FR2991690A1 - Utilisation d'une chaufferette pour favoriser une reaction biologique - Google Patents

Abstract

La présente invention porte sur l'utilisation de chaufferettes, ou packs de chaleur autonomes, pour chauffer et maintenir à une température convenable une solution enzymatique, pendant la durée nécessaire à l'action de l'enzyme, dans des applications de biologie moléculaire ou de biologie cellulaire. Des trousses de biologie contenant des chaufferettes font également partie de cette invention.

Description

UTILISATION D'UNE CHAUFFERETTE POUR FAVORISER UNE REACTION BIOLOGIQUE La présente invention concerne le domaine des trousses de biologie moléculaire et cellulaire. Elle a notamment pour objet des trousses comprenant un moyen de chauffage autonome simple et peu coûteux pour traiter des biopsies. Depuis plusieurs années, la greffe de cellules, en particulier de cellules autologues, s'impose comme un moyen efficace et sécuritaire pour favoriser la régénération de tissus malades ou lésés. Certains protocoles thérapeutiques nécessitent la prolifération et/ou la modification des cellules ex vivo avant réimplantation. D'autres protocoles prévoient essentiellement le prélèvement de cellules dans une partie saine du tissu concerné et leur réimplantation quasi-immédiate au niveau de la lésion à traiter. Ceci est notamment le cas des protocoles pour le traitement de pathologies ou lésions cutanées telles que certaines brûlures (d'étendue ne nécessitant pas d'expansion cellulaire), les hypochromies post-traumatiques et postopératoires, les dermatoses achromatiques, les cicatrices etc. Dans ces protocoles, le traitement des échantillons se résume essentiellement à une dissociation plus ou moins poussée des cellules, suivie, le cas échéant, de la séparation de différents types cellulaires pour sélectionner les cellules appropriées pour l'application visée (mélanocytes pour les dermatoses achromatiques, par exemple) et d'une filtration pour éliminer les agrégats. La dissociation cellulaire est le plus souvent réalisée par incubation de l'échantillon dans une solution de trypsine. La température optimale pour l'activité de la trypsine est de 37°C. A cette température, et suivant la concentration d'enzyme et le degré de dissociation souhaité, les temps d'incubation décrits dans la littérature sont compris entre 50 minutes et 3 heures (Guerra et al., 2003; Mulekar, 2003; van Geel et al., 2004). A une température inférieure, l'enzyme est moins active, et il est nécessaire d'allonger le temps d'incubation de plusieurs heures, ce qui rend impossible la réalisation de toutes les étapes du protocole dans la même journée (Gauthier and Surleve-Bazeille, 1992). Pour cette raison, ces protocoles sont actuellement réalisés au moins partiellement dans des structures disposant de plateformes techniques comportant un incubateur, ce qui n'est pas souvent le cas des cabinets de dermatologie.

Afin de permettre à des praticiens non équipés d'incubateur de traiter des patients atteints de vitiligo, la société Clinical Cell Culture propose un kit (ReCe110) comportant les consommables nécessaires pour effectuer toutes les étapes, du prélèvement à la réimplantation des cellules, ainsi qu'une unité de chauffage électronique équipée de piles. Ce dispositif présente deux inconvénients majeurs, qui sont son prix très élevé et son impact écologique. La présente invention propose une alternative avantageuse aux solutions de l'art antérieur, en particulier au kit ReCe110, puisqu'elle repose sur l'utilisation de chaufferettes pour chauffer et maintenir à une température convenable une solution enzymatique, pendant la durée nécessaire à l'action de l'enzyme. Les chaufferettes, aussi appelées « bouillottes magiques » ou « packs de chaleur autonomes », sont des petits objets capables d'émettre de la chaleur, utilisés par exemple pour réchauffer les mains ou les pieds exposés au froid. Leur fonctionnement repose sur des processus physiques ou chimiques exothermiques. A titre d'exemple de chaufferette reposant sur un processus physique, on peut citer les chaufferettes réutilisables constituées d'une pochette contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en surfusion. En tordant une plaquette métallique à l'intérieur du liquide, on génère des cristaux d'acétate solidifié, qui déclenchent la cristallisation, et la solution devient solide. Cette transition de phase se faisant à la température de fusion (54° pour une solution à 20%, par exemple), il y a échauffement de la pochette puis refroidissement jusqu'à la température ambiante une fois la solidification terminée. Lorsque la pochette est refroidie, il est possible de remettre l'acétate de sodium (devenu solide) à l'état liquide, en plaçant la pochette dans de l'eau très chaude. Il existe aussi des chaufferettes chimiques dont le principe est activé par oxydation au contact de l'air. Elles sont efficaces plus longtemps (de 8 à 60 heures contre environ 1 heure) mais ne servent qu'une fois. Les inventeurs ont montré (exemple 1 ci-dessous) qu'une solution placée dans un récipient, typiquement une boîte de Pétri, posée sur une chaufferette, atteint en quelques minutes une température optimale pour l'activité de nombreuses enzymes telles que la trypsine, et s'y maintient pendant au moins 15 à 20 minutes.

L'invention porte donc, en premier lieu, sur l'utilisation d'une chaufferette pour maintenir la température d'une solution enzymatique entre 30 et 40°C pendant au moins 15 minutes. Cette utilisation de la chaufferette, objet simple, peu coûteux et en général destiné aux loisirs de grand air (ski, alpinisme etc.), pour mettre en oeuvre un procédé biologique (biologie moléculaire ou cellulaire) en remplacement d'un matériel de laboratoire sophistiqué, est aussi avantageuse que surprenante, puisqu'elle permet des économies considérables sans altérer la qualité des résultats obtenus. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette est utilisée dans le cadre d'un procédé de biologie cellulaire, et la solution enzymatique contient des cellules provenant d'une biopsie, par exemple un échantillon de tissu à dissocier. Dans ce cas, la solution enzymatique contient, par exemple, de la trypsine.

Pour les réactions nécessitant une incubation de moins d'une heure, la chaufferette est de préférence constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium. Toutefois, l'invention peut également être mise en oeuvre avec une chaufferette chimique, permettant une incubation plus longue. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la chaufferette utilisée, de type pochette contenant de l'acétate de sodium, est un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à 10 cm, et la solution enzymatique a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une boîte de Petri de diamètre compris entre 7 et 11 cm, de préférence entre 8 et 10 cm, ou un compartiment de ladite boîte. Par « boîte de Petri », on entend ici une boîte cylindrique transparente peu profonde, en verre ou en plastique, munie d'un couvercle. Dans certaines réalisations particulières de l'invention, la boîte de Pétri est compartimentée, par exemple par une petite paroi le long d'un diamètre.

La présente invention porte également sur un procédé de dissociation de cellules issues d'un échantillon de tissu fraîchement prélevé, comportant les étapes suivantes : (i) initier la cristallisation dans une chaufferette constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ; (ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et 1%; (iii) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes, de préférence 15 à 20 minutes ; (iv) rincer l'échantillon de tissu. Bien entendu, lors de la mise en oeuvre de ce procédé, on veillera à ce que la géométrie de la chaufferette et celle du récipient soient telles qu'il existe une surface d'échange importante entre les deux. Selon un mode de réalisation particulier, la chaufferette a une forme de disque et le récipient est une boîte de Pétri, comme mentionné plus haut. Dans ce cas, les diamètres des deux éléments sont de préférence identiques ou quasi-identiques. Dans le procédé ci-dessus, l'étape (iv) peut, le cas échéant, être précédée ou suivie d'une étape d'inhibition de la trypsine, par ajout d'un inhibiteur. Toutefois, selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon l'invention, aucun inhibiteur de la trypsine n'est ajouté, le rinçage de l'échantillon de tissu étant suffisant pour stopper l'action de la trypsine. Ceci permet en particulier de limiter le nombre de substances qui seront appliquées au patient avec les cellules.

La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes : (i) mettre en oeuvre le procédé de dissociation décrit plus haut sur un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient ; (ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution ; le cas échéant, cette étape nécessite une étape intermédiaire de séparation et/ou de tri de certaines cellules de l'échantillon ; et (iii) filtrer la solution obtenue à l'étape (ii) sur tamis cellulaire. Selon une mise en oeuvre particulière, le procédé ci-dessus comporte une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii). Cette étape permet d'obtenir un mélange visqueux qui est facilement appliqué dans le lit de la plaie. En outre, l'acide hyaluronique favorise la viabilité des cellules.

Une application particulière des procédés ci-dessus est le traitement du vitiligo ; dans cette application, les cellules récupérées à l'étape (ii) comprennent au moins des mélanocytes. La présente invention porte également sur une trousse pour application biologique (trousse de biologie cellulaire et/ou trousse de biologie moléculaire), caractérisée en ce qu'elle comprend une chaufferette. Selon un mode de réalisation préféré des trousses selon la présente invention, la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en état de surfusion.

Une trousse selon la présente invention peut également contenir une enzyme, par exemple de la trypsine (en solution ou lyophilisée). Elle est par exemple conçue pour le traitement d'une biopsie, et comprend notamment les moyens nécessaires pour la dissociation des cellules de ladite biopsie. Selon un mode de réalisation préféré des trousses de l'invention, la trousse comprend également un récipient dont la base a la même géométrie que celle de la chaufferette, afin de permettre des échanges thermiques efficaces. Par exemple, la chaufferette peut être un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm, de préférence 4 à 6 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, de préférence 8 à 10 cm ; dans ce cas, le récipient est de préférence une boîte de Petri de diamètre sensiblement égal à celui de la chaufferette. Selon un mode de réalisation particulier, cette trousse comprend une boîte de Pétri compartimentée dont le diamètre est identique ou légèrement inférieur à celui de la chaufferette, un tamis cellulaire, et de la trypsine (sous forme lyophilisée ou en solution). La trousse peut également comprendre un support permettant de caler le récipient sur la chaufferette. Un exemple de tel support est une forme en mousse avec un trou rond d'une profondeur supérieure à l'épaisseur de la chaufferette, qui permet non seulement de caler une boîte de Pétri sur la chaufferette, mais présente aussi l'avantage d'isoler thermiquement le côté de la boîte, permettant une distribution homogène de la température. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois limiter son étendue. Exemples Exemple 1 : Température du milieu dans une boîte de Pétri placée sur une chaufferette La température d'une solution (tampon) dans une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre, placée sur une chaufferette à l'acétate de sodium, présentant une forme de disque d'un diamètre sensiblement égal à celui de la boîte de Pétri a été mesurée, et une épaisseur comprise entre 4 et 6 mm.

Les résultats (Figure 1) montrent une montée en température assez rapide, puisque la température atteint 30°C en quelques minutes. La température reste ensuite comprise entre 30 et 40°C pendant un peu plus de 20 minutes. Ces résultats ont montré une bonne reproductibilité.

Exemple 2: Application à la séparation dermo-épidermique, dans le cadre du traitement du vitiligo par greffe autologue de mélanocytes A partir d'une biopsie de peau fine (0,2 mm-0,3 mm), le lit d'une plaie est ensemencée avec des cellules autologues. La suspension cellulaire obtenue après désagrégation du greffon est constituée d'une population mixte, principalement des cellules basales de kératinocytes, mais également des cellules de Langerhans, des mélanocytes et des fibroblastes. Matériels utilisés Une chaufferette telle que décrite à l'exemple 1, et un kit à usage unique composé d'éléments et d'instruments annexes : solutions enzymatiques et d'application, instruments stériles, dont une boîte de Pétri à deux compartiments. Protocole Préparer un champ chirurgical stérile. A réception, le kit est conservé à +4°C jusqu'à utilisation. Le kit est disposé à température ambiante 10 min avant utilisation.

Préparation et chauffage de la solution enzymatique - A l'aide d'une seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 5 ml de solution de PBS et les injecter dans le flacon de trypsine lyophilisée. Bien homogénéiser avant de reprendre la solution régénérée et dans un compartiment de la boite de pétri double compartiment. - Activer le pack de chaleur instantanée en froissant la plaque métallique ; le cristal se solidifie instantanément. - Placer la boite de pétri double compartiment sur le pack de chaleur activé et attendre 5 min. Prélèvement cutané La zone à prélever est délimitée au feutre chirurgical, désinfectée avec de la Chlorexidine à 0,5% en solution alcoolique, et anesthésiée avec de la xylocaïne à 2%. Un lambeau de peau mince de 4 cm2 minimum de surface et 0,2-0,3 mm d'épaisseur est prélevé avec un dermatome. Réalisation de la séparation dermo-épidermique(SDE) - A l'aide de la pince stérile (non fournie) transférer la biopsie dans le compartiment de la boite de pétri contenant la trypsine en solution à 0.4%. - Incuber 15 minutes. - Rinçage de la biopsie : - Avec la même seringue de 5m1 et une aiguille, prélever 5m1 de solution de PBS et disposer dans le 2nd compartiment de la boite de Pétri. - A la fin de l'incubation, à l'aide de la pince stérile, transférer la biopsie dans le deuxième compartiment, pour rinçage rapide au PBS. - A l'aide de la pince stérile, disposer la biopsie à l'intérieur du couvercle de la boite de Pétri, en prenant soin de conserver le sens jonction dermo-épidermique vers le haut. - A l'aide de la pince, procéder à la séparation des 2 fragments Réalisation de la suspension cellulaire - A l'aide de la seconde seringue de 5 ml et d'une aiguille, prélever 1,5 ml de PBS et les déposer sur les fragments de biopsie, racler les cellules des surfaces de jonction avec un scalpel (non fourni) et découper la partie épidermique grossièrement pour réaliser un mélange de cellules. - Ecarter et immobiliser la partie dermique. - Pencher la boite de Pétri de façon à aspirer la totalité du volume à l'aide de la seringue de 5 ml, faire monter les cellules dans la seringue et aspirer plusieurs fois pour créer une suspension cellulaire. Filtration des cellules - Transférer la suspension cellulaire dans le tamis qui aura été placé sur le pot à bouchon rouge. Réalisation de la suspension cellulaire dans l'acide hyaluronique. - Retirer le tamis. - Déposer l'acide hyaluronique contenu dans la seringue (soit 1,5 ml) dans le pot à bouchon rouge contenant la suspension cellulaire filtrée. - A l'aide de la seringue, mélanger l'acide hyaluronique et la suspension cellulaire de façon à obtenir une suspension visqueuse mais homogène. - La suspension ainsi préparée est prête à être déposée à la seringue sur le lit de la plaie. Résultats Le protocole ci-dessus a été effectué plusieurs fois, à partir de trois échantillons cutanés différents, en utilisant deux concentrations de trypsine (0,4 et 0,8%).

Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous. Identification Concentration de trypsine Nombre de Viabilité cellulaire (%) Test Présence de cellules d'efficacité de clonage mélanocytes en cytométrie de flux isolées x 106 / cm2 Biopsie 1 0,4% 1,2 95,0% 3,4% > 0,1% 0,8% 1,2 97,0% 3,4% >0,1% Biopsie 2 0,4% 3,4 98,0% 3,3% >0,1% 0,8% 2,3 97,0% 3,8% >0,1% Biopsie 3 0,4% 4,2 97,4% 4,6% > 0,1% 0,8% 3,9 99,4% 4,5% >0,1% Concentration de la trypsine Le procédé d'obtention de la substance active a été adapté de la technique décrite par van Geel et al. (van Geel et al., 2004). La concentration de la solution de trypsine a été optimisée (trypsine 0,4% ou 0,8% au lieu de trypsine 0,25% /EDTA 0,08%). A la différence de la technique décrite par van Geel et al., l'inhibition de la trypsine n'a pas été réalisée par ajout d'inhibiteur de type sérum de veau foetal, mais par rinçage avec du PBS, ceci afin de diminuer le nombre de produits d'origine biologique utilisé pour la fabrication du produit. La viabilité cellulaire après ce mode d'inhibition de la trypsine a été validée. Viabilité cellulaire La détermination de la viabilité cellulaire a été réalisée selon une technique classique de culture cellulaire : le test d'exclusion au bleu de trypan. Une dilution volume à volume de bleu trypan et de la suspension cellulaire a été réalisée dans un tube à hémolyse. Après un temps de contact de 1 à 2 minutes, le mélange a été déposé avec une micropipette entre lame et lamelle sur une cellule de numération. Les cellules mortes, colorées en bleu, et les cellules vivantes, non colorées, ont été comptées à l'aide d'un microscope optique à contraste de phase. La viabilité cellulaire était très satisfaisante après isolement des cellules épidermiques (supérieure à 90%). Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage étaient homogènes d'une biopsie à l'autre et montraient que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsination. Nombre de cellules isolées /cm2 de biopsie Calcul effectué à partir des résultats du test décrit ci-dessus.

Le nombre de cellules isolées était variable d'un individu à un autre en fonction de la taille des biopsies traitées, mais le rendement cellule/cm2 a été relativement constant. La densité cellulaire de la suspension finale dépend donc grandement de la taille de la biopsie traitée.

Test d'efficacité de clonage (CFE) Le pourcentage d'efficacité de clonage permet d'évaluer le taux de cellules capables d'adhérer et de former des colonies. Une quantité connue de cellules épidermiques a été ensemencée dans 3 flasques T25 cm2. Vers le 14ème jour de culture, lorsque les clones étaient suffisamment gros mais non jointifs, les flasques ont été colorées par une solution de Cristal Violet (10% formaldéhyde / 0,5% Cristal Violet, qsp eau distillée). L'efficacité de clonage a été calculée en effectuant le rapport de la moyenne du nombre total de colonies par flasque T25cm2 x 100 sur le nombre de cellules ensemencées par T25 cm2. Le comportement des cellules après remise en culture et l'efficacité de clonage ont été homogènes d'une biopsie à l'autre et ont montré que la suspension cellulaire contenait des cellules capables de proliférer après trypsination. Taux de mélanocytes dans la suspension cellulaire par cytométrie en flux La membrane cellulaire a été perméabilisée dans une solution de PBS-BSA (Bovine Serum Albumine) 1% - triton 0,5%. L'anticorps primaire spécifique des mélanocytes normaux (anticorps NKI/beteb) a été incubé, puis rincé avec du PBS-BSA 1%. L'anticorps secondaire (anticorps d'âne antisouris Alexa Fluor 488) a été incubé puis rincé avec du PBS- BSA 1%. Les cellules marquées ont été reprises dans du PBS et passées au FACS-SCAN. Les ratios de mélanocytes/kératinocytes dans les suspensions épidermiques obtenues ont été comparables à ceux calculés par Guerra et al. (entre 1 :30 et 1 :200) (Guerra et al., 2003).

A noter que la technique de Guerra et al diffère du procédé présenté ici : dans l'article de Guerra et al., les cellules épidermiques isolées ont été cultivées dans un milieu favorisant la prolifération des mélanocytes, jusqu'à obtention de feuillets multicouches enrichis en mélanocytes. Le comptage de mélanocytes a alors été effectués par DOPA réaction, ce qui, dans ce cas-là, est possible compte tenu du délai existant entre la biopsie et l'utilisation des feuillets, et de la quantité d'échantillons disponibles pour l'analyse. Dans le cas présent, les cellules épidermiques isolées n'ont pas été mises en culture et le procédé a été effectué dans la journée (biopsie, fabrication du produit fini et greffe de cellules épidermiques autologues non cultivées) pour une simplification du procédé.

REFERENCES Gauthier, Y. and Surleve-Bazeille, J.E. (1992) Autologous grafting with noncultured melanocytes: a simplified method for treatment of depigmented lesions. J Am Acad Dermatol, 26, 191-194.

Guerra, L., Primavera, G., Raskovic, D., Pellegrini, G., Golisano, O., Bondanza, S., Paterna, P., Sonego, G., Gobello, T., Atzori, F., Piazza, P., Luci, A. and De Luca, M. (2003) Erbium:YAG laser and cultured epidermis in the surgical therapy of stable vitiligo. Arch Dermatol, 139, 1303-1310. Mulekar, S.V. (2003) Melanocyte-keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. Int J Dermatol, 42, 132-136. van Geel, N., Ongenae, K., De Mil, M., Haeghen, Y.V., Vervaet, C. and Naeyaert, J.M. (2004) Double-blind placebo-controlled study of autologous transplanted epidermal cell suspensions for repigmenting vitiligo. Arch Dermatol, 140, 1203-1208.15

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation d'une chaufferette pour maintenir la température d'une solution enzymatique entre 30 et 40°C pendant au moins 15 minutes.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la solution contient des cellules provenant d'un échantillon de tissu.
3. 3. Utilisation selon les revendications 1 et 2, dans laquelle la solution contient de la trypsine.
4. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium.
5. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la solution enzymatique a un volume compris entre 3 et 10 ml et est contenue dans une boîte de Petri de diamètre compris entre 7 et 11 cm ou un compartiment de ladite boîte, et en ce que la chaufferette est un disque dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm.
6. 6. Procédé de dissociation de cellules issues d'un échantillon de tissu, comportant les étapes suivantes : (i) initier la cristallisation dans une chaufferette constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium ; (ii) placer sur ladite chaufferette un récipient contenant une solution de trypsine de concentration comprise entre 0,2% et 1% ; (iii) placer l'échantillon de tissu dans ladite solution et laisser incuber au moins 10 minutes ; (iv) rincer l'échantillon de tissu.
7. 7. Procédé de préparation d'une suspension cellulaire appropriée pour une application cutanée sur un patient, comprenant les étapes suivantes : (i) soumettre un échantillon de tissu cutané comprenant des cellules appropriées pour une greffe à un patient, au procédé selon la revendication 6; (ii) récolter les cellules appropriées provenant de l'échantillon cutané et les mettre en suspension dans une solution ; et (iii) filtrer la solution obtenue à l'étape (ii) sur tamis cellulaire.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, comportant une étape supplémentaire d'ajout d'acide hyaluronique à la suspension cellulaire obtenue à l'étape (iii).
9. 9. Procédé selon les revendications 7 et 8, pour le traitement du vitiligo, caractérisé en ce qu'à l'étape (ii), les mélanocytes sont récupérés.
10. 10. Trousse pour application biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une chaufferette.
11. 11. Trousse selon la revendication 10, dans laquelle la chaufferette est constituée d'une pochette plastique hermétique contenant une solution aqueuse saturée en acétate de sodium en état de surfusion.
12. 12. Trousse selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend également une enzyme.
13. 13. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend également un récipient dont la base a la même géométrie que celle de la chaufferette.
14. 14. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour le traitement d'une biopsie, comprenant une solution de trypsine.
15. 15. Trousse selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, comprenant une chaufferette ronde dont l'épaisseur est comprise entre 3 et 7 mm et le diamètre est compris entre 7 et 11 cm, une boîte de Pétri compartimentée dont le diamètre est identique ou légèrement inférieur à celui de la chaufferette, un tamis cellulaire et de la trypsine.