RU2292388C1 - Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем - Google Patents
Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем Download PDFInfo
- Publication number
- RU2292388C1 RU2292388C1 RU2005117086/13A RU2005117086A RU2292388C1 RU 2292388 C1 RU2292388 C1 RU 2292388C1 RU 2005117086/13 A RU2005117086/13 A RU 2005117086/13A RU 2005117086 A RU2005117086 A RU 2005117086A RU 2292388 C1 RU2292388 C1 RU 2292388C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- suspension
- pale
- rabbit
- pathogenic
- treponema pallidum
- Prior art date
Links
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000035899 viability Effects 0.000 title claims description 4
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 title abstract description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 25
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- 241000589886 Treponema Species 0.000 claims description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 201000005737 orchitis Diseases 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 206010001526 Air embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N cortisol 21-acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229960001067 hydrocortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000004706 scrotum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской микробиологии. Предлагается способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем путем замораживания. Из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстрагирования в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, и затем добавляют 15% глицерина от общего объема среды. Полученный продукт после перемешивания разделяют на аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленно замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С. Использование способа гарантированно позволяет сохранять вирулентность возбудителя; за счет возможности дробного использования аликвот, содержащих взвесь возбудителя в криопротекторе, возможно произвольно регулировать время работы по перевивке штамма и получению взвеси микроорганизма.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано в эксперименте по изучению биологических свойств возбудителя сифилиса, при сохранении и поддержании штамма патогенных бледных трепонем для целей промышленного производства, в специализированных лабораториях при серодиагностике сифилиса с использованием реакций иммобилизации и непрямой иммунофлюоресценции.
Возбудитель сифилиса, бледная трепонема, был выделен в 1905 году, относится к виду Treponema pallidum (Schaudin et Hoffman). В последующие годы путем заражения лабораторных животных (приматы, кролики, морские свинки, мыши) биологическим материалом от больных сифилисом людей были получены, а затем и детально охарактеризованы штаммы патогенной бледной трепонемы (Никольса, Будапештский, 1 Иркутский, VIII и XII ЦКВИ и другие), последующее сохранение штаммов проводилось путем регулярных перевивок на лабораторных животных.
Попытки выращивания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению определенного количества штаммов культуральной бледной трепонемы (штаммы Ставрополь 1-5,7-9, Рейтера и другие). При изучении морфологии и биологии установлены определенные различия между штаммами патогенных и культуральных бледных трепонем, выявлены различия антигенных детерминант даже внутри этих двух групп бледной трепонемы. Ни одна из культур бледной трепонемы не обладает патогенностью для человека.
Имеются публикации о возможности 1-3-кратного пассирования патогенной бледной трепонемы на культурах клеток, но при этом отмечается постепенная утрата способности к росту и размножению через один-два пассажа, что приводит в конце концов к гибели штамма.
В качестве лабораторного животного для сохранения и перевивки патогенной бледной трепонемы наиболее приемлемым является кролик. Разработаны различные способы получения взвеси возбудителя для экспериментальных и исследовательских целей (заражение в переднюю камеру глаза, внутрикожная инокуляция на выбритых участках на спине или на мошонке, заражение внутрь яичка и другие) (Н.М.Овчинников. Экспериментальный сифилис. - М.: Медгиз, 1955. - С.388).
Основным недостатком метода является необходимость регулярных перевивок штамма, учет возможности потери штамма не только по причине непреднамеренного нарушения методики перевивки, но и по причине гибели лабораторного животного. Для более успешного получения взвеси с обильным содержанием возбудителя применяют дополнительное введение кроликам суспензии гидрокортизона, что приводит к снижению функции механизмов гуморального и клеточного иммунитета животных и может повышать смертность при неблагоприятных условиях. Указанные трудности сохранения штаммов приводят к необходимости систематического дублирования количества заражаемых животных, поддержания множества коммерческих связей с учреждениями, также сохраняющими штаммы патогенной бледной трепонемы.
Известен способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем в тканях яичка, полученного через 7 дней после заражения кролика, при замораживании яичка в цельном виде при температуре минус 20°С (В.Е.Павловская. Применение замороженного антигена для реакции иммобилизации бледных трепонем. // Лабораторное дело. - 1964. - №11. - С.668-670). Этот способ выбран за прототип.
Основные недостатки указанного способа: автором отмечено стабильное сохранение подвижности трепонем лишь в течение 1-2 недель и существенное понижение количества бледных трепонем в материале, полученном из тканей яичка, хранившихся в течение 3-4 недель. Кроме того, автором показано выраженное снижение вирулентности бледных трепонем в процессе хранения: при перевивке штамма материалом из яичка зараженного кролика, сохранявшимся в течение 30 суток при температуре минус 20°С, сроки образования сифилитического орхита увеличивались до 20-30 дней по сравнению с 7 днями инкубации при использовании свежей, не подвергавшейся замораживанию взвеси микроорганизмов. Отсутствие стабильности в сроках получения сифилитических орхитов по описанному способу не позволяет уверенно планировать экспериментальные и лабораторные исследования, приводит к неоправданным материальным затратам по дополнительному содержанию здоровых животных перед началом опыта. Возможно лишь однократное использование сохраненного биологического материала.
Задачей изобретения является увеличение сроков сохранения жизнеспособности штаммов патогенной бледной трепонемы, снижение прямых экономических затрат на приобретение и содержание лабораторных животных-дублеров, создание возможности произвольно регулировать (приостанавливать) работы по перевивке штаммов в ситуациях экономического или эпидемиологического характера.
Эта задача достигается за счет того, что из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстракции в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, добавляют к ней 15% глицерина от общего объема среды, после перемешивания разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленного замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С.
Добавление 15% глицерина в качестве криопротектора препятствует разрушению микроорганизмов, разделение на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл позволяет достигать оптимальных темпов замораживания и размораживания полученного продукта, а последующее хранение при температуре минус 70-80°С обеспечивает сохранение жизнеспособности микроорганизмов без потери их вирулентности не менее года (по данным экспериментальных исследований).
Преимущества указанного способа:
- при бесперебойной работе холодильного оборудования гарантированно сохраняется вирулентность патогенной бледной трепонемы;
- взвесь патогенной бледной трепонемы может быть использована для заражения кроликов непосредственно после размораживания (оттаивания) без дополнительного отмывания или другой обработки, так как среда сохранения включает тканевые компоненты, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов, и не содержит материалов или ингредиентов, способных вызывать реакцию несовместимости или отторжения со стороны лабораторного животного;
- сроки развития сифилитического орхита при применении взвеси патогенной бледной трепонемы, сохранявшейся по предлагаемому способу, не отличаются от сроков развития после заражения свежей взвесью возбудителя (7±2 дня);
- хранение взвеси в виде раздельных аликвот позволяет дробно использовать первоначально приготовленный биологический материал без ухудшения его свойств и многократно воспроизводить перевивки штамма;
- при систематическом применении данного способа снижаются прямые затраты, связанные с приобретением и содержанием лабораторных животных-дублеров (не менее чем в 2 раза) или необходимых для пассажей кроликов при временном прекращении работ по перевивке штамма бледной трепонемы.
Способ осуществляется следующим образом:
Из зараженного бледными трепонемами яичка кролика путем механического измельчения и экстрагирования в растворе натрия хлорида изотонического получают взвесь штамма патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, добавляют 15% глицерина от общего объема среды, перемешивают, разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл и немедленно замораживают для последующего хранения при температуре минус 70-80°С.
Пример №1
Кролик №8196 (пассаж 389) был умерщвлен 18 ноября 2003 г., от него с соблюдением стерильных условий были получены два яичка, каждое из которых освободили от оболочек и механически измельчили путем многочисленного разрезания хирургическими ножницами. К приготовленной массе добавили по 5,0 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического и произвели экстрагирование при покачивании на платформе орбитального шейкера. Крупные элементы ткани яичка кролика были осаждены при центрифугировании со скоростью до 1000 об/мин, полученную взвесь патогенных бледных трепонем с соблюдением условий стерильности мерной пипеткой перенесли в пробирку, добавили 15% от общего объема стерильного глицерина и тщательно перемешали. Подготовленную к сохранению взвесь разлили на аликвоты в пробирки типа эппендорф по 1,0 мл; пробирки укупорили крышками и поместили в морозильную камеру с температурой минус 70-80°С.
Через 2,5 месяца хранения (03 февраля 2004 г.) содержимое 2 пробирок после оттаивания при комнатной температуре использовали для заражения кролика №8217 (по 1,0 мл внутрь яичка с каждой стороны). Через 7 дней после заражения (10 февраля 2004 г.) у кролика развился двусторонний специфический орхит. Яички удалены, и по описанной выше методике приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем, которая была использована в качестве антигена для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) и реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ), а также для заражения кролика №8219, у которого, в свою очередь, через 7 дней наблюдали развитие специфического орхита с обеих сторон.
Пример №2
23 марта 2004 г. от кролика №8231 (пассаж 405) по стандартной методике была приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса, к ней добавлено 15% глицерина. После тщательного перемешивания взвесь была разлита в пробирки типа эппендорф по 1,5 мл, пробирки закрыты крышками и помещены в морозильную камеру с температурой минус 70-80°С.
Взвесь сохранялась при температуре минус 70-80°С в течение 12,5 месяцев и была использована 12 апреля 2005 г. для заражения кролика №8296. После размораживания при комнатной температуре и тщательного перемешивания материал набирали в шприц и вводили внутрь яичка по 1,0 мл с каждой стороны. Для снижения темпов выработки антител кролик перед заражением и через 4 дня после него получил две внутримышечные инъекции суспензии гидрокортизона ацетата в разовой дозе 0,4 мл. На 7-ой день после заражения (19.04.2005 г.) кролик был умерщвлен путем воздушной эмболии, и по стандартной методике приготовлена взвесь патогенных бледных трепонем, которая содержала до 400 бледных трепонем в поле зрения микроскопа (хорошая плотность взвеси). Материал был использован в качестве антигена для постановки серологических реакций (РИБТ и РИФ), а также для очередного пассажа на кролике №8297, у которого в свою очередь через 7 дней (26.04.2005 г.) наблюдали развитие специфического орхита с обеих сторон.
Claims (1)
- Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем, включающий заражение штаммом патогенной бледной трепонемы яичка кролика и замораживание, отличающийся тем, что из зараженного яичка кролика путем экстракции раствором натрия хлорида изотонического получают взвесь патогенных бледных трепонем, содержащую экстракт нативных тканей яичка зараженного кролика, добавляют 15% от общего объема взвеси глицерина, перемешивают, разделяют на небольшие аликвоты объемом 0,75-1,5 мл, немедленно их замораживают и хранят при температуре -(70-80)°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005117086/13A RU2292388C1 (ru) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005117086/13A RU2292388C1 (ru) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2292388C1 true RU2292388C1 (ru) | 2007-01-27 |
Family
ID=37773445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005117086/13A RU2292388C1 (ru) | 2005-06-06 | 2005-06-06 | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2292388C1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2344169C1 (ru) * | 2007-04-26 | 2009-01-20 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи "(ФГУ "ГНЦД Росмедтехнологий") | Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
| RU2650786C1 (ru) * | 2017-09-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Калужский Государственный Университет им. К.Э. Циолковского" | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |
| RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4098646A (en) * | 1977-01-27 | 1978-07-04 | Florida Institute Of Technology | Method of in vitro cultivation of pathogenic organisms of treponema pallidum and medium therefor |
-
2005
- 2005-06-06 RU RU2005117086/13A patent/RU2292388C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4098646A (en) * | 1977-01-27 | 1978-07-04 | Florida Institute Of Technology | Method of in vitro cultivation of pathogenic organisms of treponema pallidum and medium therefor |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПАВЛОВСКАЯ В.Е. Применение замороженного антигена для реакции иммобилизации бледных трепонем. Лабораторное дело. № 11, 1964, с.160. Применение замораживания - высушивания в биологии. Под ред. Р.ХАРРИСА. - М.: изд. "Иностранная литература", 1956, с.49-64. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2344169C1 (ru) * | 2007-04-26 | 2009-01-20 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи "(ФГУ "ГНЦД Росмедтехнологий") | Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum |
| RU2600883C1 (ru) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "КАНЦЕРНЕТ" | Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации |
| RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
| RU2650786C1 (ru) * | 2017-09-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Калужский Государственный Университет им. К.Э. Циолковского" | Способ криоконсервации клеток цианобактерий |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Heritage et al. | Introductory microbiology | |
| Mahony et al. | Stable L-forms of Clostridium perfringens and their growth on glass surfaces | |
| Mourad et al. | Active immunization of mice against Candida albicans | |
| EP2849780B1 (en) | Fish vaccine | |
| JPH01230532A (ja) | 新規なワクチン及びその製法 | |
| CN105462936B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒my01株及其应用 | |
| Cox | Culture of Treponema pallidum | |
| CN103432578B (zh) | 一种仔猪红痢c型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 | |
| RU2292388C1 (ru) | Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем | |
| Stott et al. | Experimental transmission of epizootic bovine abortion (foothill abortion) | |
| RU2159127C1 (ru) | Вакцина против псевдомоноза пушных зверей | |
| Salmakov et al. | Comparative study of the immunobiological properties of live brucellosis vaccines | |
| US4464470A (en) | Replication of virulent treponema pallidum in tissue culture | |
| Brem et al. | L forms of Listeria monocytogenes: I. In Vitro Induction and Propagation of L forms in All Serotypes | |
| CN101574516A (zh) | 草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN116426471A (zh) | 一种黄鳍鲷脾脏细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN107974417A (zh) | 钙离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用 | |
| US3843451A (en) | Microorganism production | |
| Alexander et al. | A new pathogenic Leptospira, not readily cultivated | |
| Kaplan et al. | A method for preparing smallpox vaccine on a large scale in cultured cells | |
| Schmitt-Slomska et al. | Induction of L-variants in human diploid cells infected by group A streptococci | |
| RU2553557C2 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов | |
| RU2344169C1 (ru) | Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum | |
| Leal et al. | Influence of initial L-asparagine and glycerol concentrations on the batch growth kinetics of Mycobacterium bovis BCG | |
| Zhao et al. | Studies on the in vitro cultivation of Babesia from buffaloes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070607 |
|
| HK4A | Changes in a published invention | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140607 |