WO2018012993A1 - Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации - Google Patents
Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации Download PDFInfo
- Publication number
- WO2018012993A1 WO2018012993A1 PCT/RU2016/000426 RU2016000426W WO2018012993A1 WO 2018012993 A1 WO2018012993 A1 WO 2018012993A1 RU 2016000426 W RU2016000426 W RU 2016000426W WO 2018012993 A1 WO2018012993 A1 WO 2018012993A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- strains
- native
- treponemal
- cultures
- treponema
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
Definitions
- the invention relates to microbiology and can be used in studies of the biological properties of the causative agent of syphilis, while maintaining and maintaining the cultural strains of pale treponemas, as well as in the production technology of therapeutic and diagnostic preparations based on them.
- the causative agent of syphilis is pale treponema (spirochete), discovered in 1905 by F. Schaudinn and E. Hoffman. According to Bergey's classification, it belongs to the Gracillicutes division, the Spirochaetales order, the Spirochaetaceae family, the Treponema genus, the Treponema pallidum species, the Treponema pallidum pallidum subspecies ( ⁇ Identifier of the Bergie bacteria. Reference book in 2 volumes / edited by J. Holet, N. Kriga , P. Snita / transl. From English under the editorship of G.A. Zavarzin. - M.: Mir, 1997. - 800 p).
- Pale treponemas develop well on the chorionallant tissue of a chicken fetus, in rabbit serum with the addition of pieces of brain tissue under a layer of paraffin oil.
- the most common culture media for cultivating treponemes are culture media, the nutritional basis of which is bovine heart broth with pieces of liver or bovine heart with the addition of peptone and growth factors (Yu.A. Kozlov, Culture media in medical microbiology, M.: Medgiz, 1950, pp. 203-206 .; Handbook of Microbiological and Virological Research Methods, edited by MO Birger, Moscow: Medicine, 1973, pp. 47-92).
- the subculturing method is characterized by a number of significant drawbacks: the complexity, the high cost of nutrient media prepared on the basis of high-quality food raw materials, the danger of contamination the ministry of crops by extraneous microflora in the process of reseeding, the threat of changes in the basic biological properties of the pathogen.
- the indicated difficulties in preserving the strains lead to the need for systematic duplication of reseeding and maintaining ties with institutions that preserve the cultured strains of pale treponemes.
- cryoprotective media (cryoprotectants).
- Treponema pallidum pallidum Nichols strain which is not susceptible to cultivation on artificial nutrient media and is maintained exclusively in the body of a susceptible laboratory animal (rabbit). It includes: testicular infection of the rabbit with a culture of pathogenic pale treponema; obtaining from the testis suspension of microbes containing an extract of native tissues; suspension stabilization with a cryoprotectant (glycerin); separation into small aliquots of 0.75-1.5 ml; freezing and storage at a temperature of minus 70-80 ° ⁇ (RU 2292388 ⁇ , January 27, 2007).
- the objective of the invention is to develop a method that preserves the viability of the cultured strains of pale treponema for a long period of time, while simplifying the method and reducing costs associated with the acquisition and / or preparation of expensive food raw materials of proper quality (nutrient media) , and eliminating the danger of contamination of crops by extraneous microflora in the process of regular reseeding.
- the technical result is to increase the life span of the culture strains of pale treponemas.
- the method of maintaining the viability of the cultured pale treponem strains using cryopreservation involves obtaining stabilized microbial suspensions from native concentrated cultures of treponemal strains by adding a cryoprotective medium, followed by freezing and storage of stabilized microbial suspensions at a temperature of minus 40 ⁇ 2 " C.
- the addition of a cryoprotective medium can be carried out in a volume ratio of 1: 2 (about on a part of the protective environment and two parts of the culture of microbes.)
- Native concentrated cultures of treponemal strains are obtained from native deep cultures using the natural precipitation method followed by removal of the supernatant.
- treponemal strains are obtained from seed material on a commercial Omata Bouillon for Treponemus and Fusobacteria ”, the cultivation of which is carried out in meat and peptone broth with the addition of pieces of the liver.
- a cryopreservation medium of any composition can be used, which ensures the viability of culture treponemes during freezing and storage.
- a protective medium is used comprising, wt.%: Sucrose - from 7 to 8%, glycerin - from 28 to 32%, potassium disubstituted phosphate - from 0.5 to 0.7%, water - up to 100%.
- the technical result is achieved due to the fact that biomass of treponems is accumulated in a liquid nutrient medium, concentrated by natural sedimentation followed by decantation of the supernatant, and stabilization of the concentrated microbial suspension by cryoprotective sucrose-glycerol medium.
- the resulting preparation is packaged in separate airtight closures, for example, 5 ml each and immediately subjected to freezing for subsequent storage at a temperature of minus 40 ⁇ 2 ° ⁇ .
- the concentration of treponem biomass ensures the creation of the required seed dose for subsequent reseeding, the addition of a cryoprotective sucrose-glycerin medium determines the protective effect during freezing and storage, packing in separate airtight closures allows achieving optimal rates of freezing and thawing of the obtained product, and subsequent storage at minus 40 ⁇ 2 ° C ensures viable microorganisms for at least 18 months. (according to experimental studies).
- cryopreserved cultures of treponemal strains after reactivation can be used for direct inoculation of liquid nutrient media from the calculation of 10 contents of one closure per 0.25 - 0.5 l of medium;
- cryopreserved cultures in separate airtight closures allows fractional use of the initially prepared preparation without 20 deterioration of its properties and is repeatedly used as a seed;
- the method is as follows:
- native concentrated suspensions of treponemal strains are obtained using the natural sedimentation method, followed by decantation of the supernatant, which includes settling the microbial culture obtained at the previous stage for a day at a temperature of 20 ⁇ 2 ° ⁇ until a formed sediment is obtained, followed by aseptic removal of the supernatant. dosing fluid in a volume of 60 to 80% of the initial volume of the culture fluid;
- stabilized microbial suspensions of the treponemal strains are prepared by adding a cryoprotective medium comprising the following components, wt.%: sucrose - from 7 to 8%, glycerin - from 28 to 32%, potassium disubstituted phosphate - from 0.5 to 0.7% ;
- Stabilized microbial suspensions of the treponem strains are packaged in separate sealed closures;
- stabilized microbial suspensions of treponemal strains are frozen at a temperature of minus 40 ⁇ 2 "C; storage of cryopreserved microbial suspensions of treponemal strains is carried out at a temperature of minus 40 ⁇ 2" for up to 18 months.
- Example Na The method of cryopreservation of culture strains of pale treponema on the example of the strain Treponema pallidum pallidum Reiter
- the contents of the seeded flasks were thoroughly mixed with neat rotational movements and placed in a thermostat at a temperature of 37 ⁇ GS for a period of 7 to 10 days. Every day several times a day, the growing cultures were mixed with neat rotational movements to evenly distribute microbes throughout the entire volume of the medium.
- a cryoprotective medium was added to the concentrated suspension in a volume ratio of 1: 2.
- the contents of the container were thoroughly mixed. After that, the typicality of the morphology of microbes and the absence of extraneous microflora in native preparations of the “crushed drop” type were monitored using phase contrast microscopy.
- the stabilized microbial suspension was packaged in 5 ml in sterile 10 ml bottles, corked with rubber stoppers, which were fixed with metal caps. Packaged and labeled vials with a stable concentrated treponem culture were immediately placed in a low-temperature refrigerator with a temperature of minus 40 ⁇ 2 ° C for freezing and storage.
- Table 1 The results of assessing the viability and growth properties of cultural treponemal strains after freezing and storage in a cryopreserved state
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии. Предлагается способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использовани- ем криоконсервации. Осуществляют накопление биомассы трепонем в жидкой пита- тельной среде, концентрирование методом естественной седиментации с последую- щим декантированием надосадочной жидкости и стабилизацию концентрированной микробной суспензии защитной сахарозо-глицериновой средой. Полученный препарат расфасовывают в отдельные герметичные укупорки и подвергают замораживанию для последующего хранения при температуре минус 40±1 °С. Использование способа гарантированно позволяет сохранять жизнеспособ- ность и ростовые свойства культуральных штаммов трепонем в течение 18 мес.
Description
СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ШТАММОВ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОКОНСЕРВАЦИИ Область техники
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иссле- дованиях по изучению биологических свойств возбудителя сифилиса, при сохранении и поддержании культуральных штаммов бледных трепонем, а также в технологии производства лечебно-диагностических препаратов на их основе.
Предшествующий уровень техники
Возбудителем сифилиса является бледная трепонема (спирохета), открытая в 1905 г. F. Schaudinn и Е. Hoffman. По классификации Bergey она относится к отделу Gracillicutes, порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum, подвиду Treponema pallidum pallidum (^Определитель бактерий Берджи. Справочное пособие в 2-х томах / под ред.Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита / пер. с англ. под ред. Г.А.Заварзина. - М.: «Мир», 1997. - 800 с).
Бледных трепонем, выделенных из патологического материала от человека, практически никогда не удавалось поддерживать в патогенном состоянии на искус- ственных средах. Однако попытки выращивания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению определенного количества куль- тивируемых штаммов. Указанные штаммы трепонем, получившие название «культу- ральные» (в отличие от патогенных «тканевых» трепонем) являются авирулентными не только для человека, но и для чувствительных к сифилису лабораторных животных - кроликов и приматов.
Культуральные трепонемы несколько отличаются от тканевых по своим мор- фол огическим, биохимическим и патогенным свойствам. Однако особенно значимо то, что антигенные свойства их очень близки к патогенным вариантам возбудителя сифилиса. Наибольшее количество культуральных штаммов бледных трепонем в нашей стране выделили В.М.Аристовский и Р.Р.Гельтцер. Данные «казанские» (I, II, IV, V) и «ставропольские» (VI, VII, VIII, IX) штаммы наряду со штаммом Рейтера применяют для приготовления антигенов для серодиагностики сифилиса (Овчинни- ков, Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М.Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с).
Следует отметить, что возбудитель сифилиса является крайне прихотливым
микроорганизмом. Культуральные трепонемы по сравнению с другими гетеротроф- ными микроорганизмами отличаются высокими питательными потребностями, не растут на обычных питательных средах, развиваются в узком температурном и кис- лотно-щелочном диапазоне, требуют тщательного соблюдения анаэробных условий, характеризуются очень медленным (до 7-10 сут) ростом и низким накоплением био- массы.
Бледные трепонемы хорошо развиваются на хорионаллантойсной ткани кури- ного зародыша, в кроличьей сыворотке с добавлением кусочков мозговой ткани под слоем вазелинового масла. Наиболее распространенными питательными средами для выращивания культуральных трепонем являются среды, питательной основой кото- рых является бульон из бычьих сердец с кусочками печени или бычьего сердца с до- бавлением пептона и ростовых факторов (Ю.А. Козлов, Питательные среды в меди- цинской микробиологии, М.: Медгиз, 1950, с. 203-206.; Справочник по микробиоло- гическим и вирусологическим методам исследования под редакцией М.О. Биргера, М.: Медицина, 1973, с. 47-92). Были разработаны среды на основе смеси асцитиче- ской жидкости с печеночным бульоном (рН 7,4-7,6), в которых кусочки печени заме- нены кусочками агара или мелко нарезанного круто сваренного куриного желтка. Описано использование жидких питательных сред на основе белковых гидролизатов пищевого и непищевого сырья (RU 2198920 С1 , 20.02.2003). На рынке предлагается сухая коммерческая среда для получения биомассы трепонем штамма Рейтера - «Бу- льон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).
Наиболее близким по существу и назначению к заявляемому способу поддер- жания культуральных штаммов трепонем является традиционный метод субкульти- вирования (Овчинников, Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М.Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с), основанный на регулярных и частых (1 раз в 2-4 недели) пере- севах в жидких питательных средах. Для поддержания чистых культур наиболее ча- сто применяют жидкие питательные среды на основе мясопептонного бульона с до- бавлением кусочков телячьей печени в количестве 0,25% от объема питательной сре- ды с рН 8,0-8,4. Культивирование осуществляют при температуре 37±1 °С в течение 5-7 сут. в статических анаэробных условиях.
Необходимо учитывать, что метод субкультивирования характеризуется рядом существенных недостатков: трудоемкостью, высокой стоимостью питательных сред, приготовленных на основе высококачественного пищевого сырья, опасностью конта-
минации культур посторонней микрофлорой в процессе пересевов, угрозой измене- ния основных биологических свойств возбудителя. Указанные трудности сохранения штаммов приводят к необходимости систематического дублирования пересевов и поддержания связей с учреждениями, сохраняющими культуральные штаммы блед- ных трепонем.
Известно, что низкотемпературная консервация отличается небольшим повре- ждающим действием и расценивается многими авторами (Никитин, Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов / Е.Е. Никитин, И.В. Звя- гин. - Москва, 1979. - 337 с; Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. - Киев: Наукова думка, 1975. - 175 с.) как один из перспективных методов хранения микробных культур, который на сегодняшний день широко используется в лабора- торной практике. Эффективность данного метода определяется неукоснительным со- блюдением режима хранения и диапазоном используемых температур (Эшвуд-Смит, М. Консервирование микроорганизмов замораживанием, сушкой из замороженного состояния и обезвоживанием в эксикаторе / М. Эшвуд-Смит / пер. с англ. - Москва, 1982. - 36 с). Для повышения устойчивости микробов в процессе низкотемператур- ной консервации и последующего хранения необходимым является применение крио- защитных сред (криопротекторов).
Следует отметить, что аналогичный подход используется для сохранения жиз- неспособности патогенного штамма бледных трепонем {Treponema pallidum pallidum штамм Никольса), который не поддается выращиванию на искусственных питатель- ных средах и поддерживается исключительно в организме восприимчивого лабора- торного животного (кролика). Он включает в себя: тестикулярное заражение кролика культурой патогенной бледной трепонемы; получение из яичка взвеси микробов, со- держащей экстракт нативных тканей; стабилизацию суспензии криопротектором (глицерином); разделение на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл; заморажива- ние и хранение при температуре минус 70-80 °С (RU 2292388 О, 27.01.2007).
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего сохране- ние жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем в течение про- должительного периода времени, при упрощении способа и снижении затрат, связан- ных с приобретением и/или приготовлением дорогостоящего пищевого сырья надле- жащего качества (питательных сред), и устранении опасности контаминации культур посторонней микрофлорой в процессе осуществления регулярных пересевов.
Технический результат заключается в увеличении сроков сохранения жизнеспо- собности культуральных штаммов бледных трепонем.
Поставленная задача решается тем, что способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации включает получение стабилизированных микробных суспензий из нативных концен- трированных культур штаммов трепонем путем добавления криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспен- зйй при температуре минус 40±2 "С. В частном варианте осуществления изобретения добавление криозащитной среды может быть осуществлено в объемном соотношении 1 :2 (одна часть защитной среды и две части культуры микробов). Нативные концен- трированные культуры штаммов трепонем получают из нативных глубинных куль- тур с использованием метода естественного осаждения с последующим удалением надосадочной жидкости. Нативные глубинные культуры штаммов трепонем получа- ют из посевного материала на коммерческом «Бульоне Омата для трепонем и фузо- бактерий», выращивание которого осуществляют в мясопептонном бульоне с добав- лением кусочков печени. В заявляемом способе может быть использована криокон- сервирующая среда любого состава, обеспечивающая жизнеспособность культураль- ных трепонем при замораживании и хранении. В частном варианте осуществления изобретения использована защитная среда включающая, масс.%: сахарозу - от 7 до 8% , глицерин - от 28 до 32%, калий фосфорнокислый двузамещенный - от 0,5 до 0,7%, вода - до 100%.
Технический результат достигается за счет того, что осуществляют накопление биомассы трепонем в жидкой питательной среде, концентрирование методом есте- ственной седиментации с последующим декантированием надосадочной жидкости и стабилизацию концентрированной микробной суспензии криозащитной сахарозо- глицериновой средой. Полученный препарат расфасовывают в отдельные герметич- ные укупорки, например, по 5 мл и немедленно подвергают замораживанию для по- следующего хранения при температуре минус 40±2 °С.
Концентрирование биомассы трепонем обеспечивает создание необходимой посевной дозы для последующих пересевов, добавление криозащитной сахарозо- глицериновой среды обусловливает защитный эффект при замораживании и хране- нии, фасовка в отдельные герметичные укупорки позволяет достигать оптимальных темпов замораживания и размораживания полученного продукта, а последующее хранение при температуре минус 40±2 °С обеспечивает сохранение жизнеспособно-
сти микроорганизмов не менее 18 мес. (по данным экспериментальных исследова- ний).
Совокупность перечисленных операций и условий их выполнения обеспечива- ет получение следующих преимуществ:
5 при бесперебойной работе холодильного оборудования гарантированно сохра- няется жизнеспособность и ростовые свойства культуральных штаммов бледных трепонем не менее 18 мес;
криоконсервированные культуры штаммов трепонем после реактивации могут быть использованы для непосредственного засева жидких питательных сред из расче- 10 та содержимое одной укупорки на 0,25 - 0,5 л среды;
осуществление контроля на всех этапах приготовления криоконсервированных культур штаммов трепонем гарантирует отсутствие посторонней микрофлоры и сни- жение связанных с этим потерь, наблюдаемых в процессе многократных пересевов; сроки культивирования штаммов трепонем в анаэробных условиях при темпе- 15 ратуре 37=1=1 °С при использовании в качестве посевного материала криоконсервиро- ванных культур практически не отличаются от аналогичных при использовании в ка- честве посевного материала глубинных культур (7-10 сут.);
хранение криоконсервированных культур в отдельных герметичных укупор- ках позволяет дробно использовать первоначально приготовленный препарат без 20 ухудшения его свойств и многократно применять в качестве посевного материала;
при систематическом применении данного способа снижаются прямые мате- риальные и трудовые затраты, связанные с приобретением и приготовлением пита- тельных сред, осуществлением регулярных пересевов, в том числе при временном прекращении работ с культуральными штаммами бледных трепонем.
25 Лучший вариант осуществления изобретения
Способ осуществляют следующим образом:
получают посевной материал штаммов трепонем путем выращивания микро- бов, например, в мясо-пептонном бульоне с добавлением от 20 до 25 % по объему ку- сочков вареной говяжьей печени в колбах в анаэробных условиях при температуре 30 37±ГС в течение от 7 до 10 сут.;
получают нативные глубинные культуры штаммов трепонем путем выращива- ния микробов, например, в коммерческой жидкой питательной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия) с добавлением коммерческой сыворотки крупного рогатого скота в колбах в анаэробных условиях
при температуре 37± С в течение от 7 до 10 сут. в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы 120±10 оборотов мин"1;
получают нативные концентрированные суспензии штаммов трепонем с ис- пользованием метода естественной седиментации с последующим декантированием надосадочной жидкости, который включает отстаивание полученной на предьщущем этапе микробной культуры в течение суток при температуре 20±2°С до получения оформленного осадка с последующим удалением в асептических условиях надоса- дочной жидкости в объеме от 60 до 80 % от исходного объема культуральной жидко- сти;
готовят стабилизированные микробные суспензии штаммов трепонем путем добавления криозащитной среды, включающей следующие компоненты, мас.%: саха- розу - от 7 до 8 %, глицерин - от 28 до 32 %, калий фосфорнокислый двузамещенный - от 0,5 до 0,7 %;
в стабилизированных микробных суспензиях штаммов трепонем осуществля- ют контроль внешнего вида, типичности свойств микробов и отсутствия посторонней микрофлоры методом фазово-контрастной микроскопии в нативных препаратах типа «раздавленная капля»;
производят фасовку стабилизированных микробных суспензий штаммов тре- понем в отдельные герметичные укупорки;
в течение 1 часа с момента приготовления стабилизированные микробные сус- пензии штаммов трепонем замораживают при температуре минус 40±2 "С; хранение криоконсервированных микробных суспензии штаммов трепонем осуществляют при температуре минус 40±2 "С сроком до 18 мес.
Осуществимость заявляемого способа с достижением технического результата подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример Na 1. Способ криоконсервации культуральных штаммов бледной тре- понемы на примере штамма Treponema pallidum pallidum Рейтера
Для получения посевного материала трепонем в колбу вместимостью 0,5 л, за- полненную на три четверти стерильным мясопептонным бульоном с кусочками пече- ни под ватно-марлевой пробкой, асептически вносили культуру штамма Рейтера в ко- личестве от 40 до 60 мл. Для создания анаэробных условий на поверхность засеянной среды осторожно наслаивали предварительно расплавленный на водяной бане сте- рильный медицинский вазелин, чтобы получилась герметичная пробка высотой 1,5-
2,0 см. Содержимое засеянных колб тщательно перемешивали аккуратными враща-
тельными движениями и помещали в термостат при температуре 37±ГС на срок от 7 до 10 сут. Ежедневно несколько раз в день осуществляли перемешивание растущих культур аккуратными вращательными движениями для равномерного распределения микробов по всему объему среды.
Для получения нативной глубинной культуры в колбу вместимостью 0,5 или 1 л, заполненную на три четверти стерильным коммерческим бульоном Рейтера с до- бавлением 10 % нативной сыворотки крупного рогатого скота, асептически вносили приготовленный на мясопептонном бульоне посевной материал в количестве около 10-20 % по объему. Для создания анаэробных условий на поверхность засеянной сре- ды осторожно наслаивали предварительно расплавленный на водяной бане стериль- ный медицинский вазелин, чтобы получилась герметичная пробка высотой 1,5-2,0 см. Содержимое засеянных колб тщательно перемешивали и помещали в шейкер- инкубатор при температуре 37± С и частоте движения платформы 120±10 кача- ний-мин-1 на срок от 7 до 10 сут. Ежедневно несколько раз в день осуществляли ви- зуальный контроль роста.
Для получения концентрированной нативной культуры по окончании выращи- вания колбы оставляли при комнатной температуре на 24 ч для уплотнения осадка. По истечении указанного срока из каждой колбы асептически с помощью стерильной стеклянной лопаточки удаляли вазелиновую пробку. Затем с помощью вакуума из каждой колбы очень осторожно удаляли надосадочную жидкость (от 60 до 80 %) та- ким образом, чтобы не нарушить целостность осадка. Кондиционные осадки со всех колб асептически мерно объединяли в одну стерильную емкость. Культуру подобным образом сконцентрировали в 30 раз. После этого осуществляли контроль типичности морфологии и наличия посторонней микрофлоры с помощью микроскопии.
К концентрированной суспензии добавляли криозащитную среду в объемном соотношении 1 :2. Содержимое емкости тщательно перемешивали. После этого осу- ществляли контроль типичности морфологии микробов и отсутствия посторонней микрофлоры в нативных препаратах типа «раздавленная капля» с помощью фазово- контрастной микроскопии.
Стабилизированную микробную суспензию расфасовали по 5 мл в стерильные флаконы емкостью 10 мл, укупоривали резиновыми пробками, которые фиксировали металлическими колпачками. Расфасованные и промаркированные флаконы со стаби- лизированной концентрированной культурой трепонем немедленно помещали в низ- котемпературный рефрижератор с температурой минус 40±2 "С для замораживания и
хранения.
Заявляемым методом было приготовлено 3 серии криоконсервированных куль- тур. В процессе хранения регулярно проводили контроль сохранности жизнеспособ- ности и ростовых свойств микробов (таблица 1). Для этого флаконы с криоконсерви- рованной культурой штамма реактивировали в течение 30 мин. при температуре 37±ГС, а затем засевали в колбы емкостью 0,25 л, содержащие мясопептонный буль- он с кусочками печени. Выращивание осуществляли от 7 до 10 сут. при температуре 37± С при ежедневном перемешивании, макро- и микроскопическом контроле роста.
Заявляемый способ был апробирован с использованием культуральных штам- мов Treponema pallidum pallidum «Казань» V, «Ставрополь» VII, «Ставрополь» VIII, «Ставрополь» IX (см. примеры 2 - 5 таблицы 1).
Результаты проведенных исследований показывают, что после замораживания и хранения криоконсервированных культур культуральных штаммов трепонем в те- чение 18 мес. при температуре минус 40±2 °С их ростовые свойства в жидкой пита- тельной среде практически не отличаются от аналогичных показателей для микробов, хранившихся в течение 1-2 мес. при комнатной температуре в мясо-пептонном буль- оне с кусочками печени.
Таблица 1 - Результаты оценки жизнеспособности и ростовых свойств культуральных штаммов трепонем после замораживания и хране- ния в криоконсервированном состоянии
Claims
1. Способ сохранения жизнеспособности культу ральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации, включающий получение стабилизи- рованных микробных суспензий из нативных концентрированных культур штаммов трепонем путем добавления криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспензий при температуре минус 40±2 °С.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что добавление криозащитной среды осуществляют в объемном соотношении 1 :2.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что нативные концентрированные культуры штаммов трепонем получают из нативных глубинных культур с использо- ванием метода естественного осаждения с последующим удалением надосадочной жидкости.
4. Способ по п.З, характеризующийся тем, что нативные глубинные культуры штаммов трепонем получают из посевного материала на коммерческом «Бульоне Омата для трепонем и фузобактерий», выращивание которого осуществляют в мясо- пептонном бульоне с добавлением кусочков печени.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что используют сахарозо- глицериновую криозащитную среду.
6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что криозащитную среду используют с содержанием следующих компонентов, масс.%: сахароза - от 7 до 8% , глицерин - от 28 до 32%, калий фосфорнокислый двузамещенный - от 0,5 до 0,7%, вода - осталь- ное.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2016/000426 WO2018012993A1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2016/000426 WO2018012993A1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018012993A1 true WO2018012993A1 (ru) | 2018-01-18 |
Family
ID=60953167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2016/000426 Ceased WO2018012993A1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2018012993A1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4226940A (en) * | 1979-06-21 | 1980-10-07 | Great Lakes Biochemical Co., Inc. | Non-frozen concentrated bacterial cultures |
| SU1650098A1 (ru) * | 1987-08-17 | 1991-05-23 | Ставропольский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток | Способ серодиагностики сифилиса |
| RU2344169C1 (ru) * | 2007-04-26 | 2009-01-20 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи "(ФГУ "ГНЦД Росмедтехнологий") | Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum |
| WO2012098358A1 (en) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Biopharma Technology Ltd | Freeze drying method |
-
2016
- 2016-07-11 WO PCT/RU2016/000426 patent/WO2018012993A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4226940A (en) * | 1979-06-21 | 1980-10-07 | Great Lakes Biochemical Co., Inc. | Non-frozen concentrated bacterial cultures |
| SU1650098A1 (ru) * | 1987-08-17 | 1991-05-23 | Ставропольский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток | Способ серодиагностики сифилиса |
| RU2344169C1 (ru) * | 2007-04-26 | 2009-01-20 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи "(ФГУ "ГНЦД Росмедтехнологий") | Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum |
| WO2012098358A1 (en) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Biopharma Technology Ltd | Freeze drying method |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ?OX??EH?O B.?. ? ?P: "Me?o?? ????e????o xpa?e??? ?o??e???o???x ??????p ???poop?a????o? ? ?e??????? pa??????", ???E???? ??C??X ??E???X ?A?E?E???, vol. 12, no. 4, 2009, pages 99 - 121 * |
| HOLLANDER DAVID H. ET AL.: "Improved Preservation of Treponemna pallidum and Other Bacteria by Freezing with Glycerol", APPL MICROBIOL., vol. 2, no. 3, 1954, pages 164 - 170, XP055459832 * |
| SPIROLATE BROTH, HIMEDIA LABORATORIES, 2011, pages 1 - 2, XP055457301, Retrieved from the Internet <URL:http://himedialabs.com/TD/M412.pdf> * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cleland et al. | Glycine betaine as a cryoprotectant for prokaryotes | |
| Day | Cryopreservation of microalgae and cyanobacteria | |
| CN104026118A (zh) | 一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用 | |
| RU2600883C1 (ru) | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации | |
| Kumar et al. | Preservation and maintenance of microbial cultures | |
| CN111296412A (zh) | 一种无血清低dmso细胞冻存液及其应用 | |
| CN108102982A (zh) | 麦氏弧菌的真空冷冻干燥保护剂及其保藏方法 | |
| WO2018012993A1 (ru) | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации | |
| Aizdaicher et al. | The development of Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent) Drew et Ross, 1965 (Rhodophyta) from Amursky Bay, sea of Japan, in a laboratory culture | |
| CN108782466A (zh) | 一种保藏秀丽隐杆线虫的方法 | |
| Cañavate et al. | Effects of culture age on cryopreservation of marine microalgae | |
| Kim et al. | Production of antifreeze proteins by cold-adapted yeasts | |
| CN104762208B (zh) | 一种黑牛肝菌母种低温保藏方法 | |
| Malik | Preservation of unicellular gree algae by a liquid-drying method | |
| Liu et al. | Spore-to-spore agar culture of the myxomycete Physarum globuliferum | |
| Day | Cryopreservation of macroalgae | |
| Boileau et al. | Lyophilization of Bdellovibrio bacteriovorus 109J for long‐term storage | |
| RU2541452C1 (ru) | Способ длительного хранения микроводорослей | |
| RU2292388C1 (ru) | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем | |
| CN101856320A (zh) | 茶树菇发酵美白液的制备方法 | |
| Salas-Leiva et al. | Criopreservación de las microalgas Chaetoceros calcitrans (Paulsen): análisis del efecto de la temperatura de DMSO y régimen de luz durante diferentes períodos de equilibrio | |
| CN105802891B (zh) | 一种血液琼脂培养基及一次性苛养菌培养板及其制备方法 | |
| KR102845001B1 (ko) | 공융용매를 이용한 종균 안정성 유지 방법 | |
| CN106857498A (zh) | 一种不含二甲基亚砜的细胞冻存保护液及其应用 | |
| RU2726299C1 (ru) | Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 16908959 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 16908959 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |