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WO2025012400A1 - Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions - Google Patents

Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions Download PDF

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Publication number
WO2025012400A1
WO2025012400A1 PCT/EP2024/069728 EP2024069728W WO2025012400A1 WO 2025012400 A1 WO2025012400 A1 WO 2025012400A1 EP 2024069728 W EP2024069728 W EP 2024069728W WO 2025012400 A1 WO2025012400 A1 WO 2025012400A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrogel
microcompartment
cells
internal part
transduction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2024/069728
Other languages
English (en)
Inventor
Clément RIEU
Joffrey MIANNÉ
Maxime FEYEUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Treefrog Therapeutics SAS
Original Assignee
Treefrog Therapeutics SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Treefrog Therapeutics SAS filed Critical Treefrog Therapeutics SAS
Publication of WO2025012400A1 publication Critical patent/WO2025012400A1/fr
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS

Definitions

  • 3D cell culture offers an alternative closer to biological reality by reproducing cell-extracellular matrix and cell-cell interactions more accurately, leading to more reliable and relevant results for cell biology studies, medical research and cell therapy.
  • the cells cultured in these 3D systems can be of any type. They can be differentiated cells with different phenotypes, progenitor cells, or stem cells.
  • 3D cell culture may hinder its use, particularly for specific applications such as transgene delivery and expression.
  • common transduction or transfection techniques that work well in 2D cell culture may not be effective for 3D cultures, where cells are encapsulated in denser extracellular matrices, thus limiting the access of transduction vectors or chemical or physical transfection agents to the cells.
  • the capsules thus formed are filled with alginate of the same density, limiting transduction within the capsule.
  • Encapsulation in alginate forming “full” capsules limits or even blocks the movement of cells and viral vectors and therefore reduces the efficiency of transduction.
  • the 3D cell culture systems existing to date do not exploit their performance potential, in particular for carrying out genetic and/or proteomic modification of cells, more particularly by transfection or transduction.
  • the invention proposes a novel cellular microcompartment comprising an external hydrogel layer defining an internal part, said internal part comprising:
  • At least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • the hydrogel of the internal part is different from the hydrogel constituting the external layer, in that it has at least one different chemical property and/or at least one different physical property.
  • the hydrogel of the outer layer maintains the hydrogel of the inner part so as to form a three-dimensional cellular microcompartment.
  • the hydrogel and/or the aqueous solution of the inner part are particularly suitable for maintaining the viability of human, animal or plant eukaryotic cells while allowing the diffusion of said cells and the transduction agents and/or transfection agent within the inner part.
  • the microcompartment according to the invention is characterized by a diffusive conductance of the external layer to at least one transduction agent and/or transfection agent strictly lower than the diffusive conductance of the internal part to this same transduction agent and/or transfection agent.
  • Diffusive conductance is the ability of a material, such as a hydrogel layer, to allow the diffusion of an object, such as a transduction agent and/or transfection agent in solutions.
  • an object such as a transduction agent and/or transfection agent in solutions.
  • the external layer of the microcompartment according to the invention is characterized by the presence of pores whose largest dimension is less than the smallest dimension d of said at least one transduction agent and/or transfection agent and, when the internal part comprises a hydrogel, this comprises pores whose smallest dimension is greater than this dimension d.
  • the size of the pores of the outer layer is less than the smallest dimension d of said at least one transduction agent and/or transfection agent, making it possible to prevent the diffusion of at least one transduction agent and/or transfection agent through the outer layer.
  • the pores of the outer layer make it possible, by their adapted dimensions, to maintain at least one transfection agent and/or transduction agent within the internal part of the microcompartment.
  • the internal part comprises a hydrogel
  • the latter comprises pores making it possible, by their adapted dimensions, to allow at least one transduction agent and/or transfection agent to diffuse within the internal part.
  • the pore size can be measured by techniques well known to those skilled in the art, namely:
  • the external hydrogel layer is characterized by the presence of pores whose largest dimension is less than 25 nm, preferably less than 20 nm, in particular less than 10 nm, even more preferably less than 5 nm.
  • the hydrogel of the internal part is characterized by the presence of pores whose smallest dimension is greater than 10 nm, preferably greater than 25 nm, even more preferably between 25 and 500 nm.
  • the internal part comprises at least one aqueous solution
  • the latter does not limit the diffusion of soluble particles such as transfection and/or transduction agents depending on their size through said solution, in particular soluble particles whose size would be greater than 10 nm, preferably 25 nm.
  • the internal part of the microcompartment according to the invention comprises at least one solution and/or at least one hydrogel comprising pores whose smallest dimension is greater than 10 nm, in particular greater than 25 nm, preferably greater than 100 nm, even more preferably greater than 500 nm.
  • the invention thus relates to a microcompartment comprising two distinct structural elements allowing transfection and/or transduction within the microcompartment, namely: - an outer layer or envelope, formed by a hydrogel layer, preventing cells and transduction and/or transfection agents of the internal part from passing through it.
  • said outer layer has a diffusive conductance to at least one transduction agent and/or transfection agent strictly lower than the diffusive conductance of the internal part to this same transduction agent and/or transfection agent, and/or comprises pores whose largest dimension is smaller than the smallest dimension d of said transduction agent and/or transfection agent, so that the transduction agent cannot diffuse through this outer layer; and
  • an internal part comprising in particular at least one aqueous solution and/or at least one hydrogel different from that of the external layer, intended to promote the encounter between the cells and the transduction and/or transfection agents comprising at least one molecule of interest, it being understood that said internal part is delimited by the external hydrogel layer.
  • said internal part has a diffusive conductance to at least one transduction agent and/or transfection agent strictly greater than the diffusive conductance of the external layer to this same transduction agent and/or transfection agent, and/or when the internal part comprises at least one hydrogel, the latter comprises pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of said transduction agent and/or transfection agent, so that the transduction agent can diffuse through this internal part.
  • the external hydrogel layer allows, on the one hand, to form the protective external envelope, and therefore to constitute the capsule or microcompartment, on the other hand, the solution and/or the hydrogel of the less rigid, looser internal part, allows cell growth and promotes the movements of cells and transfection and/or transduction agents within the internal part, given the conductance and/or the particularly suitable pore size of the solution and/or the hydrogel.
  • the known prior art composed of a single layer of hydrogel, is either too rigid, not allowing the movement of cells and transduction and/or transfection agents and inducing low transfection/transduction efficiency, or on the contrary, too loose and therefore incompatible with a culture in a bioreactor.
  • the mechanical constraints of a culture in a bioreactor in particular due to the significant shear forces generated during the culture, require a suitable cellular microcompartment.
  • the external hydrogel layer different from the internal part comprising a solution and/or a different hydrogel, makes it possible to form the external envelope of the microcompartment or capsule according to the invention, which makes it possible to protect the contents of the capsule from the external environment, in particular when the capsules are cultured in a bioreactor. Furthermore, the external hydrogel layer ensures that the cells and the transduction/transfection agents are maintained inside the latter. The external layer thus makes it possible to dissociate the concentration of the transduction/transfection agents near the cells, also called “concentration local”, the overall concentration of transduction/transfection agents in the culture system also called “global concentration”.
  • the structure of the microcompartment optimizes the cell-transfection and/or transduction agent encounters and thus makes it possible to reduce the quantity of transfection and/or transduction agent necessary to obtain the desired transfection and/or transduction efficiency, in particular compared to 2D cultures or 3D cultures described in the prior art.
  • the microcompartment comprises at least one transfection agent and/or at least one transduction agent capable of diffusing in the internal part.
  • the majority of the transfection and/or transduction agents present in the internal part of the microcompartment are capable of diffusing.
  • all the transfection and/or transduction agents present in the internal part of the microcompartment are capable of diffusing.
  • the properties of the aqueous solution and/or the hydrogel in the internal part allow the movement of cells and transfection and/or transduction agents, thus promoting their encounter and consequently promoting transfection/transduction within the internal part of the microcompartment.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one transfection agent and/or at least one transduction agent capable of diffusing in the internal part and incapable of diffusing through the external hydrogel layer.
  • the external hydrogel layer does not allow the diffusion of transfection agent and/or transduction agent, in particular from the internal part to the exterior of the microcompartment but also from the exterior of the microcompartment to the internal part.
  • microcompartment according to the invention comprises four major constituents, namely:
  • At least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • the cells present in the internal part can be of any cell type. More preferably, the cells are chosen from human, animal and plant eukaryotic cells, even more preferably pluripotent stem cells, progenitors cells in differentiation course and differentiated cells. Preferably the cells are not cells derived from a human embryo or requiring the destruction of a human embryo.
  • the diffusive conductance of the hydrogel from the internal part to a transfection or transduction agent is defined as follows:
  • D is the diffusion coefficient
  • R is the radius of the largest sphere inscribed in the inner part and r is the diameter of the smallest sphere circumscribed to the inner part.
  • layer of cells or “cell base” within the meaning of the invention, we mean several cells forming a layer or base which can be structured around a lumen, it can for example, a tissue or a cellular microtissue or a three-dimensional grouped culture.
  • the thickness of the cell layer can be variable. This layer is organized in three dimensions in the microcompartment.
  • the term “Feret diameter” means the distance, in particular “d” or “D”, between two tangents, these two tangents being parallel, such that the entire projection is between these two parallel tangents.
  • hydrogel of plant or synthetic origin we mean a hydrogel that is not of animal origin and/or derived from cancer cell lines such as Matrigel®. This may include, for example and without limitation, alginate.
  • light or “lumen” within the meaning of the invention, we mean a volume of aqueous solution topologically surrounded by cells. Preferably, its content is not in diffusive equilibrium with the volume of convective liquid present outside the microcompartment.
  • microcompartment or “capsule” means a partially or completely closed three-dimensional structure containing several cells.
  • MOI or multiplicity of infection within the meaning of the invention, we mean the ratio between the number of functional particles of each transduction agent and the number of cells within the microcompartment.
  • the term "pore” means a sub-volume within the general volume of hydrogel within which monomers and/or polymers of the hydrogel do not have covalent or ionic chemical bonds in continuity with the three-dimensional network of the general volume of the hydrogel.
  • diffusion resistance for the purposes of the invention is meant a parameter characterizing the difficulty that a substance encounters in moving by Brownian motion through a material or medium. Diffusion is the process by which molecules move from a region of high concentration to a region of low concentration, often described by Fick's law. In the context of the invention, the diffusion resistance can be influenced by several factors:
  • a denser network will offer greater resistance to diffusion.
  • Pore size Smaller pores increase resistance to diffusion of larger molecules.
  • Diffusion resistance can be measured using the following formula:
  • R d/D-AR where: d is the thickness of the material
  • D is the diffusion coefficient of the substance through the material
  • A is the surface through which diffusion occurs.
  • tissue or “biological tissue” within the meaning of the invention, we mean the common meaning of tissue in biology, that is to say the intermediate level of organization between the cell and the organ.
  • a tissue is a set of similar cells of the same origin (most often from a common cell lineage, although they can find their origin by association of distinct cell lineages), grouped in clusters, networks or bundles (fibers).
  • a tissue forms a functional whole, that is to say that its cells contribute to the same function.
  • Biological tissues regenerate regularly and are assembled together to form organs.
  • the present invention relates to a three-dimensional cellular microcompartment comprising an external hydrogel layer defining an internal part, said internal part comprising:
  • - at least one human, animal or plant eukaryotic cell - at least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • the microcompartment according to the invention is a three-dimensional microcompartment, delimited by the external hydrogel layer and inside said external layer, an internal part comprises one or more cells, one or more transduction and/or transfection agents, and one or more aqueous solutions and/or one or more hydrogels.
  • the external layer delimits an internal part and makes it possible to contain the elements present within the internal part, in particular the cells and the transfection and/or transduction agents.
  • the hydrogel of the internal part is different from the hydrogel constituting the external layer, in that it has at least one different characteristic, in particular at least one different chemical property and/or at least one different physical property.
  • the hydrogel of the internal part different from that of the external layer, allows the transfection and/or transduction agents to diffuse into the internal part and consequently improves the transduction/transfection efficiency, in particular compared to capsules or microcompartments constituted by a single hydrogel.
  • the hydrogel of the external layer has a density and/or viscosity strictly greater than the density and/or viscosity of the solution and/or the hydrogel present within the internal part.
  • the hydrogel of the outer layer has a molecular weight different from the hydrogel present within the inner part.
  • the cellular microcompartment according to the invention comprises in its inner part at least one cell, at least one transfection and/or transduction agent, at least one solution and/or at least one hydrogel of molecular weight lower than the hydrogel of the outer layer.
  • the molecular weight of the hydrogel of the outer layer is greater than the molecular weight of the hydrogel of the inner part.
  • the hydrogel and/or the solution of the internal part allows the cells and the transfection and/or transduction agents to diffuse within the internal part.
  • the external layer has a greater resistance to diffusion than the solution and/or the hydrogel of the internal part, which makes it possible to improve the transfection and/or transduction within the microcompartment.
  • the external hydrogel layer also makes it possible to protect the cells from the external environment, to limit the uncontrolled proliferation of the cells, and their differentiation in the event of differentiation.
  • the microcompartment according to the invention is characterized by a diffusive conductance of the external layer to at least one transduction agent and/or transfection agent strictly lower than the diffusive conductance of the internal part to this same transduction agent and/or transfection agent.
  • the microcompartment according to the invention has a maximum diffusive conductance of the hydrogel of the external layer to at least one transduction agent and/or transfection agent of less than 0.1 mm 3 /h, preferably less than 0.05 mm 3 /h, even more preferably less than 0.01 mm 3 /h.
  • the microcompartment according to the invention has a maximum diffusive conductance of the hydrogel of the internal part to at least one transduction agent and/or transfection agent greater than 0.1 mm 3 /h, preferably greater than 1 mm 3 /h, even more preferably greater than 10 mm 3 /h, in particular greater than 50 mm 3 /h.
  • the microcompartment according to the invention has a maximum diffusive conductance of the hydrogel of the external layer to at least one transduction agent and/or transfection agent of less than 0.003mm 3 /h, in particular less than 0.001mm 3 /h, preferably less than 0.0001mm 3 /h, even more preferably less than 0.00001mm 3 /h.
  • the microcompartment according to the invention has a ratio of the diffusive conductance of the hydrogel of the internal part to the diffusive conductance of the hydrogel of the external layer relative to a transfection and/or transduction agent greater than 5, preferably greater than 10, even more preferably greater than 100, in particular greater than 1000.
  • the microcompartment according to the invention allows, thanks to its external layer, to maintain the transduction agents and/or transfection agents within the internal part.
  • This physical barrier allows the transduction agents and/or transfection agents to be brought closer together. of transfection of cells by reducing the volume available for the diffusion of said agent and therefore of increasing the efficiency of transduction and/or transfection while reducing the quantity of transfection and/or transduction agents for a similar efficiency.
  • At least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • the porosity of the external layer is characterized by the presence of pores whose largest dimension is less than the smallest dimension d of said at least one transduction agent and/or transfection agent and, when the internal part comprises a hydrogel, the latter comprises pores whose smallest dimension is greater than this dimension d.
  • the pore size can be measured by techniques well known to those skilled in the art, namely:
  • the pore size of the hydrogel of the outer layer and of the hydrogel of the inner part is measured by neutron scattering or small angle X-rays (SANS/SAXS) and by diffusion test of polymers of known molecular mass.
  • the hydrogel of the outer layer is characterized by the presence of pores whose largest dimension is less than 25 nm, preferably less than 20 nm, in particular less than 10 nm, even more preferably less than 5 nm.
  • the particular pore size of the outer hydrogel layer makes it possible to maintain the cells and the transduction agents and/or transfection agents in the internal part.
  • the hydrogel of the internal part comprises pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of at least one transduction agent and/or transfection agent present in the internal part.
  • the hydrogel constituting the internal part comprises pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of the majority of the transduction agents and/or transfection agents present in the internal part.
  • the hydrogel of the internal part comprises pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of all the transduction agents and/or all the transfection agents present in the internal part.
  • the hydrogel of the internal part of the microcompartment comprises pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of the transduction agent and/or the transfection agent having the smallest dimension d within the internal part.
  • the microcompartment according to the invention is characterized in that it comprises at least one continuous diffusion path within the hydrogel of the internal part between a cell and a transfection and/or transduction agent for which the smallest dimension is greater than 100 nm, preferably between 25 and 500 nm.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one aqueous solution and/or at least one hydrogel, in which the hydrogel of the internal part is characterized by the presence of pores whose smallest dimension is greater than the largest dimension D of said transduction agent and/or transfection agent present in the internal part, and in that the hydrogel of the external layer is characterized by the presence of pores whose largest dimension is less than that of the dimension D so that the transduction agent cannot diffuse through this external layer.
  • the hydrogel of the internal part of the microcompartment comprises pores whose smallest dimension is greater than the largest dimension D of the transduction agent and/or the transfection agent having the largest dimension D within the internal part.
  • the microcompartment according to the invention comprises an external hydrogel layer defining an internal part, said internal part comprising at least one hydrogel, in which the Young's modulus of the hydrogel of the internal part is strictly lower than the Young's modulus of the hydrogel of the external layer. Thanks to this Young's modulus of the hydrogel of the internal part, the external layer will be more rigid than the hydrogel of the internal part, the hydrogel of which is looser, more loose, in particular due to the presence of a shorter chain, facilitating the growth of cells and the movement of transduction and/or transfection agents.
  • the advantages cited above can be improved when the Young's modulus of the hydrogel of the internal part is between 0.01 and 200 kPa, more preferably between 0.1 and 60 kPa, even more preferably between 0.1 and 5 kPa.
  • the Young's modulus of the hydrogel of the external layer is greater than 10 kPa, more preferably greater than 60 kPa, even more preferably greater than 100 kPa.
  • the hydrogel of the inner part is entangled with the hydrogel of the outer layer, in particular on the inner face of the outer layer. Also, the delimitation between the two hydrogels despite a different Young's modulus may not be perfectly clear. Consequently, at least a portion of the hydrogel of the layer or of the mesh of the inner part may be entangled with the inner face of the outer layer.
  • the hydrogel of the internal part with a low Young's modulus then presents viscoelastic and viscoplastic properties which are particularly advantageous for obtaining an extracellular matrix substitute, in which the cells will be able to lodge, grow, move and be transfected and/or transduced in a satisfactory manner.
  • a hydrogel for example an alginate hydrogel, with a low Young's modulus, has faster relaxation properties, also known as “fast-relaxing", which allows cells to move, change shape, expand, proliferate and mechanically remodel the hydrogel-based matrix and also allow the diffusion of transfection and/or transduction agents, making the microcompartment according to the invention particularly suitable for in capsulo transfection and/or transduction.
  • the hydrogel(s) used in the microcompartments according to the invention are biocompatible, i.e. they are not toxic to the cells. They must allow the diffusion of oxygen and nutrients to feed the cells contained in the microcompartment and allow their survival.
  • the hydrogel of the outer layer and/or the inner part may comprise or consist of alginate.
  • the alginate hydrogel is shear-thinning, that is to say that its viscosity decreases when the shear rate increases, this is particularly advantageous when passing through a microfluidic injector to form the microcompartments according to the invention.
  • the external hydrogel layer comprises at least alginate. It may consist exclusively of alginate.
  • the alginate constituting the outer layer may in particular be a sodium alginate, composed of 80% a-L-guluronate and 20% p-D-mannuronate, having a Young's modulus greater than 10 kPa, preferably greater than 60 kPa, more preferably greater than 100 kPa.
  • the alginate of the outer layer has an average molecular weight of 100 to 400 kDa, more preferably between 150 and 250 kDa.
  • the concentration of the alginate solution used to form said outer layer of the microcompartment is preferably between 0.5 and 5% by mass, more preferably the concentration is equal to 2% (plus or minus 0.5%) by mass.
  • the viscosity of the alginate forming the external layer is preferably between 100 and 200mPa/s.
  • the outer hydrogel layer is devoid of cells.
  • the hydrogel of the inner portion may be in the form of a layer or a mesh. According to one embodiment, the hydrogel of the inner portion is at least partially juxtaposed to the inner face of the outer layer.
  • the microcompartment according to the invention comprises in its internal part:
  • a layer of aqueous solution and/or a hydrogel layer and/or mesh, or
  • a layer of aqueous solution and/or a hydrogel.
  • the microcompartment according to the invention comprises in its internal part:
  • the hydrogel(s) used in the internal part of the microcompartments according to the invention are biocompatible, that is to say they are not toxic to the cells. They must allow the diffusion of oxygen and nutrients to feed the cells contained in the microcompartment and allow their survival.
  • These hydrogels can be chosen from all the biocompatible hydrogels having the characteristics of the invention. They can be, for example, alginate, fibrin, laminin, fibronectin, entactin, hyaluronic acid and/or collagen. They can also be an extracellular matrix or an extracellular matrix substitute such as Matrigel®.
  • the hydrogel of the inner part comprises alginate or is an alginate but different from the alginate of the outer layer if the outer layer is made of alginate.
  • This difference can be characterized in particular by a difference in diffusive conductance, viscosity, density, molecular weight, Young's modulus and/or pore sizes.
  • the inner part comprises a layer and/or a hydrogel mesh comprising at least alginate.
  • the layer and/or mesh can consist exclusively or partially of alginate.
  • the alginate present in the inner part can be in particular a sodium alginate, composed of 80% a-L-guluronate and 20% p-D-mannuronate.
  • the alginate of the internal part may be an alginate comprising pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of at least one transfection and/or transduction agent, and/or a Young's modulus of between 0.01 kPa and 200 kPa, preferably between 0.1 kPa and 60 kPa, more preferably between 0.1 kPa and 5 kPa.
  • the alginate present in the internal part has an average molecular weight of at most 75 kDa.
  • the concentration of the alginate solution intended to form the internal part of the microcompartment is preferably between 0.25 and 2%, more preferably between 0.25 and 1%, even more preferably 0.5% (percentage by mass).
  • the viscosity of the alginate is preferably 3 mPa/s.
  • alginate is well characterized, easy to sterilize and store, can possibly be chemically modified, and offers interesting mechanical properties. Also, alginate allows good growth, little cell death, good amplification and a good proportion of transfected and/or transduced cells.
  • the hydrogel of the internal part comprises fibrin or is fibrin
  • the fibrin is preferentially obtained from the polymerization of fibrinogen by a fibrinogen polymerization agent, such as thrombin.
  • a fibrinogen polymerization agent such as thrombin.
  • This polymerization agent can be added during encapsulation and/or after encapsulation.
  • the polymerization of the fibrinogen solution by the thrombin solution takes place during encapsulation and/or after encapsulation.
  • the polymerization takes place within the newly formed drop or capsule, i.e. after the rigidification of the outer layer.
  • the hydrogel of the internal part may comprise other constituents such as for example at least one peptide sequence, more preferably a peptide sequence of interest capable of interacting with the cells present in the microcompartment according to the invention.
  • the peptide sequence may be a peptide, or a protein.
  • the peptide sequence may be for example a YIGSR motif and/or an RGD motif.
  • the YIGSR motif is a peptide derived from the pi chain of laminin with the sequence Tyrosine-Isoleucine-Glycine-Serine-Arginine facilitating cell adhesion to the matrix.
  • the RGD motif is a peptide with the sequence Arginine-Glycine-Asparagine also facilitating cell adhesion to the matrix.
  • the internal part comprises at least two different hydrogels, each being different from the hydrogel of the external layer.
  • These at least two hydrogels present in the internal part are preferentially chosen from alginate, fibrin, laminin, fibronectin, entactin, hyaluronic acid, and collagen.
  • the second hydrogel may be in the form of particles.
  • this form of the second hydrogel does not prevent the diffusion of transfection and/or transduction agents within the internal part while providing a beneficial effect on the cells, preferentially by improving cell survival.
  • the internal part comprises at least one aqueous solution
  • the latter does not limit the diffusion of soluble particles, in particular transfection agents and/or transduction agents depending on their size through said solution, in particular soluble particles whose size would be greater than 10 nm, preferably 25 nm.
  • the internal part comprises at least one aqueous solution
  • the latter has a viscosity of between 0.1 and 10 mPa/s.
  • the internal part comprises an aqueous solution and a hydrogel
  • the internal part has a viscosity of between 0.1 and 50 mPa/s.
  • the viscosity of the internal part is between 0.1 and 50mPa/s.
  • the particular viscosity of the aqueous solution and/or the hydrogel facilitates the encounter of the transfection agents and/or transduction agents and the cells within the internal part of the microcompartment and consequently of increasing the proportion of transduced/transfected cells compared to the 2D cultures or the 3D cultures described in the prior art.
  • the viscosity of the aqueous solution and/or hydrogel can be measured using a viscometer at 20°C.
  • the hydrogel and/or the aqueous solution of the internal part make it possible to promote the encounter with the cells and consequently improve the efficiency of transduction/transfection.
  • the latter is preferably a culture medium adapted to the cells of the microcompartment.
  • the culture medium is chosen from culture media usually compatible with the culture of the cells present within the microcompartment, for example from culture media used in two-dimensional culture or in spheroid culture.
  • the internal part of the microcompartment comprises at least one transduction agent and/or a transfection agent comprising at least one molecule of interest.
  • the cellular microcompartment according to the invention comprises:
  • At least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • said at least one transfection agent and/or at least one transfection agent does not modify the cell type of the cells present within the internal part of the microcompartment.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one transduction agent and/or at least one transfection agent in the aqueous solution and/or in the hydrogel of the internal part.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one transduction agent
  • said agent may be chosen from a viral particle, a pseudo-viral particle or their combination.
  • the transduction agent is chosen from an adenovirus, an adeno-associated virus, a retrovirus, a lentivirus, a Sendai virus, a baculovirus and their combinations.
  • the MOI (“multiplicity of infection”) of said microcompartment is between 0.01 and 100, in particular between 0.01 and 50, even more preferably between 0.01 and 10.
  • the MOI (“multiplicity of infection”) of said microcompartment is between 0.01 and 5.
  • the MOI (“multiplicity of infection”) of said microcompartment is between 5 and 100, in particular between 5 and 50, preferably between 5 and 25, more preferably between 5 and 15.
  • the MOI of said microcompartment is less than 10.
  • the microcompartment according to the invention by its particular conformation, makes it possible to promote the encounter between the transduction agents and the cells. Consequently, the MOI necessary to obtain satisfactory transduction is lower than those of two-dimensional systems or three-dimensional systems not having the characteristics of the microcompartment according to the invention.
  • microcompartment according to the invention thus makes it possible to reduce the MOI necessary to obtain satisfactory transduction, thereby reducing the costs associated with transduction.
  • said agent may be chosen from an extracellular vesicle of endosomal origin such as an exosome, a plasma membrane derivative, a liposome, a nanoparticle, a peptide complex, calcium phosphate and their combinations.
  • the microcompartment comprises at least one transfection agent, said agent is a derivative of the plasma membrane comprising proteins of viral origin.
  • the microcompartment according to the invention is suitable for all types of transduction and transfection agents capable of modifying the genome, transcriptome or proteome of a eukaryotic cell, preferably capable of comprising and/or expressing at least one peptide sequence and/or one coding or non-coding RNA sequence and/or one transgene in a transient, constitutive or conditional manner.
  • the microcompartment according to the invention requires a lower concentration of transduction and/or transfection agent than the solutions proposed by the prior art while obtaining a similar transfection/transduction efficiency.
  • the ratio of quantity of DNA or quantity of RNA/cell is less than 10, preferably less than 5, even more preferably less than 2.
  • the microcompartment according to the invention by its particular conformation, makes it possible to promote the encounter between the transfection agents and the cells. Consequently, the ratio of quantity of DNA or quantity of RNA / cell necessary to obtain a satisfactory transfection is lower than those of two-dimensional systems or three-dimensional systems not having the characteristics of the microcompartment according to the invention.
  • the microcompartment according to the invention thus makes it possible to reduce the quantity of DNA or RNA necessary to obtain satisfactory transfection, thereby reducing the costs associated with transfection.
  • the smallest dimension d of at least one transfection agent and/or at least one transduction agent present in the internal part of the microcompartment is greater than 10 nm, preferably between 15 and 25 nm.
  • the majority of the transfection agents and/or transduction agents present in the internal part of the microcompartment preferably all, have a smallest dimension d of less than 25 nm, preferably between 15 and 25 nm.
  • the largest dimension D of at least one transfection agent and/or at least one transduction agent present in the internal part of the microcompartment is greater than 25 nm, preferably greater than 100 nm, in particular greater than 500 nm, even more preferably greater than 1 pm.
  • the majority of the transfection agents and/or the transduction agents present in the internal part of the microcompartment preferably all, have a largest dimension D greater than 50 nm, in particular greater than 100 nm, even more preferably between 300 and 500 nm.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one transduction agent and/or at least one transfection agent in the aqueous solution and/or the hydrogel of the internal part.
  • said transduction agent and/or transfection agent can diffuse into the aqueous solution and/or into the hydrogel of the internal part so as to increase its chances of encountering a cell and inserting at least one molecule of interest therein.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one transfection agent and/or at least one transduction agent comprising at least one molecule of interest chosen from a nucleic acid, a ribonucleic acid, a protein, a peptide and their combinations.
  • the transfection and/or transduction agent makes it possible to modify the behavior of the cells present in the internal part by inserting at least one molecule of interest.
  • the internal part of the microcompartment comprises at least one cell.
  • the cells present in the microcompartment may be any type of cells, in particular the cells are eukaryotic cells. More preferably, the cells are human or plant or animal cells.
  • the cells present in the internal part are chosen from pluripotent cells, progenitors, cells in the process of differentiation, differentiated cells and their mixtures.
  • the cells present in the internal part are selected from pluripotent cells, progenitors, cells undergoing differentiation and mixtures thereof.
  • the microcompartment according to the invention does not comprise a differentiated cell.
  • the microcompartment comprises pluripotent stem cells.
  • a pluripotent stem cell, or pluripotent cell is understood to mean a cell that has the capacity to form all the tissues present in the entire original organism, without being able to form an entire organism as such.
  • the pluripotent stem cells may in particular be induced pluripotent stem (iPS) cells, MUSE (Multi-lineage-differentiating Stress Enduring) cells found in the skin and bone marrow of adult mammals, or embryonic stem (ES) cells.
  • iPS induced pluripotent stem
  • MUSE Multi-lineage-differentiating Stress Enduring
  • ES embryonic stem
  • the microcompartment according to the invention does not comprise embryonic stem (ES) cells.
  • the microcompartment according to the invention comprises human or animal induced pluripotent stem cells.
  • the microcompartment according to the invention comprises:
  • At least one transduction agent and/or at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • the microcompartment according to the invention comprises human or animal multipotent cells and/or human or animal progenitor cells derived from these multipotent cells and/or cells undergoing differentiation.
  • the multipotent and/or progenitor cells have preferably been obtained from pluripotent stem cells, in particular human pluripotent stem cells, or optionally from non-pluripotent human cells whose transcriptional profile has been artificially modified to match that of multipotent cells and/or particular progenitors, typically by forced expression of transcription factors specific to the target cell phenotype.
  • the multipotent and/or progenitor cells have been obtained from pluripotent stem cells after contact with a solution capable of initiating the differentiation of said stem cells.
  • the microcompartment according to the invention comprises differentiated human or animal cells.
  • the differentiated cells have preferably been obtained from pluripotent stem cells or progenitor cells, in particular human pluripotent stem cells or human progenitor cells, or optionally from non-pluripotent human cells whose transcriptional profile has been artificially modified to match that of particular differentiated cells, typically by forced expression of transcription factors specific to the target cell phenotype.
  • the differentiated cells have been obtained from pluripotent or multipotent stem cells or progenitor cells after contact with a solution capable of initiating the differentiation of said stem cells.
  • the cellular content of the microcompartment comprises homogeneous or mixed cellular identities.
  • the differentiated cells may in particular be present in the form of at least one layer of cells or in the form of a tissue, a cell aggregate or a three-dimensional micro-tissue or in the form of several tissues or micro-tissues in the microcompartment. It may be a compacted or non-compacted tissue or micro-tissue, with or without a lumen.
  • the microcompartment according to the invention can therefore comprise several types of cells.
  • the microcompartment according to the invention has in its internal part at least two different cell types.
  • the microcompartment according to the invention can comprise for example stem cells induced to pluripotency and/or multipotent cells and/or progenitor cells and/or in the process of differentiation and/or differentiated cells.
  • the aqueous solution and/or the hydrogel are preferably arranged between the external hydrogel layer and said layer or layer of cells. It is understood that the microcompartment may also comprise in its internal part cells suspended in the aqueous solution or the hydrogel of the internal part.
  • the aqueous solution and/or the hydrogel are preferentially arranged between the external hydrogel layer and said aggregate and/or tissue and/or microtissue of cells. It being understood that the microcompartment may also comprise in its internal part cells suspended in the aqueous solution or the hydrogel of the internal part.
  • the aggregate and/or the cell layer and/or the cell base and/or the tissue and/or the microtissue comprises at least one light or lumen.
  • Said light may contain a liquid, in particular culture medium and/or a liquid secreted by the cells.
  • this hollow part allows the cells to have a small diffusive volume whose composition they can control, promoting cellular communication.
  • the cell layer and the hydrogel layer and/or mesh and/or the aqueous solution layer of the internal part are organized around at least one lumen, more preferably they are organized successively around at least one lumen.
  • the cell layer and the hydrogel layer and/or mesh and/or aqueous solution layer of the internal part are successively organized around a lumen. This is referred to as a cyst-shaped conformation.
  • the microcompartment comprises only one cyst
  • the cell layer, the hydrogel layer and/or mesh and/or the aqueous solution layer of the internal part, and the external layer are successively organized around a lumen.
  • This conformation in the form of cyst(s) makes it possible to reduce the pressures undergone by the cells.
  • This configuration also makes it possible to reduce cell mortality and to increase the amplification factor of the culture. Consequently, this makes it possible to reduce the number of passages and dissociation necessary; to reduce the time in culture necessary to reach the final number of cells necessary.
  • the microcompartment may comprise one or more cysts, and/or one or more tissues and/or microtissues and/or cell aggregates with or without lumen(s).
  • the microcompartment according to the invention is suitable for the transduction and/or transfection of any type of eukaryotic cell.
  • Such a microcompartment is thus particularly suitable for carrying out a genetic and/or transcriptomic and/or protein modification of cells of interest, preferably so that said cells can comprise and/or express at least one peptide sequence and/or a coding or non-coding RNA sequence and/or a transgene in a transient, constitutive or conditional manner.
  • the microcompartment according to the invention is obtained after several cycles of cell division.
  • the cells included in the microcompartment according to the invention can be cells obtained by amplification, from at least one cell.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention can be obtained after at least two cycles of cell division after encapsulation in an external hydrogel layer of at least one cell.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention have been obtained after at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28 or 30 cycles of cell division after encapsulation in an external hydrogel layer of at least 1 cell, preferably between 1 and 5, between 1 and 10, between 1 and 15, between 1 and 20, between 1 and 30, between 1 and 40, between 1 and 50, between 1 and 60, between 1 and 100 cells.
  • the cells present in the microcompartment were obtained after at least six cycles of cell division after encapsulation in an external hydrogel layer of at least 1 cell, preferably between 1 and 50 cells.
  • the microcompartment is obtained after at least 2 passages after encapsulation, more preferably at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 passages.
  • Each passage can last for example at least 1 day, or between 2 and 50 days, in particular between 3 and 10 days.
  • all of the cells initially encapsulated in the microcompartment before the first cycle of cell division represent a volume less than 50% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated, more preferably less than 40%, 30%, 20%, 10% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention were obtained after at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles of cell division, after encapsulation in an external layer of hydrogel of cell(s) representing a volume less than 50% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated, more preferably less than 40%, 30%, 20%, 10% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated.
  • the cells represent more than 50% by volume relative to the volume of the microcompartment, even more preferably more than 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% by volume relative to the volume of the microcompartment.
  • the microcompartment according to the invention comprises several cells, preferably at least 20 cells, even more preferably at least 100, at least 500, at least 1000, at least 10000.
  • the microcompartment according to the invention can be obtained by encapsulation carried out by means of a co-injection carried out concentrically via a microfluidic injector forming a jet at the injector outlet consisting of the mixture of the different useful solutions, said jet splitting into drops.
  • the drops are then collected in a bath, in particular a calcium bath, capable of stiffening the hydrogel solution to form the external layer of each microcompartment.
  • the co-injection is also carried out concentrically via a microfluidic injector, said injector comprising a tip, said tip being in contact with a calcium solution, forming a jet at the injector outlet consisting of the mixture of said solutions, said jet forming the tube in the calcium solution.
  • the cellular microcompartment according to the invention is preferably closed or partially closed, that is to say that the external layer is closed or partially closed. More preferably the microcompartment is closed.
  • the microcompartment according to the invention can be in any three-dimensional shape, that is to say it can have the shape of any object in space.
  • the microcompartment can have any shape compatible with the encapsulation of cells.
  • the microcompartment according to the invention is in a spherical or elongated shape. It can have the shape of an ovoid, a cylinder, a spheroid or a sphere. In particular, it can be in the shape of a hollow spheroid, a hollow ovoid, a hollow cylinder or a hollow sphere.
  • the outer layer of the microcompartment i.e. the hydrogel layer, which gives its size and shape to the microcompartment according to the invention.
  • the smallest dimension of the microcompartment according to the invention is between 10 pm and 1 mm, preferably between 100 pm and 700 pm. It may be between 200 pm and 600 pm, in particular between 300 pm and 500 pm.
  • Its largest dimension is preferably greater than 10pm, more preferably between 10pm and 1m, even more preferably between 10pm and 50cm.
  • the microcompartment according to the invention may optionally be frozen for storage. It will then have to be defrosted before use.
  • the invention also relates to several microcompartments together. Also, the invention also relates to a set or series of cellular microcompartments as described above comprising at least one cellular microcompartment according to the invention.
  • the invention also relates to a set or series of microcompartments of at least two cellular microcompartments in three dimensions, in which at least one microcompartment is a microcompartment according to the invention, preferably the majority of the microcompartments. of the set are microcompartments according to the invention. According to a particular embodiment, all of the microcompartments of the set are microcompartments according to the invention.
  • the set of microcompartments according to the invention preferably comprises between 2 and 1016 microcompartments, preferably between 1000 and 109 microcompartments according to the invention.
  • the series of microcompartments according to the invention is in a culture medium, in particular in an at least partially convective culture medium.
  • the invention relates to a set of cellular microcompartments in a closed enclosure, such as a bioreactor, preferably in a culture medium in a closed enclosure, such as a bioreactor.
  • an external hydrogel layer and the aqueous solution and/or the hydrogel of the internal part allow a uniform distribution of the cells between the microcompartments. Furthermore, the external hydrogel layer makes it possible to avoid fusions of microcompartments which are a major source of unfavorable variability for the phenotypic homogeneity of the cells.
  • the microcompartment according to the invention can be obtained by a method comprising the implementation of the following steps:
  • step (c) encapsulating the solutions and/or hydrogels of steps (a) and (b) by colinear flow in an external hydrogel layer having pores whose largest dimension is smaller than the smallest dimension d of said transduction agent and/or transfection agent of step (a);
  • step (d) culturing the microcompartments obtained in step (c) in a culture medium, preferably in a bioreactor, preferably for at least 1 day, preferably from 3 to 50 days, and
  • the microcompartment according to any of the embodiments previously described or the set of microcompartments according to any of the embodiments previously described is also particularly suitable for use in cell culture, in particular in three-dimensional cell culture. These allow the production of cells of interest in large quantities, in particular cells, micro-tissue or organoid expressing at least one peptide sequence, a coding or non-coding RNA sequence, or a transgene. transiently, constitutively or conditionally, capable of being used, for example in the context of cell therapy. Also, the invention also relates to a microcompartment according to the invention or a set of microcompartments according to the invention, for its use as a medicament.
  • the invention relates to the use of the microcompartment according to any of the preceding objects, for inserting at least one peptide sequence, a coding or non-coding RNA sequence, or a transgene transiently, constitutively or conditionally into at least one eukaryotic cell.
  • the invention also relates to the use of the microcompartment according to the invention for implementing transfection and/or transduction method(s).
  • the invention relates to the use of the microcompartment according to any of the preceding objects, for the production, preferably on a large scale, of cells, micro tissues or tissues expressing at least one transgene in a transient, constitutive or conditional manner.
  • microcompartment can be obtained by different means known to those skilled in the art for preparing microcompartments or capsules.
  • the invention also relates to a particular method for preparing microcompartments.
  • the invention relates to a method for preparing a microcompartment comprising the following steps:
  • step (c) encapsulating the solutions and/or hydrogel(s) of steps (a) and (b) by collinear flow in an external hydrogel layer, said hydrogel being different from the possible hydrogel of step (b).
  • the preparation method according to the invention also comprises a step (d) consisting of culturing the microcompartments obtained in step (c) in a culture medium, preferably in a bioreactor, preferably for at least 1 day, preferably from 3 to 50 days.
  • step (c) consists in encapsulating the solutions and/or hydrogel(s) of steps (a) and (b) by collinear flow in an external layer of hydrogel, said hydrogel having a diffusive conductance to at least one transduction agent and/or transfection agent. strictly less than the diffusive conductance of the part internal to this same transduction agent and/or transfection agent.
  • the method for preparing a microcompartment according to the invention comprises the implementation of the following steps:
  • step (c) encapsulating the solutions and/or hydrogels of steps (a) and (b) by colinear flow in an external hydrogel layer having pores whose largest dimension is smaller than the smallest dimension d of said transduction agent and/or transfection agent of step (a).
  • the solution of step (a) is produced in at least one aqueous solution, preferably a suitable culture medium.
  • Said culture medium preferably comprises at least one cytoprotective factor, more preferably at least one apoptosis inhibitor.
  • the apoptosis inhibitor may for example be one or more inhibitor(s) of the RHO/ROCK (“Rho-associated protein kinase”) pathways, or any other apoptosis inhibitor known to those skilled in the art.
  • the apoptosis inhibitor must make it possible to promote the survival of the cells at the time of the formation of the external hydrogel layer.
  • the method according to the invention may comprise a step of dissociating the cells by chemical, enzymatic or mechanical dissociation, carried out before or simultaneously with the step of incubating the cells, itself carried out before step a) of mixing. This step is particularly important in the case of adherent cells.
  • the encapsulated cells are suspended in the form of single cells and/or cell clusters.
  • the single cells represent less than 50% in number of the total encapsulated cells, more preferably the single cells are hPSC cells. Indeed it is preferable to encapsulate cell clusters because this reduces apoptosis.
  • the cell density of the solution from step (a) is between 0.1 and 40 million cells per mL, preferably between 0.8 and 20 million.
  • the solution of step (a) preferably comprises at least one cell chosen from pluripotent cells, progenitors, cells in the process of differentiating, differentiated cells and their mixtures.
  • the solution of step (a) comprises at least 2 different cell types.
  • the transduction agent is chosen from an adenovirus, an adeno-associated virus, a retrovirus, a lentivirus, a Sendai virus, a baculovirus and their combinations.
  • the solution of step (b) comprises at least one transfection agent comprising at least one molecule of interest
  • said agent can be chosen from an extracellular vesicle of endosomal origin such as an exosome, a plasma membrane derivative, a liposome, a nanoparticle, a peptide complex, calcium phosphate and their combinations.
  • the encapsulation step (c) comprises the following sub-steps:
  • step (a) bringing into contact the solution of step (a), the solution of step (b) and a hydrogel solution intended to form the external layer to form at least one drop, and
  • the microcompartment is formed.
  • the latter can then be rinsed.
  • the Young's modulus of the hydrogel in the internal part is lower than that of the hydrogel in the external layer, this makes it possible to avoid/limit the stiffening of the hydrogel in the internal part by the calcium bath.
  • the stiffening process by the calcium bath does not make it possible to stiffen the hydrogel in the internal part during the period of use of the capsules and therefore to facilitate cell multiplication.
  • step (c) is carried out by a simultaneous co-injection of the hydrogel solution intended to form the external layer, of the solution of step (a) and of the solution of step (b); said co-injection is carried out concentrically via a microfluidic or millifluidic injector forming a jet at the injector outlet consisting of the mixture of said solutions, said jet breaking up into drops.
  • the final opening diameter of the microfluidic injector is between 50 and 800 pm, preferably between 80 and 240 pm, and the flow rate of each of the solutions is between 0.1 and 2000 mL/h, preferably between 10 and 2000 mL/h, more preferably between 11 and 100 mL/h.
  • step (c) is carried out by a simultaneous co-injection of the hydrogel solution intended to form the external layer, of the solution of step (a) and of the solution of step (b); said co-injection is carried out concentrically via a microfluidic or millifluidic injector, said injector comprising a tip, said tip being in contact with a calcium solution, forming a jet at the injector outlet consisting of the mixture of said solutions, said jet forming a tube.
  • the final opening diameter of the microfluidic injector is preferably between 50 and 1000 pm, more preferably between 80 and 300 pm, and the flow rate of each of the solutions is between 1 and 100 mL/h.
  • the internal part comprising at least one hydrogel comprising pores whose smallest dimension is greater than the smallest dimension d of said transduction agent and/or transfection agent also comprises at least one second hydrogel distinct from the first hydrogel constituting the layer or the mesh of the internal part.
  • At least one hydrogel of the internal part is fibrin, it is preferentially obtained from the polymerization of fibrinogen by a fibrinogen polymerization agent, advantageously said agent is thrombin, said agent can be added during encapsulation and/or after encapsulation.
  • the thrombin solution is co-injected with the other solutions, this is preferentially mixed with the isotonic intermediate solution and the fibrinogen solution is mixed with the solution from step (b).
  • the concentration of fibrinogen is between 10 and 25 mg/mL, preferably 14-20 mg/mL, more preferably 20 mg/mL.
  • the concentration of thrombin is preferably between 0.001U/mL and 2U/ml, more preferably between 0.01U/mL and 1U/ml, between 0.01U/mL and 0.05U/ml, even more preferably 0.04U/ml.
  • U is meant a unit of enzymatic activity (i.e. the concentration for an enzyme) which represents the quantity of enzyme necessary to treat one micromole of substrate in 1 minute. It being understood that the concentration indicated is that in the mixture. Indeed, advantageously the thrombin is mixed with the other constituents according to a ratio of 1:1. Also, within the capsule, when the concentration of thrombin, before mixing, is 0.01U/ml, the concentration in the capsule is of the order of 0.01U/ml.
  • the steps subsequent to encapsulation can be carried out in the absence of agitation or with agitation.
  • the steps subsequent to encapsulation are carried out with permanent or sequential agitation.
  • This agitation is important because it maintains the homogeneity of the culture environment and avoids the formation of any diffusive gradient. For example, it allows homogeneous control of the level of cellular oxygenation; thus avoiding the phenomena of necrosis linked to hypoxia, or oxidative stress linked to hyperoxia. Consequently, it avoids an increase in cell mortality and/or oxidative stress.
  • the method comprises a step which consists of rinsing the capsules resulting from step (d), advantageously so as to eliminate the cytoprotective factor, such as the apoptosis inhibitor.
  • the method according to the invention comprises a step of rinsing the capsules obtained, the solution constituting the calcium bath is removed and replaced by a medium suitable for culturing the microcompartments according to the invention, preferably an isotonic solution, more preferably a culture medium containing an apoptosis inhibitor.
  • the step of rinsing the capsules obtained is carried out after step (d).
  • the method according to the invention comprises at least one re-encapsulation of the cells after step (d), preferably after the rinsing step if such a step is present after step (d).
  • at least one re-encapsulation of the cells is meant at least two encapsulation cycles.
  • each encapsulation cycle corresponds to one passage.
  • the number of cell divisions of the entire method (for all the passages) is at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cell division cycles.
  • re-encapsulations there may be several re-encapsulations, preferably between 1 and 100, in particular between 1 and 10 re-encapsulations.
  • Each re-encapsulation may include:
  • removal of the external hydrogel layer may be achieved in particular by hydrolysis, dissolution, piercing and/or rupture by any biocompatible means, i.e. non-toxic to the cells.
  • removal may be achieved using a phosphate buffered saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel comprises alginate and/or laser microdissection, and
  • Re-encapsulation is a suitable means for increasing cellular amplification obtained from the pluripotent stage, and reducing the risks of mutation.
  • the re-encapsulation comprises the following steps:
  • the invention also relates to a transduction method implemented in at least one cellular microcompartment defined in any of the embodiments previously described.
  • the transduction method according to the invention does not modify the cell type of the transduced cells.
  • the invention also relates to a transfection method implemented in at least one cellular microcompartment defined in any of the embodiments previously described.
  • the transfection method according to the invention does not modify the cell type of the transfected cells.
  • T lymphocytes Primary human CD3+ T lymphocytes are thawed, counted and seeded at 1 million cells per ml in TexMACS medium (Mi Itenyi Biotec).
  • cells are activated by adding "T Cell TransAct human” to the cell culture medium (1/100 dilution) and IL-2 (final concentration of 300 U/mL).
  • Cells are cultured in a T75 cell culture flask (kept upright) at 37°C, 5% CO2.
  • viral vectors are diluted in one volume of TexMACS medium (supplemented with IL-2 at 300 U/mL) to the desired final MOI (see Table 1 below) and added to the cells to obtain a final density of 5 million cells per mL.
  • the obtained cell population (containing viral particles) is divided into 2 samples, one for 2D cell culture in a 12-well plate (final medium volume of 1 mL to 0.5 million cells per mL) and the other for 3D cell encapsulation.
  • encapsulation 400 ⁇ l of the cell sample and viral vectors (at a rate of 5 million cells per ml) are injected into the encapsulation system programmed with the following parameters: alginate syringe flow rate (100 ml/h); cell and intermediate solution flow rate (50 ml/h); electric field (2000 V).
  • capsules Once the capsules have settled ( ⁇ 30 minutes to 1 hour), they are collected on a 100 ⁇ m filter and resuspended in 13 mL of TexMACS medium supplemented with IL-2 (300 U/mL), transferred to a T75 flask and incubated at 37°C, 5% CO2.
  • the capsules thus formed comprise an external hydrogel layer having a 2% alginate with a molecular weight of 150-250 KDa.
  • the internal part comprises an aqueous solution composed of TexMACS culture medium.
  • cells are decapsulated using 10 volumes of ReLeSR, pelleted and resuspended in TexMACS medium for counting and further processing for flow cytometry.
  • the transduction efficiency (% of GFP+ cells) of T lymphocytes by lentiviruses is better for 3D cell encapsulation conditions than for 2D conditions, especially for the lowest MOI tested (0.1 and 1), and this without affecting cell viability ( Figure 3A and 3B).
  • 3D cell encapsulation allows better transgene expression in transduced cells as demonstrated by higher fluorescence intensities ( Figure 2B and 2E). This better transgene expression is associated with a greater number of transgenes inserted into the T lymphocyte genome in 3D conditions than in 2D at equivalent MOI ( Figure 2C).
  • the transduction efficiency (% of GFP+ cells) of T cells by Sendai viral vectors is better for 3D cell encapsulation conditions than for 2D conditions for all MOIs tested (0.3, 1 and 5) ( Figure 2A and 2D), and this without affecting cell viability.
  • 3D cell encapsulation allows for better transgene expression in transduced cells as demonstrated by higher fluorescence intensities.
  • Example 2 Transduction of human induced pluripotent stem (hIPS) cells
  • the cell suspension and viral particles are then injected into the encapsulation system programmed with the following parameters: Alginate syringe flow rate (100 mL/h); Cell and intermediate solution flow rate (50 mL/h); Electric field (2000V). Cells pass through the encapsulation device and capsules are collected in a calcium bath (25 mM HEPES, 100 mM CaCl2, Tween80) located below the outlet nozzle of the encapsulation chip (large capsule configuration).
  • a calcium bath 25 mM HEPES, 100 mM CaCl2, Tween80
  • Capsules are then collected and rinsed with DMEM/F12 medium supplemented with CaCl2 (3 mM final) on a 100 ⁇ m filter. Rinsed capsules are resuspended in 4 volumes (using capsule volume as reference) of DMEM/F12 medium supplemented with CaCl2 (3 mM final). Once capsules settle ( ⁇ 30 minutes to 1 hour), they are collected on a 100 ⁇ m filter and resuspended in 13 mL of mTeSRl medium supplemented with Rock inhibitor (10 pM final), transferred to a T75 flask and incubated at 37°C, 5% CO2.
  • the capsules thus formed comprise an external hydrogel layer having a 2% alginate with a molecular weight of 150-250 kDa.
  • the internal part comprises an aqueous solution composed of mTeSRl culture medium.
  • the medium of cells cultured for 2D cell transduction (seeded the day before in a 12-well plate) is replaced with mTeSRl medium supplemented with Rock inhibitor (10 pM final) and transduced with viral vectors at the same MOI as those used in the 3D configuration (see Table 3).
  • the transduction efficiency (% of GFP+ cells) of iPSCs is better for 3D encapsulation conditions than for 2D conditions, regardless of the MOI used for lentiviral vectors, AAVs or Sendai viral vectors.
  • Example 3 Transduction of encapsulated cell according to the invention with several transduction agents.
  • Example 4 Comparative study of transduction efficiency within a microcompartment comprising a single hydrogel vs a microcompartment according to the invention
  • a microcompartment according to the invention comprising an external hydrogel layer composed of 2% high molecular weight alginate (150-250 kDa) and an internal part comprising an aqueous solution (mTeSRl medium).
  • a microcompartment according to the invention comprising an external hydrogel layer composed of 2% high molecular weight alginate (150-250 kDa) and an internal part comprising a 0.5% low molecular weight alginate hydrogel ( ⁇ 75kDa). Therefore, the hydrogel of the external layer and the hydrogel of the internal part are different.
  • condition 1 Three days after transduction, it can be observed in Figure 7A that transduction is more efficient in condition 1 (82.5% of GFP+ cells with a fluorescence intensity of 32338) than in condition 3 (37.1% of GFP+ cells with a fluorescence intensity of 11317).
  • Condition 2 has an intermediate transduction rate (73.3% of GFP+ cells with a fluorescence intensity of 20909).
  • condition 2 demonstrates better viability as well as better amplification of cells compared to condition 3 ( Figure 7C).
  • Transduction within the microcompartments generated under conditions 1 and 2 is therefore more efficient and less toxic to cells than transduction under condition 3 ( Figure 7A and Figure 7B).
  • condition 2 is more efficient than condition 3 ( Figure 7D) demonstrates that the physical properties required for microcompartment formation can be decorrelated from those promoting optimal transduction and cell culture, particularly in a bioreactor. Indeed, it would be impossible to generate/maintain the physical integrity of capsules filled with 0.5% alginate.
  • Example 5 Measuring the infection capacity of a transduction agent to diffuse through the external hydrogel layer of the microcompartment according to the invention from the outside to the inside.
  • human cancer cells are encapsulated according to the protocol described in example 1, at 3 million cells per ml in a microcompartment according to the invention.
  • the encapsulated cells are placed in a ventilated tube, in 500 ⁇ l of medium: either in uninfected medium (condition 1), or in infected medium (lentiviral vector encoding GFP at MOI 10) (condition 2).
  • human cancer cells are seeded at 80,000 cells per well on a 12-well plate for 24 hours.
  • empty microcompartments i.e. without cells or lentiviral vectors, are produced to represent a negative control for this example.
  • conditions 1 and 2 are incubated for 48 hours at 37°C at 5% CO2 before removing the microcompartments.
  • the fluorescence of the cells is then observed according to the same protocol as example 1 by flow cytometry in order to observe or not the transduction of the cells in conditions 1 and 2 48 hours after the removal of the microcompartments.
  • condition 3 To perform a positive control (condition 3), the microcompartments obtained after rinsing and used for incubation for 48 hours of condition 2, are collected and the encapsulated lentiviral vectors are decapsulated then transferred into DMEM medium.
  • the objective of this example is to study the transduction efficiency of two transduction agents (a lentiviral vector encoding GFP and a Sendai vector encoding mCherry) on CD3+ T lymphocytes.
  • Condition 4 Co-transduced CD3+ T lymphocytes with an MOI of 1.5 for lentiviral vectors and an MOI of 1 for the Sendai vector.
  • Example 8 Measuring the transfection efficiency of human cancer cells using exosomes
  • the objective of this example is to compare the efficiency of exosome transfection in a 3D system via the use of microcompartment according to the invention.
  • Exo-Quick-TC is a commercial solution for precipitating extracellular vesicles such as exosomes
  • exosomes may appear as a beige or white pellet at the bottom of the container;
  • exosomes were transfected as follows:
  • Transfected exosomes are ready to be added to target cells or used in vivo.
  • the transfected exosomes thus obtained are then added to the target cells according to the following protocol:
  • Table 5 describes the ratio of quantity of siRNA or plasmid DNA per cell as well as the efficiency of transfection in the microcompartment according to the invention.
  • Table 5 thus makes it possible to demonstrate that the microcompartment according to the invention is suitable for carrying out a transfection using a transfection agent such as exosomes.

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Abstract

La présente invention se rapporte aux domaines de la transduction et transfection de cellules dans un modèle de culture cellulaire en trois dimensions. Plus particulièrement, l'invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions particulier comprenant notamment au moins une cellule, au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection.

Description

TRANSDUCTION ET/OU TRANSFECTION DANS UN MICROCOMPARTIMENT EN TROIS DIMENSIONS
Domaine technique
La présente invention se rapporte au domaine de la modification génétique et protéomique, de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, de cellules dans un modèle de culture cellulaire en trois dimensions. L'invention a en particulier pour objet un microcompartiment cellulaire particulier permettant de réaliser une transduction et/ou une transfection au sein de la partie interne dudit microcompartiment.
Etat de l'art
Au cours de ces dernières années, les méthodes de culture cellulaire ont évolué tant en termes de complexité que de performances. Les méthodes traditionnelles de cultures cellulaires, qui consistent à cultiver des cellules sur des surfaces planes, en deux dimensions, sont remplacées par des techniques de culture tridimensionnelle (3D), offrant une meilleure reproduction de l'environnement cellulaire in vivo.
La culture cellulaire en 3D offre une alternative plus proche de la réalité biologique en reproduisant les interactions cellules-matrice extracellulaire et cellule-cellule de manière plus précise, conduisant à des résultats plus fiables et pertinents pour les études de biologie cellulaires, la recherche médicale et la thérapie cellulaire.
Les cellules cultivées dans ces systèmes en 3D peuvent être de tout type. Il peut s'agir, aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches.
Toutefois, certaines contraintes associées à la culture cellulaire en 3D peuvent constituer un frein à son utilisation, notamment pour des applications spécifiques telles que la délivrance et l'expression de transgène. En effet, les techniques courantes de transduction ou de transfection fonctionnant bien en culture cellulaire en 2D peuvent ne pas être efficaces pour les cultures en 3D, où les cellules sont encapsulées dans des matrices extracellulaires plus denses, limitant ainsi l'accès des vecteurs de transduction ou des agents chimiques ou physiques de transfection aux cellules.
Par exemple, le document « Neumann AJ, Schroeder J, Alini M, Archer CW, Stoddart MJ. Enhanced adenovirus transduction of hMSCs using 3D hydrogel cell carriers. Mol Biotechnol. 2013;53(2):207- 216. doi:10.1007/sl2033-012-9522-y » présente une méthode de transduction de cellules dans une culture en 3D via l'encapsulation de cellules et de vecteurs viraux dans de l'alginate. Les capsules ainsi formées sont remplies d'alginate de même densité, limitant la transduction au sein de la capsule. L'encapsulation dans de l'alginate formant des capsules « pleines » limite voire bloque le déplacement des cellules et des vecteurs viraux et par conséquent diminue l'efficacité de la transduction. Ainsi, les systèmes de culture cellulaire en 3D existant à ce jour n'exploitent pas leurs potentiels de performances, notamment pour la réalisation d'une modification génétique et/ou protéomique de cellules, plus particulièrement par transfection ou transduction.
Il existe donc un besoin important pour une nouvelle solution permettant de transfecter et/ou transduire des cellules cultivées en 3D afin que lesdites cellules puissent exprimer ou recevoir au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Résumé de l'invention
Pour répondre à ce besoin, l'invention propose un nouveau microcompartiment cellulaire comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l'hydrogel constituant la couche externe.
Préférentiellement, l'hydrogel de la partie interne est différent de l'hydrogel constituant la couche externe, en ce qu'il présente au moins une propriété chimique et/ou au moins une propriété physique différente.
Avantageusement, l'hydrogel de la couche externe maintient l'hydrogel de la partie interne de façon à former un microcompartiment cellulaire en trois dimensions. L'hydrogel et/ou la solution aqueuse de la partie interne sont quant à eux particulièrement adaptés au maintien de la viabilité des cellules eucaryote humaine, animale ou végétale tout en permettant la diffusion desdites cellules et des agents de transduction et/ou agent de transfection au sein de la partie interne.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention est caractérisé par une conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
La conductance diffusive correspond à la capacité d'un matériau, tel qu'une couche d'hydrogel, à permettre la diffusion d'un objet, tel qu'un agent de transduction et/ou agent de transfection en solutions. Ainsi, plus la conductance diffusive d'un matériau à un objet est élevée, plus l'objet pourra diffuser dans ledit matériau.
Selon un mode de réalisation, la couche externe du microcompartiment selon l'invention est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
Avantageusement, la taille des pores de la couche externe est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection permet d'empêcher la diffusion d'au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection à travers la couche externe. En d'autres termes, les pores de la couche externe permettent, par leurs dimensions adaptées, de maintenir au moins un agent de transfection et/ou agent de transduction au sein de la partie interne du microcompartiment. A contrario, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui- ci comprend des pores permettant, par leurs dimensions adaptées, de laisser diffuser au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection au sein de la partie interne.
Dans le contexte de l'invention, la taille des pores peut être mesurée par des techniques bien connues de l'Homme du métier, à savoir :
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ; et
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
Préférentiellement, la couche externe en hydrogel est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 20nm, notamment inférieure à lOnm, encore plus préférentiellement inférieure à 5nm.
Selon un objet préféré de l'invention, l'hydrogel de la partie interne est caractérisé par la présence de pores dont la plus petite dimension est supérieure à 10 nm, préférentiellement supérieure à 25nm, encore plus préférentiellement comprise entre 25 et 500 nm.
Lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci ne limite pas la diffusion de particules solubles telles que des agents de transfection et/ou transduction en fonction de leur taille au travers de ladite solution, en particulier les particules solubles dont la taille serait supérieure à 10 nm, préférentiellement à 25nm.
Selon un mode de réalisation, la partie interne du microcompartiment selon l'invention comprend au moins une solution et/ou au moins un hydrogel comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à 10 nm, notamment supérieure à 25nm, préférentiellement supérieure à lOOnm, encore plus préférentiellement supérieure à 500nm.
L'invention se rapporte ainsi à un microcompartiment comportant deux éléments structurels distincts permettant une transfection et/ou une transduction au sein du microcompartiment, à savoir : - une couche ou enveloppe externe, formée par une couche d'hydrogel, empêchant les cellules et les agents de transduction et/ou transfection de la partie interne de la traverser. Préférentiellement ladite couche externe présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement inférieure à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l'agent de transduction ne puisse diffuser à travers cette couche externe ; et
- une partie interne, comprenant notamment au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de celui de la couche externe, destinée à favoriser la rencontre entre les cellules et les agents de transduction et/ou transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, étant entendu que ladite partie interne est délimitée par la couche externe en hydrogel. Préférentiellement, ladite partie interne présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement supérieure à la conductance diffusive de la couche externe à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou lorsque la partie interne comprend au moins au moins un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l'agent de transduction puisse diffuser à travers cette partie interne.
La couche externe en hydrogel permet, d'une part de former l'enveloppe externe protectrice, et donc de constituer la capsule ou microcompartiment, d'autre part, la solution et/ou l'hydrogel de la partie interne moins rigide, plus lâche, permet la croissance cellulaire et favorise les mouvements des cellules et des agents de transfection et/ou transduction au sein de la partie interne, étant donné la conductance et/ou la taille des pores particulièrement adaptée de la solution et/ou de l'hydrogel.
A l'inverse, l'art antérieur connu, composé d'une unique couche d'hydrogel, est soit trop rigide, ne permettant pas le déplacement des cellules et des agents de transduction et/ou transfection et induisant une faible efficacité de transfection/transduction, soit au contraire, trop lâche et donc incompatible avec une culture en bioréacteur. En effet, les contraintes mécaniques d'une culture en bioréacteur, notamment du fait des forces de cisaillement importantes générées lors de la culture nécessite un microcompartiment cellulaire adapté.
La couche externe en hydrogel, différente de la partie interne comprenant une solution et/ou un hydrogel différent, permet de former l'enveloppe externe du microcompartiment ou de la capsule selon l'invention, qui permettant de protéger le contenu de la capsule de l'environnement extérieur, notamment lorsque les capsules sont cultivées dans un bioréacteur. Par ailleurs, la couche externe en hydrogel garantit le maintien des cellules et des agents de transduction/transfection à l'intérieure de celle-ci. La couche externe permet ainsi de pouvoir dissocier la concentration des agents de transduction/transfection à proximité des cellules également appelée « concentration locale », de la concentration globale d'agents de transduction/transfection dans le système de culture appelée également « concentration globale ».
Ainsi, la structure du microcompartiment optimise les rencontres cellules-agents de transfection et/ou transduction et permet ainsi de diminuer la quantité d'agent de transfection et/ou transduction nécessaire pour obtenir l'efficacité de transfection et/ou transduction désirée, notamment par rapport aux cultures en 2D ou aux cultures en 3D décrites dans l'art antérieur.
Selon un autre objet préféré de l'invention, le microcompartiment comprend au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction capable de diffuser dans la partie interne. Préférentiellement la majorité des agents de transfection et/ou de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment sont capables de diffuser. Selon un mode de réalisation tous les agents de transfection et/ou de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment sont capables de diffuser.
Avantageusement, les propriétés de la solution aqueuse et/ou de l'hydrogel dans la partie interne permettent le déplacement des cellules et des agents de transfection et/ou transduction favorisant ainsi leur rencontre et par conséquent favorise la transfection/transduction au sein de la partie interne du microcompartiment.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention comprend au moins au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction capable de diffuser dans la partie interne et incapable de diffuser à travers la couche externe d'hydrogel.
Avantageusement, selon ce mode de réalisation, la couche externe en hydrogel ne permet pas la diffusion d'agent de transfection et/ou agent de transduction, notamment de la partie interne vers l'extérieur du microcompartiment mais également de l'extérieur du microcompartiment vers la partie interne.
Aussi, le microcompartiment selon l'invention comprend quatre constituants majoritaires, à savoir :
- au moins une couche externe en hydrogel formant l'enveloppe dudit microcompartiment;
- au moins une solution et/ou un hydrogel, permettant la diffusion des agents de transduction et/ou transfection ainsi, optionnellement, que des cellules présentes dans la partie interne du microcompartiment ;
-au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt ;
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale.
Les cellules présentes dans la partie interne, peuvent être de tous types cellulaires. Plus préférentiellement, les cellules sont choisies parmi les cellules eucaryotes humaines, animales et végétales, encore plus préférentiellement les cellules souches pluripotentes, les progéniteurs les cellules en cours de différenciation et les cellules différenciées. Préférentiellement les cellules ne sont pas des cellules issues d'un embryon humain ou nécessitant la destruction d'un embryon humain.
Les cellules présentes dans la partie interne peuvent être isolées et/ou sous forme d'au moins une couche et/ou ou sous forme d'au moins un agrégat en trois dimensions et/ou sous forme d'au moins un micro-tissu cellulaire en trois dimensions, éventuellement avec au moins une lumière.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment comprend au moins une couche de cellules et au moins une lumière. Lorsque le microcompartiment comprend au moins une lumière, au moins une couche de cellules, le ou les agent(s) de transduction et/ou agent(s) de transfection, la couche de solution aqueuse ou l'hydrogel de la partie interne et la couche externe sont préférentiellement, successivement organisées autour de ladite lumière.
Selon un autre aspect, l'invention se rapporte également à un ensemble de microcompartiments, dans lequel ledit ensemble comprend au moins un microcompartiment selon l'un des quelconques modes de réalisation précédents.
Le microcompartiment selon l'invention ou l'ensemble de microcompartiments selon l'invention, est également particulièrement adapté pour être utilisé en culture cellulaire, en particulier en culture cellulaire en trois dimensions, permettant la production de cellules d'intérêt en grande quantité, notamment des cellules, micro-tissu ou organoïde comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, susceptible d'être utilisé, par exemple dans le cadre de thérapie cellulaire.
Avantageusement, la conformation du microcompartiment selon l'invention permet de réaliser une transduction et/ou transfection in capsulo et par conséquent produire des cellules comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Aussi, l'invention se rapporte également à un microcompartiment selon l'invention ou un ensemble de microcompartiment selon l'invention, pour son utilisation comme médicament.
Selon une variante, l'invention se rapporte également à une utilisation du microcompartiment selon l'invention ou d'un ensemble de microcompartiments selon l'invention pour insérer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle dans une cellule eucaryote.
Selon une autre variante, l'invention porte également sur l'utilisation du microcompartiment selon l'invention pour fabriquer des micros tissus comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle. Etant entendu que dans ce mode de réalisation particulier, les micros tissus ne sont préférentiellement pas destinés à être implantés chez un être humain ou un animal. A titre d'exemple, ils peuvent être utilisés comme modèle ex-vivo. L'invention a également pour objet un procédé de transduction et un procédé de transfection mis en œuvre dans au moins un microcompartiment selon l'invention.
D'autre part, le microcompartiment selon l'invention peut être produit de différentes manières, toutefois selon un aspect particulier, l'invention se rapporte à un procédé de préparation du microcompartiment cellulaire selon l'invention, comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel différent de celui de l'étape (b) ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l'étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Selon un objet particulier de l'invention, l'étape (c) comprend les sous-étapes suivantes :
- mettre en contact la solution de l'étape (a) et la solution de l'étape (b) avec une couche d'hydrogel pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
De façon particulièrement préférée, l'étape (c) est réalisée par co-injection simultanée de la solution de l'étape (a), la solution de l'étape (b) et une couche externe d'hydrogel, ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
Avantageusement, le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 pm, préférentiellement entre 80 et 240 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 0,1 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 10 et 2000 mL/h, plus préférentiellement entre 10 et 150 mL/h, encore plus préférentiellement entre 11 et lOOmL/h.
Selon une variante du procédé selon l'invention, l'étape (c) est réalisée par co-injection de la solution de l'étape (a) et la solution de l'étape (b) dans une couche externe d'hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l'étape (a); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d'in- jecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube.
Lorsque ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec la solution de calcium, le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est préférentiellement compris entre 50 et 1000 pm, plus préférentiellement entre 80 et 300 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
Brève description des Figures :
[Figure 1] La figure 1 représente le schéma expérimental de l'exemple 1 portant sur la transduction de lymphocytes T CD3+ primaires humains.
[Figure 2A] La figure 2A est une représentation graphique d'une étude comparative de l'efficacité de transduction d'un système de culture de lymphocytes T en 2D vs un système en 3D en fonction de la MOI d'un vecteur Lentiviral.
[Figure 2B] La figure 2B est une représentation graphique d'une étude comparative présentant l'intensité de fluorescence d'un transgène dans des cellules transduites par un vecteur Lentiviral dans un système de culture de lymphocytes T en 2D vs un système en 3D.
[Figure 2C] La figure 2C représente le nombre moyen mesuré par qPCR de transgènes GFP intégré dans le génome de lymphocytes T par un vecteur Lentiviral dans un système de culture en 2D vs un système en 3D
[Figure 2D] La figure 2D est une représentation graphique d'une étude comparative de l'efficacité de transduction dans un système de culture de lymphocytes T en 2D vs un système en 3D en fonction de la MOI d'un vecteur viral Sendaï.
[Figure 2E] La figure 2E est une représentation graphique d'une étude comparative présentant l'intensité de fluorescence d'un transgène dans des lymphocytes T transduits par un vecteur viral Sendaï dans un système cellulaire en 2D vs un système en 3D.
[Figure 3A] La figure 3A est une représentation graphique d'une étude comparative de la viabilité cellulaire d'un système de culture de lymphocyte T en 2D vs un système de culture en 3D en présence de différente MOI d'un vecteur viral Sendaï.
[Figure 3B] La figure 3A est une représentation graphique d'une étude comparative de la viabilité cellulaire d'un système de culture de lymphocyte T en 2D vs un système de culture en 3D en présence de différente MOI d'un vecteur viral Sendaï.
[Figure 4] La figure 4 représente le schéma expérimental de l'exemple 2 portant sur la transduction de cellules souches pluripotentes induites humaines (hIPS). [Figure 5] La figure 5 est une représentation graphique d'une étude comparative de l'efficacité de transduction d'un système de culture de cellules souches pluripotentes induites humaines en 2D vs un système en 3D en fonction de la MOI de plusieurs agents de transductions différents.
[Figure 6] La figure 6 est une représentation graphique montrant l'efficacité de co-transduction de 1, 2 ou 3 vecteurs lentiviraux dans des lymphocytes T.
[Figure 7A] La figure 7A est une représentation graphique d'une étude comparative de l'efficacité de transduction dans des microcompartiments selon l'invention vs des microcompartiments hors invention.
[Figure 7B] La figure 7B est une représentation graphique d'une étude comparative de l'intensité de fluorescence de transgènes au sein de microcompartiments selon l'invention vs de microcompartiments hors invention après transduction.
[Figure 7C] La figure 7C est une représentation graphique d'une étude comparative de la viabilité cellulaire de microcompartiments selon l'invention vs de microcompartiments hors invention après transduction.
[Figure 7D] La figure 7D est une représentation graphique d'une étude comparative montrant le facteur d'amplification de microcompartiments selon l'invention vs de microcompartiments hors invention après transduction.
[Figure 8] La figure 8 est un schéma expérimental simplifié de l'exemple 5.
[Figure 9] La figure 9 est une représentation graphique d'une étude comparative montrant la capacité d'un agent de transduction à traverser la couche externe en hydrogel du microcompartiment selon l'invention de l'extérieur vers l'intérieur.
[Figure 10] La figure 10 est un schéma expérimental simplifié de l'exemple 6.
[Figure 11] La figure 11 est une représentation graphique d'une étude comparative montrant la capacité d'un agent de transduction à traverser la couche externe en hydrogel du microcompartiment selon l'invention de l'intérieur vers l'extérieur.
[Figure 12] La figure 12 est une représentation graphique d'une étude comparative de l'efficacité de transduction d'un vecteur Sendaï et d'un vecteur lenviral, notamment lors d'une co-transduc- tion.
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par « cellules différenciées » au sens de l'invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation. Par « cellules humaines » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l'invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Par « cellule mutante » au sens de l'invention, on entend une cellule porteuse d'au moins une mutation.
Par « cellule progénitrice » au sens de l'invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA4/5, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l'invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans le contexte de la présente invention. Il peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA4/5. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « conductance diffusive » au sens de l'invention, on entend la capacité d'un matériau à permettre la diffusion d'un objet en solutions. La conductance diffusive peut se mesurer expérimentalement à l'aide la formule suivante :
[Math 1] dn = —AC * \ objet * dt
Où dn est le nombre d'objets ayant traversés la longueur L en un temps dt ; AC est la différence de concentration entre deux points du matériau séparé d'une longueur L (supposée stable dans le temps dt) pobjet est la conductance diffusive du matériau à l'objet
[Math2]
Figure imgf000012_0001
Où D est le coefficient de diffusion effectif des objets dans le matériau
L est la longueur du matériau à travers laquelle les objets diffusent
JJdS est correspond à l'intégration sur toute la surface du matériau à travers laquelle les objets diffusent.
Dans le contexte de l'invention, la conductance diffusive de l'hydrogel de la partie externe peut se mesurer à l'aide de deux compartiments séparés par l'hydrogel de la couche externe dont on veut mesurer la conductance diffusive. Pour mesurer sa conductance diffusive, il suffit de placer dans le premier compartiment la solution contenant l'agent de transfection ou l'agent de transduction en question et dans l'autre compartiment, la solution sans l'agent. Il suffit alors de mesurer avec une méthode adaptée, telle que le comptage, la fluorescence ou le dosage, l'évolution de la quantité d'agent dans le compartiment en fonction du temps pour en déduire la conductance diffusive. A titre d'exemple, les deux compartiments peuvent par exemple être deux réservoirs séparés par une membrane constituée de l'hydrogel de la couche externe dont on veut mesurer la conductance diffusive.
Alternativement, la conductance diffusive de l'hydrogel de la couche externe à un agent peut être mesurée localement en utilisant la technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), pour des agents d'intérêts fluorescents. Cette technique consiste à irradier une zone d'un matériau avec un laser, permettant de photoblanchir les agents fluorescent dans la zone d'irradiation, et d'observer le retour à un niveau de fluorescence normal. Le temps de retour au niveau normal est directement lié au coefficient de diffusion ce qui permet ensuite de calculer une conductance diffusive.
Dans le contexte de l'invention, la conductance diffusive de l'hydrogel de la partie interne à un agent de transfection ou transduction est définie de la manière suivante :
[Math3] pintmin = Dint*n(R)2/r
Où D est le coefficient de diffusion, R est le rayon de la plus grande sphère inscrite dans la partie intérieure et r est le diamètre de la plus petite sphère circonscrite à la partie intérieure.
Par « couche de cellules » ou « assise de cellules » au sens de l'invention, on entend plusieurs cellules formant une couche ou une assise pouvant être structurée autour d'une lumière, il peut s'agir par exemple d'un tissu ou d'un micro-tissu cellulaire ou d'une culture groupée en trois dimensions. L'épaisseur de la couche de cellules pouvant être variable. Cette couche est organisée en trois dimensions dans le microcompartiment.
Par « densité de l'hydrogel de la couche externe » ou « densité de l'hydrogel de la partie interne » au sens de l'invention, on entend la masse de l'hydrogel dans son état hydraté divisée par son volume total, y compris l'eau absorbée.
Par « diamètre de Feret » au sens de l'invention, on entend la distance, notamment « d » ou « D », comprise entre deux tangentes, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « goutte » au sens de l'invention, on entend également une structure tridimensionnel formée à partir d'au moins une solution liquide comprenant les constituants d'un hydrogel non rigidifié (précurseurs de polymérisation, chaînes de polymères non ou partiellement réticulées), d'éléments précurseurs d'hydrogel. Aussi, la goutte constitue un état transitoire entre la co-injection des différents constituants et le microcompartiment selon l'invention.
Par « hydrogel d'origine végétale ou synthétique » on entend un hydrogel qui n'est pas d'origine animale et/ou issues de lignées cellulaires cancéreuses tel que le Matrigel®. Il peut s'agir par exemple et de façon non limitative d'alginate.
Par « la plus petite dimension » de X au sens de l'invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret de X.
Par « la plus grande dimension » de X au sens de l'invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret de X.
Par « lumière » ou « lumen » au sens de l'invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement, son contenu n'est pas en équilibre dif- fusif avec le volume de liquide convectif présent à l'extérieur du microcompartiment.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « MOI ou multiplicity of infection » au sens de l'invention, on entend le rapport entre le nombre de particules fonctionnelles de chaque agent de transduction et le nombre de cellules au sein du microcompartiment.
Par « pore » au sens de l'invention, on entend un sous-volume au sein du volume général d'hydrogel au sein duquel, monomères et/ou polymère de l'hydrogel ne présentent pas liaisons chimiques covalentes ou ioniques en continuité avec le réseau tridimensionnel du volume général de l'hydrogel. Par « résistance à la diffusion » au sens de l'invention on entend un paramètre caractérisant la difficulté qu'une substance rencontre pour se déplacer par mouvement brownien à travers un matériau ou un milieu. La diffusion est le processus par lequel les molécules se déplacent d'une région de haute concentration vers une région de basse concentration, souvent décrit par la loi de Fick. Dans le contexte de l'invention, la résistance à la diffusion peut être influencée par plusieurs facteurs :
* La porosité du réseau polymère : Un réseau plus dense offrira une plus grande résistance à la diffusion.
* La taille des pores : Des pores plus petits augmentent la résistance à la diffusion des molécules plus grandes.
* L'interaction entre les molécules diffusantes et le matériau : Les interactions chimiques ou physiques peuvent ralentir la diffusion.
La résistance à la diffusion peut se mesurer à l'aide de la formule suivante :
R=d/D-AR où : d est l'épaisseur du matériau,
D est le coefficient de diffusion de la substance à travers le matériau,
A est la surface à travers laquelle la diffusion se produit.
Cette relation montre que la résistance à la diffusion augmente avec l'épaisseur du matériau et diminue avec une augmentation du coefficient de diffusion et de la surface.
Par « tissu » ou « tissu biologique » au sens de l'invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c'est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l'organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d'un lignage cellulaire commun, bien qu'elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts), regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Microcompartiment selon l'invention
La présente invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ; - au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l'hydrogel constituant la couche externe.
Le microcompartiment selon l'invention est un microcompartiment en trois dimensions, délimité par la couche externe en hydrogel et à l'intérieur de ladite couche externe, une partie interne comprend une ou plusieurs cellules, un ou plusieurs agents de transduction et/ou transfection, et une ou plusieurs solutions aqueuses et/ou un ou plusieurs hydrogels.
Avantageusement, la couche externe délimite une partie interne et permet de contenir les éléments présents au sein de la partie interne, notamment les cellules et les agents de transfection et/ou transduction.
Préférentiellement, l'hydrogel de la partie interne est différent de l'hydrogel constituant la couche externe, en ce qu'il présente au moins une caractéristique différente, en particulier au moins une propriété chimique et/ou au moins une propriété physique différente.
Avantageusement, l'hydrogel de la partie interne, différent de celui de la couche externe, permet aux agents de transfection et/ou transduction de diffuser dans la partie interne et par conséquent améliore l'efficacité de transduction/transfection, notamment par rapport à des capsules ou microcompartiment constitué par un seul hydrogel.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la couche externe présente une densité et/ou une viscosité strictement supérieure à la densité et/ou la viscosité de la solution et/ou de l'hydrogel présent au sein de la partie interne.
Selon un autre mode de réalisation, l'hydrogel de la couche externe présente un poids moléculaire différent de l'hydrogel présent au sein de la partie interne. Préférentiellement, dans ce mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l'invention comprend dans sa partie interne au moins une cellule, au moins un agent de transfection et/ou transduction, au moins une solution et/ou au moins un hydrogel de poids moléculaire inférieur à l'hydrogel de la couche externe. Ainsi, dans ce mode de réalisation, le poids moléculaire de l'hydrogel de la couche externe est supérieur au poids moléculaire de l'hydrogel de la partie interne.
Avantageusement, l'hydrogel et/ou la solution de la partie interne permet aux cellules et aux agents de transfection et/ou transduction de diffuser au sein de la partie interne. Par ailleurs, la couche externe présente une résistance à la diffusion plus importante que la solution et/ou l'hydrogel de la partie interne ce qui permet d'améliorer la transfection et/ou transduction au sein du microcompartiment. Par ailleurs, la couche d'hydrogel externe permet également de protéger les cellules du milieu extérieur, de limiter la prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation en cas de différenciation. Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention est caractérisé par une conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention présente une conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure à 0,lmm3/h, préférentiellement inférieure à 0,05mm3/h, encore plus préférentiellement inférieure à 0,01mm3/h.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention présente une conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la partie interne à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection supérieure à 0,1 mm3/h, préférentiellement supérieure à lmm3/h, encore plus préférentiellement supérieure à 10 mm3/h, notamment supérieure à 50 mm3/h.
Selon un mode de réalisation préféré, le microcompartiment selon l'invention présente une conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure à 0,003mm3/h, notamment inférieur à 0,001mm3/h, préférentiellement inférieure à 0,0001mm3/h, encore plus préférentiellement inférieure à 0,00001mm3/h.
Selon un mode de réalisation préféré, le microcompartiment selon l'invention présente une conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la partie interne à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection supérieure à 0,003 mm3/h, préférentiellement supérieure à 0,01 mm3/h, encore plus préférentiellement supérieure à 0,1 mm3/h, notamment supérieure à 1 mm3/h.
Selon un autre mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention présente un ratio de la conductance diffusive de l'hydrogel de la partie interne sur la conductance diffusive de l'hydrogel de la couche externe par rapport à un agent de transfection et/ou transduction supérieur à 5, préférentiellement supérieur à 10, encore plus préférentiellement supérieur à 100, notamment supérieur à 1000.
Dans le contexte de l'invention, la conductance diffusive est préférentiellement mesurée à 25°C et à un pH de 7.
Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention par sa couche externe d'hydrogel permet à la fois de protéger les cellules des contraintes physiques lors de la mise en culture, et également de limiter la diffusion dans la capsule d'agents de transduction et/ou d'agents de transfection présents dans le milieu qui ne seraient pas encapsulés dans la partie interne.
De manière complémentaire, le microcompartiment selon l'invention permet, grâce à sa couche externe de maintenir les agents de transduction et/ou agents de transfection au sein de la partie interne. Cette barrière physique permet de rapprocher les agents de transductions et/ou agents de transfection des cellules en diminuant le volume disponible pour la diffusion desdits agent et donc d'augmenter l'efficacité de transduction et/ou transfection tout en réduisant la quantité d'agents de transfection et/ou transduction pour une efficacité similaire.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprend une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, dans lequel la porosité de la couche externe est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
Dans le contexte de l'invention, la taille des pores peut être mesurée par des techniques bien connues de l'Homme du métier, à savoir :
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ;
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
Préférentiellement la taille des pores de l'hydrogel de la couche externe et de l'hydrogel de la partie interne est mesurée par diffusion de neutron ou rayons X aux petits angles (SANS/SAXS) et par test de diffusion de polymères de masse moléculaire connue.
Préférentiellement l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d d'au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection présent dans la partie interne. Encore plus préférentiellement, l'hydrogel constituant la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de la majorité des agents de transduction et/ou des agents de transfection présents dans la partie interne. Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de tous les agents de transduction et/ou de tous les agents de transfection présents dans la partie interne. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'hydrogel constituant la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de l'agent de transduction ou de l'agent de transfection présentant la plus petite dimension d au sein de la partie interne.
Préférentiellement, l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 20nm, notamment inférieure à lOnm, encore plus préférentiellement inférieure à 5nm. Avantageusement, la taille des pores particulière de la couche externe en hydrogel permet de maintenir les cellules et les agents de transduction et/ou agents de transfection dans la partie interne.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence d'au moins un chemin de diffusion continu entre la face externe et la face interne de la couche externe d'hydrogel pour lequel la plus petite dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 10 nm. En d'autres termes, l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par l'absence de chemin de diffusion continu entre la face externe et la face interne de la couche externe d'hydrogel pour lequel la plus petite dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 10 nm.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d d'au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection présent dans la partie interne. Préférentiellement l'hydrogel constituant la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de la majorité des agents de transduction et/ou des agents de transfection présents dans la partie interne. Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de tous les agents de transduction et/ou de tous les agents de transfection présents dans la partie interne.
De façon préférée, l'hydrogel de la partie interne du microcompartiment comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de l'agent de transduction et/ou l'agent de transfection présentant la plus petite dimension d au sein de la partie interne.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la plus petite dimension des pores de l'hydrogel de la partie interne est supérieure à lOnm, préférentiellement supérieure à 25nm, encore plus préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
De façon préférée, le microcompartiment selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins un chemin de diffusion continu au sein de l'hydrogel de la partie interne entre une cellule et un agent de transfection et/ou transduction pour lequel la plus petite dimension est supérieure à lOnm, préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
Selon un mode de réalisation préféré, le microcompartiment selon l'invention comprend au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, dans lequel l'hydrogel de la partie interne est caractérisé par la présence de pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus grande dimension D dudit agent de transduction et/ou agent de transfection présents dans la partie interne, et en ce que l'hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à celle de la dimension D de sorte que l'agent de transduction ne puisse diffuser à travers cette couche externe.
De façon préférée, l'hydrogel de la partie interne du microcompartiment comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus grande dimension D de l'agent de transduction et/ou l'agent de transfection présentant la plus grande dimension D au sein de la partie interne.
Selon un mode de réalisation particulier, le microcompartiment selon l'invention comprend une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un hydrogel, dans lequel le module de Young de l'hydrogel de la partie interne est strictement inférieur au module de Young de l'hydrogel de la couche externe. Grâce à ce module de Young de l'hydrogel de la partie interne, la couche externe sera plus rigide, que l'hydrogel de la partie interne dont l'hydrogel est plus lâche, plus desserré, notamment dû à la présence de chaîne plus courte, facilitant la croissance des cellules et le déplacement des agents de transduction et/ou transfection.
Selon un objet de l'invention, les avantages cités précédemment peuvent être améliorés lorsque le module de Young de l'hydrogel de la partie interne est compris entre 0,01 et 200kPa, plus préférentiellement entre 0,1 et 60kPa, encore plus préférentiellement compris entre 0,1 et 5kPa. Préférentiellement, le module de Young de l'hydrogel de la couche externe est supérieur à lOkPa, plus préférentiellement supérieur à 60kPa, encore plus préférentiellement supérieur à lOOkPa.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne est enchevêtré avec l'hydrogel de la couche externe, notamment sur la face interne de la couche externe. Aussi, la délimitation entre les deux hydrogels malgré un module de Young différent peut ne pas être parfaitement nette. Par conséquent, au moins une partie de l'hydrogel de la couche ou du maillage de la partie interne peut être enchevêtrée avec la face interne de la couche externe.
L'hydrogel de la partie interne avec un faible module de Young présente alors des propriétés vis- coélastiques et viscoplastiques particulièrement avantageuses pour obtenir un substitut de matrice extracellulaire, dans laquelle les cellules vont pouvoir se loger, croître, se déplacer et être transfectées et/ou transduites de manière satisfaisante.
Avantageusement, un hydrogel, par exemple un hydrogel d'alginate, avec un faible module de Young, présente des propriétés de relaxation plus rapide, également connu sur le terme "fast- relaxing", ce qui permet aux cellules de se déplacer, de changer de forme, de s'étendre, de proliférer et de remodeler de façon mécanique la matrice à base de l'hydrogel et également de permettre la diffusion des agents de transfection et/ou transduction rendant le microcompartiment selon l'invention particulièrement adapté à une transfection et/ou transduction in capsulo. Préférentiellement, le ou les hydrogel(s) utilisé(s) dans les microcompartiments selon l'invention sont biocompatibles, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas toxiques pour les cellules. Ils doivent permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie.
L'hydrogel de la couche externe et/ou de la partie interne peut comprendre ou être constitué d'al- ginate.
L'hydrogel d'alginate est rhéofluidifiant, c'est-à-dire que sa viscosité diminue quand la vitesse de cisaillement augmente, ceci est particulièrement avantageux lors du passage dans un injecteur micro fluidique pour former les microcompartiments selon l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'algi- nate. Elle peut être constituée exclusivement d'alginate.
L'alginate constituant la couche externe peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de p-D-mannuronate, ayant un module de Young supérieur à lOkPa, préférentiellement supérieur à 60 kPa, plus préférentiellement supérieur à 100 kPa.
Selon un mode de réalisation, l'alginate de la couche externe présente un poids moléculaire moyen de 100 à 400 kDa, plus préférentiellement compris entre 150 et 250kDa. Lorsque l'hydrogel de la couche externe est de l'alginate, la concentration de la solution d'alginate utilisée pour former ladite couche externe du microcompartiment, est préférentiellement comprise entre 0,5 et 5% en masse, plus préférentiellement la concentration est égale à 2% (plus ou moins 0,5%) en masse.
Lorsque la concentration de la solution d'alginate destinée à former la couche externe du microcompartiment est égale à 2%, la viscosité de l'alginate formant la couche externe est préférentiellement comprise entre 100 et 200mPa/s.
Préférentiellement, la couche externe en hydrogel est dépourvue de cellules.
L'hydrogel de la partie interne peut se présenter sous forme de couche ou de maillage. Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne est juxtaposé au moins partiellement à la face interne de la couche externe.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention comprend dans sa partie interne :
- une couche de solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une couche de solution aqueuse ; et/ou un hydrogel.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention comprend dans sa partie interne :
- au moins une couche de solution aqueuse ; et/ou - au moins une couche et/ou un maillage en hydrogel.
Préférentiellement, le ou les hydrogels utilisés dans la partie interne des microcompartiments selon l'invention sont biocompatibles, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas toxiques pour les cellules. Ils doivent permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Ces hydrogels peuvent être choisis parmi tous les hydrogels biocompatibles présentant les caractéristiques de l'invention. Il peut s'agir par exemple d'alginate, de fibrine, de laminine, de fibronectine, d'entactine, d'acide hyaluronique et/ou de collagène. Il peut s'agir également d'une matrice extracellulaire ou d'un substitut de matrice extracellulaire tel que le Matrigel®.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne comprend de l'alginate ou est un alginate mais différent de l'alginate de la couche externe si la couche externe est en alginate. Cette différence peut être caractérisée notamment par une différence de conductance diffusive, de viscosité, de densité, de poids moléculaire, de module d'Young et/ou de tailles de pores. Selon une variante, la partie interne comprend une couche et/ou un maillage d'hydrogel comprenant au moins de l'alginate. La couche et/ou maillage peut être constitué exclusivement ou partiellement d'alginate. L'alginate présent dans la partie interne peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de p-D-mannuronate. L'aginate de la partie interne peut être un alginate comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d d'au moins un agent de transfection et/ou transduction, et/ou un module de Young compris entre 0,01kPa et 200kPa, préférentiellement entre 0,lkPa et 60 kPa, plus préférentiellement entre 0,lkPa et 5 kPa.
Préférentiellement, l'alginate présent dans la partie interne présente un poids moléculaire moyen d'au plus 75kDa. Lorsque l'hydrogel de la partie interne est de l'alginate, la concentration de la solution d'alginate destinée à former la partie interne du microcompartiment, est préférentiellement comprise entre 0,25 et 2%, plus préférentiellement entre 0,25 et 1%, encore plus préférentiellement 0,5% (pourcentage en masse). Lorsque la concentration de la solution d'alginate destinée à former la partie interne du microcompartiment est de 0,5%, la viscosité de l'alginate est préférentiellement de 3mPa/s.
Avantageusement, bien que les cellules mammaliennes soient incapables d'interagir avec l'algi- nate, notamment, car celui-ci permet une adsorption minimale des protéines, l'alginate est bien caractérisé, facile à stériliser et à stocker, il peut éventuellement être modifié chimiquement, et offre des propriétés mécaniques intéressantes. Aussi, l'alginate permet d'obtenir une bonne croissance, peu de mort cellulaire, une bonne amplification et une bonne proportion de cellules transfectées et/ou transduites.
Selon un mode de réalisation, l'hydrogel de la partie interne comprend de la fibrine ou est de la fibrine, la fibrine est préférentiellement obtenue à partir de la polymérisation du fibrinogène par un agent de polymérisation du fibrinogène, tel que la thrombine. Cet agent de polymérisation peut être ajouté pendant l'encapsulation et/ou après l'encapsulation. Aussi, la polymérisation de la solution de fibrinogène par la solution de thrombine a lieu au cours de l'encapsulation et/ou après celle-ci. Lorsqu'elle a lieu après l'encapsulation, la polymérisation a lieu au sein de la goutte ou de la capsule nouvellement formée, c'est-à-dire après la rigidification de la couche externe.
L'hydrogel de la partie interne, peut comprendre d'autres constituants comme par exemple au moins une séquence peptidique, plus préférentiellement une séquence peptidique d'intérêt apte à interagir avec les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention. A titre d'exemple la séquence peptidique peut être un peptide, ou une protéine. La séquence peptidique peut-être par exemple un motif YIGSR et/ou un motif RGD. Le motif YIGSR est un peptide issu de la chaîne pi de la laminine de séquence Tyrosine-lsoleucine-Glycine-Serine-Arginine facilitant l'adhésion cellulaire à la matrice. Le motif RGD est un peptide de séquence Arginine-Glycine-Aspara- gine facilitant également l'adhésion cellulaire à la matrice.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la partie interne comprend au moins deux hydrogels différents, chacune étant différent de l'hydrogel de la couche externe. Ces au moins deux hydrogels présents dans la partie interne sont préférentiellement choisis parmi l'alginate, la fibrine, la laminine, la fibronectine, l'entactine, l'acide hyaluronique, et le collagène.
Lorsque la partie interne comprend au moins deux hydrogels, le deuxième hydrogel peut se présenter sous forme de particules.
Avantageusement, cette forme du deuxième hydrogel n'empêche pas la diffusion des agents de transfection et/ou transduction au sein de la partie interne tout en apportant un effet bénéfique sur les cellules, préférentiellement en améliorant la survie cellulaire.
Lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci ne limite pas la diffusion de particules solubles, notamment des agents de transfection et/ou des agents de transduction en fonction de leur taille au travers de ladite solution, en particulier les particules solubles dont la taille serait supérieure à 10 nm, préférentiellement à 25nm.
Selon un autre mode de réalisation, lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci présente une viscosité comprise entre 0,1 et 10mPa/s.
Préférentiellement, lorsque la partie interne comprend une solution aqueuse et un hydrogel, la partie interne présente une viscosité comprise entre 0,1 et 50mPa/s.
Préférentiellement, la viscosité de la partie interne est comprise entre 0,1 et 50mPa/s.
Avantageusement, la viscosité particulière de la solution aqueuse et/ou de l'hydrogel facilite la rencontre des agents de transfection et ou agents de transduction et des cellules aux seins de la partie interne du microcompartiment et par conséquent d'augmenter la proportion de cellules transduites/transfectées par rapport aux cultures en 2D ou aux cultures en 3D décrites dans l'art antérieur. Dans le contexte de l'invention, la viscosité de la solution aqueuse et/ou de l'hydrogel peut être mesurée à l'aide d'un viscosimètre à 20°C.
Avantageusement, l'hydrogel et/ou la solution aqueuse de la partie interne permettent de favoriser la rencontre avec les cellules et par conséquent améliorer l'efficacité de transduction/trans- fection.
De façon préférée, lorsque la partie interne comprend une solution aqueuse, celle-ci est préférentiellement un milieu de culture adapté aux cellules du microcompartiment. Typiquement, le milieu de culture est choisi parmi les milieux de culture usuellement compatibles avec la culture des cellules présentent au sein du microcompartiment, par exemple parmi les milieux de culture utilisés en culture à deux dimensions ou en culture en sphéroïde.
En plus de l'hydrogel et/ou de la solution aqueuse, la partie interne du microcompartiment comprend au moins un agent de transduction et/ou un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l'invention comprend :
- une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l'hydrogel constituant la couche externe dans lequel ledit au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection maintient le type cellulaire des cellules présentes au sein de la partie interne.
En d'autres termes, selon ce mode de réalisation, ledit au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transfection ne modifie pas le type cellulaire des cellules présentes au sein de la partie interne du microcompartiment.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection dans la solution aqueuse et/ou dans l'hydrogel de la partie interne.
Lorsque le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un agent de transduction, ledit agent peut être choisi parmi une particule virale, une pseudo-particule virale ou leur combinaison.
Préférentiellement, l'agent de transduction est choisi parmi un adénovirus, un virus adéno-associé, un retrovirus, un lentivirus, un Sendaï virus, un baculovirus et leurs combinaisons. Préférentiellement, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI (« multiplicity of infection ») dudit microcompartiment est compris entre 0,01 et 100, notamment entre 0,01 et 50, encore plus préférentiellement entre 0,01 et 10.
Selon un mode de réalisation, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI (« multiplicity of infection ») dudit microcompartiment est compris entre 0,01 et 5.
Selon un autre mode de réalisation, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI (« multiplicity of infection ») dudit microcompartiment est compris entre 5 et 100, notamment entre 5 et 50, préférentiellement entre 5 et 25, plus préférentiellement entre 5 et 15.
Selon une variante, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI dudit microcompartiment est inférieure à 10.
Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention, par sa conformation particulière, permet de favoriser la rencontre entre les agents de transduction et les cellules. Par conséquent, la MOI nécessaire pour obtenir une transduction satisfaisante est inférieur à ceux des systèmes en deux dimensions ou des systèmes en trois dimensions ne présentant pas les caractéristiques du microcompartiment selon l'invention.
Le microcompartiment selon l'invention permet ainsi de diminuer la MOI nécessaire pour obtenir une transduction satisfaisante, réduisant ainsi les coûts associés à la transduction.
Lorsque le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un agent de transfection, ledit agent peut être choisi parmi une vésicule extracellulaire d'origine endosomale tel qu'un exosome, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
Selon un mode de réalisation particulier, le microcompartiment comprend au moins un agent de transfection, ledit agent est un dérivé de la membrane plasmique comprenant des protéines d'origines virales
Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention est adapté à tous types d'agents de transduction et de transfection susceptibles de modifier le génome, le transcriptome ou le protéome d'une cellule eucaryote, préférentiellement capable de comprendre et/ou d'exprimer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle. Par ailleurs, le microcompartiment selon l'invention nécessite une concentration en agent de transduction et/ou transfection plus faible que les solutions proposées par l'art antérieur tout en obtenant une efficacité de transfec- tion/transduction similaire. Selon un mode de réalisation, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transfection le ratio quantité d'ADN ou quantité d'ARN / cellule est inférieur à 10, préférentiellement inférieur à 5, encore plus préférentiellement inférieur à 2.
Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention, par sa conformation particulière, permet de favoriser la rencontre entre les agents de transfection et les cellules. Par conséquent, le ratio quantité d'ADN ou quantité d'ARN / cellule nécessaire pour obtenir une transfection satisfaisante est inférieur à ceux des systèmes en deux dimensions ou des systèmes en trois dimensions ne présentant pas les caractéristiques du microcompartiment selon l'invention.
Le microcompartiment selon l'invention permet ainsi de diminuer la quantité d'ADN ou d'ARN nécessaire pour obtenir une transfection satisfaisante, réduisant ainsi les coûts associés à la transfection.
Selon un mode de réalisation, la plus petite dimension d d'au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction présent dans la partie interne du microcompartiment est supérieure à lOnm, préférentiellement comprise entre 15 et 25nm. Selon une variante, la majorité des agents de transfection et/ou des agents de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment, préférentiellement tous, présentent une plus petite dimension d inférieure à 25nm, préférentiellement comprise entre 15 et 25nm
Selon un autre mode de réalisation, la plus grande dimension D d'au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction présent dans la partie interne du microcompartiment est supérieure à 25nm, préférentiellement supérieure à lOOnm, notamment supérieure à 500nm, encore plus préférentiellement supérieure à lpm. Selon une variante, la majorité des agents de transfection et/ou des agents de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment, préférentiellement tous, présentent une plus grande dimension D supérieure à 50nm, notamment supérieure à lOOnm, encore plus préférentiellement comprise entre 300 et 500nm.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection dans la solution aqueuse et/ou l'hydrogel de la partie interne.
Avantageusement, ledit agent de transduction et/ou agent de transfection peut diffuser dans la solution aqueuse et/ou dans l'hydrogel de la partie interne de façon à augmenter ses chances de rencontrer une cellule et d'y insérer au moins une molécule d'intérêt.
De façon préférée, le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction comprenant au moins une molécule d'intérêt choisie parmi un acide nucléique, un acide ribonucléique, une protéine, un peptide et leurs combinaisons. Avantageusement, l'agent de transfection et/ou transduction permet de modifier le comportement des cellules présentes dans la partie interne en y insérant au moins une molécule d'intérêt.
En plus de l'hydrogel et/ou de la solution aqueuse et d'au moins un agent de transfection et/ou d'au moins un agent de transduction, la partie interne du microcompartiment comprend au moins une cellule.
Dans le contexte de l'invention, les cellules présentes dans le microcompartiment peuvent être tout type de cellules, en particulier les cellules sont des cellules eucaryotes. Plus préférentiellement, les cellules sont des cellules humaines ou végétales ou animales.
De façon préférée, les cellules présentes dans la partie interne sont choisies parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
Selon une variante, les cellules présentes dans la partie interne sont choisies parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation et leurs mélanges.
Selon une autre variante, le microcompartiment selon l'invention ne comprend pas de cellule différenciée.
Dans un mode de réalisation particulier, le microcompartiment comprend des cellules souches pluripotentes. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s'entend d'une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes peuvent être en particulier des cellules souches pluripotentes induites (iPS), des cellules MUSE (« Multi- lineage-differentiating Stress Enduring ») que l'on trouve dans la peau et la moelle osseuse des mammifères adultes, ou des cellules souches embryonnaires (ES). Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention ne comprend pas de cellules souche embryonnaires (ES).
Selon une variante particulièrement adaptée de l'invention, le microcompartiment selon l'invention comprend des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention comprend :
- une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule choisie parmi une cellule souche pluripotente induite humaine ou animale ou un lymphocyte, notamment un lymphocytes T CD3+ ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l'hydrogel constituant la couche externe. Dans un autre mode de réalisation particulier, le microcompartiment selon l'invention comprend des cellules multipotentes humaines ou animales et/ou des cellules progénitrices humaines ou animales issues de ces cellules multipotentes et/ou des cellules en cours de différenciation. Les cellules multipotentes et/ou progénitrices ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes humaines, ou éventuellement à partir de cellules humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié artificiellement pour rejoindre celui de cellules multipotentes et/ou de progéniteurs particuliers, typiquement par expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype cellulaire cible. Préférentiellement, les cellules multipotentes et/ou progénitrices ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes après mise en contact avec une solution capable d'initier la différenciation desdites cellules souches. Selon une autre variante, le microcompartiment selon l'invention comprend des cellules différenciées humaines ou animales. Les cellules différenciées ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes ou de cellules progénitrices, en particulier de cellules souches pluripotentes humaines ou de cellules progénitrices humaines, ou éventuellement à partir de cellules humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié artificiellement pour rejoindre celui de cellules différenciées particulières, typiquement par expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype cellulaire cible. Préférentiellement, les cellules différenciées ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes ou multipotentes ou progénitrices après mise en contact avec une solution capable d'initier la différenciation desdites cellules souches. Selon une variante, le contenu cellulaire du microcompartiment comprend des identités cellulaires homogènes ou mixtes.
Les cellules différenciées peuvent en particulier se présenter sous forme d'au moins une couche de cellules ou sous forme d'un tissu, d'un agrégat cellulaire ou d'un micro-tissu en trois dimensions ou sous forme de plusieurs tissus ou micro-tissus dans le microcompartiment. Il peut s'agir d'un tissu ou micro-tissu compacté ou non, avec ou sans lumière.
Le microcompartiment selon l'invention peut donc comprendre plusieurs types de cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention présente dans sa partie interne au moins deux types cellulaires différents. En particulier, le microcompartiment selon l'invention peut comprendre par exemple des cellules souches induites à la pluripotence et/ou des cellules multipotentes et/ou des cellules progénitrices et/ou en cours de différenciation et/ou des cellules différenciées.
Lorsque le microcompartiment selon l'invention comprend au moins une couche de cellules ou assise de cellules, la solution aqueuse et/ou l'hydrogel sont préférentiellement agencés entre la couche externe en hydrogel et ladite couche ou assise de cellules. Etant entendu que le microcompartiment peut également comprendre dans sa partie interne des cellules en suspension dans la solution aqueuse ou l'hydrogel de la partie interne. Lorsque le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un agrégat et/ou un tissu et/ou un microtissu cellulaire, la solution aqueuse et/ou l'hydrogel sont préférentiellement agencés entre la couche externe en hydrogel et ledit agrégat et/ou tissu et/ou microtissu de cellules. Etant entendu que le microcompartiment peut également comprendre dans sa partie interne des cellules en suspension dans la solution aqueuse ou l'hydrogel de la partie interne.
Selon un autre objet préféré de l'invention, l'agrégat et/ou la couche de cellules et/ou l'assise de cellules et/ou le tissu et/ou le microtissu comprend au moins une lumière ou un lumen. Ladite lumière peut contenir un liquide, notamment du milieu de culture et/ou un liquide sécrété par les cellules.
Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux cellules de disposer d'un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la composition, favorisant une communication cellulaire.
Selon un mode de réalisation, la couche de cellules et la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne sont organisées autour d'au moins une lumière, plus préférentiellement elles sont organisées successivement autour d'au moins une lumière.
Selon un mode de réalisation, la couche de cellules et la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne sont organisées successivement autour d'une lumière. On parle d'une conformation en forme de cyste.
Selon un mode de réalisation dans lequel le microcompartiment ne comprend qu'un seul cyste, la couche de cellules, la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne, et la couche externe sont organisées successivement autour d'une lumière.
Cette conformation sous forme de cyste(s) permet de réduire les pressions subies par les cellules. Cette configuration permet également de diminuer la mortalité cellulaire et d'augmenter le facteur d'amplification de la culture. Par conséquence cela permet de réduire le nombre de passages et dissociation nécessaire ; de réduire le temps en culture nécessaire pour atteindre le nombre de cellules final nécessaire.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment peut comprendre un ou plusieurs cystes, et/ou un ou plusieurs tissus et/ou micro tissus et/ou agrégats de cellules avec ou sans lumière(s).
Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention est adapté à la transduction et/ou transfection de tout type de cellule eucaryote.
Un tel microcompartiment est ainsi particulièrement adapté pour réaliser une modification génétique et/ou transcriptomique et/ou protéique de cellules d'intérêts, préférentiellement afin que lesdites cellules puissent comprendre et/ou exprimer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Selon un objet particulier de l'invention, le microcompartiment selon l'invention est obtenu après plusieurs cycles de division cellulaire. En effet, les cellules comprises dans le microcompartiment selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par amplification, à partir d'au moins une cellule.
En particulier, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention peuvent être obtenues après au moins deux cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel d'au moins une cellule.
De façon préférée, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28 ou 30 cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel d'au moins 1 cellule, préférentiellement entre 1 et 5, entre 1 et 10, entre 1 et 15, entre 1 et 20, entre 1 et 30, entre 1 et 40, entre 1 et 50, entre 1 et 60, entre 1 et 100 cellules. Par exemple, les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues après au moins six cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel d'au moins 1 cellule, préférentiellement entre 1 et 50 cellules.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages après l'encapsulation, plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple au moins 1 jour, ou entre 2 et 50 jours, notamment entre 3 et 10 jours.
Préférentiellement la totalité des cellules encapsulées initialement dans le microcompartiment avant le premier cycle de division cellulaire représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Ainsi, selon l'un mode de réalisation, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire, après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel de cellule(s) représentant un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Préférentiellement, dans le microcompartiment selon l'invention, les cellules représentent plus de 50% en volume par rapport au volume du microcompartiment, encore plus préférentiellement plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% en volume par rapport au volume du microcompartiment.
Le microcompartiment selon l'invention comprend plusieurs cellules, préférentiellement au moins 20 cellules, encore plus préférentiellement au moins 100, au moins 500, au moins 1000, au moins 10000. Le microcompartiment selon l'invention peut être obtenu par encapsulation réalisée au moyen d'une co-injection réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange des différentes solutions utiles, ledit jet se fractionnant en gouttes. Les gouttes sont alors collectées dans un bain, notamment un bain de calcium, apte à rigidifier la solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
Selon une variante permettant la formation d'un tube, la co-injection est également réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant le tube dans la solution de calcium.
Le microcompartiment cellulaire selon l'invention est préférentiellement, clos ou partiellement clos, c'est à dire que la couche externe est close ou partiellement close. Plus préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l'invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c'est-à-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de l'espace. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules. Préférentiellement le microcompartiment selon l'invention se présente sous une forme sphérique ou allongée. Il peut avoir la forme d'un ovoïde, d'un cylindre, d'un sphéroïde ou d'une sphère. Il peut en particulier se présenter sous la forme d'un sphéroïde creux, d'un ovoïde creux, d'un cylindre creux ou d'une sphère creuse.
C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la couche d'hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l'invention. Préférentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon l'invention est comprise entre 10 pm et 1 mm, préférentiellement entre 100 pm et 700 pm. Elle peut être comprise entre 200 pm et 600 pm, notamment entre 300pm et 500 pm.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10pm, plus préférentiellement comprise entre 10pm et lm, encore plus préférentiellement entre 10pm et 50cm.
Le microcompartiment selon l'invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être décongelé avant son utilisation.
L'invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble. Aussi, l'invention vise aussi un ensemble ou une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment comprenant au moins un microcompartiment cellulaire selon l'invention.
L'invention vise aussi un ensemble ou une série de microcompartiments d'au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, dans lequel au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'invention, préférentiellement la majorité des microcompartiments de l'ensemble sont des microcompartiments selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier la totalité des microcompartiments de l'ensemble sont des microcompartiments selon l'invention.
L'ensemble de microcompartiments selon l'invention comprend préférentiellement entre 2 et 1016 microcompartiments, préférentiellement entre 1000 et 109 microcompartiments selon l'invention.
De façon préférée la série de microcompartiments selon l'invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention a pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur.
La présence d'une couche externe d'hydrogel et de la solution aqueuse et/ou l'hydrogel de la partie interne, permettent une distribution uniforme des cellules entre les microcompartiments. Par ailleurs la couche externe d'hydrogel permet d'éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de variabilité défavorable pour l'homogénéité phénotypique des cellules.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l'invention est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l'étape (a) ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l'étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Ainsi, le microcompartiment selon l'un des quelconques modes de réalisation précédemment décrits ou l'ensemble de microcompartiment selon l'un des quelconques modes de réalisation précédemment décrits, est également particulièrement adapté pour être utilisé en culture cellulaire, en particulier en culture cellulaire en trois dimensions. Ceux-ci permettant la production de cellules d'intérêt en grande quantité, notamment des cellules, micro-tissu ou organoïde exprimant au moins une séquence peptidique, une séquence ARN codante ou non codante, ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, susceptible d'être utilisé, par exemple dans le cadre de thérapie cellulaire. Aussi, l'invention se rapporte également à un microcompartiment selon l'invention ou un ensemble de microcompartiment selon l'invention, pour son utilisation comme médicament.
Ainsi, le microcompartiment est particulièrement adapté à une utilisation en clinique.
Selon un autre objet, l'invention se rapporte à l'utilisation du microcompartiment selon l'un des quelconques précédents objets, pour insérer au moins une séquence peptidique, une séquence ARN codante ou non codante, ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle dans au moins une cellule eucaryote.
L'invention se rapporte également à l'utilisation du microcompartiment selon l'invention pour la mise en œuvre de procédé(s) de transfection et/ou de transduction.
Selon un autre objet, l'invention se rapporte à l'utilisation du microcompartiment selon l'un des quelconques précédents objets, pour la production, préférentiellement à grande échelle, de cellules, micro tissus ou tissus exprimant au moins un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Procédé de préparation
Le microcompartiment peut être obtenu par différents moyens connus de l'Homme du métier pour préparer des microcompartiments ou capsules.
L'invention a également pour objet un procédé particulier de préparation de microcompartiments.
Selon un mode de réalisation, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un microcompartiment comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, ladite solution et/ou ledit hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel, ledit hydrogel étant différent de l'éventuel hydrogel de l'étape (b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation selon l'invention comprend également une étape (d) consistant à cultiver les microcompartiment obtenus à l'étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours.
Selon un autre mode de réalisation, l'étape (c) consiste à encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel, ledit hydrogel présentant une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'invention comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection.
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l'étape (a).
Selon un mode de réalisation, la solution de l'étape (a) est réalisée dans au moins une solution aqueuse, préférentiellement un milieu de culture adapté. Ledit milieu de culture comprend préférentiellement au moins un facteur cytoprotecteur, plus préférentiellement au moins un inhibiteur de l'apoptose.
L'inhibiteur de l'apoptose peut par exemple être un ou plusieurs inhibiteur(s) des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), ou tout autre inhibiteur de l'apoptose connu de l'homme du métier. L'inhibiteur de l'apoptose doit permettre de promouvoir la survie des cellules au moment de la formation de la couche externe d'hydrogel.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique, préalablement ou simultanément mise en œuvre à l'étape d'incubation des cellules, elle-même effectuée préalablement à l'étape a) de mélange. Cette étape est particulièrement importante dans le cas de cellules adhérentes.
Les cellules encapsulées sont en suspension sous forme de cellules uniques et/ou d'amas de cellules. De façon préférée, les cellules uniques représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées, plus préférentiellement les cellules uniques sont des cellules hPSC. En effet il est préférable d'encapsuler des amas de cellules car cela diminue l'apoptose.
De façon préférée, la densité cellulaire de la solution de l'étape (a) est comprise entre 0,1 et 40 millions de cellules par mL, préférentiellement entre 0,8 et 20 millions.
La solution de l'étape (a) comprend préférentiellement au moins une cellule choisie parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, la solution de l'étape (a) comprend au moins 2 types cellulaires différents. De façon préférée, l'agent de transduction est choisi parmi un adénovirus, un virus adéno-associé, un retrovirus, un lentivirus, un Sendaï virus, un baculovirus et leurs combinaisons.
Selon un autre mode de réalisation, la solution de l'étape (b) comprend au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, ledit agent peut être choisi parmi une vésicule extracellulaire d'origine endosomale tel que qu'un exosome, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'étape (c) d'encapsulation comprend les sous étapes suivantes :
- mettre en contact la solution de l'étape (a), la solution de l'étape (b) et une solution d'hydrogel destinée à former la couche externe pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
Une fois la couche externe en hydrogel rigidifiée par le bain de calcium, le microcompartiment est formé. Celui-ci peut alors être rincé. Avantageusement, si le module de Young de l'hydrogel dans la partie interne est inférieur à celui de l'hydrogel de la couche externe, cela permet d'éviter/de limiter la rigidification de l'hydrogel dans la partie interne par le bain de calcium. En particulier, étant donné, le module de Young de l'hydrogel dans la partie interne strictement inférieur à celui de l'hydrogel de la couche externe, le processus de rigidification par le bain de calcium ne permet pas de rigidifier l'hydrogel dans la partie interne pendant la durée d'utilisation des capsules et donc de faciliter la multiplication cellulaire.
Préférentiellement, l'étape (c) est réalisée par une co-injection simultanée de la solution d'hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l'étape (a) et de la solution de l'étape (b); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou mil- lifluidique formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
Selon un objet de l'invention, le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 pm, préférentiellement entre 80 et 240 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 0,1 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 10 et 2000 mL/h, plus préférentiellement entre 11 et 100 mL/h.
Selon un variante, l'étape (c) est réalisée par une co-injection simultanée de la solution d'hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l'étape (a) et de la solution de l'étape (b); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou milli- fluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube. Lorsque la pointe de l'injecteur est en contact avec la solution de calcium, le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est préférentiellement compris entre 50 et 1000 pm, plus préférentiellement entre 80 et 300 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
Selon une autre variante de l'invention, la partie interne comprenant au moins un hydrogel comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection comprend également au moins un deuxième hydrogel distinct du premier hydrogel constituant la couche ou le maillage de la partie interne.
Lorsque au moins un hydrogel de la partie interne est la fibrine, elle est préférentiellement obtenue à partir de la polymérisation du fibrinogène par un agent de polymérisation du fibrinogène, avantageusement ledit agent est la thrombine, ledit agent peut être ajouté pendant l'encapsulation et/ou après l'encapsulation.
Aussi, selon une variante la solution de thrombine est co-injectée avec les autres solutions, celle- ci est préférentiellement mélangée avec la solution intermédiaire isotonique et la solution de fibrinogène est mélangée avec la solution de l'étape (b).
Préférentiellement, la concentration du fibrinogène est comprise entre 10 et 25 mg/mL, préférentiellement 14-20 mg/mL, plus préférentiellement 20 mg/mL.
Selon un autre objet de l'invention, la concentration de la thrombine est préférentiellement comprise entre 0.001U/mL et 2U/ml, plus préférentiellement entre 0.01U/mL et lU/ml, entre 0.01U/mL et 0,05U/ml, encore plus préférentiellement 0,04U/ml. Par « U » on entend une unité d'activité enzymatique (soit la concentration pour une enzyme) qui représente la quantité d'enzyme nécessaire pour traiter une micromole de substrat en 1 minute. Etant entendu que la concentration indiquée est celle dans le mélange. En effet, avantageusement la thrombine est mélangée avec les autres constituants selon un ratio 1 :1. Aussi, au sein de la capsule, lorsque que la concentration de la thrombine, avant le mélange, est de 0.01U/ml, la concentration dans la capsule est de l'ordre de O.OlU/ml.
Les étapes postérieures à l'encapsulation peuvent être mises en œuvre en l'absence d'agitation ou sous agitation. Préférentiellement, les étapes postérieures à l'encapsulation sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l'homogénéité de l'environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, elle permet un contrôle homogène de niveau d'oxygénation cellulaire ; évitant ainsi les phénomènes de nécrose lié à l'hypoxie, ou de stress oxydatif lié à l'hyperoxie. Par conséquent, elle évite une augmentation de la mortalité cellulaire et/ou du stress oxydatif.
Préférentiellement, après l'étape de culture des capsules obtenues, le procédé comprend une étape qui consiste à rincer les capsules issues de l'étape (d), avantageusement de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur, tel que l'inhibiteur de l'apoptose. Lorsque, le procédé selon l'invention, comprend une étape de rinçage des capsules obtenues, la solution constituant le bain de calcium est éliminée et remplacée par un milieu adapté pour la culture des microcompartiments selon l'invention, préférentiellement une solution isotonique, plus préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l'apoptose. L'étape de rinçage des capsules obtenues est réalisée après l'étape (d).
Dans une variante préférée, le procédé selon l'invention comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l'étape (d), préférentiellement après l'étape de rinçage si une telle étape est présente après l'étape (d). Par « au moins une ré-encapsulation des cellules », on entend au moins deux cycles d'encapsulations. Préférentiellement chaque cycle d'encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l'étape (d) le nombre de divisions cellulaires de l'ensemble du procédé (pour l'ensemble des passages) est d'au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire.
Dans un procédé selon l'invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulation, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation.
Chaque ré-encapsulation peut comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d'amas de cellules ; l'élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d'hydrogel.
La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue depuis l'étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation.
Selon un mode de réalisation particulier la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes :
- éliminer la couche externe en hydrogel,
- remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l'apoptose,
- encapsuler la suspension de cellules dans une couche d'hydrogel ;
- préférentiellement, cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l'apoptose, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l'apoptose ; - préférentiellement, rincer les microcompartiments, avantageusement, de manière à éliminer l'inhibiteur de l'apoptose ;
- cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
L'invention a également pour objet un procédé de transduction mis en œuvre dans au moins un microcompartiment cellulaire définis dans l'un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit.
Selon un mode de réalisation, le procédé de transduction selon l'invention ne modifie pas le type cellulaire des cellules transduites.
Enfin, l'invention a également pour objet un procédé de transfection mis en œuvre dans au moins un microcompartiment cellulaire définis dans l'un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit.
Selon un mode de réalisation, le procédé de transfection selon l'invention ne modifie pas le type cellulaire des cellules transfectées.
L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention et par des résultats.
Exemple 1 : Transduction de lymphocytes T CD3+ primaires humains
Le schéma expérimental de l'exemple 1 est décrit à la figure 1.
Les lymphocytes T CD3+ humains primaires sont décongelés, comptés et ensemencés à raison de 1 million de cellules par ml dans le milieu TexMACS ( Mi Itenyi Biotec).
Après l'ensemencement, les cellules sont activées en ajoutant "T Cell TransAct human " au milieu de culture cellulaire (dilution au l/100e) et de l'IL-2 (concentration finale de 300 U/mL).
Les cellules sont cultivées dans un flacon de culture cellulaire T75 (maintenu en position verticale) à 37°C, 5% CO2.
48 heures après l'activation, les cellules sont collectées et concentrées à 10 millions de cellules par ml dans du milieu TexMACS supplémenté en IL-2 (300 U/mL).
En parallèle, les vecteurs viraux sont dilués dans un volume de milieu TexMACS (supplémenté en IL-2 à 300 U/mL) jusqu'à la MOI finale souhaitée (voir le tableau 1 ci-dessous) et ajoutés aux cellules pour obtenir une densité finale de 5 millions de cellules par mL.
[Tableau 1]
Figure imgf000038_0001
La population cellulaire obtenue (contenant des particules virales) est divisée en 2 échantillons, l'un pour la culture cellulaire 2D dans une plaque de 12 puits (volume final de milieu de lmL à 0,5 million de cellules par mL) et l'autre pour l'encapsulation cellulaire 3D.
Pour l'encapsulation, 400 pl de l'échantillon de cellules et de vecteurs viraux (à raison de 5 millions de cellules par ml) sont injectés dans le système d'encapsulation programmé avec les paramètres suivants : débit de la seringue d'alginate (100 ml/h) ; débit des cellules et des solutions intermédiaires (50 ml/h) ; champ électrique (2000 V).
Les cellules passent à travers le dispositif d'encapsulation et les capsules sont collectées dans un bain de calcium (25 mM HEPES, 100 mM CaCI2, Tween80) situé en dessous de la buse de sortie de la puce d'encapsulation (configuration grandes capsules). Les capsules sont ensuite collectées et rincées avec du milieu DMEM/F12 additionné de CaCI2 (3mM final) sur un filtre de 100 pm. Les capsules rincées sont remises en suspension dans 4 volumes (en utilisant le volume des capsules comme référence) de milieu TexMACS additionné de CaCI2 (3mM final).
Une fois que les capsules se sont déposées (~30 minutes à 1 heure), elles sont collectées sur un filtre de 100 pm et remises en suspension dans 13 ml de milieu TexMACS supplémenté en IL-2 (300 U/mL), transférées dans un flacon T75 et incubées à 37°C, 5% CO2.
Les capsules ainsi formées comprennent une couche externe en hydrogel présentant un alginate à 2% à un poids moléculaire de 150-250 KDa. La partie interne comprend quand à elle une solution aqueuse composée de milieu de culture TexMACS.
2 jours (pour les vecteurs SeV) ou 5 jours (pour les vecteurs LV) après la transduction/encapsula- tion, les cellules sont décapsulées à l'aide de 10 volumes de ReLeSR, culottées et remises en suspension dans le milieu TexMACS pour être comptées et traitées ultérieurement pour la cytométrie en flux.
Les cellules à analyser par cytométrie en flux sont incubées avec le LIVE/DEAD™ Fixable Near IR (780) (Thermo Fisher Scientific, catalogue # L34994) pendant 30 minutes à température ambiante (RT) en suivant les instructions du fabricant. Les cellules sont ensuite incubées avec différents anticorps fluorescents (voir tableau 2), fixées dans du PBS/4% PFA et analysées par cytométrie en flux (LSR Fortessa 5L). Les résultats de cytométrie en flux obtenus pour l'expression de la GFP sont présentés à la figure 2A et 2B pour le vecteur Lentiviral et à la figure 2D et 2E pour le vecteur viral sendaï. A titre complémentaire, des résultats portant sur la viabilité cellulaire comparant les systèmes en 2D et 3D sont présentés à la figure 3A pour le vecteur Lentiviral et 3B pour le vecteur viral Sendaï.
[Tableau 2]
Figure imgf000039_0001
L'efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des lymphocytes T par les lentivirus est meilleure pour les conditions de l'encapsulation cellulaire en 3D que pour les conditions 2D, notamment pour les plus faibles MOI testées (0.1 et 1), et ce sans affecter la viabilité des cellules (Figure 3A et 3B). Par ailleurs, en plus de transduire plus de cellules, dans la condition de l'encapsulation cellulaire en 3D permet une meilleure expression du transgène dans les cellules transduites comme démontré par les intensités de fluorescence plus élevées (Figure 2B et 2E). Cette meilleure expression du transgène est associée à un plus grand nombre de transgènes insérés dans le génome des lymphocyte T en condition 3D qu'en 2D à MOI équivalente (Figure 2C)
De manière similaire, l'efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des lymphocytes T par les vecteurs viraux Sendaï est meilleure pour les conditions de l'encapsulation cellulaire en 3D que pour les conditions 2D pour toute les MOI testées (0.3, 1 et 5) (Figure 2A et 2D), et ce sans affecter la viabilité des cellules. Par ailleurs, en plus de transduire plus de cellules, l'encapsulation cellulaire en 3D permet une meilleure expression du transgène dans les cellules transduites comme démontré par les intensités de fluorescence plus élevées.
Exemple 2 : Transduction de cellules souches pluripotentes induites humaines (hIPS)
Pour les hiPSCs, les conditions de culture cellulaire pour les configurations 2D et 3D (avant l'encapsulation des cellules) sont différentes de l'exemple 1.
Le schéma expérimental de l'exemple 2 est décrit à la figure 4.
La veille de l'encapsulation, les cellules pour les expériences de transduction 2D sont ensemencées à 25 000 cellules/cm2 dans une plaque à 12 puits dans le mTeSRl complété par l'inhibiteur de Rock (10 pM final).
Pour les expériences de transduction 3D, le jour de l'encapsulation, des cellules préalablement cultivées en 2D sont lavées deux fois dans du PBS et détachées de la plaque à l'aide d'Accutase pendant 3 minutes à 37°C. Une fois en suspension, les cellules sont collectées dans 2 volumes de mTeSRl, concentrées à 10 millions de cellules/mL dans du milieu mTeSRl supplémenté en inhibiteur de Rock (10 pM final) et incubées avec des vecteurs viraux à différentes MOI (décrites dans le tableau 3) pour une densité finale de 5 millions de cellules/mL. 400 pl de la suspension de cellules et de particules virales sont ensuite injectés dans le système d'encapsulation programmé avec les paramètres suivants : Débit de la seringue d'alginate (100 mL/h) ; Débit des cellules et des solutions intermédiaires (50 mL/h) ; Champ électrique (2000V). Les cellules passent à travers le dispositif d'encapsulation et les capsules sont collectées dans un bain de calcium (25 mM HEPES, 100 mM CaCI2, Tween80) situé en dessous de la buse de sortie de la puce d'encapsulation (configuration grandes capsules).
Les capsules sont ensuite collectées et rincées avec du milieu DMEM/F12 additionné de CaCI2 (3mM final) sur un filtre de 100 pm. Les capsules rincées sont remises en suspension dans 4 volumes (en utilisant le volume des capsules comme référence) de milieu DMEM/F12 additionné de CaCI2 (3mM final). Une fois que les capsules se déposent (~30 minutes à 1 heure), elles sont collectées sur un filtre de 100 pm et remises en suspension dans 13 mL de milieu mTeSRl supplémenté en inhibiteur de Rock (10 pM final), transférées dans un flacon T75 et incubées à 37°C, 5% CO2.
Les capsules ainsi formées comprennent une couche externe en hydrogel présentant un alginate à 2% à un poids moléculaire de 150-250 kDa. La partie interne comprend quant à elle une solution aqueuse composée de milieu de culture mTeSRl.
Le même jour, le milieu des cellules cultivées pour la transduction cellulaire 2D (ensemencées la veille dans une plaque de 12 puits) est remplacé par du milieu mTeSRl supplémenté en inhibiteur de Rock (10 pM final) et transduites avec des vecteurs viraux aux mêmes MOI que celles utilisées dans la configuration 3D (voir tableau 3).
[Tableau 3]
Figure imgf000040_0001
Le jour suivant la transduction, le milieu des cellules cultivées en 2D est remplacé par du mTeSRl sans inhibiteur de Rock et le milieu des cellules cultivées en 3D est remplacé par du mTeSRl supplémenté en inhibiteur de Rock (10 pM). Deux jours après la transduction, le milieu est à nouveau remplacé par du mTeSRl sans inhibiteur de Rock, aussi bien pour les cellules cultivées en 2D qu'en 3D. Trois jours après la transduction, les cellules cultivées en 3D sont décapsulées en retirant le milieu de croissance et en ajoutant 10 volumes de ReLeSR (pour chaque volume de capsules). Après décapsulation, les cellules sont dissociées à l'aide de TrypLE 0,5X, remises en suspension dans le milieu mTeSRl et soumises à la cytométrie en flux. Les cellules à analyser par cytométrie de flux sont incubées avec la chaux fixable pendant 30 minutes à température ambiante (RT) en suivant les instructions du fabricant. Les cellules sont ensuite incubées avec différents anticorps fluorescents (voir tableau 4), fixées dans du PBS/4% PFA et analysées par cytométrie en flux. Les résultats de cytométrie en flux obtenus pour l'expression de la GFP sont présentés à la figure 5.
[Tableau 4]
Figure imgf000041_0001
L'efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des iPSC est meilleure pour les conditions d'encapsulation en 3D que pour les conditions 2D, et ce, qu'elle que soit la MOI utilisées pour les vecteurs lentiviraux, les AAV ou les vecteurs viraux Sendaï.
Exemple 3 : Transduction de cellule encapsulée selon l'invention avec plusieurs agents de transduction.
Les conditions expérimentales de cet exemple sont identiques à celle de l'exemple 1.
Toutefois, la transduction est réalisée avec 3 lentivecteurs au lieu d'un seul dans l'exemple 1. Les MOI indiquées correspondent à la MOI total utilisée pour la combinaison des 3 lentivecteurs. Les résultats sont présentés à la figure 6. Ces résultats montrent qu'il est possible de co-transduire des cellules à l'aide de plusieurs vecteurs dans un microcompartiment en 3D.
Exemple 4 : Etude comparative de l'efficacité de transduction au sein de microcompartiment comprenant un seul hydrogel vs un microcompartiment selon l'invention
Pour réaliser cette étude comparative, cet exemple comprend 3 conditions spécifique :
*Condition 1 : un microcompartiment selon l'invention comprenant une couche externe en hydrogel composée d'alginate 2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa) et une partie interne comprenant une solution aqueuse (milieu mTeSRl).
*Condition 2 : un microcompartiment selon l'invention comprenant une couche externe en hydrogel composée d'alginate 2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa) et une partie interne comprenant un hydrogel d'alginate 0,5% de faible poids moléculaire (< 75kDa). Par conséquent, l'hy- drogel de la couche externe et l'hydrogel de la partie interne sont différents.
*Condition 3 : un microcompartiment « plein », hors invention, comprenant un hydrogel d'alginate 1,2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa). Pour obtenir la condition 3, le protocole décrit par Neumann et al., 2013 (DOI 10.1007/sl2033- 012-9522-y) a été reproduit.
Résultats :
Trois jours après la transduction, on peut observer à la figure 7A que la transduction est plus efficace dans la condition 1 (82,5% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 32338) que dans la condition 3 (37.1% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 11317). La condition 2 un taux de transduction intermédiaire (73.3% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 20909). En plus d'améliorer l'efficacité de transduction, la condition 2 démontre une meilleure viabilité ainsi qu'une meilleure amplification des cellules comparée à la condition 3 (Figure 7C).
La transduction au sein des microcompartiment générés dans les conditions 1 et 2 est donc plus efficace et moins toxique pour les cellules que la transduction réalisée dans la condition 3 (Figure 7A et Figure 7B). Par ailleurs, le fait que la condition 2 soit plus performante que la condition 3 (Figure 7D) démontre que l'on peut décorréler les propriétés physiques nécessaires à la formation des microcompartiment de celui favorisant une transduction et une culture cellulaire optimale, notamment en bioréacteur. En effet, il serait impossible de générer/maintenir l'intégrité physique de capsules pleines d'alginate à 0.5%.
Exemple 5 : Mesure de la capacité d'infection d'un agent de transduction à diffuser à travers la couche externe d'hydrogel du microcompartiment selon l'invention de l'extérieur vers l'intérieur.
Pour la réalisation de cet exemple des cellules cancéreuse humaines sont encapsulées selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à 3 Millions de cellules par ml dans un microcompartiment selon l'invention.
Pendant 24h, les cellules encapsulées sont placées dans un tube ventilé, dans 500 pl de milieu : soit dans du milieu non infecté (condition 1), soit dans du milieu infecté (vecteur lentiviral codant pour la GFP à MOI 10) (condition 2).
Dans chaque condition, du milieu non infecté est ajouté de façon à que le volume final soit égal à 5mL.
La fluorescence des cellules est ensuite observée selon le même protocole que l'exemple 1 par cytométrie en flux afin d'observer ou non la transfection des cellules.
Un schéma expérimental simplifié de cet exemple est présenté à la figure 8.
Les résultats de cet exemple sont présentés à la figure 9 et montrent que les agents de transduction tel que les vecteurs lentiviraux ne sont pas capables de traverser la couche externe d'hydrogel de l'extérieur vers l'intérieur du microcompartiment selon l'invention, notamment après 24h d'incubation. Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention par sa couche externe d'hydrogel permet à la fois de protéger les cellules des contraintes physiques lors de la mise en culture, mais également la diffusion dans la capsule d'agents de transduction présents dans le milieu qui ne seraient pas encapsulés dans la partie interne.
Le microcompartiment selon l'invention garantit ainsi une transduction réalisée uniquement par des agents de transduction d'intérêts et encapsulés au sein de la partie interne du microcompartiment selon l'invention.
Exemple 6 : Mesure de la capacité d'un agent de transduction à diffuser à travers la couche externe d'hydrogel du microcompartiment selon l'invention de l'intérieur vers l'extérieur.
Pour la réalisation de cet exemple, des cellules cancéreuses humaines sont ensemencées à 80000 cellules par puit sur une plaque 12 puits pendant 24 heures.
De manière complémentaire, des vecteurs lentiviraux codant pour la GFP sont encapsulés selon le même protocole que l'exemple 1 dans des microcompartiment à 1x108 TU/mL (volume d'encap- sulation= 400 pl).
Selon le même protocole que l'exemple 1, des microcompartiments vides, c'est-à-dire sans cellule ni vecteurs lentiviraux sont produits afin de représenter témoin négatif pour cet exemple.
Les microcompartiments vides (condition 1 - témoin négatif) ou les microcompartiments comprenant des vecteurs lentiviraux (condition 2) sont ensuite déposés au-dessus des cellules préalablement obtenues.
Après une étape de rinçage, les conditions 1 et 2 sont incubées pendant 48 heures à 37°C à 5% de CO2 avant de retirer les microcompartiments.
La fluorescence des cellules est ensuite observée selon le même protocole que l'exemple 1 par cytométrie en flux afin d'observer ou non la transduction des cellules dans les conditions 1 et 2 48 heures après le retrait des microcompartiments.
Pour réaliser un contrôle positif (condition 3), les microcompartiment obtenus après rinçage et utilisées pour l'incubation pendant 48 heures de la condition 2, sont collectées et les vecteurs lentiviraux encapsulés sont décapsulés puis transféré dans un milieu DMEM.
De nouvelles cellules cancéreuses humaines sont ensemencées à 160 000 cellules par puit auquel est ajouté 1 ml de vecteur lentiviraux décapsulés (dilué au 1/10).
Le mélange cellules cancéreuses humaines et vecteurs lentiviraux décapsulés est incubé pendant 48h avant analyse par cytométrie de flux afin d'observer ou non la transduction des cellules dans la condition 3 (témoin positif).
Un schéma expérimental simplifié de cet exemple est présenté à la figure 10.
Les résultats de cet exemple sont présentés à la figure 11 et montrent que les agents de transduction sont fonctionnels (condition 3) mais ne sont pas capables de diffuser de l'intérieur vers l'extérieur de la couche externe du microcompartiment selon l'invention, notamment après 48 heures d'incubation (condition 2). Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention permet de maintenir les agents de transduction au sein de la partie interne du microcompartiment permettant ainsi un meilleur contrôle de la concentration des agents de transduction ainsi qu'une plus grande probabilité de rencontre entre les cellules et les agents de transduction.
Exemple 7 : Etude comparative de l'efficacité de transduction de deux agents de transductions
L'objectif de cet exemple est d'étudier l'efficacité de transduction de deux agents de transduction (un vecteur lentiviral codant pour la GFP et un vecteur Sendaï codant pour la mCherry) sur des lymphocytes T CD3+.
Ainsi, pour la réalisation de cet exemple plusieurs conditions ont été réalisées, à savoir :
Condition 1 : Témoin négatif correspondant à de cellules non tranduite ;
Condition 2 : Lymphocytes T CD3+ transduit à l'aide de vecteurs Sendaï à MOI 1;
Condition 3 : Lymphocytes T CD3+ transduit à l'aide de vecteurs lentiviraux à MOI 1,5 ;
Condition 4 : Lymphocytes T CD3+ co-transduit avec une MOI de 1,5 pour les vecteurs lentiviraux et une MOI de 1 pour le vecteur Sendaï.
L'ensemble des conditions ont été préparé selon le même protocole que l'exemple 1 formant ainsi d'une part un système en 3D avec les microcompartiments selon l'invention et d'autre part un système de culture en 2D.
L'ensemble des conditions ont été incubées pendant 48 heures puis l'analyse par cytométrie en flux a été réalisée afin de comparer l'efficacité de transduction des deux agents de transduction, notamment d'une co-transduction.
Les résultats de la co-transduction du vecteur lentiviral et du vecteur Sendaï 48h après encapsulation sont présentés à la figure 12.
Ces résultats démontrent que par rapport à un système en 2D, le microcompartiment selon l'invention permet une efficacité de transduction similaire ou supérieure pour les deux agents de transduction. Par ailleurs, ces résultats indiquent également qu'il est possible d'obtenir une proportion plus importante de cellules co-transduites à l'aide du microcompartiment selon l'invention.
Exemple 8 : Mesure de l'efficacité de transfection de cellules cancéreuses humaines à l'aide d'exosomes
L'objectif de cet exemple est de comparer l'efficacité de transfection d'exosomes dans un système en 3D via l'utilisation de microcompartiment selon l'invention.
Pour la réalisation de cet exemple, les exosomes ont été obtenu selon le protocole suivant :
* Mise en culture de cellules cancéreuses humaines de façon à obtenir environ 80 000 cellules par puit ; *Récupération de 10 ml de milieu de culture après 72h de culture et centrifugation à 3 000 g pendant 15 minutes pour éliminer les cellules et les débris cellulaires ;
*Transfère du surnageant dans un nouveau tube et ajoutez 2mL d'ExoQuick-TC au milieu. L'Exo- Quick-TC étant une solution commerciale permettant de faire précipiter les vésicules extracellulaires tel que les exosomes ;
*Réfrigérer toute la nuit (au moins 12 heures) à +4°C ;
*Centrifugation du mélange ExoQuick-TC/milieu à 1 500g pendant 30 minutes. Après centrifugation, les exosomes peuvent apparaître sous la forme d'une pastille beige ou blanche au fond du récipient ;
*Elimination du surnageant et centrifugation de la solution ExoQuick-TC résiduelle par centrifugation à 1 500 g pendant 5 minutes ;
*Elimination de toute trace de liquide par aspiration ;
*Remise en suspension du culot comprenant les exosomes dans 100 à 500 pl en utilisant du PBS IX stérile.
Les exosomes ainsi obtenus ont ensuite été préparés selon différentes conditions, à savoir :
*Condition 1 : Exosomes transfectés par un SiRNA TX-Red (200pl) ;
*Condition 2 : Exosomes transfectés par un plasmide lentiviral GFP (200pl).
En parallèle, un témoin négatif a été réalisé en utilisant des exosomes vides.
Pour la réalisation de cet exemple, les exosomes ont été transfectés de la manière suivante :
*Préparation d'un mélange de 0,15mL comprenant :
-10 pl de solution Exo-Fect + 20 ul d'acide nucléique (20 pmolsi ou 5 ug d'ADN plasmidique) ;
-70 ul stériles lx PBS ;
- 50 ul d'exosomes purifiés dans lx suspension PBS ;
- 150 ul de réaction de transfection totale ;
*lncubation de la solution de transfection d'exosomes à 37°C pendant 10 minutes puis placer immédiatement le tube sur de la glace.
*Pour arrêter la réaction 30 pl du réactif ExoQuick-TC fourni dans le kit à la suspension d'échantillon d'exosomes transfectés est ajouté au mélange ;
*Refroidissement de l'échantillon d'exosomes transfectés sur de la glace ou à 4°C pendant 30 minutes ;
*Centrifugation de l'échantillon d'exosomes transfectés pendant 3 minutes à 13 000-14 000 tr/min ; * Elimi nation du surnageant et remise en suspension du culot d'exosomes transfectés dans 300 pl de lx de PBS.
Les exosomes transfectés sont prêts à être ajoutés aux cellules cibles ou utilisés in vivo.
Les exosomes transfectés ainsi obtenus sont ensuite ajoutés aux cellules cibles selon le protocole suivant :
*Mélange de 150 pl d'exosomes non transfectés avec environ 2xl06 cellules cancéreuses humaines encapsulées ; OU Co-encapsulation selon le protocole de l'exemple 1 de 150 pl d'exosomes transfectés avec environ 2xl06 cellules cancéreuses humaines de façon à former des microcompartiments selon l'invention *lncubation des cellules pendant 24 heures pour les exosomes transfectés avec le SiRNA et 48h pour les exosomes transfectés avec le plasmide lentiviral GFP) ;
*Visualisation en microscopie à fluorescence et par cytométrie en flux selon le protocole de l'exemple 1 en suivant les directives d'excitation/émission suivantes pour le fluorophore utilisé.
Le tableau 5 ci-dessous décrit les ratio quantité de siARN ou d'ADN plasmidique par cellule ainsi que l'efficacité de la transfection dans le microcompartiment selon l'invention.
[Table 5]
Figure imgf000046_0001
Le tableau 5 permet ainsi de mettre en évidence que le microcompartiment selon l'invention est adapté pour la réalisation d'une transfection à l'aide d'agent de transfection tel que des exosomes.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l'hydrogel constituant la couche externe.
[Revendication 2] Microcompartiment cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrogel de la partie interne est différent de l'hydrogel constituant la couche externe, en ce qu'il présente au moins une propriété chimique et/ou par au moins une propriété physique différente.
[Revendication 3] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection est inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
[Revendication 4] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection est inférieure à 0,1/h, préférentiellement inférieure à 0,05/h, encore plus préférentiellement inférieure à 0,01/h.
[Revendication 5] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive maximale de l'hydrogel de la partie interne à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection supérieure à 0,1/h, est préférentiellement supérieure à 1/h, encore plus préférentiellement supérieure à 10/h, notamment supérieure à 50/h.
[Revendication 6] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, dans lequel le ratio de la conductance diffusive de l'hydrogel de la partie interne sur la conductance diffusive de l'hydrogel de la couche externe par rapport à un agent de transfection et/ou transduction supérieur à 5, préférentiellement supérieur à 10, encore plus préférentiellement supérieur à 100, notamment supérieur à 1000.
[Revendication 7] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, dans lequel la couche externe comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
[Revendication 8] Microcompartiment cellulaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que la plus petite dimension des pores de l'hydrogel de la partie interne est supérieure à lOnm, préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
[Revendication 9] Microcompartiment cellulaire selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la couche externe comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à lOnm.
[Revendication 10] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'hydrogel de la couche externe présente une densité et/ou une viscosité strictement supérieure à la densité et/ou la viscosité de la solution et/ou l'hydrogel présent au sein de la partie interne.
[Revendication 11] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'hydrogel de la couche externe présente un poids moléculaire différent de l'hydrogel présent au sein de la partie interne.
[Revendication 12] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe présente une résistance à la diffusion plus importante que la solution et/ou l'hydrogel de la partie interne.
[Revendication 13] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la viscosité de la partie interne est comprise entre 0,1 et 50 mPa/s.
[Revendication 14] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce la partie interne comprend :
- au moins une couche de solution aqueuse ; et/ou
- au moins une couche et/ou un maillage en hydrogel.
[Revendication 15] Microcompartiment cellulaire selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu'au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection se trouve dans la solution aqueuse et/ou dans l'hydrogel de la partie interne.
[Revendication 16] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent de transduction et en ce que la MOI (« multiplicity of infection ») dudit microcompartiment est comprise entre 0,01 et 100.
[Revendication 17] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un agent de transfection et en ce que le ratio quantité d'ADN ou quantité d'ARN / cellule dudit microcompartiment est inférieur à 10.
[Revendication 18] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'au moins un agent de transduction est choisi parmi une particule virale, une pseudo particule virale et leur combinaison.
[Revendication 19] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'au moins un agent de transfection est choisi parmi une vésicule extracellulaire d'origine endosomale, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
[Revendication 20] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprend au moins une molécule d'intérêt choisie parmi un acide nucléique, un acide ribonucléique, une protéine, un peptide et leurs combinaisons.
[Revendication 21] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne comprend au moins deux types cellulaires différents.
[Revendication 22] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes présentes dans la partie interne sont choisies parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
[Revendication 23] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne comprend au moins une solution aqueuse et/ou un hydrogel dont le module de Young est strictement inférieur au module de Young de l'hydrogel de la couche externe.
[Revendication 24] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le module de Young de la solution aqueuse ou de l'hydrogel dans la partie interne est compris entre 0,01 et 200kPa, préférentiellement de 0,1 et 60 kPa.
[Revendication 25] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le module de Young de l'hydrogel dans la partie interne est compris entre 0,1 et 5kPa.
[Revendication 26] Microcompartiment cellulaire selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le module de Young de l'hydrogel de la couche externe est supérieur à lOkPa, préférentiellement supérieur à 60kPa.
[Revendication 27] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrogel de la couche externe et/ou dans la partie interne est choisi parmi la fibrine, le collagène, la fibronectine, l'entactine, l'acide hyaluronique, l'alginate, la laminine, un substitut de matrice extra cellulaire et leurs mélanges.
[Revendication 28] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la solution aqueuse de la partie interne est un milieu de culture adapté à la culture des cellules présentes dans la partie interne.
[Revendication 29] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microcompartiment est clos.
[Revendication 30] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microcompartiment a la forme d'un ovoïde, d'un cylindre, d'un sphéroïde, d'une sphère ou d'une larme.
[Revendication 31] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne du microcompartiment comprend au moins une couche de cellules et/ou un au moins un agrégat de cellules et/ou au moins un micro-tissu cellulaire en trois dimensions, ledit agrégat et/ou micro-tissu comprenant éventuellement au moins une lumière.
[Revendication 32] Ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'une des revendications précédentes.
[Revendication 33] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 1 à 31 ou ensemble de microcompartiments cellulaires selon la revendication 32 pour son utilisation en tant que médicament.
[Revendication 34] Utilisation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 1 à 31 ou ensemble de microcompartiments cellulaires selon la revendication 32 pour produire à grande échelle des cellules et/ou des micro-tissus et/ou des organoïdes exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
[Revendication 35] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 1 à 31 ou ensemble de microcompartiments cellulaires selon la revendication 32 pour insérer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle dans au moins une cellule.
[Revendication 36] Microcompartiment selon l'une des revendications 1 à 31, pour son utilisation dans un procédé de transduction.
[Revendication 37] Microcompartiment selon l'une des revendication 1 à 31, pour son utilisation dans un procédé de transfection.
[Revendication 38] Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 1 à 31, comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, ladite solution et/ou ledit hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d'hydrogel, ledit hydrogel étant différent de l'éventuel hydrogel de l'étape b).
[Revendication 39] Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape (d) qui consiste à cultiver les microcompartiments obtenues à l'étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins l jour, préférentiellement de 3 à 50 jours.
[Revendication 40] Procédé selon l'une des revendications 38 ou 39, caractérisé en ce que la densité cellulaire de la solution de l'étape (a) est comprise entre 0,1 et 40 millions de cellules par mL, préférentiellement entre 0,8 et 20 millions.
[Revendication 41] Procédé selon l'une des revendications 38 à 40, caractérisé en ce que la solution de l'étape (a) comprend au moins 2 types cellulaires différents.
[Revendication 42] Procédé selon l'une des revendications 38 à 41, caractérisé en ce que l'étape (c) est réalisée par co-injection simultanée d'une solution d'hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l'étape (a) et de la solution de l'étape (b) ; ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
[Revendication 43] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 pm, préférentiellement entre 80 et 240 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 10 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 11 et 100 mL/h.
[Revendication 44] Procédé selon l'une des revendications 38 à 43, caractérisé en ce que l'étape (c) est réalisée par co-injection simultanée de la solution d'hydrogel destinée à former la couche externe, la solution de l'étape (a) et la solution de l'étape (b), ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube. [Revendication 45] Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est compris entre 50 et 1000 pm, préférentiellement entre 80 et 300 pm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
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