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WO2013182921A1 - Utilisation d'une chaufferette pour favoriser une reaction biologique - Google Patents

Utilisation d'une chaufferette pour favoriser une reaction biologique Download PDF

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WO2013182921A1
WO2013182921A1 PCT/IB2013/053015 IB2013053015W WO2013182921A1 WO 2013182921 A1 WO2013182921 A1 WO 2013182921A1 IB 2013053015 W IB2013053015 W IB 2013053015W WO 2013182921 A1 WO2013182921 A1 WO 2013182921A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
heater
solution
container
cells
support
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/IB2013/053015
Other languages
English (en)
Inventor
Dominique Vacher
Jean-Noël GOUZE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laboratoires Genevrier SAS
Original Assignee
Laboratoires Genevrier SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2013273251A priority patent/AU2013273251A1/en
Priority to EP13725799.4A priority patent/EP2859086A1/fr
Priority to KR20157000211A priority patent/KR20150027199A/ko
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Priority to RU2014152650A priority patent/RU2014152650A/ru
Priority to JP2015515601A priority patent/JP2015519905A/ja
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Priority to US14/405,965 priority patent/US9926530B2/en
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/14—Thermal energy storage

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular and cellular biology kits, as well as that of kits for implementing a chemical reaction requiring a moderate heat input. It particularly relates to kits comprising a simple and inexpensive autonomous heating means for treating biopsies.
  • the treatment of the samples essentially amounts to a more or less extensive dissociation of the cells, followed, if necessary, by the separation of different cell types to select the appropriate cells for the intended application (melanocytes for achromatic dermatoses). for example) and filtration to remove aggregates.
  • Cell dissociation is most often performed by incubating the sample in a trypsin solution.
  • the optimum temperature for trypsin activity is 37 ° C. At this temperature, and depending on the enzyme concentration and the degree of dissociation desired, the incubation times described in the literature are between 50 minutes and 3 hours (Guerra et al., 2003, Uiekar, 2003, van Geel and al., 2004).
  • Cîinical Cell Culture offers a kit (ReCell®) containing the necessary consumables to perform all the steps, from the collection to the reimplantation of the cells, as well as an electronic heating unit equipped with batteries.
  • ReCell® a kit containing the necessary consumables to perform all the steps, from the collection to the reimplantation of the cells, as well as an electronic heating unit equipped with batteries.
  • This device has two major disadvantages, which are its very high price and its ecological impact.
  • the present invention provides an advantageous alternative to the solutions of the prior art, in particular the ReCell® kit, since it relies on the use of heaters for heating and maintaining at a suitable temperature an enzymatic solution for the time necessary for the action of the enzyme.
  • the term “heater” here refers to small objects capable of emitting heat, also called “hot water bottles” or “stand-alone heat packs”, and whose operation is based on exothermic physical or chemical processes. They are commonly used to warm hands or feet exposed to the cold. In what follows, the terms “heater” and “heat pack” are used interchangeably.
  • reusable heaters consisting of a pouch containing a saturated aqueous solution of sodium acetate supercooled.
  • a metal wafer By twisting a metal wafer inside the liquid, solidified acetate crystals are generated, which trigger crystallization, and the solution becomes solid. This phase transition is at the melting temperature (54 e for a 20% solution, for example), there is heating of the pouch then cooling to room temperature once solidification is complete.
  • the pouch When the pouch is cooled, it is possible to return the sodium acetate (become solid) in the liquid state, placing the pouch in very hot water.
  • chemical heaters whose principle is activated by oxidation in contact with the air. They are effective longer (8 to 60 hours compared to about 1 hour for supercooled sodium acetate heaters) but are only used once.
  • a solution placed in a container typically a Petri dish, placed on a heater, reaches in a few minutes an optimal temperature for the activity of many enzymes such as trypsin, and maintains for at least 15 to 20 minutes.
  • the invention therefore relates, in the first place, to a method for carrying out a biological, biochemical or chemical reaction requiring an incubation at a temperature of between 30 and 40 ° C., characterized in that it comprises an activation step. a heater which operates on an exothermic physical or chemical process, and a step of contacting said heater with a container containing the reagents involved in said reaction.
  • This method is particularly advantageous in the context of a biological, medical or diagnostic application.
  • the step of contacting the heater with the container is performed by placing the heater and at least the inner portion of the container in a cavity of a support provided for this purpose.
  • a support makes it possible, on the one hand, to wedge the container securely on the heater, thus limiting the risk of overturning.
  • the use of an insulating support, having a low thermal conductivity limits the heat loss of the heater and promote the transfer of heat from the heater to the solution to be heated.
  • the depth of the cavity makes it possible to place the heater and only the lower part In this way, the container is well seated on the heater, does not slip, and remains easy to grasp by the operator.
  • the use of a heater and, where appropriate, an insulating support makes it possible to maintain the temperature of a biological, biochemical or chemical solution between 30 and 40 ° C. for the necessary duration. (from a few minutes to a few tens of minutes, for example 5, 10, 15, 18. 20 minutes or more).
  • This use of the heater a simple object, inexpensive and generally intended for outdoor recreation (skiing, mountaineering etc.), - to implement a biological process (molecular or cellular biology) or chemical replacement of sophisticated laboratory equipment is as advantageous as it is surprising, since it allows considerable savings without altering the quality of the results obtained.
  • biological reaction any reaction involving elements from a living being, such as for example living cells, (animal cells derived from a biopsy, plant cells, yeasts or bacteria), viruses, organelles, enzymes, metabolism products, etc.
  • a “biochemical reaction” involves substances involved in chemical reactions of living matter (enzymes, sugars, lipids, etc.).
  • the container contains an enzymatic solution and the contact between the heater and the container is maintained for at least 10 minutes.
  • the heater is used in the context of a cell biology process
  • the enzyme solution contains cells from a biopsy, for example a tissue sample to be dissociated.
  • the enzyme solution contains, for example, trypsin.
  • the heater preferably consists of a sealed plastic bag containing a saturated aqueous sodium acetate solution.
  • the invention can also be implemented with a chemical heater, allowing a longer incubation.
  • the used pouch-type heating device containing sodium acetate is a disc whose thickness is between 3 and 7 mm, preferably 4 to 6 mm. the diameter is between 7 and 11 cm, preferably 8 to 10 cm, and the solution containing the reagents involved in the reaction has a volume of between 3 and 10 ml and is contained in a petri dish with a diameter of between 7 and 10 cm. and 1 1 cm, preferably between S e 10 cm, or a compartment of said box.
  • petri dish is meant here a shallow transparent cylindrical box, glass or plastic, provided with a lid.
  • the petri dish is compartmentalized, for example by a small wall along a diameter.
  • the cavity intended to receive the heater is also circular, of diameter slightly greater than that of the heater (between 7 and 1 1, 5 cm) and has a depth between 5 and 20 night),
  • the present invention also provides a method of dissociating cells from a freshly harvested tissue sample comprising the steps of:
  • tissue sample placed in said solution and incubating for at least 10 minutes, preferably 15 to 20 minutes;
  • the heater has a disc shape and the container is a petri dish, as mentioned above.
  • the diameters of these two elements are preferably identical or almost identical; if a support is used, the cavity of the support for receiving at least the heater is also circular, of diameter slightly greater than the diameter of the heater and the container.
  • step (iv) may, if appropriate, be preceded or followed by a step of inhibiting trypsin by adding an inhibitor.
  • an inhibitor for example, no trypsin inhibitor is added, rinsing tissue sample sheet sufficient to stop the action of trypsin. This allows in particular to limit the number of substances that will be applied to the patient with the cells.
  • the present invention also relates to a method for preparing a cell suspension suitable for dermal application to a patient, comprising the steps of:
  • step (iii) filtering the solution obtained in step (ii) on a cell sieve.
  • the above method comprises an additional step of adding hyaluronic acid to the cell suspension obtained in step (Iii). This step makes it possible to obtain one. Viscous mixture that is easily applied into the wound bed. In addition, hyaluronic acid promotes viability. cells.
  • a particular application of the above methods is the treatment of vitiligo; in this application, the cells recovered in step (ii) comprise at least melanoeytes.
  • the present invention also relates to a kit for biological application (cell biology kit and / or kit of molecular biology), characterized in that it comprises a heater whose operation is based on an exothermic physical or chemical process.
  • the heater consists of a sealed plastic bag containing a saturated aqueous sodium acetate solution in a supercooled state.
  • the kit also contains a support which comprises a cavity for receiving the heater.
  • This support comprises, for example, a plate of thermal insulating material with a thickness of between 5 and 35 mm, in which the cavity intended to receive the heater has a depth of between 5 and 25 mm.
  • the support may also be constituted by a thinner plate (for example 1 m thick), folded or. assembled to form a hollow support.
  • the material used for the support has a thermal eonducti ity less than or equal to 0.4 W.nf '. "1 to 20 ° C. More preferably, thermal eonduct reinstate is less than 0.35 W, Ni '! .K" ⁇ or less than 0.08 Wm *.
  • the insulating nature of the support is secondary, since the premises in which the kit will be used are generally at least 18 ° C, and the incubation time of the cell sample with the irypsine is not very long. on the other hand, some applications may require extreme thermal conditions and / or require a time i longer incubation at a temperature between 30 and 40 ° C. In this case, it is important to use an insulating support, which can, if necessary be completed by a lid to keep the heat in the container longer.
  • kits may also comprise a container the base of which has the same geometry 'than .the heater and, where appropriate of the cavity of the support, to enable efficient heat exchange.
  • the heater may be a disc whose thickness is between 3 and? mm, preferably 4 to 6 ram and the diameter is between 7 and 11 cm, preferably 8 to. 10 cm; in this case, the container is preferably a petri dish of diameter substantially equal to that of the heater and, if a support is present, the cavity for receiving the heater is also circular, a diameter slightly greater than that of the heater.
  • a kit according to the present invention may also contain an enzyme, for example trypsin.
  • an enzyme for example trypsin.
  • a kit is for example designed for the treatment of a biopsy, and includes in particular the means necessary for the dissociation of the cells of said biopsy.
  • this kit comprises a compartmentalized Petri dish whose diameter is identical or very similar to that of the heater, a cell sieve, and trypsin (in freeze-dried form or in solution).
  • Figure 1 Evolution of the temperature of a buffer solution in a Petri dish of 9 cm diameter, placed on a heater to sodium acetate, having a disk shape with a diameter substantially equal to that of the petri dish, over a period of 40 minutes, in a room at 20 ° C
  • FIG. 2 photos of the device comprising a support and a heat pack (heater). 1: heat pack; 2: support; 3: compartmentalized box placed on the heat pack.
  • Figure 6 Evolution of the temperature as a function of time (comparison of means without support and with supports V2 or V3).
  • a wound bed is seeded with autologous cells.
  • the cell suspensio obtained after graft disintegration consists of a mixed population, mainly basal cells of keratinocytes. but also Lan.gerh.ans cells, melanocytes and fibroblasts.
  • Example 1 A heater as described in. Example 1, and a disposable kit-composed of elements and ancillary instruments; enzymatic and application solutions, sterile instruments, including a two-compartment petri dish.
  • the kit On receipt, the kit is stored at + 4 ° C until use. The kit is placed at room temperature 10 min before use.
  • the area to be sampled is defined surgical felt, disinfected with chlorhexidine 0.5 '% alcoholic solution, and anesthetized with Xylocaine 2%.
  • a thin skin flap with a minimum surface area of 4 cm 2 and 0.2-0.3 mm thickness is removed with a dermatome.
  • Biopsy 1 0.4% 1.2 95.0% 3.4%,> 0.1%
  • Biopsy 2 0.4% 98.0% 3.3%> 0J%
  • the inhibition of trypsin was not achieved by addition of fetal serum-type inhibitor, but by rinsing with PBS, in order to decrease the number of products of biological origin used in the manufacture of the product. The cell viability after this mode of inhibition of trypsin has been validated,
  • the determination of cell viability was carried out according to a conventional cell culture technique: the trypan blue exclusion test. Volume to volume dilution of trypan blue and cell suspension was performed in a hemolysis tube. After a contact time of 1 to 2 minutes, the mixture was deposited with a micropipette between slide and coverslip on a counting cell. Dead cells, stained blue. and. live, non-stained cells were counted using an optical microscope-phase contrast.
  • the number of cells isolated varied from one individual to another depending on the size of the biopsies treated, but the cell / cm 2 yield was relatively constant.
  • the cell density of the final suspension therefore depends greatly on the size of the biopsy treated.
  • the percentage of cloning efficiency makes it possible to evaluate the level of cells capable of adhering and forming colonies.
  • a known quantity of dermal epithelial cells was seeded into 3 T25 cm 2 flasks. To the 1 th day of culture, when the clones were large enough but not contiguous, the flasks were stained with a solution of crystal violet (10% formaldehyde / 0.5% crystal violet, qs distilled water). Cloning efficiency was calculated in. performing the ratio of the average total number of colonies per T25em flask 2 x 100 to the number of cells seeded per T25 cm 2 .
  • the behavior of the cells after re-culture and the cloning efficiency were homogeneous from one biopsy to another and showed that the cell suspension contained cells capable of proliferating after trypsination.
  • the cell membrane was permeabilized in a solution of PBS-BSA (Bovine Serum Albumin) 1% - 0.5% triton.
  • PBS-BSA Bovine Serum Albumin
  • the primary antibody specific for normal melanocytes KI / beieb antibody
  • the secondary antibody Alexa Fluor 488 anti-mouse donkey antibody
  • 1% BSA The labeled cells were taken up in PBS and passed to FACS-SCAN.
  • the ratios of metabolites / keratinocytes in the epidermal suspensions obtained were comparable to those calculated by Guerra et al (between 1: 30 and 1: 200) (Guerra et al, 2003).
  • isolated epidermal cells were not cultured and the entire process was performed in the daytime (biopsy, finished product manufacturing, and non-cultured autologous epidermal cell transplant).
  • Example 3 Use of an insulating support to optimize the rise and the maintenance of the temperature of the medium by the heater
  • Heat packs (heaters) PVC, CE marking Support plates consisting of a polypropylene sheet (PP) 1 to 2 mm thick, folded to obtain a support with a total thickness of 15 mm, having a circular cavity 90 mm in diameter ( Figure 2).
  • thermobouton is in contact with the medium, making it possible to measure directly within the solution the temperature variations, after ac ivation of the heat pack.
  • the experiment is carried out by placing or not the heat pack and the petri dish in the circular cavity of the support. ( Figure 2). Three different media were tested. They differ in the more or less central position of the circular cavity intended to accommodate the heater and the petri dish.
  • the temperature data collected by the temperature probe plunged into the medium are shown schematically in Figure 3.
  • the average temperature on the 6 tests was 35.5 ° C. with an average standard deviation of 3.9 * 0.
  • the temperatures reached are higher when the heaters are placed in a support (1.1 ° C difference with V2 and 0.8 ° C with V3);
  • the medium contained in the compartmentalized Pelri box is maintained at a temperature greater than 35 ° for at least 18 minutes;
  • the supports therefore make it possible to optimize the rise in temperature and / or its maintenance.
  • VitiC'ell® kit support during an enzymatic digestion of fine skin biopsy in order to achieve a dermo-epidermal separation, according to the epidermal suspensions production process described in Example 2, makes it possible to on average get a higher temperature and faster.
  • the support therefore has a double interest: worktable and optimization of the temperature rise of the heat packs.

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Description

UTILISATION D'UNE CHAU FERETTE POUR FAVORISER UNE REACTION
BIOLOGIQUE
La présente invention concerne le domaine des trousses de biologie moléculaire et cellulaire, ainsi que celui des trousses pour mettre en œuvre une réaction chimique nécessitant un apport modéré de chaleur. Elle a notamment pour objet des trousses comprenant un moyen de chauffage autonome simple et peu coûteux pour traiter des biopsies.
Depuis plusieurs années, la greffe de cellules, en particulier de cellules autologues, s'impose comme un moyen efficace et sécuritaire pour favoriser la régénération de tissus malades ou lésés. Certains protocoles thérapeutiques nécessitent la prolifération et/ou la modification des cellules ex vivo avant réimplantation. D'autres protocoles prévoient essentiellement le prélèvement de cellules dans une partie saine du tissu concerné et leur réiniplantation quasi- immédiate au niveau de la lésion- â traiter. Ceci est notamment le cas des protocoles pour le traitement de pathologies ou lésions cutanées telles que certaines brûlures (d'étendue ne nécessitant pas d'expansion cellulaire), les hypochromies post-traumatiques et postopératoires, les dermatoses achromatiques, les cicatrices eic. Dans ces protocoles, le traitement des échantillons se résume essentiellement à une dissociation plus ou moins poussée des cellules, suivie, le cas échéant, de la séparation de différents types cellulaires pour sélectionner les cellules appropriées pour l'application visée (mélanocytes pour les dermatoses achromatiques, par exemple) et d'une fîltration pour éliminer les agrégats. La dissociation cellulaire est le plus souvent réalisée par incubation de Γ échantillon dans une solution de trypsine. La température optimale pour l'activité de la trypsine est de 37°€. A cette température, et suivant la concentration d'enzyme et le degré de dissociation souhaité, les temps d'incubation décrits dans la littérature sont compris entre 50 minutes et 3 heures (Guerra et al., 2003; uiekar, 2003; van Geel et al., 2004). A une température inférieure, l'enzyme est moins active, et il est nécessaire d'allonger le temps d'incubation de plusieurs heures, ce qui rend impossible la réalisation de toutes les étapes du protocole dans la. même journée (Gauthier and Surleve-Bazeille, 1992). Pour cette raison, ces protocoles sont actuellement réalisés au moins partiellement dans des structures disposant de plateformes techniques comportant un incubateur, ce qui n'est pas souvent le cas des cabinets de dermatologie.
Afin de permettre à des praticiens non équipés d'incubateur de traiter des patients atteints de vitiligo, la société Cîinical Cell Culture propose un kit (ReCell®) comportant les consommables nécessaires pour effectuer toutes les étapes, du prélèvement à la réimplantation des cellules, ainsi qu'une unité de chauffage électronique équipée de piles. Ce dispositif présente deux inconvénients majeurs, qui sont son prix très élevé et son impact écologique.
La présente invention propose une alternative avantageuse aux solutions de l'art antérieur, en particulier au kit ReCell®, puisqu'elle repose sur l'utilisation de chaufferettes pour chauffer et maintenir à une température convenable une solution enzyraatique, pendant la durée nécessaire à Faction de l'enzyme. Le terme « chaufferette » désigne ici les petits objets capables d'émettre de la chaleur, aussi appelés « bouillottes magiques » ou « packs de chaleur autonomes », et dont le fonctionnement repose sur des processus physiques ou chimiques exothermiques. Elles sont couramment utilisées pour réchauffer les mains ou les pieds exposés au froid. Dans ce qui suit, les termes « chaufferette » et « pack, de chaleur » sont utilisés indifféremment. A titre d'exemple de chaufferette reposant sur un processus physique, on peut citer les chaufferettes réutilisables constituées d'une pochette contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en surfusion. En tordant une plaquette métallique à l'intérieur du liquide, on génère des cristaux d'acétate solidifié, qui déclenchent la cristallisation, et la solution devient solide. Cette transition de phase se faisant à la température de fusion (54e pour une solution à 20%, par exemple), il y a échauffement de la pochette puis refroidissement jusqu'à la température ambiante une fois la solidification terminée. Lorsque la pochette est refroidie, il est possible de remettre l'acétate de sodium (devenu solide) à l'état liquide, en plaçant la pochette dans de l'eau très chaude. Il existe aussi des chaufferettes chimiques dont le principe est activé par oxydation au contact de l'air. Elles sont efficaces plus longtemps (de 8 à 60 heures contre environ 1 heure pour les chaufferettes à base d'acétate de sodium en surfusion) mais ne servent qu'une fois.
Les inventeurs ont montré (exemples 1 et 3 ci-dessous) qu'une solution placée dans un récipient, typiquement une boîte de Pétri, posée sur une chaufferette, atteint en quelques minutes une température optimale pour l'activité de nombreuses enzymes telles que la trypsine, et s'y maintient pendant au moins 15 à 20 minutes.
L'invention porte donc, en premier lieu, sur un procédé pour mettre en œuvre une réaction biologique, biochimique ou chimique nécessitant une incubation à une température comprise entre 30 et 40°C, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'activation d'une chaufferette dont le fonctionnement .repose sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape de mise en contact de ladite chaufferette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction. Ce procédé est particulièrement avantageux dans le cadre d'une application biologique, médicale ou de diagnostic.
Dans une mise en œuvre particulière de ce procédé, l'étape de mise en contact de la chaufferette avec le récipient est effectuée en plaçant la chaufferette et au moins la partie intérieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à cet effet. Un tel support permet d'une part, de bien caler le récipient sur la chaufferette, limitant ainsi les risques de renversement. En outre. l'utilisation d'un support isolant, présentant une faible çonductivité thermique, permet de limiter les pertes de chaleur de la chaufferette et de favoriser le transfert de la chaleur de la chaufferette vers la solution à chauffer. Dans une mise en œuvre préférée, la profondeur de la cavité permet d'y placer la chaufferette et uniquement la partie inférieure du récipient De cette façon, le récipient est bien calé sur la chaufferette, ne risque pas de glisser, et reste facile à saisir par l'opérateur.
Dans les procédés ci -dessus, l'utilisation d'une chaufferette et, le cas échéant, d'un support isolant, permet de maintenir la température d'une solution biologique, biochimique ou chimique entre 30 et 40°C pendant la durée nécessaire (de quelques minutes à quelques dizaines de minutes, par exemple 5, 10, 15, 18. 20 minutes ou davantage). Cette utilisation de la chaufferette, objet simple, peu coûteux et en général destiné aux loisirs de- grand air (ski, alpinisme etc.),- pour mettre en œuvre un procédé biologique (biologie moléculaire ou. cellulaire) ou chimique en remplacement d'un matériel de laboratoire sophistique, est aussi avantageuse que surprenante, puisqu'elle permet des économies considérables sans altérer la qualité des résultats obtenus.
Dans ce qui précède, on appelle "réaction biologique" toute réaction impliquant des éléments issus d'un être vivant, comme par exemple des cellules vivantes, (cellules animales provenant d'une biopsie, cellules végétales, levures ou bactéries), des virus, des organelles, des enzymes, des produits du métabolisme, etc. Une "réaction biochimique" met en oeuvre des substances impliquées dans des réactions chimiques de la matière vivante (enzymes, sucres, lipides, etc.).
Selon une mise en œuvre particulière du procédé de l'invention, le récipient contient une solution enzymaîique et le contact entre la chaufferette et le récipient est maintenu pendant au moins 10 minutes. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette est utilisée- dans le cadre d'un procédé de biologie cellulaire, et la solution enzymaîique contient des cellules provenant d'une biopsie, par exemple un échantillon de tissu à dissocier. Dans ce cas, la solution enzymatique contient, par exemple, de la trypsine.
Pour les réactions nécessitant une incubation de moins d'une heure, la chaufferette est de préférence constituée d'une pochette plastique hermétique contenant, une solution aqueuse saturée en acétate de sodium. Toutefois, l'invention peut égalemen être mise en œuvre avec une chaufferette chimique, permettant une incubation plus longue.
Selon une mise en œuvre particulière du procédé de l'invention, la chaufferette utilisée, de type pochette contenant de l'acétate de sodium, est un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm e le diamètre est compris entre 7 et 1 1 cm, de préférence 8 à 10 cm, et la solution contenant les réactifs impliqués dans la réaction a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une boîte de Pétri de diamètre compris entre 7 et 1 1 cm, de préférence entre S e 10 cm, ou un compartiment de ladite boîte. Par « boîte de- Pétri », on entend ici une boîte cylindrique transparente peu profonde, en verre on en plastique, munie d'un couvercle. Dans certaines réalisations particulières de l'invention, la boîte de Pétri est compartimentée, par exemple par une petite paroi le long d'un diamètre. Lorsqu'un support est utilisé dans le cadre de cette mise en œuvre particulière, la cavité destinée à recevoir la chaufferette est également circulaire, de diamètre légèrement supérieur à celui de la chaufferette (compris entre 7 et 1 1 ,5 cm) et a une profondeur comprise entre 5 et 20 nui),
La présente invention porte également sur un procédé de dissociation de cellules, issues d'un échantillon de tissu fraîchement prélevé, comportant les étapes suivantes :
(i) initier la cristallisation dans une chaufferette constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ; optionnellement, placer ladite chaufferette dans une cavité prévue à cet effet dans un support, de préférence isolant ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et 1% ;
(ni) placer échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes, de préférence 15 à 20 minutes ;
(iv) rincer l'échantillon de tissu.
Bien entendu, lors de la mise en œuvre de ce procédé, on veillera à ce que Ses géométries de ia chaufferette, du récipient et, le cas échéant, de la cavité du support isolant, soient telles qu'il existe une surface d'échange importante entre la chaufferette et le •récipient. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette a une forme de disque et le récipient est une boîte de Pétri, comme mentionné plus haut. Dans ce cas, les diamètres de ces deux éléments sont de préférence identiques ou quasi-identiques ; si un support est utilisé, la cavité du support destinée à recevoir au moins la chaufferette est également circulaire, de diamètre légèrement supérieur au diamètre de la chaufferette et du récipient.
Dans le procédé ci-dessus, l'étape (iv) peut, le cas échéant, être précédée ou suivie d'une étape d'inhibition de la trypsine, par ajout d'un inhibiteur. Toutefois, selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé selon l'invention, aucun inhibiteur de la trypsine n'est ajouté, le rinçage de Γ échantillon de tissu étant suffisant pour stopper l'action de la trypsine. Ceci permet en particulier de limiter le nombre de substances qui seront appliquées au patient avec les cellules.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes :
(i) mettre en œuvre le procédé de dissociation décrit plus haut sur un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient ;
(ii) récolter les cellules appropriée provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution ; le cas échéant, cette étape nécessite une étape intermédiaire de séparation et/ou de tri de certaines cellules de l'échantillon ; et
(iii) filtrer la solution obtenue à l'étape (ii) sur tamis cellulaire.
Selon une mise e œuvre particulière, le procédé ci-dessus comporte une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii). Cette étape permet d'obtenir un. mélange visqueux qui est facilement appliqué dans le lit de la plaie. En outre, l'acide hyaluronique favorise la viabilité des. cellules.
Une application particulière des procédés ci-dessus est le traitement du vitiligo ; dans cette application, les cellules récupérées à l'étape (ii) comprennent au moins des mélanoeytes.
La présente invention porte également sur une trousse pour application biologique (trousse de biologie cellulaire et/ou trousse de biologie moléculaire), caractérisée en ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique.
Selon un mode de réalisation préféré des trousses selon la présente invention, la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en état de surfusion.
Selon un mode de réalisation préféré de la trousse de la présente invention, la trousse contient également un support qui comprend une cavité destinée à recevoir la chaufferette. Ce support comprend par exemple une plaque de matériau isolant thermique d'épaisseur comprise entre 5 et 35 mm, dans lequel la cavité destinée à recevoir la chaufferette a une profondeur comprise entre 5 et 25 mm. Le support peut également être- constitué d'une plaque plus fine (par exemple 1 mra d'épaisseur), pliée ou. assemblée pour former un support creux. De préférence, le matériau utilisé pour le support a une eonducti ité thermique λ inférieure ou égale à 0,4 W.nf'. "1 à 20°C. De manière encore préférée, sa eonductivité thermique est inférieure à 0,35 W,nï'! .K"\ voire inférieure à 0,08 W.m*'. '! ou même inférieure ou égale à 0,04 W.m"! .K"'. A titre d'exemples non limitatifs de matériaux utilisables, on peut citer le bois (λ du contreplaqué :~ 0, 1 1 W.nf'. " ' ), le carton (λ - 0,07 W.nf'.K*1), !e liège (λ - 0.04 W.nf '.Κ' 1), le PVC (λ -0,2 WV.K*1), le polypropylène (Â-0J à 0,22 W.rn" \ " ! ), la mousse de polyuréihane rigide (λ :::: 0,025) et le polystyrène expansé (λ ~ 0,036). Suivant les applications envisagées pour la trousse, le caractère isolant du support est plus ou moins important Par exemple, pour une trousse destinée à préparer, dans un cabinet, de dermatologie, une suspension cellulaire par un procédé tel que décrit ci-dessus, le caractère isolant du support est secondaire, car les locaux dans lesquels la trousse sera utilisée sont généralement à. au moins 18°C, et le temps d'incubation de l'échantillon cellulaire avec la irypsine n'est pas très long. En revanche, certaines applications peuvent imposer des conditions thermiques extrêmes et/ou nécessiter un temps d'incubation plus long à une température comprise entre 30 et 40°C. Dans ce cas, il est important d'utiliser un support isolant, qui peut, le cas échéant être complété par un couvercle permettant de conserver plus longtemps la chaleur dans le récipient. A titre d'exemples non limitatifs de tel les applications, nécessitant une incubation de plus d'une heure entre 30 et 4Q°€ on peut citer la digestion enzymatique de cartilage, afin d'isoler des chondroeytes ; la digestion de biopsie testiculaire, pour isoler les cellules germinaîes : l'obtention d'îlots de Langerhans à partir d'une biopsie de pancréas ; la digestion de derme pour isoler des fibrobasles ; et la digestion d'une biopsie gingivale pour isoler des fibrob fastes gingivaux.
Les trousses de l'invention peuvent également comprendre un récipient dont la base a la même géométrie' que celle de .la chaufferette et, le cas échéant de la cavité du support, afin de permettre des échanges thermiques efficaces. Par exemple, la chaufferette peut être un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et ? mm, de préférence 4 à 6 ram et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à. 10 cm ; dans ce cas, le récipient est de préférence une boîte de Pétri de diamètre sensiblement égal à celui de la chaufferette et, si un support est présent, la cavité destinée à recevoir la chaufferette est également circulaire, d'un diamètre légèrement supérieur à celui de ia chaufferette.
Une trousse selon la présente invention peut également contenir une enzyme, par exemple de la trypsine. Une telle trousse est par exemple conçue pour le traitement d'une biopsie, et comprend notamment les moyens nécessaires pour la dissociation des cellules de ladite biopsie. Selon un mode de réalisation particulier, cette trousse comprend une boîte de Pétri compartimentée dont le diamètre est identique ou très proche de celui de la chaufferette, un tamis cellulaire, et de la trypsine (sous forme lyophilisée ou en solution).
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue.
Légendes des figures
Figure 1 : Evolution de la température d'une solution tampon dans' une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette à l'acétate de sodium, présentant une forme de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boîte de Pétri, sur une durée de 40 minutes, dans une pièce à 20°C
Figure 2 : photos du dispositif comprenant un support et un pack de chaleur (chaufferette). 1 : pack de chaleur ; 2 : support ; 3 : boîte compartimentée posée sur le pack de chaleur.
Figure 3 : Evolution de la température en. fonction du temps, sans support Fi ure 4 : Evolution de la température en fonction du temps, avec le support
V2.
Figure 5 : Evolution de l'a température en fonction du temps, avec le support
V3.
Figure 6 : Evolution de la température en fonction du temps (comparaison des moyennes sans support et avec supports V2 ou V3).
Exemples
Figure imgf000007_0001
chaufferette
Fa température d'une solution (tampon) dans une boîte de Pétri, de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette à l'acétate de sodium, présentant une tonne de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boîte de Pétri et une épaisseur comprise entre 4 et 6 mm a été mesurée.
Les résultats (Figure 1) montrent une montée en température assez rapide, puisque la température atteint 30°C en quelques minutes. La température reste ensuite comprise entre 30 et 40°C pendant un. peu plus de 20 minutes.
Ces résultats ont montré une bonne reproductibilité.
Ikgjagle,,2 ,;, Application à la séparation dermo-épidermiqtie, dans lççadre dujnujen^ autologue de mélanocytes
A partir d'une biopsie de peau l ne (0,2 nini-0,3 mm), le lit d'une plaie est ensemencée avec des cellules autologues.
La suspensio cellulaire obtenue après désagrégation du greffon est constituée d'une population mixte, principalement des cellules basaies de kératinocytes. mais également des cellules de Lan.gerh.ans, des mélanocytes et des fibroblastes.
Matériels utilisés
Une chaufferette telle que décrite à. l'exemple 1 , et un kit à usage unique- composé d'éléments et d'instruments annexes ; solutions enzymatiques et d'application, instruments stériles, dont une boîte de Pétri à deux compartiments.
Protocole
Préparer un champ chirurgical stérile.
A réception, le kit est conservé à +4°C jusqu'à utilisation. Le kit est disposé à température ambiante 10 min avant utilisation.
Préparation et chauffage de la solution enzymatique
• A Laide d'une seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 5 ml de solution de PBS et les injecter dans le flacon de trypsine lyophi isée. Bien homogénéiser avant de reprendre la solution régénérée et dans un compartiment de la boite de Pétri double compartiment.
« Activer le pack de chaleur instantanée en froissant la plaque métallique ; le cristal se solidifie instantanément.
• Placer la boite de Pétri double compartiment sur le pack de chaleur activé et attendre 5 min.
Prélèvement cutané
La zone à prélever est délimitée au feutre chirurgical, désinfectée avec de la Chlorhexidine à 0,5'% en solution alcoolique, et anesthésiée avec de la xylocaïne à 2%. Un lambeau de peau mince de 4 cm2 minimum de surface et 0,2-0,3 mm d'épaisseur est prélevé avec un dermatome. Réalisation de la séparation dermo-épiderrajque(SDE)
• A l'aide de la pince stérile (non fournie) transférer la biopsie dans le compartiment de la boite de Pétri contenant la trypsine en solution à 0.4%.
· Incuber 15 minutes.
• Rinçage de fa biopsie :
Avec la même seringue de 5mî et une aiguille, prélever 5ml de solution de PBS et disposer dans le second compartiment de la boite de Pétri.
- À la fin de F incubation, à l'aide de la pince stérile, transférer la biopsie dans le second compartiment, pour rinçage rapide au PBS.
® A l'aide de la pince stérile, disposer la biopsie à l'intérieur du couvercle de la boite de Pétri, en prenan soin de conserver le sens jonction dermo-épidermique vers le haut.
• A l'aide de la pince, procéder à la séparation des deux fragments Réalisation de la suspension cellulaire
• A Paide de la seconde seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 1 ,5 ml de PBS et les déposer sur les fragments de biopsie, racler les cellules des surfaces de jonction avec un scalpel (non fourni) et découper la partie épidermique grossièrement pour réaliser un mélange de cellules.
• Ecarter et immobiliser la partie dermique.
» Pencher la boite de Pétri de façon à aspirer la totalité du volume à l'aide de la seringue de 5 ml. taire monter les cellules dans la seringue et aspirer plusieurs fois pour créer une suspension cellulaire.
Fïitration des cellules
• Transférer la suspension cellulaire dans le tamis, qui aura été placé sur le pot à bouchon rouge.
Réalisation de la suspension cellulaire dans F acide hyaluronique,
• Retirer le tamis.
• Déposer l'acide hyaluronique contenu dans la seringue (soit 1,5 ml) dans le pot à bouchon rouge contenant la suspension cellulaire filtrée,
• A l'aide de la seringue, mélanger l'acide hyaluronique et la suspension cellulaire de façon à obtenir une suspension visqueuse mais homo aène. ♦ La suspension ainsi préparée est prête à être déposée à la seringue sur le lit de la plaie.
Résultais
Le protocole ci-dessus a été effectué plusieurs fois, à partir de trois échantillons cutanés différents, en utilisant deux concentrations de trypsîne (0,4 et 0.8%),
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous.
! Identification Concentration Nombre de i Viabilité j Test Présence de de trypsine cellules cellulaire (%) j d'efficacité mélanocyies isolées x 106 j de clonage en cytométrie / cm2 de flux
Biopsie 1 0,4% 1,2 95,0% 3,4%, > 0,1%
0,8% 1 ,2 97,0% j 3,4% > 0.1%
Biopsie 2 0.4% 98,0% 3,3% > 0J %
0,8% 2,3 j 97,0% ! 3,8% > 0,1%
Biopsie 3 0,4% 4,2 97,4% j 4,6% > 0J%
0.8% 3,9 99,4% i 4,5% > <).! !
Tableau ί
Concentration de la trypsine
Le procédé d'obtention de la substance active a été adapté de la technique décrite par van Geei et al. (van Geel et al., 2004).
La concentration de la solution de trypsine a été optimisée (trypsine 0,4% ou 0,8% au lieu de trypsine 0,25% EDTA 0,08%). A la différence de la technique décrite par van Geel et al., l'inhibition de la trypsine n'a pas été réalisée par ajout d'inhibiteur de type sérum de Veau foetal, mais par rinçage avec du PBS, ceci afin de diminuer le nombre de produits d'origine biologique utilisé pour la fabrication du produit. La viabilité cellulaire après ce mode d'inhibition de la trypsine a été validée,
Viab il lté ceî hdaire
La détermination de la viabilité- cellulaire a été réalisée selon une technique classique de culture cellulaire : le test d'exclusion au bleu de trypan. Une dilution volume à volume de bleu trypan et de fa suspension cellulaire a été réalisée dans un tube à hémolyse. Après un temps de contact de I à 2 minutes, le mélange a été déposé avec une micropipette entre lame et lamelle sur une cellule de numération. Les cellules mortes, colorées en bleu. et. les cellules vivantes, non colorées, ont été comptées à l'aide d'un microscope optique -à contraste de phase.
La viabilité cellulaire était très satisfaisante après isolement des cellules épidenniques (supérieure â 90%). Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage étaient homogènes d'une biopsie à l'autre et montraient que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsination.
Nombre de cellules isolées /cm2 de biopsie
Calcul effectué â partir des résultats du test décrit ci-dessus.
Le nombre de cellules isolées était variable d'un individu à un autre en fonction de la taille des biopsies traitées, mais le rendement cellule/cm2 a été relativement constant La densité cellulaire de la suspension .finale dépend donc grandement de la taille de la biopsie traitée.
Tesi d'efficacité de clonag (CFEj
Le pourcentage d'efficacité de clonage permet d'évaluer le taux de cellules capables d'adhérer et de former des colonies. Une quantité connue de cellules épi dermiques a été ensemencée dans 3 flasques T25 cm2. Vers le 1 eme jour de culture, lorsque les clones étaient suffisamment gros mais non jointifs, les fiasques ont été colorées par une solution de Cristal Violet (10% formaldéhyde / 0.5% Cristal Violet, qsp eau distillée). L'efficacité de clonage a été calculée en. effectuant le rapport de la moyenne du nombre total de colonies par flasque T25em2 x 100 sur le nombre de cellules ensemencées par T25 cm2.
Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage ont été homogènes d'une biopsie à l'autre et ont montré que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsination.
Taux de mékmocyies dam la suspension cellulaire par c tométrie en flux
La membrane cellulaire a été perméabilisée dans une solution de PBS-BSA (Bovine Sérum Albumine) 1% - triton 0,5%. L'anticorps primaire spécifique des mélanocytes normaux (anticorps KI/beieb) a été incubé, puis rincé avec du PBS-BSA 1%, L'anticorps secondaire (anticorps d'âne antisouris Alexa Fluor 488} a été incubé puis rincé avec du PBS- BSA 1%. Les cellules marquées ont été reprises dans du PBS et passées au FACS-SCAN.
Les ratios de méîanoes4es/kératinocytes dans les suspensions épidermiques obtenues ont été comparables à ceu calculés par Guerra et al (entre 1 :30 et 1 :200) (Guerra et al, 2003).
Dans le procédé décrit ici, les cellules épidermiques isolées n'ont pas été mises en culture et l'ensemble du procédé a été effectué dans la journée (biopsie, fabrication du produit fini et greffe de cellules épidermiques autologues non cultivées).
Exemple 3 : utilisation d'un support isolant pour- optimiser la montée et le maintien de la température du milieu par la chaufferette
3.1. Matériels et niéthodes
Matériels et Réactif
Packs de chaleur (chaufferettes) en PVC, marquage CE Plateaux de support constitués d'une plaque de polypropylène (PP) de 1 à 2 mm d'épaisseur, pliée pour obtenir un support d'une épaisseur totale de 15 mm, présentant une cavité circulaire de 90 mm de diamètre (Figure 2).
Boite de P tri compartimentée (réf Dutscher 020012)
» Sonde de température (Thermobouton) programmée pour fonctionner avec le logiciel îhermoîrack V4 et/ou A BT 529.
Méthodes
Si millilitres de PBS conservés à +4°C, équilibrés 20 minutes à température ambiante, sont déposés dans un des compartiments d'une boîte de Pétri de diamètre 90 mm, dans lequel est placé un therniobouton. (dispositif permettant d'enregistrer les variations de température) pour réaliser des relevés de température toutes les minutes. La boîte de Pétri est ensuite recouverte de son couvercle,
Le thermobouton est en contact avec le milieu, permettant de mesurer directement au sein de la solution les variations de température, après ac ivation du pack de chaleur. L'expérience est réalisée en plaçant ou non le pack de chaleur et la boîte de Pétri dans la cavité circulaire du support. (Figure 2). Trois supports différents ont été testés. Ils différent par la position plus ou moins centrale de la cavité circulaire destinée à accueillir la chaufferette et la boîte de Pétri.
Chaque condition a été testée 5 à 6 fois, avec des sondes de température différentes. Les mesures de température ont été réalisées pendant 20 min. La moyenne des¬ températures a été réalisée sur l'ensemble des valeurs relevées durant ce laps de temps.
Une analyse statistique des températures mesurées dans le milieu avec ou sans support a été réalisée par un test t de student.
3.2. Résultats
Evolution de la température du milieu avec un pack de chaleur sans support
Les données de température recueillies par la sonde de température plongée dans le milieu sont schématisées à la Figure 3. La température moyenne sur les 6 tests était de 35,5°C. avec une moyenne des écarts-types de 3,9*0.
Ces résultats metten en évidence la feproduciibilité de températures obtenues avec les différentes chaufferettes, sans support.
Evolution de la température du milieu avec un pack de chaleur dam un support
Deux supports (prototypes V2 et V3) ont été testés. Us diffèrent par la position de la cavité circulaire destinée à accueillir la chaufferette. En effet, dans le support V3, cette cavité a été centralisée pour permettre une homogénéisation de la chaleur à Pintérieur du support, afin d'optimiser la montée et le maintien, de la température dans la boite de Pétri compartimentée disposée sur la chaufferette. Les données de température recueillies pendant 20 minutes par la sonde de température plongée dans le milieu sont schématisées dans les graphes présentés à la figure 4 (support V2), à la figure 5 (support V3) et à la figure 6 (comparaison des deux supports et des températures obtenues sans support), et résumées dans te tableau ci-dessous.
Durée de Température Temps pour Température maintien de la maximale atteindre la moyenne des 6 température atteinte température tests
>35°C * maximaie
Test sans 18 min 39,5°C 9 min 35.5°C ± 3.9°C support-
Test avec- 18 min 40.5°C 6 min 36.7°C ± 3.6CC support V2
Test avec 18 min 40°C 9 min 36.3°C ± l°C support V3
Tableau 2 ; * : durée obtenue sur une durée totale de l'expérience de 21 minâtes
Ces résultats mettent en évidence :
la reproductibilité entre les chaufferettes ;
les températures atteintes sont plus élevées lorsque les chaufferettes sont disposées dans un support (1,1°C de différence avec V2 et 0,8°C avec V3 ) ;
' avec ou sans support, le milieu contenu dans la boite de Pelri compartimenté est maintenu à une température supérieure à 35°€ pendant au moins 18 minutes ;
Sans support, la température maximale de 39.5 'C est atteinte en 9 min, alors qu'avec le support V2 elle atteint 40.5 °C en 6 min.
Afin de déterminer si les différences observées sont statistiquement significatives, une analyse statistique par un test t student a été réalisée en utilisant les valeurs obtenues avec le support V3. Ce test indique une probabilité de 0.03 < 0.05, démontrant l'écart des températures obtenues sans support et avec le support V3 est significatif (tableau 3). Le support V3 permet donc d'obtenir une température en moyenne plus élevée que sans support; plus rapidement et de façon plus reproductible (e-t ±l°C).
Figure imgf000014_0001
Tableau 3
Les supports permettent donc d'optimiser la montée en température et/ou son maintien.
L'utilisation du support du kit VitiC'ell® lors d'une digestion enzymatique de biopsie de peau fine afin d'en réaliser une séparation dermo-épidermique, selon le process de production de suspensions épidermiques décrit à l'exemple 2, permet d'obtenir en moyenne une température plus élevée et plus rapidement. Le support présente donc un double intérêt : plateau de travail et optimisation de la montée en température des packs de chaleur.
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Claims

REVENDICATIONS
L Procédé pour mettre en œuvre une réaction biologique, biochimique ou chimique nécessitant une incubation à une température comprise entre 30 et 40°C caractérisé en ce qu'il comprend une étape d! activai! n d'une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique, et une étape de mise en contact de ladite chaufterette avec un récipient contenant les réactifs impliqués dans ladite réaction.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact de la chaufferette avec le récipient est effectuée en plaçant la chaufferette et au moins la partie inférieure du récipient dans une cavité d'un support prévu à cet effet,
3. Procédé selon la revendication î ou la revendication 2, caractérisé en ce que le récipient- contient une solution enzymatique et en ce que ie contact entre la chaufferette et le récipient est maintenu pendant au moins 10 minutes.
4. Procédé selon F une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium,
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le volume de la solution contenant les réactifs impliqués dans la réaction est compris entre 3 et 10 ml, le récipient contenant ladite solution est. une boîte de Pétri de diamètre compris entre 7 et 1 1 cm ou un compartiment de ladite boîte et en ce que la chaufferette est un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm et le diamètre est compris entre 7 et 1 1 cm.
6. Procédé selon les revendications 2 et 5, caractérisé en ce que la cavité du support destinée à recevoir la chaufferette est circulaire, de diamètre compris entre 7 et 1 1 ,5 cm, et a une profondeur comprise entre 5 et 20 mm.
7. Procédé selon Tune quelconque des revendications i à 6, pour effectuer la dissociation de cellules issues d'un échantillon de tissu, comportant les étapes suivantes :
(i) initier la cristallisation dans une chaufferette constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ;
(ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et I % ;
(iii) placer F échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes :
(îv) rincer l'échantillon de tissu.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour préparer une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes sui vantes : (i) soumettre un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour mie greffe à un patient, au procédé selon la revendication 7 ;
(H) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution : et
(ils) filtrer fa solution obtenue à l'étape (U) sur tamis cellulaire.
9. Procédé selon la revendication 8, comportant une étape supplémentaire d'ajou d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (ni).
10. Procédé selon les revendications 8 e 9. pour le traitement du vitiligo, caractérisé en. ce qu'à l'étape (si), les mélanocytes sont récupérés.
1 1. Trousse pour application biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une chaufferette dont le fonctionnement repose sur un processus physique ou chimique exothermique.
12. Trousse selon la revendication 11 , dans laquelle ia chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en état de surfusion.
13. Trousse selon la revendication 1 1 ou la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend également un support pourvu d'une cavité destinée à recevoir ladite chaufferette.
14. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend également un récipient, dont la base a la même géométrie que celle de la. chaufferette.
15. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend également une enzyme.
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