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WO2015023165A1 - 염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포 - Google Patents

염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포 Download PDF

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Publication number
WO2015023165A1
WO2015023165A1 PCT/KR2014/007640 KR2014007640W WO2015023165A1 WO 2015023165 A1 WO2015023165 A1 WO 2015023165A1 KR 2014007640 W KR2014007640 W KR 2014007640W WO 2015023165 A1 WO2015023165 A1 WO 2015023165A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mesenchymal stem
stem cells
srage
disease
metformin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2014/007640
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조미라
양철우
박민정
이성희
이정아
문영미
서현범
김은경
이선영
박성환
문수진
곽승기
정정희
양은지
김석중
이은정
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Original Assignee
Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020140104574A external-priority patent/KR101659158B1/ko
Application filed by Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea filed Critical Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Priority claimed from KR1020140106718A external-priority patent/KR101636139B1/ko
Publication of WO2015023165A1 publication Critical patent/WO2015023165A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells excellent in immunomodulatory activity and stability, and a cell therapeutic composition for preventing or treating immune diseases including the same.
  • the present invention also relates to a mesenchymal-mesenchymal mesenchymal stem cells treated with metformin, and a cell therapeutic composition for preventing or treating immune diseases including the same.
  • Immunity is one of the body's self-protection systems against all foreign polymers (antigens) that invade or are injected into living tissue.
  • the main component of the immune system is lymphocytes, which are white blood cells that are made in the bone marrow and circulate along the blood into lymph tissues and organs, mainly lymph nodes, spleen, and tonsils.
  • lymphocytes When stimulated by an appropriate antigen, B cells multiply rapidly to form clones that produce specific antibodies (immunoglobulins) that neutralize the antigen.
  • Antibodies produced by B cells circulate in body fluids to perform humoral immunity. T cells are made in the thymus and travel to lymphoid tissue, responsible for cell-mediated immunity that directly attacks antigens.
  • one of the most important traits of all normal individuals is that they do not deleteriously react with the antigenic substances that make up self, whereas many non-self antigens can recognize and react to eliminate them.
  • Is to have the ability to The non-response of the body to autoantigens is called immunologic unresponsiveness or tolerance.
  • an immune response occurs to autoantigens, and as a result, various autoimmune diseases occur while attacking one's own tissues.
  • the main method for treating such autoimmune diseases is mainly used drugs that inhibit the autoimmune function.
  • drugs that inhibit the autoimmune function.
  • cell therapies for the treatment of immune diseases have been developed, and studies to use stem cells as cell therapies are increasing.
  • the mesenchymal stem cells of the stem cells has not yet been revealed the exact mechanism of action on the immunomodulatory ability and there is little research on the production of stem cells having excellent immune disease treatment effect.
  • an object of the present invention is to provide mesenchymal stem cells exhibiting excellent immunomodulatory ability and stability by overexpressing the soluble receptor for advanced glycation endproducts (sRAGE) gene.
  • sRAGE advanced glycation endproducts
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells having the immunomodulatory ability of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing mesenchymal stem cells having a mass-produced human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ and immunomodulatory capacity) comprising the step of culturing metformin in mesenchymal stem cells To provide.
  • TGF- ⁇ and immunomodulatory capacity human transforming growth factor-beta
  • another object of the present invention is to provide a mesenchymal stem cell having a mass production of human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ) produced by the method of the present invention and having immunomodulatory capacity.
  • TGF- ⁇ human transforming growth factor-beta
  • Another object of the present invention to provide a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the mesenchymal stem cells having an immunomodulatory ability according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides mesenchymal stem cells having immunomodulatory capacity to which nucleotide sequences encoding soluble receptor for advanced glycation endproducts (sRAGE) are introduced.
  • sRAGE advanced glycation endproducts
  • the sRAGE may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotides encoding the sRAGE may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence encoding the sRAGE may be introduced by a vector expressing sRAGE in mesenchymal stem cells.
  • the vector is a recombinant vector containing a nucleotide sequence encoding sRAGE, as long as it can overexpress sRAGE in mesenchymal stem cells, the type thereof is not limited.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from peripheral blood or adipose tissue, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells exhibit excellent immunomodulatory ability by overexpression of sRAGE, which can be achieved by controlling the expression of various immune or inflammation-related factors.
  • overexpression of sRAGE in mesenchymal stem cells induces increased expression of any one or more factors selected from the group consisting of IDO, TGF-beta, HGF and IL-10.
  • overexpression of sRAGE in the mesenchymal stem cells induces decreased expression of any one or more factors selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , IL-6 and HMGB-1.
  • the overexpression of sRAGE in the mesenchymal stem cells induces increased expression of any one or more factors selected from the group consisting of CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR1 and CXCR4.
  • the mesenchymal stem cells may be stabilized by overexpression of sRAGE.
  • sRAGE is essential for stabilizing stem cells themselves.
  • the present invention also provides a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells overexpressing the sRAGE as an active ingredient.
  • the composition may be prepared or used to be administered in a number of 2.5 ⁇ 10 5 to 2.5 ⁇ 10 7 cells per kg of body weight of the administered object.
  • the immune disease is osteoarthritis, Rheumatoid Arthritis, Asthma, Dermititis, Psoriasis, Cystic Fibrosis, Late organ transplantation and chronic Post transplantation late and chronic solid organ rejection, Multiple Sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma (scleroderma), Addison disease, vitiligo, pernicious anemia, glomerulonephritis and pulmonary fibrosis, Inflammatory Bowel Mal Malohns disease ), Autoimmune Diabetes, Diabetic retinopathy, Rhinitis, Ischemia-reperfusion injury, Post-angiopl asty restenosis, Chronic obstructive pulmonary diseases (COPD), Graves disease, Gastrointestinal allergies, Conjunctivitis, Atherosclerosis, Coronary artery disease ), Angina, cancer
  • the present invention provides a method for producing mesenchymal stem cells having a mass production of human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ), comprising the step of treating metformin to mesenchymal stem cells.
  • TGF- ⁇ human transforming growth factor-beta
  • the mesenchymal stem cells are CD105, CD29 and CD44 is positive and CD34, CD45 and HLA-DR may be a method for producing mesenchymal stem cells, characterized in that it has a negative immunological characteristics. .
  • it may be a method for producing mesenchymal stem cells, characterized in that it further comprises the step of culturing the metformin-treated mesenchymal stem cells for 14 to 21 days at a temperature of 28 ⁇ 42 °C. .
  • the mesenchymal stem cells may be a method for producing mesenchymal stem cells, characterized in that separated from peripheral blood or adipose tissue.
  • the metformin may be a method for producing mesenchymal stem cells, characterized in that treated with a concentration of 0.2 ⁇ 2mM based on the number of mesenchymal stem cells 2 ⁇ 10 5 ⁇ 1 ⁇ 10 6 cells. .
  • the mesenchymal stem cells may be increased by the expression of any one or more factors selected from the group consisting of IDO, TGF-beta and IL-10 by the treatment of metformin.
  • the present invention provides a mesenchymal stem cell having a mass production of human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ) and immunomodulatory capacity produced by the method of the present invention.
  • TGF- ⁇ human transforming growth factor-beta
  • the present invention also provides a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the mesenchymal stem cells of the present invention as an active ingredient.
  • the composition may be administered mesenchymal stem cells having immunomodulatory capacity in the number of 2 ⁇ 10 5 to 2.5 ⁇ 10 7 cells per kg body weight of the subject.
  • the immune disease is osteoarthritis, Rheumatoid Arthritis, Asthma, Dermititis, Psoriasis, Cystic Fibrosis, Late organ transplantation and chronic Post transplantation late and chronic solid organ rejection, Multiple Sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma (scleroderma), Addison disease, vitiligo, pernicious anemia, glomerulonephritis and pulmonary fibrosis, Inflammatory Bowel Mal Malohns disease ), Autoimmune Diabetes, Diabetic retinopathy, Rhinitis, Ischemia-reperfusion injury, Post-angiopla sty restenosis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD), Graves disease, Gastrointestinal allergy, Conjunctivitis, Atherosclerosis, Coronary artery disease ), Angina,
  • COPD chronic obstructive
  • Mesenchymal stem cells of the present invention exhibits excellent stability by overexpressing sRAGE, and have an effect of increasing the expression of genes and cell migration-related genes with immunomodulatory capacity, and simultaneously inhibit immunosuppression while inhibiting proliferation of inflammatory cytokines and inflammatory cells.
  • Proliferation of T cells has the effect of promoting activity has the effect that can be usefully used as a cell therapy for the treatment of immune diseases.
  • the present invention is a mass production of human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ) by treating metformin in mesenchymal stem cells having CD105, CD29 and CD44 is positive and CD34, CD45 and HLA-DR have negative immunological characteristics
  • TGF- ⁇ human transforming growth factor-beta
  • the present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells having immunomodulatory capacity, and a mesenchymal stem cell prepared by the above method and a cell therapeutic composition for treating or preventing immune diseases containing the mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells with immunomodulatory activity have increased expression of any one or more factors selected from the group consisting of immunomodulatory factor IDO, TGF-beta and IL-10, and increase autophagy and mitochondrial activity. Has the effect that can be usefully used as a cell therapy for the treatment of immune diseases.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the recombinant vector pcDNA.3-HA-hsRAGE containing a human-soluble sRAGE (soluble receptor for advanced glycation endproducts) gene prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the ELISA (left photo) and Western blot (right) to measure the expression level of sRAGE expressed in mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector and mesenchymal stem cells transformed with mock vector not containing sRAGE. Photo) shows the results.
  • FIG. 3 shows Th1 (IFN- ⁇ ), Th17 (IL-17), and Th2 (IL-) of mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vectors and mesenchymal stem cells transformed with mock vectors not containing sRAGE. 4) and Foxp3 + Tregs cell numbers were analyzed by flow cytometry.
  • Figure 4 shows the expression of immunoregulatory related genes and cell migration-related genes in mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vectors and mesenchymal stem cells transformed with mock vectors not containing sRAGE through real-time PCR. The analysis results are shown.
  • 5 shows the results of analyzing the effect of sRAGE overexpression on T cell differentiation in mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector and mesenchymal stem cells transformed with mock vector not containing sRAGE.
  • Figure 6 shows the analysis of allogeneic response control effect of mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector, showing the expression of CFSE expression.
  • Figure 7 shows the results of analyzing allogeneic response control of mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector, showing the results of analysis of IFN-r, TH17 (IL-17) and Foxp3 + Tregs.
  • Figure 8 shows the results of examining the effects on the cytokine expression of mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector and mesenchymal stem cells transformed with mock vector not containing sRAGE under homologous reaction conditions.
  • FIG. 9 is a photograph showing observation of the expression level of IDO and IL-10 by fluorescence microscope in mesenchymal stem cells transformed with sRAGE-containing recombinant vector and mesenchymal stem cells transformed with mock vector not containing sRAGE. will be.
  • FIG. 10 shows a photograph of the mesenchymal stem cells transformed with the RAGE-containing recombinant vector and the mesenchymal stem cells transformed with the mock vector not containing sRAGE.
  • FIG. 11 shows the results of analysis of rheumatoid arthritis symptom improvement and treatment effects of sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention in a mouse model induced arthritis.
  • Figure 12 shows the results of the improvement and treatment effect of rheumatoid arthritis symptoms of sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention through immunochemical staining and flow cytometry.
  • Figures 13 and 14 show the results of examining the immunomodulatory ability of the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention on lupus animal model cells.
  • Figure 15 shows the results of microscopic observation of the cell shape of mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood, and the results of analyzing the expression of cell markers of mesenchymal stem cells.
  • 16 is a graph showing the results of analyzing the degree of IDO and TGF-beta expression in mesenchymal stem cells prepared by treating mesenchymal stem cells and metformin isolated from peripheral blood.
  • FIG. 17 analyzes the expression changes of HMGB-1, IL-6, and IL-1beta, genes related to inflammatory and tumor factors, in mesenchymal stem cells prepared by treating mesenchymal stem cells and metformin isolated from peripheral blood. One result is graphed.
  • FIG. 18 is a photograph showing the results of observing the activity of autophagic vacuoles and mitochondria through electron microscopy of mesenchymal stem cells prepared by treating mesenchymal stem cells and metformin isolated from peripheral blood.
  • 19 is a graph showing the results of analysis of IL-10 and TGF-beta expression levels in mesenchymal stem cells prepared by treating mesenchymal stem cells and metformin isolated from adipose tissue.
  • FIG. 20 shows photographs of IL-10 and IDO expression in mesenchymal stem cells prepared by treating mesenchymal stem cells and metformin isolated from adipose tissue by DAPI staining.
  • Figure 21 is a group injected with human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells prepared by treating metformin in a mouse model induced osteoarthritis (Met-MSC), a group injecting only metformin untreated mesenchymal stem cells into osteoarthritis mice (MSC) And it shows the results of pain analysis in the osteoarthritis mouse group (MIA; no treatment group) (A), and the degree of destruction of cartilage was observed by staining with India ink staining (B).
  • MIA no treatment group
  • Figure 22 is a group injected with human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells prepared by treating metformin in the mouse model induced inflammatory growth disease (MSC + Metformin), the group injected only with mesenchymal stem cells (MSC; metformin untreated group ), Weight change (A), IBD disease activity (B), and length and thickness change (C) of the untreated group (IBD; inflammatory bowel disease group).
  • Figure 23 is a group injected with human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells prepared by treating metformin in the mouse model induced inflammatory growth disease (MSC + Metformin), the group injected only with mesenchymal stem cells (MSC; metformin untreated group ), Intestinal inflammatory cell infiltration and changes in cell tissue morphology (A) by H & E staining in inflammatory bowel disease group (IBD) and no treatment group (WT) and TNF-a observation by immunochimistry staining (A) B).
  • Figure 24 is a group injected with human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells prepared by treating metformin in the arthritis model IL-1Ra Knockout mouse (Met-MSC), the group injected only with mesenchymal stem cells (MSC; untreated group metformin And arthritis index in the group treated with nothing (ie arthritis invention group; IL-1Ra Knockout mouse).
  • FIG. 25 shows human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Met-MSC), mesenchymal stem cells (MSC; metformin untreated mesenchymal stem cells) and nothing treated in rheumatoid arthritis animal models.
  • Figure 26 is a group injected with human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells prepared by treating metformin in a mouse model induced osteoarthritis (Met-MSC), a group injecting only metformin untreated mesenchymal stem cells into osteoarthritis mice (MSC)
  • Met-MSC mouse model induced osteoarthritis
  • MSC osteoarthritis mice
  • H & E staining, Toluidin staining, and saffranin O staining were analyzed to analyze osteoarthritis and cartilage destruction in the osteoarthritis mice group (MIA; no treatment group).
  • the present inventors confirmed through experiments that sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells are stable and can effectively treat immune diseases, while studying to develop a cell therapy that can effectively treat immune diseases.
  • the present invention can provide sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells with immunomodulatory ability, and can provide a cell therapeutic composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the mesenchymal stem cells with immunomodulatory activity as an active ingredient.
  • a cell therapeutic composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the mesenchymal stem cells with immunomodulatory activity as an active ingredient.
  • RAGE interacts with endogenous ligands, unlike TLRs that interact with exogenous pathogens, and is involved in the development of a variety of diseases caused by chronic inflammation producing a variety of endogenous ligands.
  • mRAGE membrane-bound form of RAGE
  • mRAGE consists of three domains: an extracellular site, a hydrophobic trans-membrane-spanning domain and a short cytoplasmic domain, which play an important role in post-RAGE signaling.
  • RAGE's binding to endogenous ligands includes reactive oxygen species (ROS), mitogen-activated protein kinase (MAPK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and janus kinase (JAK) / signal converters, and the STAT pathway.
  • ROS reactive oxygen species
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • PI3K phosphoinositide 3-kinase
  • JAK janus kinase
  • soluble RAGE (hereinafter referred to as sRAGE) has an extracellular site such as RAGE, while it does not have a trans-membrane domain and cytoplasmic domain.
  • sRAGE is formed due to selective splicing of RAGE mRNA or deletion of the membrane portion, capable of binding to RAGE ligands in extracellular space prior to mRAGE, and sRAGE to the extent that mRAGE binds to their ligands It is known to play a role of competitively inhibiting the.
  • mesenchymal stem cells prepared by the treatment of metformin is significantly more effective in treating immune diseases than mesenchymal stem cells not treated with metformin. Excellent was confirmed through experiments.
  • the present invention is characterized in that the metformin of the formula 1 (Metformin) is treated to mesenchymal stem cells, metformin is N, N-Dimethylimidodicarbonimidic diamide by IUPAC nomenclature, the molecular formula is C 4 H 11 N 5 , molecular weight is 129.16364 .
  • the present invention can provide a mesenchymal stem cell having an immunomodulatory ability treated with metformin, a cell therapeutic composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the mesenchymal stem cell having the immunomodulatory capacity as an active ingredient Can provide.
  • the mesenchymal stem cell is a stem cell isolated from bone marrow, blood, dermis, and periosteum, and can differentiate into various cells, such as adipocytes, chondrocytes, bone cells, and the like. Pluripotent or multipotent cells.
  • the mesenchymal stem cells used in the present invention may be animal mesenchymal stem cells, preferably mammalian, more preferably human mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be derived from bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, liver, lung, amniotic fluid, placenta, chorionic membrane or cord blood, and preferably derived from adipose tissue or peripheral blood.
  • mesenchymal stem cells can be obtained from a variety of sources as described above.
  • the process of obtaining mesenchymal stem cells will be described in detail as follows: (1) a mammal including a human or a mouse, preferably, a human Separating the mesenchymal stem cells from the mesenchymal stem cell source of, for example, blood or bone marrow or adipose tissue; (2) culturing the isolated cells in a suitable medium; And (3) can be obtained through the step of removing the floating cells in the culturing process and passaging the cells attached to the culture plate to obtain the finally constructed mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the above process any medium commonly used for culturing stem cells can be used.
  • the medium contains serum (eg fetal calf serum, horse serum and human serum).
  • serum eg fetal calf serum, horse serum and human serum.
  • Medium that can be used in the present invention is, for example, RPMI series, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc.Exp.
  • the medium may include other components such as antibiotics or antifungal agents (eg, penicillin, streptomycin, etc.), glutamine, and the like.
  • identification of the mesenchymal stem cells isolated and cultured can be performed through flow cytometry.
  • flow cytometry is performed using specific surface markers of mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells that can be used for the production of mesenchymal stem cells having immunomodulatory capacity in the present invention are CD105, CD29 and CD44 are positive, and CD34, CD45 and HLA-DR are negative cells. Can be.
  • a new mesenchymal stem cell having an immunomodulatory ability transformed into a vector capable of overexpressing sRAGE was prepared for use in treating mesenchymal stem cells derived from various sources for immune diseases.
  • a new mesenchymal stem cell having immunomodulatory capacity was prepared by treating metformin.
  • the sRAGE introduced into the mesenchymal stem cells in the present invention is composed of a gene consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoded from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence encoding the sRAGE may be introduced into a cell by a method known in the art, for example, the sequence may be introduced in its own sequence or vector. Methods of introducing nucleic acid sequences into cells are known in the art, and can be accomplished by methods including, for example, electroporation, methods using calcium phosphate, gene guns, and liposome methods. In addition, the introduction can be made using a virus as a carrier.
  • the base sequence encoding the sRAGE may be integrated in the genome of the cell or exist in the cell separately from the genome.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of delivering another nucleic acid to which it is linked. From the standpoint of nucleic acid sequences that mediate the introduction of specific genes, in the present invention, a vector is interpreted to be used interchangeably with a nucleic acid construct and a cassette. Vectors include, for example, plasmids or viral derived vectors. Plasmid refers to a circular double stranded DNA ring to which additional DNA can be linked.
  • Vectors used in the present invention include, for example, plasmid expression vectors, virus expression vectors (eg, SV40, replication defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses) and viral vectors capable of performing their equivalent functions. However, it is not limited to these.
  • the present inventors conducted experiments to confirm the possibility of use as a therapeutic agent for immune diseases in the new mesenchymal stem cells having the immunomodulatory ability.
  • sRAGE overexpressing mesenchymal stem cells are related to the immunomodulatory ability in the cells.
  • the expression of genes such as TGF-beta, IDO, HGF and IL-10 were significantly increased compared to mesenchymal stem cells without sRAGE overexpression, and expression of genes related to cell migration was also significantly increased. .
  • TGF-beta transforming growth factor beta
  • TGF ⁇ 1 comprises 390 amino acids
  • TGF ⁇ 2 and TGF ⁇ 3 each comprise 412 amino acids.
  • TGF ⁇ since TGF ⁇ has growth inhibitory activity against most cells, TGF ⁇ also has growth inhibitory activity against cancer cells expressing the normal TGF ⁇ receptor (Twardzik et al., J. Natl. Cancer Institute, 81: 1182-). 1185, 1989).
  • tumor cells may escape from growth inhibition by TGF ⁇ by inhibiting its expression of TGF ⁇ receptor.
  • the expression of Foxp3 in the presence of TGF-beta is induced from naive T cells and thus induced Tregs have the same immunosuppressive function.
  • deficiency of the TGF-beta gene leads to severe autoimmune diseases because it does not control the activity of inflammatory immune cells.
  • mesenchymal stem cells of the present invention overexpressing sRAGE also have excellent autophagy and mitochondrial activity.
  • the autophagy is a process in which bacteria decompose their organelles or cellular components, and the polymer is extracellular. It is a distinct action from heterophages that are taken by intracellular intake such as negative or phagocytic.
  • cells act to break down their proteins or to remove unnecessary cellular components in the process of rebuilding the cells.
  • the cellular components are surrounded by membranes derived from the endoplasmic reticulum, forming a follicle. It is fused with cotton to form a child pagolyosomal to decompose.
  • autophagy action can control the beneficial or harmful effects of immunity and inflammation and can prevent infectious diseases
  • autoimmunity and inflammatory diseases mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE in the present invention are autophagy. It can have more effects in the treatment of immune and inflammatory diseases. In situations where mitochondrial activity is not regulated, more severe inflammation occurs, which is why mitochondrial adverse events are very important in the development of immunoinflammatory diseases. When mitochondrial activity is lowered, the control system of pathogenic cells becomes unstable, which causes excessive cell activity or proliferation.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention in the mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE, an increase in autophagy vesicles confirmed that the autophagy action was increased compared to the mesenchymal stem cells without sRAGE overexpression and the increase in mitochondrial activity was confirmed. It was found that the mesenchymal stem cells of the present invention can be used as a cell therapy for effective immune disease treatment.
  • the mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE with immunomodulatory ability may be used as mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood or adipose tissue, and the immune including mesenchymal stem cells having the immunomodulatory ability as an active ingredient. It can be used as a cell therapy composition for the prevention or treatment of diseases.
  • the cell therapeutic agent refers to a method of proliferating or screening live autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro or restoring biological characteristics of cells in order to restore the function of cells and tissues.
  • These cell therapies can be broadly classified into two fields. The first is stem cell therapy for tissue regeneration or long-term function recovery, and the second is immunization for the regulation of immune responses such as suppressing the immune response or enhancing the immune response in vivo. Can be classified as a cell therapy.
  • the route of administration of the cell therapy composition of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • Parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration may be, but is not limited thereto.
  • composition may be formulated in a suitable form with a pharmaceutical carrier generally used for cell therapy.
  • a pharmaceutical carrier generally used for cell therapy.
  • 'Pharmaceutically acceptable' refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic or similar reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like, when administered to a human.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • composition may also be administered by any device in which the cell therapy agent can migrate to the target cell.
  • the cell therapy composition of the present invention may include a therapeutically effective amount of cell therapy for the treatment of a disease.
  • therapeutically effective amount means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician. This includes amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder being treated.
  • the cell therapy agent included in the composition of the present invention will vary depending on the desired effect. Therefore, the optimal cell therapy content can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health, sex and diet of the patient.
  • the cell therapeutic composition of the present invention may be included so that mesenchymal stem cells having immunomodulatory capacity are administered at a number of 2.5 ⁇ 10 5 to 2.5 ⁇ 10 7 cells per kg of body weight.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an immune disease comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of the cell therapy composition of the present invention.
  • mammal refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experiment, preferably human.
  • the cell therapy agent included in the composition is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 8 per kg of body weight of the administered individual. It is preferable to include the cell number.
  • the composition comprising the cell therapy of the present invention as an active ingredient is rectal, intravenous (iv), intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular or intradermal. Administration can be by conventional routes.
  • Metformin is an oral antihyperglycemic drug that is currently being used in the treatment of non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) by lowering both basal plasma glucose and postprandial plasma glucose. Improve glucose tolerance in NIDDM patients.
  • NIDDM non-insulin dependent diabetes mellitus
  • metformin has been widely used as a type 2 diabetes treatment, and a clinical approach is being taken for polycystic ovary syndrome, weight loss, and cancer treatment.
  • the present inventors have treated the metformin in the mesenchymal stem cells.
  • the expression of related factors, TGF-beta, IDO and IL-10, was found to be markedly increased, especially when metformin was treated to peripheral blood-derived mesenchymal stem cells compared to the group not treated with metformin. Appears to increase about 10-fold (see FIGS. 16 and 18).
  • the present inventors confirmed that the mesenchymal stem cells of the present invention prepared by treating metformin have excellent autophagy and mitochondrial activity.
  • the metformin treatment to the mesenchymal stem cells through the experiment it was confirmed that the increase in autophagy vesicles can be confirmed that the autophagy action was increased compared to the case without the treatment with metformin and metformin treatment because the increase in mitochondrial activity was also confirmed
  • the mesenchymal stem cells can be seen to be more effective in treating immune diseases.
  • the present invention can provide a method for producing mesenchymal stem cells having a mass production of human transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ) and immunomodulatory capacity, wherein CD105, CD29 and CD44 are positive and CD34.
  • CD45 and HLA-DR may include the step of treating metformin to mesenchymal stem cells having negative immunological characteristics, incubating for 14 to 21 days at a temperature of 28 ⁇ 42 °C.
  • Mesenchymal stem cells that can be treated with metformin in the present invention may be used mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood or adipose tissue, the metformin is based on the number of mesenchymal stem cells 2 ⁇ 10 5 ⁇ 5 ⁇ 10 5 cells 0.2 It can be treated at a concentration of ⁇ 2 mM.
  • the present invention can provide a cell therapy composition for the prevention or treatment of immune diseases, including mesenchymal stem cells prepared by treating the metformin having the immunomodulatory capacity as an active ingredient.
  • the immune disease to be treated by mesenchymal-treated mesenchymal stem cells prepared by metformin treatment and cell therapy composition for treating immune diseases including the cells is not limited thereto, osteoarthritis, rheumatoid arthritis (Rheumatoid Arthritis), Asthma, Dermititis, Psoriasis, Cystic Fibrosis, Post transplantation late and chronic solid organ rejection, Multiple Sclerosis, Systemic lupus erythematosus Systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma, Addison disease, vitiligo, pernicious anemia , Glomerulonephritis and pulmonary fibrosis, Inflammatory Bowel Dese, Crohns disease, autoimmunity Autoimmune Diabetes, Diabetic retinopathy, Rhinitis, Ischemia-reperfusion injury, Post-ang
  • the present inventors first prepared an expression vector operably linked with the sRAGE gene for the production of mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE.
  • the sRAGE gene represented by SEQ ID NO: 1 was cloned into a pcDNA 3.0-HA vector to prepare a recombinant vector of FIG. 1.
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the medium was changed at 3 days intervals, and the cells were removed from the culture plate and cultured according to the degree of cell proliferation, and the culture was performed three times (passage 3) to obtain mesenchymal stem cells from peripheral blood.
  • Cell markers were checked to determine whether they were mesenchymal stem cells. As a result, CD105, CD29 and CD44 were positive, and CD34, CD45 and HLA-DR were negative to confirm that the isolated cells were mesenchymal stem cells.
  • Example ⁇ 1-2> The mesenchymal stem cells isolated from Example ⁇ 1-2> were transformed with the recombinant vector prepared in Example ⁇ 1-1> to prepare mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE.
  • the expression level of sRAGE in the mesenchymal stem cells transformed with the vector containing no sRAGE and the mesenchymal stem cells produced in the present invention was determined by ELISA ( Enzyme-linked immunosorbent assay and western blot were performed.
  • the inventors of the present invention show real-time PCR (polymerase chain reaction) changes in the expression of IDO, TGF-beta and HGF, genes related to immunomodulatory activity in mesenchymal stem cells, by overexpression of sRAGE in sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells. Analyzed using the method. As a result, in the mesenchymal stem cells overexpressing sRAGE, the expression of IDO, TGF-beta and HGF was significantly increased (about 2 to 6 times) compared to mesenchymal stem cells without sRAGE overexpression (Fig. 4A). ).
  • CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR1 and CXCR4 which are factors related to the movement of mesenchymal stem cells.
  • sRAGE overexpression of sRAGE
  • the expression of genes related to cell migration is significantly increased compared to mesenchymal stem cells without sRAGE overexpression, and thus, sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention are more effectively treated for inflammatory and immune diseases. It can be used as a cell therapy for.
  • Primer sequences used in PCR to analyze the expression level of each of the factors are as described in Table 1 below.
  • Real-time PCR was used to observe gene expression when an inflammatory environment in mesenchymal stem cells was applied.
  • Mesenchymal stem cells 5 ⁇ 10 5 cells were plated in 6-well plates and incubated at 37 ° C. for 3 days while stimulating with Lg 1ug / ml.
  • LPS-treated mesenchymal stem cells were used as a control, and expression levels of inflammatory and tumor factors in LPS-treated mesenchymal stem cells were analyzed using real-time PCR.
  • IL-1 ⁇ IL-6
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • HMGB-1 High-Mobility Group protein B1
  • Primer sequences used in the PCR are as described in Table 2 below.
  • sRAGE Overexpression of sRAGE was induced in adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and cultured for 3 days, and then the degree of autophagy vesicle formation was observed by electron microscopy.
  • 10 is a photograph of the mesenchymal stem cells transformed with the RAGE-containing recombinant vector and the mesenchymal stem cells transformed with the mock vector not containing the sRAGE through electron microscopy. Stem cells can be observed to increase the number of autophagic vacuoles compared to the control group.
  • the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention prepared in Example 1 were analyzed for changes in cytokine expression levels in mesenchymal stem cells due to overexpression of sRAGE. To this end, the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells were co-cultured with human CD4 + T cells, and then the amounts of IFN- ⁇ , IL-17, IL-4 and Foxp3 + Treg were measured.
  • Th1 IFN- ⁇
  • Th17 IL-17
  • Th2 IL-4
  • Foxp3 + were significantly decreased.
  • Tregs tended to increase slightly (FIG. 3).
  • the present inventors observed cytokine levels in the culture medium under the above experimental conditions, that is, alloresponse conditions, and showed that the sRAGE-MSC of the present invention effectively reduced the production of inflammatory cytokines compared to other groups (Fig. 8).
  • IL-1Ra knockout mouse was produced according to a method published by the Y. Iwakura team, which lacks the IL-1 receptor gene.
  • the IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) acts directly on the IL-1 receptor, preventing IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ from acting on the receptor, thereby naturally causing autoimmune arthritis diseases.
  • Arthritis-induced mice were injected with sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells prepared in the present invention to the diseased mouse, sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells were injected iv into the mouse at a cell number of 2 ⁇ 10 6 .
  • mice treated with sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells showed improvement in arthritis symptoms compared to the group treated with mesenchymal stem cells only (Fig. 11B), and the Th2 type IgG1 and IgG3 acting on the immune response. The production of was all significantly reduced (see FIG. 11C).
  • joints of each group were collected, fixed in 10% neutral buffered formalin, embedded in paraffin, and tissue sections were made and attached to slides.
  • xylen xylen
  • ethanol was hydrated from high to low concentrations. The staining process was hematoxylin and eosin staining.
  • the mesenchymal stem cells that did not overexpress sRAGE showed arthritis inhibitory effect, but the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells were injected, but the infiltration of inflammatory cells and cartilage destruction were significantly reduced (Fig. 11D). ).
  • cytokines IFN- ⁇ , IL-17, IL-4 and Foxp
  • Th17 cells which are pathogenic cells
  • Treg cells were observed to increase significantly (FIGS. 12A, B).
  • Th1 IFN- ⁇
  • Th17 IL-17
  • sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells prepared according to the present invention on the lupus animal model cells was investigated.
  • Cells were isolated from Roquin mice, a lupus animal model, co-cultured with mesenchymal stem cells at a ratio of 1:10 for 3 days, and the amount of IL-17 present in the culture was measured by ELISA.
  • the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells showed a further decrease in the amount of IL-17 in the culture medium and increased the activity of immunoregulatory T cells compared to the mesenchymal stem cell group without overexpressing sRAGE. (FIG. 13).
  • the pathogenic cells of the lupus model can be regulated by the sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells of the present invention.
  • the effect of sRAGE overexpressing mesenchymal stem cells prepared in the above example was co-cultured with human CD4 + T cells and analyzed on T cell differentiation using a flow cytometer.
  • sRAGE-overexpressing mesenchymal stem cells were found to increase Foxp3 + Tregs more than control (MSCs without sRAGE overexpression), and Th1 and Th17 cells were significantly decreased. And Th2 cells did not show a significant difference (Fig. 5).
  • PBMC peripheral blood
  • a-MEM medium containing 20% FBS for 5 days
  • the cells floating on the culture medium were removed.
  • the medium was changed at intervals of 3 days, and the cells were removed from the culture plate and cultured according to the degree of cell proliferation, and the culture was performed three times (passage 3) to obtain mesenchymal stem cells from peripheral blood.
  • Cell markers were identified to confirm whether they were mesenchymal stem cells, and as a result, CD105, CD29, and CD44 were positive, and CD34, CD45, and HLA-DR were negative (see FIG. 15A and 100 times on the left in FIG. 15A).
  • Enlarged picture, the right picture is a 40x magnification).
  • the adipose tissue obtained by liposuction or the adipose tissue obtained after surgery was washed 10 times or more with PBS containing 10% penicillin-streptomycin to remove blood and foreign matter, and then the tissue was chopped to 0.2 to 0.3 g. . 0.2% collagenase (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) in a solution was reacted for 1 hour at 100 °C water bath, 37 °C. After separating the solution layer and the undecomposed fragments by the collagenase using a 100 ⁇ m mesh, the same amount of PBS was added to the separated collagenase solution. Subsequently, centrifugation was performed at 4 ° C.
  • MSC basal medium (Cambrex, Walkersville, MD, USA), mesenchymal growth aid (Cambrex, Walkersville, MD, USA), 4 mM to remove remaining collagenase solution from submerged MSC L-glutamine and penicillin (0.025 unit / 500 ml) / streptomycin (0.025 mg / 500 ml)] was added again centrifuged for 5 minutes at 4 °C, 1200rpm.
  • MSCGM is a medium based on Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing fetal calf serum. Subsequently, the supernatant was removed, and the obtained MSC was inoculated in a culture plate and incubated in a 37%, 5% CO 2 incubator with MSCGM. Incubate while replacing the culture medium every other day.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • mesenchymal stem cells derived from peripheral blood were treated with metformin at a concentration of 1 mM based on the number of 2 ⁇ 10 5 cells and cultured at 37 ° C. to prepare mesenchymal stem cells treated with metformin.
  • the cells were treated with metformin at a concentration of 1 mM for 2 ⁇ 10 5 cell numbers and cultured at 37 ° C. to prepare mesenchymal-treated mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells that were not treated with metformin were used as controls, and the expression levels of the immunomodulatory genes were analyzed in metformin-treated mesenchymal stem cells.
  • TGF-beta was expressed in about 10 The expression was increased by doubled (see FIG. 16).
  • the present inventors were able to confirm the above results through the DAPI staining method, that is, in the mesenchymal stem cells treated with metformin through fluorescence microscopy after staining using DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
  • DAPI 4- ', 6-diamidino-2-phenylindole.
  • the expression levels of IL-10 and IDO were analyzed.
  • HMGB-1 mesenchymal stem cells isolated and cultured in Examples ⁇ 7-1> and ⁇ 7-2>
  • HMGB-1, IL-6, and IL which are genes related to inflammatory and tumor factors, respectively
  • IL which are genes related to inflammatory and tumor factors, respectively
  • the expression change of -1beta was analyzed.
  • the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were treated with metformin at a concentration of 1 mM for 5 ⁇ 10 5 cell numbers, and then cultured under 37 ° C. temperature to prepare mesenchymal-treated mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells not treated with metformin were used as a control group, and the expression levels of inflammatory and tumor factor genes in the metformin-treated mesenchymal stem cells were analyzed using realtime PCR.
  • the present inventors found that the mesenchymal stem cells prepared by the treatment with metformin significantly increased the expression of IDO, IL-10, and TGF-beta, which have immunomodulatory capacity, compared with the treatment without metformin. It was confirmed that the expression of HMGB-1, IL-6 and IL-1beta, genes related to inflammatory and tumor factors, was significantly reduced.
  • Electron microscopy was performed on mesenchymal stem cells prepared by treating metformin to the mesenchymal stem cells derived from peripheral blood isolated and cultured in Example 7 and those of mesenchymal stem cells derived from peripheral blood not treated with metformin. Autophagy activity and mitochondrial activity change were observed.
  • the autophagy can regulate the beneficial or detrimental effects of immunity and inflammation and can prevent infectious diseases, autoimmunity and inflammatory diseases. Therefore, the present inventors have found that the mesenchymal stem cells of the present invention treated with metformin are autologous. It is intended to check whether it is possible to treat immunity and inflammatory diseases because it has phagocytosis.
  • autophagy is known to be involved in the degradation of microorganisms (viruses, bacteria, parasites, etc.) invaded into cells, and is known to inhibit inflammatory reactions as well as to participate in the actual immune response and its regulation. This shows a very important dynamic for various pathophysiological processes, and in particular can regulate the self-defense (immune) system. Recently, it is emphasized that the regulation of autophagy balance is important in the treatment of inflammatory bowel disease and various autoimmune diseases.
  • the mesenchymal-mesenchymal stem cells treated with metformin were found to have increased numbers of autophagic vacuoles compared to the group not treated with metformin (yellow arrow), and mitochondrial activity. Increased by metformin (red arrow points to mitochondria).
  • metformin-treated mesenchymal stem cells prepared according to the present invention are actually useful for the therapeutic effect of immune diseases.
  • the therapeutic effects of the osteoarthritis-induced animal models were first examined.
  • osteoarthritis-induced mouse animals were prepared by injecting 50 mg of 3 mg monosodium iodoacdtate (Sigma, ST. Louis, MO) using an intra-articular 26.5G syringe for each osteoarthritis.
  • osteoarthritis-induced mice were injected with 2 ⁇ 10 6 adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells treated with metformin at a concentration of 1 mM once a week, twice a total of iv. Then, after 7 days, pain was measured, which is an indicator for evaluating the effect on the behavior of osteoarthritis-inducing animals, and the destruction of cartilage was analyzed by india ink staining.
  • the present inventors analyzed the degree of arthritis and cartilage destruction of osteoarthritis-induced animals after staining using H & E staining, Toluidin blue staining, and saffranin O staining.
  • mice injected with mesenchymal stem cells significantly reduced the infiltration of inflammatory cells and cartilage destruction. Confirmed.
  • test animals used C57BL / 6 (H-2kb) mice, which were infused with 3.5% dextran sulfate sodium (DSS) water for 1 week. Inflammatory bowel disease induction animal models were constructed. After that, the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and metformin-treated adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were injected 2 times a week with iv into a cell number of 2 ⁇ 10 6 cells. (Weight, colon length, DAI (disease activity index)) was confirmed.
  • the present inventors analyzed the degree of TNF-a expression through intestinal inflammatory cell invasion, cell tissue morphology, and immunochemistry staining using H & E staining method in tissues in inflammatory bowel disease animal model.
  • intestinal inflammatory cell infiltration and tissue structure of the intestinal inflammatory cells were maintained similar to those of normal mice in the case of the mesenchymal stem cells treated with metformin as compared to the group treated with the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells alone
  • TNF-a an inflammatory cytokine in the intestine
  • mesenchymal stem cells treated with metformin were similar to those of normal intestinal tissues compared to those treated with mesenchymal stem cells alone. It was confirmed that the amount of expression of TNF-a is reduced to an extent.
  • the present inventors performed the following experiment to confirm whether the metformin-treated mesenchymal stem cells have a therapeutic effect on arthritis.
  • IL-1Ra knockout mouse was produced according to a method published by the Y. Iwakura team, which lacks the IL-1 receptor gene.
  • the IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) acts directly on the IL-1 receptor, preventing IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ from acting on the receptor, thereby naturally causing autoimmune arthritis diseases. Way.
  • mice with arthritis-induced mesenchymal-treated mesenchymal stem cells prepared in the present invention were injected into the diseased mouse.
  • Metformin-treated mesenchymal stem cells were injected into the mice at a cell count of 2 ⁇ 10 6 for iv to the mouse for one week. A total of three injections were made, and arthritis dimensions of each of these mice were measured one week later.
  • a group of arthritis-induced mice and a group of arthritis mice injected with only adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were used as a control group.
  • the arthritis symptom was improved in the group of mice treated with metformin-treated mesenchymal stem cells compared to the group treated with mesenchymal stem cells only (see FIG. 24).
  • DBA / 1J mice were mixed with type II collagen (CII) and CFA (adjuvant) 1: 1, injected 100ul of CII per mouse at 50ul dose into the tail base, and 2 weeks later.
  • CII and IFA 1: 1 was injected secondly at 100 ug / 50 ul.
  • arthritis index For the measurement of arthritis index, three observers who did not know the contents of the experiment were evaluated three times a week and evaluated the severity of joint inflammation for up to 10 weeks. At this time, the evaluation of arthritis is based on the average arthritis index by Rossolinec et al., The average score divided by 3 is obtained by adding the scores according to the following scales on the three legs except the legs to which CII / CFA was administered at the time of the second dose per horse. The mean obtained by summing the values obtained by three observers in the animal model was used. The scores and criteria according to arthritis evaluation are as follows.
  • the best arthritis index per maridang is 4, so the best disease index per rat is 16.
  • arthritis was further suppressed in the mouse group injected with metformin-treated mesenchymal stem cells as compared with the mouse group injected with mesenchymal stem cells (see FIG. 25).
  • the results of the above examples indicate that the mesenchymal stem cells of the present invention prepared by treatment with sRAGE have an activity that can effectively regulate the immune response, and thus can be usefully used as a novel cell therapy for the treatment of immune diseases, especially autoimmune diseases. Shows.
  • the present inventors found that mesenchymal stem cells prepared by treating metformin have an activity that can effectively regulate the immune response, and thus can be usefully used as a novel cell therapy for the treatment of immune diseases, especially autoimmune diseases.
  • metformin mesenchymal stem cells prepared by treating metformin have an activity that can effectively regulate the immune response, and thus can be usefully used as a novel cell therapy for the treatment of immune diseases, especially autoimmune diseases.

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Abstract

본 발명은 면역조절능이 우수하고 안정한 sRAGE 과발현 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이며, 또한, 본 발명은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여, 28~42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 함유하는 면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

Description

염증조절복합체 및 ＳＴＡＴ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포
본 발명은 면역조절능과 안정성이 우수한 sRAGE-과발현 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.
면역(免疫; Immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절·비장·편도 등으로 순환하는 백혈구다. B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. T세포는 흉선에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 각종 자가면역질환이 발병하게 된다.
한편, 이러한 자가면역질환을 치료하는 주된 방법은 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다. 따라서 보다 효과적인 새로운 면역질환 치료제의 개발이 연구 및 개발되고 있는데, 최근 들어 면역질환 치료를 위한 세포치료제가 개발이 되고 있으며, 세포치료제로서 줄기세포를 이용하려는 연구가 점점 증가하고 있다. 특히, 줄기세포 중 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 아직까지 면역조절능력에 대한 정확한 작용기전이 밝혀져 있지 않고 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는 줄기세포의 제조에 대한 연구도 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 효과적인 면역치료용 세포치료제를 연구하던 중, sRAGE(soluble receptor for advanced glycation endproducts) 유전자를 과발현하는 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells) 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)가 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 sRAGE(soluble receptor for advanced glycation endproducts) 유전자를 과발현(overexpression)함으로써 우수한 면역조절능과 안정성을 나타내는 간엽줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량 생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 sRAGE(soluble receptor for advanced glycation endproducts)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 도입된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sRAGE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sRAGE를 암호화하는 뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 sRAGE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 간엽줄기세포 내에서 sRAGE를 발현시키는 벡터에 의해 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 sRAGE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 벡터로서, 간엽줄기세포 내에서 sRAGE를 과발현시킬 수 있는 것이라면 그 종류에는 제한이 없다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해 우수한 면역조절능을 나타내는데, 이는 여러 면역 또는 염증 관련 인자들의 발현을 조절함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 간엽줄기세포 내 sRAGE의 과발현은 IDO, TGF-beta, HGF 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현 증가를 유도한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포 내 sRAGE의 과발현은 IL-1β, IL-6 및 HMGB-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현 감소를 유도한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포 내 sRAGE의 과발현은 CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR1 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현 증가를 유도한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해 안정화될 수 있다. 즉, sRAGE의 발현은 줄기세포 자체의 안정화에 필수적인 요소이다.
또한, 본 발명은 상기 sRAGE를 과발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 투여개체의 체중 kg 당 2.5×105 내지 2.5×107 세포수로 투여될 수 있도록 제조 또는 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergies), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량생산하고, 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 28 ~ 42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메트포민은 간엽줄기세포 2×105 ~ 1×106 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 메트포민의 처리에 의해 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량 생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 투여개체의 체중 kg 당 2×105 내지 2.5×107 세포수로 투여할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 간엽줄기세포는 sRAGE를 과발현하여 우수한 안정성을 나타내며, 면역조절능을 갖는 유전자 및 세포이동 관련 유전자들의 발현을 증가시키는 효과가 있고, 염증성 사이토카인 및 염증세포의 증식은 억제시키면서 동시에 면역조절 T세포의 증식은 촉진시키는 활성을 가지고 있어 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 함유하는 면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포는 면역조절능을 갖는 인자인 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가되어 있고, 자가포식작용 및 미토콘드리아 활성을 증가되어 있어 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제작된 인간 유래의 sRAGE(soluble receptor for advanced glycation endproducts) 유전자를 함유하는 재조합 벡터인 pcDNA.3-HA-hsRAGE의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포에서 발현된 sRAGE의 발현량을 측정하기 위하여 ELISA(왼쪽 사진) 및 웨스턴블럿(오른쪽 사진)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 Th1(IFN-γ), Th17(IL-17), Th2(IL-4) 및 Foxp3+Treg의 세포수를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 면역조절 관련 유전자 및 세포 이동 관련 유전자들의 발현 정도를 실시간 PCR 방법을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 sRAGE 과발현이 T세포 분화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포의 동종반응 조절 효과를 분석한 것으로서, CFSE의 발현양을 조사한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포의 동종반응 조절 효과를 분석한 것으로서, IFN-r,TH17(IL-17) 및 Foxp3+Treg를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 동종반응 조건 하에서 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포의 사이토카인 발현에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 sRAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 IDO 및 IL-10의 발현 정도를 형광현미경을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 RAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 자가포식 활성 정도를 전자현미경을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 류마티스 관절염 증상 개선 및 치료 효과를 관절염이 유발된 마우스 모델을 대상으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 류마티스 관절염 증상 개선 및 치료 효과를 면역화학염색법과 유세포분석을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포가 루푸스 동물모델 세포에 미치는 면역조절능력을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 15은 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포의 세포 모양을 현미경으로 관찰한 결과와, 간엽줄기세포의 세포 표지자 발현 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IDO 및 TGF-beta 발현 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포 각각을 대상으로 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18는 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포 각각을 대상으로 전자현미경을 통해 자가포식 소낭(autophagic vacuoles) 및 미토콘드리아의 활성 정도를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 지방조직으로부터 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IL-10 및 TGF-beta 발현 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 지방조직으로부터 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IL-10 및 IDO 발현 정도를 DAPI 염색방법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 21은 골관절염이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 골관절염 마우스에 메트포민 미처리 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC) 및 골관절염 마우스 군(MIA; 아무것도 처리하지 않은 군)에서의 통증 분석 결과를 나타낸 것이고(A), 연골의 파괴정도를 인디아 잉크 염색법으로 염색하여 관찰한 것을 나타낸 것이다(B).
도 22은 염증성장질환이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(MSC+Metformin), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군), 아무것도 처리하지 않은 군(IBD; 염증성 장질환 군)에서의 몸무게 변화(A), IBD 질병활성도(B) 및 대장의 길이와 두께변화(C)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23는 염증성장질환이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(MSC+Metformin), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군), 염증성 장질환 군(IBD), 아무것도 처리하지 않은 군(WT)에서의 H&E 염색을 통한 장내 염증세포 침윤 및 세포 조직 형태 변화(A)와 immunochimistry 염색을 통한 TNF-a 관찰 결과를 나타낸 것이다(B).
도 24은 관절염 모델인 IL-1Ra Knockout mouse를 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군) 및 아무것도 처리하지 않은 군(즉, 관절염 발명 군; IL-1Ra Knockout mouse)에서의 관절염 지수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 25은 류마티스 관절염 동물모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포(Met-MSC), 간엽줄기세포(MSC; 메트포민 미처리 간엽줄기세포) 및 아무것도 처리하지 않은 군(control)에서의 류마티스 관절염 치료효과를 관절염 지수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 26는 골관절염이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 골관절염 마우스에 메트포민 미처리 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC) 및 골관절염 마우스 군(MIA; 아무것도 처리하지 않은 군)의 골관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하기 위해 H&E 염색, Toluidin 염색 및 saffranin O 염색을 시행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, sRAGE-과발현 간엽줄기세포가 안정하면서도 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.
따라서 본 발명은 면역조절능을 갖는 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 제공할 수 있으며, 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
한편, RAGE는 외재성 병원균과 상호작용하는 TLR(toll like recepter)과 달리 내재성 리간드들과 상호작용하는데, 다양한 내재성 리간드들을 생성하는 만성 염증에 의해 유발되는 다양한 질병의 발병에 관여한다. 또한, mRAGE(Membrane-bound form of RAGE)는 세포 외 부위, 소수성 트랜스-멤브레인-스패닝 도메인 및 짧은 세포질 도메인의 세 개 도메인으로 구성되며, 이것은 포스트-RAGE 신호전달에 중요한 역할을 한다. 내재성 리간드에 RAGE가 결합하면 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS), MAPK(mitogen-activated protein kinase), PI3K(phosphoinositide 3-kinase) 및 JAK(janus kinase)/신호 변환기, STAT 경로를 포함하는 다양한 세포 내 신호 케스케이드가 시작된다. 중요하게도 RAGE 신호전달은 NF-κB(nuclear factor kappa B)의 핵 전좌의 진행 속도를 높인다.
또한, 용해성 RAGE(soluble RAGE, 이하 sRAGE)는 RAGE와 같은 세포 외 부위를 갖는 반면, 트랜스-멤브레인 도메인 및 세포질 도메인은 갖고 있지 않다. sRAGE는 RAGE mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing) 또는 멤브레인 부분의 삭제(excision)로 인해 형성되며, mRAGE에 앞서 세포 외 공간에서 RAGE 리간드에 결합할수 있고, sRAGE는 mRAGE가 그들의 리간드에 결합하는 정도를 경쟁적으로 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
그러나 용해성 RAGE의 면역 및 염증 관련 질환에 대한 치료 효능 및 기작에 대한 연구는 밝혀진 바가 없다.
또한, 본 발명자들은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포가 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 면역질환의 치료 효과가 현저하게 우수함을 실험을 통해 확인하였다.
본 발명은 하기 화학식 1의 메트포민(Metformin)을 간엽줄기세포에 처리하는 것을 특징으로 하며, 메트포민은 IUPAC 명명법으로 N,N-Dimethylimidodicarbonimidic diamide이고, 분자식은 C4H11N5이며, 분자량은 129.16364이다.
화학식 1
Figure PCTKR2014007640-appb-C000001
따라서, 본 발명은 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공할 수 있으며, 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막 등에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포, 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다.
특히 본 발명에서 사용되는 상기 간엽줄기세포는, 동물의 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 말초혈액, 간, 폐, 양수, 태반의 융모막 또는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 지방조직 또는 말초혈액에서 유래한 것을 사용할 수 있다.
참고로, 간엽줄기세포는 상기와 같이 다양한 소스로부터 수득할 수 있는데, 간엽줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수 또는 지방조직으로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계; (2) 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 간엽줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM(Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM(Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10(Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1(Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A(McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신 등) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.
또한, 분리하여 배양한 간엽줄기세포의 확인은 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 바람직하게 본 발명에서 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조를 위해 사용할 수 있는 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 세포를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 다양한 소스로부터 유래한 간엽줄기세포를 면역질환의 치료 용도로 사용하고자 sRAGE를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환시킨 면역조절능을 갖는 새로운 간엽줄기세포를 제조하였다.
또한, 본 발명에서는 다양한 소스로부터 유래한 간엽줄기세포를 면역질환의 치료 용도로 사용하고자 메트포민을 처리하여 면역조절능을 갖는 새로운 간엽줄기세포를 제조하였다.
본 발명에서 간엽줄기세포에 도입한 상기 sRAGE는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자로 구성되며, 서열번호 1의 염기서열로부터 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 sRAGE를 코딩하는 염기서열은 당업계에 알려진 방법에 의하여 세포 내에 도입될 수 있는데, 예를 들면, 상기 서열은 그 자체의 서열 또는 벡터에 포함되어 도입될 수 있다. 핵산 서열을 세포에 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있는데, 예를 들면, 전기 천공(electroporation), 칼슘 포스페이트를 이용한 방법, 유전자 총(gene gun) 및 리포좀 방법을 포함하는 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 도입은 담체로서 바이러스를 사용하여 이루어질 수 있다. 상기 sRAGE를 코딩하는 염기서열은 세포의 게놈 내에 통합되거나 게놈과는 별개로 세포 내에 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 발명에서 벡터는, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터(예, SV40, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명자들은 상기 면역조절능을 갖는 새로운 간엽줄기세포를 대상으로 면역질환 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 그 결과, sRAGE 과발현 간엽줄기세포는 세포 내에서 면역조절능과 관련된 인자인 TGF-beta, IDO, HGF 및 IL-10 등의 유전자의 발현이 sRAGE가 과발현되지 않은 간엽줄기세포에 비해 현저하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 세포 이동 관련 유전자들의 발현도 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.
참고로 면역조절능과 관련성이 있는 상기 TGF-beta, IDO, HGF 및 IL-10 중에서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 면역계의 기능 및 활성을 측정하는 인자로 알려져 있으며, 최근 IL-10과 함께 염증을 억제하는 활성이 있는 것으로 밝혀졌고, TGF-beta(transforming growth factor beta)는 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3로 불리워지는 3개 이소폼이 존재하는 분비된 단백질로서, TGFβ는 큰 단백질 전구체로서 코딩되는데, TGFβ1은 390개 아미노산을 포함하고, TGFβ2 및 TGFβ3은 각각 412개 아미노산을 포함한다. 특히 TGFβ는 대부분의 세포에 대하여 성장억제 활성을 가지므로, TGFβ는 정상적인 TGFβ 수용체를 발현하는 암세포에 대해서도 성장억제 활성을 가진다(참조: Twardzik et al., J. Natl. Cancer Institute, 81:1182-1185, 1989). 따라서, 종양세포는 자체의 TGFβ 수용체 발현을 억제함으로써 TGFβ에 의한 성장저해로부터 벗어나기도 한다. 또한, TGF-beta 존재 하에서 Foxp3의 발현은 naive T cell로 부터 유도되고 이렇게 유도된 Treg은 동일한 면역 억제 기능을 갖는다. 또한 TGF-beta유전자의 결핍은 염증 면역세포의 활성을 제어하지 못하여 심한 자가 면역 질환을 유발시킨다.
나아가 본 발명자들은 sRAGE이 과발현되는 본 발명의 간엽줄기세포가 자가포식(autophagy) 작용 및 미토콘드리아 활성도 우수함을 확인하였는데, 자가포식 작용은 세균이 자신의 소기관이나 세포성분을 분해하는 과정으로서, 세포 외에서 고분자를 음작용이나 식작용 등의 세포내 섭취에 의해 받아들이는 헤테로파지와는 구분되는 작용이다. 세포가 영양소 결핍에 반응하여 자신의 단백질을 분해하거나, 세포의 재구축 등의 과정에서 불필요한 세포 성분을 제거하기 위해 작용하며, 세포 성분은 소포체에 유래하는 막에 둘러싸여 자식식포를 형성하고, 또한 리소솜과 융합하여 자식파고리소솜을 형성하여 분해하게 한다.
또한, 이러한 자가포식 작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명에서 sRAGE가 과발현되는 간엽줄기세포는 자가포식 작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료에 보다 유용할 수 있다. 미토콘드리아 활성이 조절되지 못하는 상황에서는 더 심한 염증이 생기며 이로 인하여 면역염증 질환의 발생에 미토콘드리아의 이상 반응이 매우 중요하다. 미토콘드리아 활성이 저하될 경우에는 병인 세포의 제어 시스템이 불안하게 되고 이로 인하여 과도한 세포의 활성이나 증식을 유발하게 된다.
따라서 본 발명에서는 실험을 통해 sRAGE이 과발현되는 간엽줄기세포의 경우, sRAGE이 과발현되지 않는 간엽줄기세포에 비해 자가포식 작용이 증가되었음을 확인할 수 있는 자가포식 소낭 증가를 확인하였고 미토콘드리아 활성 증가도 확인하였기에 본 발명의 간엽줄기세포를 효과적인 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에서 면역조절능을 갖는 sRAGE이 과발현되는 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 사용할 수 있으며, 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 세포치료제 조성물에는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포가 투여개체의 체중 kg당 2.5×105 내지 2.5×107 세포수로 투여되도록 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 투여개체의 체중 kg 당 1×104 내지 1×108 세포수를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내(intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에서 sRAGE 과발현 간엽줄기세포 및 상기 세포를 포함하는 면역질환 치료용 세포 치료제 조성물이 치료하고자 하는 상기 면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergies), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)을 포함할 수 있다.
메트포민은(Metformin)은 현재 비-인슐린 의존성 당뇨병 멜리튜스(non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)의 치료기술에서 사용되고 있는 경구용 항과혈당 약물로써, 기초 플라즈마 글루코스 및 식후의 플라즈마 글루코스를 모두 낮춤으로써 NIDDM 환자들에 있어서 글루코스 내성을 향상시킨다. 이처럼 메트포민(Metformin)은 주로 2형 당뇨병 치료제로 널리 이용되고 왔고, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 체중 감소, 암 치료제 등에 대해 임상적 접근이 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 메트포민을 이용한 면역질환 치료 기술 및 메트포민을 이용한 간엽줄기세포의 제조방법에 대한 내용은 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 이러한 메트포민과 간엽줄기세포를 이용한 새로운 면역질환 치료제를 개발하기 위해, 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 결과, 메트포민을 처리하여 배양 및 수득한 간엽줄기세포는 세포 내에서 면역조절능과 관련된 인자인 TGF-beta, IDO 및 IL-10 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 특히 말초혈액 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 군에 비해 TGF-beta가 약 10배 증가하는 것으로 나타났다(도 16 및 도 18 참조).
나아가 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조한 본 발명의 간엽줄기세포가 자가포식 작용 및 미토콘드리아 활성도 우수함을 확인하였다.
따라서 본 발명에서는 실험을 통해 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해 자가포식 작용이 증가되었음을 확인할 수 있는 자가포식 소낭 증가를 확인하였고 미토콘드리아 활성 증가도 확인하였기에 메트포민이 처리된 간엽줄기세포는 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다고 볼 수 있다.
또한, 본 발명은 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여, 28~42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 메트포민을 처리할 수 있는 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 사용할 수 있으며, 상기 메트포민은 간엽줄기세포 2×105~ 5×105 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 면역조절능을 갖는 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 메트포민 처리에 의해 제조된 간엽줄기세포 및 상기 세포를 포함하는 면역질환 치료용 세포 치료제 조성물이 치료하고자 하는 상기 면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
본 발명에 따른 sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 제작
<1-1> sRAGE 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터의 제작
본 발명자들은 sRAGE가 과발현되는 간엽줄기세포의 제작을 위해 먼저 sRAGE 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 제작하였다. 이를 위해 서열번호 1로 표시되는 sRAGE 유전자를 pcDNA 3.0-HA 벡터에 클로닝하여, 도 1의 재조합 벡터를 제작하였다.
<1-2> 말초혈액으로부터의 간엽줄기세포 분리 및 배양
정상인으로터 혈액을 50cc 채취한 후 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리하여 20% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 a-MEM 배지에서 5일간 배양 후 배양액 위에 뜬 세포들은 제거하였다. 이후 3일 간격으로 배지를 교체하였고, 세포증식 정도에 따라 세포를 배양 플레이트에서 떼어 재배양 시켰으며, 재배양은 3회 수행하여(passage 3) 말초 혈액으로부터 간엽줄기세포를 수득하였고, 수득한 세포가 간엽줄기세포인지를 확인하기 위해 세포 표지자를 확인하였다. 확인 결과, CD105, CD29 및 CD44는 양성이며, CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성임을 확인함으로써 분리한 세포가 간엽줄기세포임을 확인하였다.
<1-3> sRAGE 가 과발현되는 재조합 간엽줄기세포의 제작
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 재조합 벡터로 실시예 <1-2>에서 분리한 간엽줄기세포를 형질전환시켜 sRAGE가 과발현되는 간엽줄기세포를 제작하였다.
또한, 제작된 간엽줄기세포에서 실제로 sRAGE가 과발현되고 있는지 확인하기 위해 sRAGE를 포함하지 않는 벡터로 형질전환시킨 간엽줄기세포와 상기 본 발명에서 제작한 간엽줄기세포를 대상으로 sRAGE의 발현량을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 웨스턴블럿(western blot)을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제작한 sRAGE 과발현 간엽줄기세포에서 sRAGE가 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다(왼쪽 그래프는 ELISA 결과이며, 오른쪽 사진은 웨스턴 블럿 결과임).
<실시예 2>
sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 면역 또는 염증 관련 인자 조절 효과 분석
<2-1> 면역조절분자 및 케모카인 수용체( chemokine receptor )의 발현 유도 분석
본 발명자들은 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 대상으로 sRAGE의 과발현에 의해 간엽줄기세포 내에서 면역조절능과 관련된 유전자인 IDO, TGF-beta 및 HGF의 발현 변화를 실시간 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 사용하여 분석하였다. 그 결과, sRAGE가 과발현되는 간엽줄기세포의 경우, sRAGE가 과발현되지 않는 간엽줄기세포에 비해 IDO, TGF-beta 및 HGF의 발현이 유의적으로(약 2배 내지 6배) 증가한 것으로 나타났다(도 4A). 또한, 형광현미경 분석결과 IL-10 사이토카인 발현 역시 sRAGE 과발현에 의해 그 발현이 의미 있게 증가하는 것으로 나타났다(도 9). 이러한 결과는 sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 경우, sRAGE가 과발현되지 않는 세포에 비해, IDO, IL-10, HGF 및 TGF-beta의 발현이 현저하게 증가한다는 것을 보여준다.
나아가 간엽줄기세포의 이동과 관련된 인자인 CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR1 및 CXCR4의 발현 정도를 실시간 PCR을 수행하여 분석하였다. 그 결과, 위 인자들의 발현도 sRAGE의 과발현에 의해 현저하게 증가하는 것으로 나타났다(도 4B). 이와 같이 sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 경우, sRAGE가 과발현되지 않는 간엽줄기세포에 비해 세포 이동 관련 유전자들의 발현이 현저하게 증가하므로, 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포는 보다 효과적으로 염증 및 면역질환 치료를 위한 세포 치료제로 사용될 수 있다.
상기 각 인자들의 발현 정도를 분석하기 위해 PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
표 1
Figure PCTKR2014007640-appb-T000001
<2-2> 염증 및 종양 인자 억제 효과 분석
실시간 PCR을 이용하여 간엽줄기세포 내 염증 환경이 가해졌을 때의 유전자 발현을 관찰하였다. 간엽줄기세포 5×105 세포를 6-웰(well) 플레이트에 깔고 LPS 1ug/ml로 자극하면서 3일간 37℃ 하에서 배양하였다. 이 때, 대조군으로는 LPS가 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, LPS가 처리된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자의 발현 정도는 실시간 PCR 방법을 사용하여 분석하였다. 지방조직 유래의 간엽줄기세포에 LPS를 처리한 경우, LPS를 처리하지 않은 군에 비해 IL-1β, IL-6, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 및 HMGB-1(High-Mobility Group protein B1)이 각각 1.5 ~ 2배 정도 증가한 것으로 나타났다(도 4C).
이러한 간엽줄기세포에서 sRAGE를 과발현시킨후 이들의 발현이 조절되는지 조사한 결과 증가된 IL-1β, IL-6 및 HMGB-1의 발현이 sRAGE 과발현에 의해 모두 현저하게 감소되는 것을 관찰하였다(도 4D).
상기 PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
표 2
프라이머 명칭 서열
IL-1beta 정방향 GGA CAA GCT GAG GAA GAT GC
IL-1beta 역방향 TCG TTA TCC CAT GTG TCG AA
IL-6 정방향 AAT TCG GTA CAT CCT CGA CGG
IL-6 역방향 GGT TGT TTT CTG CCA GTG CC
HMGB-1 정방향 GAT CCC AAT GCA CCC AAG AG
HMGB-1 역방향 TTC GCA ACA TCA CCA ATG A
VEGF 정방향 CCA TGA ACT TTC TGC TGT CTT
VEGF 역방향 ATC GCA TCA GGG GCA CAC AG
<2-3> sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 자가포식 ( autophagy ) 작용 증가
지방조직 유래 간엽줄기세포에 sRAGE의 과발현을 유도하고 3일간 배양한 다음, 전자현미경으로 자가포식소낭 생성 정도를 관찰하였다. 도 10은 RAGE 함유 재조합 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포와 sRAGE를 함유하지 않은 mock 벡터로 형질전환된 간엽줄기세포를 대상으로 자가포식 활성 정도를 전자현미경을 통해 관찰한 사진으로, sRAGE-과발현 간엽줄기세포는 대조군에 비하여 포식 소낭(autophagic vacuoles)의 숫자가 증가한 것을 관찰할 수 있다.
<2-4> T세포 병인활성 억제 및 면역조절 T세포 증가 유도 효과 조사
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 대상으로 sRAGE의 과발현에 의한 간엽줄기세포 내 사이토카인의 발현수준 변화를 분석하였다. 이를 위해 상기 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 사람 CD4+T 세포와 함께 공조배양한 후, IFN-γ, IL-17, IL-4 및 Foxp3+Treg의 양을 측정하였다.
분석 결과, sRAGE가 과발현되지 않은 경우에 비해 간엽줄기세포에서 sRAGE가 과발현된 경우, Th1(IFN-γ)과 Th17(IL-17)의 양은 의미 있게 감소하였으나, Th2(IL-4)와 Foxp3+Treg은 약간 증가되는 경향을 보였다(도 3). 이러한 결과를 통해 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포는 sRAGE를 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비하여 Th1 및 Th17과 같은 염증성 이펙터(effector) T 세포는 감소시키고, Treg 및 Th2 세포는 감소시키지 않는 작용을 한다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 GVHD ( 이식편대숙주질환 ) 치료효과 분석
상기 본 발명에 따라 제조된 sRAGE-과발현 간엽줄기세포가 실제적으로 면역질환의 치료 효과에 유용한지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, sRAGE-과발현 간엽줄기세포에 의한 동종반응(Alloresponse)조절 효과를 관찰하기 위하여, CFSE(CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester)가 라벨된 mouse CD4+T 세포와 공조배양한 후 CFSE 발현양을 관찰하여 T 세포 증식도를 평가하였다.
분석 결과, Alloreactive T 세포의 증식이 간엽줄기세포나 sRAGE-간엽줄기세포(MSC)를 공조배양한 조건에서 의미 있게 감소하였으며, sRAGE-MSC는 더욱 의미 있게 Alloreactive T 세포의 증식이 억제되는 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, sRAGE 과발현 MSC에 의한 동종반응 조절에 있어서 T 세포 분화 조절에 대한 영향을 조사한 결과, 병인 Th1 및 Th17 세포는 sRAGE-MSC가 간엽줄기세포에 비해 더욱 감소되는 것으로 나타났고, Treg은 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
나아가 본 발명자들은 상기 실험 조건, 즉 동종반응(Alloresponse) 조건에서 배양액 내 사이토카인 레벨을 관찰한 결과, 본 발명의 sRAGE-MSC가 다른 군에 비해 효과적으로 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키는 것으로 나타났다(도 8 참조).
<실시예 4>
sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 관절염 치료효과 분석
sRAGE-과발현 간엽줄기세포가 관절염에도 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
<4-1> sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 류마티스 관절염 치료효과
먼저 자가면역 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, Y. Iwakura팀이 발표한 방법에 따라 IL-1 수용체 유전자를 결손시킨 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 제작하였는데, 이는 인터루킨1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1수용체에 직접 작용하여, IL-1α, IL-1β가 수용체에 작용하지 못하도록 함으로써 자연적으로 자가면역 관절염 질환이 유발되도록 하는 방법이다. 관절염이 유발된 마우스를 대상으로 본 발명에서 제조한 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 상기 질환 마우스에 주입하였는데, sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 2×106의 세포수로 상기 마우스에 i.v.로 주입하였고, 10일 후 이들 마우스로부터 혈청을 분리하여 혈청 내 존재하는 IgG, IgG1 및 IgG2a의 양을 분석하였다(도 11A). 이 때 대조군으로는 관절염이 유발된 마우스에 대해 sRAGE가 과발현되지 않는 간엽줄기세포만이 주입된 관절염 마우스의 혈청을 대상으로 상기 면역글로빈의 양을 측정한 것을 사용하였다. 또한, 관절염 치료 효과 분석은 각 마우스 군을 대상으로 관절염 지수를 측정하여 분석하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 관절염 증상이 개선되는 것으로 나타났고(도 11B), 면역반응에 작용하는 Th2 타입의 IgG1 및 IgG3의 생성이 모두 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(도 11C 참조).
<4-2> sRAGE -과발현 간엽줄기세포를 주입한 마우스 모델의 염증세포 침윤 분석
또한, 마우스 관절 조직 내 관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하기 위해, 각 그룹의 관절을 모아서 10 % 중성 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 조직 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본 염색을 진행하기 전에 자일렌(xylen)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 염색과정은 헤마톡실린과 에오진 염색을 진행하였다.
분석 결과, sRAGE가 과발현되지 않는 간엽줄기세포에 의해서도 관절염 억제효능이 나타났지만, sRAGE-과발현 간엽줄기세포를 주입받은 군에서 염증세포의 침윤과 연골파괴능이 현저하게 감소된 결과를 관찰하였다(도 11D).
<4-3> sRAGE -과발현 간엽줄기세포를 주입한 마우스 모델의 사이토카인 및 비장세포 내 T 세포 분석
각 마우스로부터 얻은 비장으로부터 면역화학염색법을 이용하여 사이토카인(IFN-γ, IL-17, IL-4 및 Foxp)을 염색하여 광학현미경으로 분석하였다. 각 마우스의 비장세포 내 T 세포 서브셋(subset)을 조사한 결과, 병인세포인 Th17(IL-17)세포는 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 sRAGE가 과발현된 간엽줄기세포를 주입한 마우스에 의해 의미 있게 감소된 반면, Treg(Foxp3+) 세포는 의미 있게 증가됨을 관찰하였다(도 12A,B).
또한, 비장세포로부터 유세포분석을 통하여 병인세포와 면역조절세포의 발현정도를 관찰한 결과, 병인세포인 Th1(IFN-γ), Th17(IL-17) 세포는 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 sRAGE가 과발현된 간엽줄기세포를 주입한 마우스에 의해 의미 있게 감소된 반면, Treg(Foxp3+) 세포는 의미 있게 증가됨을 관찰하였다(도 12C,D).
<실시예 5>
sRAGE -과발현 간엽줄기세포의 루푸스 ( lupus ) 치료효과 분석
추가로 본 발명에 따라 제조된 sRAGE-과발현 간엽줄기세포가 루푸스 동물모델 세포에 미치는 면역조절능력을 조사하였다. 루푸스 동물모델인 Roquin 마우스로 부터 세포를 분리하여 간엽줄기세포와 1:10의 비율로 3일간 공조배양한 뒤 배양액에 존재하는 IL-17의 양을 ELISA로 측정하였다.
그 결과, sRAGE가 과발현되지 않는 간엽줄기세포군에 비해, sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 경우 배양액 내 IL-17의 양이 더욱 감소되어 있었으며, 면역조절 T 세포의 활성은 더욱 증가되는 것을 FACs로 관찰하였다(도 13).
위 배양액 내에서 제조된 sRAGE-과발현 간엽줄기세포에 의한 항체조절능을 관찰한 결과, sRAGE 과발현 되지 않은 간엽줄기세포군에 비해 sRAGE-과발현 간엽줄기세포의 경우, 배양액 내 IgG 분비량이 더욱 감소되어 있음을 확인하였다(도 14).
이러한 결과를 통해, 루푸스 모델의 병인성 세포를 본 발명의 sRAGE-과발현 간엽줄기세포에 의해 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 6>
sRAGE -과발현 간엽줄기세포가 사람 T 세포 분화에 미치는 영향 분석
상기 실시예에서 제조한 sRAGE 과발현 간엽줄기세포를 사람 CD4+T 세포와 함께 공조배양하여 T 세포 분화에 미치는 영향을 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, sRAGE-과발현 간엽줄기세포는 대조군(sRAGE가 과발현되지 않은 MSC)에 비하여 Foxp3+ Treg을 더 증가시키는 것으로 나타났으며, Th1, Th17 세포는 의미 있게 감소시키는 것으로 나타났고, Th2세포는 큰 차이를 보이지 않는 것으로 조사되었다(도 5).
<실시예 7>
메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 제조 및 면역조절능을 갖는 유전자의 발현 정도 분석
<7-1> 말초혈액으로 간엽줄기세포 분리 및 배양
정상인으로부터 혈액을 50cc 채취한 후 PBMC를 분리하여 20% FBS가 포함된 a-MEM 배지에서 5일간 배양 후 배양액 위에 뜬 세포들은 제거하였다. 이후 3일 간격으로 배지를 교체하였고, 세포증식 정도에 따라 세포를 배양 플레이트에서 떼어 재배양시켰으며, 재배양은 3회 수행하여(passage 3) 말초 혈액으로부터 간엽줄기세포를 수득하였고, 수득한 세포가 간엽줄기세포인지를 확인하기 위해 세포 표지자를 확인하였는데, 확인 결과, CD105, CD29 및 CD44은 양성이며, CD34, CD45 및 HLA-DR은 음성임을 확인하였다(도 15A 참조, 도 15A에서 왼쪽은 100배 확대한 사진이며, 오른쪽 사진은 40배 확대한 사진이다).
<7-2> 지방조직으로부터 간엽줄기세포 분리 및 배양
지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2 ~ 0.3 g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2% 콜라게나아제(Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM[mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지(Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장 보조물(Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ml)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ml)]를 넣어 다시 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.
<7-3> 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조 및 제조된 간엽줄기세포에서 면역조절능과 관련된 유전자의 발현 정도 분석
상기 실시예 <7-1> 및 <7-2>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 메트포민을 각각 처리한 다음, 면역조절능과 관련된 유전자인 IDO, TGF-beta 및 IL-10의 발현 변화를 분석하였다.
구체적으로, 말초 혈액 유래의 간엽줄기세포에는 2×105 세포수를 기준으로 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였고, 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 2×105 세포수에 대해 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다.
이때, 대조군으로는 메트포민이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서 면역조절능 유전자의 발현 정도를 분석하였다.
분석결과, 말초혈액으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포의 경우, IDO 및 TGF-beta가 메트포민 처리에 의해 간엽줄기세포에서 발현이 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 TGF-beta는 약 10배정도 증가하여 발현된 것으로 나타났다(도 16 참조).
또한, 이러한 결과는 지방조직으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포에서도 유사하게 나타났는데, IDO, TGF-beta 및 IL-10의 발현 정도가 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 증가한 것으로 나타났다(도 19 참조).
나아가 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 DAPI 염색 방법을 통해서도 확인할 수 있었는데, 즉, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 염색 후 형광 현미경을 통해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서의 IL-10과 IDO의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 지방 조직 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해 붉은색으로 염색된 IL-10 및 IDO가 더 증가한 것으로 나타났다.
<7-4> 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조 및 제조된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자의 발현 정도 분석
상기 실시예 <7-1> 및 <7-2>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 메트포민을 각각 처리한 다음, 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6 및 IL-1beta의 발현 변화를 분석하였다.
구체적으로, 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 5×105 세포수에 대해 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다.
이때, 대조군으로는 메트포민이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자 유전자의 발현 정도는 realtime PCR 방법을 사용하여 분석하였다.
표 3
Figure PCTKR2014007640-appb-T000002
분석결과, 지방조직으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포의 경우, HMGB-1, IL-6 및 IL-1beta의 발현정도가 의미있게 감소되는 것으로 나타났다(도 17 참조).
따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포의 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해, 면역조절능을 갖는IDO, IL-10 및 TGF-beta의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인하였고, 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6 및 IL-1beta의 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.
<실시예 8>
메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서 자가소화작용( autophagy )의 활성과 미토콘드리아 활성 분석
상기 실시예 7에서 분리 및 배양한 말초혈액 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 제조한 면역조절능이 증가된 간엽줄기세포와 메트포민을 처리하지 않은 말초혈액 유래의 간엽줄기세포를 대상으로 전자 현미경을 통해 자가소화작용 활성과 미토콘드리아의 활성 변화를 관찰하였다.
이는 자가포식작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명자들은 메트포민이 처리된 본 발명의 간엽줄기세포가 자가포식작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료가 가능한지 확인하기 위함이다.
또한, 참고로 자가포식작용(autophagy)은 세포내부로 침입한 미생물(바이러스, 박테리아, 기생충 등)의 분해 관여한다고 알려져 있으며, 실제 면역반응과 그 조절에 관여 뿐만아니라 염증반응을 억제한다고 알려져 있다. 이는 다양한 병태 생리학적 과정에 대단히 중요한 역학을 하는 것을 보여주며 특히 자기방어(면역)체계를 조절할 수 있다. 최근 염증성 장질환 및 다양한 자가면역 질환에서 autophagy balance의 조절이 치료에 있어 중요함이 강조되고 있다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포는 메트포민을 처리하지 않은 군에 비해 자가포식 소낭(autophagic vacuoles)의 숫자가 증가하는 것으로 나타났으며(노란색 화살표), 미토콘드리아의 활성도 메트포민에 의해 증가된 것으로 나타났다(붉은색 화살표는 미토콘드리아를 가르키는 것임).
이러한 결과로부터 Met-MSC가 미토콘드리아 질환 치료에 효과적인 것을 알 수 있었다.
<실시예 9>
메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 골관절염 치료효과
상기 본 발명에 따라 제조된 메트포민이 처리된 간엽줄기세포가 실제적으로 면역질환의 치료 효과에 유용한지 확인하기 위해 먼저 골관절염 유발 동물모델을 대상으로 치료 효과를 조사하였다.
먼저, 골관절염 동물모델을 제작하기 위해 200 ~ 250g인 5주령 수컷 Wistar rat(중앙실험동물)을 21 ~ 22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후 골관절염 유도를 위해 3mg의 monosodium iodoacdtate(Sigma, ST. Louis, MO)를 오른쪽 무릎의 관절내에(intra-articular) 26.5G 주사기를 사용하여 50ul씩 주입하여 골관절염이 유도된 마우스 동물을 제작하였다.
이후, 골관절염이 유도된 마우스에 2×106의 지방조직유래 간엽줄기세포 및 1mM농도로 메트포민이 처리된 지방조직유래 간엽줄기세포를 1주일에 한번씩, 총 2회 i.v.로 주입하였다. 이후, 7일 경과한 다음, 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향을 평가하는 지표인 통증정도를 측정하였고, india ink 염색법으로 연골의 파괴정도를 분석하였다.
분석 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 통증반응정도가 정상 마우스에 거의 근접하게 회복되는 것으로 나타났고, 연골 파괴 정도도 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 처리한 군이 정상과 유사하게 회복되어 있는 것으로 나타났다. 참고로 도 21B 도면에서 위 아래의 도면은 골관절염이 유도된 마우스의 조인트(joint)를 다른 각도에서 관찰한 것을 나타낸 것이다.
나아가 본 발명자들은 7일이 경과한 후, H&E 염색, Toluidin blue 염색, saffranin O 염색 방법을 이용하여 염색 후 골관절염 유발 동물의 관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메포민이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스의 경우, 염증세포의 침윤이나 연골 파괴 정도가 의미있게 감소되어 있음을 확인하였다.
<실시예 10>
메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 염증성 장질환 치료효과
염증성 장질환의 마우스 모델을 제조하기 위해, 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 상기 마우스에 3.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환 유도 동물 모델을 제작하였다. 이후 상기 염증성 장질환 마우스 동물에 지방조직 유래 간엽줄기세포 및 메트포민이 1mM 농도로 처리된 지방조직유래 간엽줄기세포를 2×106의 세포수로 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 2회 주입하였고, 증상(몸무게, 대장의 길이, DAI(disease activity index))을 확인하였다.
분석 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 지방조직 유래 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 염증성 장질환으로 감소된 마우스의 몸무게가 더 효과적으로 회복되는 것으로 나타났고, IBD 질병 활성도 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며(거의 질병 활동도가 0임), 대장의 두께와 길이도 회복되어진 것으로 나타났고, 장길이의 단축 현상이 정상과 유사하게 회복되는 것으로 확인되었다.
나아가 본 발명자들은 7일이 경과한 후, 염증성 장질환 동물 모델에서 조직 내 병인 H&E 염색 방법을 이용하여 장내 염증세포 침윤 및 세포 조직 형태 변화와 immunochemistry 염색을 통한 TNF-a 발현정도를 분석하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 지방조직 유래 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 마우스의 장내 염증세포 침윤이나 세포조직 형태가 정상마우스와 유사하게 유지되는 것을 관찰하였으며, 또한 장에서 염증성 사이토카인인 TNF-a를 immunochemistry 염색을 통해 관찰한 결과도 마찬가지로 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우 정상의 장조직과 유사한 정도로 TNF-a의 발현양이 감소됨을 확인하였다.
<실시예 11>
메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 자연발생적 염증 자가면역관절염 치료효과
나아가 본 발명자들은 메트포민이 처리된 간엽줄기세포가 관절염에도 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저 자가면역 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, Y. Iwakura팀이 발표한 방법에 따라 IL-1 수용체 유전자를 결손시킨 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 제작하였는데, 이는 인터루킨1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1수용체에 직접 작용하여, IL-1α, IL-1β가 수용체에 작용하지 못하도록 함으로써 자연적으로 자가면역관절염 질환이 유발되도록 하는 방법이다.
관절염이 유발된 마우스를 대상으로 본 발명에서 제조한 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 상기 질환 마우스에 주입하였는데, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 2×106의 세포수로 상기 마우스에 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 3회 주입하였고, 1주일 후 이들 각 마우스들의 관절염 치수를 측정하였다. 이때 대조군으로는 관절염이 유발된 마우스 군, 지방조직 유래 간엽줄기세포만이 주입된 관절염 마우스군(메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포 처리군)을 사용하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 관절염 증상이 개선되는 것으로 나타났다(도 24 참조).
<실시예 12>
메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 자가항원 활성 유도를 통한 류마티스 관절염 치료효과
먼저 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, DBA/1J 마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(adjuvant) 1:1로 혼합하여, 마우스당 100ul의 CII를 tail base에 50ul 용량으로 주사하고, 2주 후 CII와 IFA 1:1 혼합액을 100ug/50ul로 2차 주입하였다.
마우스에 관절염을 유도시키고 1주일 후, 1주일에 1회 총3회 정맥을 통해 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포 또는 메트포민이 처리된 간엽줄기세포 1×105(체중 kg 당)를 투여한 후 관절염 평가를 진행하였다.
관절염 지수의 측정을 위해 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위증도를 평가하여 10주까지 관찰하였다. 이때 관절염의 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수에 기준하여 마리당 2차 접종 때 CII/CFA를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
0점 : 부족이나 종창이 없다.
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적
이때 마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1마리당 최고의 질병지수는 16이다.
분석결과 도 11에 나타난 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 관절염이 더욱 억제되는 것으로 나타났다(도 25 참조).
상기 실시예의 결과들은 sRAGE를 처리하여 제조한 본 발명의 간엽줄기세포에 면역반응을 효과적으로 조절할 수 있는 활성이 있어 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료를 위한 새로운 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있다는 점을 보여준다. 또한, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포는 면역반응을 효과적으로 조절할 수 있는 활성이 있어 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료를 위한 새로운 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (22)

  1. sRAGE(soluble receptor for advanced glycation endproducts)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 도입된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 sRAGE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 sRAGE를 암호화하는 뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 sRAGE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 간엽줄기세포 내에서 sRAGE를 발현시키는 벡터에 의해 도입된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해, IDO, TGF-beta, HGF 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해, IL-1, IL-6 및 HMGB-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 감소된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해, CCR1, CCR3, CCR4, CCR7, CXCR1 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 sRAGE의 과발현에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 투여개체의 체중 kg 당 2.5×105 내지 2.5×107 세포수로 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Dieseses), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergies), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 28 ~ 42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 메트포민은 간엽줄기세포 2×105~1×106 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 메트포민의 처리에 의해 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
  19. 제13항의 방법으로 제조된 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량 생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  20. 제19항의 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 조성물은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 투여개체의 체중 kg 당 2.5×105 내지 2.5×107 세포수로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(Mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
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