[go: up one dir, main page]

WO2015194710A1 - Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2015194710A1
WO2015194710A1 PCT/KR2014/010021 KR2014010021W WO2015194710A1 WO 2015194710 A1 WO2015194710 A1 WO 2015194710A1 KR 2014010021 W KR2014010021 W KR 2014010021W WO 2015194710 A1 WO2015194710 A1 WO 2015194710A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
acid
mesenchymal stem
dihydroxy
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2014/010021
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조미라
박성환
양철우
박민정
윤덕규
김석중
이선영
이은정
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Original Assignee
Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea filed Critical Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Priority claimed from KR1020140144100A external-priority patent/KR101705412B1/ko
Publication of WO2015194710A1 publication Critical patent/WO2015194710A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals

Definitions

  • the present invention relates to a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors as an active ingredient.
  • a method for treating a disease caused by an excessive immune response is to alleviate or reduce various symptoms caused by the disease by administering an immunosuppressant alone or in combination.
  • Immunosuppressants refer to a variety of substances used to reduce or block the host's ability to produce antibodies (a humoral immune response) or a cellular immune response to the action of an antigen. Such immunosuppressive agents may be useful for autoimmune diseases such as lupus, rheumatoid arthritis, and skin hypersensitivity reactions such as atopy and allergy as well as organ transplant field. A good immunosuppressant should be able to control the imbalance of the immune response, ensure the safety of the human body, and reduce the incidence of disease recurrence during long-term treatment.
  • immunosuppressive agents include cyclosporin A and FK506, which are compounds derived from natural products with complex chemical structures, which are expensive in terms of supply and demand of raw materials, which are uneconomical and may cause various side effects due to long-term administration. There is a risk. Therefore, there is an urgent need for the development of new immunosuppressive agents capable of economic production with low toxicity and induction of immune tolerance.
  • T cells are one of a group of cells that play a central role in the immune system as a biological defense system against various pathogens.
  • T cells are produced in the thymus of the human body and undergo a series of differentiation processes to differentiate into T cells with unique characteristics.
  • T cells which have completed differentiation, are largely divided into type 1 helper cells (Th1) and type 2 according to their function. It is divided into helper cells (Th2).
  • Th1 cells the main function of Th1 cells is involved in cell mediated immunity
  • Th2 cells are involved in humoral immunity
  • these two cell populations are balanced with each other so that they are not activated with each other.
  • immune diseases can be attributed to the imbalance between these two immune cells, for example, when the activity of Th1 cells is abnormally increased, autoimmune diseases may occur, and the activity of Th2 cells is abnormally increased. It is known that immune diseases occur due to hypersensitivity reactions.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • Th17 cells are known to be formed through a process similar to the differentiation of Treg cells during the differentiation of undifferentiated T cells. In other words, differentiation of Treg cells and Th17 cells occurs in the presence of TGF- ⁇ in common, but does not require IL-6 in Treg cells, whereas IL-6 is present in combination with TGF- ⁇ in Th17 cells. Differentiate in situations where In addition, differentiated Th17 cells are characterized by the secretion of IL-17.
  • Th17 cells Unlike Treg cells, Th17 cells have been found to be involved in the forefront of inflammatory reactions seen in immune diseases, maximizing the signal of inflammatory responses and accelerating disease progression. Therefore, in the case of autoimmune diseases which are not controlled by Treg cells among autoimmune diseases, development of therapeutic agents for autoimmune diseases that target the inhibition of Th17 cell activity has been highlighted.
  • immunosuppressive drugs are immunosuppressants that block signal transduction pathways in T cells. These immunosuppressive agents are toxic, infection, lymphoma, diabetes, tremor, headache, diarrhea, high blood pressure, and nausea. There is a problem that side effects such as renal failure occur.
  • an object of the present invention is to provide a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient.
  • STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • Another object of the present invention is to co-cultivate undifferentiated T cells into Th1 cells and Th17 cells, comprising co-culturing with mesenchymal stem cells treated with a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor. It is to provide a method for inhibiting activity.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • Another object of the present invention is co-culture of undifferentiated T cells with mesenchymal stem cells treated with a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor, Regulatory T cells (Treg: Treg) It is to provide a method for promoting differentiation and activity into).
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • Treg Treg
  • the present invention provides a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • the STAT3 inhibitor is STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12 (2H) -trione), AG-490 ((E) -2-Cyano-3- (3,4-dihydrophenyl) -N- (phenylmethyl) -2-propenamide), Atiprimod; 3- (8,8-dipropyl-3-azaspiro [4.5] decan-3 -yl) -N, N-diethylpropan-1-amine, Auranofin (3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), Aurothiomalate (Sodium) 2- (auriosulfanyl) -3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N- (2-chloro-6-methylphenyl) -2-[[6- [4- (2-)
  • the statin compound is cilastatin (cilastatin), nystatin (nystatin), lovastatin (lovastatin), somatostatin (somatostatin), pravastatin, simvastatin (simvastatin), fluvastatin ( fluvastatin, atorvastatin, atorvastatin, cervastatin, ulinastatin, and rosuvastatin.
  • the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor are inhibited the production of proinflammatory factors and inflammatory cytokines, the differentiation and activity of Th1 and Th17 cells is reduced, regulatory T cells (Regulatory T cells) differentiation and activity of cell: Treg) may be enhanced.
  • COPD chronic obstruct
  • the present invention also provides a method for producing mesenchymal stem cells having the effect of preventing and treating immune diseases, comprising the step of treating a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor to mesenchymal stem cells in vitro.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention comprises co-culturing the undifferentiated T cells with mesenchymal stem cells treated with a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor, the differentiation and activity of Undifferentiated T cells into Th1 cells and Th17 cells It provides a way to suppress.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention comprises co-culture of undifferentiated T cells with mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor, Regulatory T cells (Treg) of undifferentiated T cells Provided are methods for promoting differentiation and activity of furnaces.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • Mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor according to the present invention can effectively inhibit the expression and production of inflammatory cytokines and inflammatory factors in mesenchymal stem cells, and when co-cultured with undifferentiated T cells under pathogenic conditions, T cells Cytotoxicity of the cells has the effect of inhibiting the differentiation of Th17 and Th1 cells and promotes the differentiation and activity of immunoregulatory T cells (Tregs), which have the property of inhibiting the function of abnormally activated immune cells and controlling the inflammatory response. The effect is excellent. Therefore, mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors can be used as cell therapeutic compositions that can prevent or treat immune diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, and transplant rejection diseases caused by abnormalities in the regulation of various immune responses.
  • immune diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, and transplant rejection diseases caused by abnormalities in the regulation of various immune responses.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the expression level of IL-10, IDO, TGF-beta and HGF in the cells of the mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the cell phenotype in mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors.
  • Figure 4 shows the result of confirming whether the STAT3 inhibitor maintains the function of the stem cell itself according to maintaining the differentiation capacity of the treated mesenchymal stem cells.
  • Figure 5a is a factor related to the movement of mesenchymal stem cells, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 in order to determine whether the adipose-derived mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors have the ability to move to the lesion site. And the result of analyzing the expression level of CXCR4 by real-time PCR.
  • Figure 5b is a result confirming the degree of cell migration of mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors.
  • FIG. 6 shows IL-17 expression changes in T cells induced by mesenchymal stem cells by co-culturing T cells cultured in Th17 cell differentiation conditions with mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitor and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitor. It shows the result of analysis.
  • Figure 7 shows the differentiation of Th1 and Th17 cell differentiation of undifferentiated T cells by mesenchymal stem cells by co-cultured T cells with mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors under Th17 cell differentiation conditions, respectively. The results are analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 8 is a flow cytometer for Treg cell differentiation of undifferentiated T cells by mesenchymal stem cells by co-culturing T cells with mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors under Th17 cell differentiation conditions. The analysis results are shown.
  • Figure 9 shows the degree of IL-10 production in T cells by mesenchymal stem cells by co-cultured T cells cultured in Th17 cell differentiation conditions with mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitor and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitor. It shows the result of analysis.
  • Figure 10 shows the results of analyzing the arthritis evaluation index, IgG and inflammatory cytokines in order to determine whether the STAT3 inhibitor is treated with mesenchymal stem cells treated with rheumatoid arthritis.
  • the present invention is characterized by providing a cell therapeutic composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • cell therapies as a therapeutic agent for various diseases including cancer as well as the conventional immune diseases, and the cell therapy technology using stem cells are being developed in particular, the cell therapy has the advantage of less side effects than the conventional compound treatment There is a problem of low therapeutic effect.
  • the present inventors are developing a cell therapy for the treatment of immune diseases with a low therapeutic side effect and excellent therapeutic effect.
  • the present invention can effectively prevent and treat immune diseases. Found.
  • STATs are transcription factors having seven subunit forms of STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, and STAT6.
  • STATs include N-terminal domain (ND), coiled-coil domain (CCD), DNA-binding domain (DBD), linker domain (LD), Src homology 2 (SH2) and transcriptional activation domain (TAD) It shares six distinct structural domains, among which STAT3 has critical tyrosine and serine residues (Tyrosine 705, Serine 727 residues for STAT3) at the C-terminus that is phosphorylated by activation.
  • STAT3 is continuously activated through various pathways and promotes tumor formation, and STAT3 is also used for various cytokines, growth factor-interferons, and epidermis.
  • Growth factor platelet-derived growth factor, interleukin5, interleukin6, hepatocyte growth factor, leukemia inhibitory factor (LIF), bone morphogenetic protein2, hormone leptin, carcinogenic proteins such as Src and Ras in response to Tyrosine 705, Serine 727 It is activated through phosphorylation at two residues of.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • STAT3 is a transcriptional regulator involved in the transcription of several genes in human cells. Normally, STAT3 in the cytoplasm moves into the nucleus in response to signaling by cytokines or growth factors from the outside. Regulate genes for development, differentiation, growth, survival, angiogenesis, and immune function, but if STAT3 is abnormal, STAT3 plays an important role in cancer development. A large number of malignancies, animal model experiments, and activated STAT3 have been found in cancer patients, and STAT3 regulates the expression of many different genes that cause and develop cancer.
  • STAT3 is known to inhibit the expression of mediators necessary for immune activation against tumor cells, and the activity of STAT3 also promotes the production of factors that activate STAT3 in various immune cells while altering gene expression programs. It also suppresses the reaction.
  • the immune system controls specific immune responses to autoantigens under normal conditions, and also suppresses immune responses against external antigens.
  • the pregnant woman's response to fetuses and immunity to chronic infections Reaction are known to be induced by clonal deletion, clone anergy and active control by immunoregulatory T cells (Tregs) as a mechanism by which antigen-specific immunotolerance can be induced.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • Investigation of some patients who accidentally acquired immunotolerance against or experimentally induced animal models showed that all three of these mechanisms are involved in graft-immunity tolerance. It is attracting attention as an important cell involved in controlling almost all immune responses of the living body such as autoimmune, tumoral immunity, infectious immune response as well as immune response.
  • immunoregulatory T cells ie immunoregulatory T lymphocytes (Tregs), whose presence has recently been identified, can be largely divided into natural and adaptive Treg cells, and CD4 + CD25 + T cells, which are natural Tregs, are cells.
  • Tregs immunoregulatory T lymphocytes
  • CD4 + CD25 + T cells which are natural Tregs
  • the mechanism of immunosuppression of this cell is not yet known, but it has recently been discovered that the expression control factor of the gene, Foxp3, plays an important role in the differentiation and activity of the cell.
  • peripheral natural T cells can be differentiated into cells that exhibit immunosuppressive effects upon stimulation of autologous or external antigens under certain circumstances, which are called adaptive or inducible Tregs and secrete IL-10. These include Tr1, Th3 and CD8 Ts that secrete TGF- ⁇ .
  • T cells are also differentiated into Th17 cells through differentiation in addition to Treg cells.
  • Th17 cells are formed in the presence of TGF- ⁇ in common with Treg cells, but IL- for Treg cells.
  • Th17 cells are characterized by differentiating in the presence of IL-6 with TGF- ⁇ and secreting IL-17.
  • Th17 cells are characterized by cytotoxicity, which maximizes the signal of the inflammatory response and accelerates disease progression. Therefore, inhibition of differentiation or activity into Th17 cells is one of the ways to treat immune diseases.
  • the present inventors have developed a cell therapy with excellent therapeutic effect as a previously developed immune disease treatment agent, mesenchymal stem cells cultured by treating the mesenchymal stem cells with an inhibitor that can inhibit the expression and activity of STAT3 is immune disease
  • mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors inhibit the production of inflammatory factors and inflammatory cytokines, and differentiate Th1 and Th17 cells. And activity was reduced, it was confirmed that the differentiation and activity of Regulatory T cells (Treg) is enhanced. Therefore, the present invention can provide a cell therapeutic composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient.
  • STAT3 Simal transducer and activator of transcription 3
  • the STAT3 inhibitors that can be used in the present invention include, but are not limited to, STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12 (2H) -trione), AG-490 ((E) -2-Cyano-3- (3,4-dihydrophenyl) -N- (phenylmethyl) -2-propenamide), Atiprimod; 3- (8,8-dipropyl-3-azaspiro [4.5 ] decan-3-yl) -N, N-diethylpropan-1-amine), auranofin (3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), orosiomaleate (Aurothiomalate; Sodium 2- (auriosulfanyl) -3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N- (2-chloro-6
  • the STAT3 inhibitor is treated with a concentration of 0.1uM ⁇ 100uM in mesenchymal stem cells of 1x10 5 ⁇ 1x10 7 cells to incubate for 24 to 72 hours at a temperature of 37 °C to obtain mesenchymal stem cells excellent in the treatment of immune diseases. have.
  • statin-based compounds are cilastatin, nystatin, lovastatin, lovastatin, somatostatin, pravastatin, simvastatin, fluvastatin It may be selected from the group consisting of atorvastatin, atorvastatin, cervastatin, cerinastatin, ulinastatin, and rosuvastatin.
  • mesenchymal stem cells used in the present invention are stem cells that are separated from bone marrow, blood, dermis and periosteum, and are pluripotent capable of differentiating into various cells such as adipocytes, chondrocytes and bone cells. ) Or multipotent cells.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells of animals, preferably mammals, and more preferably human, and are mesenchymal stem cells of mice according to an embodiment of the present invention.
  • Mesenchymal stem cells are present in very small amounts in bone marrow and the like, but the process of isolating and culturing them is well known in the art and is disclosed, for example, in US Pat. No.
  • the mesenchymal stem cells can be obtained by separating them from the hematopoietic stem cells of bone marrow according to a known method and then proliferating without losing differentiation ability.
  • mesenchymal stem cells are isolated from mammalian, preferably human, mesenchymal stem cell sources, such as blood or bone marrow, including humans or mice.
  • the bone marrow can be extracted from the tibia, femur, spinal cord or iliac bone. Cells are then obtained from the bone marrow and these cells are cultured in a suitable medium. Suspension cells are removed during the culturing process and passaged cells attached to the culture plate to obtain finally established mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the above process any medium commonly used for culturing stem cells can be used.
  • the medium contains serum (eg fetal calf serum, horse serum and human serum).
  • Mediums that can be used in the present invention are, for example, RPMI series, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc.Exp. Bio.Med., 73: 1 (1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc.
  • the medium may include other components such as antibiotics or antifungal agents (eg, penicillin, streptomycin), glutamine, and the like. General descriptions of media and cultures are described in R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984), which is incorporated herein by reference.
  • identification of mesenchymal stem cells can be performed, for example through flow cytometry.
  • flow cytometry is performed using specific surface markers of mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells show a positive response to CD44, CD29 and / or MHC class I.
  • the mesenchymal stem cells used in the present invention show a positive response to surface markers CD44, CD29 and MHC class I, and negative for CD14, CD34, CD45, CD54, MHC class II and CD11b.
  • Indicates a reaction Indicates a reaction.
  • the term positive reaction used while referring to stem cells and surface markers means that the antibody specifically binds to the surface antigens of the stem cells when the stem cells are treated with an antibody against the surface markers.
  • mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor of the present invention inhibit or reduce the differentiation of undifferentiated T cells into Th17 cells that secrete inflammatory cytokines, or control T cells that can normally regulate excessive immune responses.
  • the STAT3 inhibitor of the present invention inhibit or reduce the differentiation of undifferentiated T cells into Th17 cells that secrete inflammatory cytokines, or control T cells that can normally regulate excessive immune responses.
  • the activity means that all the mechanisms of the regulatory T cells (Treg), ie, Treg cells including both natural and adaptive Treg cells, are promoted or promoted in vivo.
  • Treg regulatory T cells
  • the immunomodulatory action such as an immunosuppressive reaction is promoted or promoted so that the immune response in vivo is maintained in a normal state.
  • the amplification refers to the differentiation and proliferation of undifferentiated T cells into regulatory T cells
  • 'differentiation' is a phenomenon that the structure or function of each other during the division and growth of cells, that is, the organism Cells or tissues are changed in form or function in order to perform a given task
  • 'proliferation' refers to the division of cells and homogeneous ones, which usually increase the number of cells in the body of a multicellular organism. I say going.
  • the immune disease means a disease in which components of the mammalian immune system cause, mediate or otherwise contribute to the pathology of the mammal.
  • stimulation or interruption of an immune response may include any disease that has a compensatory effect on the progression of the disease, and in the present invention may include diseases caused by an overactive immune response.
  • immune diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases; Inflammatory diseases; And transplant rejection of cells, tissues, or organs.
  • the immune disease of the present invention is not limited thereto, but is not limited thereto, rheumatoid arthritis, asthma, dermatitis, psoriasis, cystic fibrosis, late organ transplantation, and chronic Post transplantation late and chronic solid organ rejection, Multiple Sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma (scleroderma), Addison disease, vitiligo, pernicious anemia, glomerulonephritis and pulmonary fibrosis, inflammatory growth disease (Inflammatory Bowel Imses), autoimmune diabetes (Autoimmune) Diabetes, Diabetic retinopathy, Rhinitis, Ischemia-reperfusion injury, Post-angioplasty r estenosis, Chronic obstructive pulmonary diseases (COPD), Graves disease, Gastrointestinal allergies, Conjunctivitis, Atherosclerosis, Coronary artery disease An
  • an immune response occurs to autoantigens, which causes the attack of one's own tissue.
  • the disease caused by this process is called an autoimmune disease. .
  • Inflammatory diseases include excessive necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and IL-1 (interleukin- ⁇ ) secreted by immune cells such as macrophages due to excessive stimulation of the human immune system due to harmful stimuli such as inflammation-inducing factors or irradiation.
  • TNF- ⁇ necrosis factor- ⁇
  • IL-1 interleukin- ⁇ secreted by immune cells such as macrophages due to excessive stimulation of the human immune system due to harmful stimuli such as inflammation-inducing factors or irradiation.
  • inflammatory substances inflammatory cytokines
  • IL-6 IL-6
  • prostagladin luecotriene
  • nitric oxide nitric oxide
  • T cell The major mediator of GCC is T cell, which is induced by the T cell receptor to recognize the major histocompatibility complex (MHC) expressed in the graft.
  • MHC major histocompatibility complex
  • immunosuppressive agents are used to reduce the graft immune rejection response.
  • the common purpose of these immunosuppressive agents is to suppress T cell-mediated immune responses against the graft.
  • transplantation is achieved by suppressing the immune response using regulatory T cells. Attempts have been made to treat rejection diseases.
  • composition according to the present invention can be used as a pharmaceutical composition, preferably a cell therapy composition that can prevent or treat immune diseases.
  • treatment means to reverse, alleviate, inhibit the progression of, or prevent a disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition, unless otherwise stated,
  • treatment or therapy of immune diseases in a mammal may comprise one or more of the following:
  • composition for preventing or treating an immune disease according to the present invention may include mesenchymal stem cells treated with a pharmaceutically effective amount of a STAT3 inhibitor alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of an immune disease.
  • the pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition for preventing or treating immune diseases according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient is determined by the route of administration, age, sex, It may be appropriately selected according to various factors such as the weight and the severity of the patient, and the composition for preventing or treating an immune disease according to the present invention is combined with a known compound having the effect of preventing, ameliorating or treating the symptoms of an immune disease. It may be administered, preferably parenterally. When administered parenterally, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by intravenous infusion, subcutaneous infusion, intramuscular infusion, intraperitoneal infusion, or the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the recipient. Can be.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably from 1 x 10 3 per 1 - a 1 x 10 12 cells / kg.
  • the present invention can provide a method for producing mesenchymal stem cells having the effect of preventing and treating immune diseases, comprising the step of treating a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor to the mesenchymal stem cells in vitro. And co-culturing the undifferentiated T cells with mesenchymal stem cells treated with a signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) inhibitor. It can provide a method of suppressing.
  • STAT3 signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention comprises co-culturing undifferentiated T cells with mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor, to regulated T cells (Treg) Methods for promoting differentiation and activity can be provided.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • a method of reducing or inhibiting differentiation of undifferentiated T cells into Th17 cells in vitro and a method of activating regulatory T cells include STAT3 in a medium for culturing the T cells.
  • the inhibitor-treated mesenchymal stem cells may be added and cultured together, or the medium for culturing the T cells may be cultured by treating the STAT3 inhibitor and mesenchymal stem cells together.
  • the present inventors conducted the experiment as follows to determine whether the STAT3 inhibitor is effective in inhibiting STAT3 activity and inhibiting inflammation and tumor factor at the same time.
  • the adipose tissue obtained by liposuction or the adipose tissue obtained after surgery is washed 10 times or more with PBS containing 10% penicillin-streptomycin to remove blood and foreign matter, and then the tissue is chopped to 0.2-0.3 g. Cut.
  • the solution was added to a 0.2% collagenase (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) solution and reacted at 37 ° C. in a water bath at 100 rpm for 1 hour. After separating the solution layer and the undecomposed fragments by collagenase using a 100 ⁇ m mesh, an equal amount of PBS was added to the separated collagenase solution. Subsequently, centrifugation was performed at 4 ° C.
  • MSC basal medium (Cambrex, Walkersville, MD, USA), mesenchymal cell growth aid (Cambrex, Walkersville, MD, USA), 4 mM to remove remaining collagenase solution from submerged MSC L-glutamine and penicillin (0.025 unit / 500 mL) / streptomycin (0.025 mg / 500 mL)] was added again centrifuged for 5 minutes at 4 °C, 1200 rpm.
  • MSCGM is a medium based on Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing fetal calf serum. Subsequently, the supernatant was removed, and the obtained MSC was inoculated in a culture plate and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator with MSCGM. Incubate while replacing the culture medium every other day.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the isolated and cultured mesenchymal stem cells were treated with STA-21, a STAT3 inhibitor, and analyzed for STAT3 expression in mesenchymal stem cells.
  • adipose derived mesenchymal stem cells were treated with 5 mM and 10 ⁇ M STA-21 drugs, respectively, based on the number of 2 ⁇ 10 5 cells, and cultured under 37 ° C. to prepare mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors.
  • mesenchymal stem cells that were not treated with the STAT3 inhibitor were used as controls, and the amount of STAT3 in the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor was analyzed by Western blot.
  • HMGB-1, IL-6, IL-1beta was significantly reduced by 2 to 10 times compared to the group without inhibitor.
  • the present inventors have found that by treating the mesenchymal stem cells with STAT3 inhibitors, the mesenchymal stem cells with STAT3 inhibition can be used as cell therapy for the treatment of immune diseases.
  • the present inventors first isolated and cultured mesenchymal stem cells from peripheral blood in order to investigate the efficacy of STAT3 inhibitor-treated mesenchymal stem cells (MSCs), that is, to separate the PBMC after collecting 50cc of blood from normal people After incubation for 5 days in a-MEM medium containing 20% FBS cells were removed on the culture medium. Thereafter, the medium was changed at three-day intervals, and cells were removed from the culture plate and cultured again according to the degree of proliferation, and this culture was performed three times (passage 3) to obtain mesenchymal stem cells from peripheral blood. In addition, cell markers were identified to confirm whether the obtained cells were mesenchymal stem cells. As a result, the cells isolated by confirming that CD105 + CD29 + CD44 positive and CD34, CD45, HLA-DR negative were identified as mesenchymal stem cells. Confirmed.
  • MSCs STAT3 inhibitor-treated mesenchymal stem cells
  • the isolated mesenchymal stem cells were treated with STAT3 inhibitors AG-490 and sta-21 in amounts of 5uM and 10uM based on 1x10 5 cells of mesenchymal stem cells.
  • IL-10, IDO, TGF-beta and HGF genes related to immunomodulatory activity were analyzed in mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors and mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors.
  • the amount of mRNA expressed in the cell was analyzed by real-time PCR, and the primer sequences used in PCR to analyze the expression level of each gene are as follows.
  • mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors such as AG-490 and sta-21 showed up to a 20-fold increase in IL-10 expression compared to mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors.
  • IDO expression was up to 2 times
  • TGF-beta expression was up to 7 times
  • HGF expression was up to 10 times higher.
  • the present inventors performed a phenotypic analysis to determine whether the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitors did not change in the phenotype of the mesenchymal stem cells and the cells not treated with the inhibitors, that is, the culture medium to which the STAT3 inhibitors were added and the inhibitors were used. Each cultured cell was removed from the culture medium without addition, and FACS analysis was performed using an antibody labeled with streaks related to the phenotype of mesenchymal stem cells. CD105, CD29 and CD44 were used as positive markers of mesenchymal stem cells, and CD45 and HLA-DR were used as negative markers.
  • the differentiation test was performed on adipocytes, bone cells, and chondrocytes using differentiation-inducing culture medium of different compositions.
  • Fat cells, bone cells, cartilage cells, each of the differentiation culture medium into a dedicated culture within the mesenchymal stem cells were used for differentiation kit (R & D, # sc006) , then it gave crushing the cells in 24-well plates, each 1x10 4 Kit 3 Every 4 days the medium was changed and incubated for 2-3 weeks. Then, after staining with each detection Ab, DAPI, it was observed by fluorescence microscope.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors are capable of cell migration, they can move to the lesion site, which are factors related to the movement of mesenchymal stem cells, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, and CCR9. And the expression level of CXCR4 was analyzed by real-time PCR.
  • CCR2 (about 3 times), CCR3 (about 3 times), CCR4 (about 3 times), in mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors compared to the group without treatment with STAT3 inhibitors,
  • the expression of CCR7 (about 5 fold) and CCR9 (about 4 fold) was significantly increased.
  • the present inventors used the ct-3422 product (pore size 8 micro M, polycarbonate) to determine whether the migration ability is increased by increasing cytokine expression, MSC 1x10 on the upper chamber (upper chamber) 4 / 100ul Serum Free-DMEM was added to the lower chamber (lower chamber) was added 300ul of serum free media containing 10ng / ml of SDF-1 and incubated for one day, the number of cells moved the next day.
  • the present inventors have excellent immunomodulatory ability in the co-culture of T cells and mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor of the present invention under Th17 conditions, which are inflammation and disease causing conditions. In order to investigate whether it can be used as a cell therapy for immune diseases, the following experiment was performed.
  • CD4 T cells were isolated from DBA1 / J normal mouse group, and CD3 0.5ug / ml, CD28 1ug / ml, IL-6 20ng / ml, TGF-b 2ng / ml, IFNr mAb, IL- Cells were incubated with differentiation conditions to Th17 cells by treatment with 4 mAb. Thereafter, T cells cultured under Th17 differentiation conditions were co-cultured with the STAT3 inhibitor-treated mesenchymal stem cells used in Example 1, and ELISA was performed to examine the production of IL-17 and IL-10 in the co-cultured mesenchymal stem cells. The degree of Th1 and Th17 cell differentiation and Treg cell differentiation were analyzed by flow cytometry.
  • Flow cytometry analysis was performed using anti-CD4-percp (h1, Th17) and anti-CD4-percp and The cells were treated with anti-CD25-APC (for Treg irradiation) and reacted at 4 ° C. for 30 minutes, followed by permeabilization of the cells, followed by anti-IL-17-PE, anti-IFNr-FITC and Ab anti-Foxp3-PE. After each reaction with fluorescence Ab, it was analyzed by flow cytometry. In addition, mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors were used as controls.
  • inflammatory cytokine IL in T cells was co-cultured with T cells when mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors were co-cultured with T cells even under Th17 cell differentiation conditions.
  • the production of -17 was found to be significantly reduced compared to the control, and the production of IL-10, a cytokine with immunomodulatory activity, was increased.
  • Th1 and Th17 cell differentiation was inhibited by mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors, and Th1 and Th17 cell differentiation was suppressed more effectively than mesenchymal stem cells not treated with STAT3 inhibitors.
  • Treg cells with immunomodulatory ability were more differentiated by mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors, and Treg cells were increased more than mesenchymal stem cells without STAT3 inhibitors. (See FIGS. 7 and 8).
  • the present inventors conducted the following experiments to determine whether the treatment of rheumatoid arthritis in an animal model of rheumatoid arthritis through induction of autoantigen activity of mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors.
  • type II collagen (CII) and CFA (adjuvant) 1: 1 were mixed in DBA / 1J mice, and 100 ⁇ g of CII per mouse was injected at 50 ul into the tail base. Two weeks later, the mixture was mixed with CII and IFA 1: 1. Arthritis animals were prepared by a second injection at 100 ug / 50 ul.
  • Arthritis-induced mice were injected with mesodermal stem cells treated with intravenous 1x10 6 or mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors, three times a week, one week after arthritis-induced mice. And arthritis evaluation was performed. Three weeks after the first inoculation, three observers, who did not know the contents of the experiment, evaluated the severity of the joint inflammation twice a week and observed it for up to 61 days. At this time, arthritis evaluation was averaged by dividing the scores of the three legs except the legs to which CII / CFA was administered at the second dose per dividing according to the following scale, divided by three, and then obtained by three observers in each animal model. The average value divided by summing was used. The scores and criteria according to arthritis evaluation are as follows.
  • IgG antibodies were applied to a 96-well microtitier plate for 2 hours at room temperature, and then diluted 50 ⁇ l of the diluted serum sample was reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solution was washed three times with TBS (pH 8.0) solution containing 0.05% Tween 20 (Amresco), and then the IgG antibody was reacted for 1 hour. After washing with the above solution, the TMB + H 2 O 2 system (KPL , Gaithersburg, MD). This was read as absorbance at 450 nm, and the results of antibody measurements were expressed as absorbance itself.
  • TBS pH 8.0
  • Amresco Tween 20
  • the mouse group treated with mesenchymal stem cells and STAT3 inhibitors showed a significant decrease in IgG antibody secretion (see FIG. 10).
  • the production of inflammatory cytokines, IL-17 and TNF-a was analyzed.
  • LPS (10 mg / ml) was stimulated.
  • Splenocytes were stimulated by administering mesenchymal stem cells treated with STAT3 inhibitors.
  • the cultured supernatant was collected and confirmed the expression level of IL-17 and TNF-a using mouse TNF-a, sandwich ELISA. Specifically, first, monoclonal anti-TNF-a 2 ⁇ g / in a 96-well plate (well plate) The reaction was reacted overnight at 4 ° C. with mL, and after the reaction, non-specific binding was blocked with blocking solution (1% BSA / PBST). IL-17 recombinant and TNF-a recombinant were used as a standard by diluting each successive half of each. Cell culture supernatants were added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF-a was reacted at room temperature for 2 hours, washed four times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, and reacted at room temperature for 2 hours. Then, PNPP / DEA solution was added and developed. After absorbance, absorbance was measured at 405 nm.
  • mice treated with mesenchymal stem cells and STAT3 inhibitors were more significantly inhibited in the production of inflammatory cytokines, IL-17 and TNF-a, compared with the mice injected with mesenchymal stem cells. (See FIG. 10).
  • the present inventors experimented as follows to determine the immunomodulatory ability of the STAT3 inhibitor to the lupus animal model cells of adipose derived mesenchymal stem cells treated.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 간엽줄기세포에서의 염증성 사이토카인 및 염증 유발인자의 발현과 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, 병인조건 하에서 미분화 T 세포와 공조 배양할 경우, T 세포의 세포 독성 Th17 및 Th1 세포로의 분화를 억제하는 효과가 있으며, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 분화 및 활성을 증진시키는 효과가 우수한 특징이 있다. 따라서 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 세포치료제 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료용 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다.
면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다.
현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용이 드는 문제점이 있어 비경제적이고, 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성 및 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 시급하다.
따라서 본 발명의 목적은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 간엽줄기세포에 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 Th1 세포 및 Th17 세포로의 분화 및 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)로의 분화 및 활성을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 스타틴계 화합물은 실라스타틴 (cilastatin), 나이스타틴 (nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴 (somatostatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 심바스타틴 (simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴 (cervastatin), 울리나스타틴 (ulinastatin) 및 로슈바스타틴(rosuvastatin)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 염증유발인자 및 염증성 사이토카인의 생성이 억제되고, Th1 및 Th17 세포의 분화 및 활성이 감소되며, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 분화 및 활성은 증진되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서 간엽줄기세포에 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 Th1 세포 및 Th17 세포로의 분화 및 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)로의 분화 및 활성을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 간엽줄기세포에서의 염증성 사이토카인 및 염증 유발인자의 발현과 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, 병인조건 하에서 미분화 T 세포와 공조 배양할 경우, T 세포의 세포 독성 Th17 및 Th1 세포로의 분화를 억제하는 효과가 있으며, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 분화 및 활성을 증진시키는 효과가 우수한 특징이 있다. 따라서 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 세포치료제 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포를 대상으로 STAT3의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 분석하였고, HMGB-1의 발현 정도, IL-6 및 IL-1 beta 발현 정도를 Real-time PCR로 mRNA레벨을 나타낸 것이다.
도 2는 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 STAT3 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포를 대상으로 세포 내에서 IL-10, IDO, TGF-beta 및 HGF의 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포를 대상으로 세포 표현형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 분화능 유지 따른 줄기세포 자체의 기능을 유지하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 STAT3억제제가 처리된 지방유래 간엽줄기세포가 세포 이동 능력을 가지고 있어 병소부위로 이동이 가능한지 확인하기 위해, 간엽줄기세포의 이동과 관련된 인자인 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4의 발현 정도를 실시간 PCR을 수행하여 분석한 결과이다.
도 5b는 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 세포 이동 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 Th17 세포 분화 조건에서 배양한 T 세포를 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포와 각각 공조 배양하여 간엽줄기세포에 의한 T 세포에서의 IL-17 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Th17 세포 분화 조건에서 T 세포를 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포와 각각 공조 배양하여 간엽줄기세포에 의한 미분화 T 세포의 Th1 및 Th17 세포분화 정도를 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Th17 세포 분화 조건에서 T 세포를 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포와 각각 공조 배양하여 간엽줄기세포에 의한 미분화 T 세포의 Treg 세포분화 정도를 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Th17 세포 분화 조건에서 배양한 T 세포를 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 및 STAT3 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포와 각각 공조 배양하여 간엽줄기세포에 의한 T 세포에서의 IL-10 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포에 류마티스 관절염 치료 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 관절염평가지수, IgG 및 염증성사이토카인 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 STAT3억제제가 처리된 지방유래 간엽줄기세포의 루푸스 동물모델 세포에 미치는 면역조절능력을 확인한 결과이다.
본 발명은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
종래 면역질환 뿐만 아니라 암을 포함하여 다양한 질환의 치료제로서 세포치료제의 개발이 많이 진행되고 있으며 특히 줄기세포를 이용한 세포치료제 기술이 개발되고 있는데, 세포치료제는 종래 화합물 치료제에 비해 부작용이 적은 장점이 있으나 치료 효과가 낮은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 부작용이 적으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료를 위한 세포치료제를 개발하던 중, STAT3 억제제를 처리한 간엽줄기세포를 세포 치료제로 사용할 경우, 면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 발견하였다.
한편, STATs (Signal Transducer and Transcriptions)는 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6의 일곱개의 subunit 형태를 가지는 전사인자이다. STATs은 N-터미널 도메인 (ND), 코일드-코일 도메인(CCD), DNA-바인딩 도메인 (DBD), 링커 도메인(LD), Src 호몰로지2(SH2) 및 전사활성 도메인 (TAD)이 포함된 여섯가지 별개의 구조적 도메인을 공유하며, 그 중에 STAT3는 활성화에 의해 인산화되는 C-말단에 critical tyrosine과 serine 잔기(Tyrosine 705, Serine 727 residues for STAT3)를 가지고 있다.
특히 STAT3는 다양한 경로를 통해 지속적으로 활성화 되어 종양형성을 촉진하는 역할을 하며, 또한 STAT3는 다양한 사이토카인과 성장인자-인터페론, 표피의
성장인자, 혈소판 유래된 성장인자, 인터루킨5, 인터루킨6, 간세포 성장인자, leukemia inhibitory factor (LIF), 뼈 형성유전 단백질2, 호르몬 렙틴, Src와 Ras같은 발암 단백질에 대한 반응으로써 Tyrosine 705, Serine 727의 두 잔기에 인산화를 통하여 활성화된다.
이와 같은 STAT3는 인간 세포에서 여러 유전자의 전사에 관여하는 전사조절인자이며, 정상적인 경우, 외부로부터 사이토카인이나 성장 요소들에 의한 신호전달에 반응하여, 세포질에 존재하던 STAT3는 핵 안으로 이동하여 세포의 발달, 분화, 생장, 생존, 신생혈관합성 그리고 면역기능 등을 위한 유전자들을 조절한다, 그러나 STAT3가 비정상적일 경우 STAT3는 암의 발생에 중요한 기능을 한다. 많은 수의 악성종양, 동물모델 실험, 암 환자에서 활성화된 STAT3가 발견되었으며 STAT3에 의해서 암을 유발하고 발전시키는 여러 다양한 유전자의 발현을 조절한다.
나아가 STAT3는 종양 세포에 대항하는 면역 활성화에 필요한 중재자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있고, 또한, STAT3의 활성은 유전자발현 프로그램을 변경하면서 다양한 면역 세포에서 STAT3을 활성화시키는 인자들의 생산을 촉진함으로써 항암면역 반응을 억제하기도 한다.
한편, 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.
또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
그러나 Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.
한편, 본 발명자들은 종래 개발된 면역질환 치료제로서 보다 치료 효과가 우수한 세포치료제를 개발하였는데, STAT3의 발현 및 활성을 저해할 수 있는 억제제를 간엽줄기세포에 처리하여 배양한 간엽줄기세포가 면역질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 실험을 통해 확인할 수 있었는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 염증유발인자 및 염증성 사이토카인의 생성이 억제되고, Th1 및 Th17 세포의 분화 및 활성이 감소되며, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 분화 및 활성은 증진되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 STAT3 억제제로는 이에 제한되지는 않으나, STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.
또한, 상기 STAT3 억제제는 1x105~1x107 세포수의 간엽줄기세포에 0.1uM~100uM의 농도로 처리하여 37℃의 온도에서 24~72시간 배양하여 면역질환 치료능이 우수한 간엽줄기세포를 수득할 수 있다.
또한, 상기에서 지칭하는 “스타틴계 화합물”은 실라스타틴 (cilastatin), 나이스타틴 (nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴 (somatostatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 심바스타틴 (simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴 (cervastatin), 울리나스타틴 (ulinastatin) 및 로슈바스타틴(rosuvastatin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
여기서 본 발명에서 사용된 "간엽줄기세포"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent)세포를 의미한다. 상기 간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스의간엽줄기세포이다. 간엽줄기세포는 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 간엽줄기세포를 분리한다. 상기 골수는 경골,대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다. 이어, 골수로부터 세포를 얻고, 이들 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 간엽줄기세포를 수득한다. 상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc.
199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham,R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modifA ation of Eagle's medium, Dulbecco, R.et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5a (McCoy, T.A.,et al., Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한, 간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 간엽줄기세포는 표면 마커 CD44, CD29 및 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타내며, CD14, CD34, CD45, CD54, MHC 클래스 Ⅱ 및 CD11b에 대해서는 음성 반응을 나타낸다. 줄기세포와 표면 마커를 언급하면서 사용되는 용어양성 반응은 표면 마커에 대한 항체를 줄기세포에 처리하는 경우, 줄기세포의 표면 항원과 특이적으로 결합하는 양상을 의미한다.
또한, 본 발명의 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 미분화 T 세포가 염증성 사이토카인을 분비하는 Th17 세포로 분화되는 것을 억제 또는 감소시키는 작용, 또는 과도한 면역반응을 정상으로 조절할 수 있는 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 작용을 가짐으로써 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 활성이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.
또한, 상기 증폭(expansion)이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.
본 발명에서 상기 면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 본 발명의 면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군을 포함할 수 있다.
한편, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.
그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 자가면역질환이라고 한다.
또한, 염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.
그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물, 바람직하게는 세포치료용 조성물로 사용될 수 있다.
상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 치료또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역질환을 경감시킴.
(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있으며 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구로 투여되는 경우 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 103 - 1 x 1012 세포/kg 이다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서 간엽줄기세포에 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공할 수 있으며, 또한, 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 Th1 세포 및 Th17 세포로의 분화 및 활성을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)로의 분화 및 활성을 촉진시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법, 및 조절 T 세포를 활성화시키는 방법의 바람직한 방법은, 상기 T 세포를 배양하는 배지에 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 첨가하여 함께 배양할 수 있고, 또는 상기 T 세포를 배양하는 배지에 STAT3 억제제 및 간엽줄기세포를 함께 처리하여 배양할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
STAT3 억제제가 처리된 MSC에서 STAT3 활성 억제와 동시에 염증과 종양인자 억제 효과 분석
본 발명자들은 STAT3 억제제가 처리된 MSC에서 STAT3 활성 억제와 동시에 염증과 종양인자 억제 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
먼저, 지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10％ 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2-0.3 g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2％ 콜라게나아제(Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100 ㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM[mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ㎖)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5％ CO2 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.
상기와 같이 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 STAT3 억제제인 STA-21를 처리한 다음, 간엽줄기세포내 STAT3 발현양을 분석하였다. 구체적으로, 지방유래 간엽줄기세포에는 2x105세포수를 기준으로 5uM 및 10uM의 STA-21 약물을 각각 1mM씩 처리하여 37℃의 온도 조건 하에서 배양하여 STAT3억제제를 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다. 이때, 대조군으로는 STAT3억제제를 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, STAT3억제제를 처리된 간엽줄기세포에서 STAT3양을 웨스턴블롯(western blot)으로 분석하였다.
그 결과, STAT3억제제를 처리하여 제조된 간엽줄기 세포 특이적으로 STAT3의 활성이 억제되었음을 알 수 있었다(도 1A 참조).
또한, STAT3억제제를 처리하여 제조된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자 유전자의 발현 정도를 real time PCR 방법을 사용하여 분석한 결과, 지방조직 유래의 간엽줄기세포에 STAT3억제제를 처리한 경우, STAT3억제제를 처리하지 않은 군에 비해 HMGB-1,IL-6,IL-1beta의 발현정도가 2배에서 10배정도 의미있게 감소되었음을 알 수 있었다.
STAT3 억제제인 STA-21(10uM)을 3일간 처리한 후 세포 용해물(lysate)를 얻어 세포 내 STAT3활성이 억제되었는지 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 시행한 결과, MSC내 STAT3활성이 감소됨을 알 수 있었으며, 이러한 세포내 염증이나 및 종양인자를 realtime PCR로 확인하였다.
그 결과, STAT3 억제제 농도의존적으로 이들 인자의 발현이 감소됨을 알 수 있었다(도 1B 및 C 참조).
표 1 프라이머 서열
프라이머 서열
IL-1beta 정방향 프라이머 TTT GGG TCT TCC CAG AAC C
IL-1beta 역방향 프라이머 TCG TTA TCC CAT GTG TCG AA
IL-6 정방향 프라이머 AAT TCG GTA CAT CCT CGA CGG
IL-6 역방향 프라이머 GGT TGT TTT CTG CCA GTG CC
HMGB-1 정방향 프라이머 GAT CCC AAT GCA CCC AAG AG
HMGB-1 역방향 프라이머 TTC GCA ACA TCA CCA ATG A
따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 STAT3 억제제를 간엽줄기세포에 처리하여 STAT3가 억제된 간엽줄기세포를 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 활용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
STAT3 억제제가 처리된 MSC에 의한 IL-10, IDO, TGF-beta 및 HGF의 발현정도 분석
본 발명자들은 STAT3 억제제가 처리된 간엽 줄기세포(MSC)의 면역질환 치료 효능을 조사하기 위해, 먼저 말초혈액으로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하였는데, 즉, 정상인으로부터 혈액을 50cc 채취한 후 PBMC를 분리하여 20% FBS가 포함된 a-MEM 배지에서 5일간 배양 후 배양액 위에 뜬 세포들은 제거하였다. 이후 3일 간격으로 배지를 교체하였고, 세포증식 정도에 따라 세포를 배양 플레이트에서 떼어 다시 배양하였고 이러한 재배양은 3회 수행하여(passage 3) 말초 혈액으로부터 간엽줄기세포를 수득하였다. 또한, 수득한 세포가 간엽줄기세포인지를 확인하기 위해 세포 표지자를 확인하였는데, 그 결과, CD105+CD29+CD44 양성이며, CD34,CD45,HLA-DR 음성임을 확인함으로써 분리한 세포가 간엽줄기세포임을 확인하였다.
이후 분리한 간엽줄기세포를 대상으로 STAT3 억제제인 AG-490 및 sta-21 을 1x105 세포수의 간엽줄기세포를 기준으로 5uM, 10uM의 양으로 처리하였다.
이후 STAT3 억제제를 처리하여 배양한 간엽줄기세포와 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포를 대상으로 면역조절능과 관련된 유전자인 IL-10, IDO, TGF-beta 및 HGF의 발현정도를 분석하였다. 이 4가지 유전자의 발현정도 분석은 세포내에서 발현되는 mRNA의 양을 실시간 PCR을 수행하여 분석하였고, 각 유전자의 발현 정도를 분석하기 위해 PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
표 2 프라이머 서열
프라이머 서열
IDO 정방향 프라이머 TTT GGG TCT TCC CAG AAC C
IDO 역방향 프라이머 GCG CTG TTG GAA ATA GCT TC
IL-10 정방향 프라이머 CCA AGC CTT GTC TGA GAT GA
IL-10 역방향 프라이머 TGA GGG TCT TCA GGT TCT CC
TGF-beta 정방향 프라이머 TGC GGC AGC TGT ACA TTG A
TGF-beta 역방향 프라이머 TGG TTG TAC AGG GCC AGG A
HGF 정방향 프라이머 CCA CCA TAA TCC CCC TCA CA
HGF 역방향 프라이머 GGC TGG GGC TAC ACT GGA TT
분석 결과, 도 2에 기재된 바와 같이, AG-490 및 sta-21와 같은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 IL-10의 발현이 최대 20배 정도 증가한 것으로 나타났고, IDO의 발현도 최대 2배, TGF-beta의 발현은 최대 7배, HGF의 발현은 최대 10배정도 증가한 것으로 나타났다.
<실시예 3>
STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 표현형 분석
본 발명자들은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포가 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포와 세포의 표현형에 있어서 변화가 있는지 확인하기 위해 표현형 분석을 수행하였는데, 즉, STAT3 억제제가 첨가된 배양액과 상기 억제제를 첨가하지 않은 배양액에서 각각 배양한 세포를 뜯어서 간엽줄기세포의 표현형과 관련된 현광이 라벨된 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 이때 간엽줄기세포의 양성표지자로 CD105, CD29 및 CD44를 사용하였고, 음성 표지자로 CD45, HLA-DR를 사용하였다.
분석결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 억제제가 처리되지 않은 간엽줄기세포 모두 유사한 세포 표현형을 나타낸 것으로 분석되었다. 따라서 STAT3 억제제를 처리한다고 하여 간엽줄기세포 자체의 세포 표현형에는 변화를 유발시키지 않으면서 간엽줄기세포의 면역조절능을 증진시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4>
STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 줄기세포 기능 유지 여부 확인
본 발명자들은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포가 줄기세포 자체의 기능을 유지하는지 여부를 알아보기 위하여 각기 다른 조성의 분화 유도 배양액을 이용하여 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화능 테스트를 시행하였다.
지방세포, 골세포, 연골세포 각각의 분화배양액은 중간엽줄기세포 분화 키트를 사용하였으며(R&D, #sc006), 24웰 플레이트에 세포를 각각 1x104으로 깔아준 후 키트내 전용 배양액을 넣고 3-4일마다 배지를 교환하여 2-3주간 배양하였다. 그런 다음 각각의 detection Ab, DAPI로 염색한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4와 같이 STAT3억제에 따른 중간엽줄기세포 분화능에는 차이를 보이지 않음을 알 수 있었다. 따라서, STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포가 줄기세포 자체의 기능을 잃지 않고 유지함을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 사이토카인 수용체 발현 정도 분석
본 발명자들은 STAT3억제제가 처리된 지방유래 간엽줄기세포가 세포 이동 능력을 가지고 있어 병소부위로 이동이 가능한지 확인하기 위해, 간엽줄기세포의 이동과 관련된 인자인 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4의 발현 정도를 실시간 PCR을 수행하여 분석하였다.
분석 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, STAT3억제제를 처리하지 않은 군에 비 해 STAT3억제제가 처리한 간엽줄기세포에서는 CCR2(약 3배), CCR3(약 3배), CCR4(약 3배), CCR7(약 5배), CCR9(약 4배)의 발현이 확연히 증가되어 있는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 사이토카인 발현 증가에 따른 이동(migration) 능력이 증가되는지 여부를 확인하기 위하여, ct-3422 제품(pore size 8 micro M, polycarbonate)을 사용하여 상부 체임버(upper chamber) 위에 MSC 1x104/100ul Serum Free-DMEM을 넣어주고 하부 체임버(lower chamber)에는 SDF-1 10ng/ml포함된 serum free media 300ul넣고 하루동안 배양한 뒤, 다음날 이동한 세포의 수를 세었다.
그 결과, STAT3억제제를 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 STAT3억제제를 처리한 간엽줄기세포에서 월등하게 이동된 세포가 증가하였음을 알 수 있었다(도 5b 참조).
<실시예 6>
Th17 조건에서 T 세포와의 공조배양에 의한 STAT3 억제제가 처리된 MSC의 면역조절능 분석
본 발명자들은 염증 유발 및 질병 유발 조건인 Th17 조건 하에서, T 세포와 본 발명의 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 공조 배양할 경우에도 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포가 우수한 면역 조절능을 가지고 있어 면역질환을 위한 세포 치료제로 사용될 수 있는지 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, DBA1/J 정상 마우스군으로부터 CD4 T 세포를 분리하였고, 분리된 세포에 CD3 0.5ug/ml, CD28 1ug/ml, IL-6 20ng/ml, TGF-b 2ng/ml, IFNr mAb, IL-4 mAb를 처리하여 Th17 세포로의 분화 조건으로 세포를 배양하였다. 이후 Th17 분화 조건에서 배양된 T 세포를 상기 실시예 1에서 사용한 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 공조 배양하였고, 공조 배양된 간엽줄기세포를 대상으로 IL-17 및 IL-10의 생성정도를 ELISA를 사용하여 분석하였으며, Th1 및 Th17 세포분화 정도와 Treg 세포 분화 정도를 유세포분석기를 통하여 분석하였는데, 유세포기를 이용한 분석은 anti-CD4-percp(h1, Th17 조사용) 및 anti-CD4-percp 와 anti-CD25-APC(Treg 조사용)를 세포에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세포를 permeabilization 한 다음, anti-IL-17-PE, anti-IFNr-FITC 및 Ab anti-Foxp3-PE 형광 Ab로 각각 반응시킨 후, 유세포 분석기로 분석하였다. 또한, 대조군으로는 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포를 사용하였다.
분석 결과, 도 6 및 도 9에 나타낸 바와 같이 염증 유발 및 질병 유발 조건인 Th17 세포분화 조건 하에서도 STAT3 억제제를 처리한 간엽줄기세포를 T 세포와 공조 배양한 경우, T 세포에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성양은 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났고, 면역조절능을 갖는 사이토카인인 IL-10의 생성은 증가한 것으로 나타났다.
또한, Th1 및 Th17 세포분화 정도는 STAT3 억제제를 처리한 간엽줄기세포에 의해 Th1 및 Th17 세포분화가 억제되는 것으로 나타났고, 억제 정도는 STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 더욱 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며, 반면 면역조절능을 갖는 Treg 세포는 STAT3 억제제를 처리한 간엽줄기세포에 의해 더욱 분화가 증가된 것으로 나타났으며, STAT3 억제제를 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 Treg 세포는 더욱 증가된 것으로 나타났다(도 7 및 도 8 참조).
<실시예 7>
STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 류마티스 관절염 치료 효과 분석
<7-1> STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 관절염 지수 평가
본 발명자들은 STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포의 자가항원활성유도를 통한 류마티스관절염 동물모델에서 류마티스 관절염 치료 효과가 있는지를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
먼저, DBA/1J마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(adjuvant) 1:1 로 혼합하여 마우스당 100ug의 CII를 tail base에 50ul 용량으로 주사하였다 2주후, CII와 IFA 1:1로 혼합액을 100ug/50ul로 2차로 주입하는 방법으로 관절염 동물을 제작하였다.
관절염 유도마우스 1주일 후 1주일에 1회 총3회 정맥내 1x106의 복강 내 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포 또는 STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포를 각각 주입하였으며, 각 군은 5마리씩을 대상으로 진행하였고 관절염 평가를 진행하였다. 첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 두 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 61일까지 관찰하였다. 이 때 관절염 평가는 마리당 2차 접종 때 CII/CFA 를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3 으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
투여한 후 관절염 평가를 진행하였다.
그 결과, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 관절염이 더욱 의미있게 억제됨을 알 수 있었다(도 10 참조).
<7-2> STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 항체 조절 효과 분석
또한, STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포에 항체를 조절할 수 있는 효과가 있는지 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
먼저, IgG항체를 상온에서 2시간 동안 96-웰 마이크로필터 플레이트(well microtitier plate)에 도포한 다음 희석해 둔 혈청 샘플을 well당 50㎕씩 넣고 실온에서 1시간 반응 시켰다. 반응이 끝나면 0.05% Tween 20(Amresco)이 포함된 TBS(pH 8.0)용액으로 3번씩 세척 후, IgG항체를 1시간동안 반응시키고, 위의 용액으로 세척한 후 TMB +H2O2 system(KPL, Gaithersburg, MD)으로 발색하였다. 이는 450nm에서 흡광도로 읽었으며, 항체 측정 결과는 흡광도 자체로 표시하였다.
그 결과, 단순히 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 간엽줄기세포와 STAT3억제제가 함께 처리된 마우스군의 경우 IgG 항체 분비가 현저히 감소하였음을 알 수 있었다(도 10 참조).
<7-3> STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포의 염증성사이토카인 분비 조절능 효과 분석
또한, STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포에 염증 조절 효과가 있는지 여부를 알아보기 위하여 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-a의 생성정도를 분석하였는데, LPS(10mg/ml)를 3일간 자극하는 조건에 STAT3억제제가 처리된 간엽줄기세포를 함께 투여하여 비장세포를 자극하였다.
배양된 상층액을 모아 mouse TNF-a, sandwich ELISA를 이용하여 IL-17 및TNF-a 발현 정도를 확인하였는데, 구체적으로 먼저, 96웰 플레이트(well plate)에 단클론성 anti-TNF-a 2μg/mL으로 4℃에서 밤새 반응시켰으며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단시켰다. IL-17 recombinant 및 TNF-a recombinant를 각각 1/2씩 연속 희석하여 스탠다드(standard)로 사용하였고, 세포배양 상층 액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 그리고 나서 바이오티닐(biotinylated) anti-TNF-a를 2시간 동안 실온 반응 시키고 4회 세척 후 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰으며, 이후 PNPP/DEA 용액을 넣고 발색하였고, 발색 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 단순히 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 간엽줄기세포와 STAT3억제제가 함께 처리된 마우스군의 경우 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-a의 생성이 더 유의적으로 억제되었음을 알 수 있었다(도 10 참조).
<실시예 8>
병인 T림프구와의 공조배양에 의한 STAT3 억제제가 처리된 MSC의 면역조절능 분석
본 발명자들은 STAT3억제제가 처리된 지방유래 간엽줄기세포의 루푸스 동물모델 세포에 미치는 면역조절능력을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 하였다.
먼저, 루푸스 동물모델인 Roquin마우스로부터 세포를 분리하여 간엽줄기세포와 1:10의 비율로 3일간 공조배양한 뒤 면역조절 T 세포(Foxp3+Treg)의 활성을 유세포분석법을 통해 분석하였다. 유세포기를 이용한 분석은 anti-CD4-percp(h1, Th17 조사용) 및 anti-CD4-percp 와 anti-CD25-APC(Treg 조사용)를 세포에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 세포를 permeabilization 한 다음, anti-Foxp3-PE 형광 Ab로 각각 반응시킨 후, 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 도11에서 나타낸바와 같이 STAT3억제제를 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군의 경우, 면역조절 T 세포의 활성이 더욱 증가됨을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 염증유발인자 및 염증성 사이토카인의 생성이 억제되고, Th1 및 Th17 세포의 분화 및 활성이 감소되며, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 분화 및 활성은 증진되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 시험관 내에서 간엽줄기세포에 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  7. 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 Th1 세포 및 Th17 세포로의 분화 및 활성을 억제하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미분화 T 세포의 Th1 세포 및 Th17 세포로의 분화 및 활성을 억제하는 방법.
  9. 미분화 T 세포를 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포와 함께 공조 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 T 세포의 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)로의 분화 및 활성을 촉진시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미분화 T 세포의 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)로의 분화 및 활성을 촉진시키는 방법.
PCT/KR2014/010021 2014-06-17 2014-10-23 Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Ceased WO2015194710A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140073719 2014-06-17
KR10-2014-0073719 2014-06-17
KR1020140144100A KR101705412B1 (ko) 2014-06-17 2014-10-23 Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR10-2014-0144100 2014-10-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015194710A1 true WO2015194710A1 (ko) 2015-12-23

Family

ID=54935678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/010021 Ceased WO2015194710A1 (ko) 2014-06-17 2014-10-23 Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015194710A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018133212A1 (zh) * 2016-10-14 2018-07-26 长庚大学 氯硝柳胺及其衍生物的用途
WO2018182612A1 (en) * 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Methods and ingestible devices for the regio-specific release of stem cells at the site of gastrointestinal tract disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100114230A (ko) * 2009-04-15 2010-10-25 서울대학교산학협력단 제대혈 유래 줄기세포를 함유한 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 조성물
KR101160698B1 (ko) * 2003-06-27 2012-06-28 아사히 가세이 가부시키가이샤 세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101160698B1 (ko) * 2003-06-27 2012-06-28 아사히 가세이 가부시키가이샤 세포 분화 억제제, 이것을 이용하는 세포 배양 방법, 배양 배지 및 배양된 세포주
KR20100114230A (ko) * 2009-04-15 2010-10-25 서울대학교산학협력단 제대혈 유래 줄기세포를 함유한 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIN, LI ET AL.: "novel small molecule inhibits STAT3 phosphorylation and DNA binding activity and exhibits potent growth suppressive activity in human cancer cells", MOLECULAR CANCER, vol. 9, no. 1, 2010, pages 217 - 226, XP021077955 *
PARK, YOUNG EUN ET AL.: "IL -15 Induced an Increased SDF-1 Expression in the Synovial Fibroblasts of Patients with Rheumatoid Arthritis", JOURNAL OF RHEUMATIC DISEASES, vol. 17, no. 3, September 2010 (2010-09-01), pages 238 - 245, XP055245097 *
YOON, JIN SEON: "Role of STAT3 In Immunoregulatory Function of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell", SEOUL NATIONAL UNIVERSITY PHD THESIS, August 2009 (2009-08-01) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018133212A1 (zh) * 2016-10-14 2018-07-26 长庚大学 氯硝柳胺及其衍生物的用途
WO2018182612A1 (en) * 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Methods and ingestible devices for the regio-specific release of stem cells at the site of gastrointestinal tract disease

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101705412B1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2018097540A9 (ko) 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
KR101723265B1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2018074758A2 (ko) 면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법
WO2019135645A1 (ko) 인터페론 감마로 전처리된 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 및 이로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 피부질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
WO2014157918A1 (ko) 조절 t 세포로의 분화 유도 및 증식 촉진을 통한 면역 반응 억제용 약학 조성물
WO2017164467A1 (ko) 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조방법
WO2016048107A1 (ko) 인터페론-감마 또는 인터류킨-1베타를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2019198995A1 (ko) 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법
Li et al. Mesenchymal stem cells induced regulatory dendritic cells from hemopoietic progenitor cells through Notch pathway and TGF-β synergistically
WO2017146538A1 (ko) 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019103436A9 (ko) Nk 세포 배양용 조성물 및 이를 이용하여 nk 세포를 배양하는 방법
WO2017146468A1 (ko) 줄기세포의 효능 개선을 위한 조성물 및 방법
WO2015167243A1 (ko) 면역질환 치료효과를 갖는 신규한 화합물 및 이의 용도
KR101819827B1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2015194710A1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015199402A1 (ko) 특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물
WO2015076430A1 (ko) 메트포민을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015023147A1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2020091463A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2018062876A2 (ko) 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트
WO2016117960A1 (ko) 면역질환 치료 효능을 갖는 grim19이 과발현된 중간엽줄기세포 및 이의 용도
WO2022231083A1 (ko) 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2022131700A1 (ko) 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법
WO2018143649A1 (ko) 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14894877

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14894877

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1