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WO2018143652A1 - 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 그 제조방법 - Google Patents

면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2018143652A1
WO2018143652A1 PCT/KR2018/001299 KR2018001299W WO2018143652A1 WO 2018143652 A1 WO2018143652 A1 WO 2018143652A1 KR 2018001299 W KR2018001299 W KR 2018001299W WO 2018143652 A1 WO2018143652 A1 WO 2018143652A1
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WO
WIPO (PCT)
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dendritic cells
agonist
differentiation
toll
cells
Prior art date
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PCT/KR2018/001299
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English (en)
French (fr)
Inventor
신성재
김우식
김홍민
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Quratis Inc
Original Assignee
Quratis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2018215740A priority patent/AU2018215740A1/en
Priority to BR112019015785-9A priority patent/BR112019015785A2/pt
Priority to JP2019541284A priority patent/JP2020505050A/ja
Priority to US16/482,094 priority patent/US20200190473A1/en
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing immune tolerant plasmacytoid dendritic cells, an immune tolerant plasmacytoid dendritic cell produced by the method and a cell therapeutic agent comprising the same.
  • the immune response and immune tolerance response must be balanced and balanced.
  • a hyperimmune response occurs, for example, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases of type 1 diabetes and sepsis and irritable allergic diseases can occur, which greatly affects the survival and quality of life of a person.
  • dendritic cells were thought to act as an important axis only in inducing an immune response, but recently it is known that a significant contribution to the immune tolerance response has been actively studied.
  • Dendritic cells play a pivotal role in regulating acquired immunity, which is selectively generated by acquired causality, as well as innate immunity. Specifically, dendritic cells perform a function of presenting information of externally invaded antigens to T cells. It is a kind of representative antigen presenting cells.
  • the dendritic cells are cells that serve as a bridge between innate and acquired immunity, and correspond to the only cells capable of priming naive T cells among immune cells. It exists in the shape of a twig in each tissue cell gap of several tissues, including lymphoid tissue.
  • the dendritic cells are finally differentiated cells, which are present in less than 1% of the total immune cells in the body, but are cells capable of inducing the activity of lymphocytes more strongly than monocytes or macrophages, and are immature in origin in bone marrow. In one form, it can travel through the bloodstream to all organs in the body. This allows dendritic cells to collect antigens around each tissue and move to lymphoid organs to deliver antigens to T lymphocytes, which can play an important role in T cell activation.
  • the dendritic cells have been used as immune vaccines or immunotherapeutic agents, and both the immune vaccines and immunotherapeutics are known to be safe without side effects, and their use is expanding for various diseases.
  • the dendritic cells are composed of various subpopulations according to origin, phenotype and function.
  • plasmacytoide dendritic cells pDC
  • pDC plasmacytoide dendritic cells
  • cDCs conventional dendritic cells
  • the pDC expresses B220
  • CD11c expresses low levels
  • cDCs express high levels of CD11c and CD11b, but does not express B220.
  • Both pDCs and cDCs are obtained by the process of maturation of immature dendritic cells so that they can act as effective stimulators of a harmonious immune response.
  • pDCs are known to play an important role in the defense of viral infections by activating immune cells by releasing large amounts of type I IFNs when infected by DNA viruses or single-stranded RNA viruses.
  • mDCs mature DCs
  • studies on the differentiation or role of pDCs in the body are insignificant compared to other dendritic cells.
  • the inventors of the present invention have treated toll-like receptor agonists (TLR agonists) in immature dendritic cells to initiate differentiation, or toll-like receptor agonists during the process of differentiation of immature dendritic cells.
  • TLR agonists toll-like receptor agonists
  • One object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells from immature dendritic cells.
  • Another object of the present invention is to provide a plasmacytoid dendritic cell prepared by the above method, and consistently showing immune tolerance.
  • the present invention comprises the step of treating toll-like receptor agonist to immature dendritic cells, a method for producing immune tolerant plasmacytoid dendritic cells (pDC) To provide.
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • the present invention also provides immune tolerant plasmacytoid dendritic cells induced by treating toll-like receptor agonists with immature dendritic cells.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent comprising the immune tolerant plasmacytoid dendritic cells.
  • the present invention can induce high yield of plasmacytoid dendritic cells having immune tolerance from immature dendritic cells through a simple and easy process, thereby enabling a stable supply of large amounts of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells.
  • the immune tolerant plasmacytoid dendritic cells obtained as described above induces the expression of anti-inflammatory cytokines, inhibits the expression of inflammatory cytokines, and promotes differentiation into regulatory T cells. It is possible to effectively prevent or treat an overactive immune disease or an allergic disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the design of a method for treating differentiation-inducing factor (Flt3L-containing media) and toll-like receptor agonists (TLR agonists) for immature dendritic cells according to an embodiment of the present invention.
  • Flt3L-containing media differentiation-inducing factor
  • TLR agonists toll-like receptor agonists
  • FIG. 2 is a diagram showing the separation of differentiation-induced plasma cytokine dendritic cells (TLRs-pDC) after the treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) in Example 1 according to an embodiment of the present invention.
  • TLRs-pDC differentiation-induced plasma cytokine dendritic cells
  • Pam3 toll-like receptor agonist
  • FIG. 3 (a) is a diagram showing surface expression molecules specifically induced in differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells after treatment of a toll-like receptor agonist (Pam3) according to an embodiment of the present invention in Example 1 .
  • Pam3 toll-like receptor agonist
  • Figure 3 (b) is a graph of the ratio of the number of immature dendritic cells in Example 1 compared to the number of differentiation-induced plasma cytokine dendritic cells after treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) according to an embodiment of the present invention The figure shown.
  • FIG. 4 shows cytokines in differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (TLRs-pDC) and common plasmacytoid dendritic cells (pDC) after treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) in Example 2 according to one embodiment of the present invention. It is a graph showing the result of comparing the expression pattern of the kine (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-12p70, IL-10).
  • Figure 5 shows the expression patterns of cytokine IL-10 in differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells and general plasmacytoid dendritic cells (non) after treatment of various toll-like receptor agonists according to an embodiment of the present invention in Example 3 Is a graph showing the results of comparing.
  • FIG. 6 shows cytokines (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL) according to the time point of treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) treated to immature dendritic cells according to an embodiment of the present invention in Example 4.
  • -12p70, IL-10) is a graph showing the results of comparing the expression pattern.
  • TLRs-pDC differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells
  • pDC general plasmacytoid dendritic cells
  • a graph showing the results of comparing the expression patterns of the complex molecules, CD80 and CD86.
  • FIG. 8 shows IDO in differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (TLRs-pDC) and common plasmacytoid dendritic cells (pDC) after treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) in Example 6.
  • TLRs-pDC differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells
  • pDC common plasmacytoid dendritic cells
  • Pam3 toll-like receptor agonist
  • TLRs-pDC plasmacytoid dendritic cells
  • Pam3 toll-like receptor agonist
  • FIG. 9 (b) shows the differentiation-induced differentiation of plasmacytoid dendritic cells (TLRs-pDC) or general plasmacytosis after treatment of toll-like receptor agonist (Pam3) according to one embodiment of the present invention. It is a graph showing the results of measuring the proliferation rate of regulatory T cells after the treatment of id dendritic cells (pDC).
  • FIG. 10 is a diagram showing the degree of binding of Rv1411c protein of dendritic cells (TLR2-/-) isolated from wild-type dendritic cells (WT) and TLR2 knockout mice in Example 8.
  • FIG. 10 is a diagram showing the degree of binding of Rv1411c protein of dendritic cells (TLR2-/-) isolated from wild-type dendritic cells (WT) and TLR2 knockout mice in Example 8.
  • FIG. 11 shows differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c (Rv1411c) after treatment of a toll-like receptor agonist (Rv1411c protein (0.1 ⁇ g / ml, 0.5 ⁇ g / ml)) according to an embodiment of the present invention in Example 9.
  • 0.1 ⁇ g / ml) -pDC, Rv1411c (0.5 ⁇ g / ml) -pDC) and cytokine (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-12p70, IL-) in common plasma cytokine dendritic cells (pDC) 10 is a graph showing the results of comparing the expression patterns of 10).
  • Example 10 shows in Example 10 differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) and general plasmacytoid dendritic cells (pDC) after treatment of toll-like receptor agonists (Rv1411c protein) according to one embodiment of the present invention.
  • a graph showing the results of comparing the expression patterns of the MHC complex molecule, CD80, CD86 and immune tolerance induction molecules (IDO, CCR9 and PD-L1).
  • Figure 13 shows the differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) or general plasmacytoid dendritic cells after treatment of T cells in Example 11 and toll-like receptor agonist (Rv1411c protein) according to one embodiment of the present invention.
  • pDC is a graph showing the results of comparing the degree of proliferation of T cells after the mixed culture.
  • Figure 14 shows the differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) or common plasmacytoid dendritic cells after treatment of T cells in Example 11 and toll-like receptor agonist (Rv1411c protein) according to one embodiment of the present invention.
  • pDC is a graph showing the results of confirming the secretion pattern of IFN-gamma after the mixed culture.
  • FIG. 15 (a) shows differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) or general plasma after treatment of toll-like receptor agonist (Rv1411c protein) according to an embodiment of the present invention with respect to T cells in Example 12.
  • cytokine dendritic cells (pDC) treatment is a diagram showing the results confirmed by the flow cytometry LSRFortessa x-20 proliferation to regulatory T cells.
  • FIG. 15B shows differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (RVc1411c-pDC) or general plasma after treatment of Toll-like receptor agonist (Rv1411c protein) according to an embodiment of the present invention with respect to T cells in Example 12. It is a graph showing the results of measuring the proliferation rate of regulatory T cells after treating cytokine dendritic cells (pDC).
  • FIG. 16 shows CD4 +, CD25- actuation of T cells differentiated by plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) induced after treatment of toll-like receptor agonist (Rv1411c protein) in Example 13;
  • FIG. After incubating with T cells the graph shows the results of measuring the change in T cell proliferative capacity with respect to the ratio of primed T cells to CD25-acting T cells.
  • TLR agonist plasmacytoid dendritic cells
  • RYv1411c protein and Pam3 plasmacytoid dendritic cells induced after untreated treatment in Example 14;
  • the graph which shows the result of comparing the number of (Non).
  • the present invention relates to a method for producing immune tolerant plasmacytoid dendritic cells, comprising treating toll-like receptor agonists with immature dendritic cells.
  • DC dendritic cell
  • MHC major histocompatibility complex
  • mDC mature dendritic cells
  • the term “immature dendritic cell” is found in the early stages of maturation of dendritic cells and does not express CD14, the surface phenotype of monocyte cells, and also does not include any of the co-stimulatory molecules CD40, CD54, CD80, CD86 and CD274. One is expressed at low levels compared to mature dendritic cells.
  • the term “quasi-dendritic dendritic cell” is a dendritic cell that loses some of the properties of immature dendritic cells and has some characteristics of the phenotype of mature dendritic cells, and partially or incompletely matured morphological and phenotypic characteristics. Meaning dendritic cells.
  • mature dendritic cell refers to a cell formed by maturation of immature dendritic cells.
  • Mature dendritic cells have high expression of MHC class II, CD40, CD54, CD80, CD86, and CD274 as well as DC-LAMP, release anti-inflammatory cytokine, and primitive allogeneic in mixed lymphocyte reactions. Characterized by having the ability to produce increased production of allogeneic T cells and syngeneic T cells and / or increased production of dendritic cell cytokines.
  • Mature dendritic cells typically express high levels of CCR7 and CXCR4.
  • the dendritic cells to which the toll-like receptor agonist is treated are preferably immature dendritic cells that are not differentiated.
  • the immature dendritic cells may include primitive dendritic cells, and may be isolated and obtained from mammalian bone marrow or the like.
  • the immune tolerant dendritic cells induced by differentiation by treating toll-like receptor agonists to immature dendritic cells as described above may be immune tolerant plasmacytoid dendritic cells (pDC).
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • plasmacytoid dendritic cells refers to a subset of dendritic cells, 1958, Lennert and Dr. Plasmacytoid T cells, first known by histological detection of plasma cell morphology in human lymph nodes, but not expressing B cell specific markers (Plasmacytoid T cells) After being known to express myeloid lineage antigen and MHC class II without expressing CD3, a common marker of T cells, it was named plasmacyytoid monocyte. After that, the ability to induce an allerogenic mixed lymphocyte reaction (MLR), which is inherent in dendritic cells, has been identified, which is again referred to as plasmacytoid dendritic cells, or simply referred to as 'pDC'. do.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • the term “immune tolerance” refers to a state that suppresses an immune response as well as a state that does not exhibit an immune response to a specific antigen. Therefore, in the present invention, the "immune tolerant plasmacytoid dendritic cells” promote the secretion of anti-inflammatory cytokines such as IL-10, inhibit the secretion of inflammatory cytokines such as IL-12p70 and TNF- ⁇ , Indoleamine-2,3 dioxygenase (IDO) molecules, recently known as immune tolerance inducing molecules, and CCR9, a surface molecule of immune tolerance induction cells, are expressed at high levels. Induce differentiation of regulatory T cells and inhibit the activity of effector T cells.
  • anti-inflammatory cytokines such as IL-10
  • IDO Indoleamine-2,3 dioxygenase
  • immune tolerant plasmacytoid dendritic cells can be stably and in large quantities prepared by treating the toll-like receptor agonist before or during differentiation of immature dendritic cells.
  • the term “before the differentiation” may include a time point before the differentiation-inducing factor is treated in immature dendritic cells.
  • the term 'differentiating' means a time point from the time of processing the factor for inducing differentiation to the immature dendritic cells until the differentiation is completed by the factor for inducing differentiation. Preferably, it may include a time within 7 days after the treatment from the time of processing the factor for inducing differentiation, but is not limited thereto.
  • the toll-like receptor agonist is not particularly limited as long as it is treated only before or during the differentiation of immature dendritic cells as described above.
  • the toll-like receptor agonist may be treated within 7 days (168 hours), 5 days (120 hours) or 3 days (72 hours) from the start of differentiation.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the immature dendritic cells may be depleted by using a factor for inducing differentiation within 36 hours, preferably 24 hours, after the agent is treated. Differentiation can be initiated, but is not limited thereto.
  • the toll-like receptor agonist may be treated one or more times, and the number of specific treatments is not particularly limited, but when the toll-like receptor agonist is treated during differentiation of immature dendritic cells, the immature dendritic cells are differentiated.
  • the toll like receptor agonist may be treated at least once within 7, 5 or 3 days from the start.
  • the immature dendritic cell is treated at least once with the toll-like receptor agonist, and then within 36 hours or 24 hours from any one treatment time point. Differentiation of immature dendritic cells may be initiated and optionally further treated one or more times during the differentiation.
  • the "initiation of differentiation” may mean a process of adding a factor for inducing differentiation to a culture medium of immature dendritic cells or inoculating immature dendritic cells in a medium containing a factor for inducing differentiation.
  • the differentiation-inducing factor is not particularly limited as long as it can induce differentiation of immature dendritic cells.
  • the term "toll-like receptor agonist” is a pathogen-derived conserved molecular substance, which may be Pathogen associated molecular patterns (PAMPs).
  • PAMPs Pathogen associated molecular patterns
  • the pathogen may be Gram-positive bacterium, Gram-negative bacterium, fungus or virus.
  • the toll-like receptor agonists are endogenous molecules released from damaged or dead cells, and may be Damage associated molecular patterns (DAMPs). DAMPs or PAMPs collect adapter molecules in the cytoplasm of the cell to initiate and transmit an immune response via the TLR signal.
  • the toll like receptor agonist will be a derivative of PAMPs or DAMPs that bind to fragments, variants, analogs, homology or toll like receptors and induce activation by TLR-mediated, such as activation of NF- ⁇ B activity.
  • TLR-mediated such as activation of NF- ⁇ B activity.
  • the toll-like receptor agonist fragments, variants, analogs, homologs or derivatives are at least 30-99% identical to the amino acids of the TLR agonist and will induce activation by toll-like receptor-mediated.
  • the type of toll-like receptor agonist to be treated to the immature dendritic cells is not particularly limited, but is preferably a PAMP ligand, more preferably immature that can pass through MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88) signal. Differentiation of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells can be induced from dendritic cells.
  • the toll-like receptor agonist in the present invention may include one or more selected from the group consisting of TLR2 agonist, TLR4 agonist, TLR5 agonist, TLR7 agonist, TLR8 agonist, TLR9 agonist, TLR11 agonist, TLR12 agonist and TLR13 agonist.
  • TLR2 agonist TLR4 agonist
  • TLR5 agonist TLR5 agonist
  • TLR7 agonist TLR8 agonist
  • TLR9 agonist TLR11 agonist
  • TLR12 agonist and TLR13 agonist TLR13 agonist.
  • one or more of the ligands shown in Table 1 may be included, but is not particularly limited thereto, and may bind to toll-like receptors of dendritic cells, and may be a ligand that may pass through a MyD88 signal. Can be used without limitation.
  • the TLR2 agonist when used as the toll-like receptor agonist in the present invention, it may further include at least one of a TLR1 agonist and a TLR6 agonist that acts as a co-receptor.
  • a TLR1 agonist and a TLR6 agonist that acts as a co-receptor.
  • specific examples of the TLR1 agonist and the TLR6 agonist may be ligands shown in Table 1 below, but any ligand that may act as a co-receptor of the TLR2 agonist is not particularly limited.
  • the toll-like receptor agonist may be derived from a microorganism, a virus, a plant or an animal, may be synthesized, and the source is not particularly limited.
  • the differentiation of the immature dendritic cells in the present invention can be performed using a factor for inducing differentiation.
  • the factor for inducing differentiation it is preferable to use FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L).
  • the immature dendritic cells may be plasmacytoid dendritic cells and general dendritic cells (conventional). There is no particular limitation as long as it can induce differentiation into plasmacytoid cells (cDCs).
  • the differentiation of the immature dendritic cells in the present invention may be performed by culturing the immature dendritic cells in a medium containing a factor for inducing differentiation, or by adding the factor for inducing differentiation to the culture medium of the immature dendritic cells.
  • the factor for inducing differentiation may be additionally added one or more times during the process of differentiating the immature dendritic cells.
  • FMS-like tyrosine kinase 3 (Flt3L) corresponds to endogenous small molecules that activate hematopoietic progenitors to perform cytokines and growth factors. do.
  • the differentiation period of the immature dendritic cells in the present invention is not particularly limited, and may vary depending on the type and environment of the medium used, for example, may be performed for 5 to 15 days, preferably 7 days May be carried out for 10 to 10 days, more preferably for 8 to 9 days.
  • the immune tolerance of the plasmacytoid dendritic cells can be activated.
  • the kind of toll-like receptors used for activating the differentiated immune tolerant plasmacytoid dendritic cells as described above is not particularly limited. It may include one or more selected from the group consisting of, TLR7 agonist, TLR8 agonist, TLR9 agonist, TLR11 agonist, TLR12 agonist and TLR13 agonist, but preferably TLR9 agonist may be used.
  • the above-described process can effectively induce differentiation from immature dendritic cells to immune tolerant plasmacytoid dendritic cells. Accordingly, immature dendritic cells can be used to stably supply a large amount of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells through a simple and easy process.
  • the present invention relates to an immune tolerant plasmacytoid dendritic cell prepared by the above method.
  • the immune tolerant plasmacytoid dendritic cells obtained in the present invention can induce differentiation of regulatory T cells and inhibit the activity of effector T cells to effectively suppress the immune response.
  • the present invention also relates to a cell therapeutic agent comprising the immune tolerant plasmacytoid dendritic cells.
  • cell therapeutic agent refers to the proliferation, screening, or other methods of biological characteristics of cells in vitro for autologous, allogenic, xenogenic cells to restore the function of cells and tissues.
  • These cell therapies can be broadly classified into two categories, the first of which is an immune cell therapy for the regulation of immune responses, such as the suppression of immune responses or the enhancement of immune responses, and the second is a stem for tissue regeneration or long-term function recovery.
  • Cell therapy the cell therapy provided by the present invention may be the immune cell therapy.
  • the cell therapeutic agent may be used to induce differentiation or promote the activity of regulatory T cells, and particularly to prevent or treat autoimmune diseases, irritable immune diseases and various allergic diseases by effectively suppressing the immune response.
  • the route of administration of the cell therapeutic agent may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration may be, but is not limited thereto.
  • the composition may be formulated in a suitable form with a pharmaceutical carrier generally used for cell therapy.
  • 'Pharmaceutically acceptable' refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic or similar reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, etc. when administered to a human.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the cell therapeutic agent may be administered by any device capable of moving to a target cell.
  • the cell therapy agent of the present invention may include a therapeutically effective amount of cell therapy agent for the treatment of a disease.
  • a therapeutically effective amount means the amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician. Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder being treated. It is apparent to those skilled in the art that the content (number) of plasma cytokine dendritic cells included in the cell therapeutic agent of the present invention will vary depending on the desired effect.
  • the optimal cell therapeutic content can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health, sex and diet of the patient. It can be adjusted according to various factors including the administration time, the route of administration and the rate of administration of the composition, the duration of treatment, the drug used concurrently, for example, 2x10 4 cells / ml ⁇ 8x10 7 cells / ml plasmacytoid dendritic Cells may be included, but are not limited thereto.
  • the composition comprising the cell therapeutic agent of the present invention as an active ingredient is conventionally used through rectal, intravenous, arterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular subcutaneous or intradermal routes. It may be administered in a phosphorous manner.
  • the cell therapeutic agent comprising the immune tolerant plasmacytoid dendritic cells of the present invention as an active ingredient may be used as an external preparation for skin for the prevention or improvement of autoimmune diseases, irritable immune diseases or allergic diseases.
  • the formulation is not particularly limited. Specifically, for example, it may be a cosmetic composition having a formulation of a softening lotion, nourishing lotion, massage cream, nutrition cream, pack, gel or skin adhesive type cosmetics, and may also be a lotion, ointment, gel, cream, patch or spray Transdermal dosage forms.
  • femoral bone marrow was collected from bone marrow harvesting injections from C57BL / 6 mice.
  • the collected bone marrow was washed with phosphate buffer saline (PBS) and red blood cells were removed using ammonium chloride.
  • PBS phosphate buffer saline
  • the isolated cells (3 ⁇ 10 6 cells / well) were seeded in 6-well plates, followed by 10% FBS (Fetal bovine serum, calf serum), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 50 ⁇ M.
  • Incubation and differentiation were initiated by addition of 1 ml RPMI 1640 comprising mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate and 250 ng / ml FLT3L.
  • Pam 3 was treated at a concentration of 100-500 ng / ml.
  • 1 ml of RPMI 1640 was supplemented and incubated for 8 days.
  • the cells obtained after the cultivation were subjected to plasmacytoid dendritic cells using a plasmacytoid dendritic cell separation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) and a magnetic cell sorting system (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Separation (FIG. 2). Since the treatment of the toll-like receptor agonist may affect the differentiation of the plasmacytoid dendritic cells, the surface-expressing molecules specifically induced in the plasmacytoid dendritic cells are confirmed on the 8th day, and the results are shown in FIG. ).
  • a plasmacytoid dendritic cell separation kit Miltenyi Biotec, Auburn, CA
  • Vario MACS Miltenyi Biotec, Auburn, CA
  • the toll-like receptor agonist when the toll-like receptor agonist was treated (TLRs-pDC), the ratio of the number of plasmacytoid dendritic cells obtained after 8 days to the number of initial immature dendritic cells was measured, and the result is shown in FIG. ).
  • the case where the toll-like receptor agonist was not treated is shown as a comparative example (pDC).
  • Example 2 In order to confirm the cytokine secretion of the plasma cytokine dendritic cells isolated in Example 1, inoculated cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) in 48 well plate and then ODN1826 (1 ⁇ g / ml) Treatment was stimulated. After 24 hours, the obtained supernatant was separated, and cytokine secretion was confirmed by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results are shown in FIG. 4. However, in order to confirm the treatment effect of the toll-like receptor agonist, the case where the toll-like receptor agonist was not treated during differentiation of immature dendritic cells in Example 1 is shown as a comparative example (pDC).
  • pDC comparative example
  • plasma-cytoid dendritic cells strongly induced type I interferons (IFN- ⁇ and IFN- ⁇ ) and representative inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-12p70.
  • toll-like receptor agonists 0.5 ⁇ g / ml
  • TLRs-pDC differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells
  • ODN1826 ODN1826.
  • IL-10 an immunosuppressive cytokine
  • plasmacytoid dendritic cells induced by differentiation by treating a toll-like receptor agonist to immature dendritic cells according to the present invention were found to have immune tolerance unlike conventional plasmacytoid dendritic cells.
  • plasmacytoid dendritic cells were induced in the same manner as in Example 1, but as the toll-like receptor agonist, ligands shown in Table 2 were used. After 8 days of incubation, plasmacytoid dendritic cells were separated with a purity of 85% or more using a plasmacytoid dendritic cell separation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) and a magnetic cell sorting system (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). It was.
  • a plasmacytoid dendritic cell separation kit Miltenyi Biotec, Auburn, CA
  • Vario MACS Miltenyi Biotec, Auburn, CA
  • Isolated cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) were inoculated in 48 well plates, treated with ODN1826 (1 ⁇ g / ml) and incubated for 24 hours. Thereafter, only the supernatant was separated and the secretion pattern of the immunosuppressive cytokine IL-10 was confirmed by enzyme immunoassay. The results are shown in FIG. 5. However, in order to confirm the treatment effect of the toll-like receptor agonist, the case where the toll-like receptor agonist was not treated during differentiation of immature dendritic cells is shown as a comparative example (non).
  • the differentiation of plasmacytoid dendritic cells is induced in the same manner as in Example 1, but the time to start the differentiation of the toll-like receptor agonist (0 day treatment)
  • the treatment was performed after 3 days from the start of differentiation (3 day treatment).
  • the plasmacytoid dendritic cells were purified to 85% or higher using a plasmacytoid dendritic cell separation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) and a magnetic cell sorting system (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Separated.
  • Isolated cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) were inoculated in 48 well plates, treated with ODN1826 (1 ⁇ g / ml) and incubated for 24 hours. After separating only the supernatant, the secretion pattern of cytokines was confirmed by enzyme immunoassay, and the results are shown in FIG. 6. However, in order to confirm the treatment effect of the toll-like receptor agonist, the case where the toll-like receptor agonist was not treated during the differentiation of immature dendritic cells is shown as a comparative example (no-treatment, non).
  • the toll-like receptor agonist is treated at the start of differentiation of immature dendritic cells, that is, at the same time as FLT3L, a factor for inducing differentiation, the differentiation of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells is induced as in the case of differentiation. there was.
  • Dendritic cells including plasmacytoid dendritic cells, present antigens through MHC molecules to activate T cells upon recognition of foreign antigens and express co-stimulatory factors such as CD80 and CD86 to facilitate interaction.
  • the plasmacytoid dendritic cells isolated in Example 1 were stimulated with ODN1826 and then cultured for 24 hours to confirm the expression level of the cell surface molecules.
  • specific markers of plasmacytoid dendritic cells anti-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences), anti-PDCA-1 (PerCP-eFluor® 710 , ebioscience) and anti-CD80 (v450, BD Biosciences), anti-CD86 (APC, ebioscience), anti-MHC-I (PE, ebioscience) and anti-MHC-II (APC-eFluor) specific for cell surface molecules 780, ebioscience)
  • the antibody was treated for 30 minutes at 4 ° C and analyzed by flow cytometry LSRFortessa x-20 (BD Biosciences). The results are shown in FIG. However, in order to confirm the treatment effect of the toll-like receptor agonist
  • pDCs general plasmacytoid dendritic cells express high levels of co-stimulating factor CD86 and MHC class II molecules exogenous antigen presentation, but differentiation-induced plasma by treating toll-like receptor agonists Cytoid dendritic cells (TLRs-pDC) showed no or no response. Meanwhile, another co-stimulatory factor, CD80, and MHC class I molecules presenting endogenous or cross-antigens, were treated with toll-like receptor agonists and were not treated with differentiation-induced plasmacytoid dendritic cells (TLRs-pDC). It was confirmed that the expression at a higher level than (pDC).
  • anti-CD11c PE-Cy7, BD Biosciences
  • markers specific for plasmacytoid dendritic cells and Cell surface factor antibodies such as anti-PDCA-1 (PerCP-eFluor® 710, ebioscience) and immune tolerance induced cell surface molecules, such as anti-PD-L1 (PE, ebioscience) and anti-CCR9 (FITC, ebioscience)
  • anti-PDCA-1 PerCP-eFluor® 710, ebioscience
  • immune tolerance induced cell surface molecules such as anti-PD-L1 (PE, ebioscience) and anti-CCR9 (FITC, ebioscience
  • CCR9 and IDO molecules were significantly increased compared to the untreated plasmacytoid dendritic cells upon stimulation with ODN1826.
  • the expression of CCR9 was higher than that of untreated plasmacytoid dendritic cells even when unstimulated.
  • TLRs-pDC differentiation-induced plasma cytokine dendritic cells
  • RPMI1640 culture medium containing 10% FBS, 1% antibiotic and 100ng / ml of granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) was used for differentiation of dendritic cells. Incubated for 8 days. After 8 days of incubation, 5 ⁇ g / ml of Rv1411c protein was treated to wild-type dendritic cells (WT) and TLR2 knockout mice (TLR2-/-), respectively, and mixed for 2 hours intermittently. Facilitated. Then, the Hisv labeled with the Rv1411c protein was stained with an antibody having antigen-antibody specificity, and the degree of binding was measured using a flow cytometer. The results are shown in FIG. 10.
  • wild-type dendritic cells showed increased binding to Rv1411c protein compared to TLR2 knockout dendritic cells (TLR2-/-), but in TLR2 knockout dendritic cells (TLR2-/-). Although the Rv1411c protein was treated, the same degree of binding as the untreated experimental group was confirmed.
  • Rv1411c protein binds to the TLR2 receptor and has activity as a TL2 agonist.
  • Example 8 Induced differentiation of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells in the same process as in Example 1, but as the toll-like receptor agonist, the Rv1411c protein (0.1 ⁇ g / ml) was confirmed as a toll-like receptor agonist in Example 8. , 0.5 ⁇ g / ml) was used. After 8 days of incubation, plasmacytoid dendritic cells were separated with a purity of 85% or more using a plasmacytoid dendritic cell separation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) and a magnetic cell sorting system (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). It was.
  • a plasmacytoid dendritic cell separation kit Miltenyi Biotec, Auburn, CA
  • Isolated cells (5 ⁇ 10 5 cells / ml) were seeded in 48 well plates, treated with ODN1826 (1 ⁇ g / ml) and incubated for 24 hours. The supernatant obtained after the cultivation was isolated, and the results of confirming cytokine secretion by Enzyme Linked Immunosorbent assay (ELISA) are shown in a graph of FIG. 11. However, in order to confirm the treatment effect of Rv1411c protein, Rv1411c protein was untreated, and typical plasma cytoid dendritic cells stimulated (ODN +) or unstimulated (ODN ⁇ ) with ODN1826 are shown as comparative examples (pDC).
  • ODN1826 Enzyme Linked Immunosorbent assay
  • Rv1411c As shown in FIG. 11, stimulation of plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c (0.1 ⁇ g / ml) -pDC, Rv1411c (0.5 ⁇ g / ml) -pDC) treated with Rv1411c protein with ODN1826 results in normal plasmacytoid dendritic cells.
  • the concentrations of strongly induced type I interferons (IFN- ⁇ and IFN- ⁇ ) and the representative inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-12p70 were rapidly reduced in a dose-dependent manner.
  • IL-10 was found to increase its expression level in a concentration dependent manner.
  • the plasmacytoid dendritic cells treated with the Rv1411c protein have immune tolerance differently from the ordinary plasmacytoid dendritic cells, and the degree of immune tolerance also increases in proportion to the concentration of the Rv1411c protein.
  • Example 9 the expression patterns of surface molecules and enzymes in the plasmacytoid dendritic cells induced differentiation with Rv1411c protein were confirmed.
  • the markers specific for plasmacytoid dendritic cells were treated at 4 ° C.
  • anti-CD11c PE-Cy7, BD Biosciences
  • anti-PDCA-1 PerCP-eFluor 710, ebioscience
  • Anti-CD80 v450, BD Biosciences
  • anti-CD86 APC, ebioscience
  • anti-MHC-I PE, ebioscience
  • anti-MHC-II APC-eFluor® 780, ebioscience
  • anti-PD Cell surface factor antibodies such as -L1 (PE, ebioscience) and anti-CCR9 (FITC, ebioscience) were treated at 4 ° C.
  • the most important feature in vivo of immune tolerant plasmacytoid dendritic cells is to inhibit the activity of T lymphocytes.
  • the following experiment was performed to determine the effect of differentiation-induced plasma cytokine dendritic cells on the proliferation and activity of T cells by treating Rv1411c protein in Example 9.
  • T cells 1.5 ⁇ 10 5 cells / well isolated from allogeneic mice and stained with CellTrace (Invitrogen) were stimulated through 1 ⁇ PMA / Ionomycin (ebioscience). This treatment of PMA / Ionomycin increases the proliferation rate of T lymphocytes and promotes the secretion of interferon gamma (IFN-gamma).
  • IFN-gamma interferon gamma
  • the cells were treated with Tv and Rv1411c protein to induce differentiation-induced differentiation of plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) or general plasmacytoid dendritic cells (pDC) in a ratio of 1: 5 and incubated for 3 days. .
  • Rv1411c protein was untreated, and typical plasma cytoid dendritic cells stimulated (ODN +) or unstimulated (ODN ⁇ ) with ODN1826 are shown as comparative examples (pDC).
  • both plasmavoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) and general plasmacytoid dendritic cells (pDC) induced by differentiation by treating Rv1411c protein induced T cell proliferation, but treated with Rv1411c protein to differentiate.
  • the induced plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) were observed to have much lower proliferative induction capacity for CD4 + T cells than normal plasmacytoid dendritic cells (pDC).
  • the secretion of IFN-gamma was lowered at a lower level than that of the non-treated plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in which plasmavoid dendritic cells (Rv1411c-pDCs) induced by differentiation were treated with Rv1411c protein. I could see the induction.
  • T cells stained with CellTrace (Invitrogen) after isolation from allogeneic mice were treated with Rv1411c protein in Example 9 to induce differentiation of plasmacytoid dendritic cells (Rv1411c-pDC) or normal plasmacytoid dendritic cells (pDC). The ratio was 10: 1, 5: 1, or 1: 1 and incubated for 5 days. However, as the plasmacytoid dendritic cells were used ODN1826 stimulated (ODN +) and unstimulated (ODN-). Five days after incubation, cells were treated with anti-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience) for 30 minutes at 4 ° C. and Foxp3 / transcription factor staining buffer (ebioscience) at 37 ° C.
  • T cells are reported to induce immune tolerant dendritic cells and inhibit the proliferation of other T cells. Therefore, below, according to Example 12, the activity of T cells induced by differentiation by Rv1411c protein as regulatory T cells was confirmed.
  • mice spleens are isolated, red blood cells are removed, and CD4 + and CD25- activated T cells are isolated using a magnetic cell sorting system (MACS), and then stained with a violet proliferation dye to determine the extent of proliferation. It was. Differentiated T cells were then incubated for two days in wells coated with anti-CD3e and anti-CD28 antibodies with CD4 +, CD25- effector T cells. As a result, the change in T cell proliferative capacity was measured with respect to the ratio of primed T cells to CD25-acting T cells, and is graphically shown in FIG. 16.
  • MCS magnetic cell sorting system
  • Toll-like receptor agonist was further treated in the differentiation-induced immune tolerant plasmacytoid cells according to the present invention, it effectively inhibits the activity of effector T cells by activating immune tolerance.
  • Femoral bone marrow was harvested using bone marrow harvesting injections from C57BL / 6 mice. The collected bone marrow was washed with phosphate buffer saline (PBS) and red blood cells were removed using ammonium chloride. Isolated cells (5 ⁇ 10 5 cells / well) were seeded in 6-well plates, followed by 10% FBS (Fetal bovine serum, calf serum), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 50 ⁇ M Incubation and differentiation were initiated by addition of 1 ml RPMI 1640 comprising mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate and 250 ng / ml FLT3L.
  • PBS phosphate buffer saline
  • Rv1411c protein and Pam3 were treated with a toll like receptor agonist at a concentration of 100-500 ng / ml.
  • 1 ml of RPMI 1640 was supplemented and incubated for 8 days.
  • the cells obtained after the cultivation were subjected to plasmacytoid dendritic cells using a plasmacytoid dendritic cell separation kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) and a magnetic cell sorting system (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Separation.
  • TLR agonist plasmacytoid dendritic cells
  • TLR agonist toll-like receptor agonists during the differentiation of immature dendritic cells
  • Non plasmacytoid dendritic cells induced differentiation

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Abstract

본 발명은 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법과, 상기 방법에 의해 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.

Description

면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 그 제조방법
본 발명은 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법과, 상기 방법에 의해 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
면역 체계에 있어서 면역 반응과 면역 관용 반응은 상호 조화와 균형을 이루어야 한다. 과다 면역 반응이 일어나는 경우, 예를 들면, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병의 자가 면역 질환과 패혈증 및 과민성 알레르기 질환 등이 발생할 수 있으며, 이들은 사람의 생존과 삶의 질에 매우 큰 영향을 준다.
기존에는 수지상 세포가 면역 반응을 유도함에 있어서만 중요한 축으로 작용한다고 생각하였으나, 최근에는 면역 관용 반응에도 큰 기여를 한다는 사실이 알려짐에 따라 그에 대한 연구가 활발해지고 있다.
수지상 세포는 선천성 면역뿐만 아니라, 후천적인 인과에 의해 선택적으로 발생되는 획득 면역 조절에도 중추적인 역할을 담당하는 세포로서, 구체적으로는 T 세포에 외부에서 침입한 항원의 정보를 제시하는 기능을 수행하는 대표적인 항원 제시 세포의 일종이다.
또한, 상기 수지상 세포는 선천 면역과 후천 면역의 다리 역할을 하는 세포로, 면역 세포 중에서 원시 T 세포(naive T cells)의 프라이밍(priming)을 할 수 있는 유일한 세포에 해당한다. 이는 림프계 조직을 비롯하여 여러 조직의 각 조직 세포 간극에서 나뭇가지 모양으로 존재한다. 또한, 상기 수지상 세포는 최종적으로 분화된 세포로, 체내 전체 면역 세포의 1% 이하로 존재하지만, 단핵구나 대식세포에 비해 훨씬 강력하게 림파구의 활성을 유도할 수 있는 세포이며, 골수에서 기원해서 미성숙한 형태로 혈류를 거쳐 체내 모든 기관으로 이동할 수 있다. 이로 인해 수지상 세포는 각 조직 주변의 항원을 채집하여 림프 기관으로 이동해 T 림프구에 항원을 전달하여 T 세포 활성화에 중요한 역할을 담당할 수 있다.
이에 따라, 최근에는 상기 수지상 세포를 면역 백신 또는 면역 치료제로 사용하고 있으며, 상기 면역 백신이나 면역 치료제는 모두 부작용이 없이 안전하다고 알려져 다양한 질환에 대하여 그 사용이 확대되고 있는 추세이다.
한편, 상기 수지상 세포는 근원(origin), 표현형(phenotype) 및 기능(function) 등에 따라 다양한 부분 모집단(subpopulations)으로 구성된다. 구체적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoide dendritic cells, pDC)의 경우 다양한 병원균 유래 자극에 대응하여 I형 IFN을 높은 수준으로 생산할 수 있다. 이들은 표면 표현형에 의해 일반적인 수지상 세포(conventional Dendritic cells, cDC)와 구별된다. 상기 pDC는 B220를 발현하고, CD11c는 낮은 수준으로 발현하는 반면, cDCs는 CD11c 및 CD11b를 높은 수준으로 발현하지만, B220는 발현하지 않는다. 상기 pDC 및 cDC는 모두 조화로운 면역 반응의 효과적인 자극제로 작용할 수 있도록, 미성숙 수지상 세포가 성숙되는 과정에 의해 얻어진다.
상기한 바와 같이, pDC는 DNA 바이러스나 단일 가닥 RNA 바이러스에 의해 감염 시 대량의 I형 IFNs를 분비함으로써 면역 세포를 활성화시켜 바이러스 감염의 방어에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 항원을 제시할 수 있는 성숙한 수지상 세포(maturated DCs, mDCs)를 강력하게 활성화시켜 T 세포에 의한 항바이러스 반응을 증폭시키는데 일조한다. 하지만, 체내에서 pDC의 분화나 역할에 대한 연구는 다른 수지상 세포에 비하여 미미한 실정이다.
최근에는 자가 면역 질환 치료용 수지상 세포의 활용이 두드러지고 있다. 자가 면역 질환은 만성 질환으로 전세계적으로 수십억 명의 환자가 있는 것으로 추산되고 있는 주요 질환이다. 수지상 세포의 면역을 주관하는 특정 유전자의 발현 조절이나 면역 관용 유발 물질 발굴을 통해 일관성 있게 면역 관용성을 유지 혹은 강화시킨 면역 관용성 수지상 세포의 제조 기술이 시급히 요구되고 있다. 특히, pDC가 다양한 자가 면역 질환 또는 감염성 질환에서 중요한 역할을 할 것이라는 연구가 많이 이루어지고 있지만 면역 관용성 pDC를 제작하는 체계적이고 표준화된 분화 방법이 알려지지 않았다.
본 발명의 발명자들은 미성숙 수지상 세포(dendritic cells)에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리한 후 분화를 개시하거나, 혹은 상기 미성숙 수지상 세포가 분화하는 과정 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 목적은 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 일관적으로 면역 관용성을 보이는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 이용하여 면역 세포 중에서도 조절 T 세포로의 분화를 유도하고 작동 T 세포의 활성을 억제할 수 있는 세포 치료제를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 항염증성 사이토카인의 발현은 유도하고, 염증성 사이토카인의 발현은 억제하며, 조절 T 세포로의 분화를 촉진함에 따라 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 또는 알러지 질환 등을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미성숙 수지상 세포에 대하여 분화 유도용 인자(Flt3L-containing media) 및 톨 유사 수용체 작용제(TLRs agonists) 처리 방법의 설계도를 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 분리를 나타낸 도이다.
도 3의 (a)는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 나타낸 도이다.
도 3의 (b)는 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 수 대비 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 4는 실시예 2에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 5는 실시예 3에서 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(non)에서 사이토카인 IL-10의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 6은 실시예 4에서 본 발명의 일 실시예에 따라 미성숙 수지상 세포에 대하여 처리되는 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 시점에 따라 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 실시예 5에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80 및 CD86의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 8은 실시예 6에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 IDO, CCR9 및 PD-L1의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 9의 (a)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9의 (b)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 10은 실시예 8에서 야생형 수지상 세포(WT) 및 TLR2 넉아웃 마우스에서 분리한 수지상 세포(TLR2-/-)의 Rv1411c 단백질과의 결합 정도를 나타낸 도이다.
도 11은 실시예 9에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml))의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 12는 실시예 10에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80, CD86 및 면역 관용 유도 분자(IDO, CCR9 및 PD-L1)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 13은 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 14는 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 IFN-gamma의 분비 양상을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 15의 (a)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15의 (b)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 16은 실시예 13에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)에 의하여 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 배양한 후, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 17은 실시예 14에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(RYv1411c 단백질 및 Pam3)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLR agonist)와, 미처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Non)의 수를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
단, 도 1 내지 17에서 *은 P<0.05, **은 P<0.01, ***은 P<0.005를 의미한다.
본 발명은, 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "수지상 세포 (dendritic cell, DC)"는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 또한 수지상 세포는 면역원성(immunogenic) 및 면역 관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상 세포(semimature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상 세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "미성숙 수지상 세포"는 수지상 세포의 초기 성숙 단계에 발견되는 것으로, 단핵구 세포의 표면 표현형인 CD14를 발현하지 않으며, 또한, 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현된다.
본 명세서에서 용어, "준성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상 세포를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상 세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅱ, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높고, 항염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상 세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상 세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다.
다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제가 처리되는 수지상 세포는 분화가 되지 않은 미성숙 수지상 세포인 것이 바람직하다. 여기서 상기 미성숙 수지상 세포는 원시적인 수지상 세포(naive dendritic cells)를 포함할 수 있고, 포유류의 골수 등으로부터 분리 및 획득된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 면역 관용성 수지상 세포는 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells)"란 수지상 세포의 한 부류(subset)로, 1958년 Dr. Lennert와 Dr. Remmele에 의하여 사람의 림프절에서 형질 세포(plasma cell)의 형태를 조직학적으로 발견함으로써 처음 알려졌지만 B 세포 특이적 마커 (immunoglobulin)를 발현하지 않는다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 T 세포(Plasmacytoid T cells)로 명명되다가, T 세포의 공통적 마커인 CD3를 발현하지 않으면서 골수계 항원(myeloid lineage antigen)과 MHC 클래스 Ⅱ를 발현한다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 단핵구(plasmacytoid monocyte)로 명명되었다. 그 후, 수지상 세포의 고유 성질인 동종 이계 혼합 림프구 반응(allerogenic mixed lymphocyte reaction, MLR)을 유도할 수 있는 능력이 확인됨에 따라 다시 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 명명되고 있으며, 간단히 'pDC'로 표기하기도 한다.
본 명세서에서 용어, "면역 관용성"이란 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태뿐만 아니라, 면역 반응을 억제하는 상태를 의미한다. 따라서, 본 발명에서, 상기 "면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포"는 IL-10 등과 같은 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고, IL-12p70 및 TNF-α 등의 염증성 사이토카인의 분비는 억제하며, 최근 면역 관용 유도분자들로 알려진 인돌아민-2,3 디옥시제네이즈(indoleamine-2,3 dioxygenase, IDO) 분자 및 면역 관용 유도 세포의 표면 분자인 CCR9이 높은 수준으로 발현되어, 조절 T 세포(regulatory T cells)의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T cells)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 처리함으로써 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로, 그리고 대량으로 제조할 수 있다. 여기서, 상기 '분화 개시 이전'이라 함은, 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하기 이전의 시점을 포함할 수 있다. 또한, 상기 '분화 중'이라 함은 상기 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 분화 유도용 인자에 의하여 분화가 완료되기 이전까지의 시점을 의미한다. 바람직하게는 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 처리 후 7일 이내의 시기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는, 상기한 바와 같이 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에만 처리되면 구체적인 시점을 특별히 제한하지 않는다. 다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 분화 개시 시점으로부터 7일(168시간), 5일(120시간) 또는 3일(72시간) 이내에 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 작용제를 처리한 시점으로부터 36시간, 바람직하게는 24시간 내에 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시할 수 있으나, 역시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 상기 톨 유사 수용체 작용제를 1회 이상 처리할 수 있으며, 구체적인 처리 횟수를 특별히 제한하지 않으나, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 7일, 5일 또는 3일 이내에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리할 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포에 대하여 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리한 뒤, 어느 일 처리 시점으로부터 36시간 또는 24시간 이내에 상기 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시하고, 그 분화 중에 선택적으로 1회 이상 추가로 처리할 수 있다.
여기서, 상기 "분화 개시"라 함은 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 분화 유도용 인자를 첨가하거나, 또는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 미성숙 수지상 세포를 접종하여 배양하는 공정을 의미할 수 있으나, 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)"는 병원체(pathogen) 유래 보존된 분자적 물질로, PAMPs(Pathogen associated molecular patterns)일 수 있다. 여기서, 상기 병원체로는 그람-양성 박테리움, 그람-음성 박테리움, 균류 또는 바이러스가 될 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들로, DAMPs(Damage associated molecular patterns)일 수 있다. DAMPs 또는 PAMPs는 TLR 신호를 통해 면역 응답을 개시하고 신호를 전달하기 위해 세포의 세포질 내에서 어댑터 분자들을 모으게 된다. 상기 톨 유사 수용체 작용제는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 톨 유사 수용체와 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 PAMPs 또는 DAMPs의 유도체가 될 수 있다. 상기 톨 유사 수용체 작용제인 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 유도체는 TLR 효능제의 아미노산의 최소한 30~99% 동일하며 톨 유사 수용체-중재에 의한 활성화를 유도하게 된다.
본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는 톨 유사 수용체 작용제의 종류는 특별히 제한하지 않으나, PAMPs 리간드인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유할 수 있는 것이 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 하기 표 1에 나타낸 리간드 중 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 수지상 세포의 톨 유사 수용체에 결합할 수 있는 것으로, MyD88 시그널을 경유할 수 있는 리간드라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로 TLR2 작용제를 사용하는 경우, 그 보조 수용체(co-receptor)로 작용하는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 1종 이상을 추가로 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제의 구체적인 예시로는 하기 표 1에 나타낸 리간드일 수 있으나, 상기 TLR2 작용제의 보조 수용체로서 작용할 수 있는 리간드라면 특별히 제한하지 않는다.
Figure PCTKR2018001299-appb-T000001
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는 미생물, 바이러스, 식물 또는 동물 유래일 수 있고, 합성된 것일 수 있으며, 근원을 특별히 제한하지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행될 수 있다. 여기서, 상기 분화 유도용 인자로는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)를 사용하는 것이 바람직하지만, 상기 미성숙 수지상 세포를 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 일반적인 수지상 세포(conventional plasmacytoid cells, cDCs)로의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 상기 미성숙 수지상 세포를 배양하거나, 상기 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 상기 분화 유도용 인자를 첨가하며 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 선택적으로 상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포를 분화하는 과정 중에 1회 이상 추가로 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)"는 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitors)를 활성화시켜 사이토카인 및 성장 인자로서의 기능을 수행하는 내인성 저분자에 해당한다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 기간은 특별히 제한하지 않으며, 사용되는 배지의 종류 및 환경에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 7일 내지 10일 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 8일 내지 9일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 미성숙 수지상 세포로부터 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리함으로써 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 면역 관용성을 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 분화 완료된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 활성화 시킴에 있어 사용되는 톨 유사 수용체의 종류는 특별히 제한하지 않으며, TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 TLR9 작용제를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 공정을 통해 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이에 따라, 미성숙 수지상 세포를 이용하여 간단하고 용이한 공정을 통해 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로 공급할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 방법으로 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 조절 T 세포의 분화를 유도하고 작동 T 세포의 활성은 억제하여 면역 반응을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포 치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 생체 내 면역 반응의 억제 혹은 면역 반응의 항진 등 면역 반응 조절을 위한 면역 세포 치료제이며, 두 번째는 조직 재생 혹은 장기 기능 회복을 위한 줄기세포 치료제인데, 본 발명에서 제공하는 세포 치료제는 상기 면역 세포 치료제일 수 있다.
본 발명에서 상기 세포 치료제는 조절 T 세포의 분화를 유도하거나 그 활성을 촉진하기 위하여 사용될 수 있고, 특히 면역 반응을 효과적으로 억제함에 따라 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 및 다양한 알러지 질환을 예방 또는 치료하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포 치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
또한, 본 발명에서 상기 세포 치료제는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포 치료제는 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포 치료제에 포함되는 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 함량(수)은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포 치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 예를 들면, 2x104cells/ml ~ 8x10７cell/ml의 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법에서 본 발명의 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 피하 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제는 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제로 사용될 수 있다. 이러한 경우에 신체 부위에 따라, 그 제형이 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양 크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다. 또한, 각 제형에 의한 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 이외의 다른 성분들은 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 톨 유사 수용체 작용제의 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화 조절 효과
미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도되는지 확인하기 위하여, 도 1에 나타낸 설계도를 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(3×106cell/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다(도 2). 상기 톨 유사 수용체 작용제의 처리가 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 8일째에 확인하여 그 결과를 도 3의 (a)에 나타내었다. 또한, 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLRs-pDC)에 있어서, 초기 미성숙 수지상 세포의 수 대비 8일 경과 후 얻어진 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 측정하여 그 결과를 도 3의 (b)에 나타내었다. 단, 상기 톨 유사 수용체 작용제의 분화 조절 효과를 확인하기 위하여 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여도 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었고, 분화 효율에 있어서도 미처리한 경우와 차이가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 자극 및 사이토카인의 분비 양상 확인
상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 사이토카인 분비 양상을 확인하기 위하여, 분리한 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종한 뒤 ODN1826 (1 μg/ml)을 처리하여 자극하였다. 24시간이 경과한 후 얻어진 상층액을 분리하고, 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 일반적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70가 강력하게 유도되었다. 하지만, 톨 유사 수용체 작용제(0.5 μg/ml)를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826으로 자극하자 그 발현 수준이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 달리 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었다.
[실시예 3] 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리에 따른 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서의 IL-10 분비 양상 확인
다양한 톨 유사 수용체 작용제의 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 하기 표 2에 나타낸 리간드를 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리하여 면역 억제성 사이토카인 IL-10의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.
Non TLR2 작용제 TLR3 작용제 TLR4 작용제 TLR7 작용제 TLR9 작용제
미처리 Pam3 Poly I:C LPS 이미퀴모드 CpG-ODN
도 5에서 보는 바와 같이, 다양한 톨 유사 수용체 작용제 중 MYD88 시그널을 경유하는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR8 작용제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포만이 ODN1826으로 자극하자 IL-10의 발현 수준이 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 MYD88 시그널을 경유하는 톨 유사 수용체를 처리하는 경우 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서의 사이토카인 분비 양상 확인
톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment), 분화 개시일로부터 3일이 경과하였을 때(3 day treatment) 처리하였다. 총 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리한 뒤 사이토카인의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 그 결과를 도 6에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(no-treatment, non)로 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment) 또는 분화 개시일로부터 3일째(3 day treatment)에 처리한 경우 모두, 미처리한 경우(no-treatment)에 비하여 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현은 억제되고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점, 즉 분화 유도용 인자인 FLT3L과 동시에 처리하여도, 분화 중에 처리한 경우와 마찬가지로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화가 유도되는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 공동 자극 인자 및 MHC 분자의 발현 확인
플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함한 수지상 세포는 외부 항원 인지 시 T 세포를 활성화시키기 위하여 MHC 분자들을 통해 항원을 제시하고, CD80 및 CD86과 같은 공동 자극 인자를 발현하여 상호작용을 촉진시킨다.
이에 따라, 상기 실시예 1에서 분리한 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 ODN1826으로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤 상기 세포 표면 분자들의 발현 수준을 확인하였다. 먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences), 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　 710, ebioscience)와 세포 표면 분자들에 특이적인 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor　780, ebioscience) 항체를 4℃에서 30분간 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20 (BD Biosciences)를 통하여 분석하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되었으나, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 보여 주었다. 한편, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원 제시를 하는 MHC 클래스 I 분자는 톨 유사 수용체 작용제로 처리되어 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)가 처리되지 않은 세포(pDC)보다 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 면역 관용 유도 분자의 발현 확인
일반적인 수지상 세포는 항원 제시를 통하여 T 세포 반응을 일으켜 후천성 면역 반응을 활성화시키지만, 일부 면역 관용성 수지상 세포의 경우 T 세포의 반응을 억제한다고 보고되고 있다. 이러한 면역 반응의 억제는 최근 다양한 면역 관용 유도 분자들로 예를 들면, PD-L1 및 IDO의 유도를 통해 이루어진다고 보고되고 있다. 또한 CCR9+pDCs은 조절 T 세포의 강력한 유도를 통하여 다양한 면역관용 현상을 유도할 수 있다고 보고되고 있다.
따라서, 이하에서는 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 면역 관용 유도 분자들의 발현을 확인하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　710, ebioscience)과 면역 관용 유도 세포 표면 분자들인 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한, 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위해 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분간 처리한 후 항-IDO (eFluor　 660, ebioscience)를 염색하고 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 이용하여 발현 수준을 분석한 뒤 그 결과는 도 8에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 경우, ODN1826으로 자극하자 CCR9 및 IDO 분자 모두 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 발현양이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었고, CCR9의 경우는 비자극시에도 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 높은 발현 양상을 보였다.
이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 분화 유도된 것을 알 수 있었다.
[실시예 7] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 조절 T 세포 유도 능력 확인
면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Tolerogenic pDC)는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)로의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T 세포)의 활성이나 증식을 억제한다고 보고되고 있다.
따라서, 이하에서는 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에 의한 조절 T 세포(Foxp3+CD4+ T cells)의 증식 여부를 확인하였다. 구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 5:1의 비율로 5일 동안 혼합 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는, ODN1826로 자극(ODN +)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 미자극(ODN -)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 사용하였다. 5일 배양 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼(Transcription Factor Staining Buffer)(ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후, 항-Foxp3 (PE, ebioscience)로 처리한 뒤 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 도 9의 (a)에 나타내었고, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 9의 (b)에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극(ODN +)하자 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 톨 유사 수용체 자극제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826로 자극한 경우(ODN +)가 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식이 현저하게 유도된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성이 활성화되어 조절 T 세포로의 분화 또한 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.
[실시예 8] Rv1411c 단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성 확인
기존 보고에 따르면 결핵균 유래 단백질들은 다양한 톨 유사 수용체에 결합할 수 있다는 보고가 있다. 따라서, 이하에서는 TLR2 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 골수에서 분화시킨 수지상 세포와 Rv1411c 단백질의 결합을 확인하여 Rv1411c 단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 골수를 분리하여 적혈구를 제거한 뒤, 수지상 세포의 분화를 위하여 10% FBS, 1% 항생제 및 100ng/ml의 GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony stimulating factor)가 함유된 RPMI1640 배양액을 사용하여 8일간 배양하였다. 8일 배양 후 야생형 수지상 세포(WT)와 TLR2 넉아웃 마우스(TLR2-/-)에서 분리한 수지상 세포 각각에 5 μg/ml의 Rv1411c 단백질을 처리한 후 2시간 동안 간헐적으로 섞어주어 단백질의 결합을 용이하게 하였다. 이후 Rv1411c 단백질에 표지된 His분자에 항원-항체 특이성을 가지는 항체로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 결합 정도를 측정하고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 야생형 수지상 세포(WT)에서는 TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에 비하여 Rv1411c 단백질과의 결합이 증가한 것으로 확인되었으나, TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에서는 Rv1411c 단백질을 처리하였음에도 불구하고 처리하지 않은 실험군과 동일한 결합 정도를 확인할 수 있었다.
이를 통하여 Rv1411c 단백질은 TLR2 수용체에 결합하며 TL2 작용제로서 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] Rv1411c 단백질의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화 유도능 확인
상기 실시예 1과 동일한 공정으로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 상기 실시예 8에서 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성이 확인된 Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml)을 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)으로 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액을 분리하여 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인한 결과를 도 11에 그래프로 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)를 ODN1826으로 자극하자 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 강력하게 유도되는 I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현이 농도 의존적으로 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있었고, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10은 농도 의존적으로 그 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 다르게 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었으며, 상기 Rv1411c 단백질의 처리 농도와 비례하여 면역 관용성의 정도 또한 증가하는 것을 알 수 있었다.
[실시예 10] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 공동 자극 인자, MHC 분자 및 면역 관용 유도 분자의 발현 확인
상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질로 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 표면 분자 및 효소의 발현 양상을 확인하였다.
먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　710, ebioscience)와, 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor　780, ebioscience), 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위하여 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리한 뒤, 항-IDO (eFluor　 660, ebioscience)를 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 분석하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, ODN1826 자극 시 Rv1411c 단백질로 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되는 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)는 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 볼 수 있었다.
반면, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원제시를 하는 MHC 클래스 I 분자의 경우는, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 더욱 높은 수준으로 발현되는 것을 볼 수 있었다.
또한, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우, ODN1826으로 자극(ODN +) 시 PD-L1, CCR9 및 IDO 분자 모두, 미자극한 경우(ODN -)에 비하여 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, CCR9과 PD-L1의 경우는 미자극 시(ODN -)에도 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 높은 발현 양상을 나타내는 것을 볼 수 있었다.
[실시예 11] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 T 세포의 활성 억제
면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체 내에서의 가장 중요한 특징은 T 림프구의 활성을 억제하는 것이다. 이에, 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 T 세포의 증식과 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리하여 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포(1.5×105cell/well)를 1X의 PMA/Ionomycin (ebioscience)을 통하여 자극을 주었다. 이러한 PMA/Ionomycin의 처리는 T 림프구의 증식 속도를 증가시키며, 인터페론 감마(IFN-gamma)의 분비를 촉진시키게 된다. 이러한 반응들이 이루어질 때 T 세포와 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 비율이 1:5가 되도록 혼합하여 3일간 배양하였다. 3일 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience), 항-CD8 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 처리하고, 4℃에서 30분간 염색하였다. 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 T 세포의 증식 정도를 분석하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 또한, 상기 3일 배양 후 얻어진 상층액을 분리한 뒤 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 IFN-gamma의 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC) 모두 T 세포의 증식을 유도하였지만, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 CD4+ T 세포에 대한 증식 유도 능력이 훨씬 낮게 관찰되었다.
또한, 도 14에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 낮은 수준으로 IFN-gamma의 분비를 유도하는 것을 볼 수 있었다.
[실시예 12] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 조절 T 세포 분화 조절
동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)와 그 비율이 10:1, 5:1 또는 1:1이 되도록 하여 5일 동안 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는 ODN1826로 자극된 것(ODN +)과 미자극 된 것(ODN -)을 사용하였다. 배양 후 5일 째에, 세포들에 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)로 4℃에서 30분간 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 (ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후 항-Foxp3 (PE, ebioscience)를 염색하여 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통해 조절 T 세포로의 증식 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 15의 (a)에 나타내었다. 또한, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 15의 (b)에 나타내었다.
도 15에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극하는 경우 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우 ODN1826로 자극하자(ODN +) 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식을 현저하게 유도함을 확인할 수 있었으며, T 세포 대비 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 비율이 증가할수록 조절 T 세포의 증식률 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 조절 T 세포의 증식 또한 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.
[실시예 13] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 의한 작동 T 세포의 활성 억제
조절 T 세포는 면역 관용 수지상 세포를 유도하고 다른 T 세포의 증식을 억제한다고 보고되고 있다. 따라서 이하에서는 상기 실시예 12에 따라 Rv1411c 단백질에 의해 분화 유도된 T 세포의 조절 T 세포로서의 활성을 확인하였다.
먼저 마우스의 비장을 분리한 후 적혈구를 제거한 뒤 자기세포분류시스템(MACS)을 사용하여 CD4+, CD25- 작동 T 세포를 분리해 낸 후 증식 정도를 알아보기 위하여 보라색 증식 염색제(violet proliferation dye)로 염색하였다. 이후 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 항 CD3e와 항CD28 항체로 코팅된 웰에서 2일 동안 배양하였다. 그 결과, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정하여 도 16에 그래프로 나타내었다.
도 16에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포 중 ODN1826으로 자극된 세포(Rv1411c-pDC(ODN))에 의하여 유도된 T 세포만이 작동 T 세포의 분화 정도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 작동 T 세포의 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
[실시예 14] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 획득 수율
C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(5×105cell/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 톨 유사 수용체 작용제로 Rv1411c 단백질과 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다. 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수(TLR agonist)를 측정한 결과를 도 17에 그래프로 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.
도 17에서 보는 바와 같이, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLR agonist), 미처리한 경우(Non)와 비교하여 분화 유도되는 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수가 현저히 증가함을 볼 수 있었다.
이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 처리되어, 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 유도하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 분화 완료 이전에 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 분화 유도용 인자는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포에 1회 이상 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 분화 유도용 인자와 동시에 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 1회 이상 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유하는 것인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  12. 제2항에 있어서,
    상기 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리하여 면역 관용성을 활성화시키는 단계를 더 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 관용성을 활성화시키기 위하여 사용되는 상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR9 작용제인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법.
  14. 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는, 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 상기 톨 유사 수용체 작용제가 처리되어 분화 유도된 것인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는 세포 치료제.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포 치료제는 조절 T 세포(regulatory T cells)로의 분화를 유도하는, 세포 치료제.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 세포 치료제는 작동 T 세포(effector T cells)의 활성을 억제하는, 세포 치료제.
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