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WO2017146538A1 - 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2017146538A1
WO2017146538A1 PCT/KR2017/002096 KR2017002096W WO2017146538A1 WO 2017146538 A1 WO2017146538 A1 WO 2017146538A1 KR 2017002096 W KR2017002096 W KR 2017002096W WO 2017146538 A1 WO2017146538 A1 WO 2017146538A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
icosl
cells
regulatory
cell
hcmsc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/002096
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English (en)
French (fr)
Inventor
송순욱
이택기
이현주
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCM Lifescience Co Ltd
Original Assignee
SCM Lifescience Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US16/069,486 priority patent/US11096967B2/en
Priority to RU2018124640A priority patent/RU2727900C2/ru
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Priority to CN201780009667.XA priority patent/CN108699524B/zh
Priority to EP17756875.5A priority patent/EP3388514B1/en
Priority to JP2018535058A priority patent/JP6580791B2/ja
Priority to AU2017224499A priority patent/AU2017224499B2/en
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention provides a composition for inducing differentiation of CD4 + T cells into regulatory T cells through ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells, and preventing or treating regulatory T cell mediated diseases, and It is about a method.
  • ICOSL Induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL Overexpressing mesenchymal stem cells
  • autoimmune disease One of the most important traits of all normal individuals is their ability to recognize and react and eliminate them against many non-self antigens, while not detrimentally reacting to the antigenic substances that make up self. Is to have.
  • the non-response of the body to autoantigens is called immunologic unresponsiveness or tolerance.
  • Self-tolerance occurs by removing lymphocytes that may have specific receptors for autoantigens, or by inactivating the self-reacting function after contact with autoantigens. When a problem arises in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response occurs to autoantigens, and the resulting disease is called an autoimmune disease.
  • an allergic disease refers to a disease that causes a hypersensitivity reaction of various symptoms only to a specific person due to abnormalities of the immune system and harmless to the average person.
  • the allergen causing substance is called an allergen or an antigen, and pollen, antibiotics, drugs, dust, food, cold air or sunlight may also cause allergies.
  • Symptoms of the allergic disease include urticaria, sneezing, itching, runny nose, cough, hay fever, hyperemia, eczema, rash.
  • Representative allergic diseases include allergic asthma with symptoms such as airway stenosis, increased mucus secretion, dyspnea, coughing, etc.
  • atopic dermatitis, conjunctivitis, rhinitis, and ulcerative colitis are examples of the allergic disease.
  • T cell mediated disease has been recognized as a disease representing a number of immune system diseases, in particular T cells are considered to develop and persist autoimmune diseases.
  • the immune response to autoantigens is achieved by the constant or regular activation of autoreactive T cells, which are directly and indirectly attracted attention as the cause of characteristic tissue injury and tissue destruction found in autoimmune diseases. have.
  • mesenchymal stem cells are known to have immunomodulatory ability to regulate the activity and differentiation of immune cells in addition to multipotent, and to treat T cells, B cells, macrophages, natural killer cells, and dendritic cells in various inflammatory environments. It is known to modulate and inhibit regulatory T cells by inducing immune responses. However, as to the induction of regulatory T cells, little is known about specific regulators and mechanisms of action, and there is still a lack of studies on specific mechanisms and active ingredients for use in the treatment of immune diseases such as autoimmune diseases.
  • the present inventors can induce the induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) on the mesenchymal stem cell surface to differentiate CD4 + T cells into regulatory T cells. In this way, it was confirmed that the production of many regulatory T cells, and can effectively improve T cell mediated diseases, and completed the present invention.
  • ICOSL induced T cell co-stimulator ligand
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating regulatory T cell mediated diseases, including regulatory T cell mediated CD4 + T cells, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells. It is to provide a composition and method for inducing differentiation.
  • regulatory T cell mediated diseases including regulatory T cell mediated CD4 + T cells, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating regulatory T cell mediated diseases, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • regulatory T cell mediated diseases including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • the present invention also provides a composition for inducing differentiation and proliferation of CD4 + T cells into regulatory T cells, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • regulatory T cells including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • the present invention comprises the steps of treating the stem cells with increased expression of ICOSL or ICOSL to CD4 + T cells in vitro; It provides a method for inducing differentiation and proliferation of CD4 + T cells comprising regulatory T cells.
  • Induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention can induce differentiation of regulatory T cells through the PI3K-Akt mechanism by inducing the expression of ICOS of regulatory T cells, Since proliferation of PBMCs can be effectively inhibited, regulatory T cell mediated diseases can be effectively prevented, treated or ameliorated.
  • Figure 1 is a diagram showing the results confirmed by flow cytometry marker expression of hcMSC. Dashed lines indicate staining with homozygous control Ab and solid lines indicate specific expression of each marker.
  • Figure 2 shows the results of confirming the in vitro T cell inhibitory activity of hcMSC through CFSE assay (M; hcMSC, P: CFSE stained PBMC).
  • 3A is a diagram showing the results of Treg differentiation of CD4 + T cells by flow cytometry on Days 2 and 5 under Treg induction conditions
  • B and C are the effects of hcMSC on Treg differentiation of CD4 + T cells
  • Is a diagram showing the results obtained by the FoxP3 and CD25 expression (B) and the increase in FoxP3 + CD4 + CD25 + cells (C) (*, P 0.017).
  • FIG. 4 shows the morphology of CD4 + T cells according to co-culture of hcMSC and CD4 + T cells through optical microscopy (A) and comparing the changes of CD25 + and FoxP3 + in floating CD4 + T cells and adherent CD4 + T cells.
  • (B) is a diagram (blue box: floating CD4 + T cells, red box: hcMSC adherent CD4 + T cells).
  • Figure 5 is a diagram showing the results of comparing the changes in CD25 +, FoxP3 + in co-culture of CD4 + T cells and hcMSC, transwell culture, floating CD4 + T cells, adherent CD4 + T cells.
  • Figure 6 shows the results of confirming the change in ICOSL protein expression of hcMSC (A), the change in mRNA expression (B) according to the co-culture of CD4 + T cells and hcMSC (C) showing the results of ICOSL expression by confocal microscopy (C) (Magnification: x200, x400).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of confirming the change of ICOS protein expression (A) and the expression change of FoxP3, CD25 and ICOS in CD4 + cells by co-culture of CD4 + T cells and hcMSC (B).
  • FIG. 8A is a flow cytometric analysis of the expression changes of FoxP3, CD25 and ICOS following co-culture of CD4 + T cells and hcMSC by anti-ICOSL Ab (10 ⁇ g / mL) ( ⁇ ICOSL) or control Ab (Con Ab) treatment.
  • FIG. 8B and C show IL-10 production of CD4 + T cells following co-culture of CD4 + T cells and hcMSC by anti-ICOSL Ab (10 ⁇ g / mL) ( ⁇ ICOSL) or control Ab (Con Ab) treatment.
  • Figure 9 shows the results of confirming the knockdown result of ICOSL (A) and the change of Treg induction effect (B) according to the knockdown using shRNA (shICOSL) targeting ICOSL through qRT-PCR and flow cytometry analysis.
  • shICOSL shRNA
  • hcMSC ICOSL shows increased expression of ICOSL in hcMSC (hcMSC ICOSL ) with a lentivirus expressing full-length human ICOSL and MSC control (hcMSC Emp ) with the empty vector qRT-PCR (A), Western blot (B). , Shows the results confirmed by flow cytometry (C).
  • FIG. 13 shows the results of confirming the effect of inducing Treg differentiation according to rhICOSL treatment through flow cytometry (A) and confirming the effect of Akt phosphorylation according to rhICOSL treatment through Western blot (B).
  • FIG. 14 shows inhibition of phosphorylation of PI3K-Akt following treatment with PI3K inhibitor LY294002 (5 ⁇ M) and Akt inhibitor GSK690693 (1 ⁇ M) to determine whether PI3K-Akt signaling pathway is involved in ICOSL mediated Treg differentiation. And the result which confirmed the Treg differentiation inhibitory effect (B).
  • Figure 15 shows the difference in ICOSL expression of non-clonal MSC (hncMSC) and hcMSC 1 to 4 by RT-PCR and qRT-PCR (A, B) and their Treg cell induction ability of mixed lymphocyte reaction (mixed lymphocyte) reaction, MLR) and co-culture with PBMC (C) or Treg induction conditions (D) is a diagram showing the results compared.
  • Figure 16 shows the increased expression of ICOSL mRNA according to IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , LPS treatment (A), increase with time-dependent expression of ICOSL mRNA by IL-1 ⁇ (B), IL-1R expression by IL-1 ⁇ The figure which showed the result of having confirmed change (C).
  • FIG. 17 shows the results of ICOSL induction of clonal (hcMSC) and non-clonal MSC (nhcMSC) following IL-1 ⁇ treatment through qRT-PCR (A), Western blot (B), and flow cytometry (C). Is a diagram showing.
  • FIG. 19A is a diagram showing the result of confirming the ratio of CD4 + CD25 + FoxP3 + or CD4 + ICOS + Foxp3 + T cell populations by flow cytometry (hcMSC IL - 1 ⁇ ; IL- 1 ⁇ priming) Priming hcMSC, hcMSC Veh ; IL-1 ⁇ untreated hcMSC).
  • 19B is a diagram showing the results of confirming the effect of reducing CD25 + FoxP3 + Tregs induced by hcMSC IL - 1 ⁇ and normal hcMSC by anti-ICOSL neutralizing antibody treatment ( ⁇ ICOSL).
  • 20 is a schematic view showing a method for preparing a DSS colitis model.
  • 21 is a diagram showing the results of confirming the change in colon length according to hcMSC ICOSL treatment in DSS-induced colitis mouse model.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of regulatory T cell mediated diseases, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • regulatory T cell mediated diseases including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • ICOSL Induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells can promote the differentiation of CD4 + T cells into regulatory T cells and the proliferation of regulatory T cells. Or by inhibiting an autoimmune response, it can be used for the prevention or treatment of regulatory T cell mediated diseases.
  • ICOS of the present invention, also called H4 or AILIM, is a superfamily of CD28, a costimulatory molecule, and is known to increase its expression in activated T cells. ICOS can mediate intracellular signal transduction in combination with B7-H2, B7RP-1, B7h, GL50, and ICOSL, also known as LICOS. ICOSL is a co-stimulatory protein that carries a T cell activation signal and in humans is encoded by the ICOSLG gene (Gene ID: 23308). In addition, ICOSL is known to be abundantly expressed in B lymphocytes, and may be increased in mesenchymal stem cell surface, especially under inflammatory conditions.
  • the ICOSL may be derived from mesenchymal stem cells
  • mesenchymal stem cell derived refers to the ICOSL expressed on the surface of the mesenchymal stem cells or a form in which it is isolated. Therefore, the ICOSL of the present invention may include without limitation any form expressed on the mesenchymal stem cell surface or an isolated form synthesized by recombination thereof.
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells refers to stem cells that the surface expression of mesenchymal stem cells of ICOSL is increased compared to the normal control, the increase in the surface expression of ICOSL induces the introduction of ICOSL gene, expression increased Such genes or protein expression increasing methods known in the art can be achieved without limitation.
  • a lentiviral expressing the full-length human ICOSL gene is introduced into a human clonal MSC (hcMSC) together with a viral packaging contructs to induce an increase in the expression of ICOSL in mesenchymal stem cells and Overexpressing mesenchymal stem cells were prepared.
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells have an excellent ability to promote the differentiation of CD4 + T cells into regulatory T cells (Tregs) and to promote the proliferation of regulatory T cells, and can cause inflammation or autoimmune reactions such as colitis. Can be suppressed more effectively.
  • the stem cells are preferably clonal mesenchymal stem cells (clonal MSC).
  • clonal MSC clonal mesenchymal stem cells
  • ICOSL significantly better than hncMSC (human non clonal MSC).
  • Monoclonal stem cells can be obtained through a method known in the art, but preferably, Song SU, et al.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more species selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta. , Particularly preferably, bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells of the present invention can be understood as a concept that includes not only the stem cell itself but also its culture.
  • the ICOSL of the present invention is expressed on the surface of mesenchymal stem cells, and may be characterized by increasing the expression of induced T cell co-stimulator (ICOS) of T cells.
  • ICOS induced T cell co-stimulator
  • ICOS is expressed on the surface of T cells during T cell activation.
  • CD25 + FoxP3 + Tregs showed higher ICOS expression through co-culture of hcMSC and CD4 + T cells.
  • the ICOSL of the present invention can be characterized by activating the PI3K-Akt signal pathway, through the binding of ICOSL and ICOS on T cells, promotes phosphorylation of Akt in Tregs, PI3K-Akt signaling pathway is activated.
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells are treated with one or more selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1 and LPS (lipopolysaccharide) Characterized in that the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of regulatory T cell mediated diseases.
  • At least one selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1, and LPS (lipopolysaccharide), preferably IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , LPS, most preferably IL-1 ⁇ may play a role in priming stem cells by treating mesenchymal stem cells. More specifically, treating mesenchymal stem cells with one or more selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and LPS (lipopolysaccharide) may induce an increase in the expression of ICOSL in mesenchymal stem cells.
  • the production of ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells can strongly promote regulatory T cell (Treg) differentiation and proliferation.
  • the prepared ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells can be used as a stem cell therapy for the prevention or treatment of regulatory T cell mediated diseases through regulatory T cell (Treg) differentiation and growth promoting effect.
  • the present invention is at least one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells and IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1 and LPS (lipopolysaccharide), preferably IL-1 ⁇ , TNF - ⁇ , LPS, most preferably in the form of a kit comprising IL-1 ⁇ in separate compartments, and selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ and LPS (lipopolysaccharide) to mesenchymal stem cells
  • Pretreatment of at least one, most preferably IL-1 ⁇ to induce overexpression of ICOSL in mesenchymal stem cells, thereby preventing or treating a regulatory T cell mediated disease comprising ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells Can be prepared.
  • regulatory T cell mediated disease means a disease induced by abnormality or deficiency of regulatory T cells, and specifically, may be an inflammatory disease or an autoimmune disease.
  • the inflammatory disease is lupus, Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, fibromyalitis, scleroderma, ankylosing spondylitis, Behcet's disease, aphthral stomatitis, Gili Barre syndrome, alopecia areata, dermatitis, Crohn's disease, colitis, nodular And at least one member selected from the group consisting of polyarteritis, recurrent polychondritis, and autoimmune thrombocytopenia.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, insulin-dependent childhood diabetes due to pancreatic cell antibodies, alopecia areata, psoriasis, asthma, asthma, aphthous stomatitis, chronic thyroiditis, some acquired dysplastic disorders Anemia, primary cirrhosis, ulcerative colitis, Beche's disease, Crohn's disease, silicosis, asbestos, IgA kidney disease, glomerulonephritis after streptococcal infection, Sjoren's syndrome, dermatitis, multiple myositis, multiple sclerosis, Autoimmune hemolytic anemia, autoimmune encephalomyelitis, myasthenia gravis, Grave's hyperthyroidism, nodular polyarteritis, ankylosing spondylitis, fibromyalitis, temporal arthritis, Wilson's disease, FA, congenital syndrome, multiple myel
  • compositions of the present invention may include pharmaceutically acceptable carriers and / or additives and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers for example, sterile water, saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants, surfactants, suspending agents, isotonic agents, preservatives, and the like can be included.
  • organic materials such as biopolymers, inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof, and mixed compositions thereof may be used. However, it is not limited thereto.
  • dextran 40 methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfate, etc.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid palmitate, and L-ascorbic acid.
  • Chelating agents such as acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triacyl gallate, propyl gallate or sodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate can be used.
  • the suspending agent may be, for example, methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragantmal, carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and the like.
  • isotonic agent for example, D-mannitol, sorbitol and the like can be used.
  • preservative for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol and the like can be used.
  • the ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells, the cultures thereof, or the pharmaceutical preparations comprising the ICOSL according to the present invention prepared as described above are combined with other stem cells used for transplantation and other uses using administration methods commonly used in the art. Or it may be administered in the form of a mixture with such stem cells, specifically, it is possible to engraft or implant directly into the disease site of the patient in need of treatment, or directly implanted or injected into the abdominal cavity, but is not limited thereto.
  • the administration can be both non-surgical administration using a catheter and surgical administration such as injection or transplantation after dissection of the disease site, but non-surgical administration using a catheter is more appropriate.
  • the single dose of the stem cells is 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 10 cells / kg body weight, specifically 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 9 cells / kg body weight, more specifically 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg body weight may be administered once or in several doses.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age and gender, and therefore, the dosage may be It does not limit the scope of the present invention in terms of aspects.
  • the present invention comprises the steps of administering ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells to the subject; It provides a method for preventing or treating a regulatory T cell mediated disease comprising a.
  • ICOSL Induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells to the subject; It provides a method for preventing or treating a regulatory T cell mediated disease comprising a.
  • the subject is a mammal, including a human, a patient in need of treatment for regulatory T cell mediated disease, a patient undergoing treatment with regulatory T cell mediated disease, a patient who has been treated with regulatory T cell mediated disease, a regulatory T All patients needing to be treated for cell mediated disease, including those who have undergone surgical operations to treat regulatory T cell mediated disease.
  • ICOSL Induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells can be treated in combination with drugs or methods for the treatment of other regulatory T cell mediated diseases.
  • ICOSL induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention it may be treated simultaneously or sequentially with other drugs or methods for treating regulatory T cell mediated diseases. .
  • the present invention provides a composition for inducing differentiation and proliferation of CD4 + T cells into regulatory T cells, including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • regulatory T cells including induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • differentiation and proliferation induction promotes differentiation of CD4 + T cells into regulatory T cells by direct contact of CD4 + T cells with ICOSL on the surface of mesenchymal stem cells, and induced T cell co-stimulator ligand (ICOSL) or ICOSL.
  • ICOSL induced T cell co-stimulator ligand
  • ICOSL induced T cell co-stimulator ligand
  • the composition is One or more selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1 and LPS (lipopolysaccharide) for the purpose of further promoting the expression of ICOSL in mesenchymal stem cells
  • IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1 and LPS lipopolysaccharide
  • IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , LPS lipopolysaccharide
  • the present invention comprises the steps of treating ICOSL or ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells to CD4 + T cells in vitro; It provides a method for inducing differentiation of CD4 + T cells comprising regulatory T cells.
  • the ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells are at least one selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-2, IL-1 and LPS (lipopolysaccharide), preferably IL- 1 ⁇ , TNF- ⁇ , LPS, and most preferably IL-1 ⁇ , characterized in that the stem cells with increased expression of ICOSL or ICOSL is the ICOS of CD4 + T cells through direct contact with CD4 + T cells May induce increased expression of and promote differentiation into regulatory T cells and proliferation of differentiated regulatory T cells.
  • the treatment may include culturing CD4 + T cells in wells coated with ICOSL or co-culturing CD4 + T cells with ICOSL overexpressing mesenchymal stem cells.
  • hcMSC Human bone marrow was obtained from healthy male volunteers and experiments were performed according to In-In University Hospital's Ethics Committee (IRB # 10-51).
  • hcMSC has been described in Song SU, et al. (2008), Variations of clonal marrow stem cell lines established from human bone marrow in surface epitopes, differentiation potential, gene expression, and cytokine secretion.Stem cells and development 17 (3): 451-461.) was separated by a layered culture method according to. All hcMSCs were cultured in low glucose DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin, and various cell surface markers were identified by flow cytometry on the isolated hcMSCs.
  • Antibodies used in the assay were as follows: anti-CD29 (Serotec, Kidlington, UK), anti-CD44 (Serotec), anti-CD105 (Serotec), anti-CD34 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) , Anti-CD45 (BD Biosciences), anti-CD90 (BD Biosciences), anti-CD73 (BD Biosciences), anti-HLA class I (BD Biosciences), anti-HLA DR (BD Biosciences), anti-CD80 (eBiosciences, San Diego, CA, USA), anti-CD86 (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), and anti-Oct4 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
  • PBMC activity of hcMSC was confirmed by CFSE assay.
  • PBMCs treated with hcMSC and PHA were co-cultured, more specifically 1 ⁇ 10 6 PBMCs were stained with 1 uM CFSE, and the stained PBMCs were stimulated with 1 ug / ml of PHA in the presence or absence of 1 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 6 hcMSCs.
  • PBMCs were harvested and analyzed by flow cytometry and the results are shown in FIG. 2.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • CD4 + T cells were obtained from PBMC using CD4 + T cell Isolation Kit MicroBeads (Miltenyi Biotech, Bisley, Surrey, UK).
  • isolated CD4 + T cells were cultured in complete medium containing RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin to confirm Treg differentiation. 24 well plates were coated with 1 ug / ml anti-CD3 monoclonal antibody at 4 ° C. overnight.
  • purified CD4 + T cells were subject to Treg differentiation. Stimulation with anti-CD3, anti-CD28, IL-2, TGF-bl, and atRA. To confirm Treg differentiation, expression of FoxP3 and CD25 was confirmed on days 2 and 5.
  • CD4 + T cells were cultured alone without co-culture with hcMSC or hcMSC, and the results were analyzed by FoxP3 and CD25 expression analysis and FoxP3 + CD4 + at 1st to 3rd day of culture. It was confirmed through the increase of CD25 + cells and the results are shown in FIG. 3.
  • hcMSC and CD4 + T cells were co-cultured, and the appearance of these cells was confirmed by light microscopy (x400), divided into adherent or suspended forms depending on the presence form, and their CD25 and FoxP3 expression levels were compared by flow cytometry.
  • CD4 + T cells As shown in FIG. 4, the presence of CD4 + T cells in adherent or suspended form was confirmed by optical microscopy (A), and some CD4 + T cells were attached to hcMSC, and more adherent CD4 + T cells were found. CD25 and FoxP3 were expressed. Some CD4 + T cells, on the other hand, remained suspended in the culture medium, and these floating cells expressed less CD25 and FoxP3 than adherent cells (B).
  • transwell assay In order to further verify whether cell attachment affects MSC mediated Treg induction, a transwell assay was performed for 2 days. For transwell assay, CD4 + T cells were cultured in the lower chamber and cultured in the hcMSC upper chamber, and it was confirmed whether or not the induction of Treg-induced effect by hcMSC could be achieved by such a culture method, and the results are shown in FIG. 5. It was.
  • hcMSC did not affect the expression of CD25 and FoxP3 in CD4 + T cells when CD4 + T cells and hcMSCs were cultured separately through a transwell assay.
  • hcMSC mediated Treg induction requires intercellular contact, and that direct interaction between hcMSC and T cells may play an important role in the induction signaling for Treg differentiation in CD4 + T cells.
  • HcMSC and CD4 + Tregs were co-cultured for 2 days under Treg induction conditions and expression of ICOSL protein in hcMSC was confirmed by flow cytometry, mRNA expression was confirmed by qRT-PCR 24 hours after co-culture, and the expression of ICOSL on hcMSC was After removal of adherent CD4 + T cells were confirmed by confocal microscopy through immunofluorescence staining.
  • RNA of hcMSC was measured using EasyBlue RNA isolation reagent (Intron, Biotechnology, Sungnam, Korea) and cDNA was synthesized from 2ug of total RNA.
  • RT-PCR was performed via AccuPower PCR premix (Bioneer). The amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel containing SybrSafe and analyzed via a fluorescence image analyzer.
  • PCR was performed using the following primers: IL-10 (forward 5′-ATCCAAGACAACACTACTAA-3 ′ and reverse 5′-TAAATATCCTCAAAGTTCC-3 ′), IL-1 (forward 5 ′ ′-GCTGAGTGCTGCAAAGTACC-3 ′ and reverse 5 ′ -TGAGGAGGGA -CTTGTGACTG-3 ′), IL-1R (Forward 5′- ATTGATGTTCGTCCCTGT CC-3 ′ and Reverse 5′-CCTCCACCTTAGCAGGAACA-3 ′) and GAPDH (Forward 5′-CCACTGGCGTCTTCACCAC-3 ′ and Reverse 5′-CCTGCT- TCACCACCTTCTTG-3 ′).
  • qRT-PCR was performed using TaqMan probes (Assay ID: Hs00323621_m1; Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) and TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). mRNA levels were normalized to 18s rRNA (Hs03928985_g1) and the results are shown in FIG. 6.
  • ICOS of T cells is up-regulated during T cell activation, and expression of ICOSL of APC can inhibit T cell response through Treg induction.
  • hcMSC influences the ICOS expression of T cells
  • hcMSC and CD4 + T cells were co-cultured for 48 hours under Treg differentiation conditions, and five independent experiments were conducted to induce the ICOS induction of CD4 + T cells in the presence of hcMSC. The result confirmed through FIG. 7 is shown.
  • ICOS was found to increase further in co-culture conditions of CD4 + T cells with hcMSC (A), interestingly CD25 + FoxP3 + Tregs expressed higher ICOS in the presence of hcMSC (B ). These results indicate that hcMSC induces CD4 + T cells to exhibit higher ICOS expression and FoxP3 + Treg phenotype.
  • anti-ICOSL neutralizing antibody was added to co-cultured hcMSC and CD4 + T cells in an amount of 10 ⁇ g / mL.
  • Cell surfaces were stained with FITC or allophycocyanin (APC) -conjugated CD25, APC and PE-conjugated ICOS, FITC-conjugated CD4 (eBiosciences) for 20 minutes in a dark environment at 4 ° C.
  • Co-culture was performed for 2 days and the ratio of FoxP3 + CD25 + and Foxp3 + ICOS + populations was confirmed by flow cytometry.
  • ICOS-ICOSL interaction is important for IL-10 production, and since Treg expression ICOS promotes IL-10 production, production of IL-10 by Tregs induced by hsMSC was analyzed by flow cytometry and ELISA. IL-10 production was confirmed after restimulation of cells with PMA (40 ng / mL; Sigma) and Ionomycin (1 ⁇ g / mL; Sigma) for 5 hours, and Monensin (4 ⁇ M; Sigma) was added for termination of stimulation.
  • ICOSL of hcMSC was knocked down through shRNA (shICOSL) expressing lentiviral infection targeting ICOSL, and thus, the Treg population was confirmed to change expression of Foxp3, ICOS, and CD25.
  • shRNA short-hairpin RNA
  • ICOSL virus particles were added to Santa cruz (Santa cruz biotechnology, Santa cruz, CA, USA). It was purchased from and used.
  • hcMSCs were dispensed on 24-well plates and the next day attachment hcMSCs were added polybrene (5 ⁇ g / mL, Santa Cruz) as a control (shCon) or ICOSL shRNA lentivirus particles (shICOSL) Infected for 24 hours with or without addition. Knockdown of ICOSL was confirmed by qRT-PCR analysis. Infected hcMSC was then used for co-culture with CD4 + T cells under Treg induction conditions, and the change in Treg induction effect according to knockdown results and knockdown is shown in FIG. 9.
  • ICOSL was effectively knocked down by shRNA treatment (A), and by this knockdown, Treg induction of hcMSC was confirmed to decrease in the ICOSL knockdown group (B).
  • ICOSL expression vectors were transfected into 293FT cells using the Lenti-vpak packaging kit (Origene).
  • hcMSC hcMSC ICOSL
  • hcMSC Emp MSC control
  • hcMSC ICOSL GFP increased at, indicating that overexpression of ICOSL was effectively induced.
  • hcMSC ICOSL Induced more CD25 + FoxP3 + Tregs compared to the control with the empty vector, hcMSC ICOSL Tregs induced by expressed more ICOS (A). Also hcMSC ICOSL Is an effector anti-inflammatory cytokine IL-10 by Tregs It was confirmed through flow cytometry and ELISA analysis to further promote the production and secretion of. These results indicate that ICOSL plays a very important role in the induction of MSC-mediated Tregs, which shows that MSC's ICOSL plays a role as an effective Trereg inducer.
  • Treg can induce CD4 + T cells to exhibit a Treg phenotype expressing CD25, FoxP3, ICOS and IL-10 under Treg induction conditions. Since Treg is known to have lymphocyte inhibitory activity both in vitro and in vivo, it was confirmed whether Treg could inhibit the proliferation of activated lymphocytes.
  • CD4 + T cells isolated from PBMC were co-cultured with hcMSC Emp or hcMSC ICOSL for 2 days under Treg induction conditions. Thereafter, CD25 + cells were isolated from CD4 + T cells comprising the Treg population.
  • PBMCs were labeled at a final concentration of 10 7 cells / mL in PBS preheated with 10 uM CFSE.
  • CFB labeled PBMCs were stimulated for 3 days with 1 ⁇ g / mL anti-CD3 mAb (eBiosciences) and 3 ⁇ g / mL anti-CD28 mAb (eBiosciences) and separated from co-cultures of CD4 + T cells with hcMSC ICOSL or hcMSC Emp CD25 + populations were co-cultured with CFSE labeled and activated PBMCs in 1: 5 or 1:10 (Treg: PBMC) for 3 days. Proliferation of PBMC was analyzed by CFSE dilution evaluation flow cytometer and the results are shown in FIG. 12.
  • CFSE analysis showed that 80% of PBMCs were activated in the absence of Tregs, and when co-cultured with Tregs, dividing PBMCs were cell-dependently reduced and immunosuppressed by Tregs. It was confirmed that appears. On the other hand, there was no marked functional difference in PBMC inhibition between hcMSC ICOSL -induced Tregs and hcMSC Emp -induced Tregs.
  • the PI3K-Akt signaling pathway is known to play an important role in the function of T cells, such as the proliferation, migration, differentiation and cytokine production of T cells.
  • T cells such as the proliferation, migration, differentiation and cytokine production of T cells.
  • molecular signal regulation by ICOSL-ICOS interaction during Treg differentiation was confirmed in terms of signal transduction.
  • rhICOSL (5 ⁇ g / mL) (R & D research, Minneapolis, MN, USA), a recombinant human ICOSL, was treated on CD4 + T cells under Treg induction conditions for 2 days, and flow cytometric expression of their CD25, ICOS, and FoxP3 was performed. was analyzed. All experiments were performed five times independently. Specifically, for administration of rhICOSL (R & D research, Minneapolis, MN, USA), the wells were coated with 5 ⁇ g / mL rhICOSL for 4 hours at 37 °C.
  • CD4 + T cells were added to each well at 1 ⁇ 10 6 cells / mL, 1 ng / mL IL-2 (eBiosciences), 5 ng / mL TGF- ⁇ (R & D research, Minneapolis, MN, USA) and 0.1 ⁇ M all Stimulation with 3 ⁇ g / mL anti-CD28 mAb (eBiosciences) with -trans-retinoic acid (atRA; PHASigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • hcMSC2 and CD4 + T cells were co-cultured at 1:10 (hcMSCs: T cells) ratio for 2 days.
  • hcMSC was washed three times with cold PBS containing 0.05 mM EDTA and lymphocytes were isolated from hcMSC. HcMSC was then trypsinized and washed twice with PBS-EDTA solution, and PE-conjugated ICOSL antibody (BioLegend) was added and stained for ICOSL expression analysis. Phosphorylation of Akt following rhICOSL treatment was confirmed by Western blot, and these results are shown in FIG. 13.
  • PI3K (phosphatidylinositide 3-kinases) inhibitor LY294002 or AKt inhibitor GSK690693 was treated to further confirm whether the PI3K-Akt signal pathway is involved and confirmed the result.
  • Akt inhibitor GSK690693 Calbiochem, San Diego, Calif., USA
  • LY294002 Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
  • CD4 + T cells were pretreated with LY294002 (5 ⁇ M) and GSK690693 (1 ⁇ M) for 30 minutes, and treatment of exogenous rhICOSL induced Akt phosphorylation, and PI3K-Akt inhibitors were used to determine rhICOSL induced Akt phosphorylation. It was confirmed whether to inhibit within 1 hour under, and the total Akt was confirmed.
  • the effects of PI3K-Akt inhibition on rhICOSL-induced Tregs induction were treated with LY294002 (5 ⁇ M) or GSK690693 (1 ⁇ M) for 2 days, followed by CD25, ICOS, FoxP3 through culture of rhICOSL-treated CD4 + T cells. It was analyzed through the expression of, the results are shown in FIG.
  • hcMSC4 showed the highest expression of CD25 and FoxP3 in both MLR condition (C) and Treg induction condition (D), and it was confirmed that hcMSC4 is the most effective cell line for Treg induction.
  • Cell lines with higher ICOSL mRNA expression showed higher Treg induction effect.
  • IL-1 ⁇ (10 ng / mL), TNF- ⁇ (10 ng / mL), and LPS (2 ⁇ g / mL) were each treated with hcMSC for 24 hours, and then qRT-PCR, Expression of ICOSL was confirmed after 1 hour and 3 hours.
  • IL-1R expression was changed in hcMSC according to IL-1 ⁇ treatment
  • the expression of IL-1R in hcMSC was confirmed after 24 hours of IL-1 ⁇ treatment. 16 is shown.
  • IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , LPS In all treatment groups, mRNA levels of ICOSL were increased (A, B), and IL-1 ⁇ showed the strongest effect. It is known that IL-1 ⁇ regulates cellular responses through binding to its receptor, IL1 receptor 1 (IL-1R1), and that IL-1R1 is expressed in hcMSCs. As with RT-PCR results, it was confirmed that normal hcMSC expresses mRNA of IL-1R1. Treatment with IL-1 ⁇ (10 ng / ml) also immediately and significantly increased the mRNA of ICOLS, but did not alter the expression of mRNA of IL-1R.
  • hcMSC4 showed better expression induction effect of ICOSL compared to hncMSC
  • an experiment was performed to confirm the difference in ICOSL induction effects of clonal and non-clonal MSCs according to IL-1 ⁇ treatment. Specifically, hncMSC and hcMSC4 were treated with IL-1 ⁇ (10 ng / ml) for 24 hours, mRNA expression of ICOSL was analyzed over time by qRT-PCR, and protein expression changes of ICOSL were analyzed by Western blot and flow cytometry. Confirmed. Flow cytometry was shown as representative of five independent experiments and the results are shown in FIG. 17.
  • qRT-PCR results show that induction of IL-1 ⁇ -stimulated ICOSL appears differently at 6 and 24 hours in hcMSC and hncMSC (A).
  • the difference in ICOSL by IL-1 ⁇ between the two MSCs was the same in Western blot and flow cytometry (B, C).
  • Anti-IL-1 ⁇ antibody (10 ⁇ g / mL), which is an IL-1 ⁇ neutralizing antibody, was used to confirm whether the difference in ICOSL induction effect according to the type of clonal or non-clonal MSCs is represented by IL-1 ⁇ . Treatment to block IL-1 ⁇ function and confirm the change in ICOSL induction effect accordingly, the results are shown in Figure 18.
  • IL-1 ⁇ is a potent priming factor for inducing ICOSL in hcMSCs.
  • hcMSC IL obtained by processing for 24 hours hcMSC in IL-1 ⁇ - a 1 ⁇ under differentiation conditions Treg CD4 + T cells and two days Coculture, and the proportion of CD4 + CD25 + FoxP3 + or CD4 + ICOS + Foxp3 + T cell populations was confirmed by flow cytometry.
  • hcMSC primed with IL-1 ⁇ is hcMSC Veh , an IL- 1 ⁇ untreated hcMSC It was shown to produce more CD25 + FoxP3 + Tregs in comparison with (A). It was also shown that anti-ICOSL neutralizing antibody treatment reduced both hcMSC IL - 1 ⁇ and CD25 + FoxP3 + Tregs induced by normal hcMSC (B). These results indicate that hcMSC primed with IL-1 ⁇ expresses ICOSL and promotes Treg differentiation through activation of the PI3K-Akt signaling pathway.
  • Balb / c female mice were diluted with 4% DSS in drinking water for 0-7 days and replaced with normal drinking water on day 8. Experiments were performed by dividing Balb / c mice into four groups, and such a colitis animal model induction protocol is shown in FIG. 20.
  • hcMSCs were transduced with ICOSL expressing lentiviruses 24 hours prior to DSS administration. Transduced hcMSCs were washed with PBS and resuspended in PBS at 5 ⁇ 10 5 cells / head / 200 ⁇ l density.
  • mice On days 1 and 3, hcMSCs (5 ⁇ 10 5 cells, 200 ⁇ l PBS) were injected intravenously through the tail vein and mice were sacrificed on day 10. Balb / c mice were divided into the following experimental groups: control group (Con, 4 mice), PBS treated colitis group (PBS + DSS, 6 mice), hcMSC ICOSL -injected colitis group (hcMSC ICOSL + DSS, 6 mouse).
  • Colitis severity was checked daily in the DDS-induced colitis mouse model and evaluated by fecal concentration, blood presence and weight loss. The entire colon was removed from the mice and the length of the colon was confirmed by an indirect inflammatory marker.
  • mouse Tregs in the colon cells isolated from mesenteric lymph nodes were incubated with APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-CD4, and PE-conjugated anti-FoxP3 antibodies (eBioscience).
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen and lymph nodes, and the purity of the isolated cells was confirmed by flow cytometry.
  • CD4 + T cells were activated with 1 ug / ml plate attached anti-CD3 mAb and 3 ⁇ g / mL of soluble anti-CD28 mAb, and assays were performed on day 1 and day 2, and the results are shown in FIG. 21.
  • ICOS-ICOSL interaction plays an important role in inducing human Tregs by MSC.
  • hcMSCs can induce ICOSL expression on their surface, which can promote the induction of Tregs through activation of the PI3K-Akt signaling pathway through ICOS expression on Tregs.
  • IL-1 ⁇ is a potent priming factor capable of promoting human Tregs by upregulated ICOSL in hcMSCs.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare tablets.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • Purified water was added to adjust the total volume to 1,00 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.

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Abstract

본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 통해 CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 및 증식을 유도하고, 조절 T 세포 매개성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 PBMC 의 증식을 효과적으로 억제하고, 조절 T 세포의 ICOS의 발현을 유도함으로써 PI3K-Akt 기전을 통해 조절 T 세포의 분화 및 증식을 유도할 수 있으므로, 조절 T 세포 매개성 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

Description

조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 통해 CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화를 유도하고, 조절 T 세포 매개성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self)항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기관용은 자기항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다. 예시적인 자가면역질환의 하나로 알레르기성 질환(allergic disease)을 들 수 있으며, 알레르기성 질환은 면역체계의 이상으로 보통 사람에게는 무해한 물질이 특정인에게만 다양한 증상의 과민반응을 일으키는 질환을 의미한다. 상기 알레르기성 질환을 일으키는 물질은 알레르겐(allergen) 또는 항원이라고 하며, 꽃가루, 항생제, 약물, 먼지, 음식, 찬공기나 햇빛 등도 알레르기를 유발하는 원인이 될 수 있다. 상기 알레르기성 질환의 증상으로는 두드러기, 재채기, 가려움증, 콧물, 기침, 건초열, 충혈안, 습진, 발진 등이 있다. 대표적인 알레르기성 질환으로는 기도협착, 폐점액분비 증가, 호흡곤란, 기침 등의 증상을 동반하는 알레르기성 천식이 있으며, 이외에 아토피 피부염, 결막염, 비염, 및 궤양성 대장염 등이 있다.
이처럼 각종 자가면역체계의 이상에 의해 발생되는 질병과 관련하여, 조절 T 세포의 중요성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 1970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과기 기능(effector funtion)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 억제 T 세포라는 개념을 도입하여 처음으로 제시된 이래(R. K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37), 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다. 특히, 1995년 Sakaguchi에 의해 CD25가 자연 발생 CD4+ 조절 T 세포의 중요한 표현형 마커로서 작용할 수 있음이 제시된 이래(S. Sakaguchi etal., J. Immunol., 1995, 155: 1151-1164), 자가 항원(self-antigen)에 대한 말초 관용(peripheral tolerance)의 유도에 있어 조절 T 세포가 갖는 역할과 중요성에 대한 연구가 중점적으로 수행되었다.
최근에는 T 세포 매개성 질병이 다수 면역계 질환들을 대표하는 질병으로 인식되고 있으며, 특히 T 세포는 자가면역 질환을 발생시키고 영속시키는 것으로 간주되고 있다. 자가 항원에 대한 면역 반응은 자가 반응성 T 세포의 지속적인 활성화 또는 정기적인 활성화에 의해 이루어지며, 자가 반응성 T 세포는 직, 간접적으로 자가면역 질환에서 확인되는 특징적인 조직 상해 및 조직 파괴의 원인으로 주목받고 있다.
따라서 자가면역 질환 및 그 외 T 세포 매개성 질병들에 대한 많은 치료제들이 제시되고 있지만, 여전히 또다른 치료제가 필요한 실정이며 특히 치료제로 활용되기 위해서는 이의 정확한 기전에 대한 연구가 필요하다.
한편, 중간엽줄기세포는 다분화능 외에 면역세포의 활성과 분화를 조절할 수 있는 면역조절능을 가지고 있다고 알려져 있고, 다양한 염증성 환경에서 T 세포, B 세포, 대식세포, 자연살해세포, 수지상세포 등을 조절하며 조절 T 세포를 유도하여 면역반응을 억제할 수 있다고 알려져 있다. 그러나 조절 T 세포에 유도에 관해서는 구체적인 조절인자나 작동 기전에 대해서는 거의 알려져 있지 않아 이를 자가면역질환 등의 면역 질환 치료에 활용하기 위한 구체적인 기전 및 유효 성분에 대한 연구가 아직까지 부족한 상황이다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포와 조절 T 세포 매개성 질환에 대하여 연구하던 중, 중간엽 줄기세포 표면의 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand)이 CD4+ T 세포를 조절 T 세포로 분화되도록 유도할 수 있으며, 이를 통해 많은 조절 T 세포를 생산하고, T 세포 매개성 질환을 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 유도용 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 ICOSL 또는 ICOSL의 발현이 증가된 줄기세포를 in vitro에서 CD4+ T 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 CD4+ T 세포를 조절 T 세포로 분화 및 증식을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 조절 T 세포의 ICOS의 발현을 유도함으로써 PI3K-Akt 기전을 통해 조절 T 세포의 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, PBMC 의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 조절 T 세포 매개성 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.
도 1은 hcMSC의 마커 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 점선은 동형 대조 Ab 로 염색된 것을 나타내며, 실선은 각 마커의 특이적 발현을 나타낸다.
도 2는 hcMSC의 In vitro T 세포 억제 활성을 CFSE 어세이를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (M; hcMSC, P: CFSE 염색된 PBMC).
도 3의 A는 Treg 유도 조건에서의 CD4+ T 세포의 Treg 분화를 2, 5일차에 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이며, B 및 C 는 CD4+ T 세포의 Treg 분화에 미치는 hcMSC의 영향을 FoxP3 및CD25 발현 (B) 및 FoxP3+CD4+CD25+ 세포의 증가를 통해 확인 (C) 한 결과를 나타낸 도이다 (*, P=0.017).
도 4는 hcMSC와 CD4+ T세포 공동 배양에 따른 CD4+ T세포의 형태를 광학 현미경을 통해 확인한 결과 (A) 및 부유성 CD4+ T세포 및 부착성 CD4+ T세포에서의 CD25+, FoxP3+ 의 변화를 비교한 결과 (B)를 나타낸 도이다 (파란 박스: 부유성 CD4+ T세포, 빨간 박스: hcMSC 부착성 CD4+ T세포).
도 5는 CD4+ T세포와 hcMSC의 공동배양, 트랜스웰 배양, 부유성 CD4+ T세포, 접착성 CD4+ T세포에서의 CD25+, FoxP3+ 의 변화를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 CD4+ T세포와 hcMSC의 공동배양에 따른 hcMSC 의 ICOSL 단백질 발현의 변화 (A), mRNA 발현의 변화 (B)를 확인한 결과 및 ICOSL 발현을 공초점 현미경으로 확인한 결과 (C) 를 나타낸 도이다 (배율: x200, x400).
도 7은 CD4+ T세포와 hcMSC의 공동배양에 따른 ICOS 단백질 발현의 변화 (A) 및 CD4+ 세포에서의 FoxP3, CD25 및 ICOS 의 발현 변화 (B) 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8의 A는 항-ICOSL Ab (10μg/mL) (αICOSL) 또는 대조군 Ab (Con Ab) 처리에 의한, CD4+ T세포와 hcMSC의 공동 배양에 따른 FoxP3, CD25 및 ICOS 의 발현 변화를 유세포 분석 및 FoxP3+CD4+CD25+ T 세포 및 FoxP3+CD4+ICOS+ T 세포를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P=0.017, **P=0.049).
도 8의 B 및 C는 항-ICOSL Ab (10μg/mL) (αICOSL) 또는 대조군 Ab (Con Ab) 처리에 의한, CD4+ T세포와 hcMSC의 공동 배양에 따른 CD4+ T 세포의 IL-10 생산을 유세포 분석 (B) 및 ELISA 분석 (C)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (***P=0.03).
도 9는 ICOSL 를 표적화하는 shRNA (shICOSL) 를 이용한 유전자 적중에 따른 ICOSL 의 넉다운 결과 (A) 및 넉다운에 따른 Treg 유도 효과의 변화 (B) 를 qRT-PCR 및 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P = 0.008, **P = 0.013).
도 10은 전장 인간 ICOSL 을 발현하는 렌티 바이러스가 도입된 hcMSC (hcMSCICOSL) 및 공벡터가 도입된 MSC 대조군 (hcMSCEmp) 에서의 ICOSL 의 발현 증가를 qRT-PCR (A), 웨스턴 블랏 (B), 유세포 분석 (C) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 hcMSCICOSL의 Treg 유도 증가 효과 (A) 를 유세포 분석 및 ELISA로 확인한 결과 (*P = 0.045, **P = 0.049) 및 Treg에 의한 IL-10 분비 증가 효과를 유세포 분석 (B) 및 ELISA (C) (***P = 0.034)를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 hcMSCICOSL 또는 hcMSCEmp 의 공동배양물로부터 분리된 CD25+ 집단을 CFSE 표지되고 활성화된 PBMC 와 함께 1:5 또는 1:10 (Treg:PBMC) 로 3일간 공동 배양한 후, PBMC의 증식을 CFSE 희석 평가 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 rhICOSL 처리에 따른 Treg 분화 유도 효과를 유세포 분석을 통해 확인한 결과 (A) 및 rhICOSL 처리에 따른 Akt 인산화 효과를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과 (B) 를 나타낸 도이다.
도 14는 ICOSL 매개된 Treg 분화에 있어서, PI3K-Akt 신호경로가 관여하는지 여부를 확인하기 위하여, PI3K 억제제 LY294002 (5μM) 및 Akt 억제제 GSK690693 (1μM) 처리에 따른 PI3K-Akt 의 인산화 억제 (A) 및 Treg 분화 억제 효과 (B) 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 비클로날 MSC (hncMSC) 및 hcMSC 1 내지 4 의 ICOSL 발현 차이를 RT-PCR 및 qRT-PCR로 확인한 결과 (A, B) 및 이들의 Treg 세포 유도 능력을 혼합 림포사이트 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 에서 PBMC와의 공동 배양 (C) 또는 Treg 유도 조건 (D) 에서 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 IL-1β, TNF-α, LPS 처리에 따른 ICOSL mRNA의 발현 증가 (A), IL-1β 에 의한 ICOSL mRNA의 시간에 발현 따른 증가 (B), IL-1β에 의한 IL-1R 발현 변화(C)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 IL-1β 처리에 따른 클로날 (hcMSC) 및 비-클로날 MSC (nhcMSC)의 ICOSL 유도 효과를 qRT-PCR (A), 웨스턴 블랏(B), 유세포 분석(C)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 항- IL-1β 중성화 항체의 처리에 따른 IL-1β 차단 후의 ICOSL 발현이 유도 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P=0.003).
도 19 의 A는 IL-1β 프라이밍에 따른 CD4+CD25+FoxP3+ 또는 CD4+ICOS+Foxp3+ T 세포 집단의 비율을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (hcMSCIL - 1β; IL-1 β 프라이밍 hcMSC, hcMSCVeh ; IL-1 β 미처리 hcMSC).
도 19의 B는 항-ICOSL 중화 항체 처리 (αICOSL) 에 의하여 hcMSCIL - 1β및 정상 hcMSC 에 의해 유도되는 CD25+FoxP3+Treg 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 20 은 DSS 대장염 모델 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 21 은 DSS 유도된 대장염 마우스 모델에서 hcMSCICOSL 처리에 따른 대장 길이 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포가 CD4+ T 세포가 조절 T 세포로 분화되는 것 및 조절 T 세포의 증식을 촉진할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 염증성 또는 자가면역성 반응을 억제하여 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 "ICOS" 는 H4 또는 AILIM 으로도 불리며 공동자극 분자인 CD28의 슈퍼패밀리이고, 활성화된 T 세포에서 그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. ICOS 는 B7-H2, B7RP-1, B7h, GL50, 및 LICOS로도 알려져 있는 ICOSL 과 결합하여 세포간 신호 전달을 매개할 수 있다. ICOSL은 T 세포 활성화 신호를 전달하는 공동 자극 단백질이며, 인간의 경우 ICOSLG 유전자 (Gene ID: 23308) 에 의하여 암호화된다. 또한 ICOSL은 B 림프구에서 풍부하게 발현되는 것으로 알려져 있으며, 특히 염증성 조건하에서 중간엽 줄기세포 표면에 발현이 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ICOSL 은 중간엽 줄기세포 유래일 수 있으며, “중간엽 줄기세포 유래”는 중간엽 줄기세포 표면에 발현된 ICOSL 또는 이를 분리한 형태를 지칭한다. 따라서 본 발명의 ICOSL은 중간엽 줄기세포 표면에 발현된 형태 또는 이를 재조합하여 합성된 분리 형태를 모두 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 "ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포" 는 ICOSL 의 중간엽 줄기세포 표면 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가되어 있는 줄기세포를 의미하고, ICOSL 의 표면 발현의 증가는 ICOSL 의 유전자 도입, 발현 증가 유도 등 당 분야에 공지된 유전자 또는 단백질 발현 증가방법을 제한없이 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 일 예시에서는 전장 인간 ICOSL 유전자를 발현하는 렌티바이러스를 바이러스 팩킹 구조체 (viral packaging contructs) 와 함께 hcMSC (human clonal MSC) 에 도입하여, 중간엽 줄기세포에서 ICOSL 의 발현의 증가를 유도하고 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 제조하였다. ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 CD4+ T 세포가 조절 T 세포 (regulatory T cell; Treg) 로 분화되는 것을 촉진하는 능력 및 조절 T 세포의 증식을 촉진하는 능력이 우수하며, 염증 또는 자가면역 반응, 예컨대 대장염을 더욱 효과적으로 억제할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 줄기세포는 클로날 중간엽 줄기세포(clonal MSC)인 것이 바람직하다. 본 발명에서는 상기 클로날 중간엽 줄기세포를 사용하는 경우 hncMSC (human non clonal MSC) 보다 현저히 우수한 ICOSL 의 발현을 유도할 수 있음을 실시예 11을 통해 확인하였다. 단클로날 줄기세포는 당분야에 공지된 수득 방법을 통해 얻을 수 있으나, 바람직하게는 Song SU, et al. (2008) (Variations of clonal marrow stem cell lines established from human bone marrow in surface epitopes, differentiation potential, gene expression, and cytokine secretion. Stem cells and development 17(3):451-461.)에 개시된 층분리 배양 수득방법에 따라 분리할 수 있고, 상기 문헌은 본 발명에 참조로서 통합된다. 단클로날 줄기세포는 ICOSL 의 발현이 hncMSC 보다 증가되어 있으며, 조절 T 세포의 분화 유도 효과 역시 hncMSC 보다 우수하여, 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료에 더욱 효과적으로 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상 유래의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)일 수 있으며, 특히 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 줄기세포 자체 뿐만 아니라 이의 배양물을 제한없이 포함하는 개념으로 이해할 수 있다.
본 발명의 ICOSL 은 중간엽 줄기세포의 표면에 발현되고, T 세포의 ICOS (Induced T cell co-stimulator) 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. ICOS 는 T 세포 활성화 동안 T 세포의 표면에 발현되며, 본 발명에서는hcMSC 와 CD4+ T세포의 공동 배양을 통해 CD25+FoxP3+ Tregs 가 더 높은 ICOS 의 발현을 나타냄을 확인하였다.
또한 본 발명의 ICOSL 은 PI3K-Akt 신호경로를 활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, ICOSL 과 T 세포상의 ICOS 의 결합을 통해, Treg 에서 Akt 의 인산화를 촉진하고, PI3K-Akt 신호 경로가 활성화된다.
본 발명의 또다른 양태에서는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 처리된 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 IL-1β, TNF-α, LPS, 가장 바람직하게는 IL-1β 는 중간엽 줄기세포에 처리함으로써 줄기세포를 프라이밍하는 역할을 수행할 수 있다. 보다 구체적으로 IL-1β, TNF-α 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 중간엽 줄기세포에 처리하면, 중간엽 줄기세포에서 ICOSL 의 발현의 증가를 유도할 수 있으며, 이를 통해 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 제조함으로써 조절 T 세포(Treg) 분화 및 증식을 강하게 촉진할 수 있다. 또한 제조된 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 조절 T 세포(Treg) 분화 및 증식 촉진 효과를 통해 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 줄기세포 치료제로 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 IL-1β, TNF-α, LPS, 가장 바람직하게는 IL-1β 을 개별적 구획에 포함하는 키트의 형태로도 제공될 수 있으며, 중간엽 줄기세포에 IL-1β, TNF-α 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 가장 바람직하게는 IL-1β을 전처리함으로써, 중간엽 줄기세포에서 ICOSL의 과발현을 유도하고, 이를 통해 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 “조절 T 세포 매개성 질환”은 조절 T 세포의 이상 또는 결핍에 의하여 유도되는 질환을 의미하며, 구체적으로는 염증성 질환 또는 자가면역성 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 염증성 질환은 루푸스, 쇼그렌증후군, 류마티스 관절염, 섬유근염, 경피증, 강직성 척추염, 베체트병, 아프타 구내염, 길리안바레 증후군, 원형탈모증, 피부근염, 크론병, 대장염, 결절성 다발 동맥염, 재발성 다발 연골염 및 자가면역 혈소판 감소증으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 자가면역성 질환은 류머티스성 관절염, 전신성 경피증, 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 일부 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 실리코시스, 아스베스토시스, IgA 신장질환, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염, 쇼그렌증후군, 길리안-바레증후군, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증, 그레이브씨 갑상선 항진증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 측두동맥염, 윌슨병, 판코니증후군, 다발성 골수종 및 전신성 홍반성 루푸스로 이루어진 군에서 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제, 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 또한, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그 화학적 유도체, 그리고 이들의 혼합조성물을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 안정제로는 예를 들어, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 상기 산화방지제로는 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤,L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨,갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 사용할 수 있다. 상기 현탁제는 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸 셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 사용할 수 있다. 상기 등장화제로는 예를 들어, D-만니톨, 소르비톨 등을 사용할 수 있다. 상기 보존제로는 예를 들어, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산 에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 사용할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명에 따른 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포, 이의 배양물 또는 ICOSL을 포함하는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 구체적으로 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 적절하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다. 상기 줄기세포의 1회 투여량은 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 구체적으로 1.0×105 내지 1.0×10 9 세포/kg 체중, 보다 구체적으로 1.0×106 내지 1.0×108 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 필요로 하는 환자로 조절 T 세포 매개성 질환 치료 중인 환자, 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 받은 적이 있는 환자, 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함하며, 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 위하여 외과적 수술을 시행한 환자 또한 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 이 외 기존의 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 위한 약물 또는 치료방법과 병용하여 처리될 수 있다. 본 발명의 ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 병용 처리하는 경우, 이는 조절 T 세포 매개성 질환 치료를 위한 다른 약물 또는 치료방법과 동시에 또는 순차적으로 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 일 양태로서, ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물을 제공한다.
상기 "분화 및 증식 유도”란 중간엽 줄기세포 표면의 ICOSL 과 CD4+ T 세포의 직접적인 접촉에 의하여 CD4+ T 세포가 조절 T 세포로 분화되는 것을 촉진하고, ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포에 의해 분화 유도된 조절 T 세포의 증식이 촉진되는 것을 의미한다.
상기 조성물은 중간엽 줄기세포에서 ICOSL의 발현을 더욱 촉진하기 위한 목적으로 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 IL-1β, TNF-α, LPS, 가장 바람직하게는 IL-1β 을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있고, 상기 IL-1β, TNF-α 및 LPS 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 중간엽 줄기세포 표면에 ICOSL 의 과발현을 촉진하도록 줄기세포를 프라이밍하는 물질이다.
또한 본 발명의 또다른 일 양태로서, 본 발명은 ICOSL 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 in vitro에서 CD4+ T 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 CD4+ T 세포를 조절 T 세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 IL-1β, TNF-α, LPS, 가장 바람직하게는 IL-1β으로 전처리된 것을 특징으로 할 수 있으며, ICOSL 또는 ICOSL의 발현이 증가된 줄기세포는 CD4+ T 세포와의 직접적인 접촉을 통해 CD4+ T 세포의 ICOS의 발현 증가를 유도하고, 조절 T 세포로의 분화 및 분화된 조절 T 세포의 증식을 촉진할 수 있다.
본 방법에 있어서, 상기 처리는 CD4+ T 세포를 ICOSL 이 코팅된 웰에서 배양하거나 CD4+ T 세포와 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 공동 배양하는 것을 모두 포함할 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예, 실시예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예, 실시예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예, 실시예 및 제제예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 클로날 MSC ( hcMSC ) 의 특성 분석
인간 골수를 건강한 남성 지원자로부터 얻었으며, 인하대학교 병원의 윤리위원회의 스인 (IRB #10-51) 에 따라 실험을 수행하였다. hcMSC를 이전 문헌 (Song SU, et al. (2008), Variations of clonal marrow stem cell lines established from human bone marrow in surface epitopes, differentiation potential, gene expression, and cytokine secretion. Stem cells and development 17(3):451-461.) 에 따른 층분리 배양법으로 분리하였다. 모든 hcMSC를 10% FBS 와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 저 글루코오스 DMEM 배지에서 배양하였으며, 분리된 hcMSC 에 대한 유세포 분석을 통해 다양한 세포 표면 마커를 확인하였다. 상기 분석에 사용된 항체는 다음과 같다: 항-CD29 (Serotec, Kidlington, UK), 항-CD44 (Serotec), 항-CD105 (Serotec), 항-CD34 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA), 항-CD45 (BD Biosciences), 항-CD90 (BD Biosciences), 항-CD73 (BD Biosciences), 항-HLA class I (BD Biosciences), 항-HLA DR (BD Biosciences), 항-CD80 (eBiosciences, San Diego, CA, USA), 항-CD86 (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA), 및 항-Oct4 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). 세포들은 유세포 분석기 (FACS Calibur; BD Biosciences)를 이용하여 분석하였으며, 동형으로 매치된 대조군 항체 (Isotype matched control antibody)를 대조군으로 이용하였다. 유세포 분석을 이용하여 hcMSC 의 표면 마커 발현을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, CD29, CD44, C73, CD90, CD105, Oct-4 및 HLA class I 에 대한 양성, CD34, CD45, 및 HLA-DR 에 대한 음성 발현을 확인하였으며, 공동 자극 인자 CD80, CD86 에 대해서도 음성 발현을 확인하였다.
hcMSC의 In vitro PBMC 활성을 CFSE 어세이를 통해 확인하였다. hcMSC 와 PHA로 처리된 PBMC 를 공동 배양하였으며, 보다 구체적으로 1x106 PBMC 를 1uM CFSE로 염색하고, 염색된 PBMC를 1x105 또는 1x106 의 hcMSC 의 존재 또는 부존재하에서 1ug/ml의 PHA 로 자극하였다. PHA 자극 72 시간 후, PBMC 를 수확하고 유세포 분석기로 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, hMSC 를 PHA 처리로 활성화된 PBMC 와 공동배양한 경우, 이는 PBMC의 증식을 억제하였다.
실시예 2. hcMSC의 Treg 분화 유도 확인
PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) 를 건강한 공여자로부터 얻었으며, ficoll-hypaque 밀도 구배 원심분리를 통해 분리하였다. PBMC로부터 CD4+ T 세포를 CD4+ T cell Isolation Kit MicroBeads (Miltenyi Biotech, Bisley, Surrey, UK)를 이용하여 수득하였다.
먼저 Treg 분화를 확인하기 위하여 분리된 CD4+ T 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린이 보충된 RPMI 1640 함유 완전 배지에서 배양하였다. 24 웰 플레이트를 1ug/ml 항-CD3 단클론 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 또한 정제된 CD4+ T 세포를 Treg 분화를 위한 조건인 anti-CD3, anti-CD28, IL-2, TGF-b1, 및 atRA로 자극하였다. Treg 분화를 확인하기 위하여, FoxP3 및 CD25 의 발현을 2일 및 5일 째에 확인하였다.
Treg 유도와 hcMSC 와의 관련성을 확인하기 위하여, hcMSC 와 공동배양 또는 hcMSC 없이 CD4+ T 세포만을 단독 배양하고 그 결과를 배양 1 내지 3일째의 FoxP3 및 CD25 발현 분석 및 FoxP3+ CD4+ CD25+ 세포의 증가를 통해 확인하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Treg 유도 조건에서 점차적으로 FoxP3+CD25+ Treg 가 확인 (A) 되었다. 또한 hcMSC 와의 공동 배양이 뚜렷하게 더 많은 FoxP3+CD25+ Treg 를 유도 (B) 할 수 있고, CD4+ T 세포 유래의 FoxP3+CD25+ 집단 역시 증가시킬 수 있음을 확인 (C) 하였다. 이와 같은 결과를 통해, hcMSC가 Treg 를 강하게 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3. hcMSC의 접촉 의존적 유도 효과 확인
hcMSC 와 CD4+ T 세포를 공동 배양하고, 이들 세포들의 모습을 광학현미경 (x400) 으로 확인하였으며, 존재 형태에 따라 부착 또는 부유 형태로 나누고 이들의 CD25 및 FoxP3 발현 양을 유세포 분석법을 통해 비교하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, CD4+ T 세포가 부착 또는 부유형태로 존재하는 것을 광학 현미경 상에서 확인하였고 (A), 일부 CD4+T 세포가 hcMSC 에 부착되어 있었으며, 이와 같은 부착 CD4+T 세포는 더 많은 CD25와 FoxP3를 발현하였다. 반면 일부 CD4+T세포들은 배양 배지에서 부유한 상태로 존재하였으며 이와 같은 부유 세포들은 부착세포보다 더 적은 양의 CD25 및 FoxP3 를 발현하였다 (B).
MSC 매개된 Treg 유도에 세포의 부착 여부가 영향을 미치는지 여부를 추가적으로 검증하기 위하여, 트랜스웰 어세이를 2일동안 수행하였다. 트랜스웰 어세이를 위하여 CD4+ T 세포는 하부 챔버에 배양하였고 hcMSC 상부 챔버에 배양하였으며, 이와 같은 배양 방법에 의해서도 hcMSC에 의한 Treg 유도 효과가 나타날 수 있는지 여부를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 트랜스웰 어세이를 통해 CD4+ T 세포와 hcMSC를 분리배양한 경우 hcMSC는 CD4+ T 세포의 CD25 및 FoxP3 의 발현에 영향을 주지 않았다.
이와 같은 결과는 hcMSC 매개된 Treg 유도는 세포 간 접촉을 필요로 하며, hcMSC와 T 세포간의 직접적인 상호작용이 CD4+ T 세포에서 Treg의 분화를 위한 유도 신호전달에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. hcMSC 상의 ICOSL 발현과 Treg 유도 관련성 확인
hcMSC 와 T 세포의 직접적인 상호작용이 Treg 분화를 유도한다는 것을 확인하였으므로, hcMSC 상의 ICOSL 의 발현이 신호전달에 중요한 역할을 할 것으로 예상하고 이를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. Treg 유도 조건 하에서 hcMSC와 CD4+ Treg 를 2일간 공동 배양하고 hcMSC 에서의 ICOSL 단백질의 발현을 유세포 분석으로, mRNA의 발현을 공동 배양 24 시간 후 qRT-PCR 을 통해 확인하였으며, hcMSC 상의 ICOSL의 발현을 비부착 CD4+ T 세포를 제거한 후 면역형광염색을 통해 공초점 현미경을 통해 확인하였다. hcMSC의 총 RNA는 EasyBlue RNA isolation reagent (Intron, Biotechnology, Sungnam, Korea) 이용하여 측정하였으며 cDNA를 2ug의 총 RNA로부터 합성하였다. RT-PCR 을 AccuPower PCR premix (Bioneer) 을 통해 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 SybrSafe을 포함하는 1% 아가로오스 젤 상에 전기영동하였으며, 형광 이미지 분석기를 통해 분석하였다. PCR 은 하기 프라이머를 이용하여 수행하였다: IL-10 (정방향 5′-ATCCAAGACAACACTACTAA-3′ 및 역방향 5′-TAAATATCCTCAAAGTTCC-3′), IL-1 (정방향 5′′-GCTGAGTGCTGCAAAGTACC-3′ 및 역방향 5′-TGAGGAGGGA -CTTGTGACTG-3′), IL-1R (정방향 5′- ATTGATGTTCGTCCCTGT CC-3′ 및 역방향 5′-CCTCCACCTTAGCAGGAACA-3′) and GAPDH (정방향 5′-CCACTGGCGTCTTCACCAC-3′ 및 역방향 5′-CCTGCT -TCACCACCTTCTTG-3′).
ICOSL mRNA를 확인하기 위하여, qRT-PCR 을 TaqMan probes (Assay ID: Hs00323621_m1; Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) 및 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 를 이용하여 수행하였다. mRNA 수준은 18s rRNA (Hs03928985_g1) )에 대하여 표준화 하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, ICOSL 은 Treg 분화 조건에서 hcMSC와의 공동 배양의 경우 뚜렷하게 상향 조절됨을 유세포 분석을 통해 확인하였다 (A). 또한 유세포 분석 결과와 동일하게, qRT-PCR 결과에서도 공동 배양 동안 hcMSC 의 ICOSL mRNA 발현이 증가된 것을 확인하였다 (B). hcMSC 공동 배양에서의 ICOSL의 발현의 증가가 면역형광염색에 위해서도 동일하게 나타났다 (C).
이와 같은 결과는, Treg 유도 조건 하에서 hcMSC 상의 ICOSL 의 발현이 증가된다는 것을 보여준다.
실시예 5. hcMSC와의 공동 배양을 통한T 세포의 ICOS의 발현 증가 확인
T 세포 활성화 동안 T 세포의 ICOS 는 상향 조절되어 있는 것으로 알려져 있으며, APC의 ICOSL의 발현은 Treg 유도 촉진을 통해 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. hcMSC가 T 세포의 ICOS 발현에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위하여, hcMSC 와 CD4+ T세포를 Treg 분화 조건 하에서 48시간동안 공동 배양하였으며, hcMSC 존재하에서 CD4+ T 세포의 ICOS 의 유도를 5회의 독립적 실험을 통해 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, ICOS 는 CD4+ T 세포와 hcMSC의 공동 배양 조건에서 더욱 증가하는 것으로 나타났으며 (A), 흥미롭게도 hcMSC 의 존재 하에서 CD25+FoxP3+ Treg 는 더높은 ICOS를 발현하였다 (B). 이러한 결과는 hcMSC가 CD4+ T 세포로 하여금 더 높은 ICOS 발현 및 FoxP3+ Treg 표현형을 나타내도록 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 6. ICOS-ICOSL 의 신호전달 경로의 확인
Treg 유도와 hcMSC 상의 ICOSL 와의 상호작용을 직접적으로 검증하기 위하여, ICOSL 의 기능을 차단하고 그에 따른 변화를 확인하였다. ICOSL의 기능 차단을 위해서 ICOSL에 대한 중화항체 처리 실험 및 유전자 적중 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로 ICOSL의 기능을 차단하기 위하여, 공동 배양된 hcMSC와 CD4+ T 세포에 항-ICOSL 중성화 항체를 10μg/mL 양으로 첨가하였다. 세포 표면을 FITC 또는 APC(allophycocyanin)-접합된 CD25, APC 및 PE-접합된 ICOS, FITC-접합된 CD4 (eBiosciences) 로 암 환경, 4℃ 에서 20분 동안 염색하였다. 2일 동안 공동 배양을 수행하고 FoxP3+CD25+ 및 Foxp3+ICOS+ 집단의 비율을 유세포 분석을 통해 확인하였다.
한편 ICOS-ICOSL의 상호작용이 IL-10 생산에 중요하고, Treg 발현 ICOS 가 IL-10 생산을 촉진하므로, hsMSC 에 의해 유도되는 Treg에 의한 IL-10의 생산을 유세포 분석기 및 ELISA 로 분석하였다. IL-10 생산은 PMA (40ng/mL; Sigma) 및 Ionomycin (1μg/mL; Sigma) 로 5시간 동안 세포를 재자극한 후 확인하였으며, 자극의 종료를 위해 Monensin (4μM; Sigma) 를 추가하였다.
상기와 같은 hcMSC 매개 Treg 유도에 있어서, 중화항체 처리를 통한ICOSL의 기능 차단에 따른 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, ICOSL 에 대한 중화항체 처리 (αICOSL) 는 CD25+FoxP3+ Treg 집단을 뚜렷하게 감소시켰으며 이에 따라 Treg 집단에서 ICOS 발현 역시 감소함을 확인하였다 (A). 한편 hcMSC 는 Treg 의 IL-10 생산을 유의적으로 증가시킨 반면, ICOSL 중화항체 처리에 따라 IL-10의 생산은 감소하였다 (B, C).
또한 hcMSC의 ICOSL 를 ICOSL 를 표적화하는 shRNA (shICOSL) 발현 렌티바이러스 감염을 통해 넉다운 시킨 후, 이에 따른 Treg 집단을 Foxp3, ICOS, CD25 의 발현 변화를 확인하였다. 렌티바이러스 shRNA (short-hairpin RNA)- 매개된 유전자 넉다운을 위하여, ICOSL 바이러스 입자를 Santa cruz (Santa cruz biotechnology, Santa cruz, CA, USA). 로부터 구입하여 사용하였다. shRNA 형질감염을 위하여 1×105 hcMSC 를 24-웰 플레이트상에 분주하였으며 다음날 부착 hcMSC를 대조군 (shCon) 또는 ICOSL shRNA 렌티바이러스 입자 (shICOSL) 로 폴리브렌 (5 μg/mL, Santa Cruz) 을 첨가하거나 첨가하지 않고 24시간 동안 감염시켰다. ICOSL 의 넉다운은 qRT-PCR 분석을 통해 확인하였으며, 감염된 hcMSC 는 이후 Treg 유도 조건에서 CD4+ T 세포와의 공동 배양에 사용하였고, 넉다운 결과 및 넉다운에 따른 Treg 유도 효과의 변화를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, ICOSL은 shRNA 처리에 의해 효과적으로 넉다운 되었고 (A), 이와 같은 넉다운에 의하여 hcMSC의 Treg 유도는 ICOSL 넉다운 군에서 감소하는 것을 확인하였다 (B).
이와 같은 결과는 ICOSL 이 hcMSC 매개 Treg 유도에 필수적인 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. hcMSC의 ICOSL 과발현에 의한 Treg 집단 유도
7.1 ICOSL 과발현 유도 확인
MSC 매개 Treg 유도에 있어서, hcMSC 에서 ICOSL의 과발현을 유도하고 이에 따른 효과를 확인하였다. ICOS의 과발현을 위하여, 전장 인간 ICOSL 유전자를 발현하는 렌티바이러스를 hcMSC에 바이러스 팩킹 구조체 (viral packaging contructs) 와 함께 도입하였다. 보다 구체적으로 전장 인간 ICOSL 유전자 발현 벡터를 C-terminal mGFP 태깅된 pLenti 벡터에 서브 클론하였다. cDNA 정량화를 위하여, 이를 competent E. coli 세포에 형질전환시켰으며, 결과물인 클론을 ICOSL 삽입 확인을 위하여 서열분석하였다. 293FT 세포에 ICOSL 발현 벡터를 Lenti-vpak packaging kit (Origene) 를 이용하여 형질감염시켰다. 2.5×106 의 293 FT 세포를 렌티바이러스 생산을 위하여 100-mm 배양 디시에 분주하였다 2일 후, 바이러스-포함 배양 상층액을 수확하고 hcMSC 감염에 사용하였다. hcMSCs 감염 후 qRT-PCR, 웨스턴 블랏, 유세포 분석을 ICOSL 과발현 수준 확인을 위하여 수행하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 전장 인간 ICOSL 을 발현하는 렌티 바이러스가 도입된 hcMSC (hcMSCICOSL) 는 공벡터가 도입된 MSC 대조군 (hcMSCEmp)과 비교하여, ICOSL 의 mRNA 및 단백질 발현이 모두 증가되어 있음을 확인하였다 (A, B). 또한 ICOSL 와 융합된 렌티바이러스 벡터 발현 GFP 발현을 통해 ICOSL 유도를 추가적으로 확인한 결과, hcMSCICOSL 에서 GFP 가 증가하여, ICOSL의 과발현이 효과적으로 유도되었음을 확인하였다.
7.2. hcMSCICOSL 에서의 Treg 유도 증가 확인
상기 7.1에서 hcMSC에서 ICOSL이 과발현된 것을 확인하였으므로, hcMSCICOSL 에서의 Treg 유도 증가 여부를 유세포 분석 및 ELISA 를 통해 확인하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, hcMSCICOSL 는 공벡터가 도입된 대조군과 비교하여 더 많은 CD25+FoxP3+ Treg를 유도하였고, hcMSCICOSL 에 의해 유도된 Treg는 더 많은 ICOS 를 발현하였다 (A). 또한 hcMSCICOSL 는 Treg에 의한 이펙터 항-염증성 사이토카인인 IL-10 의 생산 및 분비를 더욱 촉진하는 것을 유세포 분석 및 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 ICOSL이 MSC-매개 Treg 유도에 매우 중요한 역할을 수행함을 나타내는 것이고, 이는 MSC의 ICOSL이 효과적인 Treg 유도제로서의 역할을 한다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 8. hcMSC 유도된 Treg 의 PBMC 증식 억제 효과 확인
hcMSC가 Treg 유도 조건하에서 CD4+ T 세포가 CD25, FoxP3, ICOS 및 IL-10을 발현하는 Treg 표현형을 나타내도록 유도할 수 있음을 확인하였다. 한편 Treg는 in vitro 및 in vivo에서 모두 림프구 억제 활성을 가지고 있다는 것이 알려져 있으므로, 활성화된 림프구의 증식을 Treg가 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.
PBMC로부터 단리된 CD4+ T 세포를 Treg 유도 조건 하에서 hcMSCEmp 또는 hcMSCICOSL 와 2일 동안 공동 배양하였다. 그 후, Treg 집단을 포함하는 CD4+ T 세포로부터 CD25+ 세포를 단리하였다. PBMC를 10uM CFSE 로 미리 가열된 PBS 에서 최종 농도 107cells/mL 에서 표지하였다. 1μg/mL 항-CD3 mAb (eBiosciences) 및 3μg/mL 항-CD28 mAb (eBiosciences) 로 CFSE로 표지된 PBMC를 3일 동안 자극하였으며, CD4+ T 세포와 hcMSCICOSL 또는 hcMSCEmp 의 공동 배양물로부터 분리된 CD25+ 집단을 CFSE 표지되고 활성화된 PBMC 와 함께 1:5 또는 1:10 (Treg:PBMC) 로 3일간 공동 배양하였다. PBMC 의 증식을 CFSE 희석 평가 유세포 분석기를 통해 분석하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, Treg 가 없는 조건에서 활성화된 PBMC는 약 80% 인 것으로 CFSE 분석 결과 나타났으며, Treg 와 공동 배양된 경우, dividing PBMC 는 세포수 의존적으로 감소하여 Treg에 의해 면역억제 효과가 나타남을 확인하였다. 한편 hcMSCICOSL-유도된 Treg 및 hcMSCEmp-유도된 Treg 사이에 PBMC 억제에 대한 뚜렷한 기능적 차이는 나타나지 않았다.
실시예 9. ICOSL-ICOS 상호작용에 따른 PI3K-Akt 신호 경로 활성화 확인
PI3K-Akt 신호전달 경로는 T 세포의 증식, 이동, 분화 및 사이토카인 생산과 같은 T 세포의 기능에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. ICOSL 의 생리학적인 기능을 추가적으로 확인하기 위하여, Treg 분화 동안의 ICOSL-ICOS 상호작용에 의한 분자 신호 조절을 신호 전달 관점에서 확인하였다.
이를 위하여 CD4+ T 세포에 재조합 인간 ICOSL 인 rhICOSL (5μg/mL) (R&D research, Minneapolis, MN, USA) 를 Treg 유도 조건에서 2일 동안 처리하고, 유세포 분석을 통해 이들의 CD25, ICOS, FoxP3 의 발현을 분석하였다. 모든 실험은 5회 독립적으로 수행하였다. 구체적으로 rhICOSL (R&D research, Minneapolis, MN, USA) 의 투여를 위하여, 웰들을 5μg/mL rhICOSL로 37℃ 에서 4시간 동안 코팅하였다. 분리된 CD4+ T 세포를 각 웰에 1 × 106 cells/mL로 추가하고, 1ng/mL IL-2 (eBiosciences), 5ng/mL TGF-α (R&D research, Minneapolis, MN, USA) 및 0.1 μM all-trans-retinoic acid (atRA; PHASigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 함께 3μg/mL 항-CD28 mAb (eBiosciences) 로 2 내지 5일간 자극하였다. hcMSC2 와 CD4+ T세포는 2일 동안 1:10 (hcMSCs : T cells) 비율로 공동 배양하였다. 2일 후, hcMSC를 0.05mM EDTA 를 함유한 차가운 PBS 로 3회 세척하고 hcMSC로부터 림프구를 분리하였다. 그 후 hcMSC를 트립신화 시키고 PBS-EDTA 용액으로 2회 세척하였으며, PE-접합된 ICOSL 항체 (BioLegend) 를 ICOSL 발현 분석을 위해 첨가하여 염색하였다. rhICOSL 처리에 따른 Akt 의 인산화 여부를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, 이들 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, hcMSC 와 처리 결과와 유사하게 CD4+ T 세포에 대한 rhICOSL 의 처리 역시 비처리 대조군과 비교하여 FoxP3+ICOS+ Treg 유도를 촉진시켰다 (A). 또한 rhICOSL 의 처리는 Akt 인산화를 현저하게 증가시켰다 (B). 이러한 결과는 ICOSL 이 PI3K-Akt 신호경로를 Treg 유도 동안에 활성화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 10. PI3K-Akt 신호경로를 통한 Treg 분화 조절 확인
ICOSL 매개된 Treg 분화에 있어서, PI3K-Akt 신호경로가 관여하는지 여부를 추가 확인하기 위하여 PI3K (phosphatidylinositide 3-kinases) 억제제 LY294002 또는 AKt 억제제 GSK690693 를 처리하고 이에 따른 결과를 확인하였다. Akt 억제제 GSK690693 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 는 1uM농도로, LY294002 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 는 5-10 uM 농도로 사용하였다.
보다 구체적으로 CD4+ T 세포를 LY294002 (5μM) 및 GSK690693 (1μM) 로 30분 동안 전처리하고, 외인성 rhICOSL 의 처리가 Akt 인산화를 유도하는지 여부 및 PI3K-Akt 억제제가 rhICOSL 유도된 Akt 인산화를 Treg 유도 조건하에서 1시간 이내에 저해시키는지 여부를 확인하고, 총 Akt 를 확인하였다. 또한 rhICOSL-유도된 Treg 유도에 있어서 PI3K-Akt 억제의 영향을 LY294002 (5μM) 또는 GSK690693 (1μM) 를 2일 동안 처리한 후, rhICOSL-처리된 CD4+ T 세포의 배양을 통한 CD25, ICOS, FoxP3 의 발현을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, LY294002 및 GSK690693 의 처리는 모두 Akt 인산화를 뚜렷하게 감소시켰다 (A). 동시에 rhICOSL 또는 hcMSC-유도된 Treg 는 이들 억제제의 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였다 (B). 이와 같은 결과는 PI3K-Akt 신호전달 경로가 ICOSL-조절된 Treg 유도에 관여한다는 것을 나타낸다. 반면 PI3K-Akt 경로의 억제에 의한 정상 상태에서의 Treg 집단의 감소는 정상 Treg 유도 동안에 신호전달 경로의 기능적 중요성을 나타낸다 (B). 이러한 결과는, ICOSL-ICOS-PI3K-Akt 신호전달 축이 hcMSC-매개된 Treg 유도 조절에 관여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11. MSC 클론 간 ICOSL 발현과 Treg 유도와의 관련성 확인
다른 MSC 클론들은 서로 다른 기능적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, hcMSC 에따라 인간 Treg 를 유도하기 위한 ICOSL 발현 정도가 상이한지 여부를 확인하였다. 총 6개의 hMSC 주를 이용하였으며, 하나의 수여자 유래의 5개의 클로날 hcMSC(hcMSC 1-5) 및 하나의 비-클로날 hcMSC(hncMSC) 에서 ICOSL 의 기본 발현을 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 또한 hcMSC의 Treg 유도 활성을 확인하기 위하여 hcMSC1 및 hcMSC4 세포주들의 Treg 유도 능력을 혼합 림포사이트 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 에서 PBMC와의 공동 배양 또는 Treg 유도 조건에서 hncMSC, hcMSC1 및 hcMSC4에서 CD25, FoxP3 의 발현 비교를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 15 에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, hcMSC4 에서 가장 높은 ICOSL mRNA 발현이 나타났으며, hncMSC와 비교하여 대부분의 hcMSC가 더 높은 ICOSL 발현을 나타냄을 확인하였다 (A, B). 특히 hcMSC4 는 MLR 조건 (C) 및 Treg 유도 조건 (D) 모두에서 CD25 및 FoxP3 발현이 가장 높은 것으로 나타났으며, 이를 통해 hcMSC4가 Treg 유도에 가장 효과적인 세포주임을 확인하였다. 또한 ICOSL mRNA 발현 증가가 높은 세포주일수록 높은 Treg 유도 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ICOSL 의 발현 능력이 Treg 유도를 위한 hcMSC 능력과 상관관계가 있음을 보여주며, ICOSL 유도성이 높은 세포주일수록 Treg 유도능이 높다는 것을 나타낸다.
실시예 12. IL-1β에 의한 hcMSC에서의 ICOSL 유도 확인
MSC의 면역억제 활성은 다양한 프라이밍 및 적절한 자극에 의해 좌우될 수 있음이 알려져 있다. hcMSC 에서의 ICOSL의 발현이 Treg 유도와 관련이 있는 것으로 확인하였으므로, ICOSL 의 발현을 증가시키는 경우, 더 많은 Treg 가 증가되고 hcMSC 의 면역억제 기능이 강화될 수 있을 것으로 예상하였다. 이를 확인하기 위하여, ICOSL 의 발현을 유도할 수 있는 전 염증성 사이토카인을 확인하기 위한 실험을 먼저 수행하였다. 먼저, 적절한 프라이밍 인자를 찾기 위하여, IL-1β(10ng/mL), TNF-α (10ng/mL), LPS (2μg/mL) 를 각각 24 시간 동안 hcMSC에 처리한 후, qRT-PCR 을 통해, ICOSL의 발현을 1시간, 3시간 후에 확인하였다. 또한 IL-1β 처리에 따라 hcMSC에서의 IL-1R 의 발현이 변화되는지 여부를 확인하기 위하여 IL-1β 을 24시간 동안 처리한 후 hcMSC에서의 IL-1R의 발현을 함께 확인하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, IL-1β, TNF-α, LPS 처리군 모두에서 ICOSL의 mRNA 수준이 증가하는 것을 확인 (A, B) 하였고, 이 중 IL-1β 가 가장 강력한 효과를 나타내었다. IL-1β 는 이의 수용체인 IL1 수용체 1 (IL-1R1)과의 결합을 통해 세포성 반응을 조절하고, hcMSC에 IL-1R1의 발현된다는 사실이 알려져 있다. RT-PCR 결과와 같이, 정상 hcMSC 는 IL-1R1의 mRNA를 발현한다는 것을 확인하였다. 또한 IL-1β (10ng/ml) 의 처리는 ICOLS의 mRNA 를 즉시, 현저하게 증가시켰으나, IL-1R의 mRNA의 발현은 변화시키지 않았다.
실시예 13. 클로날 MSC 의 IL-1β 유도 효과 확인
hncMSC 와 비교하여 hcMSC4가 ICOSL 의 발현 유도 효과가 더 우수하다는 사실을 확인하였으므로, IL-1β 처리에 따른 클로날(clonal) 및 비-클로날 MSC의 ICOSL 유도 효과 차이를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로 24시간동안 IL-1β (10ng/ml) 로 hncMSC 및 hcMSC4 를 처리하고, qRT-PCR을 통해 ICOSL 의 mRNA 발현을 시간에 따라 분석하였으며, 웨스턴 블랏 및 유세포 분석을 통해 ICOSL의 단백질 발현 변화를 확인하였다. 유세포 분석은 5번의 독립 실험의 대표값으로 나타내었고, 그 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, qRT-PCR 결과는 IL-1β-자극된 ICOSL 의 유도가 hcMSC 및 hncMSC에서 6 및 24 시간에서 다르게 나타난다는 것을 보여준다 (A). 두 MSC 사이의 IL-1β 에 의한 ICOSL의 차이는 웨스턴 블랏 및 유세포 분석 결과에서도 동일하게 나타났다 (B, C).
상기와 같은 클로날, 비클로날 MSC의 종류에 따른 ICOSL 유도 효과의 차이가 IL-1β 에 의하여 나타나는 것인지 여부를 확인하기 위하여 IL-1β 중화 항체인 항- IL-1β 항체 (10μg/mL) 를 처리하여 IL-1β 기능을 차단하고, 이에 따른 ICOSL 유도 효과의 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 항- IL-1β 중화 항체의 처리는 IL-1β의 기능을 차단하였으며, 그 결과 IL-1β 에 의해 유도되는 ICOSL 발현이 감소되는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 IL-1β이 hcMSC에서 ICOSL 을 유도하는데 강력한 프라이밍 인자임을 보여주는 것이다.
실시예 14. IL-1β 처리에 따른 Treg 유도 증가 효과 확인
IL-1β 로 프라이밍된 hcMSC가 Treg 유도 활성을 더욱 증가시킬 수 있는지 여부를 검증하기 위하여, hcMSC를 IL-1β로 24시간 동안 처리하여 얻어진 hcMSCIL - 1β 를 Treg 분화 조건 하에서 CD4+ T 세포와 2일 동안 공동 배양하였으며, 이에 따른 CD4+CD25+FoxP3+ 또는 CD4+ICOS+Foxp3+ T 세포 집단의 비율을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 또한 항-ICOSL 중화 항체 (5ug/ml) 를 처리한 후, hcMSCIL - 1β 와 CD4+T 세포를 공동배양하고, ICOS의 중화 억제가 IL-1β 프라임된 hcMSC에 의한 Treg 유도를 억제할 수 있는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, IL-1β 로 프라이밍된 hcMSC (hcMSCIL - 1β) 는 IL-1 β 미처리 hcMSC인 hcMSCVeh 과 비교하여 CD25+FoxP3+ Treg 를 더 많이 생산하는 것으로 나타났다 (A). 또한 항-ICOSL 중화 항체 처리에 의하여 hcMSCIL - 1β 및 정상 hcMSC 에 의해 유도되는 CD25+FoxP3+ Treg를 모두 감소시키는 것으로 나타났다 (B). 이러한 결과는 IL-1β 로 프라이밍된 hcMSC는 ICOSL 을 발현시키고, PI3K-Akt 신호전달 경로의 활성화를 통해 Treg 분화를 촉진한다는 것을 나타내는 결과이다.
실시예 15. hcMSC에 의한 DDS 유도 대장염의 완화
15.1 DDS 대장염 유도 동물 모델의 제조 및 실험 방법
상기 실시예를 통해 hcMSC 의 면역억제 능력에 있어, 인간 ICOSL의 기능적 역할을 확인하였으므로, 실제 이와 같은 처리가 T 세포 매개 질환의 치료에 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, T 세포 매개 질환 중 하나인 대장염 모델에서 MSC 투여에 의한 면역억제 효과에 미치는 영향을 확인하였다.
급성 대장염을 유도하기 위하여 0 내지 7일 동안 식음수에 4% DSS 를 희석하여 Balb/c 암컷 마우스에 투여하였으며, 8일째에 정상적인 식음수로 교체해주었다. Balb/c 마우스들을 4군으로 나누어 실험을 수행하였으며, 이와 같은 대장염 동물 모델 유도 프로토콜을 도 20에 나타내었다. hcMSC는 DSS투여 24시간 전 ICOSL 발현 렌티바이러스를 통해 형질도입되었다. 형질도입된 hcMSC는 PBS로 세척하고 PBS에서 5×105cells/ head/200㎕ 밀도로 재현탁하였다. 1일차 및 3일차에 hcMSCs (5×105cells, 200 ㎕ PBS) 을 꼬리 정맥을 통해 정맥 주입하였고, 마우스들을 10일차에 희생시켰다. Balb/c 마우스는 하기와 같은 실험군으로 나눠 실험하였다: 대조군 (Con, 4 마우스), PBS 처리된 대장염군 (PBS + DSS, 6 마우스), hcMSCICOSL-주입된 대장염군 (hcMSCICOSL + DSS, 6 마우스).
15.2. DDS 유도된 대장염에 대한 hcMSC의 영향
DDS 유도된 대장염 마우스 모델에서 대장염 심각도를 매일 확인하였으며, 분변의 농도, 혈액 유무, 체중 감소 여부로 이를 평가하였다. 마우스로부터 전체 대장을 제거하였으며, 대장의 길이를 간접적 염증 마커로 확인하였다. 대장 내 마우스 Treg의 분석을 위하여, mesenteric 림프절로부터 분리된 세포들을 APC-접합된 항-CD25, FITC-접합된 항-CD4, 및 PE-접합된 항-FoxP3 항체 (eBioscience)와 함께 배양하였다. In vitro 실험을 위하여, CD4+ T 세포를 비장 및 림프절로부터 분리하였고, 분리된 세포의 순도를 유세포 분석을 통해 확인하였다. CD4+ T 세포는 1ug/ml 의 플레이트 부착 항-CD3 mAb 및 3μg/mL 의 soluble 항-CD28 mAb 로 활성화시켰으며, 1 일 및 2일 차에 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, PBS 처리된 대장염 군과 비교하여, hcMSCICOSL 주입 마우스 대장의 수축이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 hcMSCICOSL 주입 마우스에서는 체중의 손실 역시 감소되었다. 이와 같은 결과는, hcMSCICOSL 가 모두 대장염 마우스에서 효과적인 대장염 완화 및 치료 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.
상기와 같은 결과를 종합하면 ICOS-ICOSL 의 상호작용이 MSC에 의한 인간 Treg 유도에 중요한 역할을 수행한다는 것을 알 수 있다. 염증성 조건 하에서, hcMSC는 ICOSL 을 그들의 표면에 발현 유도할 수 있으며, 이는 Treg 상의 ICOS 발현을 통한 PI3K-Akt 신호전달 경로의 활성화를 통해 Treg 의 유도를 촉진할 수 있다. IL-1β 는 hcMSC에서 상향 조절된 ICOSL 에 의한 인간 Treg를 촉진할 수 있는 강력한 프라이밍 인자이다. 이와 같은 결과를 통해, hcMSC 의 면역억제기전을 명확하게 이해할 수 있으며, 난치성 면역 질환의 표적 치료를 위한 더욱 효과적인 줄기세포 치료제를 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.
제제예 1. 의약품의 제조
1.1 산제의 제조
ICOSL 100mg
유당 100mg
탈크 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1.2 정제의 제조
ICOSL 100mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1.3 캡슐제의 제조
ICOSL 100mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.
1.4 주사제의 제조
ICOSL 100mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.5 액제의 제조
ICOSL 100mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1,00ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (16)

  1. ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ICOSL는 중간엽 줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 ICOSL 은 중간엽 줄기세포 표면에 발현되는 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 클로날 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 ICOSL은 T 세포의 ICOS (Induced T cell co-stimulator) 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 ICOSL은 PI3K(phosophoinositide 3-kinase)-Akt 신호경로를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 처리된 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조절 T 세포 매개성 질환은 염증성 질환 또는 자가면역성 질환인 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 염증성 질환은 루푸스, 쇼그렌증후군, 류마티스 관절염, 섬유근염, 경피증, 강직성 척추염, 베체트병, 아프타 구내염, 길리안바레 증후군, 원형탈모증, 피부근염, 크론병, 대장염, 결절성 다발 동맥염, 재발성 다발 연골염 및 자가면역 혈소판 감소증으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 자가면역성 질환은 류머티스성 관절염, 전신성 경피증, 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 일부 후천성 재생불량성 빈혈, 일차성 간경변, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 실리코시스, 아스베스토시스, IgA 신장질환, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염, 쇼그렌증후군, 길리안-바레증후군, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증, 그레이브씨 갑상선 항진증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 측두동맥염, 윌슨병, 판코니증후군, 다발성 골수종 및 전신성 홍반성 루푸스로 이루어진 군에서 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 포함하는, CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, CD4+ T 세포의 조절 T 세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물.
  14. ICOSL 또는 ICOSL 과별현 중간엽 줄기세포를 in vitro에서 CD4+ T 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 CD4+ T 세포를 조절 T 세포로 분화 및 증식을 유도하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 ICOSL의 발현이 증가된 줄기세포는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-1 및 LPS (lipopolysaccharide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 전처리된 것을 특징으로 하는, CD4+ T 세포를 조절 T 세포로 분화 및 증식을 유도하는 방법.
  16. ICOSL (Induced T cell co-stimulator ligand) 또는 ICOSL 과발현 중간엽 줄기세포를 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 조절 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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