WO2016063265A2

WO2016063265A2 - Formulação tópica para o tratamento de infeções na pele ou mucosas, método de preparação e seus usos

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Publication number: WO2016063265A2
Application number: PCT/IB2015/058245
Authority: WO
Inventors: Rita Manuela PALMEIRA DE OLIVEIRA; Ana Cristina PALMEIRA DE OLIVEIRA
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2016-04-28
Anticipated expiration: 2017-04-24
Also published as: EP3210619A2; WO2016063265A3; US20170304411A1

Abstract

A presente divulgação insere-se no domínio da terapêutica de infeções na pele ou suas mucosas e diz respeito ao uso da bromelaína isolada ou com agentes antimicrobianos para inibir, reduzir ou tratar biofilmes em infeções derivadas da presença deste mecanismo de patogenicidade. Esta aplicação pretende usufruir da ação enzimática da bromelaína para destruir os biofilmes e permitir a penetração dos antifúngicos, potenciando, deste modo, a sua ação local no foco da infeção, tratando e reduzindo os sintomas. A presente divulgação pode ser utilizada na área farmacêutica para o tratamento de infeções, em cremes, loções, géis, ou ampolas para a aplicação local na pele ou mucosas. Foram desenvolvidas formulações com capacidade de manter a estabilidade da enzima e dos restantes componentes ativos com boas características para aplicação na pele ou mucosas, em particular a vagina, promovendo, deste modo, a eficácia e a aceitabilidade do produto final.

Description

D E S C R I Ç Ã O

FORMULAÇÃO TÓPICA PARA O TRATAMENTO DE INFEÇÕES NA PELE OU MUCOSAS,

MÉTODO DE PREPARAÇÃO E SEUS USOS

Domínio técnico

[0001] A presente divulgação insere-se no domínio da terapêutica de infeções na pele ou suas mucosas e diz respeito ao uso da bromelaína isolada ou com agentes antimicrobianos para inibir, reduzir ou tratar biofilmes em infeções derivadas da presença deste mecanismo de patogenicidade. Esta aplicação pretende usufruir da ação enzimática da bromelaína para destruir os biofilmes e permitir a penetração dos antifúngicos, potenciando, deste modo, a sua ação local no foco da infeção, tratando e reduzindo os sintomas.

[0002] A presente divulgação pode ser utilizada na área farmacêutica para o tratamento de infeções, em cremes, loções, géis, ampolas ou óvulos para a aplicação local na pele ou mucosas.

[0003] Foram desenvolvidas formulações com capacidade de manter a estabilidade da enzima e dos restantes componentes ativos com boas características para aplicação na pele ou mucosas, em particular a vagina, promovendo, deste modo, a eficácia e a aceitabilidade do produto final.

Antecedentes

[0004] O tratamento de infeções causadas por microrganismos que apresentam a capacidade de se organizarem em biofilmes é uma área que carece de estratégias para promover a eficácia.

[0005] Biofilmes são comunidades de células microbianas incorporadas numa matriz polimérica produzida pelas próprias células, que se encontram aderidas a superfícies de natureza biológica ou inerte. Esta estrutura traduz-se num fator de patogenicidade por conferir elevada resistência aos agentes antimicrobianos e à ação protetora das células do sistema imunitário do hospedeiro, uma vez que consiste num mecanismo de proteção à penetração de moléculas e células. Assim, infeções causadas por estirpes com capacidade de formar biofilme traduzem-se numa maior dificuldade no tratamento e erradicação conduzindo, frequentemente, ao insucesso terapêutico.

[0006] Os fungos (leveduras) do género Cândida spp. são exemplos de microrganismos com capacidade de produzir biofilmes e são responsáveis por infeções superficiais (pele, mucosas e unhas) e sistémicas. No que respeita às infeções mucocutâneas, a candidose vulvovaginal (CVV) é a mais frequente visto que afeta cerca de 75% das mulheres pelo menos uma vez ao longo da vida, sendo que 50% destas mulheres acabam por apresentar episódios de recorrência. Cândida albicans é a espécie mais frequentemente isolada, sendo reportada entre 70 a 90% dos isolados clínicos. No âmbito das infeções sistémicas verifica-se que a maioria está associada à formação de biofilmes na superfície de cateteres, válvulas cardíacas ou outros dispositivos médicos, os quais libertam células para a corrente sanguínea podendo atingir outros locais disseminando a infeção.

[0007] O primeiro passo para a colonização é a adesão das leveduras às células do hospedeiro e/ou a dispositivos médicos, sendo a adesão um processo fulcral na formação de biofilmes. Estima-se que 80% das infeções humanas provêm de biofilmes patogénicos.

[0008] A resistência aumentada aos antibióticos expressa pelas células em biofilme representa um dos principais mecanismos reconhecidos nestas estruturas organizadas.

[0009] Fármacos antifúngicos do grupo terapêuticos dos azóis (fluconazol, clotrimazol, itraconazol, etc.) são as opções de primeira linha no tratamento da candidose. As opções terapêuticas para o tratamento de infeções fúngicas são escassas, e o uso excessivo destes fármacos (por vezes em doses sub-terapêuticas) favorece o desenvolvimento de resistências, resultando em insucesso terapêutico. Os azóis são ainda menos efetivos na presença dos biofilmes devido aos diversos mecanismos de resistência por eles apresentados.

[0010] Têm sido propostas alternativas aos tratamentos convencionais no sentido de aumentar a eficácia dos tratamentos e diminuir a sua recorrência. Neste contexto, foi demonstrado que os óleos essenciais de espécies do género Thymus spp. como é o caso da Thymbra capitata e do Thymus vulgaris apresentam ação antifúngica, particularmente ação anti-Candida incluindo estirpes isoladas de casos de infeção recorrente.

[0011] A utilização de terapêuticas combinadas surge como uma tentativa de superar os problemas inerentes às resistências dos microrganismos. Esta estratégia terapêutica apresenta vantagens que incluem a possibilidade de diminuir a emergência de estirpes resistentes e diminuir a toxicidade relacionada com a dose, visto que, nas terapias combinadas, normalmente são administradas doses menores de cada fármaco, para além de se pretender alcançar um efeito sinérgico entre os compostos associados.

[0012] A bromelaína é uma enzima isolada do ananás (Ananás comosus). Este fruto foi extensamente utilizado pelas culturas nativas pelas suas propriedades medicinais que atualmente se atribuem à bromelaína . A bromelaína é, assim, reconhecida pela inibição reversível da agregação plaquetária, propriedades antiedematosas, anti- inflamatórias, antitrombóticas e fibrinolíticas. A bromelaína apresenta, ainda, a capacidade de aumentar a permeabilidade tecidular de antibióticos como as penicilinas e tetraciclinas, após administração ora l, aumentando, assim, a absorção e difusão dos antibióticos após administração subcutânea e intramuscular. Esta enzima está associada a muito poucos efeitos adversos sendo, por isso, considerada um fármaco bem tolerado.

[0013] Até ao momento a bromelaína não foi utilizada isoladamente para potenciar o tratamento das infeções através de alterações provocadas nos biofilmes.

[0014] O documento US2011182874A1 descreve a utilização de um sistema enzimático que inclui obrigatoriamente a peptidase de Serratia spp., e que pode ou não estar associada a outras enzimas como a bromelaína ou papaína, para utilização em biofilmes microbianos. Contudo, esta patente não preconiza a utilização da bromelaína como enzima isolada para esta função referindo em todas as reivindicações a associação obrigatória com a peptidase de Serratia spp. e, defendendo, assim um sistema enzimático múltiplo. Na presente divulgação demonstra-se que a bromelaína, não associada a qualquer outra enzima, tem capacidade de reduzir os biofilmes de Cândida spp. podendo, por isso, ser aplicada em combinação com azóis ou extratos de plantas no tratamento de infeções causadas por este microrganismo.

[0015] Segundo a Farmacopeia Portuguesa (FP IX), as preparações vaginais incluem as preparações líquidas, semi-sólidas ou sólidas destinadas a serem administradas por via vaginal, geralmente para uma ação local. Contêm uma ou mais substâncias ativas num excipiente apropriado. Distinguem-se várias categorias de preparações vaginais: óvulos; comprimidos vaginais; cápsulas vaginais; soluções, emulsões e suspensões vaginais; comprimidos para soluções ou suspensões vaginais; preparações vaginais semi-sólidas; espumas vaginais e tampões vaginais medicamentosos.

[0016] Na prática, as formas farmacêuticas mais frequentemente administradas por via vaginal são óvulos, comprimidos e pomadas. Num estudo recente da nossa equipa de investigação foi demonstrado que a preferência das mulheres portuguesas no que respeita aos produtos de aplicação vaginal recai sobre formas farmacêuticas semi- sólidas (geles, pomadas, cremes) confirmando os dados internacionais de literatura previamente publicados relativamente a contracetivos e microbicidas vaginais. Adicionalmente são identificadas pelas mulheres como desvantagens frequentes das preparações vaginais o reduzido tempo de retenção, devido ao mecanismo de autodepuração vaginal, associando-se a desconforto e sensação de escorrência; desconforto na aplicação e dor ou dificuldade de adaptação ao corpo após a aplicação. Estes dados são importantes para permitir o desenvolvimento de formulações de aplicação vaginal capazes de reunir a aceitabilidade das utilizadoras e, consequentemente maior adesão à terapêutica com resultados na sua eficácia. [0017] Estes documentos ilustram o problema técnico a resolver pela presente solução.

Descrição geral

[0018] A presente divulgação insere-se no domínio da terapêutica de infeções e diz respeito à aplicação da bromelaína (uma enzima de origem natural usada na terapêutica como anti-inflamatório) ou bromelaína e antimicrobianos (como os azóis, antifúngicos clássicos largamente utilizados na terapêutica ou substâncias de origem natural, como os óleos essenciais de Thymbra capitata, Thymus spp. que têm sido propostas como alternativas às terapêuticas convencionais) ou da bromelaína isolada para inibir, reduzir ou tratar biofilmes em infeções na pele ou mucosas derivadas da presença deste mecanismo de patogenicidade. Esta aplicação pretende usufruir da ação enzimática da bromelaína para destruir infeções por biofilmes que afetam a pele ou mucosas e permitir a penetração dos antifúngicos, potenciando, deste modo, a sua ação.

[0019] A presente divulgação descreve uma formulação compreendendo bromelaína numa forma farmacêutica adequada à aplicação na pele ou mucosas, em particular aplicação vaginal, apresenta diversos desafios particularmente por estar descrita a sua rápida inativação em meio aquoso. De facto, os produtos comercialmente disponíveis para via oral, contendo esta enzima, encontram-se formulados sob a forma de comprimidos cuja natureza anidra permite manter a estabilidade da substância ao longo do tempo. A presente divulgação desenvolveu ainda formulações que permitem evitar a degradação da bromelaína de forma a permitir manter a sua eficácia no tratamento de infeções na pele ou em mucosas.

[0020] Demonstrou-se surpreendentemente que a bromelaína isolada tem capacidade de reduzir a biomassa de biofilmes de Cândida spp. Demonstrou-se, ainda, o efeito redutor da associação de bromelaína e clotrimazol na biomassa e atividade metabólica de biofilmes de C. olbicons. O efeito antifúngico dos óleos essenciais de Thymbro capitata, Thymus vulgaris e outras espécies pertencentes ao género Thymus foi também previamente demonstrado.

[0021] Outro aspeto da presente divulgação descreve formulações semi-sólidas com capacidade de manter a estabilidade da enzima e dos restantes componentes ativos com boas características para aplicação na pele ou mucosas, em particular na vagina, promovendo deste modo a eficácia e a aceitabilidade deste novo uso terapêutico como produto final, pelas utilizadoras.

[0022] Por outro lado, a mistura das substâncias ativas com excipientes diluentes, agregantes e lubrificantes permite a formação de comprimidos pela técnica de compressão e a sua incorporação em bases de óvulos permite a veiculação sob a forma de óvulos vaginais.

[0023] Demonstrou-se laboratorialmente que a bromelaína tem capacidade de promover a destruição de componentes da matriz do biofilme, permitindo a diminuição da biomassa do biofilme. Verificou-se ainda que a associação de bromelaína ao clotrimazol reduz acentuadamente a biomassa e a atividade metabólica dos biofilmes de estirpes de C. albicans. A associação destas substâncias resulta num efeito sempre superior à soma das atividades individuais dos componentes, manifestando-se no aumento da suscetibilidade das leveduras à ação do clotrimazol. A bromelaína é, assim, apresentada para uma utilização inovadora. A aplicação desta associação, ou da bromelaína isolada, na terapêutica deve ter em conta o perfil de aceitabilidade das utilizadoras.

[0024] A presente divulgação descreve a aplicação da associação de fármacos ou da bromelaína isolada com o objetivo de melhorar o tratamento de infeções através da inibição, redução ou destruição dos biofilmes e promoção da atividade antimicrobiana.

[0025] Um dos aspetos surpreendentes da presente invenção é o uso da bromelaína no tratamento de infeções na pele ou mucosas, nomeadamente o efeito da bromelaína isolada, isto é, sem estar integrada em misturas de outras enzimas. Para além disso, desenvolveram-se formulações com efeitos melhorados para aplicação vaginal desta enzima isolada ou em associação com outras substâncias ativas caracterizadas pela reduzida solubilidade aquosa. Os estudos realizados até ao momento demonstram que esta associação resulta num efeito potenciador da atividade antimicrobiana final e não apenas da adição das atividades individuais dos fármacos e que estas atividades são mantidas na formulação final.

[0026] A presente divulgação diz respeito à aplicação de bromelaína e antimicrobianos (como os azóis, antifúngicos clássicos ou extratos naturais com ação antimicrobiana como os óleos essenciais) para o tratamento de infeções causadas por microrganismos que formam biofilmes como mecanismo de patogenicidade. A inovação expressa consiste na utilização da bromelaína com o intuito de inibir, reduzir ou tratar os biofilmes devido à sua ação proteolítica associada à ação antimicrobiana de substâncias de origem sintética ou natural que atuam por mecanismos de morte ou inibição de crescimento microbiano. Esta associação pretende usufruir da ação enzimática da bromelaína para destruir os biofilmes e promover a penetração dos antifúngicos, potenciando a sua ação. Por outro lado, a bromelaína poderá ser aplicada isoladamente para o mesmo fim, sempre que se verifique que não necessita de estar associada a um antimicrobiano.

[0027] Esta divulgação pode ser aplicada ao tratamento de diversas infeções na pele ou mucosas, em particular na vagina, de preferência no tratamento da candidose mucocutânea ou sistémica.

[0028] Um dos aspetos da presente divulgação, diz respeito a uma formulação tópica que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva da enzima de bromelaína e um excipiente adequado para o tratamento de infeções na pele ou mucosas, em particular na vagina, em particular infeções provocadas por biofilmes microbianos, nomeadamente candidose mucocutânea ou sistémica.

[0029] A bromelaína é uma enzima de origem natural, derivada do ananás, que se encontra aprovada no panorama terapêutico como anti-inflamatório para uso oral. A sua aplicação, não associada a outras enzimas, no tratamento de infeções com o objetivo de destruir biofilmes não tinha sido referida até hoje. A associação desta enzima a fármacos antimicrobianos, particularmente os antifúngicos (azóis) utilizados no tratamento da candidose vulvovaginal e os extratos naturais de que é exemplo o óleo essencial de Thymbra capitata e de outras espécies pertencentes ao género Thymus consiste no segundo aspeto inovador desta divulgação. Numa realização, a aplicação destas substâncias a nível vaginal carece de uma formulação adequada visto que, por um lado, a enzima bromelaína hidrolisa facilmente perdendo, por isso, atividade em meio aquoso enquanto, por outro lado, o óleo levanta desafios de formulação dada a sua baixa solubilidade em água. Nesta divulgação desenvolveram- se formulações semi-sólidas de base não aquosa para aplicação vaginal que ultrapassam as limitações de estabilidade mencionadas garantindo, simultaneamente, a aceitabilidade das utilizadoras. A veiculação das mesmas substâncias em formas farmacêuticas sólidas é, ainda, incluída como variação da formulação. Uma vez que a candidose vulvovaginal é uma infeção altamente prevalente com taxas elevadas de recorrência e que a formação de biofilmes é reconhecida como um fator associado à dificuldade de tratamento dos casos mais difíceis, esta divulgação surge como proposta de alternativa terapêutica potencialmente eficaz no seu tratamento. A bromelaína isolada ou associada a antimicrobianos pode, ainda, ser aplicada a ouras infeções caracterizadas pela presença de biofilmes desde que corretamente veiculada em formulações, dispositivos médicos ou material de penso adequados.

[0030] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica que pode compreender 0,125-10% (m/m) de bromelaína, de preferência 0,25-2% (m/m) de bromelaína, mais preferencialmente 0,25-1% (m/m) de bromelaína.

[0031] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica que que pode compreender um dos seguintes excipientes: propilenoglicol, propilenoglicol gelificado, carbopol, polietilenoglicois e suas misturas.

[0032] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica para o tratamento de infeções na pele, em particular infeções provocadas por filmes bacterianos que pode compreender: 70-98% (m/m) de triacetina, 0-17% (m/m) de propilenoglicol; 0-17% (m/m) de glicerina; 1-11% (m/m) de dióxido de silício coloidal; 0,125-10% (m/m) de bromelaína.

[0033] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica que pode compreender 7,5 -15 % (m/m) de propilenoglicol e 0-5% (m/m) de glicerina.

[0034] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica que pode compreender ainda um segundo agente antimicrobiano.

[0035] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que a concentração do segundo agente antimicrobiano pode variar entre 0,1-10% (m/m).

[0036] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica, em que o agente antimicrobiano pode ser selecionado da Thymus, em particular a Thymbra capitata, a Thymus vulgaris, a Thymus mastichina, ou suas misturas.

[0037] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que a concentração da Thymus pode variar entre 0,1 - 1% (m/m), de preferência 0,25 - 1% (m/m).

[0038] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que o agente antimicrobiano pode ter uma ação antifúngica.

[0039] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que o agente antimicrobiano pode ser da classe dos azóis.

[0040] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que a concentração do antifúngico pode variar entre 0,5-3% (m/m), de preferência 0,5-1% (m/m).

[0041] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que o antifúngico é o clotimidazol. [0042] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica que pode compreender ainda um antibiótico, de preferência numa concentração que varia entre 1 - 10% (m/m).

[0043] Uma realização da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica em que o antibiótico pode ser ácido fusídico, bacitracina, neomicina, ou suas combinações.

[0044] Numa realização, foram desenvolvidas formulações semi-sólidas de base anidra conjugando a triacetina na concentração m/m de 70 a 98%, o propilenoglicol (0-17%) ou glicerina (0-17%) e o aerosil 200 (1-11%) como agente gelificante. As formulações com diversas concentrações de excipientes foram preparadas por dispersão do aerosil em cerca de metade da mistura triacetina+humectante (propilenoglicol ou glicerina) e por dissolução ou diluição do antifúngico (azol ou óleo essencial) no restante volume. Após formação do gel originado pela primeira mistura procede-se à mistura do antifúngico com a anterior e homogeneização para obtenção da preparação final. Este gel final pode ser aplicado diretamente (na vagina ou em pele afetada) ou veiculada em dispositivos médicos, material de penso ou material cirúrgico.

[0045] Outro aspeto da presente divulgação diz respeito a uma formulação tópica para uso no tratamento de infeções ginecológicas, em particular infeções vaginais, em particular o tratamento de candidose vulvovaginal.

[0046] Outro aspeto da presente divulgação diz respeito a um gel, creme, loção, ampola, comprimido vaginal ou óvulo que compreende a formulação tópica descrita na presente divulgação.

[0047] Outro aspeto da presente divulgação diz respeito ao uso da bromelaína como revestimento antimicrobiano de artigos, em que o artigo pode ser um dispositivo médico, um cateter, uma prótese ou um microchip.

[0048] A aplicação da associação destes fármacos ou da bromelaína isolada, na concentração terapêutica, pode ser realizada através de formulações direcionadas a cada via de administração, contendo, pelo menos um excipiente de grau farmacêutico adequado, com capacidade para manter a estabilidade das substâncias ativas e promover a sua eficácia. Pode ainda ser aplicada em dispositivos médicos e material de penso.

[0049] Numa forma de realização, uma dose diária consiste numa ampola ou outro dispositivo, que compreende uma bromelaína, a totalidade da qual se destina a ser administrada como uma dose única.

[0050] Ao longo da descrição e reivindicações a palavra "compreende" e variações da palavra, não têm intenções de excluir outras características técnicas, aditivos, componentes, ou passos. Objetos adicionais, vantagens e características da invenção irão tornar-se evidentes para os peritos na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos como forma de ilustração, e não têm a intenção de serem limitativos da presente invenção. Além disso, a presente invenção abrange todas as possíveis combinações de formas de realização particulares ou preferenciais aqui descritas.

Breve descrição das figuras

[0051] Para uma mais fácil compreensão da solução juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.

[0052] Figura 1: Representação esquemática do efeito da concentração de bromelaína na biomassa do biofilme de estirpes Cândida spp., no qual (Fig. 1.1) diz respeito a Estirpes de coleção (ATCC) e clínicas de C. albicans; (Fig. 1.2) diz respeito a Estirpe clínica de C. glabrata; (Fig. 1.3) diz respeito a Estirpes clínicas de C. para silosis; (Fig. 1.4) diz respeito a Estirpes clínicas de C. tropicalis; (Fig. 1.5) diz respeito a Estirpes clínicas de C. guilliermondi; e (Fig. 1.6) diz respeito a Estirpe clínica de C. krusei. [0053] Figura 2: Representação esquemática do efeito da combinação de bromelaína com o antifúngico Clotrimazol na biomassa de biofilme de estirpes de C. albicans.

[0054] Figura 3: Representação esquemática do efeito da combinação de bromelaína com o antifúngico Clotrimazol na atividade metabólica do biofilme de estirpes de C. albicans.

[0055] Figura 4: Representação em imagens obtidas por microscopia confocal de um ensaio checkerboard de avaliação da combinação de bromelaína e clotrimazol na estirpe AP25A (I).

Descrição detalhada

[0056] A presente divulgação descreve uma formulação compreendendo bromelaína numa forma farmacêutica adequada à aplicação na pele ou mucosas, em particular aplicação vaginal, apresenta diversos desafios particularmente por estar descrita a sua rápida inativação em meio aquoso. De facto, os produtos comercialmente disponíveis para via oral, contendo esta enzima, encontram-se formulados sob a forma de comprimidos cuja natureza anidra permite manter a estabilidade da substância ao longo do tempo. A presente divulgação desenvolveu ainda formulações que permitem evitar a degradação da bromelaína de forma a permitir manter a sua eficácia no tratamento de infeções na pele ou em mucosas.

[0057] A presente divulgação descreve ainda a aplicação da bromelaína associada a fármacos antifúngicos clássicos (como o clotrimazol) ou com extratos de plantas, nomeadamente os óleos essenciais de Thymbra capitata, Thymus vulgaris e outras espécies do género Thymus, ou utilizada isoladamente para o tratamento de infeções fúngicas caracterizadas pela formação de biofilmes, como a candidose mucocutânea. Estas substâncias são incorporadas numa formulação semi-sólida de base anidra que garante a estabilidade da enzima e a dissolução dos azóis ou mistura com os óleos essenciais. [0058] Numa realização da presente divulgação, demonstrou-se que a bromelaína isolada tem capacidade de reduzir a biomassa de biofilmes de Cândida spp, em infeções na pele ou mucosas. Demonstrou-se, ainda, o efeito redutor da associação de bromelaína e clotrimazol na biomassa e atividade metabólica de biofilmes de C. albicans. O efeito antifúngico dos óleos essenciais de Thymbra capitata, Thymus vulgaris e outras espécies pertencentes ao género Thymus foi também previamente demonstrado.

[0059] A divulgação descrita consiste na aplicação da associação da bromelaína a antimicrobianos, ou da bromelaína isolada para inibição, redução ou tratamento de biofilmes em infeções bacterianas ou fúngicas derivadas da presença deste mecanismo de patogenicidade, como a candidose mucocutânea, infeções da pele ou da ponta de cateter provocadas por S. aureus.

[0060] Ensaios laboratoriais foram realizados em biofilmes maduros pré-formados (48h) em microplaca de 96 poços, recorrendo-se a ensaios colorimétricos descritos na bibliografia para quantificar a biomassa do biofilme (ensaio Cristal Violeta) e a atividade metabólica das suas células (ensaio de redução do XTT).

[0061] O efeito da bromelaína foi testado em biofilmes pré-formados de 20 estirpes de Cândida spp., que contemplam 6 espécies: C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondi e C. krusei. Os resultados são apresentados na Figura 1, em gráficos de redução da biomassa que agrupam as estirpes nas respetivas espécies. Verificou-se que o efeito da bromelaína isolada na redução da biomassa dos biofilmes de Cândida spp. ocorre em todas as espécies, sendo dependente da concentração testada e variável de acordo com as estirpes. Deste modo, verifica-se que o referido efeito não é específico da espécie em estudo. Para as maiores concentrações testadas (250-500μg/mL) foi atingida redução na biomassa do biofilme, variável entre 40% e 80%, em todas as espécies e estirpes testadas.

[0062] O efeito de combinação da bromelaína com o antifúngico clotrimazol foi avaliado pela técnica de checkerboard descrita por Roxana G. Vitale, Javier Afeltra e Eric Dannaoui em Antifungal Combinations e os seus resultados na redução da biomassa e atividade metabólica do biofilme representados nos gráficos 2 e 3, respetivamente. O gráfico 2 demonstra que o efeito do clotrimazol isolado na redução da biomassa do biofilme é reduzido (sem bromo) e que a adição da mais baixa concentração testada de bromelaína provoca uma redução deste parâmetro na ordem dos 80% nas estirpes de C. albicans testadas. Para concentrações de bromelaína mais elevadas esta redução chega mesmo a atingir os 90%.

[0063] No que se refere à atividade metabólica, a figura 3 demonstra que concentrações crescentes de clotrimazol produzem reduções de atividade também crescentes, não sendo estas superiores a 60% para as estirpes de C. albicans testadas. Quando se associa a bromelaína, verifica-se um aumento na redução da atividade, dependente da concentração de enzima (a adição de uma solução de bromelaína a 250 μg/mL leva a reduções da atividade metabólica próximas de 80% para ambas as estirpes). Estudos por nós realizados anteriormente demonstraram que a bromelaína não tem atividade fungistática ou fungicida direta em células planctónicas de diversas espécies Cândida, inclusive C. albicans. Deste modo, o aumento na redução da atividade metabólica demonstrado aquando da associação de bromelaína ao clotrimazol não se deve a uma atividade antifúngica direta desta enzima, mas sim à degradação da matriz do biofilme. A degradação da matriz possibilita a penetração do clotrimazol no biofilme, favorecendo, deste modo, a sua ação antimicrobiana.

[0064] A ação anti-Candida de óleos essenciais extraídos de plantas do género Thymus já tinha sido demonstrada anteriormente.

[0065] Apesar da bromelaína não demonstrar atividade antifúngica em células planctónicas, nesta aplicação a adição de bromelaína sem clotrimazol ao biofilme também reduz significativamente a atividade metabólica, variando esta redução entre 24,48% e 49,67% para a estirpe AP25A e entre 54,89% e 76,2% para ATCC 10231. As elevadas reduções da atividade metabólica demonstradas pela bromelaína não se devem a atividade antifúngica direta, mas sim a uma ação destrutiva do biofilme, fazendo com que as células sejam libertadas da microplaca. Ao proceder-se à lavagem das microplacas, o número de células metabolicamente ativas disponíveis para metabolizar o XTT diminui, conduzindo a uma redução na atividade metabólica.

[0066] As imagens obtidas por microscopia confocal, apresentadas na figura 4, permitem confirmar visualmente as reduções de biomassa verificadas no ensaio anterior. O recurso ao calcofluor na marcação da biomassa revela em comparação com o controlo positivo, o efeito notório da combinação de bromelaína e clotrimazol ao longo do biofilme.

[0067] Numa realização, foram desenvolvidas formulações sob a forma de gel, isento de água para aplicação vaginal da mistura de antifúngico com a bromelaína ou da bromelaína isolada (tabela 1). Estas formulações baseiam-se em excipientes que se misturam com a água apresentando, por isso, a vantagem de serem facilmente laváveis.

[0068] Contudo, o facto de não conterem água na sua composição é um elemento chave de garantia da estabilidade da bromelaína cuja autoproteólise e degradação em meio aquoso tem sido demonstrada em diversos estudos. Numa realização, uma das bases das formulações é a triacetina, um excipiente largamente utilizado em preparações farmacêuticas, cosméticas e na indústria alimentar. Este excipiente foi selecionado por ter sido demonstrada a sua segurança não só por via oral como também o seu baixo potencial de irritação quando aplicado puro, na pele ou mucosas, em penso oclusivo (patch test). Os estudos de segurança da triacetina após aplicação no olho demonstraram que embora provoque irritação ocular não é causadora de dano o que sustenta a sua utilização segura. Por outro lado, no que respeita à via vaginal este excipiente é a base de formulação de cremes aprovados para utilização vaginal e endocervical na Europa e nos Estados Unidos da América. A este excipiente pode ser acrescentado um outro humectante tal como o propilenoglicol (PPG) ou a glicerina nas concentrações m/m de 0 a 17%. O dióxido de sílica coiloidal (existente sob a marca comercial Aerosil, entre outras, e utilizado preferencialmente na porosidade de 200) é utilizado como agente gelificante nas concentrações m/m de 1 a 11% permitindo a formação de um gel de viscosidade e textura adequadas à aplicação vaginal. A bromelaína nas concentrações m/m de 0,125 a 10% e/ou o óleo essencial ou o antifúngico azólico nas concentrações de 0,1 a 3% m/m são dissolvidas ou diluídas em parte da mistura de triacetina com PPG/glicerina ou na triacetina (caso não seja adicionada de PPG ou glicerina) e misturadas com o gel formado pela dispersão do Aerosil no restante veículo.

[0069] Tabela 1 - Exemplos de géis anidros contendo bromelaína e um agente antifúngico natural ou sintético para o tratamento da candidose vulvovaginal recorrente

Formulação Matérias-primas (designação e concentração %m/m)

Triacetina Aerosil Propilenoglicol Bromelaína Óleo Clotrimazol

200 / Glicerina essencial

de

Thymbra

capitata

1 q.b.p. 100 8 15 1 1 0

2 8 15 1 0 1

3 8 0 1 1 0

4 8 0 1 0 1

5 8 0 0,25 1 0

6 8 0 0,25 0,2 0

7 8 7,5 1 1 0

8 6 15 1 1 0

9 6 0 0,25 1 0

10 6 0 1 0 1

11 6 0 0,25 0,17 0

12 4 0 0,25 1 0

13 4 0 1 1 0

14 4 7,5 0,25 1 0

15 4 7,5 0,25 0,17 0 [0070] Outras bases de formulação podem ser utilizadas para veicular estes agentes tais como o propilenoglicol gelificado com carbopol ou policarbófilo e os polietilenoglicóis.

[0071] Ainda que na presente divulgação se tenham somente representado e descrito realizações particulares da solução, o perito na matéria saberá introduzir modificações e substituir umas características técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, sem sair do âmbito de proteção definido pelas reivindicações anexas.

[0072] As realizações apresentadas são combináveis entre si.

[0073] As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais.

Claims

R E I V I N D I C A Ç Õ E S

Formulação tópica que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva da enzima de bromelaína e um excipiente adequado para o tratamento de infeções na pele ou mucosas, em particular infeções provocadas por biofilmes microbianos.

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior que compreende 0,125 -10% (m/m) de bromelaína.

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior que compreende 0,25- 2% (m/m) de bromelaína, de preferência 0,25-1% (m/m) de bromelaína.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores que compreende ainda um dos seguintes excipientes: propilenoglicol, propilenoglicol gelificado, carbopol, polietilenoglicois e suas misturas.

Formulação tópica para o tratamento de infeções na pele, em particular infeções provocadas por filmes bacterianos que compreende:

70-98% (m/m) de triacetina,

0-17% (m/m) de propilenoglicol;

0- 17% (m/m) de glicerina;

1- 11% (m/m) de dióxido de silício coloidal;

0,125-10% (m/m) de bromelaína.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores que compreende 7,5 -15 % (m/m) de propilenoglicol e 0-5% (m/m) de glicerina.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores que compreende ainda um agente antimicrobiano.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores, em que a concentração de agente antimicrobiano varia entre 0,1-10% (m/m). Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores, em que o agente antimicrobiano é selecionado da Thymus, em particular a Thymbra capitata, a Thymus vulgaris, a Thymus mastichina, ou suas misturas.

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior, em que a concentração da Thymus varia entre 0,1 - 1% (m/m), de preferência 0,25 - 1% (m/m).

Formulação tópica de acordo com as reivindicações 7-10 em que o agente antimicrobiano tem uma ação antifúngica.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações 7-10 em que o agente antimicrobiano é da classe dos azóis.

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior, em que a concentração do antifúngico varia entre 0,5-3% (m/m), de preferência 0,5-1% (m/m).

Formulação tópica de acordo com as reivindicações 8-9, em que o antifúngico é o clotimidazol.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores que compreende ainda um antibiótico numa concentração que varia entre 1 - 10% (m/m).

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior, em que o antibiótico é ácido fusídico, bacitracina, neomicina, ou suas combinações.

Formulação tópica de acordo com as reivindicações anteriores para o uso no tratamento de infeções ginecológicas, em particular infeções vaginais.

Formulação tópica de acordo com a reivindicação anterior para o uso no tratamento de candidose vulvovaginal ou S. aureus.

Gel, creme, loção, ampola, comprimido vaginal, ou óvulo que compreende a formulação tópica descrita em qualquer uma das reivindicações anteriores.

Uso da bromelaína como revestimento antimicrobiano de artigos. Uso de acordo com a reivindicação anterior em que o artigo é um dispositivo médico, um cateter, uma prótese ou um microchip.