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WO2013037818A2 - Getränke enthaltend glykolipide als konservierungsmittel - Google Patents

Getränke enthaltend glykolipide als konservierungsmittel Download PDF

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WO2013037818A2
WO2013037818A2 PCT/EP2012/067823 EP2012067823W WO2013037818A2 WO 2013037818 A2 WO2013037818 A2 WO 2013037818A2 EP 2012067823 W EP2012067823 W EP 2012067823W WO 2013037818 A2 WO2013037818 A2 WO 2013037818A2
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WO
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glycolipid
glycolipids
preservative
formula
beverage
Prior art date
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PCT/EP2012/067823
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French (fr)
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WO2013037818A3 (de
WO2013037818A9 (de
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Thomas Schloesser
Sven JAKUPOVIC
Werner KATZER
Grit KLUGE
Karsten Siems
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Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Publication date
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the invention relates to drinks containing glycolipids as natural preservatives and to processes for producing these drinks.
  • Preservatives are substances that protect a solid or liquid from spoiling due to microorganism attack.
  • microorganisms can be, for example, yeasts, molds, Gram-positive or Gram-negative bacteria.
  • infestation of foods by yeasts, molds or bacteria is prevented in order to ensure the safety of the products over a limited period of time.
  • Consumers' desire to consume a safe and limited-life food is offset by the desire for the greatest possible naturalness of the food. The consumer would like to forego the addition of chemically synthesized food additives.
  • natural alternatives to synthetic additives are increasingly being offered on the market.
  • a good example is the replacement of synthetic dyes in foods with dyes of natural origin.
  • Glycolipids are molecules in which one or more mono- or oligosaccharides are glycosidically bound to a lipid molecule.
  • the saccharide residue in the glycolipid is responsible for naming the various glycolipid classes. If, for example, the disaccharide sophorose is part of a glyco-lipid, it is called sophoroselipids.
  • sophoroselipids Also known in the literature are rhamnoselipids, trehaloselipids, cellobioselipids and mannosylerythritollipids.
  • Ustilago maydis (C7 maydis) is a fungus of the genus U-stilaginomycete that can infest corn plants. Especially in Mexico U. maydis is considered food and is eaten there as a delicacy.
  • the genus Pseudozyma is also a member of the Üsitilaginomyceten and is closely related to Ustilago.
  • R s is H or OH
  • R 7 is H or OH or -0
  • the beverage preferably contains as preservative a glycolipid of the formula (II)
  • Ri is H or COCH 3 represents
  • R 2 is the same or different and H or
  • R 3 is the same or different and is H or OH and
  • R 4 is OH or OCH 3
  • glycolipid or a salt of the glycolipid.
  • the beverage contains on its own a glycolipid of the formulas (III) to (XXV)
  • the salt is preferably an alkali or alkaline earth salt.
  • glycolipid of the formulas (XI), (XV), (IX) or (XIII) or one of their mixtures Preference is given to a glycolipid of the formulas (XI), (XV), (IX) or (XIII) or one of their mixtures, more preferably a glycolipid of the formulas (XI) or ⁇ XIII) or one of their mixtures, where again a Mixture of the glycolipids of the formulas (XI) and (XIII) is particularly preferred.
  • drinks contain at least one of said glycolipids in an amount of 10 to 4000 ppm.
  • drinks contain at least one of the glycolipids mentioned in each case in an amount of 10 to 1000 ppm.
  • drinks contain at least one of the glycolipids mentioned in each case in an amount of 10 to 100 ppm.
  • the beverages are juices, nectars, soft drinks, milk-based products, whey-containing drinks or yoghurt drinks.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the beverages according to the invention.
  • the glycolipids or mixtures of the glycolipids according to formula (I) or formula (II) to (XXV) are either added directly to the beverage or added to the beverage via preliminary solutions in water or ethanol.
  • a preliminary solution of the glycolipids or mixtures of the glycolipids in beverage bases or emulsion bases for drinks is possible.
  • the glycolipids or mixtures of the glycolipids are either added directly to the beverage base or beverage emulsion base, or to the beverage base or beverage base via pre-solutions in water or ethanol.
  • the glycolipids according to formulas (I) to (XVII) and ⁇ XXV) can be prepared by culturing the microorganism U. maydis in a nutrient medium, the glycolipids being formed by the microorganism and subsequently isolating the glycolipids from the medium and getting cleaned.
  • the glycolipids according to formulas (XVIII) to (XXIV) can be prepared by culturing the microorganism Pseudozyma sp. In a nutrient medium, wherein the glycolipids are formed by the microorganism and the glycolipids are subsequently isolated from the medium and purified.
  • the preparation of the glycolipids of the formulas (I) to (XVII) and (XXV) with the aid of a U. maydis strain is preferably carried out in a shake flask or a fermenter by methods known to the person skilled in the art.
  • the preparation of the glycolipids of the formulas (XVIII) to (XXIV) with the aid of a Pseudozyma sp, strain is preferably carried out in a shake flask or a fermenter by methods known to the person skilled in the art.
  • the carbon source is preferably sugar, sugar alcohols or organic acids. Glucose, lactose, sucrose, maltose, D-mannitol or glycerol are particularly preferably used as carbon sources.
  • the nitrogen source used is preferably ammonia, ammonium salts, amino acids, urea or protein hydrolysates.
  • salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron, and in trace ⁇ i. in ⁇ concentrations) salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper and nickel can be added.
  • organic acids e.g., acetate, citrate
  • amino acids e.g. L-isoleucine, D / L-methionine
  • vitamins e.g., vitamin B1, vitamin B6, vitamin B12
  • the pH of the medium during the cultivation is preferably in the pH range of 2.0 to 10.0, particularly preferred is a pH range of 2.0 to 8.5.
  • the incubation of the ü. aydis strain and the Pseudozyma sp. strain is preferably carried out under aerobic conditions, over a period of 20 h to 300 h and in the region of the optimum growth temperature for the respective strain.
  • the incubation temperature is preferably 20-35 ° C, particularly preferred is an incubation temperature of 24-30 ° C. Particularly preferred is a cultivation time between 24 and 150 h.
  • the glycolipids can be purified by a process in which the glycolipids formed during the fermentation are omasse and culture supernatant isolated, and the compounds according to formula (I) to (XXV) are purified by chromatography, by selective extraction or by crystallization.
  • glycolipids from biomass and culture supernatant takes place in a known manner, for example by separation, centrifugation, adsorption or membrane administration.
  • solvents for example methanol, acetone, ethanol, isopropanol, methyl acetate, ethyl acetate, CO 2 , propane, butane, hexane, dichloromethane or ethyl methyl ketone, which can be used for extraction.
  • methanol is used for extraction.
  • the biomass may also be mechanically such as e.g. be pretreated by high-pressure homogenization or ultrasound.
  • the purification of the compounds can be carried out by chromatographic methods known to those skilled in the art, selective extraction, ion exchange or crystallization. Preference is given first to a coarse separation by means of medium pressure chromatography (MPLC) and subsequent fine separation by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).
  • MPLC medium pressure chromatography
  • RP-HPLC reversed phase high performance liquid chromatography
  • the invention also relates to the use of a glycolipid according to formula (I) to (XXV) or one of its salts as preservative in beverages, the above-mentioned preference of the different glycolipids and amounts also apply here.
  • glycolipids of the formulas (II) to (XXV) or one of their salts as preservatives in beverages is particularly preferred.
  • glycolipids of the formulas (III) to (XXV) or one of their salts are particularly preferred as preservatives in beverages, very particularly preferably in juices, nectars, soft drinks, milk-containing products, whey-containing drinks and yoghurt drinks.
  • the U. maydia strain ACD 04507fxxx000Q0l was isolated in September 2010 from the fire spores of an affected corncob. The sample comes from the federal state of Brandenburg in Germany. The
  • the strain was maintained by freezing a suspension in a glycerol-containing freezing solution at -80 ° C.
  • the strain ACD 04507fxxxOOOQOl was on 02/2011 at the DSMZ ⁇ German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-381 2 Braunschweig) under the number DSM 25129 according to Budapest Treaty by the company Analyticon Discovery GmbH (Hermannswerder house 17, 14473 Potsdam, Germany ) deposited.
  • Example 2 Cultivation
  • special 500 mL Erlenmeyer flasks ⁇ 500 mL Erlenmeyer flasks with two opposing punctures; the punctures are about 2.5 cm long, placed between 2 and 3 cm above the bottom of the flask and at an angle of 30 ° C to the horizontal;
  • the preculture flasks were incubated on an orbital shaker with a 50 mm shaking radius at a shaking speed of 200 rpm and 24-25 ° C. for two days.
  • the main culture was carried out in just such Erlenmeyer flasks with 100 mL GLO1 medium (50 g / L glucose, 1.7 g / L Yeast Nitrogen base, pH 6.5, the glucose and Yeast Nitrogen Base solutions were separated autoclaved). The flasks were inoculated with 10 mL each of the preculture.
  • GLO1 medium 50 g / L glucose, 1.7 g / L Yeast Nitrogen base, pH 6.5, the glucose and Yeast Nitrogen Base solutions were separated autoclaved.
  • the flasks were inoculated with 10 mL each of the preculture.
  • the inoculated flasks were incubated on an orbital shaker with a 50 mm shaking radius at a shaking speed of 200 rpm and 24-25 ° C for five days.
  • Example 2 was harvested in 1 L TM 2-vial beakers and centrifuged in a Heraeus Sepatech centrifuge at 5300 g for 20 min. The sediment thus obtained was frozen and lyophilized. The extraction was carried out with methanol and was supported by 15 min treatment in an ultrasonic bath and shaking for 15 min. After a filter ration, the sediment was again extracted in the same way with methanol.
  • the isolation of the compounds contained was carried out by a two-step process.
  • the extract grown on Celite was fractionated by medium pressure chromatography (MPLC) on RP-18 (200 x 50 mm) with a gradient (methanol-water) of 57-90% methanol at a flow rate of 30 mL / min (see Table 1).
  • MPLC medium pressure chromatography
  • DSM 2498 and DSM 62841 were frozen at ⁇ 80 ° C and used directly; the titer of the frozen suspensions was determined by plating on agar plates.
  • the inoculum was prepared from single colonies of freshly grown agar plates, typically overnight cultures.
  • the titer of the inoculum suspension is determined approximately by measuring the absorbance at 625 nm. If this corresponds to the absorption of McFarland Standard 0.5, a titer of 10 8 is assumed.
  • the test is carried out in polystyrene 96-well plates with U-bottom. Test substances are typically dissolved in DMSO, DMSO water or water. Table 7:
  • the calculated titre of the strains after inoculation is reproduced in Table 7. Anaerobically growing strains are under seed; of the BD GasPak EZ Anaerobic System ⁇ BD, Tullastr. 8-12, 69126 Heidelberg, Germany). The BreathEasy film (Diversified Biotech, 65 Commerce Way, Dedham, MA 02026, USA) prevents contamination of adjacent fungal spores.
  • the growth is evaluated by means of a binocular and other optical aids.
  • Aa Alicyclobacillus acidoterrestris DSM
  • Gl Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
  • Aa Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
  • Gl Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
  • Example 5 Various microorganism strains were incubated as described in Example 5 in the presence of various concentrations of the glycolipids (XIII), (V), (VIII), (IX), (XI), (XXII) and the glycolipid mixture AW-048 , In contrast to Example 5, the microorganisms were incubated in beverage matrices. Table 10 lists the drinks used. By plating the inoculated drinks after 1 day, 1 week, 2 weeks and 4 weeks on suitable agar media, the preservative effect was checked. A substance was considered conservative if there was no increase in cell titer for 4 weeks. The mycel-forming fungi were additionally examined by binocular for hyphae growth.
  • Table 11 gives an overview of the preservative effects of the glycolipids and glycolipid mixtures.
  • Vitaperle energy 111 g / L sugar taurine, caffeine, B vitamins, carbon dioxide
  • Aa ⁇ licyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
  • 25, 100, 300 ... preserving effect at a concentration of 25, 100, 300 ... ⁇ g / mL; > 600,> 1800 no preserving effect at the maximum used concentration of 600 ⁇ g / mL or 1800 g / mL
  • the pseudozyma sp. Strain ACD 01658f xxOOOOll was isolated from a soil sample in December 2002. The sample comes from the Rift Valley in Kenya. The strain was maintained by freezing a suspension in a glycerol-containing freezing solution at -80 ° C.
  • strain ACD 01658f xxOOOOll was on 20.06.2012 at the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,
  • Example 9 was shaken after addition of about 5 volume percent Diaion HP20 adsorbent after 45 minutes and then harvested in 1 L centrifuge beaker and centrifuged in a Heraeus Sepatech centrifuge at 5300 g for 20 min. The sediment thus obtained was extracted twice with acetone. The extraction was carried out with 15 min treatment in an ultrasonic bath and shaking for 15 min. After filtration, the sediment was again extracted in the same way with acetone.
  • the extract grown on Celite was fractionated by medium pressure chromatography (MPLC) on RP-18 (200 ⁇ 50 mm) with a gradient (methanol-water) of 57-90% methanol at a flow rate of 30 ml / min (see Table 12) ).
  • MPLC medium pressure chromatography
  • the biomass sediment centrifuged from the fermentation of Ustilago maydis contains Ustilagin yarnren and Ustilipide.
  • the extraction with solvent, the precipitation from aqueous solution and a subsequent enrichment of the urstilaginic acids by degreasing were carried out to remove the ustilipids.
  • the extract is mixed with 50 ° C warm methanol, filtered and the resulting extract reduced in volume. After addition of 9 times the volume of water (preheated to 50 ° C.) precipitation takes place by cooling to room temperature and position. for two days at 4 ° C.
  • the urstilagic acid-containing precipitate is separated by means of a centrifuge, washed with cold water and dried after repeated degreasing with methyl tert-butyl ether (MTBE).
  • MTBE methyl tert-butyl ether
  • Example 13 Analytical data for AW-048 product
  • the content determination by HPLC-ELSD method gives> 99% U-stilaginic acids in total.
  • 1 shows the HPLC ELSD chromatogram of an enriched urstilagic acid fraction (glycolipid mixture AW-048 product).
  • Example 15 Olfactory assessment of the glycolipid-containing product AW-048
  • Example 16 Taste assessment of a solution of the substance NP-018256 (XI) Substance NP-018256 (purity 98.4% according to HPLC method 3, tabular details see above) was dissolved in a concentration of 50 ppm in still mineral water with heating to 60 ° C. The prepared solution, after cooling to room temperature, was evaluated by nine test persons according to the "taste-and-spit" method, and as a result, two subjects found no difference in comparison to water, and two more subjects described the solution as neutral Five subjects were able to differentiate the solution from water, the taste was not described as unpleasant, and the substance did not adversely affect the taste of beverages at the concentration tested.
  • Example 17 Taste Assessment of AE-048 in Drinks AW-048 solutions of 50 ppm were prepared in various beverages as described in Example 15 for water. In addition to an apple spritzer, an orange platter and an ice tea, an energizer drink and a drink whey were also used. Three subjects were unable to discriminate between the original drinks and drinks with AW-048. In summary it could be stated that no taste impairment of the drinks by AW-048 takes place.
  • Example 18 Preparation of an apple spritzer with AW-048
  • Example 22 Preparation of a drinking whey with AW-048
  • Example 25 Preparation of an Energydrink Basic Substance with AW-

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Getränk enthaltend als natürliches Konservierungsmittel ein Glykolipid der Formel (I), oder n = 2 ist, R1 gleich oder verschieden ist und H oder COCH3 bedeutet, R2 gleich oder verschieden ist und H oder (a) bedeutet, wobei m 1, 2 oder 3 ist, R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und R4 OH oder OCH3 bedeutet, R5 H oder (b) oder (a) bedeutet, wobei m 1, 2 oder 3 ist, R6 H oder OH bedeutet, R7 H oder OH oder =0 bedeutet oder ein Salz des Glykolipids.

Description

Getränke enthaltend Glykolipide als Konservierungsmittel
Die Erfindung betrifft Getränke, enthaltend Glykolipide als natürliche Konservierungsmittel sowie Verfahren zur Herstellung dieser Getränke.
Konservierungsmittel sind Stoffe, die einen Feststoff oder eine Flüssigkeit vor dem Verderb infolge eines Befalls durch Mikroorganismen schützen. Diese Mikroorganismen können beispielswei- se Hefen, Schimmelpilze, grampositive oder gramnegative Bakterien sein. Besonders in der Lebensmittelindustrie rauss ein Befall von Lebensmitteln durch Hefen, Schimmelpilze oder Bakterien verhindert werden um eine Sicherheit der Produkte über einen begrenzten Zeitraum zu gewährleisten. Dem Wunsch der Verbraucher, ein sicheres und begrenzt haltbares Lebensmittel zu konsumieren, steht der Wunsch nach größtmöglicher Natürlichkeit des Lebensmittels entgegen. Der Verbraucher würde gerne auf den Zusatz von chemisch synthetisierten Zusatzstoffen in Lebensmitteln verzichten. So werden auf dem Markt immer häufiger natür- liehe Alternativen zu synthetischen Zusatzstoffen angeboten. Ein gutes Beispiel ist der Austausch von synthetischen Farbstoffen in Lebensmitteln durch Farbstoffe natürlichen Ursprungs . Im Bereich der Konservierung von Lebensmitteln werden bisher natürliche Konservierungsmittel nur in sehr eingeschränkten Spezialanwendungen eingesetzt. Dies liegt an den schlechten sensorischen Eigenschaften der entsprechenden Substanzen oder Extrakte. Besonders in der Getränkeindustrie spielt die Senso- rik eines Produkts eine entscheidende Rolle. Aus diesem Grund ist es bisher nicht gelungen natürliche Alternativen zu den chemisch synthetisierten Konservierungsstoffen Sorbinsäure und Benzoesäure in Getränken zu etablieren. Glykolipide sind Moleküle, bei denen ein oder mehrere Mono- o- der Oligosaccharide glykosidisch an ein Lipid-Molekül gebunden sind. Der Saccharid-Rest im Glykolipid ist für die Namensgebung der verschiedenen Glykolipid-Klassen verantwortlich. Ist beispielsweise das Disaccharid Sophorose Bestandteil eines Glyko- lipids, spricht man von Sophoroselipiden. Literaturbekannt sind weiterhin Rhamnoselipide , Trehaloselipide, Cellobioselipide und Mannosylerythritollipide .
Ustilago maydis (C7. maydis) ist ein Pilz aus der Klasse der U- stilaginomyceten, der Maispflanzen befallen kann. Vor allem in Mexico gilt U. maydis als Nahrungsmittel und wird dort als Delikatesse verzehrt. Die Gattung Pseudozyma gehört ebenfalls zu den üsitilaginomyceten und ist mit Ustilago nahe verwandt.
Aus EP1 15538 ist bekannt dass sich Backwaren durch Rhamnolipi - de konservieren lassen. Aus US2698843 ist bekannt, dass das Cellobioselipid Ustilagin- säure antibiotische Wirksamkeit besitzt.
Die Biosynthese der Ustilaginsäure sowie die Verwendung als A- gens zur biologischen Kontrolle des pflanzenpathogenen Pilzes Botrytis cinerea sind in der Dissertation von Beate Teichmann (http : //archiv . ub . uni- marburg . de/opus / rontdoor . php?source gpus=2342&la=de) beschrieben. In der Publikation von Ross (Appl . Microbiol . 1958, 6(4):268- 73) ist ein Screening von potentiell antimikrobiellen Substanzen beschrieben bei dem auch Ustilaginsäure verwendet wurde, die allerdings keine konservierende Wirkung im Test zeigte. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Getränken, die durch ein natürliches Konservierungsmittel konserviert werden, und die bekannten sensorischen Nachteile be~ kannter natürlicher Konservierungsmittel nicht aufweisen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Getränk enthaltend als natürliches Konservierungsmittel ein Glykolipid der Formel (I)
Figure imgf000005_0001
oder n = 2 ist gleich oder verschieden ist und H oder COCH3 bedeutet gleich oder verschieden ist und H oder
Figure imgf000005_0002
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist,
gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
OH oder OCH3 bedeutet
H oder
Figure imgf000005_0003
oder
Figure imgf000006_0001
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist,
Rs H oder OH bedeutet
R7 H oder OH oder -0 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids . Bevorzugt enthält das Getränk als Konservierungsmittel ein Gly- kolipid der Formel (II)
Figure imgf000006_0002
(II)
wobei
Ri H oder COCH3 bedeutet
R2 gleich oder verschieden ist und H oder
Figure imgf000006_0003
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist,
R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
R4 OH oder OCH3 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids .
Besonders bevorzugt enthält das Getränk als on ervierungsmit- tel ein Glykolipid der Formeln (III) bis (XXV)
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
oder ein Salz der genannten Verbindungen.
Bei dem Salz handelt es sich vorzugsweise um ein Alkali- oder ein Erdalkalisalz.
Bevorzugt handelt es sich um ein Glykolipid der Formeln (XI) , (XV) , (IX) oder (XIII) oder eines ihrer Gemische, besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (XI) oder {XIII) oder eines ihrer Gemische, wobei wiederum ein Gemisch der Glykolipide der Formeln (XI) und (XIII) insbesondere bevorzugt ist.
Vorzugsweise enthalten Getränke mindestens eines der genannten Glykolipide jeweils in einer Menge von 10 bis 4000 ppm. Besonders bevorzugt enthalten Getränke mindestens eines der genannten Glykolipide jeweils in einer Menge von 10 bis 1000 ppm.
Insbesondere bevorzugt enthalten Getränke mindestens eines der genannten Glykolipide jeweils in einer Menge von 10 bis 100 ppm .
Bevorzugt handelt es sich bei den Getränken um Säfte, Nektare, Erfrischungsgetränke, milchhaltige Produkte, molkehaltige Getränke oder Joghurtgetränke.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Getränke. Bei diesem Verfahren werden die Glykolipide oder Gemische der Glykolipide gemäß Formel (I) bzw. Formel (II) bis (XXV) entweder direkt in das Getränk gegeben oder über Vorlösungen in Wasser oder Ethanol dem Getränk zugegeben. Weiterhin ist eine Vorlösung der Glykolipide oder Gemische der Glykolipide in Getränkegrundstoffen oder Emulsions- grundstoffen für Getränke möglich. Auch bei den Getränkegrund- Stoffen oder Emulsionsgrundstoffen für Getränke werden die Gly- kolipide oder Gemische der Glykolipide entweder direkt in den Getränkegrundstoff oder Emulsionsgrundstoff für Getränke gegeben oder über Vorlösungen in Wasser oder Ethanol dem den Ge- tränkegrundstoff oder Emulsionsgrundstoff für Getränke zugegeben .
Die Glykolipide gemäß Formeln (I) bis (XVII) und {XXV) lassen sich dadurch herstellen, dass der Mikroorganismus U. maydis in einem Nährmedium kultiviert wird, wobei die Glykolipide durch den Mikroorgani mus gebildet werden und die Glykolipide anschließend aus dem Medium isoliert und gereinigt werden.
Die Glykolipide gemäß Formeln (XVIII) bis (XXIV) lassen sich dadurch herstellen, dass der Mikroorganismus Pseudozyma sp.-in einem Nährmedium kultiviert wird, wobei die Glykolipide durch den Mikroorganismus gebildet werden und die Glykolipide anschließend aus dem Medium isoliert und gereinigt werden. Die Herstellung der Glykolipide der Formeln (I) bis (XVII) und (XXV) mit Hilfe eines U. maydis- Stammes erfolgt vorzugsweise in einem Schüttelkolben oder einem Fermenter nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Herstellung der Glykolipide der Formeln (XVIII) bis (XXIV) mit Hilfe eines Pseudozyma sp, -Stammes erfolgt vorzugsweise in einem Schüttelkolben oder einem Fermenter nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Als Kohlenstoff -Quelle dienen vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren. Besonders bevorzugt werden als Kohlenstoff -Quellen Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, D- Mannit oder Glycerin eingesetzt. Als Stickstoff -Quelle werden vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze, Aminosäuren, Harnstoff oder Proteinhydrolysate verwendet .
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren {d.h. in μΜ Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zuge- setzt werden.
Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat) , Aminosäuren {z.B. L-Isoleucin, D/L-Methionin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6, Vitamin B12) dem Medium zugesetzt werden.
Als komplexe Nährstoffquellen können z.B. Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojamehl oder Hefeextrakt zum Einsatz kommen. Der pH-Wert des Mediums liegt während der Kultivierung bevorzugt im pH-Bereich von 2,0 bis 10,0 besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von 2,0 bis 8,5.
Die Inkubation des ü. aydis-Stammes und des Pseudozyma sp.- Stammes erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, über einen Zeitraum von 20 h bis 300 h und im Bereich der für den jeweiligen Stamm optimalen Wachstumstemperatur. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 20 - 35 °C, besonders bevorzugt ist eine Inkubationstemperatur von 24 - 30 °C. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungs2eit zwischen 24 und 150 h.
Die Glykolipide lassen sich reinigen durch ein Verfahren, bei dem die während der Fermentation gebildeten Glykolipide aus Bi- omasse und Kulturüberstand isoliert, extrahiert und die Verbindungen gemäß Formel (I) bis (XXV) chromatographisch, durch selektive Extraktion oder durch Kristallisation aufgereinigt werden.
Die Isolation der Glykolipide aus Biomasse und Kulturüberstand erfolgt in bekannter Art, beispielsweise durch Separation, Zentrifugation, Adsorption oder Membranverf hren. Dem Fachmann sind verschiedene Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Aceton, Ethanol, Isopropanol, Methylacetat , Ethyl- acetat, C02, Propan, Butan, Hexan, Dichlormethan oder Ethylme- thylketon bekannt, die zur Extraktion eingesetzt werden können. Bevorzugt wird Methanol 2ur Extraktion eingesetzt.
Neben den genannten chemischen Aufschlussmethoden kann die Biomasse auch mechanisch wie z.B. durch Hochdruckhomogenisation oder Ultraschall vorbehandelt werden. Die Reinigung der Verbindungen kann durch dem Fachmann bekannte chromatographische Methoden, selektive Extraktion, lonenaus- tauschverfahren oder Kristallisation durchgeführt werden. Bevorzugt ist zunächst eine grobe Trennung durch eine Mittel - druckchromatographie (MPLC) sowie eine anschließende Feintren- nung durch eine Reversed-Phase-Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) .
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Verbindungen sehr gute konservierende Eigenschaften insbesondere auch gegenüber klassischen Getränkeverderbern wie Alicyclobacillus acidoter- restris , Gluconacetobacter liquefaciens , Lactobacillus planta¬ ren, Weissella confusa, Brettano yces naardenensis, Aspergillus brasiliensis , Penicillium expansum und Zygosaccharo yces rouxii besitzen und nicht die sensorischen Nachteile anderer natürlicher Konservierungsmittel aufzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Glykolipids gemäß Formel (I) bis (XXV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel in Getränken, wobei die bereits genannte Bevorzugung der verschiedenen Glykolipide und Mengen auch hier gilt.
Besonders bevorzugt ist daher die Verwendung der Glykolipide der Formeln (II) bis (XXV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel in Getränken.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der Glykolipide der Formeln (III) bis (XXV) oder eines ihrer Salze als Konservie- rungsmittel in Getränken, ganz besonders bevorzugt in Säften, Nektaren, Erfrischungsgetränken, milchhaltigen Produkten, molkehaltigen Getränken und Joghurtgetränken.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Hr- findung.
Beispiel 1: S ammisolierung
Der U. maydia- Stamm ACD 04507fxxx000Q0l wurde im September 2010 aus Brandsporen eines befallenen Maiskolbens isoliert. Die Pro- be stammt aus dem Bundesland Brandenburg in Deutschland. Die
Haltung des Stammes erfolgte durch Einfrieren einer Suspension in einer Glycerol-haltigen Einfrierlösung bei -80°C.
Der Stamm ACD 04507fxxxOOOQOl wurde am 02.09.2011 bei der DSMZ {Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-381 2 Braunschweig) unter der Nummer DSM 25129 gemäß Budapester Vertrag von der Firma Analyticon Discovery GmbH (Hermannswerder Haus 17, 14473 Potsdam, Deutschland) hinterlegt. Beispiel 2 : Kultivierung
ACD 04507fxxx000001 wurde auf einem MA-Agarmedium (30 g/L Malzextrakt, 15 g/L Agar agar, pH = 7,0) bei 24 - 25°C revitali- siert. Zur Vorkultur wurden spezielle 500 mL Erlenmeyer-Kolben {500 mL Erlenmeyer-Kolben mit zwei gegenüberliegenden Einstichen; die Einstiche sind etwa 2,5 cm lang, zwischen 2 und 3 cm über dem Boden des Kolbens und in einem Winkel von 30 °C zur Horizontalen angeordnet; Die Kolben werden mit Polyurethan- Schaumstopfen von 50 mm Länge und 40 mm Durchmesser steril ver- schlössen) mit jeweils 100 mL MAT-Medium (30 g/L Malzextrakt, 1 g/L Agar agar, 0,2 Volumenprozent Tween 85, pH = 7,0) durch drei bis vier bewachsene Agarstücke von 11 Tage alten Agarplat- ten beimpft.
Die Vorkulturkolben wurden auf einem Orbitalschüttler mit 50 mm Schüttelradius bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 rpm und 24 - 25 °C zwei Tage inkubiert.
Die Hauptkultur erfolgte in ebensolchen Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 mL GLOl-Medium (50 g/L Glucose, 1,7 g/L Yeast Nit- rogen Base, pH 6,5; die Glucose- und Yeast Nitrogen Base- Lösungen wurden getrennt autoklaviert) . Beimpft wurden die Kolben mit jeweils 10 mL der Vorkultur.
Die beimpften Kolben wurden auf einem Orbitalschüttler mit 50 mm Schüttelradius bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 rpm und 24 - 25 °C fünf Tage inkubiert.
Beispiel 3: Ernte und Extrak berei ung
126 Kolben der Hauptkultur gem. Beispiel 2 wurden in 1 L™ 2entrifugenbecher geerntet und in einer Heraeus Sepatech Zentrifuge bei 5300 g für 20 min zentrifugiert . Das so gewonnene Sediment wurde eingefroren und lyophilisiert. Die Extraktion erfolgte mit Methanol und wurde durch 15 min Behandlung im Ultraschallbad und 15 min schütteln unterstützt. Nach einer Filt- ration wurde das Sediment nochmals auf gleiche Weise mit Methanol extrahiert .
Durch die zweimalige Extraktion wurden 3300 mL einer Lösung erhalten, die 83,7 g Feststoffe enthielt. Der Extrakt wurde nach Zugabe von 168 g Celite getrocknet.
Beispiel 4: Isolierung
Die Isolierung der enthaltenen Verbindungen erfolgte durch ein zweistufiges Verfahren.
1. Stufe : Vor xennung mittels MPLC
Der auf Celite aufgezogene Extrakt wurde durch Mitteldruckchromatographie (MPLC) an RP-18 (200 x 50 mm) mit einem Gradient (Methanol-Wasser) von 57 - 90 % Methanol bei einer Flussrate von 30 mL/min aufgetrennt (siehe Tabelle 1} .
Tabelle 1: Relevante Fraktionen der MPLC-Trennung
FrakVolumen Ausbeute Bewertung
tion [mL] [g]
A 1000 < 24,23
B 750 1,21
C 750 präparative HPLC, als C~
1,28 1237-C
D 750 präparative HPLC, als C-
8 , 47 1237-D
Ξ 750 präparative HPLC, als C-
17, 08 1237-E und C-1237-R
F 750 15, 98
G 750 9, 73
I 750 5, 04
K 600 0, 67 2. Stufe: Feintrennung mittels präparativer RP-HPLC
Zur Isolierung der enthaltenen Verbindungen wurden jeweils max 3,50 g der PLC-Fraktionen, die bei der Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) wachstumshemmende Wirkung gegen die Testkeime zeigten, über präparative HPLC mittel der in den Tabellen 2 bis 4 beschriebenen Methoden getrennt.
Tabelle 2: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-C
Stationäre Phase LiChrospher Select B, 10 pm, 250 x
50 mm
Flußrate 80 mL/min
Detektion Evaporative Light Scattering Detector
{ ELSD) , UV-Detektor
Laufmittel A Bidest. Wasser + 5 ni Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (pH 3)
Laufmittel B Acetonitril/ ethanol - 1:1 + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (pH 3)
Gradient von 32 % auf 66 % B in 57,7 min
Tabelle 3: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-D
Stationäre Phase LiChrospher Select B, 10 pm, 250 x
50 mm
Flußrate SO mL/min
Detektion ELSD , UV
Laufmittel A Bidest. Wasser + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (pH 3)
Laufmittel B Acetonitril/Methanol = 1:1 + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure {pH 3)
Gradient von 52 % auf 74 % B in 57,7 min Tabelle 4: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-E und -R
Figure imgf000021_0001
Die isolierten Feinfraktionen wurden per HPLC (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode ltt tabellarisch dargestellt) , LC/MS (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode 2" tabellarisch dargestellt) und NMR- Spektroskopie charakterisiert und die analytischen Daten zur Klärung der Strukturen genutzt.
Methode 1: Analytisches HPLC-ELSD™Verfahren
HPLC System Merck Hitachi
Daten System HPLC-Manager D-7000 HSM
Stationäre Merck Superspher 60 RP-select B 125 x 4 Phase mra, 4 pra
Flußrate 1 mL/min
Detektion ELSD (Sedex 75)
Injektions- 10 L
volumen
Mobile PhaA: 5 mM Ammoniumfortniat und 0,1 % Ameisense : säure
B: Acetonitril/Methanol = 1:1, Zusatz von 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (pH 3)
Gradient Zeit [min] % A % B
0 85 15
15 0 100
18 0 100
Methode 2: Analytisches LC/MS-Verfahren
Figure imgf000023_0001
In der folgenden Tabelle 5 sind die Ergebnisse 2U Feintrennungen zusammengestellt.
Tabelle 5: Mengen und Reinheit der Chargen zu den relevanten Strukturen aus C-1237
Figure imgf000024_0001
Beispiel 5 : Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
Die Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität erfolgte im
Broth-Dilution-Test und wurde in Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit U-Boden durchgeführt. Dieses Verfahren wurde auch zur Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) eingesetzt. Die verwendeten Mikroorganismen sind in Tabelle 6 aufgelistet . Tabelle 6: Verwendete Mikroorga:
Figure imgf000025_0001
Zur Inokulumproduktion wurden Sporen von DSM 1988, DSM 2498 und DSM 62841 bei ~80°C eingefroren und direkt verwendet; der Titer der gefrorenen Suspensionen wurde durch ausplattieren auf Agar- platten bestimmt.
Bei den anderen Stämmen wurde das Inokulum aus Einzelkolonien frisch bewachsener Agarplatten, typischerweise Übernachtkultu- ren, hergestellt. Der Titer der Inokulumsuspension wird näherungsweise durch Messung der Absorption bei 625 nm bestimmt. Entspricht diese der Absorption von McFarland-Standard 0.5, wird ein Titer von 108 angenommen. Der Test wird in Polystyrol - 96 -well-Platten mit U-Boden durchgeführt. Testsubstanzen werden typischerweise in DMSO, DMSO- Wasser oder Wasser gelöst. Tabelle 7:
Zusammenfassung und Übersicht hinsichtlich der Testbedingungen
Figure imgf000026_0001
Der rechnerische Titer der Stämme nach Inokulation ist in Ta~ belle 7 wiedergegeben. Anaerob wachsende Stämme werden unter Einsät.; des BD GasPak EZ Anaerobe System {BD, Tullastr. 8-12, 69126 Heidelberg, Deutschland) inkubiert. Durch die BreathEasy- Folie (Diversified Biotech, 65 Commerce Way, Dedham, MA 02026, USA) wird die Kontamination von benachbarten Wells mit Pilz- sporen verhindert.
Die Auswertung des Wachstums erfolgt mittels Binokular und anderer optischer Hilfsmittel.
Nähr- und Testmedien:
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0001
Anleitung zur Herstellung von AAMA:
Figure imgf000028_0002
PDA:
Figure imgf000028_0003
Figure imgf000028_0001
MESA:
Figure imgf000029_0001
TM186:
Figure imgf000029_0002
WAC08:
Bestandteil Lieferant [g L]
1 Sabouraud Dextrose Di fco 12, 0 Broth 238230
2 Glucose Roth HNO6 7,0
3 Fructose Diasan 15, 0
4 Saccharose Handels15, 0 ware
Demineralisiertes 1000 mL Wasser
6 pH-Wert pH 4,5 AC14
Figure imgf000030_0001
Anleitung zur Herstellung von WAC14 :
Lösung A und Lösung B getrennt autoklavieren.
1)
2) Nach dem Autoklavieren Lösung B in die Gefäße mit Lösung A zugeben und homogenisieren.
3} Medium in sterile Gefäße dispensieren. Beispiel 6: Antimikrobielle Aktivität der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E
Verschiedene Mikroorganismen-Stämme wurden, wie in Beispiel 5 ausgeführt, unter Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Fraktionen C-1237-C, 01237-D und C-1237-E inkubiert. In Tabel- le 8 sind die MIC-Werte der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E und in Tabelle 9 die MIC-Werte der isolierten Glykoli- pide (II) bis (XI) für die einzelnen Mikroorganismen aufgelis- tet.
Tabelle 8: MIC-Werte der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C- 1237-E
Figure imgf000031_0001
Aa = Alicyclobacillus acidoterrestris DSM
Gl = Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
Lp = Lactobacillus plantarum DSM 20174
Pe = Penicillium expansum DSM 62841
Zr = Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525
Tabelle 9: MIC-Werte der Glykolipide (III) bis (XXV) in g/raL
Figure imgf000032_0001
Aa = Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
Gl = Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
Lp = Lactobacillus plantarum DSM 20174
Pe = Penicillium expansum DSM 62841
Zr = Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525 Beispiel 7: Konservierende Wirkung im Konservierungsbelastungs- test
Verschiedene Mikroorganismen-Stämme wurden, wie in Beispiel 5 ausgeführt, unter Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Glykolipide (XIII), (V), (VIII), (IX), (XI), (XXII) sowie dem Glykolipid-Gemisch AW-048 inkubiert. Im Unterschied zu Beispiel 5 wurden die Mikroorganismen in Getränkematrices inkubiert. In Tabelle 10 sind die verwendeten Getränke aufgelistet. Durch ausplattieren der inokulierten Getränke nach 1 Tag, 1 Woche, 2 Wochen und 4 Wochen auf geeigneten Agarmedien wurde die konservierende Wirkung überprüft. Als konservierend wurde eine Substanz angesehen, wenn es über 4 Wochen zu keiner Zunahme des Zelltiters kam. Die mycelbildenden Pilze wurden zusätzlich mittels Binokular auf Hyphenwachstum untersucht.
Tabelle 11 gibt einen Überblick über die konservierende Wirkung der Glykolipide und Glykolipid-Gemische .
Tabelle 10: Im Konservierungsbelastungstest eingesesetzte Getränkematrices
Getränk Zuckergehalt Besondere Zusätze
Apfelschorle cT g/L Zucker Kohlensäure
(Adelholzener)
Nestea® 69 g/L Zucker Citronensäure, Na-
Pfirsich Geschmack Citrat, Teeextrakt
Orangen-Nektar 83 g/L Zucker Ascorbinsäure
(Frucht Oase)
Bio Trinkmolke 117 g/L Kohkit Süßmolke, Zitronen- Orange -Maracuj a lenhydrate saftkonz., Pektin, Jo- (Andechser) hannisbrotkernmehl
Vitaperle energy 111 g/L Zucker Taurin, Koffein, B- Vitamine, Kohlensäure
Orangensaft (Sonniger) , unverdünnter
aentrifugiert , überSaft:
stand 1:1 mit Wasser 93 g/L Zucker
verdünnt Tabelle 11: Ergebnisse im Konservierungsbelastungstest
Figure imgf000034_0001
Legende :
Stämme :
Aa = Älicyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
Gl - Gluconacetobacter li uefaciens DSM 5603
Lp = Lactobacillus plantarum DSM 20174
Pe = Penicillium expansum DSM 62841
Zr = Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525
Bn = Brettanomyces naardenensis CBS 6115
Ab = Aspergillus brasiliensis DSM 1988
Wc = Weissella confusa DSM 20194
Matrices :
AP = Apfelschorle
02 = Orangensaft 1 : 1 verdünnt
ON = Orangennektar
TM = Trinkmolke
ET = Nestea* Eistee VE = Vitaperle Energy (Details siehe Tabelle 10)
Zahlenwerte :
25, 100, 300 ... = konservierende Wirkung bei einer Konzentration von 25, 100, 300 ... μg/mL; >600, >1800 keine konservierende Wir- kung bei der maximalen eingesetzten Konzentration von 600 μg/mL bzw. 1800 g/mL
Beispiel 8: Stammisolierung
Der Pseudozyma sp. -Stamm ACD 01658f xxOOOOll wurde im Dezember 2002 aus einer Bodenprobe isoliert. Die Probe stammt aus dem Rift Valley in Kenia. Die Haltung des Stammes erfolgte durch Einfrieren einer Suspension in einer Glycerol -haltigen Einfrierlösung bei -80°C.
Der Stamm ACD 01658f xxOOOOll wurde am 20.06.2012 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 26076 gemäß Budapester Vertrag von der Firma Analyticon Discovery GmbH (Hermanns- werder Haus 17, 14473 Potsdam, Deutschland) hinterlegt. Beispiel 9: Kultivierung
ACD 01658fxxxO 00011 wurde auf einem MA-Agarmedium (30 g/L Malzextrakt, 15 g/L Agar agar, pH = 7,0) bei 30°C revitalisiert . Von der revitalisierten Kultur wurde die Vorkultur mit drei bis vier bewachsenen Agarstücken beimpft. Die Vorkultur wurde in einer 500 mL~Laborflasche mit 125 mL Malzextrakt -Weichagar (30 g/L Malzextrakt, 2,75 g/L Agar agar, pH = 7,0) und Raschigrin- gen von etwa 50 mL Schüttvolumen statisch bei 30°C inkubiert und alle 2 bis 3 Tage durch Schütteln homogenisiert.
Die Hauptkultur erfolgte in speziellen 500 mL Erlenmeyer-Kolben (500 mL Erlenmeyer-Kolben mit zwei gegenüberliegenden Einstichen; die Einstiche sind etwa 2,5 cm lang, zwischen 2 und 3 cm über dem Boden des Kolbens und in einem Winkel von 30 °C zur Horizontalen angeordnet; die Kolben werden mit Polyurethan- Schaumstopfen von 50 mm Länge und 40 mm Durchmesser steril verschlossen) mit jeweils 200 mL SGCHl-Medium (10 g/L Ii- Glutaminsäure Mononatriumsalz Monohydrat, 30 g/L Saccharose, 0,15 g/L di- aliumhydrogenphosphat , 0,4 g/L Kaliumchlorid, 0,05 g/L Magnesiumsulfat Heptahydrat, 0,5 g/L Hefeextrakt, 25 mL einer Spurenelementelösung und 2,0 g/L Calciumcarbonat. Vor Zugabe des Calciumcarbonats wurde der pH-Wert mit 1 M Salzsäure auf pH = 6,5 eingestellt. Die Spurenelementelösung enthält pro Liter 0,01 M Schwefelsäure 1,5 g FeS04 x 7 H20, 0,9 g ZnS04 x 7 H20, 0,4 g MnS04 x H20, 0,55 g CuS04 x 5 H20, 0,6 g Co(N03)2x 6 H20, 0,25 g Borsäure und 0,2 g Na2Mo04 x 2 H20) Die Hauptkulturkolben wurden mit 2,5 mL homogenisierter Vorkultur pro Erlene- meyer-Kolben beimpft und auf einem Orbitalschüttler mit 50 mm Schüttelradius bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 rpm und 24 - 25 °C sieben Tage inkubiert,
Beispiel 10 : Ernte und Extraktbereitung
50 Kolben der Hauptkultur gem. Beispiel 9 wurden nach Zugabe von etwa 5 Volumenprozent Diaion HP20-Adsorberharz nach 45 Mi- nuten geschüttelt und danach in 1 L-Zentrifugenbecher geerntet und in einer Heraeus Sepatech Zentrifuge bei 5300 g für 20 min zentrifugiert . Das so gewonnene Sediment wurde zweimal mit Aceton extrahiert. Die Extraktion erfolgte mit 15 min Behandlung im Ultraschallbad und 15 min schütteln. Nach einer Filtration wurde das Sediment nochmals auf gleiche Weise mit Aceton extrahiert .
Durch die zweimalige Extraktion wurden 2650 mL einer Lösung erhalten, die 25,4 g Feststoffe enthielt. Der Extrakt wurde nach Zugabe von 51 g Celite getrocknet.
Beispiel 11: Isolierung
Die Isolierung der enthaltenen Verbindungen erfolgte durch ein zweistufiges Verfahren. 1. Stufe: Vortrennung mittels PLC
Der auf Celite aufgezogene Extrakt wurde durch Mitteldruckchromatographie {MPLC) an RP-18 {200 x 50 mm) mit einem Gradi- ent (Methanol -Wasser) von 57 - 90 % Methanol bei einer Flussrate von 30 mL/min aufgetrennt (siehe Tabelle 12) .
Tabelle 12: Relevante Fraktionen der MPLC-Trennung
Figure imgf000037_0001
2. Stufe: Feintrennung mittels präparativer RP-HPLC
2ur Isolierung der enthaltenen Verbindungen wurden die MPLC- Fraktionen sinnvoll vereinigt und über präparative HPLC mittels der in den Tabellen 13 bis 14 beschriebenen Methoden getrennt. Tabelle 13: Trennungsbedingungen der Fraktion H-0695-C
Figure imgf000038_0001
Die isolierten Feinfraktionen wurden per HPLC (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode 3" tabellarisch dargestellt) , LC/MS (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode 4" tabell risch dargestellt) und NMR- Spektroskopie charakterisiert und die analytischen Daten zur Klärung der Strukturen genutzt. Methode 3: Analytisches HPLC-ELSD-Verfahren
HPLC System Merck Hitachi
Daten System HPLC-Manager D-7000 HSM
Stationäre Merck Superspher 60 RP-select B 125 x 4 Phase mm, 4 pm
Flußrate 1 mL/min
Detektion ELSD (Sedex 75}
Injektions10 L
volumen
Mobile PhaA: 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisense : säure
B: Acetonitril/Methanol = 1:1, Zusatz von 5 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (pH 3)
Gradient Zeit [min] % A % B
0 85 15
15 0 100
18 0 100
Methode 4: Analytisches LC/MS -Verfahren
Figure imgf000040_0001
In der folgenden Tabelle 15 sind die Ergebnisse zu Feintrennungen zusammengestellt. Tabelle 15: Mengen und Reinheit der Chargen zu den für das Patent relevanten Strukturen aus H-0695
Figure imgf000041_0001
Beispiel 12: Downstream processing (Produktion des AW-048 Produktes)
Das aus der Fermentation von Ustilago maydis abzentrifugierte Biomassesediment enthält Ustilaginsäuren und Ustilipide. Zur Aufreinigung der Ustilaginsäuren wurde die Extraktion mit Lö- sungsmittel, die Fällung aus wässriger Lösung und eine nachfolgende Anreicherung der Ustilaginsäuren durch Entfettung zur Abtrennung der Ustilipide durchgeführt.
Der Extrakt wird mit 50 °C warmem Methanol versetzt, filtriert und der erhaltene Extrakt auf des Volumens reduziert. Nach Zugabe des 9- fachen Wasservolumens (auf 50 °C vorgewärmt) erfolgt die Fällung durch Abkühlung auf Raumtemperatur und Lage- rung für zwei Tage bei 4°C. Der Ustilaginsäure-haltige Niederschlag wird mittels Zentrifuge abgetrennt, mit kaltem Wasser gewaschen und nach mehrfacher Entfettung mit Methyl -tert- butylether (MTBE) getrocknet.
Beispiel 13: Analytische Daten zum AW-048 Produkt
Die Gehaltsbestimmung nach HPLC-ELSD-Verfahren ergibt > 99% U- stilaginsäuren in Summe. Fig. 1 zeigt das HPLC-ELSD-Chromatogramm einer angereicherten Ustilaginsäurefraktion (Glykolipid-Gemisch AW-048 -Produkt) .
Auswertung über Peakflachen
Rt Rel.Are Substanz- Nr . Imin] Area a MW Fragmente Kommentar klasse
277, 489, üstilagin-
1 20, 22 5,42 0,47 % 782 507 säuren
277, 305, Ustilagin¬
2 21, 75 774 , 88 67,86 % 784 509 NP-0182 7 sauren
Ustilagin¬
3 22, 31 1,08 0,10 % 810 305, 507 sauren
Ustilagin¬
4 23, 11 12, 47 1,09 % 754 277, 479 sauren
Ustilagin-
5 23, 77 334, 11 29,26 % 812 305, 509 NP-018256 säuren
Ustilagin-
6 24,20 4, 94 0,43 % 768 277, 493 NP-01825S säuren
Ustilagin¬
7 25, 01 3,30 0,29 % 782 305, 479 sauren
z.B. 606145- Ustilipid
8 31,13 0,97 0,08 % 662 541 53-3 El?
9 40, 70 4, 76 0,42 %
UstilaginSumme 99,50 % sauren
Zur Identifizierung der Nebenkomponenten der Ustilaginsäure- fraktion wurde ein LCMS vermessen. Alle Peaks, die im LCMS-ELSD der angereicherten Ustilaginsäurefraktion mit einer relativen Fläche von > 0.1 % detektiert werden können, lassen sich anhand der Molmassen bzw. charakteristischer Fragmente im Massenspekt ~ rum identifizieren und der Substanzklasse der Ustilaginsauren zuordne .
Zur Quantifizierung wurde das ELSD-Chromatogramm herangezogen. Bei den detektierten Peaks handelt es sich bis auf 2 Peaks (Re- tentionszeit bei 31,13 min und 40,70 min} um Ustilaginsauren mit einem Gesamtanteil > 99 %. Beispiel 14: Isolierung aus dem Fällungsprodukt
Die Isolierung der in jeweils 2,0 g Pällungsprodukt enthaltenen Verbindungen erfolgte durch Feintrennung mittels präparativer P-HPLC wie in der Tabelle 16 beschrieben.
Tabelle 16: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1391-N und C- 1392-N
Figure imgf000044_0001
Die isolierten Feinfraktionen wurden per HPLC (Einzelheiten siehe oben unter „Methode 3" tabellarisch dargestellt), LC/MS (Einzelheiten siehe oben unter „Methode 4" tabellarisch dargestellt) und N R-Spektroskopie charakterisiert und die analytischen Daten 2ur Klärung der Strukturen genutzt. In der folgenden Tabelle 17 sind die Ergebnisse zu den Feintrennungen zusammengestellt. Tabelle 17: Mengen und Reinheit der Chargen zu den Strukturen aus C-1391-N und C-1392-N
Figure imgf000045_0001
Beispiel 15: Olfaktorische Beurteilung des Glykolipid-haltigen Produktes AW-048
Die direkte olfaktorische Beurteilung des pulverförmigen AW- 048 -Produktes von vier Testpersonen ergab, dass das AW-048- Produkt zwar leicht charakteristisch, jedoch nicht unangenehm riecht .
Weiterhin wurde das Gylkolipid-haltige Produkt AW-048 in Konzentrationen von 50 ppm und 100 ppm in Leitungswasser (pH = 6) gelöst. Dazu wurden zunächst 5 mg AW-048 bzw. 10 mg AW-048 ein- gewogen und jeweils in 125 L Ethanol (absolut) in 1,5 mL Eppendorf Reaktionsgefäßen vorgelöst. Diese Lösungen wurden anschließend in jeweils 100 mL Leitungswasser (pH = 6) pipettiert. Die anschließende olfaktorische Beurteilung der zwei Losungen von vier Testpersonen ergab, dass die Lösungen nicht von reinem Leitungswasser (pH = 6) unterschieden werden konnten.
Beispiel 16: Geschmackliche Beurteilung einer Lösung der Substanz NP-018256 (XI) Substanz NP-018256 (Reinheit 98,4% nach HPLC Methode 3, Einzelheiten tabellarisch siehe oben) wurde in einer Konzentration von 50 ppm in stillem Mineralwasser unter Erwärmen auf 60°C gelöst. Die hergestellte Lösung wurde nach Abkühlen auf Räum em- peratur von neun Testpersonen nach der „ taste-and-spit" -Methode beurteilt. Als Ergebnis stellten zwei Testpersonen keinen Unterschied im Vergleich zu Wasser fest. Zwei weitere Testperso- nen beschrieben die Lösung als neutral. Fünf Testpersonen konnten die Lösung im Vergleich zu Wasser unterscheiden, der Ge- schmack wurde als nicht unangenehm beschrieben. Die Substanz beeinträchtigt in der getesteten Konzentration den Geschmack von Getränken nicht negativ.
Beispiel 17 : Geschmackliche Beurteilung von ÄW-048 in Getränken AW-048-Lösungen von 50 ppm wurden in verschiedenen Getränken, wie in Beispiel 15 für Wasser beschrieben, hergestellt. Neben einer Apfelschorle, einem Orangenenktar und einem Eisteee wurde auch ein Engergydrink und eine Trinkmolke verwendet. Drei Testpersonen waren nicht in der Lage zwischen den Original- Getränken und den Getränken mit AW-048 zu diskriminieren. Zusammenfassend konnte festgehalten werden, dass keine geschmackliche Beeinträchtigung der Getränke durch AW-048 erfolgt.
Beispiel 18 : Herstellung einer Apfelschorle mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 pL reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 100 mL einer Apfelschorle (Adelholzener Alpenquellen GmbH) gegeben.
Beispiel 19: Herstellung eines Eistees mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 uL reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 100 mL eines Eistees (Nestea* Pfirsich; Coca-Cola GmbH) gegeben. Beispiel 20: Herstellung eines Orangennektars mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 μ3 reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 100 mL eines Orangennektars (Hardthof Orangen Nektar; efresco Deutschland GmbH) gegeben.
Beispiel 21: Herstellung eines Energydrinks mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 L reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 100 mL eines Energydrings (Energy Rocket; Radlberger Getränke GmbH & Co.} gegeben.
Beispiel 22: Herstellung einer Trinkmolke mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 L reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 100 mL einer Trinkmolke (Müller* Fitness Molke Apfel; Molkerei Alois Müller GmbH & Co. KG) gegeben.
Beispiel 23: Herstellung eines Apfelschorlen-Grundstoffes mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 μL reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 7,641 mL eines Apfelschorlen-Grundstoffes (Döhler GmbH) gegeben. Diese Menge des Grundstoffes eignet sich zur Herstellung von 100 mL Apf lschorle.
Beispiel 24: Herstellung eines Mehrfruchtnektar-Grundstoffes mit AW-048
5 mg AW-048 wurden in 75 μL reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 9,748 mL eines Mehrfruchtnektar- Grundstoffes (Döhler GmbH) gegeben. Diese Menge des Grundstoffes eignet sich zur Herstellung von 100 mL Mehrfruchtnektar. Beispiel 25: Herstellung eines Energydrink-Grundstoffes mit AW-
048
5 mg AW-048 wurden in 75 L reinem Ethanol gelöst. Anschließend wurde diese Lösung zu 8,419 mL eines Energydrink-Grundstoffes (Döhler GmbH) gegeben. Diese Menge des Grundstoffes eignet sich zur Herstellung von 100 mL Energydrink.

Claims

Patentansprüche :
1. Getränk enthaltend als natürliches Konservierungsmittel ein Glykolipid der Formel (I) :
Figure imgf000049_0001
Ri gleich oder verschieden ist und H oder COCH3 bedeutet 2 gleich oder verschieden ist und H oder
Figure imgf000049_0002
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist,
R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
OH oder OCH3 bedeutet
Figure imgf000049_0003
oder
Figure imgf000049_0004
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist, R6 H oder OH bedeutet
R7 H oder OH oder =0 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids gemäß Formel I
2. Getränk gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es al Konservierungsmittel ein Glykolipid der Formel (II)
Figure imgf000050_0001
(II)
wobei
Ri H oder COCH3 bedeutet
R2 gleich oder verschieden ist und H oder
Figure imgf000050_0002
bedeutet, wobei m l, 2 oder 3 ist,
R gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
OH oder OCH3 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids gemäß Formel II enthält.
3. Getränk gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Konservierungsmit el ein Glykolipid der Formeln (III) bis (XXV)
Figure imgf000050_0003
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
£Z8/.90/ZT0Zd3/I3d 8ΐ8/.εο/εΐοζ OAV
Figure imgf000053_0001
£Z8/.90/ZT0Zd3/I3d 8ΐ8/.εο/εΐοζ OAV
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
Figure imgf000054_0003
10
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000056_0002
Figure imgf000057_0001
oder ein Salz der genannten Verbindungen enthält.
4. Getränk gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz ein Alkali- oder ein Erdalkalisalz der genannten Verbindungen ist.
5. Getränk gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Konservierungsmittel um ein Gly kolipid der Formeln (XI) , (XV) , (IX) oder (XIII) oder eines i rer Gemische handelt.
6. Getränk gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Konservierungsmittel um ein Gly- kolipid der Formeln (XI) oder (XIII) oder eines ihrer Gemische handelt .
7. Getränk gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Konservierungsmittel um ein Gemisch der Glykolipide der Formeln (XI) und (XIII) handelt.
8. Getränk gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Glykolipide jeweils in einer Menge von 10 bis 4000 ppm vorhanden ist.
9. Verwendung eines Glykolipids gemäß Formel (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel in Getränken.
10. Verfahren zur Herstellung der Getränke gemäß Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykolipide oder Gemische der Glykolipide gemäß Formel (I) bzw. Formel (II) bis (XXV) entweder direkt in das Getränk gegeben oder über Vorlösungen in Wasser oder Ethanol dem Getränk zugegeben werden.
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