une valeur d'environ 50% de celle obtenue 15
avant 1'introduction du peptide , comme le montre la figure 1B.
Les résultats de la figure 1B ont été obtenus sur la même cellule que ceux de la figure 1A. Les résultats de la figure 1B sont enregistrés 9 minutes après introduction du peptide .
La dépendance vis-à-vis du temps de l'action inhibitrice du peptide est due au temps nécessaire pour la diffusion de ce peptide . Le peptide est introduit dans la cellule sous la forme d'une solution aqueuse en utilisant la micro-pipette . L'introduction de volume similaire de fluide ne comprenant pas le peptide n'affecte pas les courants cellulaires de CaΛ La figure 1C montre que durant la période de diffusion ,il n'y a pas de diminution significative de l'amplitude due au courant de Ca2+ en absence de peptide . Sur cette figure, les cercles ouverts représentent le courant obtenu 16 minutes après la liaison cellule-pipette . Les triangles représentent le courant obtenu 25 minutes après la formation de cette liaison .
Cependant , l'addition du peptide à une concentration de 1 μM au bain induit une importante diminution du pic du courant de tous les potentiels de membrane étudiés comme le montre la figure ID. Sur cette figure , les cercles ouverts correspondent au courant obtenu en absence de peptide 16 minutes après formation de la liaison, le peptide étant ajouté à la 17ième minute . Les cercles fermés représentent le courant obtenu 25 minutes après la formation de la liaison c'est-à-dire 8 minutes après l'addition du peptide au bain. 16
Il en résulte que la conductance diminue de 5,8 nS en l'absence de peptide et de 3,2 nS en sa présence.
Le temps d'action de l'effet inhibiteur du peptide a été étudié en répétant les mesures toutes les 3 minutes aussi bien pour le témoin que pour les cellules traitées par le peptide . Le rapport entre le courant maximum rentrant obtenu à tout instant et le courant maximum rentrant obtenu 3 minutes après la liaison de la cellule à la pipette a été mesuré .
Ce rapport est significatif de la diminution du courant de Ca2+ en fonction du temps . Comme le montre la figure 1E , le rapport n'est pas modifié de manière substantielle dans le cas des cellules non traitées et reste proche de 1 (cercles vides)
Cependant , l'addition du peptide (cercles pleins) entraîne une diminution marquée de ce rapport, indiquant que le peptide bloque les courants de CaA dépendant de la tension de type L dans les cellules chromaffines . La flèche indique le moment d'addition du peptide .
E) Liaison du peptide sur la membrane plasmatique des cellules chromaffines .
Des cellules chromaffines ( 250.000 cellules par puits ) ont été lavées à l'aide de la solution de Locke et incubées avec la microprotéine iodée en présence de diverses concentrations de microprotéines non marquées ou diverses concentrations de peptides dérivés du CGA. Les expériences sont effectuées dans 0,5 ml de solution de Locke contenant 0,25 % de sérum albumine bovine . L'état d'équilibre est atteint après une incubation de deux heures à 15°C . Le tampon de 17
liaison est éliminé en fin de réaction , les cellules étant lavées trois fois avec de la solution de Locke. La radioactivité restante associée aux cellules est mesurée à 1'aide d'un compteur Comme indiqué sur la figure 2A , les courbes de liaison indiquent la présence d'un site simple ayant un Kd d'environ 6,51 nM , et un Bmaχ de 2,7 pmol/mg de protéine . La valeur kD est comparable à la concentration inhibant de 50 % la libération de catécholamine comme indiqué en B) ou comme calculé à partir de la figure 3B .
Le peptide iodé de l'exemple 2 montre donc un haut degré de spécifité de liaison vis-à-vis des cellules chromaffines mais pas vis-à-vis des cellules du type endothélial ou fibroplastique présentes dans la culture , puisque le traitement des cultures avec de la 6-hydroxy dopamine ou des ensemencements différentiels induisent une disparition complète de la liaison spécifique . Cette liaison est indépendante du calcium mais diminue de 70% quand la concentration en magnésium externe est réduite de 2,5 mM à 0 .
De plus , la liaison est très dépendante du pH atteignant un maximum pour un pH de 7,5 et montrant une réduction importante avec des changements aussi faibles que 0,5 unité de pH .
Ces résultats sont résumés sur les figures 2A et 2B .
F ) Spécificité de la liaison du peptide de 1'exemple 2.
La spécificité de liaison de la microprotéine de l'exemple 2 a été testée sur des cellules chromaffines intactes en déplaçant la microprotéine iodé par des peptides dérivant de la CGA.
Comme montré sur la figure 3A , la liaison du peptide iodé n'est pas affectée par l'augmentation des concentrations de pancréastatine , de CAP. 14, qui a une séquence peptidique hautement conservée corres¬ pondant aux acides aminés 316-329 de la séquence du CGA bovin , et de la chromostatine synthétique de rat. Par contre , le composé iodé de 1'exemple 2, ou chromostatine bovine est déplacé par la chromostatine bovine ainsi que par de la chromostatine bovine à laquelle on a ajouté les quatre acides aminés EVEK à son extrémité N-terminale .
Ces résultats sont à mettre en relation avec le fait que ni la pancréastatine , ni le CAP 14 , ni la chromostatine de rat sont capables de moduler la libération de catécholamine à partir de cellules chromaffines de bovins , tandis que , aussi bien la chromostatine bovine que la chromostatine bovine allongée inhibent de manière forte la sécrétion comme le montre la figure 3B.
Curieusement , la chromostatine humaine qui est identique à 50% à la chromostatine bovine et qui possède une région hautement conservée de 6 acides aminés dans sa séquence interne déplace la chromostatine bovine iodée avec un IC 50 de 50 nM (figure 3 A). De plus , comme le montre la figure 3 , la CGA native qui a une activité biologique d'environ 100 fois inférieure à celle de la chromostatine en ce qui concerne la libération de catécholamine ( ID 50= 600 nM ) , déplace la chromostatine iodée bovine avec une efficacité 100 fois moindre ( IC 50=480 nM ) que la chromostatine bovine . 19
La liaison de la chromostatine iodée bovine n'est affectée ni par des peptides non liés aux CGA tels que la substance P ou l' enkephaline ni par le 1,1 - diméthyl-4-phényl-pipérazinium et l'apomorphine, ce qui exclut la possibilité d'interférence de la chromostatine avec les récepteurs nicotinique ou dopaminergique présents sur les cellules chromaffines. G) Expériences de couplage entre le peptide et son récepteur . Des cellules chromaffines cultivées à une densité de 500.000 cellules par puits , puis privées de sérum de foetus de veau durant 24 heures , sont lavées et incubées durant deux heures à 15*C avec de la chromostatine bovine iodée dans de la solution de Locke contenant une concentration de chromostatine non marquée en l'absence d'acide ascorbique et de sérum d'albumine bovine . Les cellules sont ensuite lavées de manière à enlever la chromostatine non liée et sont incubées durant 20 minutes à température ambiante avec 20 mM de l-éthyl-3-(3-diméthylaminepropyl) carbodi- imide (EDC) .
La réaction de couplage est arrêtée par lavage rapide des cellules avec une solution 50 mM Tris (pH 7,6) et 160 mM NaCl . Les cellules sont ensuite homogénéisées et centrifugées à 55 rpm durant 30 minutes de façon à séparer les membranes des fractions solubles . Les deux échantillons sont solubilisés dans du sodium dodécylsulfate ( SDS ) et analysés sur un gel d'électrophorèse en polyacrylamide à 12 %. La radioactivité est ensuite quantifiée sur le gel séché. Ces expériences de couplage ont été effectuées de manière à déterminer la masse moléculaire du site de liaison de la chromostatine . L' EDC est utilisé pour lier la chromostatine iodée à son récepteur .
Les figures 4A, 4B , 4C correspondent respectivement à 1'électrophorèse en gel monodimen- sionnel , à 1'autoradiographie , et au calcul de radioactivité associé aux protéines marquées .
On observe que les groupements aminés de la chromostatine iodée sont bloqués . Le couplage se fait donc par l'intermédiaire des six groupements carboxyliques présents le long du peptide ( 4 groupements aspartique , 1 groupement glutamique et 1 groupement proline ) .
On remarque sur la figure 4B , une bande unique correspondant à un composant d'un poids moléculaire d'environ 80 kD . Cette bande n'est pas détectable quand les cellules sont pré-incubées avec un excès de chromostatine avant 1'incubation avec la chromostatine iodée . De plus , la présence de chromostatine dans le milieu extra-cellulaire dans des concentrations déplaçant la liaison de haute affinité de la chromostatine iodée ( figure 3A) fait décroître de manière progressive le marquage de la bande de 80 kD ( Figures 4B , 4C ) . Le traitement pepsique des cellules dans des conditions qui ne détachent pas les cellules cultivées conduit à une disparition complète de la radioactivité correspondant à la bande 80 kD . Ceci confirme que le site de liaison pour la chromostatine iodée est une protéine membranaire .
H) Effet des produits selon l'invention sur les contractures indépendantes des ions Ca^ dans des fragments de veine saphène . 21
Les fragments de veine saphène sont enrobés d'endothélium .
Dans ces fragments , 45 à 55 % de la contraction en présence de concentrations importantes en ion potassium ( 80 mM ) persiste dans un milieu sans calcium en présence d'EDTA à 1 mM .
Quand ces fragments sont pré-incubés durant 15 minutes en présence de fragments de CGA dans un milieu sans calcium , mais contenant de l'EDTA , la réponse au potassium est très inhibée par rapport au témoin . Ce phénomène est observé aussi bien avec la chromostatine humaine qu'avec l'extrémité N-terminale du CGA ( extrémité 1 - 40 ) . Une incubation avec 1 μM de nifedipine inhibe totalement la contraction en réponse à des concentrations de potassium importantes, aussi bien des milieux sans calcium que dans milieux contenant du calcium . Ceci indique qu'il existe dans le réticulum sarcoplasmique et les membranes cellulaires des canaux sensibles à la tension. Ces résultats montrent qu'il existe un effet de la chromostatine humaine sur la veine saphène humaine , et que cet effet est une inhibition de la libération d'ions calcium intracellulaires .
Ces résultats sont résumés sur la figure 5 dans laquelle bN-22 représente l'extrémité N-terminale de la CGA contenant la chromostatine bovine , bLE-40 représente la séquence 1-40 de la CGA , et hChrS représente la séquence 124-143 de la chromostatine humaine .
Figure imgf000024_0001
TABLEAU I
Figure imgf000024_0002
Entre parenthèses sont portés les pourcentages d'inhibition
5
ON
I

Claims

REVENDICATIONS 1. Nouveaux peptides répondant à la formule générale (I) :
R^G-X^R-P-Q-A-Xg-P-Rj (I) dans laquelle :
* R représente un résidu de formule :
Figure imgf000025_0001
ou un résidu de formule
S-Xj-E^^-D- dans lesquelles :
X-_ représente un résidu D ou G X2 représente un résidu D ou A X3 représente un résidu S ou T Xg représente un résidu V ou A où R^ représente un résidu de formule : D-A-F-E-G-T-T-E-
* X4 représente un résidu D, A ou P
* Xg représente un résidu S, L ou F
* R2 représente un résidu de formule : -G-L-G-P-G-P ou de formule
-E-P-X7-Q-E-S dans laquelle X7 est un résidu M ou K.
2. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que :
R, représente un résidu de formule E-V-E-K-S-D-E-D-S-D- ou S-D-E-D-S-D-
R2 représente un résidu -G-L-G-P-G-P
3. Peptides selon l'une des revendications 1 ou 2 répondant à la formule :
S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P (II) . 24
4. Peptides selon la revendication 1 , caractérisés en ce que :
R^ représente un résidu de formule : E-A-E-K-S-G-E-A-T-D- et R représente un résidu de formule :
-E-P-M-Q-E-S.
5. Peptides selon la revendication 1 , répondant à la formule (I) dans laquelle:
Ri représente un résidu de formule S-G-E-A-T-D- et R2 représente un résidu de formule :
- E-P-M-Q-E-S.
6. Peptides selon la revendication 5 répondant à la formule : S-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P-M-Q-E-S- (III).
7. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que :
R^ représente le résidu de formule : D-A-F-E-G-T-T-E .
8.Peptides selon la revendication 7 répondant à la formule :
D-A-F-E-G-T-T-E-G-P-R-P-Q-A-F-P-E-P-K-Q-E-S (IV) .
9. Fragment de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 .
10. Procédé de préparation des peptides ou fragments tels que définis à l'une des revendications
1 à 9 , caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur une résine oxymethyl polystyrène réticulée les amino-acides dûment protégés en utilisant un agent de couplage , on libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée et on déprotège les amino-acides , pour obtenir le peptide ou fragment recherché .
11. Procédé selon la revendication 10 , caractérisé en ce que la résine oxymethyl polystyrène réticulée est une résine de type "Boc-AA-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, AA est le premier amino-acide et CM désigne la résine oxymethyl polystyrène réticulée.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11 , caractérisé en ce que l'agent de couplage est le BOP ou ( benzotriazol-1-yloxy) tris (diméthylamino)phosphonium hexafluorophosphate.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12 , caractérisé en ce que la libération de la résine de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température .
14 . Médicaments , caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les peptides ou fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
15. Compositions pharmaceutiques , caracté¬ risées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif , l'un au moins des peptides ou fragments selon l'une des revendications 1 à 9 .
16 . Utilisation des peptides ou fragments selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'affections liés à une hypersécrétion des catecholamines ou des corticoïdes .
17 . Utilisation des peptides ou fragments selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des affections ou des troubles dus à une hypersécrétion de glucocorticoïdes .
18. Utilisation des peptides ou fragments selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'affections d'ordre cardiovasculaire.
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